CN101624473B - 一种规模化培养肝细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型的具有肝细胞特异性的丝素-半乳糖基化壳聚糖大孔微载体及其制备方法，以及利用它在微重力旋转培养条件下进行肝细胞培养的方法。本发明提供的新型微载体与常规的实心支架材料相比具有更大的表面积/体积，且窦隙结构与体内肝窦结构高度相似，因而更有利于肝细胞在支架材料上的黏附、更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。

Description

一种规模化培养肝细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种规模化培养肝细胞的方法，具体涉及利用一种新型的肝细胞特异性大孔微载体进行肝细胞规模化培养的方法。 

背景技术

生物人工肝于80年代后期开始逐渐发展起来，虽已经历20余年发展，取得一定的进展，但仍未能广泛而有效地运用于临床，成为完全替代肝脏移植手术以治疗各种急慢性肝功能衰竭的最佳方法，其中如何实现体外肝细胞数量多、功能强的规模化培养是目前强烈限制生物人工肝发展的瓶颈问题。 

肝细胞是锚定依赖性细胞，其功能的有效发挥必须依赖于对支架材料等支持物的贴附。理想的肝组织工程支架除了应具有无毒、良好的组织细胞相容性与细胞粘附性能等基本要求外，具有足够的细胞粘附表面积和利于气体和物质交换的孔隙率亦尤为重要。支架材料的选择是肝脏组织工程中的热点问题，目前常见的肝组织工程支架材料有壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯树酯、聚氨酯泡沫等天然或合成的材料。而在众多的体外肝细胞规模培养方法中，而目前研究表明，多孔微载体作为支架的三维培养正是实现肝细胞规模化培养的一种有效方法，这种培养模式具有单层培养和悬浮培养两种培养方法的优点。但在肝细胞培养中，现存的多孔微载体均不够理想，因而寻求一种理想的具有肝细胞特异性的多孔微载体对目前实现肝细胞体外规模化培养具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型微载体，具有与常规的实心支架材料相比具有更大的表面积/体积，且窦隙结构与体内肝窦结构高度相似，因而更有利于肝细胞在支架材料上的黏附、更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。 

本发明的另一目的在于提供一种体外规模化培养肝细胞的方法，该方法结合使用所述新型微载体和微重力旋转培养系统，以实现肝细胞功能强、密度高的规模化培养。 

为实现上述目的，本发明的一个方面提供一种大孔微载体，其对肝细胞具有高度的亲和性，该大孔微载体的粒度为200-500μm，其是由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得的。 

在本发明的实施反式中，可通过下述方法制备所述大孔微载体，该方法包括： 

(a)将丝素蛋白溶液与半乳糖基化壳聚糖溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-7w/v％的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液； 

(b)将乳化剂分散进入所述丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液中，得到白色乳液，并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化； 

(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌40-60分钟，过滤得到互不粘连的微球； 

(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球； 

(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。 

优选地，所述乳化剂为石蜡和/或司班80。所述交联剂优选为戊二醛。 所述极性溶剂优选为异丙醇和/或丙酮。 

在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)中的冷冻干燥之前还包括用高浓度蔗糖溶液浸泡所述微球的步骤。 

在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。所述消毒步骤优选为以钴60-γ射线辐照。 

本发明的另一方面提供一种体外大规模培养肝细胞的方法，该方法包括： 

(a)提供所述大孔微载体； 

(b)将所述大孔微载体用于微重力旋转培养系统中。 

在本发明的一个实施方式中，在步骤(b)之前还包括用0.1mol/L、pH为7.0的无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡大孔微载体过夜并用含血清培养基浸泡至少10个小时的步骤。 

在本发明的实施方式中，所述微重力旋转培养系统使用浓缩静止接种法接种细胞。优选地，所述浓缩静止接种法中的细胞接种量为2×10⁵/ml～1×10⁶/ml。优选地，所述浓缩静止接种法中起始培养基量为培养瓶容积的40％～90％。优选地，所述浓缩静止接种法中使用的静止时间为12h～24h。优选地，所述浓缩静止接种法使用的初始旋转速度为7.6～9rpm。 

在优选的实施方式中，所述浓缩静止接种法中使用的培养基的血清浓度为10％～15％。优选地，所述培养基为DMEN或PRMI 1640；优选地，所述培养基含有浓度为20mmol/L～50mmol/L的HEPES。 

本发明的优点在于利用一种新型的具有肝细胞特异性的丝素-半乳糖基化壳聚糖大孔微载体在模拟微重力旋转培养条件下进行肝细胞培养，建立了一种简单的、可靠的体外肝细胞高密度、高分化规模化培养方法，采用该方法1)可高密度培养肝细胞，丝素-半乳糖基化壳聚糖大孔微载体具有高度类 似于体内肝血窦样的窦隙结构，不仅具有特异性肝细胞吸附的作用，为肝细胞生长提供广大的生长空间，还可实现有效的肝细胞与培养基间营养、氧气和代谢产物的有效流通，实现体外高密度培养，一般可达10⁷/ml；2)培养肝细胞功能强，在微重力旋转培养下持续的模拟微重力环境有利于肝细胞增值分化，有利于细胞与细胞间接触，形成三维结构样组织，进一步增强体外培养肝细胞功能；3)对肝细胞损伤小，微重力旋转培养采用膜式氧和气体交换，无气泡与涡流产生，产生的剪切力较小；4)细胞接种效率高，肝细胞是高耗氧量细胞，特别是在培养起始贴壁期，需氧量最大，且对的剪切力都非常地敏感；5)通过浓缩接种期细胞与微载体悬液，不仅提高了细胞与微载体的相对浓度，增加了细胞与微载体间的接触机会，还在旋转培养瓶内产生了气液平面，缩短了细胞与气液平面的距离，并通过扭开阀门和瓶盖，可与外界(即孵箱)进行有效的气体交换。因而，该方法更有利于肝细胞在支架材料上的黏附、更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提高体外肝细胞的培养密度和肝细胞功能。 

附图说明

图1是本发明的大孔微载体在倒置显微镜下的图片； 

图2是本发明的大孔微载体在电子显微镜下的图片； 

图3a是利用本发明的丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体静止培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图3b是利用本发明的丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体微重力培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图4是在静止和微重力下丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养CL-1 细胞的上清尿素浓度； 

图5a是利用实心微载体(cytodex)微重力培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图5b是利用本发明的大孔微载体(丝素/半乳糖基化壳聚糖)微重力培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图6是在利用图5a和图5b中的载体进行微重力培养的CL-1细胞上清尿素浓度的比较； 

图7a是利用多孔微载体(cytodpore)微重力培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图7b是利用本发明的大孔微载体(丝素/半乳糖基化壳聚糖)微重力培养的CL-1细胞(第六天)在电子显微镜下的图片； 

图8是利用图7a和图7b中的载体进行微重力培养的CL-1细胞上清尿素浓度的比较。 

具体实施方式

为了更好地理解本发明的方法，下面将通过实施例和实验证据进一步阐述本发明及其优势。在详细描述以下实施例和实验之前，首先需要定义和澄清一些术语。 

丝素蛋白是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们在蛋白总量中大概占85％。目前研究表明丝素蛋白不仅具有良好的生物相容性、无毒、无刺激性，还具有促进细胞吸附和增殖的特性，因而在生物医用领域得到了日益广泛的应用。而将其用于细胞培养的基质，或对一些生物高分子进行修饰，改善它们的生物性 能，使其适用于组织工程，更是近年来丝素蛋白研究的热点。 

壳聚糖是近年来在生物医药、组织工程领域得到广泛应用的一种天然生物高分子，不仅具有生物功能性、生物相容性、低毒性及几乎无过敏性等特性而且还具有高化学反应活性，易于被一些化学试剂修饰，可通过各种方法对其进行性质改良，而半乳糖基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，具有诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能。在EDC和NHS的活化作用下，将半乳糖基引入到壳聚糖的结构中制备半乳糖基化壳聚糖，对其材料表面进行改性，并将其与丝素蛋白进行复合制备形成丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体，不仅可为体外肝细胞培养提供较大三维生长空间还可显著增强肝细胞的功能和提高细胞活力，是一种理想的具有肝细胞特异性新型多孔微载体。 

生物反应器是生物人工肝装置及对肝功能衰竭治疗效果最有影响的关键部分。理论上，生物反应器应最大限度地模仿正常肝脏的组织结构，为培养肝细胞提供类似于体内的生存及代谢环境。因此，理想的生物反应器应具备以下功能：细胞密度达1×10⁷个细胞/ml水平；反应装置能根据需要任意增容，细胞培养量可达数升；连续灌注培养实现有效的营养物质、氧气及代谢产物双向物质传输；可进行自动化在线细胞状态、培养液PH值、氧浓度等方面检测和调节功能，以便于医护人员的监督和操作；肝细胞代谢功能至少达单层培养的水平，并至少保持2周以上；便于运输和装配。现在常用的生物反应器有以下几类：中空纤维生物反应器、转瓶培养反应器、搅拌悬浮培养反应器、空气升液培养反应器和微重力旋转培养反应器等。其中中空纤维生物反应器的应用最为广泛的，其优点是异种蛋白可以隔离，同时防止人体内针对异种细胞抗原的预存抗体对装载细胞的杀伤作用，因而比较适合异种细胞类 (如猪肝细胞)生物反应器。但这类生物反应器存在以下问题：(1)容积有限，细胞装载量小；(2)培养液与肝细胞交换面积有限，不利于肝细胞的功能维持和扩增；(3)半透膜的侧孔易被细胞团堵塞，影响交换效率；(4)因为中空纤维不能耐受深低温，不适合大规模冻存。其它类型的反应器如转瓶培养、搅拌培养等由于剪切力较大等缺点目前亦无法实现高效均一的细胞种植，氧气营养物质及细胞代谢产物的运输，达到高密度、大容量地规模化培养细胞，及细胞功能的长期维持。而最初由美国航空航天局设计并应用于微重力生命科学领域的旋转培养系统(RCCS)在目前的众多组织工程生物反应器中，经过近二十几年的相关研究表明其较其它组织工程反应器具有持续模拟微重力环境有利于细胞增值分化，有利于细胞与细胞间接触，形成三维结构样组织；膜式氧和气体交换，无气泡与涡流产生，低剪切力等对细胞机械损伤小等优点，目前已成功广泛运用于兔角膜细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞、胚胎干细胞、皮层神经元细胞、脂肪组织等多种组织工程领域中，是一种具有较广应用前景的生物反应器。 

本发明一方面提供一种新型的大孔微载体，其可以用于体外肝细胞规模化培养。本发明的另一方面提供一种利用该大孔微载体进行体外肝细胞规模化培养的方法。实施例中使用的丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖分别可从市场上购买得到，或者可通过下述方法制备而得。所使用的各种试剂、材料和仪器都可从市场上购买得到。本文中所使用的缩写、名称具有本领域技术人员所知的意义。 

大孔微载体的制备及其应用

1.大孔微载体的制备 

1)丝素蛋白的制备：将生蚕丝在5g/L的碳酸钠溶液中煮沸1小时，然 后用大量去离子水或蒸馏水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获得丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下去离子水或蒸馏水透析3天，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃下低速搅拌，蒸发部分水分，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液，备用； 

2)半乳糖基化壳聚糖(GC)的制备：称取2.2g壳聚糖，溶于30-40ml的1.0％-2.5％的醋酸水溶液中，再加适量TEMED/HCl的缓冲溶液(pH4.7)将壳聚糖溶液稀释至4w/v％，再分别加入0.14g NHS、0.6g EDC和2.2g乳糖酸(LA)，在室温下搅拌反应72h后，蒸馏水透析3-4天，即得到半乳糖基化壳聚糖(GC)溶液，蒸发部分水分浓缩备用。 

3)将1)中的丝素蛋白、2)中的半乳糖基化壳聚糖按4∶1、7∶3、6∶4、5∶5、5.5∶4.5等不同的比例混合均匀，丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液终浓度为4-7w/v％； 

4)取一定量的液体石蜡加入烧杯中，然后加入3-5％的乳化剂(如司班80)，混合均匀后以一定速度恒速搅拌，按5∶1、4∶1等油水比加入3)中丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液，在室温下继续恒速搅拌30-45min，分散均匀得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入一定量的交联剂如戊二醛溶液等，继续搅拌2-3h，使水相交联固化； 

5)取一定体积的极性溶剂如异丙醇、丙酮等，再往其中加入适量去离子水或蒸馏水将其稀释，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10； 

6)将5)中溶液以200-400转/分搅拌，将4)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌40-60分钟；过滤得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中 4-8小时，使微球充分固化； 

7)将微球用5)中稀释后的极性溶剂、石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-500μm的微球； 

8)将筛分后的微球，用戊二醛中和剂甘氨酸溶液浸泡2-4小时，除去未反应的戊二醛，再用大量蒸馏水洗涤； 

9)将8)中洗涤干净后的微球用高浓度蔗糖溶液浸泡数分钟，然后倒去多余的蔗糖溶液；将上述浸泡过蔗糖溶液的微球置于冰箱中冷冻36-72小时，然后冷冻干燥，得到大孔微载体。 

2、大孔微载体的应用

微重力旋转培养下丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体规模化肝细胞培养方法，具体步骤如下： 

1)丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体预处理：将所需数量的丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、pH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用含血清培养基浸泡10小时以上，备用； 

2)浓缩静止接种法接种细胞：消化收集平板培养的肝细胞悬液，按所需接种密度将细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含血清培养基至60％体积，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶 置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有含血清的培养液，另一支不装培养液)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6～9rpm， 

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并非对本发明的限制； 

实施例一、静止/微重力旋转培养下丝素/半乳糖基化壳聚糖培养人肝细胞株CL-1细胞； 

一、完全培养基的配置：每100ml DMEN(高糖型)培养基添加15ml胎牛血清、3.5mmolHEPES、青霉素10000U、链霉素10000U 

二、丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体预处理：将0.1g丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、PH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用1)配置的完全培养基浸泡10小时以上，备用； 

三、静止/微重力旋转条件下丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养人肝细胞(CL-1) 

1、微重力旋转培养组(浓缩静止接种法接种细胞)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶， 打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。每天换液量30ml，并调整转速1次。 

2、静止培养组(浓缩静止接种法接种细胞)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上， 打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，每天换液量30ml。 

四、生物功能检测：于每天换液时留取上清作样品，2 000r/min离心10min，，在Beckman全自动生化系统检测上清尿素含量； 

五、扫描电镜：留取样品，PBS清洗三次，加2％戊二醛固定0.5小时，1％锇酸固定0.5小时，接着用酒精梯度脱水，再用乙酸异戊脂置换4小时以上，临界干燥器干燥后真空喷溅铂金离子，日本S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。 

实验结果：本发明选用微重力丝素/半乳糖苷化壳聚糖大孔微载体为体外肝细胞规模化培养模式，较常规的静止三维培养更有利于肝细胞增殖分化及细胞-细胞间接触，形成致密三维结构样组织，实现体外肝细胞大规模高密度培养；可进一步增强肝细胞的功能(见图3a、图3b和图4)。 

实施例二、微重力旋转培养下微载体培养人肝细胞株CL-1细胞(丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体SF/GC、实心微载体：cytodex 3)； 

一、完全培养基的配置：每100ml DMEN(高糖型)培养基添加15ml胎牛血清、3.5mmolHEPES、青霉素10000U、链霉素10000U 

二、微载体预处理： 

1、丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体预处理：将0.2g丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、PH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经 121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用1)配置的完全培养基浸泡10小时以上，备用； 

2、实心微载体(cytodex 3)预处理：将0.25g实心微载体(cytodex 3)置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、PH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用1)配置的完全培养基浸泡10小时以上，备用； 

三、微重力旋转培养下微载体培养人肝细胞株CL-1细胞 

1、微重力丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养人肝细胞(CL-1)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内 外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。每天换液量30ml，并调整转速1次。 

2、微重力实心微载体(cytodex 3)培养人肝细胞(CL-1)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含cytodex 3微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。每天换液量30ml，并调整转速1次。 

四、生物功能检测：于每天换液时留取上清作样品，2 000r/min离心10min，，在Beckman全自动生化系统检测上清尿素含量； 

五、扫描电镜：留取样品，PBS清洗三次，加2％戊二醛固定0.5小时，1％锇酸固定0.5小时，接着用酒精梯度脱水，再用乙酸异戊脂置换4小时以上，临界干燥器干燥后真空喷溅铂金离子，日本S450扫描电子显微镜观察细 胞生长情况并摄影。 

实验结果：本发明以丝素/半乳糖苷化壳聚糖大孔微载体为体外肝细胞规模化培养支架材料，较常规的实心支架材料(cytodex 3)具有更大的表面积/体积，高度的窦隙结构与体内肝窦结构相似，更有利于细胞间的相互接触及氧气、营养成分的传送和代谢产物的排出，从而进一步提高体外肝细胞培养密度及其功能(见图5a、图5b和图6)。 

实施例三、微重力旋转培养下微载体培养人肝细胞株CL-1细胞(丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体SF/GC、多孔微载体：cytopore)； 

一、完全培养基的配置：每100ml DMEN(高糖型)培养基添加15ml胎牛血清、3.5mmolHEPES、青霉素10000U、链霉素10000U 

二、微载体预处理： 

1、丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体预处理：将0.2g丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、PH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用1)配置的完全培养基浸泡10小时以上，备用； 

2、多孔微载体(cytopore)预处理：将0.2g多孔微载体(cytopore)置于50ml塑料离心管中，用0.1mol/L、PH为7.0无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜后，吸去PBS，再用PBS洗涤3次，经121℃高压灭菌30分钟后，吸出PBS，用培养基洗涤2次，最后用1)配置的完全培养基浸泡10小时以上，备用； 

三、微重力旋转培养下微载体培养人肝细胞株CL-1细胞 

1、微重力丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养人肝细胞(CL-1)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含丝素/半乳糖基化壳聚糖大孔微载体的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。每天换液量30ml，并调整转速1次。 

2、微重力多孔微载体(cytopore)培养人肝细胞(CL-1)：消化收集平板培养的人肝细胞株(CL-1)悬液，总量为2×107的CL-1细胞悬液放入上述微载体中，轻轻混匀，在无菌条件下取出50ml无菌高横截面微重力旋转培养瓶，打开瓶盖和两个孔阀门，用注射器将含多孔微载体(cytopore)的肝细胞悬液经注射空缓缓注入微重力旋转培养瓶中，继续添加含1)配置的完全培养基至30ml，取出两个注射器，盖上瓶盖并将其稍稍扭松，静止横放于二 氧化碳孵箱中，培养条件为温度：37℃，二氧化碳浓度：5％。每8小时取出轻轻摇晃1分钟。24小时后取出微重力旋转培养瓶置于紫外消毒后的超净台中，用75％酒精擦拭瓶盖和瓶壁3次，打开瓶盖，将两支无菌10ml注射器(其中一支装有1)配置的完全培养基，另一支不装培养基)分别连接在两个取样孔上，打开取样孔阀门，将注射器中的培养液缓慢注入容器内，容器内气泡从另一支空的注射器中排出(培养过程中始终保持容器内无气泡，以避免形成涡流)，将整个容器充满后再用75％酒精擦拭瓶口和瓶壁3次，最后将其移入二氧化碳培养箱中，安装在培养装置上，并根据所接种微载体和细胞的量调整容器的转速，以微载体在旋转过程中不贴附在容器的内外壁上为宜。本试验中设定旋转初速度为7.6rpm。每天换液量30ml，并调整转速1次。 

四、生物功能检测：于每天换液时留取上清作样品，2 000r/min离心10min，，在Beckman全自动生化系统检测上清尿素含量； 

五、扫描电镜：留取样品，PBS清洗三次，加2％戊二醛固定0.5小时，1％锇酸固定0.5小时，接着用酒精梯度脱水，再用乙酸异戊脂置换4小时以上，临界干燥器干燥后真空喷溅铂金离子，日本S450扫描电子显微镜观察细胞生长情况并摄影。 

实验结果：半乳糖基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，本发明所使用丝素/半乳糖苷化壳聚糖大孔微载体在EDC和NHS的活化作用下进行半乳糖基化改性，较常规的多孔微载体(cytopore)更有利于肝细胞在支架材料上的黏附，可进一步促进体外肝细胞的培养密度及其肝细胞功能(见图7a、图7b和图8)。 

虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背 本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。 

Claims (17)

1.一种大孔微载体，其粒度为200-500μm，由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下通过包括以下步骤制得：

(a)将丝素蛋白溶液与半乳糖基化壳聚糖溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-7w/v％的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液；

(b)将乳化剂分散进入所述丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液中，得到白色乳液，并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；

(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌40-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；

(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；

(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。

2.一种制备权利要求1的大孔微载体的方法，其包括：

(a)将丝素蛋白溶液与半乳糖基化壳聚糖溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-7w/v％的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液；

(b)将乳化剂分散进入所述丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液中，得到白色乳液，并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；

(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌40-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；

(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；

(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为石蜡和/或司班80。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂为异丙醇和/或丙酮。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(e)中的冷冻干燥之前还包括用高浓度蔗糖溶液浸泡所述微球的步骤。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述消毒步骤优选为以钴60-γ射线辐照。

9.一种体外大规模培养肝细胞的方法，该方法包括：

(a)提供如权利要求1所述大孔微载体；

(b)将所述大孔微载体用于微重力旋转培养系统中。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(b)之前还包括用0.1mol/L、pH为7.0的无钙镁离子磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡大孔微载体过夜并用含血清培养基浸泡至少10个小时的步骤。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述微重力旋转培养系统使用浓缩静止接种法接种细胞，所述浓缩静止接种法中的细胞接种量为2×10⁵/ml～1×10⁶/ml。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述浓缩静止接种法中起始培养基量为培养瓶容积的40％～90％。

13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述浓缩静止接种法中使用的静止时间为12h～24h。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述浓缩静止接种法使用的初始旋转速度为7.6～9rpm。

15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述浓缩静止接种法中使用的培养基中含10％～15％的血清。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述培养基为DMEN或PRMI1640。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述培养基含有浓度为20mmol/L～50mmol/L的HEPES。

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