CN102321352B - 介孔结构的聚己内酯及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有介孔结构的聚己内酯及其制备方法和用途。本发明所述的介孔聚己内酯，是一种具有孔径为5μm～10μm、45μm～50μm和200μm～300μm多孔结构的聚己内酯。制备所述介孔聚己内酯的方法的主要步骤是：采用粒径为45μm～50μm的溶于水和符合医用条件的斜方晶型无机粒子和粒径为200μm～300μm的氯化钠粒子与聚己内酯依次经“溶剂浇注及粒子浸出”，“气体发泡”以及“热致相分离”后得到目标物。本发明所提供的介孔聚己内酯可用于制备组织(如软骨、骨、皮肤和肌腱等)工程支架。

Description

介孔结构的聚己内酯及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种具有介孔结构的聚己内酯及其制备方法和用途。

背景技术

组织工程最早是由美国国家科学基金会于1987年正式提出，是应用工程学和生命科学的原理开发生物替代物以重建，修复或提高组织功能的一门交叉学科。其基本原理是从人体提取一定的正常细胞，进行分离和增殖，然后种植到具有生物相容性，可逐步降解吸收的多孔支架上，形成细胞-支架复合体，细胞在支架上增殖，分化到一定程度后，将此复合物植入体内，随着材料的逐步降解，细胞外基质的不断分泌和组织的不断形成，重建新的预自身功能和形态相适应的组织或器官，从而达到修复病损组织或器官的目的。

组织工程三要素为细胞，支架，生物活性因子，其中组织工程支架能提供细胞所需的特殊环境，能通过制备方法的调整模拟细胞外基质(extra cell matrix，ECM)，既起到了了物理支撑的作用，又是细胞在体外培养和后期植入的黏附物质。因而它必须具备许多物理及化学性质，为能黏附大量的细胞，支架材料的设计首选必须具备很大的比表面积；所种植的细胞在生长及ECM的形成中需要充分合适的空间，因而支架材料的设计还需具有高的孔隙率。此外，支架材料必须具备内部均匀分布和相互连通的孔结构，这样有利于细胞在整个支架体内部均匀分布，也有利于新生成的组织成分形成三维网络结构。

研究表明，不同的孔结构，孔尺寸对细胞行为有很大的影响，比如成纤维细胞在孔径范围40-150μm具有很好的材料粘附性(Salem A.K，Stevens R，Pearson R.G，Davis M.C，Tendler S.J，Roberts C.J，et al.Interactions of 3T3 fibroblasts and endothelial cells with defined pore features.JBiomed Mater Res 2002；61：212-7)，而在186-200μm增殖生长地更快(Oh S.H，Park I.K，KimJ.M，Lee J.H.In vitro and in vivo characteristics of PCL scaffolds with pore size gradient fabricatedby a centrifugation method.Biomaterials 2007；28：1664-71)。这就要求我们设计出具有特殊孔结构的材料，使细胞的不同行为得到调控。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一种同时具有三种不同孔径的介孔聚己内酯，经细胞种植实验表明，本发明所提供的介孔聚己内酯(特别是重均分子量为50,000～120,000的介孔聚己内酯)可用于制备组织工程支架。

本发明所述的介孔聚己内酯，是一种具有孔径(直径)分别为5μm～10μm、45μm～50μm和200μm～300μm多孔结构的聚己内酯。

本发明的目的之二在于，提供一种制备本发明所述介孔聚己内酯的方法，所述方法的主要步骤是：采用粒径(直径)为45μm～50μm的溶于水和符合医用条件的斜方晶型无机粒子和粒径(直径)为200μm～300μm的氯化钠粒子与聚己内酯依次经“溶剂浇注及粒子浸出”，“气体发泡”以及“热致相分离”后得到目标物(本发明所述的介孔聚己内酯)。

本发明的目的之三在于，揭示一种本发明所述的介孔聚己内酯的用途，即本发明所述的介孔聚己内酯(特别是重均分子量为50,000～120,000的介孔聚己内酯)在制备用于组织(如软骨、骨、皮肤和肌腱等)重构的组织工程支架中的应用。

附图说明

图1为实施例1中，由聚己内酯(原料)转化为本发明所述的介孔聚己内酯，聚己内酯的重均分子量变化曲线

图2为实施例1中，由不同比例无机粒子制得本发明所述的介孔聚己内酯的连通性评价曲线；

图3为实施例1所制备的介孔聚己内酯(之一)的SEM图；

其中：(1)×50，(2)×400。

图4为比较实施例1所制备的介孔聚己内酯的SEM图；

其中：(1)×50，(2)×400。

图5为比较实施例2所制备的介孔聚己内酯的SEM图；

其中：(1)×50，(2)×400。

图6为实施例1、比较实施例1和比较实施例2所制备的介孔聚己内酯的连通性评价曲线；

其中，...■...表示实施例1制备的介孔聚己内酯；

...◆...表示比较实施例1制备的介孔聚己内酯；

...▲...表示比较实施实施例2制备的介孔聚己内酯

图7为成纤维细胞分别在实施例1、比较实施例1和比较实施例2所制备的介孔聚己内酯上的分布图(荧光)。

具体实施方式

在本发明中，对于用于制备本发明所述的介孔聚己内酯的原料(即聚己内酯)并无特殊要求，只要所用的聚己内酯符合医用条件即可。本发明推荐使用重均分子量为50,000～120,000的聚己内酯。

本发明提供一种制备本发明所述介孔聚己内酯的方法，具体包括如下步骤：

(1)将聚己内酯和二氧六环置于一容器中，充分搅拌后得到澄清溶液，将由粒径(直径)为45μm～50μm的溶于水和符合医用条件的斜方晶型无机粒子和粒径(直径)为200μm～300μm的氯化钠粒子组成的混合物加入所得的澄清溶液中，搅拌混匀，并在-20℃～-18℃状态下保持至少12小时，得固状物；

(2)将由步骤(1)所得的固状物依次浸入-20℃～-18℃的乙醇中、pH值为5～6的酸性水溶液(如盐酸水溶液等)中和“双蒸水”中，取出固状物，其经干燥后即为目标物(本发明所述介孔聚己内酯)；

其中，所述固状物在所述乙醇中的浸泡时间为12小时至24小时、在所述的酸性水溶液中浸泡至少24小时、在“双蒸水”中浸泡至少120小时。

其中，所述的“双蒸水”是指经两次蒸馏的去离子水。

在本发明一个优选的技术方案中，所述的斜方晶型无机粒子与氯化钠粒子的质量比为4∶1～1∶4，更优选的质量比为1∶1～1∶2；

在本发明另一个优选的技术方案中，所述的斜方晶型无机粒子碳酸氢盐，如(但不限于)：碳酸氢铵或/和碳酸氢钠等。

在本发明又一个优选的技术方案中，由所述的斜方晶型无机粒子与氯化钠粒子组成的混合物与所述的聚己内酯的质量比为4∶1～10∶1。

下面通过实施例对本发明作进一步阐述。所列实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

重均分子量为50,000～120,000的聚己内酯溶解于二氧六环中，浓度为0.2g/ml，在40℃下溶解充分得到澄清溶液，倒入自制的聚四氟乙烯模具中；把筛取的粒径(直径)为200-300μm氯化钠粒子和粒径(直径)为45-50μm碳酸氢钠粒子分别以4∶1，2∶1，1∶1，1∶2以及1∶4的比例混合，得无机粒子混合物，以10∶1的无机粒子混合物/聚合物质量比加入上述澄清溶液中，搅拌超声使无机粒子在聚合物溶液中均匀分散后，置于-20℃冰箱中冷冻过夜。取出后置于200mL，-20℃～-18℃的无水乙醇溶液中过夜，取出后置于pH值为5的盐酸水溶液中，24小时后取出，再浸没于双蒸水中，每12小时换一次水，6天后取出，冷冻干燥得到本发明所述介孔聚己内酯。

整个制备过程中聚己内酯的重均分子量损失如图1；

对采用不同质量比例的无机粒子混合物，所得到相应的本发明所述介孔聚己内酯进行连通性的评价，详见图2；

以所述粒径(直径)为200-300μm氯化钠粒子与所述粒径(直径)为45-50μm碳酸氢钠粒子的质量比为2∶1时，所得到相应的本发明所述介孔聚己内酯的SEM图如图3所示。

实施例2

除以不同的无机粒子混合物/聚合物质量比外，其它条件与实施例1相同，重复实施1的步骤，其结果见表1

表1

由表1可知：随着无机粒子混合物加入量的减少，所得到介孔聚己内酯使的孔之间的连通性变差。

比较实施例1

以粒径(直径)为200-300μm氯化钠粒子替代实施例1中的无机粒子混合物，按实施例1所述的方法制得介孔聚己内酯，其SEM图如图4所示。

比较实施例2

以粒径(直径)为45-50μm碳酸氢钠粒子替代实施例1中的无机粒子混合物，按实施例1所述的方法制得介孔聚己内酯，其SEM图如图5所示。

实施例3

分别将由实施例1、比较实施例1和比较实施例2所制得的介孔聚己内酯进行连通性评价和成纤维细胞培养测试，所述的连通性评价按下列方法进行：

将干燥的多孔支架称量，标为Wd，之后浸没于乙醇溶液中，每隔一定的时间取出，擦拭去表面的液体后称量，标为Wa，则，乙醇的

乙醇的吸收率越高，表示多孔支架的连通性越好，其结果见图6。

所述的成纤维细胞培养测试，按下列方法进行：

(1)细胞种植：

细胞种植之前，支架用刀切割为5mm×5mm×3mm，乙醇浸没过夜杀菌，之后在培养液DMEM中浸没48h；成纤维细胞2×10⁶种植于支架表面，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养；培养液每2天更换一次。

(2)成纤维细胞荧光观察

用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色成纤维细胞的细胞核，观察不同时间段，细胞在支架内部的分布情况；

取出培养一定时间的细胞/支架复合物，用pH值为7～8的磷酸缓冲液(PBS)冲洗2次后，用4％多聚甲醛溶液固定30min；加入DAPI的PBS溶液(2μg/ml)，置于暗处15min进行细胞核染色；染色后的复合物进行冷冻切片后，在荧光显微镜下进行观察，其结果见图7。

其中，成纤维细胞(3T3 fibroblast)(由武汉原生原代生物医药技术有限公司提供)，其它试剂都来自于Aldrich。

Claims (9)

1.一种介孔聚己内酯，其为具有孔直径分别为5μm～10μm、45μm～50μm和200μm～300μm多孔结构的聚己内酯。

2.如权利要求1所述的介孔聚己内酯，其特征在于，所述的聚己内酯的重均分子量为50,000～120,000。

3.一种制备如权利要求1或2所述的介孔聚己内酯的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将聚己内酯和二氧六环置于一容器中，充分搅拌后得到澄清溶液，将由颗粒直径为45μm～50μm的溶于水和符合医用条件的斜方晶型无机粒子和颗粒直径为200μm～300μm的氯化钠粒子组成的混合物加入所得的澄清溶液中，搅拌混匀，并在-20℃～-18℃状态下保持至少12小时，得固状物；

(2)将由步骤(1)所得的固状物依次浸入-20℃～-18℃预冷冻的乙醇中、pH值为5～6的酸性水溶液中和“双蒸水”中，取出固状物，其经干燥后即为目标物；

其中，所述固状物在所述乙醇中的浸泡时间为12小时至24小时、在所述的酸性水溶液中浸泡至少24小时、在“双蒸水”中浸泡至少120小时；所述的“双蒸水”是指经两次蒸馏的去离子水。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述由斜方晶型无机粒子与氯化钠粒子组成的混合物与所述的聚己内酯的质量比为4∶1～10∶1。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所述的斜方晶型无机粒子与氯化钠粒子的质量比为4∶1～1∶4。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其中所述的斜方晶型无机粒子与氯化钠粒子的质量比为1∶1～1∶2。

7.如权利要求3～6中任意一项所述的方法，其特征在于，其中所述的斜方晶型无机粒子为碳酸氢盐。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中所述的斜方晶型无机粒子为碳酸氢铵或/和碳酸氢钠粒子。

9.如权利要求1或2所述的介孔聚己内酯在制备用于组织重构的组织工程支架中的应用。

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