CN107596453A

CN107596453A - 一种3d打印复合磁性金属支架及其应用

Info

Publication number: CN107596453A
Application number: CN201711009998.1A
Authority: CN
Inventors: 黄振飞; 于凌佳; 贺宇; 王海; 吴志宏
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种3D打印复合磁性金属支架及其应用。本发明的3D打印复合磁性金属支架包括三维多孔金属支架、聚多巴胺外壳和复合磁性纳米粒子，所述三维多孔金属支架呈三维贯通的多孔网状结构，所述聚多巴胺外壳包覆在所述三维多孔金属支架的表面，所述复合磁性纳米粒子均匀粘附在所述包覆有聚多巴胺外壳的三维多孔金属支架的表面。本发明的3D打印复合磁性金属支架可以应用在制备骨缺损修复材料中，不仅满足了骨修复材料对于力学强度的需要，而且具有更好的生物相容性、材料亲水性和成骨诱导活性，有利于细胞的粘附、增殖，可促进间充质干细胞分化成骨。

Description

一种3D打印复合磁性金属支架及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种3D打印复合磁性金属支架及其应用。

背景技术

骨缺损治疗一直是困扰临床的难题。体内实验表明，6×6×10mm³的骨缺损即需要通过骨移植来修复。有报道称胫骨骨折后发生延迟愈合或不愈合的情况高达13％，此外，整形外科、口腔颌面外科手术以及严重的创伤、感染、骨肿瘤和骨骼畸形造成的大段骨缺损等，都需要通过骨移植来修复。

临床上骨缺损的移植材料包括自体骨和异体骨。自体骨移植一直是骨缺损治疗的“金标准”，但自体骨一般取自患者的髂骨和腓骨，不但取骨量有限，而且也会造成创伤甚至取骨处感染；异体骨则存在免疫排斥、传播疾病的风险。

目前，应用于骨组织工程的生物材料主要包括4类：生物陶瓷、高分子材料、金属材料、复合材料。每种材料均有其特有的优点，但也普遍存在着各自的不足。第一类：生物陶瓷，包括硫酸钙、磷酸钙、羟基磷灰石(hydroxyapatite)、β-TCP(β-Tricalciumphosphate)、生物玻璃等。陶瓷材料与天然人骨的无机成分和晶体结构都有许多相似之处，具有极佳的生物相容性，是一种很好的骨替代材料。羟基磷灰石和磷酸三钙用于填充和重建骨缺损，已经在骨科和齿科有了广泛的应用。Ambrosio等研究还发现陶瓷材料具有促进干细胞向成骨细胞增殖和分化的作用。尽管生物陶瓷有包括高弹性模量、高机械强度及其优异的耐磨特性等众多优点，却也存在着脆性高、可塑性差、难以加工等诸多缺点，而导致其在临床的应用受到很多约束。除此之外，如何调控陶瓷支架降解的速率也是研究的难点所在。第二类：高分子材料，分为天然高分子材料，包括胶原、壳聚糖、海藻酸盐等；以及人工合成高分子材料，包括聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等。胶原、壳聚糖、海藻酸盐等天然高分子材料具有良好的生物活性，可以促进细胞的粘附和增殖，与此同时具有良好的可降解性，但是存在的问题是加工塑型性能较差，并且其制备物力学强度往往不足，限制了在临床的使用。人工合成高分子材料是近年来发展较快的领域，其成分单一，性状可控，制备物具有一定的力学强度，还可以借助快速成型技术制作各种符合要求的复杂多孔结构，已经成为生物材料领域的研究主力，但其存在的问题是普遍缺乏生物活性，缺乏细胞识别的位点，并且其降解代谢产物往往对局部细胞产生负面影响。有学者研究发现聚左旋乳酸和聚乙醇酸等材料降解后会产生酸性物质，降低局部环境的pH值，导致细胞和组织坏死。第三类：金属材料，包括不锈钢、钛合金、钴铬钼合金、钽金属、镁合金等，它们的优势在于可以供足够的机械强度以及拥有良好的生物相容性，但缺点是没有生物活性并且往往不能降解吸收。第四类：复合材料，顾名思义就是联合两种或两种以上上述材料所构建的复合组织工程支架。单一材料或多或少都有这样或那样的不足，联合使用多种材料可以实现取长补短、优势互补，是目前生物材料研究的新热点。比如将生物陶瓷与高分子材料复合，不但可以获得足够的力学强度，还可以获得良好的生物相容性和生物活性。

金属材料中的钛及钛合金因其具有良好的生物相容性和耐腐蚀等优点已在临床应用多年，同时也充分证实了其优异的力学性能，然而钛合金的弹性模量约为103-110GPa，而正常松质骨的弹性模量约为0.5-3.5GPa，可见钛合金与人体的正常骨组织弹性模量严重不匹配，当受应力时钛合金和骨组织之间差异较大，容易出现应力遮挡效应，严重影响钛合金植入物与骨组织的稳定性。3D打印技术的出现让人们又重新认识了钛合金，利用3D打印技术可以将钛合金制备成多孔结构，这些多孔结构不但可以模拟正常天然骨组织的多孔结构，为新生骨的长入供了空间，也通过多孔结构的改变降低了材料的弹性模量，使其弹性模量接近骨组织，减少植入物对骨的应力遮挡，明显提高植入物与骨组织结合的稳定性。然而，钛合金属于惰性金属，本身没有生物活性，也没有细胞可以识别的位点，因此如何使用促进成骨的修饰技术对钛合金植入物进行修饰是目前研究的重点内容。但是，由于钛合金支架多孔的结构给传统工艺，比如等离子喷涂、表面活性涂层、负载生长因子等各种修饰技术的应用带来了困难，因此如何对多孔结构金属支架进行全方位的促成骨修饰是研究热点。

近年来，随着组织工程学的不断发展，有部分学者开始尝试将纳米磁性粒子作为组织工程的一种促成骨因子用于制备骨生物材料支架。众所周知，纳米磁性粒子已在研究中应用多年，既往主要集中在分子生物学领域，包含核磁共振成像、药物载体、靶向治疗、细胞筛选等领域。受电磁刺激效应的启发，近年来国内外一些研究团队制备了含有磁性纳米粒子(MNPs)的多种复合材料支架，探索磁性纳米粒子对成骨细胞的作用及其在骨缺损修复和改善植入体/骨界面结合性方面的应用。RajendraK.Singh研究了含有磁性纳米粒子的聚己内酯(PCL)支架的物理、化学、力学和生物学性质及其对骨再生的影响。加入纳米磁性粒子支架浸泡于模拟体液的磷灰石形成能力大幅改善，成骨细胞的粘附和增殖能力明显优于单纯PCL支架，生物相容性方面，他们发现PCL-MNPs纤维支架植入大鼠皮下表现组织的不良反应最小，而且可以诱导大量新生血管。在动物实验中也验证了PCL-MNPs纤维支架更好的骨再生能力。

近年来的大量研究表明，聚多巴胺(PDA)在任何材料(甚至是聚四氟乙烯(PTFE))的湿表面都可以很好的粘附。这些材料既包括高分子等有机材料，也包括金属和非金属氧化物、陶瓷等无机材料。而且，聚多巴胺具有非常优异的生物相容性，于2007年在《Science》报道后引起众多关注，并随之被广泛应用于生物医用材料的表面改性。聚多巴胺可以粘附在几乎所有的有机和无机材料的湿表面，并且，聚多巴胺自身的酚羟基和含N基团可以引发二次反应，通过电化学或者接枝反应在聚多巴胺表面形成金属层或其他大分子，得到功能化的复合材料。Si等报到了一种制备单分散磁性纳米粒子的方法，即在Fe₃O₄的湿表面沉积聚多巴胺，制备出了核一壳结构的Fe₃O₄@PDA复合纳米粒子，复合后的纳米粒子明显降低了裸露Fe₃O₄的细胞毒性。另外，聚多巴胺分子链上大量的酚羟基和氨基都具有亲水性，因此，沉积聚多巴胺之后的材料的亲水性能和分散性会有很大的改善。Zhu等人采用多巴胺对炭黑进行了表面修饰，研究成功实现了炭黑由疏水向亲水的转化。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大孔径、高孔隙率、孔孔连通和适当弹性模量的3D打印复合磁性金属支架。

本发明的第二目的在于提供所述复合磁性金属支架在制备骨缺损修复材料中的应用。

为实现上述目的，本发明提供一种3D打印复合磁性金属支架，所述复合磁性金属支架包括三维多孔金属支架、聚多巴胺外壳和复合磁性纳米粒子，所述三维多孔金属支架呈三维贯通的多孔网状结构，所述聚多巴胺外壳包覆在所述三维多孔金属支架的表面，所述复合磁性纳米粒子均匀粘附在所述包覆有聚多巴胺外壳的三维多孔金属支架的表面。

优选的，所述三维多孔金属支架由正十二面体或菱形十二面体为基本单位，按照一定孔径和孔柱的3D数字模型打印的具有孔孔连通的三维多孔贯通支架。

优选的，所述三维多孔金属支架的孔径是300-800μm，孔柱是200-300μm。

优选的，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金、纯钛、钴合金或不锈钢。

更优选的，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金。

优选的，所述聚多巴胺外壳的厚度为50-200nm。

优选的，所述复合磁性纳米粒子为聚多巴胺修饰的Fe₃O₄纳米颗粒，即Fe₃O₄@PDA；所述复合磁性纳米粒子为壳核结构，其中Fe₃O₄为内核，聚多巴胺为外壳。

优选的，所述聚多巴胺的厚度为50-200nm。

进一步地，本发明还提供了一种3D打印复合磁性金属支架在制备骨缺损修复材料中的应用。

有益效果

1、本发明的3D打印复合磁性金属支架为三维多孔贯通支架，具有大孔径、高孔隙率和适当弹性模量，能在减少金属用量的同时满足骨修复材料力学强度的要求，实现了金属用量的最优化。

2、本发明的3D打印复合磁性金属支架表面包覆聚多巴胺涂层，不仅增加了支架的亲水性，有利于细胞的黏附，同时也可降低金属支架的细胞毒性，明显增加该复合支架的生物相容性。

3、本发明的复合磁性纳米粒子通过聚多巴胺修饰的方法能够均匀粘附在金属支架表面，增加材料的磁性，促进成骨细胞或者间充质干细胞的粘附、增殖和分化，大大增强了支架的成骨能力。

4、本发明设计的3D打印复合磁性金属支架结构简单，易于生产，同时生物相容性更好，促进成骨的能力更强，是非常优异的骨修复材料。

附图说明

图1 3D打印技术制备的三维多孔钛合金支架；

图2包覆有聚多巴胺外壳的三维多孔钛合金支架的示意图；

图3黏附有复合磁性纳米粒子的三维多孔钛合金支架的示意图；

图4复合磁性纳米粒子的截面结构示意图；

图5 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架合成示意图；

图6实施例4中三组不同涂层材料表面元素组成分析图；

图7实施例4中三组不同涂层材料表面元素分布分析图；

图8实施例5中亲水性检测结果图；

图9实施例6中各组支架在荧光显微镜下采集图像；

图10实施例6中LIVE/DEAD染色试剂盒检测各组支架的细胞存活率；

图11实施例6中CCK-8检测各组支架细胞毒性结果图；

图12实施例7中各组支架成骨和成血管分化基因的相对表达情况；

图13实施例7中细胞茜素红染色结果；

图中附图标记如下：

三维多孔金属支架1，聚多巴胺外壳2，复合磁性纳米粒子3，Fe₃O₄31，聚多巴胺32。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法或按照试剂制造厂家所建议的条件。

本发明所使用的术语“Fe₃O₄@PDA”，为复合磁性纳米粒子，是一种核壳结构，即在Fe₃O₄表面沉积聚多巴胺。

LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒(LIVE/DEADViability/CytotoxicityKit)是一种快速简便的双颜色试验，其原理是细胞质膜完整性和酯酶活性。由于活细胞的显著特点是普遍具有细胞内酯酶活性以及完整的细胞质膜，细胞毒性检测试剂盒LIVE/DEAD可快速从死亡细胞中区别活细胞，其原理是：采用绿色荧光钙黄绿素-AM(CalceinAM)对细胞进行染色，能够显示活细胞胞内酯酶活性；而红色乙锭二聚体-1(EthD-1)能够显示因细胞质膜完整性缺失而标记的死亡细胞。

细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，CCK-8(cell-countingkit-8)检测的基本原理是活细胞线粒体内的一些脱氢酶，可以将其还原成有色的甲臜(formazan)，而死细胞无此功能，活细胞越多，则颜色越深。WST-8是一种类似于3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)的化合物，属于升级替代品，WST-8产生的甲臜(formazan)比XTT和MTS产生的甲臜(formazan)更易溶解，且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定，因此实验结果也相对更加稳定。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,简称Real-Time PCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，以实现对起始模板进行定量分析的方法。它通过在扩增指数期测量扩增产物实现定量检测，因为扩增指数期荧光值与DNA(RNA)起始量存在相关性。

RUNX2，编码蛋白基因，对于成骨细胞分化和骨骼形态发生是必不可少的，它是参与骨骼基因表达的核酸和调控因子的支架，在成骨细胞的分化和骨形成方面起重要的作用。

ALP，编码蛋白基因，细胞碱性磷酸酶基因，与骨的钙化作用密切相关。

OCN，编码蛋白基因，成骨细胞骨钙素基因，是成骨细胞活性剂分化的指标之一。

OPN，编码蛋白基因，骨桥蛋白基因，可促进骨基质形成、基质矿化和矿化结节的形成。

COL-1，编码蛋白基因，I型胶原蛋白基因，I型胶原是成骨细胞分泌的主要的蛋白，胶原是参与创伤愈合的主要结构蛋白。

如图1-图4所示，本发明提供了一种3D打印复合磁性金属支架，包括三维多孔金属支架1、聚多巴胺外壳2和复合磁性纳米粒子3，所述三维多孔金属支架1呈三维贯通的多孔网状结构，如图1所示；所述聚多巴胺外壳2包覆在所述三维多孔金属支架1的表面，如图2所示；所述复合磁性纳米粒子3均匀粘附在所述包覆有聚多巴胺外壳2的三维多孔金属支架1的表面，如图3所示。

所述三维多孔金属支架1由正十二面体或菱形十二面体为基本单位，按照一定孔径和孔柱的3D数字模型打印的具有孔孔连通的三维多孔贯通支架，如图1所示，所述三维多孔金属支架是1由菱形十二面体为基本单位的三维多孔贯通支架。

所述三维多孔金属支架1的孔径是300-800μm，孔柱是200-300μm。

在一优选实施例中三维多孔金属支架的孔径是300μm，孔柱是200μm。

在另一优选实施例中三维多孔金属支架的孔径是600μm，孔柱是300μm。

在又另一优选实施例中三维多孔金属支架的孔径是800μm，孔柱是300μm。

所述三维多孔金属支架1的材料为钛合金、纯钛、钴合金支架或不锈钢。

在一优选实施例中所述三维多孔金属支架1的材料为钛合金。

所述聚多巴胺外壳的厚度为50-200nm。

所述复合磁性纳米粒子3为聚多巴胺修饰的Fe₃O₄，即Fe₃O₄@PDA；所述复合磁性纳米粒子为壳核结构，其中Fe₃O₄31为内核，聚多巴胺32为外壳，如图4所示。所述聚多巴胺的厚度为50-200nm。

实施例1 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)的制备

1、运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔径300μm、孔柱200μm的3D数字模型。

2、将上述制备参数输入激光3D打印设备(ConceptLaser德国)，最大扫描速度7m/s，建造速度为1-5cm³/h。设置打印层厚，熔融速度，扫描方向，激光光斑间隔，铺粉速度，对于粉末进行熔融，层层堆积成型，然后采用线切割分离样品，热处理释放应力。

3、采用10％稀盐酸浸泡过夜，超声波清洗去除残留钛合金粉末，得到三维多孔钛合金支架。

4、将磁性纳米粒子(Fe₃O₄)和三维多孔钛合金支架同时沉浸在一定浓度的多巴胺水溶液中，用Tris-HCl调节溶液的pH值到8.5，与海洋环境相接近(每毫升水中加入2mg多巴胺，10mM Tris-HCl)，反应一定时间后，溶液逐渐由无色变成黑色，这时在钛合金表面就会包覆一层聚多巴胺的外壳，同时也会均匀的黏附一层Fe₃O₄@PDA复合磁性纳米粒子。

5、超声清洗去掉结合不稳固的Fe₃O₄@PDA复合磁性纳米粒子，即可得到磁性纳米粒子(Fe₃O₄)经PDA修饰后的钛合金支架，即Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)，如图5支架的合成示意图所示。

实施例2 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)的制备

1、运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔径600μm、孔柱300μm的3D数字模型。

2、将上述制备参数输入激光3D打印设备(ConceptLaser德国)，该设备最大扫速度为7m/s，建造速度为1-5cm³/h。设置打印层厚，熔融速度，扫描方向，激光光斑间隔，铺粉速度，对于粉末进行熔融，层层堆积成型，然后采用线切割分离样品，热处理释放应力。

实施例3 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)的制备

1、运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔径800μm、孔柱300μm的3D数字模型。

2、将上述制备参数输入激光3D打印设备(ConceptLaser德国)，最大扫速度7m/s，建造速度为1-5cm³/h。设置打印层厚，熔融速度，扫描方向，激光光斑间隔，铺粉速度，对于粉末进行熔融，层层堆积成型，然后采用线切割分离样品，热处理释放应力。

实施例4 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)的表征

1、支架孔隙率的测定

采用改良液体位移法测量钛合金支架的孔隙率。在量筒中置入体积为V₁无水乙醇，将三维人工骨支架材料放入量筒中，Smin后负压抽吸空气，使无水酒精完全充满于支架材料的空隙中，记录此时的体积为V₂，再将材料取出记录这时的酒精体积为V₃。按以下公式计算孔隙率：

孔隙率＝(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100％

2、支架力学性能分析

随机选取实施例1-3中制备的复合磁性钛合金支架3只，采用万能材料实验机(Instron3369,USA)测定支架的压缩力学性能。沿垂直地面长轴方向进行垂直压缩以测量抗压强度，加载速度0.5mm/min，支架材料压扁的最大压力为F(N)，根据公式P＝F/A(A为受压面积)，求得抗压强度。根据公式E＝σ/ε求得弹性模量(σ为应力，ε为应变)。取3个试样结果的平均值作为测量值。表征结果见下表表1：

表1支架的表征

	测量值
		孔柱(μm)	352±46
孔隙率(％)	80.7±4.6
		弹性模量(GPa)	3.4±0.8
抗压强度(MPa)	77.4±3.6

结果显示，本发明制备的支架抗压强度及弹性模量接近正常人骨(正常人骨的弹性模量为0.5-3.5GPa)，有效避免了应力遮挡，有利于更好的融合；高孔隙率，达到80％，更利于骨细胞长入其中。

3、材料表面能谱分析

设置对照组实验，对照组：①空白钛合金支架组(pTi)：实施例1步骤3得到的三维多孔钛合金支架，不包括聚多巴胺外壳和Fe₃O₄磁性纳米粒子。

②PDA组(PDA@pTi)：仅包括聚多巴胺外壳的三维多孔钛合金支架，无Fe₃O₄磁性纳米粒子。

实验组：③Ti-PDA-Fe₃O₄组(Fe₃O₄/PDA@pTi)：实施例1-3中制备的Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架。

使用能谱分析仪(牛津IE250X-Max50)对三组不同涂层的材料表面元素组成进行分析，如图6所示，Fe₃O₄/PDA@pTi相对于pTi而言表面增加了N和Fe元素，单纯PDA@pTi表面仅增加了N元素。另外，从图中的扫描电镜图片可以看出，涂层Fe₃O₄纳米颗粒后的材料微表面粗糙度明显增加，这些有利于成骨细胞的黏附和增殖。

4、材料表面元素分布分析

材料表面元素分布分析结果更为直观，如图7所示，可清晰看到Fe₃O₄/PDA@pTi支架表面均匀分布一层Fe元素，且N元素和O元素相对于PDA@pTi明显增加，这些均可表明在钛合金支架表面形成了一层均匀的Fe₃O₄@PDA涂层。

实施例5 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)亲水性测定

由于Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)表面不规则，为准确测量其亲水性，特制作钛合金复合薄片，表面光滑，表面摩擦到2400目，随机选取钛合金复合薄片3只，采用水接触角测量仪(Dataphysics，Germany)测定薄片的亲水性能。测量过程如下：

5uL去离子水滴于钛合金复合薄片表面，1min后使用水接触角测量仪记录并测量水接触角。取3个试样结果的平均值作为测量结果，如图8所示。

实施例6 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)细胞毒性测定

1、LIVE/DEAD染色试剂盒检测

(1)设置如实施例4中的对照组实验，对照组：空白钛合金支架组(pTi)PDA组(PDA@pTi)，实验组：Ti-PDA-Fe₃O₄组(Fe₃O₄/PDA@pTi)

将浓度为2.5×10⁵/mL的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)(商购)细胞悬液40μL分别接种于：空白钛合金支架组、PDA组、Ti-PDA-Fe₃O₄组中，Basal-MEM培养液中培养(10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，放入37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中，每2-3天换液一次。在培养第7日，取出各组支架后用PBS冲洗。

(2)LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒(Life technologies美国)从冰箱取出，恢复室温。

(3)在20μL的2mM EthD-1原液中(试剂B)加入10mL灭菌PBS，搅拌保证充分混合，从而得到约4μM的EthD-1溶液。

(4)在上述10mL EthD-1溶液中加入5μL的钙黄绿素原液(试剂A)搅拌以保证彻底混合，由此得含2μM钙黄绿素和2μM EthD-1的LIVE/DEAD工作溶液，其DMSO终浓度≤0.1％(对大多数细胞无害)。

(5)150μL上述LIVE/DEAD工作液，加入放有支架的96孔板中，确保液面没过支架，孵育过程应该防止污染和干燥。

(6)在室温下孵育30–45分钟，如果染料浓度高或孵化温度高，可以适当缩短孵育时间。

(7)取出各组支架，送荧光显微镜下观察并采集图像，如图9所示；每组取3个样本,随机在100×视野下取6个ROI(Region ofinterest)区域，通过Image J软件分析各组细胞存活状况。

LIVE/DEAD染色试剂盒检测结果如图10所示，Ti-PDA-Fe₃O₄组细胞存活率最高，细胞毒性最小。

2、CCK-8细胞增殖检测

(1)浓度为2.5×10⁵/mL的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)(商购)细胞悬液40μL分别接种于：空白钛合金支架组、PDA组、Ti-PDA-Fe3O4组中，Basal-MEM培养液中培养(10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，放入37℃、体积分数为5％CO₂饱和湿度培养箱中，每2-3天换液一次。在培养第1、3、7日进行检测，全部过程避光进行。

(2)将CCK-8溶液以1:10的比例与Basal-MEM培养液充分混合，配置完毕后避光待用。

(3)各组支架在细胞培养的第1、3、7日，先弃去培养液，再加入上述CCK-8混合工作液；培养箱内孵育1小时。

(4)将上述96孔板中各组的100μL上清转移至新的96孔板中，避免气泡产生。

(5)酶标仪测定在450nm处的吸光度，测定各孔的OD值并进行计算分析，结果如图11所示，Ti-PDA-Fe₃O₄组细胞毒性最小。

由此可见，Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)可降低钛合金金属支架和PDA包覆的钛合金支架的细胞毒性。

实施例7 Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架(Ti-PDA-Fe₃O₄)体外成骨测定

1、Real-time PCR检测各组支架成骨分化基因

将浓度为2.5×105/mL的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)(商购)细胞悬液40μL分别接种于：空白钛合金支架组、PDA组、Ti-PDA-Fe3O4组中，Basal-MEM培养液中培养(10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，放入37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱中，每2-3天换液一次。在培养第14日，取出各组支架。

(2)对空白钛合金支架组、PDA组、Ti-PDA-Fe₃O₄组人骨髓间充质干细胞分别进行RNA提取，采用TRIZOL(invitrogen)提取试剂，实验操作按产品说明书进行，提取的RNA采用NanoVus Plus分光光度计(GE)和164-5070电泳仪(Bio-Rad)检测RNA纯度、浓度和RNA样品的提取情况。

(3)采用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪，CW2569)按照表2的反转录体系和反转录程序进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。

表2反转录体系和反转录程序

(4)采用SYBR FAST qPCR Kit MasterMix(2×)ABI Prism(KAPA Biosystems)qPCR试剂盒进行扩增，优选5个成果成骨分化标志基因，其mRNA引物均由信生元公司设计合成，具体如表3所示：

表3引物序列

(5)以cDNA稀释液为实时定量PCR模板，反应体系如表3所示，扩增程序如表4所示，实时定量PCR仪器使用StepOne Plus实时定量PCR仪(ABI)，在熔解曲线基本符合要求无非特异性扩增的情况下，参考操作手册，以GAPDH为内参，采用threhold cycle(Ct)方法，通过计算ΔCT，ΔΔCT，2^-ΔΔCt值，获得三组支架中RUNX2、ALP、OCN、OPN、COL-1的相对表达量。

表4 SYBR Green I PCR体系

试剂	加入量
		SYBRFASTQpcrKitMasterMix(2×)	10μL
PrimerF(10μM)	0.5μL
		PrimerR(10μM)	0.5μL
cDNA	2μL
		ROX校正染料	0.5μL
加入灭菌蒸馏水	补齐至20μL

表5 PCR程序

RT-PCR结果如图12所示，Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架组各种成骨因子表达水平显著升高，实验结果表明，磁性支架对细胞分化有明显的促进作用。

2、茜素红染色

(1)浓度为2.5×10⁵/mL的人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)(商购)细胞悬液40μL分别接种于：空白钛合金支架组、PDA组、Ti-PDA-Fe₃O₄组中，Basal-MEM培养液中培养(10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，放入37℃、体积分数为5％CO₂饱和湿度培养箱中，每2-3天换液一次。在培养14日后，取出各组支架。

(2)于24孔板底部细胞进行茜素红染色，称取10mg茜素磺酸钠溶解于10ml蒸馏水中，配置为0.1％的茜素红ARS水溶液，添加氨水至PH值为4.2。

(3)细胞使用4％组织固定液(或10％福尔马林)固定20分钟，然后使用1*PBS清洗3次，然后用去离子水清洗残余离子。

(4)使用步骤(2)配置的1％的茜素红ARS进行染色，室温下孵育10分钟，弃去ARS，加入去离子水清洗。

(5)茜素红染色结果如图13所示，Fe₃O₄@PDA复合磁性钛合金支架组出现明显的红色钙盐结节，表明磁性支架对间充质干细胞钙盐沉积有明显的促进作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 一种3D打印复合磁性金属支架及其应用

<130> P1724

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

catgtccctc ggtatgtccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

actctggctt tgggaagagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tcctgttgac accccaaacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggaaacgcag gatttcccac 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ctcacactcc tcgccctatt g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

cgcctgggtc tcttcactac 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

atctcctagc cccacagacc c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cacactatca cctcggccat c 21

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

tgctcgtgga aatgatggtg 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cctcgctttc cttcctctcc 20

<210> 11

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gtcaaggctg agaacgggaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

aaatgagccc cagccttctc 20

Claims

1.一种3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述复合磁性金属支架包括三维多孔金属支架、聚多巴胺外壳和复合磁性纳米粒子，所述三维多孔金属支架呈三维贯通的多孔网状结构，所述聚多巴胺外壳包覆在所述三维多孔金属支架的表面，所述复合磁性纳米粒子均匀粘附在所述包覆有聚多巴胺外壳的三维多孔金属支架的表面。

2.如权利要求1所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述三维多孔金属支架由正十二面体或菱形十二面体为基本单位，按照一定孔径和孔柱的3D数字模型打印的具有孔孔连通的三维多孔贯通支架。

3.如权利要求2所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述三维多孔金属支架的孔径是300-800μm，孔柱是200-300μm。

4.如权利要求1-3任意一项所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金、纯钛、钴合金或不锈钢。

5.如权利要求4所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金。

6.如权利要求1所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述聚多巴胺外壳的厚度为50-200nm。

7.如权利要求1所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述复合磁性纳米粒子为聚多巴胺修饰的Fe₃O₄纳米颗粒，即Fe₃O₄@PDA；所述复合磁性纳米粒子为壳核结构，其中Fe₃O₄为内核，聚多巴胺为外壳。

8.如权利要求7所述的3D打印复合磁性金属支架，其特征在于，所述聚多巴胺的厚度为50-200nm。

9.如权利要求1-8任意一项所述的3D打印复合磁性金属支架在制备骨缺损修复材料中的应用。