CN101954120B - 一种工程化脂肪组织的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种工程化脂肪组织的制备方法，本发明是在微重力条件下，将间充质干细胞接种到微粒化的生物支架上，并向脂肪细胞方向诱导，在微重力旋转发生器中生长、成熟形成具有活性的工程化脂肪组织；本发明所制备的工程化脂肪组织不仅与天然脂肪结构相似，具有一定的弹性和韧性，其形状和大小能根据具体需求制备，大量生产、长期贮存；且适于注射，便于临床应用，适用于大面积软组织缺损的手术修复；其在体内可以继续发育为成熟的脂肪组织，易于血管长入；在临床治疗中可提高脂肪移植成功率，可用于凹陷畸形的修复、美容充填、软组织功能重建等；尤其在美容充填中可促进外形恢复、防止液化坏死。
Description
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种工程化脂肪组织的制备方法。
背景技术
每年全世界有数百万例因创伤、肿瘤切除术和先天性缺陷导致的软组织缺损患者，需要通过手术进行修复重建。这些缺损常因脂肪组织的缺失而导致正常组织的形态改变和功能障碍。随着对功能性恢复的要求和美观考虑，对一些深部软组织的缺损需要塑型，使患者的心理创伤降到最低。
目前软组织重建常用的方法包括各种组织瓣移植或人工合成替代物的植入，但目前尚无一种填充材料可以满足所有的临床需要。利用自体脂肪组织移植(游离移植或真皮脂肪瓣移植)修复软组织缺损的历史比较久远，也有不少临床应用的报告，但因游离移植的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作复杂、不易塑形，效果并不理想。随着组织工程学技术的发展，构建工程化的脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一。
工程化脂肪组织是应用正常脂肪组织的活细胞或可向脂肪细胞分化的干细胞，在体外进行大规模培养，再接种到三维结构的生物相容性支架上培养，然后将其从体外培养环境转移至体内，能促进与受区细胞整合和血管长入；最终，工程化脂肪组织中的支架材料在降解过程中逐步被宿主健康的软组织取代。为使工程化脂肪组织成功地应用于临床上的软组织重建，需要处理好工程化脂肪组织构建程序中的各环节，包括种子细胞和支架材料的选择、细胞培养的环境和转移方式等。
种子细胞的选择：应用前脂肪细胞(preadi pocyte)和成熟脂肪细胞(Mature adipocyte)作为种子细胞构建工程化脂肪组织来修复组织缺损，存在以下缺点：在移植后由于新生血管不能快速长入工程化脂肪组织中心区域，成熟脂肪细胞无法得到充足的血供，很快液化坏死，使组织难以长期存活，常常导致移植的脂肪组织被吸收。成熟的脂肪细胞在培养过程中处于分化终末期，其增殖能力有限，不能轻易地扩增。前脂肪细胞，虽然容易培养、扩增，而且能分化为成熟的脂肪细胞，但是前脂肪细胞经多次传代后，也会丧失分化能力。干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，能产生表现型和基因型与自己完全相同的子细胞，同时还能分化为祖细胞；本发明人研究认为，应用干细胞作为工程化脂肪组织的种子细胞是理想的选择。
支架材料在组织工程组织的构建中占有举足轻重的地位。理想的三维支架应具有临时细胞外基质(ECM)的作用，为脂肪组织工程种子细胞提供附着、增殖、分化和营养代谢的场所。细胞以其附着的三维支架为微环境，发展形成新的脂肪组织。现已开发有许多不同种类的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸(PGA)、聚对苯二甲酸乙酯(PET)、多聚共乳乙交酯酸(PLGA)和聚四氟乙烯(PTEF)，以及天然衍生材料，例如胶原，透明质酸衍生物，基质胶和纤维蛋白等也已得到应用。在设计支架时需要考虑：支架的机械性能、降解特性、免疫原性、细胞对材料的反应性、临床应用是否易于操作并能减少成本等。可用于工程化脂肪组织构建的支架材料很多，合适的支架材料选择，应具有适合细胞的黏附、增殖和分化，良好的生物相容性，可降解及易于操作的特性。
美国航天局(NASA)制备的微重力旋转发生器(rotary cell culturesysterm RCCS)是采用水平旋转、无气泡的膜扩散式气体交换的细胞培养系统。该系统中细胞通过膜式气体交换器完成吸氧和排出CO2，任何气泡都会被清除，消除了旋涡对细胞生长的影响；细胞和微载体在水平的旋转式细胞培养容器内产生一个均匀的、极低剪切力的液体悬浮轨道，细胞可在微载体表面均匀生长，随着细胞的增殖，可调节旋转的速度来抵偿沉降速率；由于该系统没有推进器、空气升液器，细胞颗粒不会与容器壁或任何易致伤的物体相碰，故没有破坏性的剪切力；RCCS最重要的优势是可以模拟微重力环境，对细胞的生物学行为产生一定的影响。微重力条件对细胞的增殖和分化有着不同的作用，可以促进细胞的增殖，影响间充质干细胞的成骨和成软骨分化。本发明在研究中发现，微重力也有利于脂肪组织的形成。
目前的组织工程脂肪是采用各种材料结合脂肪前体细胞或是干细胞，通过诱导后在体内形成脂肪。其存在以下缺点：血管化不足，体内移植容易液化坏死；诱导时机不确切，体外诱导时间太长；不能够大规模生产；可注射的种类较少。因此研发新的制备方法已成为脂肪组织工程的发展趋势。
经检索，未见有与本发明相同的工程化脂肪组织制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种工程化脂肪组织的制备方法，使所获得的工程化脂肪组织具有粒径大小可调和可注射的优点，适用于软组织充填、修复软组织缺损造成的凹陷畸形、美容塑形，快速成活形成脂肪组织。
本发明所提出的工程化脂肪组织的制备方法，其特征在于，在微重力条件下，将间充质干细胞接种到微粒化的生物支架材料上，并向脂肪细胞方向诱导，在微重力旋转发生器中生长、成熟形成具有活性的工程化脂肪组织；所述的微粒化生物支架材料是明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、脱细胞真皮、脱细胞猪小肠粘膜下层的任一种或是任几种的组合；所述的微粒化生物支架材料粒径为20～1000μm。所述的间充质干细胞为可向脂肪细胞分化的间充质干细胞，是骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙髓干细胞的任一种。
本发明所述的工程化脂肪组织的制备方法，包括有微粒化生物支架的制备、培养基的配制、以及工程化脂肪组织的三维培养，具体步骤包括：
步骤一.选择微粒化生物支架：微粒化生物支架材料可以选择已商品化的产品或自行制备；其材质为机体可接受的生物可降解材料，包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、脱细胞真皮、脱细胞猪小肠粘膜下层的任一种或是几种的组合；微粒化生物支架材料粒径为20～1000μm，是空心球状、或实心球状、或多孔微粒状结构的任一种；
步骤二.配制培养基：按9∶1的体积比将α-MEM商用培养液与胎牛血清混合为基础液；按500ml基础液标准加入碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基；
诱导培养基：在基础培养基中加入10～200μM地塞米松，0.1～1mM异丁基甲基黄嘌呤，100～300μM吲哚美辛，10～100μg/ml胰岛素；
维持培养基：在基础培养基中加有10～100μg/ml胰岛素；
步骤三.细胞的获取：将原代间充质干细胞按20～200个细胞/cm2接种到细胞培养板上，用α-MEM商用培养液与胎牛血清按4∶1的体积比混合的培养液，在体外经过扩增培养10～15天，每3天换液一次；间充质干细胞呈克隆样生长，而掺杂其中的非间充质干细胞由于接种密度低，其生长受到抑制，从而获取多克隆的干细胞；将多克隆的间充质干细胞经过传代培养，获取第3～5代的间充质干细胞；
步骤四.将获取的间充质干细胞与微粒化生物支架重量按106～107个细胞/g的比例加入微重力旋转发生器中，培养液为基础培养基；接种后静置0.5～1小时，旋转5～15分钟后再静置，如此静置旋转反复3～4次后，开始旋转培养，转速15转/分；
步骤五.在旋转培养过程中，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；培养3～4天后，更换培养液为维持培养基；再培养3天后，更换培养液为诱导培养基，继续培养3～4天，完成工程化脂肪组织的制备。所形成的脂肪，细胞围绕微粒化生物支架生长，细胞内有大量脂滴堆积。
本发明采用可向脂肪细胞分化的间充质干细胞结合可降解的微粒化生物支架材料，在微重力条件下向脂肪细胞方向诱导分化，获得在体内可发育再生的微粒化脂肪组织。所制备的工程化脂肪组织不仅与天然脂肪结构相似，具有一定的弹性和韧性，其形状和大小能根据具体需求制备，大量生产、长期贮存；且适于1ml注射器注射，便于临床应用，适用于大面积软组织缺损的手术修复；其在体内可以继续发育为成熟的脂肪组织，易于血管长入；在临床治疗中可提高脂肪移植成功率，主要功能有：用于凹陷畸形的修复(如颞部、颊部凹陷)，美容充填，软组织功能重建等；尤其在美容充填中，本发明制备的工程化脂肪组织可促进外形恢复、防止液化坏死。
本发明方法中的间充质干细胞在微粒化生物支架材料表面呈三维方向生长，且随着材料的不同可向微粒中心生长，所形成的脂肪结构与天然脂肪相似；在培养过程中，诱导时间短，启动了间充质干细胞向脂肪分化的信号通路，但又不在体外达到终末分化，将该工程化脂肪组织植入体内，可防止脂肪组织的液化，在体内随着微粒化生物支架材料的降解，最终形成与天然脂肪类似的结构。
附图及其说明
附图1为本发明实例1所制备工程化脂肪组织的照片，图A为相差显微镜观察间充质干细胞在明胶微球表面生长的照片，可以看出脂肪干细胞在旋转培养系统中可以很好的与明胶微球黏附并在其表面生长；图B为激光共聚焦观察脂肪间充质干细胞在微球上生长的照片，可以看出通过细胞膜和细胞核两种荧光染色可见，脂肪干细胞均匀分布在明胶微球的表面；图C为扫描电镜观察脂肪干细胞在明胶微球表面生长的照片，可看出脂肪干细胞在明胶微球上黏附并伸展。附图2为本发明实例1所制备的工程化脂肪组织移植动物体内生长情况的照片，图A为未经向脂肪细胞方向诱导分化的脂肪干细胞与微球移植动物体内8周的照片；图B为经向脂肪细胞方向诱导分化的脂肪干细胞与微球移植动物体内8周的照片，与图A相比没有明显的差别；图C为未经向脂肪细胞方向诱导分化的脂肪干细胞与微球移植动物体内8周后油红0染色的组织学照片，可见只有少量的脂滴形成；图D为经向脂肪细胞方向诱导分化的脂肪干细胞与微球移植动物体内8周后油红0染色的组织学照片，可见大量的脂滴形成，与天然脂肪组织类似。
具体实施方式
以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实例1、
步骤一.微粒化生物支架选择明胶为材料，制备成粒径100～150μm的实心球状结构；方法参考(Adipose tissue engineering based on humanpreadipocytes combined with gelatin microspheres containing basicfibroblast growth factor.Biomaterials.2003 Jun；24(14)：2513-21.)。
步骤二.将α-MEM商用培养液与胎牛血清按9∶1的体积比混合为基础液；按500ml基础液标准加入碱性成纤维细胞生长因子10ng，腺嘌呤15mg，转铁蛋白5mg，维生素C 30mg，制备成基础培养基；
再用基础培养基配制以下培养基：
诱导培养基：在基础培养基中加入100μM地塞米松(dexamethasone，美国Sigma公司)，0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美国Sigma公司)，200μM吲哚美辛(indomethasone)和50μg/ml胰岛素；
维持培养基：在基础培养基中加入50μg/ml胰岛素；
步骤三.细胞的获取：将自体或者异体来源的脂肪间充质干细胞，在体外按200个细胞/cm2接种到细胞培养板上，用α-MEM商用培养液与胎牛血清按4∶1体积比混合的培养液，经过扩增培养10天，每3天换液一次；获得多克隆干细胞；经过传代培养，获取第3～5代的脂肪间充质干细胞；
步骤四.将体外培养的脂肪间充质干细胞与微粒化生物支架按106～107个/g的比例加至微重力旋转发生器(美国国家航空航天局(NASA)旋转式细胞培养系统)中，加入基础培养基，静置0.5小时，旋转15分钟后再静置，如此静置旋转反复4次，再以15转/分的转速旋转培养；
步骤五.在旋转培养过程中，每2天用基础培养基排空在旋转培养过程中产生的气泡；培养3天后，更换培养液为维持培养基；再培养3天后，更换培养液为诱导培养基，继续培养4天，则完成工程化脂肪组织的制备。
所形成的微粒化脂肪组织，细胞围绕微粒化生物支架生长，细胞内有大量脂滴堆积(参见附图1)；其适用于颜面部微小软组织注射充填美容。
实例2、
步骤一.微粒化生物支架选择脱细胞真皮基质为材料，制备成粒径为300～800μm的多孔球状结构；方法参考(Expansion and delivery of humanfibroblasts on micronized acellular dermal matrix for skinregeneration.Biomaterials.2009May；30(14)：2666-74)；
步骤二.将α-MEM商用培养液与胎牛血清按9∶1的体积比混合为基础液；按500ml基础液标准加入碱性成纤维细胞生长因子50ng，腺嘌呤12mg，转铁蛋白10mg，维生素C 10mg，制备成基础培养基；
再用基础培养基配制以下培养基：
诱导培养基：在基础培养基中加入10μM地塞米松(dexamethasone，美国Sigma公司)，1mM异丁基甲基黄嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美国Sigma公司)，100μM吲哚美辛(indomethasone)和10μg/ml胰岛素；
维持培养基：在基础培养基中加入10μg/ml胰岛素；
步骤三.细胞的获取：将自体或者异体来源的骨髓间充质干细胞，在体外按60个细胞/cm2接种到细胞培养板上，用α-MEM商用培养液与胎牛血清按4∶1体积比混合的培养液，经过扩增培养，培养15天，每3天换液一次；获得多克隆干细胞；经过传代培养，获取第3～5代的脂肪间充质干细胞；
步骤四.将体外培养的脂肪间充质干细胞与微粒化生物支架按106～107个/g的比例加至微重力旋转发生器中，加入基础培养基，静置0.5小时，旋转10分钟后再静置，如此静置旋转反复4次，再以15转/分的转速旋转培养；
步骤五.在旋转培养过程中，每2天用基础培养基排空在旋转培养过程中产生的气泡；培养4天后，更换培养液为维持培养基；再培养3天后，更换培养液为诱导培养基，继续培养4天，则完成工程化脂肪组织的制备。
所形成的微粒化脂肪组织，细胞围绕微粒化生物支架生长，细胞内有大量脂滴堆积。其适用于大面积软组织缺损的充填修复。
Claims (1)
1.一种工程化脂肪组织的制备方法，包括有微粒化生物支架的制备，其特征在于，在微重力条件下，将间充质干细胞接种到微粒化的生物支架上，并向脂肪细胞方向诱导，在微重力旋转发生器中生长、成熟形成具有活性的工程化脂肪组织；所述的微粒化生物支架材料为明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、脱细胞真皮、脱细胞猪小肠粘膜下层的任一种或是任几种的组合，其粒径为20～1000μm；所述的间充质干细胞为可向脂肪细胞分化的间充质干细胞，是骨髓间充质干细胞、脂肪源性间充质干细胞、牙龈间充质干细胞、牙髓干细胞的任一种；具体步骤包括：
步骤一.选择微粒化生物支架：微粒化生物支架材料为明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、脱细胞真皮、脱细胞猪小肠粘膜下层的任一种或是几种的组合；微粒化生物支架为空心球状、或实心球状、或多孔微粒状结构的任一种；
步骤二.配制培养基：按9∶1的体积比将α-MEM商用培养液与胎牛血清混合为基础液；按500ml基础液标准加入碱性成纤维细胞生长因子2～50ng，腺嘌呤12～17mg，转铁蛋白1～10mg，维生素C5～30mg，制备成基础培养基；再用基础培养基配制以下培养基；
诱导培养基：在基础培养基中加入10～200μM地塞米松，0.1～1mM异丁基甲基黄嘌呤，100～300μM吲哚美辛，10～100μg/ml胰岛素；
维持培养基：在基础培养基中加有10～100μg/ml胰岛素；
步骤三.细胞的获取：将原代间充质干细胞按20～200个细胞/cm2接种 到细胞培养板上，用α-MEM商用培养液与胎牛血清按4∶1的体积比混合的培养液，在体外经过扩增培养10～15天，每3天换液一次；将多克隆的间充质干细胞经过传代培养，获取第3～5代的间充质干细胞；
步骤四.将获取的间充质干细胞与微粒化生物支架重量按106～107个细胞/g的比例加入微重力旋转发生器中，培养液为基础培养基；接种后静置0.5～1小时，旋转5～15分钟后再静置，如此静置旋转反复3～4次后，开始旋转培养，转速15转/分；
步骤五.在旋转培养过程中，每2天排空在旋转培养过程中产生的气泡；培养3～4天后，更换培养液为维持培养基；再培养3天后，更换培养液为诱导培养基，继续培养3～4天，完成工程化脂肪组织的制备。
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