CN101492655B

CN101492655B - 一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法

Info

Publication number: CN101492655B
Application number: CN2009100797268A
Authority: CN
Inventors: 姚睿; 颜永年; 张人佶; 王小红; 林峰; 栾杰; 熊卓; 隋少春; 张磊; 卢清萍
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2009-03-09
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2029-03-09
Also published as: CN101492655A

Abstract

本发明涉及一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法。本发明所述的血管化脂肪组织是模仿天然脂肪组织的结构，将脂肪细胞包裹在微囊中，与血管组织实现分区，其构建方法包括：1)脂肪区的构建；2)血管成分的制备；3)血管化脂肪组织的构建：i)将生长因子缓释微球、脂肪细胞囊与基质材料混合，作为主体材料，将平滑肌细胞作为通道材料，构建有贯通通道的三维结构体；ii)将三维结构体进行脉动体外培养，并以内皮细胞的悬液灌流，使内皮细胞附着在通道的内壁，形成外壁为平滑肌细胞、内壁为内皮细胞的血管组织。根据本发明的构建方法，可得到具有脂肪和血管分区分布、分级血管结构、可在体内长期稳定存在的脂肪组织。

Description

一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是涉及一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法。

背景技术

每年全世界有数百万例患者，因为创伤、肿瘤切除术和先天性缺陷导致的软组织和乳房缺损，需要通过手术进行修复重建，其中由于乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率高达10％～15％，并且还呈逐年上升和年轻化的趋势，肿瘤切除造成的软组织和乳房缺损数量最多。据美国矫形外科医师协会报道，2004年全世界有超过500万人实行了乳房重建手术，其中有400万是由于肿瘤切除。。

一般认为，理想的乳房填充材料应该与乳腺组织有相似的柔软性、相同的渗透压、稳定的理化性能、良好的生物相容性、不致癌、不致敏、不致畸、不钙化等。目前较普遍使用的乳房填充及再造材料包括医用材料和自体移植物两大类。医用材料又包括硅胶、聚丙烯酰胺凝胶、三酰甘油(甘油三酯)、透明质酸等植入型假体和液体石蜡、凡士林等注射用混合物。目前的研究表明使用这些材料易出现假体破裂或渗漏、炎症反应、肉芽肿、包膜挛缩、假体移位、感染、蒙道尔病等并发症，安全性受到很大的质疑。以硅胶假体为例，1992年美国食品与药物管理局禁止了所有硅胶假体的使用。

自体移植物包括注射型自体脂肪颗粒、真皮-脂肪游离组织和带蒂真皮-脂肪瓣等。针对小范围及小体积的缺损，自体脂肪游离移植是目前临床经常使用的一种方案，其中注射型自体脂肪颗粒多来源于自体脂肪组织的抽提。此方法的优点是生物相容性好，组织来源丰富、易于塑形、不会引起免疫排异等反应；缺点是由于注入到乳房内的脂肪颗粒不能很好地建立起血液供应系统，当大量脂肪堆集在一起，会因供血不足导致脂肪细胞坏死、溶解、吸收，极易引发感染、血肿、变形、疼痛、硬结、囊肿、坏死等后遗症。研究发现约有50％～60％的脂肪颗粒被吸收，存活下来的组织也逐渐被纤维化或钙化，效果不持久，常需要多次注射维持形状。

针对大体积的软组织缺损，尤其是乳房肿瘤切除术后的修复，目前多采用转移下腹部皮瓣的手术治疗方案，通过显微外科血管吻合技术移植游离的肌皮瓣以达到隆乳目的，其外形逼真、质地好、易于塑形，血运系统良好，但给供区不可避免地造成创伤和瘢痕，引起功能障碍，如局部肌肉神经萎缩、腹部软弱和形成腹壁疝等，而且移植后吸收明显，效果不能持久，尤其是当带蒂组织移植体的蒂部扭转或受压时可出现移植组织坏死等不良反应。患者常常难以接受此办法，移植物供体受到相应的限制。

目前，应用组织工程学原理来构建脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一。

在种子细胞研究方面，由于成体脂肪细胞(个大、壁薄、内有脂肪颗粒)的不增殖性和易受损伤性，人们将兴趣越来越多的转向具有特定分化潜能，良好自我更新和扩增能力的干细胞。脂肪干细胞(adipose derived adult stem cells)已被证实能向脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞，神经细胞及成骨细胞等多个方向定向转化。而自体脂肪干细胞具有可供取材的脂肪组织来源丰富，抽取方便，可反复获得，操作损伤小，无免疫排异反应，细胞容易培养，增殖速度很快等优点，已被越来越多的人所接受。前脂肪细胞是一种类成纤维细胞，能够增殖并特异性向脂肪细胞分化，可从经酶消化的脂肪组织或皮下脂肪抽吸物中分离而来，对外界机械损伤的抵抗力较强。用普通的细胞培养方法就可以生长，并能够在体外扩增及分化，目前脂肪组织工程的研究也主要集中在脂肪干细胞和前脂肪细胞。

在支架材料方面，脂肪族聚酯类生物降解高分子中的聚乙醇酸(polyglyclic aicd)、聚乳酸(polylactic acid)及两者的共聚物(polylacticacid/polyglyclic aicd copolymers)、胶原等已用于动物实验。Patrick等将前脂肪细胞接种到PLGA支架后证明可生成脂肪组织。但存在的问题是：一方面常用的合成高分子材料相对于乳房组织显得太硬，另一方面复合细胞的可降解高分子材料同样会被机体吸收，难以长期保持稳定。Patrick等报道的复合前脂肪细胞的PLGA结构体在体内5个月被彻底吸收。胶原水凝胶/细胞复合体则在3周内体积降解到原来的30％。也有人对藻酸盐及透明质酸凝胶进行过研究，Mooney和其同事用RGD(arginine-glycine-aspartic acid，三种氨基酸组成的细胞识别肽段)制成藻酸盐，并将其注入大鼠模型体内，观察脂肪组织的增长、生物相容性等，效果仍不容乐观。同注射型脂肪颗粒一样，材料/细胞被降解、吸收，三维结构不稳定的主要因素仍然是血液供应不足。

综上所述，用自体组织或细胞移植治疗软组织缺损的方法有其先天不可克服的问题，主要是吸收和供给区创伤等；而用组织工程的方法修复脂肪或乳房缺损虽然是目前的研究热点，但还未取得突破性的进展，主要问题是由于供血不足引起的基质材料的降解和吸收。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法。

本发明的另一目的是提供构建血管化脂肪组织的过程中的设备。

本发明所述的基于分区的血管化脂肪组织是模仿天然脂肪组织的结构，将脂肪组织包裹在微囊中，与血管组织实现分区。

本发明所述的基于分区的血管化脂肪组织的构建方法为：

1)脂肪区的构建：提取脂肪干细胞，将脂肪干细胞先制成干细胞微胶囊，然后将脂肪干细胞诱导培养成脂肪细胞，得到材料包裹的高浓度脂肪细胞团簇；

2)血管成分的制备：i)将脂肪干细胞分别诱导成平滑肌细胞和内皮细胞；ii)将血管化生长因子制成生长因子缓释微球；

3)血管化脂肪组织的构建：i)将生长因子缓释微球、脂肪细胞囊与基质材料混合，作为主体材料，将平滑肌细胞作为通道材料，构建有贯通通道的三维结构体；ii)将三维结构体进行脉动体外培养，并以内皮细胞的悬液灌流，使内皮细胞附着在通道的内壁，形成外壁为平滑肌细胞、内壁为内皮细胞的血管组织；iii)将三维结构体继续进行脉动体外培养，生长因子缓释微球逐渐释放出血管化生长因子以促进毛细血管的生长，得到产生毛细血管的血管化脂肪组织。

其中，步骤1)所述提取脂肪细胞可采用手术或脂肪抽吸术等本领域公知技术进行；所述将脂肪干细胞制成干细胞微胶囊如下进行：将脂肪干细胞与海藻酸钠基水凝胶材料混合后滴入固化液中，制成干细胞微胶囊；同样，步骤2)中所述的将血管化生长因子制成生长因子缓释微球也可以类似进行：将血管化生长因子与海藻酸钠混合后滴入固化液中制成。

其中海藻酸钠基水凝胶材料可以是海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶中的一种；所述固化液为含二价阳离子的盐溶液，如氯化钙、氯化钡等，优选氯化钙溶液。

所述海藻酸钠基水凝胶材料的使用浓度为0.1-10％，其中明胶或胶原的浓度为0.01-5％，氯化钙溶液优选为100mM。

所述干细胞微胶囊的粒径为100μm～500μm；所述生长因子缓释微球的粒径为20μm～50μm。

所述血管化生长因子为血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF，Epidermal GrowthFactor)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β1)和血管生成素-1(angiopoietin-1)等血管相关生长因子。

特别的，可采用非接触式高压静电发生法来制备干细胞微胶囊和生长因子缓释微球，所述非接触式高压静电发生法制备微胶囊或微球的原理图见图1。其实质是以静电力作用于微滴，抵抗液体的表面张力作用，将液体离散成球形液滴，可以通过改变电压、推进速度及反应时间来调节微囊的直径和通透性。

基于以上原理，本发明还提供一种非接触式高压静电收集器，包括：

高压静电发生装置：提供高压电场，施加电场力于正极的成囊液，使其呈球状滴入负极的固化液中；

液体推进装置：将成囊液推入所述高压电场的正极；以及

收集装置：置于负极的固化液将球状液滴固化，收集固化的液滴。

其中收集装置(见图2)可由前面板可拆卸、上方板开通孔的盒体4，在通孔上设置的位于盒体外部的可拆卸套筒1和同轴套筒2，所述同轴套筒2上设置有电源正极接口，设置在盒体4内部的与同轴套筒2相对的负极基座3(连接电源负极)，以及置于负极基座3的固化液构成。同轴套筒2可放置针头，可拆卸套筒1固定成囊液输送管，并辅助调整针头高度并确保针头与固化液的液面垂直。使用时，高压静电发生装置的正极和负极分别连接在可拆卸套筒1和负极基座3上，负极基座3上放置盛有固化液的培养皿；将成囊液体置于推进装置中，通过管道推到针头，在电场力和重力的双重作用下，克服液体的黏滞力和表面张力，形成极小的圆球状液滴，球状液滴落入固化液中固化成微胶珠。

该非接触式高压静电收集器可广泛用于各种细胞、生长因子的微胶囊化以制备微胶囊，载体材料主要是海藻酸钠基的生物材料，也可用于制备海藻酸钠基的生物材料微球，不限于本发明提出的用途。

本发明所述的高压静电发生装置可采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压0～40kV；成囊液推进装置可采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，推进速度0～90ml/min，可采用1～60mL注射器。

本发明所述的将脂肪干细胞诱导成脂肪细胞，平滑肌细胞和内皮细胞是本领域公知的方法，将脂肪干细胞在相应的诱导剂的作用下进行培养，成脂诱导剂有多种组成，如：高糖DMEM，10％胎牛血清，0.5mmol/L IBMX，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，1％青链霉素原液等；将脂肪干细胞诱导成内皮细胞的内皮诱导剂也有多种组成，如低糖DMEM，2％胎牛血清，2％马血清，10ng/mL VEGF，2ng/mLbFGF(R&D系统)，1×ITS(Sigma)，0.61g/L尼克酰胺，0.1μmol/L地塞米松，2g/L BSA，0.1g/L鸟氨酸，0.03g/L脯氨酸，0.73g/L谷氨酰胺，1g/L葡萄糖，2g/L半乳糖及适量微量元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰)等；将脂肪干细胞诱导成内皮细胞的平滑肌诱导剂也有多种组成，例如：含5ng/mL TGF-β1和50ng/mLPDGF-BB的M-199诱导液。

本发明所述的基质材料是明胶，海藻酸钠，胶原，纤维蛋白原中的一种或多种。

所述步骤3)的步骤i)的构建可采用铸模法或挤出法进行，所述挤出法优选采用三维受控组装设备进行，具体的说，可采用下述一种方式进行：

a)铸模法：采用溶芯技术(专利公开号：CN1654028)制备内部贯通的二级血管支架，第一级模拟小血管的生物学结构，内径为1000μm～300μm，第二级结构模拟微血管，内径为300μm～100μm，进行体外脉动培养，循环液为平滑肌细胞悬液，使平滑肌细胞均匀附着在血管支架通道内形成多层平滑肌细胞；将脂肪细胞微胶囊、生长因子微球与基质均匀混合，采用铸模后凝胶化的方法成型三维结构体；然后将已形成平滑肌细胞层的分级血管支架定位组装在三维结构体中，构建出具有贯通通道的三维结构体；

b)将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊和离散的平滑肌细胞与基质材料均匀混合，降温凝胶化；通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，用单喷头三维成型机(专利公开号： CN1257762)在计算机的控制下将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊、离散平滑肌细胞与基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形，小血管和微血管的通道在成形时自然形成；

c)将生长因子缓释微球和脂肪细胞微胶囊与基质材料均匀混合，并降温凝胶化；将离散平滑肌细胞与基质材料混合并降温凝胶化。通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，用第二代双喷头细胞组装机(专利公开号：CN1820791)在计算机的控制下分别将生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体和平滑肌细胞/基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形；平滑肌细胞/基质材料混合体构成分级血管结构通道管壁，生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体构成结构体的主体部分，形成具有多层平滑肌细胞管道结构的类脂肪组织，小血管和微血管的通道在成形时自然形成。

在构建过程中，生长因子缓释微球、脂肪细胞囊和基质材料的加入量是本领域人员的公知常识，如对基质材料来说，由于不是天然脂肪组织的成分，移植后需要由机体降解，所以在构建时，只要加入量能够满足成型要求即可；脂肪细胞囊的加入量根据特定组织的要求而定，如构建乳房组织时，脂肪细胞囊和基质材料的体积比优选2∶1～1∶2，平滑肌细胞的加入量为以基质材料计10⁵个/ml～10⁷个/ml。

上述构建方式中，a)，b)，c)可根据需要构建两个半球，如图3所示，然后可将两个半球按图3所示的方式组合成整体后进行脉动培养；当然也可以根据需要构建成特定的形状，然后进行体外脉动培养。

本发明所述的脉动体外培养采用脉动生物反应器进行，所述脉动反应器主要包括培养液循环部分和压力检测部分；培养液循环部分：为脂肪组织提供循环培养液；由培养液供应装置、液体连续推进装置和脂肪组织培养装置相互连接组成，液体连续推进装置将源于培养液供应装置的培养液推入脂肪组织，脂肪组织流出的培养液流回培养液供应装置，形成循环；压力检测部分：是检测脂肪组织培养装置中培养液的压力的压力表。

为保证与机体环境一致，还包括脉动部分：液体间歇推进装置的进液口连接培养液供应装置，出液口连接脂肪组织培养装置，推出的液体与循环培养液一起循环，为脂肪组织提供培养液的脉动流；间歇式液体推进装置是上述液体推进装置的有效补充，提供具有明显脉动的培养液。如需要，只采用连续式推进装置也可以进行培养。

该脉动生物反应器可广泛用于各种人造组织的体外培养，不限于本发明提出的用途。简单的脉动反应器如图4所示，培养液循环部分由培养液瓶、蠕动泵和培养盒构成，各部分由硅胶管连接，培养液经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒(内置人造脂肪组织)，然后经硅胶管流回培养液瓶；导轨滑块、注射器和直流电机构成脉动部分，直流电机与导轨滑块连接推动注射器活塞往复运动，注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接，由此形成脉动流；压力表设置在培养盒上，检测置于培养盒内的脂肪组织内的培养液压力。

本发明所述的脉动生物反应器可选用工作电压0-24V，流速0-120ml/min的蠕动泵；选用工作电压0-12V、转速1-100r/min的直流电机；选用硅胶管作为管路；各部件，如直流电机、导杆、滑块导轨、注射器采用相应的支架固定在底板上，其电源可选择能满足脉动生物反应器蠕动泵和直流电机的需要的0-24V直流电压的可调节电源。

根据脉动培养要求可在0-24V调节蠕动泵工作电压，线性控制脉动培养过程中培养基的流速在0-120ml/min范围内变化；

在0-12V范围内调节直流电机，线性控制脉动培养过程中脉动频率在0-100次/min的范围内变化。

如上所述，本发明的具体实施方法有以下三种：

实施方法1：其操作流程见图5。采用抽脂手术获得病人自体脂肪干细胞，常规培养增殖至足够数量。取出一部分脂肪干细胞采用非接触式高压静电发生器(见图2)制成固态脂肪干细胞微胶囊，囊芯材料为海藻酸钠基水凝胶材料，如海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶等，固化液为氯化钙溶液。对脂肪干细胞微胶囊进行成脂培养，形成脂肪细胞团簇。

对部分脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞，而部分脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导，然后分别制备成悬液备用。采用非接触式高压静电发生器(见图2)制备血管化生长因子(如bFGF，VEGF等)缓释微球。

采用溶芯技术(专利公开号：CN1654028)制备两套内部贯通的二级血管支架，如图3所示。第一级模拟小血管的生物学结构，内径为1000μm～300μm，第二级结构模拟微血管，内径为300μm～100μm，用脉动生物反应器进行培养和训练，循环液为平滑肌细胞悬液，使平滑肌细胞均匀附着在血管支架通道内形成多层平滑肌细胞。

将脂肪细胞微胶囊、生长因子微球与基质材料(如明胶、海藻酸钠、胶原、纤维蛋白原等)均匀混合，采用铸模后凝胶化的方法成型特定形状的水凝胶结构体。将已形成平滑肌细胞层的两套分级血管支架按图3所示的方式定位组装在结构体中，并对整体结构脉动培养训练，循环液为内皮细胞悬液，即在结构体的血管支架最内层形成内皮细胞层，高度仿生天然脂肪组织和血管的生理结构；继续脉动培养，随着血管化生长因子的缓释，内皮细胞向基质材料中的渗入，调控毛细血管网的发生，形成具有小血管/微血管/毛细血管网的自体脂肪组织。该方法中，毛细血管网的发生也可移植到体内后进行。

实施方法2：其操作流程见图6。采用抽脂手术获得病人自体脂肪干细胞，常规培养增殖至足够数量。取出一部分脂肪干细胞采用非接触式高压静电发生器(见图2)制成固态细胞微胶囊，囊芯材料为海藻酸钠基水凝胶材料，如海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶等，固化液为氯化钙溶液。对脂肪干细胞微胶囊进行成脂培养，形成脂肪细胞团簇。

对部分脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞，而部分脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导。采用非接触式高压静电发生器(见图2)制备血管化生长因子(如bFGF，VEGF等)缓释微球。

将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊和离散的平滑肌细胞与基质材料均匀混合后装入一次性针管并降温凝胶化。通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，将结构体的三维造型模型用STL文件输出，用单喷头三维成型机(专利公开号：CN1257762)的计算机对该文件分层解析，在计算机的控制下将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊、离散平滑肌细胞与基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形，分别构建两个半球，小血管和微血管的通道在成形时自然形成。

将两个半球按图3所示管道方式组合成整体后用脉动反应器培养和训练，循环液为内皮细胞悬液，即在结构体的血管通道最内层形成内皮细胞层，高度仿生天然脂肪组织和血管的生理结构。继续脉动培养，随着血管化生长因子的缓释，内皮细胞向基质材料中的渗入，可调控毛细血管网的发生，即形成具有小血管/微血管/毛细血管网的自体脂肪组织。进行自体移植可进行乳房肿瘤切除术后的脂肪组织重建。毛细血管网发生也可在体内进行。

实施方法3：其操作流程见图7。采用抽脂手术获得病人自体脂肪干细胞，常规培养增殖至足够数量。取出一部分脂肪干细胞采用自制非接触式高压静电发生器(见图6)制成固态细胞微胶囊，囊芯材料为海藻酸钠基水凝胶材料，如海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶等，固化液为氯化钙溶液。对脂肪干细胞微胶囊进行成脂培养，形成脂肪细胞团簇。

对部分脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞，而部分脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导。采用非接触式高压静电发生器(见图 3)制备血管化生长因子(如bFGF，VEGF等)缓释微球。

将生长因子缓释微球和脂肪细胞微胶囊与基质材料均匀混合后装入一次性针管并降温凝胶化；将离散平滑肌细胞与基质材料混合后装入另一支一次性针管并降温凝胶化。通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，将结构体的三维造型模型用STL文件输出，用第二代双喷头细胞组装机(专利公开号：CN1820791)的计算机对该文件分层解析，在计算机的控制下分别将生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体和平滑肌细胞/基质材料混合体从针管中以层层叠加的方式挤出堆积成形。平滑肌细胞/基质材料混合体构成分级血管结构通道管壁，生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体构成结构体的主体部分，形成具有多层平滑肌细胞管道结构的类脂肪组织。小血管和微血管的通道在成形时自然形成，可分别构建两个半球，将两个半球按图3所示管道方式组合成整体后用脉动反应器培养和训练，循环液为内皮细胞悬液，即在结构体的血管通道最内层形成内皮细胞层，高度仿生天然脂肪组织和血管的生理结构。继续脉动培养，随着血管化生长因子的缓释，内皮细胞向基质材料中的渗入，可调控毛细血管网的发生，即形成具有小血管/微血管/毛细血管网的自体脂肪组织。进行自体移植可进行乳房肿瘤切除术后的脂肪组织重建。毛细血管网发生也可在体内进行。

上述方法构建的基于分区的血管化的脂肪组织，能实现尺寸分明的三级结构，每级结构都有其特定的组成、结构和功能。具体如下：

1.三级结构，即三维结构体。它由基质材料形成的互相交错的丝状水凝胶构成，具有宏观通道以便营养和新陈代谢物的交换，并为血管化预留空间。这是最宏观的一级结构。

2.二级结构，即细胞团簇结构。它主要由固态脂肪干细胞微囊和水凝胶丝状支撑网架组成，细胞微囊的粒径和囊内细胞浓度可调，微囊粒径为100μm～500μm之间。支撑网架尺寸为300μm～1000μm，支撑网架将多个高浓度细胞团组合成三维结构体。

3.一级结构，即单元结构。它是由基质材料微单元、生长因子缓释系统、离散的内皮细胞和平滑肌细胞组成的，尺寸为10μm～50μm。生长因子缓释系统用于诱导毛细血管生成，并调控内皮细胞和平滑肌细胞发育成为成熟血管组织，基质材料微单元在体内/外培养时能维持细胞正常的生理功能，并为细胞提供迁移和相互传递信息的空间，利于细胞自组装特性的发挥。

本发明是在模拟天然脂肪组织功能和结构特点的基础上，通过计算机采用相应软件对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，并在计算机的控制下将脂肪干细胞微胶囊和血管化细胞空间定位组装成形，构建高浓度脂肪细胞簇和管道状血管和微血管，同时结合细胞因子时序控制缓释技术，诱导毛细血管发生，以实现体外再造脂肪组织的血管化，构建出具有分级血管结构的、特定形状的、可在体内长期稳定存在的脂肪组织。

本发明涉及的构建方法通过快速成形技术能构建特殊尺寸的体外组织，满足治疗时病人的个体需求，实现个性化制造；通过血管/微血管分级结构的直接构建和毛细血管的诱导生成，能够解决组织移植后被吸收的问题，为脂肪等软组织缺损的修复提供了很好的解决方法。基于分区的血管化脂肪组织的构建方法结合了细胞微囊制备技术、生长因子缓释技术、细胞三维组装技术以及脉动生物反应器体外培养技术。细胞微胶囊具有半透膜结构，能在维持细胞正常生命活动的同时为细胞提供免疫隔离保护；具有很高的机械强度，能保护脂肪细胞在基础和成形的过程中不受损伤；能构建局部高浓度细胞簇，形成仿生囊状结构，对细胞的空间定位进行调控，同时能实现多种细胞的混合和复合体系，是体外再造组织的基础。生长因子缓释系统是调控细胞生长分化和组织发育的重要手段。细胞三维受控组装技术构建的水凝胶结构体将多个高浓度细胞团簇、血管化细胞和生长因子缓释体系结合成有机整体，为其提供物理保护和生长、代谢环境，并能够根据实际需求完成个性化制造。血管脉动生物反应器对结构体的体外培养能提供循环的、脉动培养系统，促进血管化过程。

本发明的细胞分区组装技术、分级血管构建技术、生长因子缓释技术和脉动培养技术能为体外各种干细胞的生长分化和构建其他组织(如肝组织、乳腺组织等)等研究提供模型和平台。

本发明提供的非接触式静电微胶囊发生器可成形粒径可调、形状圆润完整的细胞微胶囊，该装置创造了很好的无菌环境，成形过程操作简便，对细胞损伤小，所成形的微囊强度高、截断分子量合适，在体外常规培养条件下可稳定维持细胞生长、增殖、分化等功能，能很好避免传统液态微胶囊的细胞沉降和中心坏死区现象。形成固态脂肪干细胞微囊的生物活性很好，机械强度较高。在细胞受控组装技术中引入了固态细胞微囊结构，能形成浓度可调的局部细胞团簇，加强细胞之间的信号交流，并可仿生具有囊状结构的生物体组织。

本发明提供的脉动生物反应器可模拟生物体内血管的生长环境，通过调节参数模拟生物体内对组织生长有影响的力学因素，培养构建完成的水凝胶结构体，涂覆形成内皮细胞层，促进毛细血管的产生；而且脉动生物反应器能够在生物力学、循环系统等各方面满足体外组织培养的基本要求，起到静态培养所不能达到的作用。

附图说明

图1非接触式高压静电发生法原理图。

图2高压静电发生器收集装置示意图；其中1.可拆卸套筒；2.同轴套筒；3.负极铜片基座；4.有机玻璃盒。

图3血管化脂肪组织结构体构建示意图。

图4脉动生物反应器结构示意图；其中a.主视图；b.俯视图；1.电压表；2.底板；3.支柱；4.培养液瓶；5.硅胶导管；6.单向阀；7.培养盒；8.蠕动泵；9.导轨滑块；10.注射器；11、直流电机。

图5实施方法1流程图。

图6实施方法2流程图。

图7实施方法3流程图。

图8三维结构体的三级结构的照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。如无特别指明，实施例中所用的生长因子和试剂均购自Sigma公司。

实施例1脂肪干细胞的提取和诱导培养

采用抽脂手术获得患者的自体脂肪，以磷酸缓冲液冲洗脂肪组织后，然后加入0.75g/LI型胶原酶，37℃震荡、消化60min，胎牛血清终止消化。1200r/min离心10min，去上清液及悬浮的残存组织，重悬细胞，加入2倍体积的红细胞裂解液(NH₄Cl 154mmol/L+KHCO₃10mmol/L+EDTA 0.1mmol/L)静置10min，离心、弃上清液。用适量的PBS液清洗3次，200目筛网过滤，得到脂肪组织干细胞。

将所得脂肪组织干细胞接种于25cm²的培养瓶，加5mL含体积分数为0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基，混合均匀，置于37℃、体积分数为0.05的CO₂饱和湿度培养箱内培养。相差显微镜观察细胞形态特征及增殖情况，36～48h后首次换液，以后每72h换液1次。待细胞融合至超过培养瓶底80％时，常规胰酶消化传代。常规培养增殖至足够数量。

取生长至融合期的脂肪干细胞，采用海藻酸钠/胶原体系作为成囊材料，用非接触式高压静电发生器(见图2)制成固态细胞微胶囊：

1.用磷酸缓冲液溶解海藻酸钠，用2％的乙酸溶解胶原制成溶液。将两者混合为海藻酸钠和胶原最终浓度分别为2％(w/w)和0.35％(w/w)的溶液并1mM的NaOH溶液调整PH值至7.2左右。

2.将脂肪干细胞以10⁵个/ml的密度与成囊溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。

3.连接非接触式高压静电微囊发生器，本设备的高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压10kV；成囊液推进装置采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，推进速度10ml/h，采用10mL注射器，针尖与铜片间距离为30mm，推进速度为10ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的玻璃培养皿，固化液为100mmol/L氯化钙溶液。

4.在5分钟内收集细胞胶囊，用生理盐水洗涤两次后观察记录，细胞胶囊形状圆整光滑，粒径为150μm。

用成脂培养液(高糖DMEM，10％胎牛血清，0.5mmol/L IBMX，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，1％青链霉素原液)在37℃体积分数为0.05的CO₂饱和湿度培养箱内培养脂肪组织干细胞胶囊约10天，得到脂肪细胞囊。

采用非接触式高压静电发生器(见图2)制备血管化生长因子(bFGF和VEGF)缓释微球。

1.将海藻酸钠用PBS缓冲溶液配置成1.5％(w/w)的溶液。

2.将bFGF和VEGF以10⁵个/ml的浓度与成囊溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。

3.连接非接触式高压静电微囊发生器，工作电压7kV，针尖与铜片间距离为20mm，推进速度为30ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的玻璃培养皿，固化液为100mmol/L氯化钡溶液。

4.在5分钟内收集细胞胶囊，用生理盐水洗涤两次后观察记录，生长因子缓释微球的形状圆整光滑，粒径为250μm。

取常规培养的脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞(用含2％胎牛血清，2％马血清，10ng/mL VEGF，2ng/mL bFGF，1×ITS，0.61g/L尼克酰胺，0.1μmol/L地塞米松，2g/L BSA，0.1g/L鸟氨酸，0.03g/L脯氨酸，0.73g/L谷氨酰胺，1g/L葡萄糖，2g/L半乳糖及适量微量元素(氯化锌、硫酸锌和氯化锰等)的低糖DMEM置于37℃、体积分数为0.05的CO₂饱和湿度培养箱内培养10天，然后用培养所用的低糖DMEM培养液配置成浓度为10⁶个/ml的悬液备用。

取常规培养的脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导(含5ng/mLTGF-β1和50ng/mLPDGF-BB的M-199诱导液置于37℃、体积分数为0.05的CO₂饱和湿度培养箱内培养10天。然后用所用的M-199诱导液配置成浓度为10⁶个/ml的悬液备用。

实施例2

采用溶芯技术(专利公开号：1654028)制备两套内部贯通的二级血管支架，如图3所示。第一级模拟小血管的生物学结构，内径为1000μm，第二级结构模拟微血管，内径为300μm，用脉动生物反应器进行培养和训练，每天2小时，持续一周，循环液为10⁶个/ml平滑肌细胞悬液(溶剂为对应的细胞培养液)，使平滑肌细胞均匀附着在血管支架通道内形成多层平滑肌细胞。

将实施例1制备的脂肪干细胞微胶囊和生长因子缓释微球与明胶在常温下，以体积比10∶1∶5均匀混合，铸模成直径为2cm的半球，然后降温凝胶化；将已形成平滑肌细胞层的两套分级血管支架按图3所示的方式定位组装在结构体中，并对整体结构脉动培养训练，每天2小时，持续一周，循环液为浓度为10⁶个/ml的内皮细胞悬液(溶剂为对应细胞的培养液)，在结构体的血管支架最内层形成内皮细胞层；继续脉动培养一个月，随着血管化生长因子的缓释，内皮细胞向基质材料中的渗入，调控毛细血管网的发生，形成具有小血管/微血管/毛细血管网的自体脂肪组织。

实施例3

取常规培养的脂肪干细胞采用海藻酸钠/明胶体系作为成囊材料，用非接触式高压静电发生器(见图2)制成固态细胞微胶囊：

1.将海藻酸钠的溶液和明胶溶液(溶剂PBS缓冲溶液)混合为最终浓度分别为1.8％(w/w)和3％(w/w)的溶液。

2.将脂肪干细胞以10⁶个/ml的密度与成囊溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。

3.连接非接触式高压静电微囊发生器，本设备的高压静电发生装置可采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压10kV；成囊液推进装置可采用LongerPump公司TS2-60型注射泵，采用5mL注射器，针尖与铜片间距离为10mm，推进速度为10ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的玻璃培养皿，固化液为100mmol/L氯化钙溶液。

4.在5分钟内收集细胞胶囊，用生理盐水洗涤两次后观察记录，细胞胶囊形状圆整光滑，粒径为300μm。

采用成脂培养液(高糖DMEM，10％胎牛血清，0.5mmol/L IBMX，1μmol/L地塞米松，10μmol/L胰岛素，1％青链霉素原液)于37℃、体积分数为0.05的CO₂饱和湿度培养箱内培养干细胞微胶囊培养约10天，得到脂肪细胞囊。

采用非接触式高压静电发生器(见图2)制备血管化生长因子(bFGF、VEGF和VCAM-1)缓释微球。

1.用PBS缓冲溶液制备浓度为0.5％(w/w)海藻酸钠溶液。

2.将bFGF、VEGF和VCAM-1分别以2ng/mL和10ng/mL密度与成囊溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。

3.连接非接触式高压静电微囊发生器，工作电压8kV，针尖与铜片间距离为20mm，推进速度为10ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的玻璃培养皿，固化液为100mmol/L氯化钙溶液。

4.在5分钟内收集细胞胶囊，用生理盐水洗涤两次后观察记录，生长因子缓释微球的形状圆整光滑，粒径为50μm。

取常规培养的脂肪干细胞进行成内皮诱导以形成内皮细胞，另取部分脂肪干细胞进行成平滑肌细胞诱导(培养条件和过程与实例1相同)。

将制备的生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊和海藻酸钠在常温下以体积比1∶10∶5，平滑肌细胞在整体中的浓度为10⁶个/ml，均匀混合后装入500ml一次性针管并降温凝胶化。通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，将结构体的三维造型模型用STL文件输出，用单喷头三维成型机(专利公开号：1257762)的计算机对该文件分层解析，在计算机的控制下将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊、离散平滑肌细胞与基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形，分别构建两个半球，小血管和微血管的通道在成形时自然形成。

实施例4

将实施例3制备的生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊和海藻酸钠、明胶和纤维蛋白原在常温下以体积比1∶10∶3∶3∶3混合，平滑肌细胞以10⁶个/ml的浓度与1∶1∶1的海藻酸钠、明胶和纤维蛋白原均匀混合，分别装入500ml一次性针管并降温凝胶化。

通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，将结构体的三维造型模型用STL文件输出，用第二代双喷头细胞组装机(专利公开号：1820791)的计算机对该文件分层解析，在计算机的控制下分别将生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体和平滑肌细胞/基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形。平滑肌细胞/基质材料混合体构成分级血管结构通道管壁，生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体构成结构体的主体部分，则形成具有多层平滑肌细胞管道结构的类脂肪组织。小血管和微血管的通道在成形时自然形成，

根据患者软组织的损伤，构建特定形状的三维结构体，然后用脉动反应器培养和训练每天2小时，一周，循环液为内皮细胞悬液(10⁶个/ml的内皮细胞悬液)，即在结构体的血管通道最内层形成内皮细胞层，高度仿生天然脂肪组织和血管的生理结构。继续脉动培养一个月，随着血管化生长因子的缓释，内皮细胞向基质材料中的渗入，调控毛细血管网的发生，即形成具有小血管/微血管/毛细血管网的自体脂肪组织。进行自体移植可进行乳房肿瘤切除术后的脂肪组织重建。

制备出的血管化脂肪组织见图8所示，可见作为三级结构的水凝胶块；作为二级结构的细胞团簇结构，其主要由约300μm固态脂肪干细胞微囊和水凝胶支撑网架组成；由基质材料微单元、生长因子缓释系统、离散的内皮细胞和平滑肌细胞组成的一级结构。

实施例5脉动体外培养过程

脉动生物反应器采用产自崇州市崇阳众诚不锈钢配件服务部的蠕动泵JD-200来提供相应的循环动力，设定其工作电压为12V，流速为60ml/min；直流电机选用产自北京艾克斯公司的电机ZGB37RH52i，设定其工作电压为12V、转速为100r/min；采用100ml的注射器；将自制导杆和滑块导轨，以及各部件，如直流电机、导杆、滑块导轨、注射器用自制的支架固定在底板上，连接各部件，如图4所示。

培养液循环部分由培养液瓶、蠕动泵和培养盒构成，各部分由硅胶管连接，培养液经硅胶管由蠕动泵从培养液瓶泵入培养盒(内置人造脂肪组织)，然后经硅胶管流回培养液瓶；导轨滑块、注射器和直流电机构成脉动部分，直流电机与导轨滑块连接推动注射器活塞往复运动，注射器与蠕动泵的出液端连接后和培养盒连接，由此形成脉动流；压力表设置在培养盒上，检测置于培养盒内的脂肪组织内的培养液压力。

在进行体外培养以前，先拆卸脉动生物反应器的连接管、注射器，利用高温高压灭菌。然后接通脉动生物反应器，蠕动泵和直流电机接通，首先在培养液瓶中加入少量75％的酒精，利用酒精在脉动循环系统中流动灭菌；倒掉酒精然后在培养液瓶中加入一定量已灭菌的PBS溶液，利用该溶液冲洗残余酒精。

关掉电源，然后在培养液瓶中加入待培养需使用的培养液，用灭菌好的镊子夹住实施例4制备的人工脂肪组织接到培养盒的接头上。为使人工组织牢固地接在接头上，用已灭菌的细线固定人造组织的两头。待脉动生物反应器系统完全连接好后，接通电源，调整蠕动泵的电压为12V，调节人造组织处所受压力到0.1Mpa，然后就可以持续运行脉动生物反应器对人造组织进行脉动培养了。

在培养过程中保持上述电压和脂肪组织的压力，使线性控制脉动培养过程中脉动频率在100次/min。

直流电机运行平稳后，带动滑块在导轨上推动注射器活塞往复运动，活塞拉出的时候从培养液瓶中吸取培养液，挤出时把吸入的培养液注入蠕动泵形成的循环系统中流经培养盒中的人造组织流回培养液瓶。通过调节注射器每次吸入、挤出的培养液的量可调节培养人造组织处的压力。由此，蠕动泵和直流电机持续运动，脉动生物反应器就提供了一个脉动循环的培养液流实现了对人造组织的脉动培养。

Claims

1.一种血管化脂肪组织的构建方法，包括：

1）脂肪区的构建：提取脂肪干细胞，将脂肪干细胞先制成干细胞微胶囊，然后脂肪干细胞诱导培养成脂肪细胞，得到材料包裹的高浓度脂肪细胞团簇；

2）血管成分的制备：i）将脂肪干细胞分别诱导成平滑肌细胞和内皮细胞；ii）将血管化生长因子制成生长因子缓释微球；

3）血管化脂肪组织的构建：i）将生长因子缓释微球、脂肪细胞囊与基质材料混合，作为主体材料，将平滑肌细胞作为通道材料，构建有贯通通道的三维结构体；ii）将三维结构体进行脉动体外培养，并以内皮细胞的悬液灌流，使内皮细胞附着在通道的内壁，形成外壁为平滑肌细胞、内壁为内皮细胞的血管组织；iii）将三维结构体继续进行脉动体外培养，生长因子缓释微球逐渐释放出血管化生长因子以促进毛细血管的生长，得到产生毛细血管的血管化脂肪组织；

步骤1）所述干细胞微胶囊是将脂肪干细胞与海藻酸钠基水凝胶生物材料均匀混合后滴入固化液中制成；步骤2）中所述的生长因子缓释微球是将血管化生长因子与海藻酸钠混合后滴入固化液中制成；所述干细胞微胶囊的粒径为100μm～500μm；所述生长因子缓释微球的粒径为20μm～50μm；

所述海藻酸钠基水凝胶材料是海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/明胶中的一种；所述固化液为含二价阳离子的盐溶液；所述海藻酸钠基水凝胶材料的使用浓度为0.1-10％，其中明胶或胶原的浓度为0.01-5％，氯化钙溶液优选为100mM；

所述基质材料是明胶，海藻酸钠，胶原，纤维蛋白原中的一种或多种；

步骤3）的步骤i）所述的脂肪细胞囊与基质材料的体积比为2:1～1:2，平滑肌细胞的加入量为以基质材料计10⁵个/ml～10⁷/ml；

步骤3）所述的脉动体外培养采用脉动生物反应器进行，该脉动生物反应器包括：培养液供应装置，液体连续推进装置，液体间歇推进装置，脂肪组织培养装置和压力检测装置；

培养液供应装置，液体连续推进装置和培养液供应装置依次相互连接，液体连续推进装置将源于培养液供应装置的培养液推入置于脂肪组织培养装置的脂肪组织，从脂肪组织流出的培养液流回培养液供应装置，为脂肪组织提供循环培养液；

液体间歇推进装置的进液口连接培养液供应装置，出液口连接脂肪组织培养装置，为脂肪组织提供培养液的循环脉动流；

压力检测装置是检测脂肪组织培养装置中培养液的压力的压力表。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述干细胞微胶囊和生长因子缓释微球采用非接触式高压静电发生法来制备。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述非接触式高压静电发生法通过一种非接触式高压静电收集器来完成，其包括：

液体推进装置：将成囊液推入所述高压电场的正极；以及收集装置：置于负极的固化液将球状液滴固化，收集固化的液滴。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3）的步骤i）的构建是采用铸模法或挤出法进行。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述挤出法采用三维受控组装设备进行。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述铸模法，步骤为：采用溶芯技术制备内部贯通的二级血管支架，第一级模拟小血管的生物学结构，内径为1000μm～300μm，第二级结构模拟微血管，内径为300μm～100μm，进行体外脉动培养，循环液为平滑肌细胞悬液，使平滑肌细胞均匀附着在血管支架通道内形成多层平滑肌细胞；将脂肪细胞微胶囊、生长因子微球与基质均匀混合，采用铸模后凝胶化的方法成型三维结构体；然后将已形成平滑肌细胞层的分级血管支架定位组装在三维结构体中，构建出具有贯通通道的三维结构体。

7.如权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述挤出法，使用单喷头三维成型机的三维受控组装设备，具体步骤为：将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊和离散的平滑肌细胞与基质材料均匀混合，降温凝胶化；通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，用单喷头三维成型机在计算机的控制下将生长因子缓释微球、脂肪细胞微胶囊、离散平滑肌细胞与基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形，小血管和微血管的通道在成形时自然形成；或，

所述挤出法，使用双喷头细胞组装机的三维受控组装设备，具体步骤为：将生长因子缓释微球和脂肪细胞微胶囊与基质材料均匀混合，并降温凝胶化；将离散平滑肌细胞与基质材料混合并降温凝胶化；通过计算机对体外再造的脂肪组织进行材料建模和结构建模，用双喷头细胞组装机在计算机的控制下分别将生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体和平滑肌细胞/基质材料混合体以层层叠加的方式挤出堆积成形；平滑肌细胞/基质材料混合体构成分级血管结构通道管壁，生长因子缓释微球/脂肪细胞微胶囊/基质材料混合体构成结构体的主体部分，形成具有多层平滑肌细胞管道结构的类脂肪组织，小血管和微血管的通道在成形时自然形成。