CN111184915B - 用于血管网络发生的工程化人工结构体及构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可用于血管网络发生的工程化人工结构体及其构建方法，所述人工结构体包含水凝胶微球、血管化生长因子缓释微球、血管化细胞和载体材料。所述人工结构体可通过生物反应器培养获得血管网络，或移植入体内再生血管网络。获得的血管网络具有生理功能，可用于血管再生、疾病发生研究、药物检测等体内和体外研究。本技术用于组织工程、再生医学、体外生理模型/病理模型/药理模型构建、组织/器官/人体芯片、细胞生物学或药物研究等方面。

Description

用于血管网络发生的工程化人工结构体及构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种可用于血管网络发生的工程化人工结构体及其构建方法与应用。
背景技术
工程化结构体在体内快速和充分的血管化一直是组织工程和再生医学瓶颈问题，因为当每个细胞距离最近的血管的距离大于200μm时，就存在营养供给不足的问题，最终导致细胞坏死。而在没有外界条件干预的情况下，血管长入移植物的速度极慢，一般在几毫米/天的量级。因此，对于具有临床意义的移植物来说，含有预先放置的功能性血管网络是实现成功血管化和移植物存活、重构的重要策略之一，即，体内血管化策略。该策略通过一次手术获得天然功能性血管网络，取出血管后与移植物复合，进行二次手术植入，大大提高移植成功率。但由于天然血管网络供体极其有限，且对供区损伤大，因此通过人工结构体体内移植的方法获得体内功能性血管网络的研究具有重要意义。
除了组织再生的需求之外，体外生理/药理/病理模型和组织/器官芯片等研究也对功能性血管网络提出了巨大需求。目前仍缺乏大量具有正常功能的天然血管网络辅助相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于血管网络发生的工程化人工结构体及其构建方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种可用于血管网络发生的工程化人工结构体的构建方法，包括以下步骤：
S1、水凝胶微球的制备；
S2、将涂覆材料均匀涂覆在S1制备的水凝胶微球表面，得到具有涂层的水凝胶微球；
S3、将血管化细胞A与S2制备的具有涂层的水凝胶微球混合，在血管细胞培养液内培养3-5天，得到含血管化细胞层的水凝胶微球；
S4、血管化生长因子1缓释微球的制备；
S5、人工结构体(即三级缓释结构体)的制备：将S3制备的含有血管内皮细胞层的水凝胶微球、S4制备的血管化生长因子1缓释微球、血管化生长因子2、血管化细胞B与载体材料混合，在血管细胞培养液内培养(1-30天)，即得可用于血管网络发生的工程化人工结构体。
其中，所述血管化生长因子1、2为相同或不同的血管化生长因子；所述血管化细胞A、B为相同或不同的血管化细胞。
优选地，S1制备的微球为含血管化生长因子3的水凝胶微球。其中，所述血管化生长因子3与血管化生长因子1、2为相同或不同的血管化生长因子。
本发明中，所述血管化生长因子为任意促进毛细血管发生和促进血管成熟的细胞因子。所述血管化生长因子1、2、3选自血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子、血管生成素-1等血管相关生长因子中的至少一种，优选血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子；
更优选地，所述血管化生长因子3为血管内皮细胞生长因子，所述血管化生长因子1为碱性成纤维细胞生长因子，所述血管化生长因子2为表皮生长因子。
在一些实施方案中，血管化生长因子的包裹方式包括但不限于被载体材料直接包裹、采用缓释载体包裹等，优选的包裹方式为采用缓释载体包裹。
本发明中，所述血管化细胞A、B选自血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、微血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、血管成纤维细胞、间充质干细胞、周细胞等中的至少一种，这些细胞可以是组织中提取获得的，也可以是细胞分化/转分化而来的，优选血管内皮细胞、间充质干细胞；
更优选地，所述血管化细胞A、B都为脐静脉血管内皮细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞。
本发明中，所述涂覆材料为生物可降解的，且具有生物活性、细胞粘附性和生物相容性天然生物材料，包括但不限于胶原、纤维蛋白原、matrigel、层连蛋白、黏多糖等天然细胞外基质材料。
本发明中，所述载体材料为具有生物相容性的天然生物材料和/或人工合成生物材料。
所述天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物等中的至少一种，优选藻酸钠、明胶或胶原。
所述人工合成生物材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等中的至少一种，优选聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
前述方法中S1制备的微球平均直径为50-1000μm，S4制备的微球平均直径为10nm-100μm，且S4制备的微球平均直径小于S1制备的微球。例如S1制备的微球的平均直径可以为50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm或其间的任意数值。例如S4制备的微球的平均直径为10nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm或其间的任意数值。
在形成水凝胶微球后，将涂覆材料与水凝胶微球均匀混合，在一定的培养空间内静置培养或动态培养，直至所述涂覆材料与所述微球表面充分结合。所述培养空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间，如离心管、12孔板等。所述动态培养方法可选择本领域常用的仪器，如微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。
在血管细胞培养液内，将步骤S2制备的具有涂层的水凝胶微球进行静态培养或动态培养，使血管化细胞附着在所述材料涂敷层上，形成血管化细胞层。所述培养空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间，如离心管、12孔板等。所述动态培养方法可选择本领域常用的仪器，如微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。采用的培养基和培养条件是本领域培养血管化细胞和/或组织细胞常用的，由本领域技术人员依据本领域的公知技术决定。
前述方法中S4优选以藻酸钠为成囊材料制备微球。所述微球中藻酸钠的最终浓度为0.5％-10％，例如为1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。
本发明中，可采用悬滴法、非粘附自组装法、高压静电喷射法等制作微球。S1和S4优选都采用非接触式高压静电法制备微球。有关非接触式高压静电法制备微球可采用CN200910079726.8的非接触式高压静电发生器进行。
在水凝胶微球之间的间隙天然形成贯通通道。所述形成的贯通通道可以作为体内血管再生的起点和空间保障，并与体内血管快速连接。
可用于血管网络发生的工程化人工结构体的构建方法具体如下：
一、血管化生长因子缓释微球的制备
1.将藻酸钠(Sigma-Aldrich,A0682)用PBS缓冲溶液配置成0.5％～10％(w/w)的溶液。
2.将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Abcam，AB9596)以1～10ng/ml的浓度与藻酸钠溶液均匀混合后装入容积为1-20ml的一次性针管。
3.连接高压静电细胞微球制备装置，高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压12-17kV；将步骤2的10ml注射器装夹在推进装置：LongerPump公司TS2-60型注射泵中，针尖与铜片间距离为15-30mm，推进速度为5-20ml/h，采用内径为100-300μm的针头，收集器为直径60mm的一次性塑料培养皿(各种尺寸的塑料、玻璃培养皿都可以)，固化液为10-400mmol/L氯化钙溶液(或氯化钡溶液)。
4.在5min内收集血管化生长因子缓释微球，用生理盐水洗涤两次后观察记录，血管化生长因子缓释微球的形状圆整光滑，平均直径为30μm。
5.注意在整个过程中尽量保持低温。
二、水凝胶微球的制备
1、将藻酸钠(Sigma-Aldrich,A0682)的溶液和明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)混合为最终浓度分别为1.5％-6％(w/w)和2％-6％(w/w)的水凝胶前体溶液。
2、将血管内皮细胞生长因子(VEGF，Abcam，AB9571)以5～50ng/ml的浓度与1获得的水凝胶前体溶液均匀混合后装入容积为1-20ml的一次性针管。
3、连接高压静电喷射细胞微球制备装置，高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压7-12kV；将步骤2的10ml注射器装夹在推进装置：LongerPump公司TS2-60型注射泵中，针尖与铜片间距离为10-30mm，推进速度为5-50ml/h，采用内径为100-500μm的针头，收集器为直径60mm的一次性塑料培养皿(各种尺寸的塑料、玻璃培养皿都可以)，固化液为100-400mmol/L氯化钙溶液(或氯化钡溶液)。
4、在5min内收集细胞微球，用生理盐水洗涤两次后观察记录，细胞微球形状圆整光滑，平均直径为400μm。
5、注意在整个过程中尽量保持25～37℃。
三、涂敷材料涂敷层的制备
将1-3ml胶原溶液(Sigma，C7661，原液)与1-3ml水凝胶微球混合均匀后装入离心管，此时细胞微球由于密度较大沉于底部。1000r/min的转速离心4min，使得胶原溶液充分与底部的单元结构微球接触。在离心管中静置培养48～72小时，使得胶原溶液均匀分布在微球表面。
四、含血管内皮细胞层的水凝胶微球的制备
1、脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)常规培养在内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)中，取生长状态良好的细胞以106-108个/mL的密度重悬在内皮细胞培养液中。
2、采用微重力生物反应器制备内皮细胞层：将重悬的内皮细胞以1:5-5:1的体积比与步骤三中得到的微球混合，将10mL混合物从细胞接口接种至微重力生物反应器(Synthecon，RCCSTM)内，排空反应器内气泡并封闭排气口。将生物反应器装置置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，以10-50rpm转速培养(以使水凝胶微球悬浮不下沉的最小速度为宜)3～5天，每天半量换液。
五、人工结构体(三级缓释结构体)的制备
1、将质量分数3％-20％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:5-5:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2、将步骤一获得的血管化生长因子缓释微球、步骤四获得的含血管内皮细胞层的水凝胶微球、表皮生长因子(EGF，Abcam，ab9697)和脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)分别以体积比5:1-20:1、1:5-5:1、5～50ng/ml和105-107个/mL的浓度与载体材料前体溶液均匀混合后，以50-200mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置0.5-2小时，完成载体材料交联过程。
3、采用内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)培养2中获得的人工结构体，每2-3天换液。
六、人工结构体体外生物反应器培养及血管网络的形成
采用微重力生物反应器(装有相应的血管细胞培养液)培养上述制备的人工结构体。将生物反应器装置置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，以50-500rpm转速培养(以使人工结构体悬浮不下沉的最小速度为宜)8～12天，每天半量换液，即获得血管网络。
第二方面，本发明提供按上述方法构建得到的人工结构体。所述人工结构体包含水凝胶微球、血管化生长因子缓释微球、血管化细胞和载体材料。
第三方面，本发明提供所述人工结构体在血管再生中的应用。所述天然血管网络由人工结构体经体外生物反应器或体内移植血管再生而获得。
第四方面，本发明提供一种构建血管的方法，将所述人工结构体在装有血管细胞培养液的生物反应器(优选微重力生物反应器)内培养8-12天。
第五方面，本发明提供一种血管网络的获得方法。将所述人工结构体移植入体内，并成熟一段时间后，形成体内再生的功能性天然血管网络。将移植物取出，溶解未降解的微球材料，即获得功能性天然血管网络。该血管网络可用于二次移植，或生理模型/病理模型/药理模型构建、组织/器官/人体芯片、细胞生物学或药物测试开发等体外研究。
在一些实施方案中，所述方法包括通过使用一次性注射器将本发明人工结构体移植入体内，并在体内快速实现血管再生。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
本发明的可用于血管网络发生的工程化人工结构体，所述结构体包含水凝胶微球、血管化生长因子缓释微球、血管化细胞和载体材料。其中，载体材料可包裹血管化生长因子，作为一级因子缓释体系；水凝胶微球内可包裹生长因子，作为二级因子缓释体系；因子缓释微球直径更小，作为三级因子缓释体系。其中血管化细胞均匀附着在水凝胶微球表面，作为一级血管化细胞结构；载体材料内可包裹血管化细胞，作为二级血管化细胞结构。所述人工结构体可通过生物反应器培养获得血管网络，或移植入体内再生血管网络。获得的血管网络具有生理功能，可用于血管再生、疾病发生研究、药物检测等体内和体外研究。
所述基本单元由结构单元微球、材料涂敷层和血管化细胞组成。所述结构单元微球外周涂敷有材料涂敷层，在材料涂敷层外粘附有血管化细胞，并且在所述水凝胶微球之间的间隙形成贯通通道。所述形成的贯通通道可以作为体内血管再生的起点和空间保障，并与体内血管快速连接。
在一些实施方案中，结构单元微球为微米级球状结构，平均直径为50μm～1000μm。例如所述水凝胶微球的平均直径可以为50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm或其间的任意数值。
在一些实施方案中，所述结构单元微球的成分为天然生物材料和/或人工合成生物材料，其为具有生物相容性的材料。
所述可用于血管网络发生的工程化人工结构体，可按照如下方法制备得到：将天然生物材料和/或人工合成生物材料制成微米级球状结构，并在球状结构外涂敷材料层和血管化细胞层，利用结构单元之间的间隙作为形成血管网络的贯通通道，结合血管化生长因子缓释体系，以快速形成体内功能性血管网络，所述方法包括以下步骤：
(1)将含有或者不含有血管化生长因子缓释体系的微球材料，制造形成结构单元微球；
(2)在所述结构单元微球外层均匀涂敷由材料涂敷层；
(3)在所述材料涂敷层外粘附血管化细胞层；
(4)注射式或非注射式体内移植；
(5)一段时间后取出移植物，获得功能性血管网络。
可采用多种本领域技术人员已知的方法将含有或不含有血管化生长因子缓释体系的微球材料制成单元结构微球，如悬滴法、非粘附自组装法、高压静电喷射法等，优选高压静电喷射法，过程如下：将含有或不含血管化生长因子缓释体系的微球材料通过注射泵挤出，经过高压静电场的拉力滴入固化液中，制成单元结构微球。
在一些实施方案中，基于藻酸钠的微球材料的最终浓度为0.5％-10％，例如为1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等。
在一些实施方案中，所述固化液为含二价阳离子的盐溶液，如氯化钙、氯化钡等，优选氯化钙溶液。
在一些实施方案中，所用氯化钙溶液的浓度为100mM-500mM，例如100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM或500mM等。
在另一些实施方案中，血管化生长因子首先形成血管生长因子缓释微球，然后与微球材料混合。在这样的情况下，结构单元微球或血管化生长因子缓释微球的平均直径可根据本领域技术人员的需要来决定，为便于配合，血管化生长因子缓释微球的平均直径应小于结构单元的平均直径；优选的结构单元微球的平均直径为50μm～1000μm；血管化生长因子缓释微球的平均直径为10nm～100μm。例如所述结构单元的平均直径可以为50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm或其间的任意数值。例如所述血管化生长因子缓释微球的平均直径为10nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm或其间的任意数值。
在形成单元结构微球后，将形成材料涂敷层的生物材料与单元结构微球均匀混合，在一定的培养空间内静置培养或动态培养，直至所述生物材料与所述微球表面充分结合。所述培养空间可选择各种本领域常用的培养用具所形成的空间，如离心管、12孔板等。所述动态培养方法可选择本领域常用的仪器，如微重力培养装置、灌流培养装置和生物反应器、搅拌培养装置和生物反应器、波浪式培养装置和生物反应器等。
将步骤(3)获得的人工结构体采用注射式或非注射式的方式移植入体内，所述移植方式为本领域均知。等待一段时间完成移植物的体内血管化。等待时间根据人工结构体成分、单元结构微球尺寸、血管化生长因子种类与浓度、移植体积、移植部位、宿主类型而异，最优选的人工结构体是海藻酸/胶原体系，单位结构微球尺寸400μm，血管化生长因子VEGF缓释体系为50μm，浓度为10ng/ml，移植体积为1mL，移植部位和宿主类型为自体皮下移植。
将步骤(4)的移植物手术取出，取出方式为本领域均知，溶解为降解的微球材料后，获得功能性天然血管网络。
另一个方面，本发明提供根据本发明方法制备的人工结构体在制备用于快速体内血管化组织之药物中的用途。
另一个方面，本发明提供功能性天然血管网络在制备用于快速体内血管化组织之药物中的用途。
另一个方面，本发明提供功能性天然血管网络在制备用于构建生理/病理/药理模型、组织/器官/人体芯片、细胞生物学研究、药物学研究、治疗疾病以及恢复、替代、维持或提高组织器官功能的植入物中的用途。
另一个方面，本发明提供人工结构体快速再生体内功能性血管网络的方法，所述方法包括将本发明人工结构体移植入体内，并在体内快速实现血管再生。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)生物功能好。通过具有诱导血管再生的人工结构体体内移植，可快速再生功能性天然血管网络。单元结构微球之间的贯通空隙是血管再生的物理空间，血管化细胞和血管化生长因子在促进血管再生的物质基础。再生的血管网络与宿主体内天然血管汇通，红细胞丰富，且完全为天然组织，生物功能优异，血管再生速度最高达约6mm2/天的量级。
(二)用途广泛。本发明获得的天然血管网络可用于多种体内、体外研究。如与其他人工结构体结合，进行二次移植，体内再生血管化组织，修复、维持或功能增强病损组织。此时，天然血管网络是实现移植物存活、重构、成熟的重要基础。此外，还可作为生理模型/病理模型/药理模型构建、组织/器官/人体芯片、细胞生物学或药物测试开发等体外研究的血管成分。
(三)可实现大体积血管网络的体内再生。通过对基本单元个数的控制，可一次性移植数百至数万量级的球状结构单元，移植体积1-20ml之间可调，可实现大体积血管网络的体内再生。
附图说明
图1为本发明实施例5中人工结构体的结构示意图。其中，1：水凝胶微球。2：生长因子缓释微球。3：血管化细胞。4：载体材料。
图2为本发明实施例4中人工结构体实物图。其中，A：水凝胶微球形成初期，包括海藻酸钠微球、胶原材料涂敷层和血管化细胞HUVEC。血管化细胞呈聚集状粘附在涂覆材料表面。B：多个水凝胶微球形成成熟期，血管化细胞呈片状均匀粘附在微球表面。C：人工结构体。白色箭头所示为生长因子缓释微球体系，黑色箭头所示为水凝胶微球，灰色箭头所示为载体材料中的血管化细胞。
图3为本发明实施例7中人工结构体在生物反应器中培养10天后形成血管网络。其中，A：CD31染色结果，在人工结构体的水凝胶微球周围间隙处形成大量血管样结构，如白色箭头所示。标尺：500μm。B：CD31染色结果放大图，结构体中形成大量血管网络结构。C：各组人工结构体中形成血管样结构密度定量检测。**表示p<0.01，***表示P<0.001，数据有显著性差异。
图4为本发明实施例8中人工结构体在裸鼠体内注射移植28天后形成功能性血管网络。其中，A：移植物切片HE染色。白色箭头所示为血管网络中的红细胞，显示血管功能性和贯通性良好，紫色为未降解的结构单元材料。标尺：100μm。B：移植物切片放大图，白色箭头所示为血管网络中的红细胞，显示血管功能性和贯通性良好。标尺：50μm。C：各组人工结构体再生血管密度定量检测。**表示p<0.01，***表示P<0.001，数据有显著性差异。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
术语：
本发明使用的“人工结构体移植”是指通过移植经工程化技术制备的含有活性细胞的组织，来修复、改善或重建患者的组织或器官的结构和/或功能的技术。“人工结构体”是指经人工技术制备的、含有活性细胞的结构体。所述活性细胞优选人体细胞，更优选自体细胞。
术语“血管化”和“形成功能血管网络”在本发明中可以互换使用，是指在身体组织中形成血管和毛细血管的过程。
本发明使用的“血管再生”是指包括血管发生和血管生成两种机制。前者通过激活血管化细胞(特别是血管内皮细胞)的前体细胞形成新生血管。后者又成为血管新生，是指已经存在的毛细血管的血管细胞发生增殖而形成新生血管网的过程。本发明所述的“血管化生长因子”在这两种机制中均发挥着重要作用。
术语“基本单元”、“基本结构单元”和“结构单元”在本发明中可以互换使用，其为本发明人工结构体的基本构成单元，结构如图1所示，并且本发明人工结构体包含多于一个所述单元。
本发明使用的“血管化细胞”指的是形成血管的细胞。
本发明使用的“血管化生长因子缓释微球”是指仅将血管化生长因子包裹在载体材料中形成的球体。
本发明使用的“均匀”是指使材料或物质的性质、厚度、密度等一致或近似一致。
术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”是指“和/或”。除非本发明另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
实施例1血管化生长因子缓释微球的制备
1.将藻酸钠(Sigma-Aldrich,A0682)用PBS缓冲溶液配置成1.5％(w/w)的溶液。
2.将碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Abcam，AB9596)以2ng/ml的浓度与藻酸钠溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。
3.连接高压静电细胞微球制备装置，高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压15kV；将步骤2的10ml注射器装夹在推进装置：LongerPump公司TS2-60型注射泵中，针尖与铜片间距离为20mm，推进速度为10ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的一次性塑料培养皿(各种尺寸的塑料、玻璃培养皿都可以)，固化液为50mmol/L氯化钙溶液(或氯化钡溶液)。
4.在5min内收集血管化生长因子缓释微球，用生理盐水洗涤两次后观察记录，血管化生长因子缓释微球的形状圆整光滑，平均直径为30μm。
5.注意在整个过程中尽量保持低温。
实施例2水凝胶微球的制备
1、将藻酸钠(Sigma-Aldrich,A0682)的溶液和明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)混合为最终浓度分别为2％(w/w)和3％(w/w)的水凝胶前体溶液。
2、将血管内皮细胞生长因子(VEGF，Abcam，AB9571)以10ng/ml的浓度与1获得的水凝胶前体溶液均匀混合后装入容积为10ml的一次性针管。
3、连接高压静电喷射细胞微球制备装置，高压静电发生装置采用SA167-Y(天津)高压电场发生器，输出电压10kV；将步骤2的10ml注射器装夹在推进装置：LongerPump公司TS2-60型注射泵中，针尖与铜片间距离为10mm，推进速度为20ml/h，采用内径为191μm的针头，收集器为直径60mm的一次性塑料培养皿(各种尺寸的塑料、玻璃培养皿都可以)，固化液为200mmol/L氯化钙溶液(或氯化钡溶液)。
4、在5min内收集细胞微球，用生理盐水洗涤两次后观察记录，细胞微球形状圆整光滑，平均直径为400μm。
5、注意在整个过程中尽量保持25～37℃。
实施例3涂敷材料涂敷层的制备
将1ml胶原溶液(Sigma，C7661)与1ml水凝胶微球混合均匀后装入离心管，此时细胞微球由于密度较大沉于底部。1000r/min的转速离心4min，使得胶原溶液充分与底部的单元结构微球接触。在离心管中静置培养48～72小时，使得胶原溶液均匀分布在微球表面。
实施例4含血管内皮细胞层的水凝胶微球的制备
1、脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)常规培养在内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)中，取生长状态良好的细胞以107个/mL的密度重悬在内皮细胞培养液中。
2、采用微重力生物反应器制备内皮细胞层：将重悬的内皮细胞以1:1的体积比与实施例3中得到的微球混合，将10mL混合物从细胞接口接种至微重力生物反应器(Synthecon，RCCSTM)内，排空反应器内气泡并封闭排气口。将生物反应器装置置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，以20rpm转速培养(以使水凝胶微球悬浮不下沉的最小速度为宜)3～5天，每天半量换液。培养1天的结果显示于图2(A)中，培养5天的结果显示于图2(B)中。
实施例5人工结构体(三级缓释结构体)的制备
1、将质量分数10％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2、将实施例1获得的血管化生长因子缓释微球、实施例4获得的含血管内皮细胞层的水凝胶微球、表皮生长因子(EGF，Abcam，ab9697)和脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)分别以体积比10:1、2:1、10ng/ml和106个/mL的浓度与载体材料前体溶液均匀混合后，以100mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置1小时，完成载体材料交联过程。
3、采用内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)培养步骤2中获得的人工结构体，每2-3天换液，培养1-30天。培养7天后形成的三级缓释人工结构体示意图如图1所示，实物图如图2C所示。
实施例6二级缓释结构体、一级缓释结构体和无因子缓释结构体的制备(对照组)
(一)二级缓释结构体与三级缓释结构体的不同是，载体材料中不含血管化生长因子缓释微球，具体制备方法是：
1、将质量分数10％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2、将实施例4获得的含血管内皮细胞层的水凝胶微球、表皮生长因子(Abcam，ab9697)和脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)分别以体积比2:1、10ng/ml和106个/mL的浓度与载体材料前体溶液均匀混合后，以100mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置1小时，完成载体材料交联过程。
3、采用内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)培养步骤2中获得的人工结构体，每2-3天换液，培养1-30天(优选7天)。形成二级缓释人工结构体。
(二)一级缓释结构体与二级缓释结构体的不同是，载体材料中不含水凝胶微球，具体制备方法是：
1.将质量分数10％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2.将表皮生长因子(Abcam，ab9697)和脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)分别以10ng/ml和106个/mL的浓度与载体材料前体溶液均匀混合后，以100mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置1小时，完成载体材料交联过程。
3.采用内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)培养步骤2中获得的人工结构体，每2-3天换液，培养1-30天(优选7天)。形成一级缓释人工结构体。
(三)无因子缓释结构体与一级缓释结构体的不同是，载体材料中不含表皮生长因子，具体制备方法是：
1.将质量分数10％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2.将脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)以106个/mL的浓度与1获得的载体材料前体溶液均匀混合后，以100mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置1小时，完成载体材料交联过程。
3.采用内皮细胞培养液(含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基)培养步骤2中获得的人工结构体，每2-3天换液，培养1-30天(优选7天)。形成无因子缓释人工结构体。
实施例7人工结构体体外生物反应器培养、血管网络的形成及检测
本发明的三级缓释人工结构体(实验组)，以及对照组(二级缓释结构体、一级缓释结构体和无因子缓释结构体)培养方式和检测方式相同。
采用微重力生物反应器培养实验组及对照组的人工结构体，形成血管化结构。体积比将各人工结构体从细胞接口接种(一个结构体接种一个腔)至10ml腔体体积的微重力生物反应器(Synthecon，RCCSTM)内，排空反应器内气泡并封闭排气口。将生物反应器装置置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，以100rpm转速(以使人工结构体悬浮不下沉的最小速度为宜)培养8～12天，每天半量换液。
采用CD31免疫荧光染色鉴定人工结构体血管样结构形成情况。具体操作步骤为：采用冰冻切片机将人工结构体制备为5～10μm的薄片。4℃丙酮固定5～10min，烘箱干燥20min，磷酸缓冲液(phosphatic buffer solution,PBS)(BI,02-024-1AC)清洗3次；用0.3％Triton-X(Sigma,X100)破膜处理10min；用10％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)(Multicell,800-096-EG)封闭1h；加入一抗溶液Anti-CD31(Abcam，ab24590，1:1000稀释)，4℃过夜。用PBS洗涤3次，每次3min；加入对应二抗，Alexa
Figure BDA0001865332040000131
488(Abcam，150113，稀释1000倍)，室温避光孵育2h后，用磷酸缓冲液(Sigma)冲洗组织3次，每次5min。使用荧光显微镜(LSCM，Nikon，Z2)进行图片观察，如图3A和3B所示。随机选择三个视野，根据荧光染色图片定量分析得到结构体中生成的血管样结构密度，如图3C所示。
由生物反应器培养和检测结果可见，本发明提供的三级因子缓释人工结构体生成大量血管样结构，与三组对照组数据存在显著性差异。
实施例8人工结构体移植
将人工结构体移植入免疫缺陷裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，BALB/c-nude，N＝4)皮下。在植入28天后，挑选注射部位样品取出，石蜡切片，并进行免疫组化HE(Sigma)染色，在光学显微镜(DP70,Olympus)下观察植入物切片，如图4A和4B所示。每个样品选取3个随机视野，根据HE染色图片定量分析得到结构体中生成的血管密度，如图4C所示。由检测结果可见，本申请提供的人工结构体明显在体内再生功能性血管网络，这些血管与体内血管汇通，观察到大量红细胞的存在，并与三个对照组数据存在显著性差异。血管再生速度最可达约6mm2/天的量级。
实施例9获取天然血管网络
在某些应用中，如需要提取血管结构，则将从生物反应器或体内取出的移植物浸泡在55mM柠檬酸钠(Sigma)溶液中，溶解尚未完全降解的材料，5min后用PBS溶液润洗3次，即可获得血管网络结构。
实施例10含间充质干细胞层的水凝胶微球的制备
1、间充质干细胞(ATCC，ADSC)常规培养在干细胞细胞培养液(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)中，取生长状态良好的干细胞以107个/mL的密度重悬在内皮细胞培养液中。
2、采用微重力生物反应器制备血管化细胞层：将重悬的间充质干细胞以3:1的体积比与实施例3中得到的微球混合，将10mL混合物从细胞接口接种至微重力生物反应器(Synthecon，RCCSTM)内，排空反应器内气泡并封闭排气口。将生物反应器装置置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内，以20rpm转速培养(以使水凝胶微球悬浮不下沉的最小速度为宜)3～5天，每天半量换液，培养7天。
实施例11人工结构体(三级缓释结构体)的制备
1、将质量分数5％的明胶(Sigma-Aldrich,G1890)溶液(溶剂PBS缓冲溶液)和胶原溶液(Sigma，C7661)按照体积比1:1均匀混合形成载体材料前体溶液。
2、将实施例1获得的血管化生长因子缓释微球、实施例10获得的含间充质干细胞层的水凝胶微球、表皮生长因子(EGF，Abcam，ab9697)和脐静脉血管内皮细胞(ATCC，HUVEC)分别以体积比10:1、2:1、10ng/ml和106个/mL的浓度与载体材料前体溶液均匀混合后，以100mL/孔的体积移入96孔板中，在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱内静置1小时，完成载体材料交联过程。
3、采用内皮细胞和间充质干细胞1:1均匀混合培养液(内皮细胞培养液为：含有2％胎牛血清，0.1mg/ml肝素钠和0.04mg/ml内皮细胞生长辅助物ECGS的F12培养基；间充质干细胞培养液为：含有10％胎牛血清的DMEM培养基)培养步骤2中获得的人工结构体，每2-3天换液，培养1-30天(优选7天)。
4、按照实施例7的方法进行人工结构体体外生物反应器培养。由生物反应器培养和检测结果可见，本发明提供的三级因子缓释人工结构体生成大量血管样结构。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种可用于血管网络发生的工程化人工结构体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、含血管化生长因子3的水凝胶微球的制备；
S2、将涂覆材料均匀涂覆在S1制备的水凝胶微球表面，得到具有涂层的水凝胶微球；
S3、将血管化细胞A与S2制备的具有涂层的水凝胶微球混合，在血管细胞培养液内培养3-5天，得到含血管化细胞层的水凝胶微球；
S4、血管化生长因子1缓释微球的制备；
S5、人工结构体的制备：将S3制备的含有血管内皮细胞层的水凝胶微球、S4制备的血管化生长因子1缓释微球、血管化生长因子2、血管化细胞B与载体材料混合，在血管细胞培养液内培养，即得可用于血管网络发生的工程化人工结构体；
其中，所述血管化细胞A、B为相同或不同的血管化细胞；
所述涂覆材料为生物可降解的，且具有生物活性、细胞粘附性和生物相容性天然生物材料；
所述载体材料为具有生物相容性的天然生物材料和/或人工合成生物材料；
所述血管化生长因子3为血管内皮细胞生长因子，所述血管化生长因子1为碱性成纤维细胞生长因子，所述血管化生长因子2为表皮生长因子；
所述血管化细胞A、B都为脐静脉血管内皮细胞、间充质干细胞、内皮祖细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S1制备的微球平均直径为50-1000μm，S4制备的微球平均直径为10nm-100μm，且S4制备的微球平均直径小于S1制备的微球。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述涂覆材料选自胶原、纤维蛋白原、matrigel、层连蛋白、黏多糖中的至少一种；和/或
所述载体材料中的天然生物材料选自明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、纤维素、纤维素衍生材料、琼脂、基质胶、胶原、胶原衍生物、氨基酸、氨基酸衍生物、蛋白多糖、蛋白多糖衍生物、糖蛋白及衍生材料、透明质酸、透明质酸衍生物、壳聚糖、壳聚糖衍生物、DNA水凝胶材料、层连接蛋白、纤连接蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白衍生物、丝素蛋白、丝素蛋白衍生物中的至少一种；和/或
所述人工合成生物材料选自聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酰胺、聚氨基酸、聚缩醛、聚吡咯、聚酯、聚乙烯、聚氧化乙烯中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述载体材料中的天然生物材料为藻酸钠、明胶或胶原。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述人工合成生物材料为聚乳酸或乳酸-羟基乙酸共聚物。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，S4以藻酸钠为成囊材料制备微球。
7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，S1和S4都采用非接触式高压静电法制备微球。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法构建得到的人工结构体。
9.权利要求8所述人工结构体在制备血管再生材料中的应用。
10.一种构建血管的方法，其特征在于，将权利要求8所述人工结构体在装有血管细胞培养液的生物反应器内培养8-12天。
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