CN105311677B - 用于医疗移植物的细胞接种的方法、基底和系统 - Google Patents

Abstract

描述了用于制备给患者施用的包含细胞的移植物材料的方法、细胞生长基底和装置。可在细胞生长基底中界定管状通道以促进细胞至基底的分配。还描述了用于制备接种细胞的移植物组合物的方法和装置，用于在施用细胞之前预条件化细胞生长基底的方法和装置，以及具有新型基底的接种细胞的移植物，以及其用途。

Description

用于医疗移植物的细胞接种的方法、基底和系统

本申请是申请号为201180031363.6、申请日为2012、12、24的同名申请的分案申请。

参考相关申请

本申请要求2010年5月25日提交的标题为METHODS,SUBSTRATES,AND SYSTEMSUSEFUL FOR CELL SEEDING OF MEDICAL GRAFTS的美国临时专利申请系列No.61/348,135的利益，其通过引用整体并入本文。

背景

本发明总地来说涉及医学材料和方法，并且在具体方面涉及包含细胞的医疗移植物以及用于制备其的方法、基底和装置。

组织工程领域已显示了用于改进跨多种病况或损伤的患者的医学治疗的远大前景。研究的一个领域是，包含来自患者或其它来源的活细胞的可植入移植物材料的领域。关于来自患者的细胞的收集和再引入(称为自体细胞治疗)，用于处理来自患者的组织样品以产生可被再引入患者的细胞制剂的方法和系统是已知的。已有人提出，可将此类方法和系统在医院中在“床边”使用，例如用于其中生物学组织样品获自患者，被处理成细胞组合物并且被再引入患者的单次医院过程或医院就诊。

在某些使用模式中，可将待引入患者的细胞与细胞生长基底组合以形成包含细胞的可植入移植物。有时，此类使用模式包括，在应用于细胞生长基底后扩增细胞数目的培养期。其它使用模式不包括这样的扩增。相反地，将细胞施用至细胞生长基底，然后植入而无需培养期。

虽然已显示了应用前景，但包含细胞的移植物材料的临床实施一直以来进展缓慢。存在对用于将细胞与细胞生长基底组合以便它们在患者中能够存活并且通常扩增的更方便和/或有效的方法或材料的需要。在某些方面，本发明解决了此类需要。

概述

在一些实施方案中，本发明提供了用于制备给患者施用的包含细胞的移植物材料的方法、细胞生长基底和装置。本发明的细胞生长基底可包括允许它们与细胞悬浮液的增强的组合的特征。在某些实施方案中，此类特征包括，在将细胞悬浮液施用于基底的过程中促进细胞分配的、在细胞生长基底中界定的管状通道。本文中公开的其它实施方案涉及，用于制备接种细胞的可流动基质(matrix)移植物组合物的方法和装置；用于在将细胞组合物应用于细胞生长基底之前预条件化(pre-conditioning)所述细胞生长基底的方法和装置；用于通过将细胞组合物与基底材料组合来制备接种细胞的可植入移植物的自动化方法和装置，例如包括用于将细胞分配在整个基底材料中的特征；以及细胞生长基底的颗粒形式和它们用于制备可流动的细胞移植物材料的用途。

在一个具体的实施方案中，提供了用于支持细胞生长的细胞生长基底。所述基底包括至少一个伸长的管状通道，该通道具有界定从细胞生长基底主体的表面上的第一管腔开口延伸入细胞生长基底的内部区域的管腔的通道壁。管腔可被构造来接收包含细胞的液体介质流以将细胞分配至细胞生长基底的内部区域中。细胞生长基底可以为细胞生长基质。基底可包含胶原和/或还可包含在基底的外部并且与管腔开口流体连接的合成的聚合管状元件。基底可包括多个管状通道。至少一个管状通道可包括至少一个主管状通道和至少一个从主管状通道分枝的次级管状通道(secondary tubular passage)。基底可包含可重塑的胶原性细胞外基质片层材料，且片层材料可保有用于片层材料的来自动物来源组织的蛋白聚糖、生长因子、和/或糖胺聚糖。

在另一个实施方案中，提供了用于制备接种细胞的材料的方法，其包括将细胞生长基底例如上述段落中描述的细胞生长基底连接至液体细胞悬浮液的来源，其中连接包括将伸长的通道与所述来源的运输腔流体连接。该方法还包括将一定量的液体细胞悬浮液运输通过运输腔，并进入伸长的通道以将细胞递送至基底的内部区域。连接步骤可包括，将基底插入细胞接种室(具有与液体细胞悬浮液的来源流体连接的输入管)和将输入管流体连接至基底的第一管腔开口。

在其它实施方案中，提供了用于制备用于递送至患者的接种细胞的组合物的方法。所述方法包括，将流体细胞外基质颗粒组合物(包含细胞外基质的颗粒和液体介质)与液体细胞悬浮液组合以形成细胞流体组合物。所述方法还可包括，混合细胞流体组合物和/或使细胞流体组合物形成凝胶。导致胶凝的方法(gel-causation)可包括改变细胞流体组合物的pH和/或改变细胞流体组合物的温度的步骤。

其它实施方案提供了用于制备和施用细胞移植物的方法。所述方法包括将血清蛋白质组合物应用于适合给患者施用的生物相容性基底，以制备包括血清蛋白质组合物和生物相容性基底的预条件化的基底。将细胞添加至预条件化基底以制备细胞移植物，并将细胞移植物施用至患者。应用血清蛋白质组合物的步骤可包括喷雾施用组合物。添加细胞的步骤可包括将液体细胞悬浮液喷雾至预条件化的基底上和/或将液体细胞悬浮液传输进入基底的管状通道。

在另一个实施方案，提供了用于给基质接种细胞的装置。装置包括用于接收液体细胞悬浮液的第一小室和用于接收待接种细胞的细胞生长基质材料的第二小室。接种装置还包括用于将一定量的液体细胞悬浮液从第一小室转移至第二小室的通道、用于检测液体细胞悬浮液的至少一个状况的装置和用于将一定量的液体细胞悬浮液应用于第二小室中接收的基质材料的施用装置。施用装置可包括至少一个喷嘴或至少一个具有管腔的套管。接种装置还可包括用于移动喷嘴或套管的机械装置。在施用装置包括套管的情况下，可操作移动机械装置，以向近端(proximally)撤回套管同时从套管的开口例如最远端开口分配液体细胞悬浮液。接种装置还可包括用于将基质材料相对于施用装置保持在预定位置中的定位结构(registration structure)。接种装置还可包括分配辅助装置，该分配辅助装置与第二小室联接并且可用于在利用施用装置将细胞施用至基质材料后促进细胞在基质材料内的分配。分配辅助装置可被操作以产生横跨基质材料的磁场；可以是混合器，所述混合器可被操作以在第二小室接收的液体中产生流动；可被操作以在第二小室内产生压力梯度；可被操作以移动第二小室中接收的细胞生长基底；和/或可被操作以旋转第二小室，从而至少部分地通过离心力将细胞分配在细胞生长基质材料内。当存在时，可被操作以产生流动的混合器可被操作以在第二小室接收的液体中产生脉动的(pulsatile)双向流动。

其它实施方案提供了用于制备可流动的接种细胞的移植物的装置。装置包括包含液体细胞悬浮液的第一小室，和包含待接种细胞的可流动的细胞生长基底材料的第二小室，第二小室流体连接至第一小室，从而可将液体细胞悬浮液与可流动的细胞生长基底材料组合以形成可流动的接种细胞的移植物材料。装置还可包括可被操作以混合可流动的接种细胞的移植物材料的混合器。混合器可以是位于可流动的接种细胞的移植物材料的流动路径内的静态混合器，或旋转混合器。第一和/或第二小室可以是通道。

在另一个实施方案，提供了用于制备用于治疗患者包括人患者的接种细胞的基底的方法，和潜在地用于治疗患者的方法。所述方法包括，处理患者的组织样品以获得患者的细胞悬浮液，和将细胞生长基底加载至细胞接种装置的温育小室中。所述方法还包括，起始细胞接种装置的操作，其中操作引起细胞悬浮液的至少一个状况的检测，以及引起细胞悬浮液与细胞生长基底的组合以形成接种细胞的基底。在用于治疗患者的方法中，该方法还包括给患者施用接种细胞的基底。

还提供了用于制备接种细胞的基质的方法，该方法包括将细胞与可胶凝的具有第一粘度的组合物混合以形成可胶凝的细胞混合物，和将可胶凝的细胞混合物施用至细胞生长基底。所述方法还包括使可胶凝的细胞混合物胶凝，以形成与所述细胞生长基底接触的细胞凝胶。凝胶可具有大于第一粘度的第二粘度。混合物的胶凝可通过任何适当的措施或其组合，包括例如改变(例如升高或降低)混合物的pH和/或改变(例如升高或降低)混合物的温度来引起。可将混合物与基底接触，以在基底的外表面上提供涂层(layer)，和/或可将其大体上均匀分配在基底(例如当基底是多孔的时候)，或至少基底的部分中。混合物的随后胶凝可提供外部细胞化的凝胶层和/或大体上均匀地分配在整个基底或基底的一部分中的细胞化的凝胶。

在其它实施方案中，提供了接种细胞的移植物，其包括细胞外基质基底材料，应用至基底材料的胶原性凝胶，和附着至基底材料、凝胶或两者的细胞。胶原性凝胶可包含含有天然胶原的细胞外基质水解物和至少一种另外的来自细胞外基质水解物的来源组织的天然生物学活性物质。至少一种另外的天然生物学活性物质可包括生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖。

其它实施方案提供了用于制备用于治疗患者包括人患者的细胞移植物的方法以及潜在地用于治疗患者的方法。所述方法包括从患者获得血清，处理患者的组织样品以获得患者的细胞群。所述方法还包括将血清施用至基质基底(matrix substrate)以制备血清预条件化的基质基底，和将细胞群施用至预条件化的基质基底以形成细胞移植物。在用于治疗患者的方法中，该方法还可包括给患者施用细胞移植物。

在其它实施方案中，提供了用于制备用于治疗患者的材料的方法以及潜在地用于治疗患者的方法。所述方法包括将细胞悬浮液与颗粒状细胞生长基底组合，温育与颗粒状细胞生长基底接触的细胞悬浮液以形成细胞化的颗粒体(particulate body)，所述颗粒体具有附着至颗粒状细胞生长基底的颗粒的细胞，其中在不使细胞数目显著扩增的条件和持续时间下进行温育。在用于治疗患者的方法中，该方法还包括给患者施用细胞化的颗粒体。在某些形式中，可在有效地实现至少20％的悬浮细胞附着至颗粒而无细胞数目的扩增的条件和持续时间下进行所述方法的温育。

另一个实施方案提供了用于治疗患者的细胞移植物，以及潜在地细胞移植物在利用细胞移植物治疗患者的方法中和/或在制造用于治疗患者的材料的方法中的用途。细胞移植物包括包含附着至细胞外基质颗粒的细胞的细胞化的颗粒体。为了用于治疗，可将细胞移植物导入患者。

另一个实施方案提供了包括颗粒状细胞生长基底材料和附着至细胞生长基底材料的颗粒的细胞的细胞移植物材料。细胞包括内皮祖细胞、肌肉来源细胞或其组合。颗粒可以是从动物来源分离的并且任选地经处理以保留内源生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖的天然来源的细胞外基质片层材料的颗粒。可通过粉碎片层材料以形成随机产生的颗粒和/或通过切割片层材料以形成规则形状的颗粒(例如圆形、椭圆形和/或多边形的形状)来制备天然来源的细胞外基质片层材料的此类颗粒。

其它实施方案提供细胞移植物，所述移植物包含由细胞外基质材料组成的纤丝和附着至纤丝的细胞群。纤丝可以是从动物来源分离的并且经处理以保留内源生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖的天然来源的细胞外基质片层材料的区段。

另一个实施方案提供了细胞移植物，所述移植物包括以纤丝形式存在的细胞生长基底和附着至纤丝的细胞群，其中细胞包括内皮祖细胞。在本发明的其它实施方案中，可将该细胞移植物引入患者的组织，所述实施方案提供了用于血管化患者的组织的方法。

另一个实施方案提供了用于制备细胞移植物的方法。所述方法包括提供第一细胞生长基底片层，以及首先将细胞组合物施用至第一细胞生长基底片层的表面以形成第一接种细胞的表面。在所述第一施用后，所述方法包括将第二细胞生长基底片层堆叠在所述第一接种细胞的表面上。所述方法还包括随后将细胞组合物施用至第二细胞生长基底片层的表面。

另一个实施方案提供了包括第一细胞生长基底片层和堆叠在第一片层上的第二细胞生长基底片层的细胞移植物。移植物还包括位于第一片层与第二片层之间的一层接种的细胞。

另一个实施方案提供了用于制备接种细胞的移植物的装置。装置包括用于接收细胞生长基底的温育小室和用于将液体细胞悬浮液施用至细胞生长基底的施用装置，施用装置包括用于分配一定量的悬浮液的多个套管。装置可被构造来撤回多个套管同时从其分配一定量的悬浮液。

在另一个实施方案中，提供了细胞生长基底组合物，其包括包含具有紧凑形状的片层形式的细胞生长基底颗粒的颗粒材料。在一些形式中，至少25％的片层形式的基底颗粒，当在片层的平面中考虑时，具有第一最大横截面尺寸轴(dimension axis)，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面轴的长度的约2倍。基底颗粒可具有在约20微米至约2000微米的范围内的最大横截面尺寸。基底颗粒可以是从动物来源分离的并且任选地经处理以保留内源生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖的天然来源的细胞外基质片层材料的颗粒。可以例如通过切割片层材料以形成具有紧凑形状(例如圆形、椭圆形和/或多边形形状)的颗粒来制备天然来源的细胞外基质片层材料的此类颗粒。

另一个实施方案提供了细胞外基质组合物，其包括包含具有紧凑形状的片层形式的细胞外基质颗粒的颗粒状细胞外基质材料。至少25％的片层形式的细胞外基质颗粒，当在片层的平面中考虑时，可具有第一最大横截面尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面轴的长度的约2倍。细胞外基质颗粒可具有在约20微米至约2000微米的范围内的最大横截面尺寸。细胞外基质颗粒可以是从动物来源分离的并且任选地经处理以保留内源生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖的天然来源的细胞外基质片层材料的颗粒。天然来源的细胞外基质片层材料的此类颗粒可以例如通过切割片层材料以形成紧凑形状(例如圆形、椭圆形和/或多边形形状)的颗粒来制备。细胞外基质组合物还可包括附着至颗粒的细胞，在某些实施方案中细胞大体上覆盖颗粒的整个外表面和/或在表面上形成大体上汇合的单层。细胞可包括内皮细胞、内皮祖细胞或其混合物和/或可以是克隆的。在一些情况下，细胞可由内皮细胞、内皮祖细胞或其混合物组成。

在另一个实施方案中，提供了细胞生长基底制品，其包括细胞生长基底材料，和封装细胞生长基底材料并且被构造来指导流体介质流动通过基底材料的封装材料。封装材料可界定至少第一开口，和至少与第一开口间隔的第二开口。

另一个实施方案提供了细胞移植物，其包括来源于脂肪组并且包括干细胞、内皮祖细胞、白细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的细胞的混合群体。细胞移植物还包括包含细胞外基质材料和/或以颗粒形式存在的细胞生长基底。细胞外基质材料可包括对于细胞外基质材料的来源组织是天然的(native)保留的生物学活性组分。保留的生物学活性组分可以是生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖。当使用时，颗粒状细胞生长基底可包含片层形式的颗粒。为了这些目的，天然来源的细胞外基质片层材料的片层形式的颗粒可例如通过切割片层材料以形成颗粒例如具有紧凑形状(例如圆形、椭圆形和/或多边形形状)的颗粒来制备。

在其它实施方案中，提供了包括内皮祖细胞群和颗粒状细胞生长基底的细胞移植物。颗粒状细胞生长基底可包括片层形式颗粒和/或可包括细胞外基质材料。用于这些目的细胞外基质颗粒可以为从动物来源分离的并且任选地经处理以保留内源生长因子、糖胺聚糖和/或蛋白聚糖的天然来源的细胞外基质片层材料的颗粒。天然来源的细胞外基质片层材料的此类颗粒可以例如通过切割片层材料以形成紧凑形状(例如圆形、椭圆形和/或多边形形状)的颗粒来制备，或可以为例如通过随机粉碎片层材料而产生的片层材料的片段。

另一个实施方案提供了用于给基质接种细胞的系统。系统包括用于将细胞与待接种细胞的细胞生长基底组合的小室。系统还包括用于评估细胞对基底的附着的机械装置。用于评估的机械装置可包括细胞计数器。用于接种基质的相关方法包括如下步骤：将细胞与待接种细胞的细胞生长基底组合，和评估细胞对基底的附着。在治疗方法中，该方法还可包括给患者包括人患者施用接种有附着的细胞的基底。

根据本文中的其他描述，本发明的另外的实施方案以及其特征和有利方面将变得显而易见。

附图概述

图1提供了本发明的细胞生长基底的一个实施方案的侧视图。

图2提供了本发明的细胞生长基底的另一个实施方案的侧视图。

图3提供了图1的基底的顶视图。

图4显示本发明的可选择的细胞生长基底的顶视图。

图5显示细胞生长基底的其它实施方案的顶视图。

图6显示具有歧管进料(manifold feed)的细胞生长基底的另一个实施方案的顶视图。

图7显示细胞生长基底的另一个实施方案的顶视图。

图8提供了细胞生长基底的另一个实施方案的顶视图，所述实施方案在基底中具有较大的主通道和较小的次级通道。

图9提供了用于将细胞组合物施用至细胞生长基底的系统的一个实施方案的示意图。

图9A举例说明图9的系统的某些亚组件的一个实施方。

图9B举例说明图9的系统的某些亚组件的另一个实施方案。

图10提供用于将细胞组合物与细胞生长基底组合的装置的另一个实施方案的示意图。

图11为其组合物可用作细胞生长基底的脱细胞ECM片层的紧凑片层颗粒的数字图像。

图11A提供了与递送装置组合的本发明的可流动的细胞移植物材料的示意图。

图12提供了本发明的细胞化的纤丝移植物的示意图。

图12A提供了具有远端滞留倒钩(retention barb)的本发明的细胞化的纤丝移植物的示意图。

图12B提供了用于植入移植物的递送针套管中接收的图12A的移植物的示意图。

图13提供了具有多个堆叠的细胞生长基底片层的本发明的细胞移植物的示意图。

图14至16提供了本发明的细胞生长基底制品的示意图。

图17和18提供了本发明的另外的细胞移植物构建体的示意图。

详细描述

为了帮助理解本发明的原理，现参考实施方案(其中一些实施方案在附图中进行了举例说明)，并且使用具体的语言来描述所述实施方案。然而应理解，本发明的范围无意受此限制。设想了所描述的实施方案的任何改变和其它改进以及本文中描述的本发明原理的任何其它应用，这对于本发明涉及的领域内的技术人员来说是可想到的。

如上文中所公开的，本发明的方面涉及用于将细胞与基底材料组合以制备可用于某些实施方案如用于患者的医学植入物的组合物的方法、材料和系统。

具有界定的内部通道的细胞生长基底

现参考图1-8，显示了对于与细胞组合物组合以形成包含细胞的移植物材料是特别有用的细胞生长基底构建体的各种实施方案。

具体地，图1提供了基质基底20的侧视图。基底20包括优选包含适合于支持细胞生长的多孔基质材料的基底主体21。基底主体21包括延伸入基底主体21的内部区域的内部界定的通道22。在描述的实施方案20中，基底主体21包括以这样的方式连接至第二片层24的第一片层23，所述方式界定片层23与片层24之间的通道22。片层23与片层24沿着连接的区域25在环绕通道22的面中彼此连接。连接的区域25可以是例如在片层23与片层24的相对表面之间建立紧密连接的键合、融合、胶粘、交联、缝合的安排或其它安排。管状通道22因此包括具有由片层23的面界定的部分26和由片层24的相对面界定的部分27的通道壁。在示例性实施方案中，使区域26和27产生为圆形，从而为通道22提供大体上圆形或椭圆形横截面。应理解，其它安排也是合适的，包括具有多边形或不规则横截面形状的通道。连接的区域25具有位于通道22的管腔处的末端区域28和29。末端区域28和29从而可用作沿通道22的壁的缝。

为了制备基底20，可将通道形成元件置于片层23与片层24之间，随后可将此类片层在连接区域25中彼此连接，从而将通道形成元件夹在片层之间。如上文中指出的，该连接可以是键合、融合、胶粘或另外的方式。当期望通道22的开口位于基底20的最外部边缘时，通道形成元件可延伸至或超出片层23和24的最外部边缘，由于它们彼此层叠，从而在成品中提供这样的开口。在此类制备方法中，通道形成元件可以是杆状、棒状、梳状结构、导线、管或适用于维持片层23与24之间的空间以在成品中提供通道的任何其它元件。在其中通道形成元件在连接的区域25形成后将被移除的实施方案中，期望通道形成元件具有外部表面，所述外部表面能充分避免粘结或结合至片层23与24的相对面，从而通道形成元件在连接的区域25形成后可被除去以保持通道22完好无损。

在某些实施方案中，通道形成元件或至少其部分将保留在成品中。现参考图2，显示了一个这样的实施方案。基底30包括与基底20相同的特征并且一般情况下可以以相同的方式构建。因此，基底30包括主体31、至主体31的内部区域的通道32和彼此连接的片层33和34。此外，基底30包括片层33与34之间接收的驻留管状元件35。管状元件35可由生物相容性聚合物或其它适当的材料制造，并且可保留在基底30中以植入患者。管状元件35可包含永久性聚合物(非生物可吸收的)或生物可吸收的聚合物。在某些实施方案中，管状元件35包含生物可吸收的聚合物并且可在植入患者后被完全吸收。在基底30的制造中，可将管状元件35置于片层33与34之间，随后可如上文中对于基底20(图1)所描述的连接片层。或者，可首先制备装置例如基底20，此后可将管状元件插入通道22。管状元件35可包括多孔壁或在它们的壁中包括洞或穿孔，以允许可流动的细胞悬浮液传输通过管状元件35的壁并且进入移植物主体31的周围区域。在某些形式中，管状元件35由这样的材料构建，所述材料与主体31的材料相比，较不易被含水细胞悬浮液吸收，和/或润湿时比主体31的材料保持更坚硬以保留开口通道，从而可用于更好地将含水细胞悬浮液流沿着通道32传输以到达基底31的内部区域。可控制管状元件35中的穿孔的孔隙度，以在将含水细胞悬浮液流输入通道32后，优化基底31的润湿和细胞接种。

现参考图3，显示了图1的基底装置20的顶视图。通道22以幻影(虚线)显示。如所描述的，基底20通常为矩形结构，包括第一对通常平行的侧面40和41，以及与其垂直的第二对通常平行的侧面42和43。通道22具有暴露于基底20的侧面40的开口。描述的实施方案中的通道22为盲孔(blind hole)，并且在主体21的内部具有末端44，与主体21的侧面41相距距离“d”。这样，流体组合物例如含水细胞悬浮液可从侧面40传送入通道22，且不会通过通道22一直被输送至对侧面41。这可提供增强的在通道22内产生流体压力以更快地将细胞悬浮液和/或另一种流体例如基底预条件化介质分散入主体21的相邻区域的能力。在某些使用模式中，盲孔通道22可经历由通过开口引入侧面40上的通道22的流体产生的流体压力，以驱动流体和溶解的或悬浮的(例如细胞)材料进入和通过主体21的内部空间(volume)。

参考图4-8，显示了界定内部通道的基底装置的可选择的实施方案。特别地参考图4，显示了具有与图1和3的基底20的特征相似的特征的细胞生长基底50，除了具有从基底的第一周界完全延伸至第二周界的通道外。具体地，基底50包括通常具有矩形形状的主体51(具有第一侧面52、通常与侧面52平行的第二侧面53、第三侧面54和通常与侧面54平行的第四侧面55)。基底50包括多个延伸通过主体51的材料的通道22。通道22具有存在于基底50的侧面52上的第一组开口56，和存在于基底50的与侧面52相对的侧面53上的第二组开口57。这样，通道22在基底主体51的间隔位置上(在举例说明的实施方案中在相对的侧面52和53中)提供了开口56和57。可将包括细胞的可流动的组合物从开口56通过通道22输送至开口57，以允许细胞渗入、接触和附着至主体51的材料，从而使细胞定殖在基底50上。

参考图5，显示了与图4的基底50相似的细胞生长基底60，除具有彼此交叉的第一和第二组通道外。因此，基底60包括具有第一侧面62、第二侧面63、第三侧面64和第四侧面65的基底主体61。基底60包括第一组多个通道22，通道22在主体61的侧面62上具有开口66并且在主体61的侧面63上具有相对的开口67。基底60包括第二组多个通道68，所述通道68以与通道22的方向相交的方向穿过主体61，在举例说明的实施方案中与通道22的方向大主体上垂直。通道68包括存在于侧面64中的开口69，和存在于侧65中的相对开口70。在某些实施方案中，通道68在遍布主体61的通道交叉点71上流体连接至通道22并且与其相交。在使用中，可通过将细胞组合物流动通过通道22和通过通道68来用细胞定殖基底60。在这一点上，在细胞定殖的操作过程中，可同时或在不同的时间或使用这两种方式的组合将流体细胞组合物通过通道22和68。在其中通道22和68彼此相交并从而流体连接的实施方案中，细胞组合物或其它流体同时通过通道22和68的同时通过可在交叉点71上产生流体流动状况(fluid flow condition)例如湍流、涡流或至少净流动的部分再定向(沿着与通道22和通道68都不一致的矢量方向)，以帮助驱动流体流出通道并且进入周围的组成基底主体61的材料的内部空间。这可提供了细胞或其它物质在基底主体61的整个内部空间上的更快速或高效的分配。

参考图6，显示了具有通过共同的歧管结构进料的多个通道22的细胞生长基底80。具体地，基底80包括具有多个延伸穿过其的通道22的主体81。共同的进料通道82流体连接至多个通道22。共同的进料通道82依次地流体连接至具有朝向主体81的外部的开口84的输入通道83。通道22各自具有朝向主体81的外部的开口85。在使用中，流体例如细胞组合物可通过开口84传送入输入通道83，然后流体组合物传送入共同通道82，其依次将流体组合物分配至通道22中并且通过通道22，经由开口85排出。这样，流体细胞或其它组合物可进行循环并且潜在地通过基底80再循环以将细胞定殖在基底中。关于本文中描述的其它实施方案，为实现该目的，通道22以及潜在地还有通道82和83对于组合物是可渗透的，以允许逸出至相邻的主体81的内部空间中。

现参考图7，显示的是另一种细胞生长基底90。基底90包括主体91和第一、第二、第三及第四侧面，分别地92、93、94和95。主体91包括延伸通过主体91的材料并且具有第一外部开口97和与其间隔的第二外部开口98的曲折通道96。在示例性实施方案中，曲折内部通道96包括与第二组多个弯管(bend)100相对存在的第一组多个弯管99，弯管99与100相对而置。通常直通道段(straight passage segment)101互连弯管99和100。这样，当曲折通道96从开口97遍历至开口98时，其采取通常重复的正弦波形状。含有细胞的流体可从开口97通过曲折通道96循环并且到达开口98，在该过程中细胞和流体逸出通道96以向基底91的内部空间提供细胞接种。

现参考图8，显示了与上述基底90共有许多共同特征的细胞生长基底110，所述特征进行了相应编号。然而，基底110还包括多个流体连接至主通道116并且从主通道116引导的次级通道122，次级通道具有比曲折通道116更小的直径或横截面积。次级通道122因此可接收通过主通道116传输的细胞液流，并且帮助将流体和其中的细胞分配在整个基底主体111中。

应理解，在图1和3-8中描述的细胞生长基底的其它实施方案中，可在部分或所有界定的内部通道内接收单独的管状元件，如上文结合图2描述的。此外，在优选实施方案中，用于制备示例性基底的片层(例如23和24)可包含脱细胞的ECM组织片层(期望地保留天然的(内源)生物学活性组分)，如在下文中所描述的。同样地，图1-8中举例说明的基底主体可包含或由多孔海绵或泡沫基质组成，其可以例如通过将基质形成材料例如本文中描述的任何基质形成材料围绕通道浇铸来形成，随后将其除去或存留在成品中以促成通道，如上文中所描述的。

细胞/基底处理系统和方法

在本发明的其它方面，提供了用于给基底自动接种细胞的装置。图9提供了自动细胞接种系统200的一个实施方案的示意图。系统200可任选地包括原始组织处理模块201，其处理原始或早期组织样品以提供来源于组织样品的单细胞悬浮液的输出。处理模块201从而可被操作以进行一个或多个共同针对该目的的功能，包括例如组织的物理破坏(例如浸软)、组织的酶促(例如胶原酶、胰蛋白酶)或其它化学离解和/或利用盐水或其它适当的洗涤介质进行的组织或细胞组分的洗涤。组织处理模块201还可进行细胞分离或浓缩步骤，包括例如特定类型或种类的细胞的免疫化学选择、分级分离、过滤、沉降或其它类似操作。模块201还可包括扩增细胞群的特征，例如提供生长基底或生长介质和适当的温育条件以扩增细胞数目。用于组织处理以输出细胞悬浮液的示例性系统公开于2005年2月3日公布的美国专利公开案US2005/0025755、2007年1月18日公布的国际公开案WO2007/009036、2008年1月17日公布的美国专利申请公开案US2008/0014181和2006年7月29日公布的美国专利申请公开案US2006/0141623中。针对其中的组织处理法和用于获得单细胞悬浮液的设备(适用于系统200的模块201)的教导,将这些公开案各自通过引用整体并入本文。

将模块201的细胞悬浮液输出通过导管202转移至细胞悬浮小室203。提供了用于检测细胞悬浮液的至少一个状况的装置204，以提供用于在施用至基底之前潜在地调整细胞悬浮液和/或用于优化将悬浮液施用至基底的参数的输出。例如，装置204可被操作以测定小室203中细胞悬浮液的细胞浓度，并且可操作地与小室203联接。例如，装置204可以为细胞计数装置例如Coulter计数器，其基于在细胞通过通道的过程中充满液体的通道的电阻改变获得细胞计数值。该电阻变化可被感知为电流或电压脉冲，可将所述脉冲与细胞悬浮液中的细胞浓度相关。装置204还可以是利用光散射(例如使用激光的前向光散射)计算细胞浓度值的装置。装置204还可以是使用流式细胞术测定细胞悬浮液中的细胞浓度的装置。用于测量细胞浓度的其它工具对于本领域技术人员来说是显然的，应理解用于测量细胞浓度的具体工具对于本申请公开的系统和方法而言不是至关重要的。

为了促进细胞浓度分析，装置204可通过导管205获取细胞悬浮液的样品以用于分析。任选地，否则装置204可在分析后通过导管206将细胞样品送返回小室203，除非这在小室203内引起细胞悬浮液的不期望的污染，在该情况下可通过废物管线(未显示)弃去获取的样品。装置204和/或小室203可包括用于将细胞样品移动通过导管205、206的适当的阀门和任选的泵(未显示)，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类阀门和/或泵可在过程控制器229的控制之下，如在下文中更详细地描述的。

系统200还可包括通过导管208流体连接至小室203的处理介质单元207。与系统200中的将在其中转移流体介质的所有其它导管一样，可将导管208与任选的阀门(未显示)和可被操作以驱动流体从介质单元207转移至小室203的泵209联接。应理解，泵209可由其中单个泵驱动系统200的一些或所有不同小室或其它组件间的流体转移的共享的值勤泵(pump duty)提供。因此，虽然结合系统200描述了几个单独的泵，但应理解，这些泵操作在系统200的操作内可以是共享的或单独的，或其组合。此类阀门和/或泵可在过程控制器229的控制之下，如下文中更详细描述的。处理介质单元207可包括一个或多个小室，所述小室装有用于处理或加工从模块201输出的细胞悬浮液组合物的多种介质的任一种或可向其中充满所述介质。此类介质可包括例如洗涤介质、细胞培养介质或用于准备施用至细胞生长基底的细胞的其它材料，包括例如用于细胞扩增期的不同阶段的不同介质。

系统200还包括通过导管211，任选的阀门(未显示)和联接的泵212与第一细胞悬浮液小室203流体连接的优化的细胞制剂小室210。此类阀门和/或泵212可在下文中更详细地描述的过程处理器229的控制之下。因此，在于小室203中进行任何初步处理后，可通过操作泵212以通过导管211转移悬浮液来将细胞悬浮液组合物转移至小室210用于进一步处理。提供了用于测定小室210内优化的细胞制剂的细胞浓度的装置213。装置213可具有与上述装置204类似的设计。导管214可用于将细胞悬浮液组合物的样品从小室210转移至装置213以进行分析。任选地，可提供用于在适当时将样品送回小室210的导管215。或者，如上所述，可在分析后通过废物管线弃去样品。

将配制介质单元216通过导管217流体连接至小室210。可通过任选的阀门(未显示)和泵218来促进材料从单元216的一个或多个小室转移至小室210。此类阀门和/或泵218可在下文中更详细地描述的过程控制器229的控制之下。配制介质单元216可包含待与细胞悬浮液组合并且对于给患者施用是生理上可接受的材料。配制介质可以例如包括盐水、细胞培养介质、药物例如抗生素、被设计来引发特定细胞反应例如分化或静息的物质或其它材料。在一种情况中，装置213用于测定小室210内的细胞悬浮液的细胞浓度。如果细胞浓度高于期望的用于给细胞生长基底施用的细胞浓度，则可从小室216添加配制介质以稀释细胞悬浮液，获得期望的细胞浓度。可基于小室210内的组合物的总体积和通过装置213测定的细胞浓度计算待添加的配制介质的体积。待施用至细胞生长基底的小室210中的优化的细胞制剂的有益细胞浓度可在约10⁵至约10⁸个细胞/ml的范围内，但也可使用其它浓度。在其中细胞浓度低于期望的浓度的可选择的情形中，则可以可操作地将小室210与用于增加细胞浓度(例如通过除去一定量的介质)的装置联接。在一个实施方案中，可为小室210的排出口238提供具有被选择来防止细胞通过但允许悬浮细胞的流体介质通过的孔径的滤器239。可提供任选的阀门(未显示)和泵240来对着该滤器驱动或推动一定量的细胞悬浮液以选择性从小室210除去一定量的流体介质，从而浓缩小室210内的细胞悬浮液。需要时可提供震动装置241来震动滤器以在操作过程中避免细胞对滤器的堵塞。此外或可选择地，系统可配置适当的泵和/或阀门来指导液体逆流通过滤器，以倒冲洗的模式清洗滤器。此类操作和任何伴随的阀门、泵240和/或震动装置241可在于下文中更详细地描述的过程控制器229的控制之下。通过排出口238从小室210除去的材料可以例如去向废物单元“W”。必要时，还可将废物单元W流体连接至小室203或系统200中的其它流体来源，以从其接收废物至单个废物小室或单独的废物小室中。在作为先前起始的浓度测量的结果或另外地作为将介质引入小室210或从小室210撤出介质的结果而上调或下调小室210内的细胞浓度后，可将额外的样品抽取至装置213中并且进行评估以确认细胞悬浮液在期望的细胞浓度范围内。如有必要，可进行另外的调整以获得期望的细胞浓度。在细胞悬浮液经确认具有期望的细胞浓度后，可使用任选的阀(未显示)并且通过泵220驱动，将细胞悬浮液通过导管219从小室210转移至施用装置221。此类阀门和/或泵220可在下文中更详细描述的过程处理器229的控制之下。

施用装置221可以是用于将细胞悬浮液组合物施用至接种小室222内接收的细胞生长基底223的多种装置的任一种。施用装置221在操作过程中可以是固定的，或在操作过程中可以是可移动的以横跨更广的面积或内部空间(与其固定时可能的面积或内部空间相比)施用材料。施用装置221可在下文中更详细描述的过程控制器229的控制之下。施用装置221在一个实施方案中可以为喷雾装置，例如喷嘴或与在喷墨打印机中发现的相似的喷射喷雾器。可排列此类喷雾装置以将细胞悬浮液组合物施用至基底(通过从固定位置或在一、二或三个维度中移动后将组合物喷雾至基底上)。在另一个实施方案，施用装置221可以为具有至少一个套管，优选多个套管的插套管的装置，其用于将细胞组合物从固定位置或在于一、二或三个维度中移动的过程中施用至细胞生长基底223的表面和/或其内。一些实施方案整合了插套管的施用装置221，所述装置具有一个或多个在施用细胞组合物(例如通过在始于插入在基底223的内部空间内的远端位置上的套管的拉回操作过程中从套管压出细胞组合物)的过程中插入基底223的套管。在具体实施方案中，这样的施用装置包括线性排列或其它方式排列的用于将细胞组合物施用至基底223的针。其它施用模式对于本领域技术人员来说也是显而易见的。

期望地，施用装置221将细胞组合物大体上均匀地施用至基底，施用至基底的表面或通过基底的内部空间。然而，在其它实施方案中，施用装置221可选择性地接种基底的某些部分，从而施用装置221可被构造来将细胞组合物施用至基底223的特定区域，而同时使基底的其它区域不含细胞组合物。可将不同类型的施用装置221的组合整合入系统200，例如其中系统包括喷雾施用装置和插套管的施用装置。

在本发明的具体实施方案中，系统200具有构造来将细胞接种至界定了用于接收细胞组合物流的内部通道的细胞生长基底(例如基底例如图1-8中描述的基底)上和/或其内的施用装置221。期望地，这样的实施方案中的施用装置221包括至少一个套管和优选多个套管。在某些实施方案中，套管流体连接至基底中的界定的通道(例如图1-8的通道22、68、83、84、96和/或116)并且可操作地将一定量的细胞组合物传输至通道中。在其它实施方案中，在施用装置221上为朝向细胞生长基底的外部的通道的每一个开口提供了套管，其中套管相应于此类开口并且相对于此类开口定位。在细胞组合物施用过程中是固定的施用装置221中，套管可在压力下指导细胞组合物进入通道，所述压力将引导细胞组合物流动通过通道，流出通道的侧壁，并且进入周围的基底材料的内部空间。对于包括在基底上的间隔位置上具有开口的单独通道的细胞生长基底，例如具有间隔的开口56和57的图4的基底的通道22，分别具有间隔的开口对66、67和69、70的图5的基底的通道22和68，具有间隔的开口84和85的图6的基底的通道83、84和22，以及分别地具有间隔的开口对97、98和117、118的图7和8的基底的通道96和116，施用装置221可具有流体连接至每一个开口的套管。这样的施用装置221可以例如以流通模式(flow-through mode)、相对流动模式(opposed flow mode)或其组合来操作。在流通模式中，输入套管迫使细胞组合物进入第一开口至通道中，输出套管接收穿过通道的流体，使至少一部分输出组合物的细胞沉积在细胞生长基底中。在相对流动模式中，输入套管迫使细胞组合物进入第一开口和第二开口至通道中，其中各自的输入流动至彼此相对的通道。这可在通道内产生压力，从而驱动细胞流体流出通道并且进入周围的基底材料的内部空间中，促进更均匀的接种操作。

上文提及的流通模式可以仅包括单个通过基底的细胞组合物的通道，但在有利的实施方案中可进行该模式以将输出套管中接收的材料传输回基底通道至少一次以沉积另外的细胞，这可以例如通过收集输出流体并且逆转流动方向通过通道，和/或通过提供其中输出流体再次被导向相同输入套管并且返回通过基底通道至输出套管的循环回路来实现。在许多实施方案中，包含未接种的细胞的原始输出流体将被多次传输返回通过基底通道，以将更高百分比的细胞组合物中的原始细胞接种至基底中。

在这一点上，结合图9，参考图9A，显示了用于接种内部探明的细胞生长基底50例如图4中显示的细胞生长基底的循环回路施用装置221的一个实施方案。施用装置221具有多个输入套管221a和多个输出套管221b，输入套管221a流体连接至基底50的开口56并且输出套管221b流体连接至基底50的开口57。将输入套管221a安装在输入歧管221c中，其界定了具有开口221e的内部输入歧管通道221d，歧管通道221d流体连接至每一个输入套管221a并且给所述输入套管进料。开口221e流体连接至导管219(图9)，所述导管从小室210提供细胞组合物的进料。输出套管221b被安装在输出歧管221f中，所述输出歧管界定了具有输出开口221h的内部输出歧管通道221g，输出套管221b流体连接至输出歧管通道221g并进料。提供了流体连接输入歧管221c的输入开口221e和输出歧管221f的输出开口221h的循环回路221i。细胞计数器221j，例如使用Coulter原理、光散射或流式细胞术以提供计算的细胞浓度的细胞计数器，可流体连接至循环回路221i。细胞计数器221j可在线或通过提取并且评估样品来测定在回路221中循环的流体的细胞浓度，如上文的描述中提及的。提供了任选的阀门(未显示)和泵221k以在用于接种基底50的施用装置221中驱动循环。这样的细胞计数器221j、阀门和/或泵221k可在下文中更详细描述的过程控制器229的控制之下。

在使用时，将以分批操作、连续方式或间断方式从导管219给施用装置221的循环回路进料的细胞组合物通过输入歧管221c、输入套管221a、基底50、输出套管221b、输出歧管221f和循环回路221i反复地循环。在该操作过程中，细胞将被接种至基底50中，而一些细胞将保留在循环流体中。细胞计数器221j可用于连续或周期性地测定在循环回路221i中循环的流体的细胞浓度。初始提供的细胞至基底50内的可接受的百分比接种可利用系统200来测定，和/或当利用细胞计数器221j检测的细胞浓度达到期望或预定的低值时，例如通过使用在下文中更详细地描述的过程控制器229来给用户发信号。随后终止施用装置221内的循环，并且可立即或在进一步的温育或培养期后制备用于给患者施用的基底50。

如上文中所公开的，在其它实施方案中，施用装置221可被构造以在将细胞组合物施用至基底的过程中移动。结合图9，参考图9B，显示了用于将细胞组合物施用至预先探明的细胞生长基底例如图3的基底20或图4的基底50(以图9B的幻影、虚线显示)的一个这样的施用装置221。图9B的施用装置221包括多个安装至输入歧管托架(carriage)221l的套管221k。输入歧管托架221l界定了具有输入开口221n的内部歧管通道221m，歧管通道221流体连接至套管221k并且进料。输入开口221n流体连接至与系统200的导管219，所述导管进料来自小室210的细胞组合物。输入歧管托架221l连接至托架柱221o，所述托架柱被可转移地接收通过柱安装支架(post feed mounts)221p中的开口。电动机、螺线管或其它动力机械装置(未显示)机械地联接至柱221o并且可操作地通过支架221p，优选地以恒定速率或以另一种预定的方式撤回柱221，从而引起歧管托架221l及其连接的套管221k的拉回运动。在该拉回操作中，通过夹紧衔接基底20,50的至少部分边缘的元件224a或用于维持基底相对于施用装置221的定位的任何其它适当的机械装置(参见下文中关于定位装置224的另外的描述)来将基底20,50保持在其起始位置。借助于基底20或50的通道22内初始接收的套管221k(其远端尖端位于远侧)，可起始自动拉回运动，在该过程中细胞组合物被泵动并且以预定的速率从套管221k的尖端压出。这样，通过控制拉回的速率和从套管221k流动的速率，系统200可高度有效地用给定的可流动的细胞组合物接种细胞生长基底。

现继续参考图9，如上所述，系统200可包括用于将细胞生长基底223保持在相对于施用装置221的起始或进行中的位置的预定位置或否则保留在小室222内的定位装置224。这样，可容易地操作装置221以将细胞组合物以期望的方式沉积至基底223。定位装置224可以例如包括直立壁、夹子、栓(pin)或与基底223的材料或形状相关以将所述基底原位保持在小室222内的其它特征。此外，基底223可配备有在装载至小室222内的过程中与定位装置224协作的机械元件。例如，基底223可具有临时(非可植入的)或永久性地连接的(可植入的)具有相对坚硬的可塑性的条带或棒，以与定位装置224的刚性结构可靠地协作，从而将基底223稳定地安置在小室222内。在接种后并且在植入前，如果不希望或不适合于植入此类机械元件，则可从基底223取出此类机械元件。

系统200还可具有用于促进细胞通过或穿过基底223的分配的分配辅助装置225。因此，分配辅助装置225可被操作以将力传递至小室222内和/或驻留在基底223上的细胞组合物。分配辅助装置225可以例如可被操作以产生真空以拉动细胞组合物，从而使细胞通过基底223的厚度，以更均匀地将细胞分配在基底223内。或者，分配辅助装置225可以是磁铁例如永久性磁铁或电磁铁，且可赋予涵盖基底223的磁场。这，结合与细胞结合的磁性材料例如细胞所附着至的磁性脂质体，可用于驱动细胞通过和/或沿着基底223，以分配细胞。或者，分配辅助装置225可被操作以赋予基底223运动例如震动或旋转，从而帮助将细胞组合物分配通过基底223。在一个实施方案中，分配辅助装置225可赋予快速旋转以通过离心力驱动细胞组合物，并且可将基底223安排在驱动的细胞组合物的路径中(例如，当在水平面中旋转时沿着大体上垂直或否则直立的壁)。通过使用该安排，可驱动细胞组合物朝向基底223并且进入其中。还可使用将力传递至细胞组合物和/或至基底223以增强两者的组合的其它装置225，包括例如可将脉动和/或双向流动传递至小室222内的液体的装置225。在某些实施方案中，可将片层形式的基底223安装在小室222内以将小室222分隔成第一和第二内部空间，除横跨基底外，第一和第二内部空间彼此流体密封。随后可通过借助分配装置225产生压力差来在小室222内引起双向流动，从而提供细胞悬浮液横跨基底223的透壁流动，以将细胞分配至基底223上和潜在地也分配入基底223中。小室222的所有功能可在下文中更详细地描述的过程控制器229的控制之下。

在其它实施方案中，细胞外基质水解物或凝胶材料，包括例如本文中描述的那些，可与细胞一起被装至小室222中，并且可将固体的、三维上稳定的细胞生长基底在一定体积的水解物/凝胶与细胞的混合物中温育，包括完全浸没于其中。可如本文中所述进行组合的材料的搅拌。固体的三维上稳定的基底可以为本文中描述的ECM材料，其优选保留至少一种天然的(内源)生物学活性组分或其组合(如本文中描述的)和/或可以以片层、纤丝或线或颗粒的形式存在。可如本文中所述温育组合的材料，随后将其给患者施用。

在其它实施方案中，施用装置221可具有一个或多个本文中描述的套管，并且套管的排出开口可内置于固体细胞生长基底223例如海绵、泡沫或其它类似的纤维性基底的内部空间内。随后细胞流体可被注射入基底材料223的内部空间，并且可在压力下朝向基底223外表面迁移(和潜在地迁移出外表面)，在途中将细胞沉积在基底内。在某些实施方案中，套管及其开口和基底223可被构造来引起流体材料在所有方向上从基底内通常中心的位置大体上均匀流动通过基底223，从而促进细胞在基底223内的均匀分配。

在接种基底223和温育如本文所述的时间的过程中和/或之后，系统200可评估接种的基底223以确定是否大量的非附着细胞保留在基底223之上或之中。这可以例如通过下述来实现：用液体的探测脉冲(probing pulse)冲洗全部或部分基底223以排出非附着或未充分附着的细胞，随后收集液体脉冲并且评估细胞的存在(在一些实施方案中，包括进行定量评估)。可以例如通过管线227将探测脉冲从介质单元226的小室(在下文中进一步描述)注入小室222，或可提供另一个独立来源和进料管线。测试脉冲液体可以例如为生理盐水、预条件化介质、细胞培养介质、或允许置换和随后检测基底223上非附着或未充分附着的细胞的任何其它液体。在一个实施方案中，可将具有排出的细胞的收集的脉冲体积导向本文中描述的检测器213，例如利用Coulter原理的细胞计数装置或用于计数细胞的另一种装置。如果过度大量的细胞被探测脉冲排出，则可将基底223和细胞再温育一段时间以允许细胞附着。如果无细胞或充分少的细胞被收集在测试脉冲中，则可从小室222取出接种的基底223，将其给患者施用。系统200可任选地产生信号例如可视和/或可听信号，以指示小室222内接种的基底223已可用于给患者施用。所有这些操作可在下文中进一步描述的过程控制器229的控制之下。

系统200还可包括具有通过导管227流体连接至施用装置221的一个或多个小室并且由泵228驱动的预条件化介质单元226。施用装置221可共享将细胞组合物和预条件化介质施用至基底223的职责，或可整合单独的施用装置。预条件化单元226可包含和提供用于预处理基底223以条件化所述基底以接收细胞组合物的介质。小室226内的预条件化介质可以例如为细胞培养介质，或可包含对细胞有益或使得基底223与细胞的存活更相容的蛋白质或其它物质。在一个实施方案中，单元226中的预条件化介质包括血清，优选来自接收使用系统200产生的细胞移植物的患者的自体血清。可使用施用装置221将预条件化介质施用至基底223。还任选地，系统200的预条件化单元226或其它组件可包括用于在用其它预条件化介质处理后漂洗基底223，用于测试基底或其它操作的材料。为了此类目的，在某些实施方案中小室222可包括连接至废物管线的排液装置。

系统200优选是自动化的，从而包括过程处理器229，其可被操作以控制系统200中的各种机械装置例如泵、阀门、温度控制单元、检测器例如装置204和213、施用装置221、分配辅助装置225和系统200的其它组件以实现本文中叙述的功能。过程控制器229可以为用于控制(完全自动化或通过辅助用户控制)系统200的所有各种机械装置的基于处理器的系统。虽然为了明晰起见而未在图9中举例说明，但过程控制器229被偶联至它控制的或它通过适当的输入和/或输出通讯路径从其接收传感数据的系统200的各种机械装置，这对于本领域技术人员来说是显然的。

过程控制器229可包括通过连接231连接的电子用户输入装置230例如键盘和/或鼠标。可提供通过连接233连接的显示装置232以给用户显示状态输入、分析结果、提示(prompt)和需要的其它信息。可提供通过连接243连接的打印机装置242以产生细胞接种操作的当前状态，分析结果的打印记录和/或在细胞接种操作过程中由系统200完成的操作的记录，和需要的其它信息。连接此类控制装置以允许将用户控制指令输入过程控制器229，以便系统200可按当前细胞接种操作的需要进行操作，并且可由用户显示、打印或处理各种形式的信息。

可在个人计算机、工作站计算机、膝上计算机、掌上计算机、台式计算机、具有计算能力的无线终端(例如手机或具有Windows CE、Palm操作系统的个人数字助理(PDA)等)上或利用整合入系统200的微控制器执行过程控制器229。对于本领域技术人员来说显然的是，还可使用其它计算机系统体系结构，并且所选择的特定体系结构对于本申请公开的系统和方法不是至关重要的。

一般地，此类过程控制器229，当使用计算机执行时，包含用于互通信息的总线、与总线偶联用于处理信息的处理器、偶联至总线用于存储信息和处理器指令的主存储器、偶联至总线用于存储静态信息和处理器指令的只读存储器。显示装置232偶联至总线以用于给用户显示系统200的信息，输入装置230偶联至总线以用于与处理器互通信息和用户命令选择。还可在过程控制器229中包括用于与包含数字信息的数据存储装置交流的大容量存储器接口，以及用于与网络通信的网络接口。

处理器可以是多种通用处理器或微处理器的任一种，例如由Intel Corporation制造的PENTIUM,CORE和XEON微处理器、由IBM Corporation制造的POWER PC或POWER ISA、由Sun Corporation制造的SPARC处理器等。然而，对于本领域技术人员很明显的是，还可在任何特定的计算机系统中使用其它种类的处理器。显示装置232可以为液晶装置(LCD)、阴极射线管(CRT)、等离子体监视器、发光二极管(LED)装置或其它适当的显示装置。大容量存储接口可允许处理器通过总线访问数据存储装置上的数字信息。大容量存储接口可以是偶联至总线以用于转移信息和指令的通用串行总线(USB)接口、电子集成驱动器(IDE)接口、串行高级技术附件(SATA)接口等。数据存储装置可以是常规硬盘驱动器、软盘驱动器、闪存装置(例如U盘(jump drive)或SD卡)、光学驱动器例如光盘(CD)驱动器、数字多功能光碟(DVD)驱动器、HD DVD驱动器、蓝光DVD驱动器或另一种磁性固体状态或光学数据存储装置以及相关介质(软盘、CD-ROM、DVD等)。

通常，处理器使用大容量存储接口从数据存储装置取回处理指令和数据，并且将该信息下载至随机存取存储器以进行执行。处理器随后执行来自随机存取存储器或只读存储器的指令流。在输入装置230上输入的命令选择和信息用于指导由处理器执行的指令流。该处理执行的结果随后可用于控制系统200中的各种机械装置。

过程控制器229被构造来产生用于在显示装置232上显示和/或用于驱动打印机242打印硬拷贝的输出。优选地，显示装置232也是图形用户界面，允许用户与显示的信息交互。

过程控制器229还可被构造来通过网络例如局域网(LAN)、广域网(WAN)或因特网与一个或多个外部系统(未显示)通信。过程控制器229和外部系统都可被构造来用作网络服务器、客户或两者，并且可使得能够被浏览。因此，系统200可远程访问和/或存取信息，可被远程控制和/或监控，可进行过程控制器229与其它系统之间的数据交换。

为了在转移操作过程中使细胞的损失最小化，可期望在细胞悬浮液的处理过程中利用尽可能少的小室。因此，在某些实施方案中，系统200可省略优化的细胞制剂小室210及其连接的检测器213，而在第一小室203内将细胞悬浮液处理成期望的状态以用于施用至基底。因此，幻影中显示了该可选择的实施方案的将小室203流体连接至施用装置221的导管234。导管234可在泵235的驱动下将优化的细胞悬浮液转移至装置221。在该更加简化的形式中，系统200还可包括由泵218驱动的通过小室216将制剂给细胞悬浮小室203进料的导管236。因此，可利用来自小室207的处理介质和利用来自小室216的配制介质处理细胞悬浮液组合物，全部都在单个小室203内。对于利用各种介质的随后的处理步骤，可给小室203配备用于除去施用的介质的装置，例如上述滤器，或可在施用一定体积的来自小室207和/或216的处理介质后除去液体或另外地浓缩细胞的其它装置。在小室203内处理和调整细胞悬浮液组合物后，可将装置204用于确认细胞悬浮液组合物具有在期望的范围内的细胞浓度，随后可将组合物传送至施用装置221以施用至基底223。为了便于处理和操作，系统200可包括内置有一些或全部本文中描述的组件的外壳237。

参考图10，显示了另一种自动化细胞接种系统250的示意图。系统250可用于制备可流动的细胞移植物，所述细胞移植物在某些实施方案中可利用微创技术例如通过针、导管或其它经皮引入的递送装置来递送。系统250包括与上文中描述的系统200(图9)共同的许多组件，所述组件在图10中等同地编号，并且在此处不必再次描述。关于其它组件，系统250包括用于接收颗粒形式的基底、凝胶形式的基底或其前体材料或此类形式的组合(潜在地还与用于移植物的其它材料一起)的细胞生长基底输入小室251。使用任选的阀门(未显示)和在泵220的驱动下，通过导管219将处理的细胞悬浮液组合物与小室251中的细胞生长基底组合。使用任选的阀门(未显示)和通过泵253驱动，将包含细胞和基底材料的来自小室251的制备的组合物通过经由导管252的流动转移至容器254。此类阀和/或泵220和253可在过程控制器229的控制之下。容器254可以是暂时连接至和流体连接至导管252的小室装置，其可被移走以将细胞移植物材料转移出系统250。容器254因此可以为小瓶、袋子或流体连接至导管252的其它容器。在某些实施方案中，容器254可以包含用于将细胞移植物组合物递送至患者的递送装置或其组件。在一个实施方案中，容器254包括小室，示例性地，通过流体连接的针、导管或其它微创装置将细胞移植物组合物从其强有力地排出以递送至患者组织的注射器筒。系统250可以以流体连接至导管252以接收制备的可流动的细胞移植物材料的方式包括用于插入和配对此类容器254的结构配对特征。

小室251可配备有在小室251内混合材料的装置255。装置255可包含完全位于小室251的外部但赋予小室251或其部分运动以混合其中的组分的机械装置。例如，这样的装置可以包括振动器、摇床、旋转元件例如涡旋器或位于待混合的组分的流动路径中的静态混合器。装置255还可包含位于小室251内的机械装置例如桨、搅棒或叶轮，这样的机械装置由马达或其它装置驱动，以搅拌小室251内接收的可流动的组合物。装置255还可包含在小室251内部和外部的组件，例如驱动小室251内的磁耦合的浆、搅拌棒或其它元件的外部移动(例如转动式)磁体。装置255可在过程控制器229的控制之下。

除了提供小室251内的混合外，系统250可包括与小室251联接的热控制装置256和/或与容器254联接的热控制装置257，所述热控制装置可被操作以控制其中各自材料的温度。热控制装置256、257可在过程控制器229的控制之下，并且可包括适当的温度传感元件以提供当前的温度反馈读数来帮助调控温度。热控制装置256可以是加热元件和/或冷却元件。在某些模式中，热控制装置256可被操作来控制小室251内的材料的温度，从而调节其粘度。举例来说，小室251内接收的细胞生长基底组合物可包含可胶凝的材料，并且热控制装置256可被操作来在材料与从导管219注入的细胞悬浮液组合之前和期间使材料维持在未胶凝的状态。这样，基底材料的较不粘的状态将允许与细胞悬浮液材料更容易地混合。在该情形中，对于粘度随温度下降而增加的可胶凝材料，可操作热控制装置256以加热小室251内的材料。在这一点上，期望控制加热以避免对细胞的任何显著的热损伤，例如当细胞存在时加热至低于约42℃的温度。在某些实施方案中，选择基底组合物内的可胶凝材料以便其在37℃或略微更高的温度下胶凝。为了与细胞悬浮液混合以获得大体上均一的组合物，可将材料加热至高于其胶凝点的温度，但低于细胞将受到明显损伤时的温度(例如低于约42℃)。混合后，在递送至患者之前和期间，可以例如使用热控制装置257将细胞/基底组合物维持在高于基底材料的胶凝温度。这样，在例如利用针或其它套管的递送过程中提供了不太粘的(和更加可流动的)递送状态，但在递送至患者(例如具有约37℃的正常体温的人患者)后材料将胶凝，从而粘度增加，以促进递送的移植物材料在施用位置的维持。或者，在混合以提供大体上的均一性后，可允许或引起细胞/基底材料在患者的外部胶凝(例如通过利用装置256和/或257冷却)，随后可将其作为更粘的移植物进行递送。

对于随温度升高而胶凝或另外地粘度增加的可胶凝的基底材料，可操作热控制装置256以冷却小室251内的材料。在这一点上，期望控制冷却以避免对细胞的任何明显的冻伤，例如冷却至高于约0℃的温度。在某些实施方案中，选择基底组合物中的可胶凝材料以便其在约37℃的温度下，与更低的温度(例如约室温(约25℃)或更低)相比较，胶凝或另外地粘度增加。为了与细胞悬浮液混合以获得大体上均一的组合物，可利用装置256冷却材料以保持较不粘的状态。混合后，可在递送之前和期间使用热控制装置256和/或257将细胞/基底组合物维持在冷却状态。这样，在例如通过针或其它套管的递送过程中提供更加可流动的状态，但在递送至患者(例如具有约37℃的正常体温的人患者)后材料的粘度将增加，以促进递送的移植物材料在施用位置的维持。或者，在混合以提供大体上的均一性后，可以例如使用装置256和/或257加温细胞/基底材料，或允许其在环境条件下加温，以作为较粘的移植物进行递送。

当需要时(例如在与细胞的混合操作后)，除温度外的条件也可用于使细胞生长基底材料胶凝。例如，可选择随pH增加而胶凝的胶原性材料。在小室251中进行的混合操作过程中，可将基底/细胞组合物的pH维持在相对较低的水平上，在该水平上组合物维持更加可流动，且在该水平上细胞至少在混合期间可存活。举例来说，这样的pH可以在约4至约6.5的范围内。在混合后，可增加组合物的pH以引起胶原性材料胶凝和增加移植物材料的粘度。这样的pH调整可通过添加生物相容性碱或缓冲剂或两者来实现。此类添加剂可从单元226中的小室提供，或从系统250提供的另一个试剂小室提供。组合物的混合后的pH可以例如在高于约6.5直至约8的范围内。期望地，混合后pH将为适用于给患者施用的pH，在某些特定实施方案中其为约7至约7.5。

在将细胞生长基底材料与上述系统200或250中的细胞组合物组合后，可将接种的移植物材料立即给患者施用。在其它实施方案中，可将接种细胞的移植物材料离体温育至少一段足以实现至少一些细胞(期望地，显著百分比的细胞，例如大于约20％的初始提供的细胞)附着至细胞生长基底的时间。这样的细胞-附着温育期可具有1分钟直至约5小时，在特定的实施方案中约5分钟直至约3小时的持续时间。在此期间，将组合物维持在这样的条件下，在所述条件下组合物中的细胞，至少部分地通过其天然能力附着至表面，附着至细胞生长基底片层、颗粒或组合的组合物中的其它材料。可进行细胞附着期或周期，在此期间初始提供的细胞的数目未经历显著扩增，例如其中相比于最初与细胞生长基底组合的组合物，组合物具有不超过10％更多的活细胞，以及在某些实施方案中，其中与最初与细胞生长基底组合的数目相比较，组合物具有基本上相同数目的细胞或更少的细胞。

在自动化系统250中制备可流动的移植物材料时，在上述细胞附着期中，可以任选地连续或周期性搅拌组合物，例如使用混合装置255。在具体的实施方案中，混合装置255可用于在细胞附着周期中周期性温和地搅拌组合物，且相对静止的细胞附着期可在搅拌期之间发生。例如，多个非搅拌期可各自具有约3分钟至约20分钟的持续时间，被温和进行的更短的例如约10秒至5分钟的搅拌期中断，从而使另外的悬浮的游离细胞与细胞生长基底颗粒或材料接触但避免已附着至基底材料的细胞显著排出。

在上述小室251内接种基底和温育一段时间的过程中和/或之后，系统250可评估可流动的基底细胞/基底混合物，以确定是否大量的非基底附着的细胞保留在混合物的悬浮介质中。这可以例如通过在收集后过滤样品以除去具有附着的细胞的基底材料，仅留下游离地悬浮在悬浮介质中的细胞来实现。随后可将游离悬浮的细胞转移至检测器213或另一个独立地检测器，并利用Coulter原理、光散射或用于计数细胞的另一种装置计数细胞，如本文中所描述的。在另一种模式中，可获取来自小室251的完整介质的样品，并利用Coulter原理、光散射或另一种装置来进行测试(例如包括颗粒基底、悬浮介质和细胞)。介质的评估值(例如，散射或电阻)将根据附着的(例如附着至基底颗粒)对游离悬浮的细胞的百分比而变化，从而评估值可与可接受水平的细胞至基底的附着相关联。如果过度多的细胞在悬浮介质中保持游离，则可将基底和细胞再温育一段时间以使细胞附着。如果无细胞或足够少的细胞在悬浮介质中保持游离，则可将接种的基底材料从小室251取出，将其给患者施用。与系统200一样，系统250可任选地产生信号，例如可视(例如在显示装置232上)和/或可听信号，以指示小室251内的接种的基底材料已可以用于给患者施用。所有这些操作可在过程控制器229的指导之下。

在上文中公开的系统200和250中，所述的小室可以通过任何适当的安排来提供，包括例如袋、小瓶、通道、塑料容器等。所述的导管可以由适当的管道、通过系统的更大的塑料结构产生的管腔或任何其它适当的安排来提供。同样地，应理解，可在小室和/或导管内提供阀门，以与泵或其它材料转移装置协同作用以选择性允许或阻止流动(视情况而定)。鉴于本文中的公开内容，此类和其它物理系统特征对于本领域技术人员来说将是易于想到的。

系统200和250可被构造来在植入患者之前提供细胞移植物材料的相对短的停留时间(例如直至约3小时)。此类构造通常被设计来实现细胞至基底的附着而无细胞数目的任何显著扩增(例如无细胞数目的扩增，或少于10％的细胞数目的增加)。然而，系统200和250可在某些实施方案中被构造来进行细胞移植物材料的更长时间的温育和培养以实现细胞数目的扩增(与最初接种至基底的数目相比较)，例如大于20％的细胞数目的增加，在一些实施方案中大于100％的增加。为了这些目的，系统200和250还可包括用于在培养期中对基底施加力例如剪切力、应变力(strain force)或张力的机械装置。这些力可在温育/培养期中影响接种的细胞的生长和分化，导致与在所述力不存在的情况下温育/培养的相同细胞相比，不同的蛋白质表达模式。这样，可增强细胞移植物在患者中的给定的终用途。

同样地，在某些实施方案中，系统200或250可包括与小室222分离的第二细胞温育小室。可在第二小室中培养与在小室222中温育的细胞不同的细胞，以分泌信号分子例如激素、细胞因子、生长因子等，所述信号分子被转移至小室222。信号分子可与于小室222中培养的细胞接触，例如以调节它们的生长或分化。信号分子从第二温育小室转移至小室222的转移可以例如通过将它们泵送通过导管，通过流动穿过膜或其它方式来实现。在一些形式中，信号分子可有效地驱动更高百分比的在小室222中培养的干细胞或祖细胞沿着给定的分化途径进行。第二细胞温育小室的控制可通过过程控制器229或通过任选地与过程控制器229通信的分开的过程控制器来实现，如上文中所描述的。

颗粒状多细胞/基底移植物材料

在某些实施方案中，提供了可流动的细胞移植物材料，所述材料包括悬浮在液体介质中的多细胞主体，其中所述主体各自包含具有附着至其上的细胞的细胞生长基底颗粒。基底颗粒可具有约20微米至约2000微米，在某些实施方案中约100至约1000微米的最大横截面尺寸。基底颗粒可在尺寸上彼此相对地大体上均一，例如具有彼此相差在约20％或10％内的最大横截面尺寸，或在尺寸上彼此相对地可发生变化(例如具有一些较小的颗粒和一些较大的颗粒，通过混合两种或更多种大体上均一的颗粒群体而产生的潜在受控的总群体，其中群体具有相对于彼此不同的尺寸)。在有利的变体中，基底颗粒以片层形式存在，并且可具有约20至约2000，更优选约20至约500微米的片层厚度，和/或大于片层厚度并且在约25至约2500微米，更优选约100至约1000微米的范围内的在片层的平面中考虑的最大横截面轴长度(例如高度或宽度)。片层厚度可在约20至1000微米的范围内，和/或在某些实施方案中，在片层的平面中考虑的最大横截面轴长度可在约100至约1500微米的范围内。此外或可选择地，当在片层的平面中考虑时，基底颗粒可以是相对圆的或紧凑的，与长的和纤维状的相反。基底颗粒可具有彼此规则的或彼此不规则的形状。在某些实施方案中，颗粒可以是具有大体上圆形、椭圆形和/或多边形(例如具有3至10条边，例如三角形、正方形或另外地矩形、五边形、六边形等)形状的片层形式颗粒。例如，组合物中的基底颗粒或显著百分比的基底颗粒(例如，高于约25％)，当在片层的平面中考虑时，可具有这样的最大横截面尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的横截面尺寸轴的长度的约2倍；优选，至少约50％的基底颗粒具有该特征，更优选至少约70％的基底颗粒具有该特征。此类颗粒状细胞生长基底材料也构成本发明的实施方案，其单独地(例如作为无细胞组织移植物材料)或与本文中描述的细胞组合物组合使用。

可从基底材料的更大片层切取上述小的片层形式的基底颗粒。在某些实施方案中，基底材料的更大片层为从组织来源收获的并且脱细胞的细胞外基质片层材料，如本文中描述的。可使用机械工具例如穿孔器或模具，或通过使用激光切割，或使用任何其它适当的装置从更大的ECM片层切取具有上述特征的片层形式的颗粒。在期望的实施方案中，所使用的切割方法将不会消除天然生物学活性ECM的特征或天然生物学活性ECM分子，当该特征或此类分子存在于待加工的更大的起始ECM片层中时，如在本文中更详细地描述的。此外，待加工的ECM片层和所得的ECM片层颗粒可在片层材料的一侧或两侧具有保留的天然上皮基底膜和/或在片层的一侧或两侧具有生物合成地沉积的基底膜组分。为了在片层的两侧上提供天然上皮基底膜，可将两个分离的脱细胞ECM层(各自具有单个基底膜侧和对侧)以基底膜侧朝外的方式彼此堆叠并且融合或键合。随后可处理所得的双层片层以形成如上所述的片层形式的颗粒。为了制备具有沉积的非天然基底膜组分的颗粒，可通过在两侧上生长上皮、内皮或其它细胞以沉积基底膜组分来条件化脱细胞的ECM片层。随后可除去细胞，而留下基底膜组分，随后处理片层以制备如上所述的片层形式的颗粒。

图11提供了示例性的极小的ECM“点”(从更大的ECM片层激光切割的)的数字图像。在该特定的实例中，使用的ECM片层为单层猪小肠粘膜下层，这可从Cook BiotechIncorporated,West Lafayette,Indiana,USA获得。如可以看到的，片层平面中的最大横截面轴的长度为约505微米，而在与所述最大横截面轴垂直并且以其为中心的线上获取的横截面轴的长度为约413微米。因此，这两个长度尺寸彼此相差在约25％以内，从而提供了紧凑的片层颗粒结构。其中大于约50％的颗粒在长度尺寸上显示该水平的对应性的ECM颗粒组合物在使用时可以是特别有益的，特别地在大于约50％的颗粒在片层平面中具有在约100至约1000微米的范围内的最大横截面轴的情况下。

为了制备接种细胞的移植物组合物，可以例如使用上述系统250将上述颗粒状生长基底与细胞制剂组合。对于可流动的移植物，可将颗粒状生长基底悬浮在液体介质例如含水介质中。在施用之前，可在细胞附着周期例如上述的任何周期中温育移植物组合物。颗粒状细胞生长基底的尺寸和相对平的紧凑形状提供了有利的悬浮和细胞附着特征，所述特征在使用柔软基底材料例如细胞外基质片层材料时也可得到增强。为了给患者施用，可将可流动的接种细胞的移植物载入注射器或其它递送装置，且移植物被递送至被靶向以进行移植的组织。举例来说，参考图11，显示了包括装载在注射器302中的可流动的细胞移植物组合物301的医疗装置300。细胞移植物组合物301包括多个脱细胞主体303，所述主体303包括基质颗粒304(如此处和上文中描述的)和附着至每一个基质颗粒304的细胞305的群体。在某些实施方案中，细胞305形成覆盖基质颗粒304的基本上汇合的细胞层。细胞化的主体303悬浮在液体介质306例如任选地包含用于细胞的营养物的含水介质(其在生理上与人或其它患者相容)中。细胞移植物组合物301是可流动的并且接收于注射器302的筒307中。柱塞308接收于筒307内并且可按照线性驱动操作来驱动组合物301通过流体连接的针309并且流出其开口310。医疗装置300因而可用于将组合物301施用入患者的组织。在某些优选实施方案中，靶组织需要血管重建，细胞移植物主体303包括能够形成血管的细胞305，例如内皮细胞或内皮祖细胞，在某些实施方案中包括本文中描述的内皮集落形成细胞。在注射入靶组织后，基质颗粒304将帮助细胞305保留在靶区域中。在特别优选的实施方案中，颗粒304是本文中描述的细胞外基质颗粒。

具有凝胶包被的基质基底的细胞移植物

本发明的细胞移植物可具有多孔基质细胞生长基底，其至少部分被凝胶例如细胞外基质凝胶包被，且细胞被掺入凝胶内部，凝胶表面上或两者。可在与细胞混合之前、之后或过程中或这些时间的任意组合中将凝胶应用于多孔基质基底。凝胶可包含增强细胞附着至基底的能力的物质，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原I或其它材料。当用于具有细胞的混合物时，可以以较不粘的形式(例如未胶凝的状态)施用凝胶或凝胶的前体材料以促进对基底的施用，并且需要时，与细胞一起渗透入基底的多孔网络。因此，凝胶或可胶凝的前体可被允许或使得能够胶凝，或另外地增加粘度以促进凝胶和其中携带的细胞快速附着至多孔基质基底。在某些实施方案中，凝胶包含细胞外基质凝胶，例如2007年4月12日公布的美国专利申请公开案US20070082060、2004年8月25日提交的公布的美国专利申请No.10/569,218(所述专利申请通过引用整体并入本文)中描述的。因此，凝胶可包括通过用酸和/或酶降解ECM组织(例如本文中描述的)而制备的ECM水解物组合物，该组合物可在将pH升高至约6.8至约8和/或在将材料的温度升高至约37℃后胶凝。此类组合物可包含起始ECM材料的天然胶原和天然(内源)生物学活性非胶原组分例如生长因子、糖胺聚糖、蛋白聚糖和/或其它材料，如在下文中结合ECM材料描述的。

上文描述的系统200可用于制备此类具有凝胶包被的基质基底的细胞移植物。例如，可使用施用装置221将凝胶或凝胶前体施用至基底223。为了在细胞之前施用凝胶材料，可从预条件化介质单元226给料凝胶或凝胶前体，将其施用至基底223。为了在施用至基底之前将细胞与凝胶或凝胶前体组合，可通过在从施用装置221释放之前组合来自导管219和227的进料来在线混合细胞与凝胶材料，或可在注入至施用装置221之前将细胞材料与凝胶或凝胶前体在预条件化介质单元226的小室内或另一个小室内组合。需要时，还可通过系统220提供温度和/或pH控制以在施用的材料与基底223接触后促进所述材料的粘度增加。举例来说，为了进行pH调整，可紧在施用至基底223之前将一定量的碱性物质例如NaOH与细胞/凝胶前体组合物组合，由此材料的完全胶凝化可被充分延迟以便施用至基底223和随后硬化。或者，可利用碱性物质或缓冲物质预条件化基底223以在与基底223接触后中和和升高较酸性的细胞/凝胶前体材料的pH。此外，可在对基底223施用之前和/或之后通过加热元件来升高细胞/凝胶前体材料的温度。此类和其它凝胶形成条件的调整可由系统200自动化进行。

细胞移植物纤丝

在其它实施方案中，本发明提供了细胞移植物，其包括以伸长的纤丝形式存在的细胞生长基底(细胞群沿纤丝附着)。在此类实施方案中，纤丝可具有至少约1mm，例如在某些实施方案中在约1至约30mm，或约5至约30mm的范围内的长度。纤丝还可具有约20微米至约2mm或约100微米至约1mm的最大横截面尺寸。本文中描述的细胞外基质基底对于此类目的是优选的。为了制备此类细胞移植物，可以例如在自动化系统例如本文中描述的系统200或系统250中，在包含期望的细胞的细胞悬浮液存在的情况下温育伸长的基底，进行至少足以使细胞附着至基底的一段时间。参考图12，显示了显示几个细胞化的纤丝移植物的示意图。每一个细胞化的纤丝移植物320包括伸长的细胞生长基底321和一群附着至基底321的细胞322。细胞322在某些实施方案中可形成覆盖细胞生长基底321的基本上汇合的层。为了实现该目的，可将充足的初始提供的细胞附着至基底321以形成层，或可接种基底纤丝320，随后将其充分培养以形成基本上汇合的层。在使用时，可以将细胞化的纤丝移植物320逐个地引入进行治疗的部位，例如通过将每一根细胞化的纤丝移植物320纵向保持在针腔中，将针插入期望的靶组织，随后利用流体压力从针驱动移植物320。移植物320从而将细胞322分配在靶组织的整个伸长的区域。这可以是有用的，例如在期望该区域的脉管壁血管发育的情况下。为了此类目的，可使用形成血管的细胞，例如内皮细胞或内皮祖细胞，包括ECFC细胞，如本文中描述的。在可选择的实施方案中，可在注射器内提供包含多个伸长的纤丝移植物320的可流动的细胞移植物悬浮液，并将其注射入靶组织。除使用伸长的移植物320而非相对更紧凑的颗粒状细胞移植物主体303或使用两者外，此类悬浮液和用于递送其的医疗产品可与图11中描述的产品300相似。

现参考图12A，显示了本发明的另一个细胞化的纤丝移植物320A。移植物320A可具有与上述移植物320相同的特征，包括伸长的纤丝基底321A和一群附着至基底的细胞322A。移植物320A还包括患者组织-啮合锚定元件，其在示例性实施方案中显示为具有茎324A和组织啮合倒钩末端325A的倒钩或钩323A。示例性实施方案中的倒钩323A或其它锚定元件连接至纤丝基底321A的末端上或其附近。该连接可以是通过系(tying)、熔接(welding)、粘合、与其形成整体或任何其它适当的方式。在某些实施方案中，锚定元件例如倒钩323A在一个方向上比在相反方向上更大地阻碍通过组织。这可以例如利用定向倒钩325A来实现。倒钩323A或其它锚定元件可由永久性材料或由生物可吸收的材料制造。举例来说，永久性或生物可吸收的材料可由金属或聚合物材料制造。适当的生物可吸收的聚合物包括乙醇酸的聚合物、乳酸的聚合物或乙醇酸与乳酸的共聚物，聚已酸内酯，以及其它已知的材料。在使用时，倒钩323A或其它锚定元件将在移植物320A植入患者的组织例如肌肉或其它组织后阻碍移植物320A的迁移。

现参考图12B，在一个使用模式中，可将移植物320A与递送套管326A例如针套管组合。在一个形式中，移植物320A可具有在套管326A的管腔328A中接收的全部或部分纤丝基底320A。同样地，倒钩元件323A可部分或完全地接收在套管326A中，或者，倒钩323A可完全存在于套管326A外，例如在其远端携带。在示例性实施方案中，茎324A或至少其部分接收在套管326A的远端区域的管腔内，并且倒钩末端325A位于套管326A的穿透组织的远端尖端327A(例如针尖)之外。通过利用在该条件下组合的装置，可将套管326A和倒钩325A用于穿透入患者的被靶向以接收移植物320A的组织(通过穿透患者皮肤“S”，随后驱动其至下面组织的期望深度)。此后，当对套管326A施用撤回力时，例钩尖端325A将啮合患者的组织并且阻止回撤，然而套管326A被撤出，从而当撤出套管326A时，从管腔328A递送了移植物320A。移植物320A随后被留下植入患者，并且在某些实施方案中细胞群体322A可在患者的治疗中增殖。在一些发明变型中，细胞群体322A包括内皮细胞和/或内皮祖细胞，包括例如本文中描述的内皮集落形成细胞。待治疗的和其中植入移植物320A的组织可以是需要血管发育的组织，例如心肌的局部缺血组织或因临界性肢体缺血导致的局部缺血组织。在此类使用中，可将细胞群体322A植入定位在沿着基底321A的伸长的区域中，并且所述细胞群体可沿着伸长的植入区域产生血管。然而，应理解，可使用其它类型的细胞群体322A，并且可使用纤丝移植物320A治疗其它疾病、缺陷或病况。

具有堆叠的基底层的细胞移植物

本发明的细胞移植物还可包括以堆叠的构型存在的多个细胞生长基底片层(细胞群体插在堆叠的片层之间)，并且潜在地还提供构建体的最外层。为了制备此类移移植物，可以用细胞接种第一细胞生长基底层，例如通过将包含细胞悬浮液的液体薄膜施用至片层的至少一侧。随后可将第二基底层堆叠在第一基底层的已接收液体薄膜的一侧上，然后将另一个细胞液体薄膜施用至第二基底层的暴露的侧面。必要时可重复该过程以提供堆叠的基底构建体，细胞均匀地或区域性分配在构建体的整个厚度中。图13提供了一个这样的堆叠的移植物构建体330的示意图。构建体330包括多个堆叠的细胞生长基底层331，期望地收获、纯化的细胞外基质组织片层，如本文所述。堆叠的层331可部分或完全地彼此重叠。在片层331之间提供了各自包含一群细胞333的细胞层332，并且任选地还在构建体330的最外表面提供细胞层332。在植入之前，可将构建体330温育至少足以使细胞附着至片层331的一段时间，这可促成构建体作为整体移植物单位的稳定性。在一个可选择的实施方案中，在培养期间温育构建体330以扩增初始接种的细胞群体。同样地，在构建体330的制造过程中，在将细胞333施用至片层331之前，可用血液组分例如血清或血清蛋白质和/或用其它培养介质组分例如营养物、盐等预条件化片层331。

可在自动化系统例如图9的系统200中制备堆叠的细胞移植物构建体例如构建体330。为此，可在小室222中提供第一基底片层331，随后可将施用装置221用于将经处理的细胞悬浮液施用至片层331的上表面。随后可将第二基底片层331覆盖至第一片层上，随后将施用装置221用于将额外量的细胞悬浮液施用至第二片层331。可重复该过程多次，例如2、3、4或5次。此外，可从介质单元226提供预条件化介质，将其施用至各个片层331，随后施用细胞悬浮液。可由用户手工地或使用由系统200提供的自动化进料机械装置依次将第一、第二和随后的片层地置于小室222内。

图17显示了本发明的具有堆叠的生长基底片层的细胞移植物的另一个实施方案。细胞移植物380包括第一细胞生长基底片层381(期望地本文描述的任何细胞外基质层)和沉积在片层381的表面上的细胞材料382。细胞材料382可包括本文描述的任何细胞以及可流动的细胞生长材料或基底例如本文中描述的颗粒状细胞生长基底和/或本文中描述的凝胶细胞生长基底材料。在材料382沉积在片层381的表面上后，将第二细胞生长基底片层383覆盖在材料382上以产生堆叠的或夹心的细胞移植物。

图18举例说明了本发明的细胞移植物的另一个实施方案。移植物390包括具有多个其中界定的并且仅延伸通过片层391的部分厚度的孔392的第一细胞生长基底片层391。细胞材料393沉积在孔392内。细胞材料393可以例如仅为细胞群体或可以为与可流动的细胞生长材料(例如颗粒基底或形成凝胶的基底或其组合)组合的细胞，如在本文中进一步描述的。将第二细胞生长基底片层394覆盖在第一片层391上以覆盖填充的孔392和任选地至少暂时将细胞材料391捕获在孔392内。细胞生长基底片层391和/或394以及某些实施方案为本文中描述的ECM层的任一种。

具有导流层的细胞生长基底制品

本发明还提供了包括被第二材料覆盖或封装的细胞生长基底材料的制品，所述第二材料对流体例如含水细胞组合物的渗透性不如细胞生长基底材料高，其中覆盖或封装材料可帮助指导细胞流体流动通过细胞生长基底材料的长度或厚度以帮助将细胞分配在整个材料中。参考图14，显示了细胞生长基底制品340，其包括细胞生长基底材料341例如本文中公开的任何细胞生长基底材料，和包封细胞基底材料341的渗透性或半透性封装材料342。封装材料342可界定第一开口343和与第一开口343间隔的第二开口344。在某些实施方案中，开口343和344存在于细胞生长基底材料341的相对侧。此外，在可选择的实施方案中可提供多个开口343和/或344。在使用中，可将制品340连接至液体细胞悬浮液的来源，使悬浮液在压力下进入开口343，从而驱动细胞悬浮液材料通过细胞生长基底341，以使细胞能够附着或驻留在基底341内。细胞悬浮液的流体可通过开口344离去，减少至少一些初始细胞。任选地，可将离开开口344的流体通过开口343再循环回来以将至少一些剩余的细胞接种在基底341内。细胞生长基底材料341可以是本文中描述的任何整体的、颗粒的或其它细胞生长基底材料。封装材料342可植入在患者中，或可以是可在接种细胞后植入细胞生长基底341前移除的不期望用于植入的材料。封装材料342可以例如是天然或合成的聚合材料，其可以是永久性的或植入后生物可吸收的。生物可吸收的合成的聚合物例如本文中其它地方公开的那些，可用于封装材料342。

参考图15，显示的是本发明的另一种细胞生长基底制品。制品350包括细胞生长基底351例如本文中公开的任何细胞生长基底，和其中接收材料351的第一封装材料352。封装材料352对其中悬浮细胞或将要悬浮细胞的液体例如水或另一种含水介质的渗透性不如基底材料351高。封装材料352可以例如是其中接收材料351的塑料或其它聚合物托盘。托盘或其它封装材料352可界定第一开口353和与第一开口353间隔的第二开口354。第二封装材料355覆盖并且密封由托盘或其它材料352界定的开口。封装材料355可以例如为可从托盘或其它封装材料352剥离的聚合薄膜。为了这些目的，薄膜或其它材料355可包括暴露的和可抓住的部分356(期望地在其外周)，该部分可被抓住并且用于将材料355剥离托盘或其它材料352以打开由托盘和其它材料352界定的开口，并暴露细胞生长基底351以便取出。这样，在细胞接种操作(例如上文结合图14描述的操作)的过程中，材料355将维持对材料352的密封，从而封闭细胞生长基底351以帮助将流体从开口353导向开口354，以将细胞接种在材料351的内部空间。在接种过程后，可将封装材料355从材料352剥离，将接种的基底351取出以植入患者。

现参考图16，显示了细胞生长基底制品360的另一个实施方案。制品360在许多方面与上述制品350相似，从而具有相应地编号的特征(除在“360”系列中外)。制品360还包括与至少流体入口363相关，优选地与该入口和流体出口364都相关的流体分配特征。期望地，这些特征促进流体大体上活塞式流动通过制品360，塞子具有大体上以基底361的横截面的形状存在的横截面尺寸。这可帮助将细胞均匀地分配通过基底361。为了这些目的，托盘或其它封装材料362界定导水壁(diverting wall)367和368，所述导水壁，随着它们离开开口363并且朝向细胞生长基底361的周围，岔开。期望地，导水壁367和368的内表面在细胞生长基底361的外周上大体上岔开至两个点。这样，流体进口363将充满基底361的近端的确定的空隙369，随后流体进口363的压力将均匀地分配并且引起在其整个横截面尺寸上通过基底361的明显的活塞式流动。随后通过基底361的流体将在由壁371和372界定的空隙373中收集，所述壁371和372会聚于出口364的方向。根据本发明，涉及了这些和其他特征，用于促进穿过制品360内的基底361的明显的活塞式流动。

用于本发明实施方案中的细胞生长基底材料

如上文中所指出的，本发明的和用于本发明的细胞生长基底可包含细胞外基质(ECM)组织。ECM组织可获自温血脊椎动物例如羊、牛或猪动物。例如，适当的ECM组织包括，含有粘膜下层、肾小囊膜(renal capsule membrane)、真皮胶原、硬膜、心包膜、阔筋膜、浆膜、腹膜或基底膜层(包括肝基底膜)的那些。用于此类目的的适当的粘膜下层材料包括例如，肠粘膜下层包括小肠粘膜下层、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。用于本发明的包含粘膜下层(潜在地与其它伴随的组织一起)的ECM组织可通过收获此类组织的来源，并将包含粘膜下层的基质与平滑肌层、粘膜层和/或在组织来源中存在的其它层分层来获得。猪组织来源是从其收获ECM组织包括含有粘膜下层的ECM组织的优选来源。

ECM组织，当用于本发明时，优选地进行脱细胞和高度纯化，例如，如Cook等人的美国专利No.6,206,931或注明日期2008年11月20日的美国专利申请公布No.US2008286268，2008年7月23日提交的公布的美国专利申请系列No.12/178,321(其全部通过引用整体并入本文)中所描述的。优选的ECM组织材料将显示低于约12个内毒素单位(EU)/克，更优选低于约5EU/克，最优选低于约1EU/克的内毒素水平。作为另外的参数选择，粘膜下层或其它ECM材料可具有低于约1个集落形成单位(CFU)/克，更优选低于约0.5CFU/克的生物负荷量。类似地期望真菌水平较低，例如低于约1CFU/克，更优选低于约0.5CFU/克。核酸水平优选低于约5μg/mg，更优选低于约2μg/mg，病毒水平优选低于约50噬斑形成单位(PFU)/克，更优选低于约5PFU/克。美国专利No.6,206,931或美国专利申请公布No.US2008286268中教导的粘膜下层或其它ECM组织的此类和另外的特征可以是本发明中使用的任何ECM组织的特征。

在某些实施方案中，用作或用于细胞生长基底的ECM组织材料为从组织来源分离的具有片层结构的膜组织。ECM组织可以，如所分离的，具有约50至约250微米(当完全水合时)，更常见地约50至约200微米(当完全水合时)的层厚度，虽然也可获得和使用具有其它厚度的分离的层。这些层厚度可随用作组织来源的动物的种类和年龄而变化。同样地，这些层厚度可随获自动物来源的组织的来源而变化。

期望地，所使用的ECM组织材料保留来自来源组织的结构性微结构，包括非随机取向的结构性纤维蛋白例如胶原和/或弹性蛋白。此类非随机胶原和/或其它结构性蛋白纤维在某些实施方案中可提供这样的ECM组织，其在拉伸强度上不是各向同性的，从而在一个方向上具有与在至少一个其它方向上的拉伸强度不同的拉伸强度。

ECM组织材料可包括一种或多种对于ECM组织材料的来源来说是天然的并且通过处理保留在ECM组织材料中的生物学活性试剂。例如，粘膜下层或其它可重塑的(remodelable)ECM组织材料可保留一种或多种天然生长因子，例如但不限于碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、软骨源性生长因子(CDGF)和/或血小板源性生长因子(PDGF)。同样地，粘膜下层或其它ECM材料，当用于本发明时，可保留其它天然生物学活性试剂，例如但不限于蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖。例如，ECM材料可包括肝素、硫酸肝素、透明质酸、纤连蛋白、细胞因子等。因此，一般说来，粘膜下层或其它ECM材料可从来源组织保留一种或多种生物学活性组分，所述组分直接或间接诱导细胞反应例如细胞形态学、增殖、生长、蛋白质或基因表达的改变。

本发明中使用的包含粘膜下层的ECM材料或其它ECM材料可来源于任何适当的器官或其它组织来源，通常而言包含结缔组织的来源。经处理用于本发明的ECM材料通常包括丰富的胶原，最常见地包含按重量计算(基于干重)至少约80％的胶原。此类天然来源的ECM材料大多包括非随机取向的胶原纤维，例如以通常单轴或多轴但有规则取向的纤维形式存在的胶原纤维。当经处理以保留天然生物学活性因子时，ECM材料可将此类因子作为固体散布在胶原纤维之间、之上和/或之内。用于本发明的特别期望的天然来源的ECM材料可包括显著量的此类散布的非胶原性固体，所述固体在光学显微镜检查下通过适当的染色可容易地确定。此类非胶原性固体在某些本发明的实施方案中可构成显著百分比的ECM材料的干重，例如在本发明的不同实施方案中构成按重量计至少约1％，至少约3％和至少约5％的ECM材料的干重。

用于本发明的包含粘膜下层的ECM材料或其它ECM材料还可显示血管生成特征，从而有效地诱导植入了该材料的宿主的血管生成。在这一点上，血管生成是身体通过其制造新血管以给组织提供增加的血液供给的过程。因此，血管生成材料，当与宿主组织接触时，增进或促进新血管至材料内的形成。最近已开发了用于测量响应生物材料植入的体内血管生成的方法。例如，一个这样的方法使用皮下植入模型来测定材料的血管生成特征。参见，C.Heeschen等人,Nature Medicine 7(2001),No.7,833-839。当与荧光微血管造影术结合时，该模型可提供生物材料内的血管生成的定量和定性测量。C.Johnson等人,CirculationResearch 94(2004),No.2,262-268。

此外，作为包含此类天然生物学活性组分的补充或替代，可将非天然生物学活性组分例如由重组技术或其它方法(例如，遗传物质例如DNA)合成产生的那些组分掺入本发明使用的ECM材料中。此类非天然生物学活性组分可以是天然来源的或重组产生的蛋白质，所述蛋白质相应于天然存在于ECM组织中的蛋白质，但可能来自不同物种。此类非天然生物学活性组分还可以是药物。可添加至材料中的示例性药物包括例如.抗凝血剂例如肝素、抗生素、消炎药、血栓促进物质(thrombus-promoting substance)例如凝血因子例如凝血酶、血纤蛋白原等，以及抗增殖试剂例如紫杉醇衍生物例如紫杉酚。可以以任何适当的方式，例如(仅举几例)，通过表面处理(例如，喷雾)和/或浸渍(例如，浸泡)将此类非天然生物学活性组分掺入ECM材料中和/或其上。同样地，还可在即将进行方法前(例如，通过将材料浸渍在包含适当的抗生素例如头孢唑林的溶液中)，或在将材料移植入患者的过程中或之后，将此类物质在预制造步骤中施用至ECM材料。

本发明的移植物组合物可掺入异种移植ECM材料(即，交叉物种材料，例如给人受体的来自非人供体的组织材料)、同种异体移植ECM材料(即，种内材料，来自与受体相同的物种的供体的组织材料)和/或自体移植ECM材料(即，其中供体与受体为相同个体)。此外，任何掺入ECM材料的外源生物学活性物质可来自与ECM材料所源自的动物相同的物种(例如相对于ECM材料是自体的或同种异体的)或可来自与ECM材料来源不同的物种(相对于ECM材料是异种的)。在某些实施方案中，ECM组织材料相对于接受移植物的患者是异种的，并且任何添加的细胞或其它外源材料可来自与接受移植物的患者相同的物种(例如自体或同种异体的)。举例来说，可利用已用外源人细胞和/或血清蛋白质和/或本文中描述的其它材料修饰的异种ECM材料(例如猪、牛或羊衍生的)来治疗人患者，此类外源材料为天然来源的和/或重组产生的。

当用于本发明时，ECM材料可不含或基本上不含另外的非天然交联，或可包含另外的交联。这样的另外的交联可通过光交联技术，通过化学交联剂，或通过由脱水或其它方法诱导的蛋白质交联来实现。然而，因为某些交联技术、某些交联试剂和/或某些程度的交联可破坏可重塑材料的可重塑性，因此在可重塑性质的保持是期望的情况下，可重塑ECM材料的任何交联可进行至这样的程度或以这样的方式进行，所述程度或方式允许材料保持至少一部分其可重塑性质。可使用的化学交联剂包括例如醛类例如戊二醛、二酰亚胺例如碳二亚胺例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、核糖或其它糖类、酰基叠氮、磺基-N-羟基琥珀酰胺或聚环氧化物化合物，包括例如多缩水甘油醚例如可在商品名称DENACOL EX810下从Nagese Chemical Co.,Osaka,Japan获得的乙二醇二缩水甘油醚和可在商品名称DENACOL EX 313下从Nagese Chemical Co.获得的甘油聚缩水甘油醚。通常，当使用时，聚缩水甘油醚或其它聚环氧化物化合物可具有2至约10个环氧化物基团/分子。

在另外的实施方案中，本发明的基底可由已经历扩张材料的处理的ECM或其它胶原性材料制造。在某些形式中，此类扩张的材料可通过ECM材料与变性剂例如一种或多种碱性物质的受控接触(直至材料扩张)以及扩张的材料的分离来形成。举例来说，接触可足以将ECM材料扩张至其初始总体积的至少120％(即1.2倍)或在一些形式中扩张至其原始体积的至少约2倍。此后，可任选地从碱性介质分离扩张的材料，例如通过中和和/或漂洗。可以以任何适当的方式将收集的扩张的材料用于制备基底。举例来说，可富集具有生物学活性组分的扩张的材料，在具有期望的形状或构型的基底的形成中，将其进行粉碎、干燥和/或模塑等。在某些实施方案中，用扩张的ECM材料形成的干燥基底可以是高度可压缩的和/或可扩张的。

用变性剂例如碱性物质处理ECM材料可引起材料的物理结构的改变，这反过来引起其扩张。此类变化可包括材料中胶原的变性。在某些实施方案中，优选将材料扩张至其初始总体积的至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约6倍或甚至更多倍。对于本领域技术人员来说很显然的是，扩张的量级与几个因素相关，包括例如碱性介质的浓度或pH、碱性介质对材料的暴露时间以及处理待扩张的材料所用的温度等等。鉴于本文中的公开内容，可通过常规实验来改变这些因素，以获得具有期望的扩张水平的材料。

胶原原纤维包含原胶原分子的四交错阵列(quarter-staggered array)。原胶原分子本身由通过分子内共价键和氢键连接在一起形成三螺旋的三条多肽链形成。此外，在胶原原纤维内的不同原胶原分子之间形成分子间共价键。经常地，多个胶原原纤维彼此装配以形成胶原纤维。据信，可控制碱性物质至本文中描述的材料的添加以不显著破坏分子内和分子间键，但使材料变性至这样的程度，其为材料提供增加的处理的厚度例如至少2倍于天然存在的厚度。可经处理以产生用作基底的扩张的材料的ECM材料可包括本文中公开的任何此类ECM材料或其它适当的ECM。通常，此类ECM材料可包括具有天然发生的分子内交联和天然发生的分子间交联的胶原原纤维的网络。在进行如本文中描述的扩张过程后，可将天然存在的分子内交联和天然存在的分子间交联充分地保留在处理的胶原性基质材料中，以维持胶原性基质材料作为完整胶原性片层材料；然而，可使胶原性片层材料中的胶原原纤维变性，并且胶原性片层材料可具有大于起始材料厚度的碱处理的厚度，例如为起始厚度的至少120％，或起始厚度的至少2倍。随后可处理扩张的ECM材料以提供泡沫或海绵基底，例如通过粉碎、浇铸和干燥处理的材料。关于扩张的ECM材料及其制备的另外的信息可见于2009年12月31日公布的美国专利申请公布No.US20090326577、2009年6月22日提交的已公布的美国专利申请系列No.12/489,199(它们通过引用整体并入本文)中。

除ECM材料外或作为对ECM材料的替代选择，本发明中使用的细胞生长基底可包含其它适当的材料。示例性材料包括例如包含天然或合成的聚合物的合成产生的基底。示例性合成的聚合物可包括不可吸收的合成的生物相容性聚合物，例如醋酸纤维素、硝酸纤维素、硅酮、聚对苯二甲酸乙二酯、聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚醚砜、聚碳酸酯、聚丙烯、高分子量聚乙烯、聚四氟乙烯或其混合物或共聚物；或可吸收的合成的聚合物材料，例如聚乳酸、聚乙醇酸或其共聚物，聚酸酐、聚己酸内酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基链烷酸酯或另一种生物可降解的聚合物或其混合物。包含此类或其它材料的优选细胞生长基底可以为多孔基质材料，其被构造以允许细胞侵入基质并且向内生长。

用于本发明实施方案的细胞

广泛细胞类型的任一种或任意组合可用于本发明的细胞移植物-相关的组合物和方法。例如，细胞可以为皮肤细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肺细胞、肠系膜细胞或脂肪细胞。脂肪细胞可来自网膜脂肪、腹膜前脂肪、肾周围脂肪、心包脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪或附睾脂肪。在某些实施方案中，细胞包含间质细胞、干细胞或其组合。如本文中所使用的，术语“干细胞”以广义使用，包括常规干细胞、脂肪衍生的干细胞、祖细胞、前祖细胞(preprogenitor cell)、贮藏细胞(reserve cell)等。示例性干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、多潜能干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞(lymphoid stem cell)、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、周围神经系统干细胞等。可使用的另外的示例性细胞包括肝细胞、上皮细胞、枯否细胞、成纤维细胞、神经元、心肌细胞、肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰岛(islets of Langerhans)、骨细胞、成肌细胞、卫星细胞、内皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胆道上皮细胞和任何此类细胞类型的祖细胞。

在一些实施方案中，包含在细胞移植物中的细胞为内皮祖细胞(EPC)或包括内皮祖细胞。用于本发明的优选EPC为内皮集落形成细胞(ECFC)，特别地具有高增殖潜能的ECFC。适当的此类细胞描述于例如2005年12月1日公布的美国专利申请公布No.20050266556、2005年2月9日提交的公布的美国专利申请系列No.11/055,182和2008年1月1日公布的美国专利申请公布No.20080025956、2007年8月13日提交的公布的美国专利申请No.11/837,999中，其各自通过引用整体并入本文。此类ECFC细胞可以为克隆性群体和/或可获自人或其它动物的脐带血。此外或可选择地，内皮集落形成细胞具有下列特征：(a)表达细胞表面抗原CD31、CD105、CD146和CD144；和/或(b)不表达CD45和CD14；和/或(c)摄取乙酰化LDL；和/或(d)当从个单细胞涂铺时，重新涂铺成至少2000个细胞的至少次级集落；和/或(e)表达高水平的端粒酶(HeLa细胞表达的端粒酶水平的至少34％)；和/或(f)显示大于0.8的核质比(nuclear to cytoplasmic ratio)；和/或(g)具有小于约22微米的细胞直径。此类特征(a)-(g)的一些或全部特征的任意组合可表征用于本发明的ECFC。

在其它实施方案中，掺入细胞移植物的细胞为或包括，肌肉来源的细胞，包括肌肉来源的成肌细胞和/或肌肉来源的干细胞。适当的此类干细胞和用于获得它们的方法描述于例如美国专利No.6,866,842和美国专利No.7,155,417中，其各自通过引用整体并入本文。肌肉来源的细胞可表达结蛋白、M-钙粘蛋白、MyoD、肌形成蛋白、CD34和/或Bcl-2，并且可缺乏CD45或c-Kit细胞标志物的表达。

在其它实施方案中，掺入细胞移植物的细胞为或包括，来源于脂肪组织的干细胞。适当的此类细胞和用于获得它们的方法描述于例如美国专利No.6,777,231和美国专利No.7,595,043中，其各自通过引用整体并入本文。细胞群体可包括脂肪来源的干细胞和再生细胞，有时也称为血管基质部分细胞，其可以为包括干细胞、内皮祖细胞、白细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的混合群体，其可以是成体来源的。在某些形式中，本发明的细胞移植物可利用脂肪来源的细胞制备并且可包括脂肪来源的细胞，所述脂肪来源的细胞可分化成骨细胞、软骨细胞、神经细胞或肌肉细胞的两种或更多种。

利用细胞移植物的医学治疗

根据本发明的以及根据本发明制备的细胞移植物可用于多种临床应用以治疗损伤的、患病的或不充足的组织，并且可用于人或非人动物。待治疗的此类组织可以例如为肌肉组织、神经组织、脑组织、血液、心肌组织、软骨组织、器官组织例如肺、肾或肝组织、骨组织、动脉或静脉血管组织、皮肤组织等等。

在某些实施方案中，细胞移植物可用于增强患者的血管形成，例如以缓和组织的局部缺血。血管形成细胞移植物(例如包含内皮集落形成细胞或其它内皮祖细胞的移植物)至局部缺血部位的直接施用可增强新血管在受影响的区域的形成以及改善血流或其它结果。待治疗的局部缺血组织可以例如为局部缺血心肌组织(例如在梗塞后)，或腿或其它肢体中的局部缺血组织(例如在临界性肢体缺血中发生的)。施用至局部缺血组织的细胞移植物可以为可流动的移植物材料，特别是可注射的移植物材料，如本文中公开的。

细胞移植物还可用于增强部分或完全厚度的真皮伤口(例如皮肤溃疡例如糖尿病性溃疡和烧伤)的愈合。举例来说，包含内皮集落形成细胞或其它内皮祖细胞的移植物至此类伤口的施用可增强伤口愈合。

在其它应用中，细胞移植物可用于在靶部位上产生肌肉组织，例如在骨骼肌组织、平滑肌组织、心肌组织或其它组织的治疗中。举例来说，可以将包含肌肉来源的成肌细胞的本发明的细胞移植物递送入(例如通过注射)括约肌例如膀胱括约肌的肌肉组织内以治疗失禁。

应理解，可使用本文中描述的细胞接种装置和系统制备和进行所有本文中描述的包含细胞的移植物材料实施方案和本文中描述的方法实施方案，例如通常包括步骤：将基底材料加载至细胞接种装置中，将细胞组合物加载至细胞接种装置中，和通过操作细胞接种装置至少部分地和潜在完全地组合基底材料与细胞。当使用本文中描述的其它组分例如预条件化介质、凝胶或可胶凝材料等时，可将它们装载至细胞接种装置的适当的小室或通道，以在细胞接种装置的作用下进行操作和与其它材料组合，如通常所描述的。本领域技术人员将易于理解，构成本发明其它方面的本文中描述的特征和实施方案的此类组合。随后可从细胞接种装置获得接种细胞的移植物材料，并任选地将其给患者包括人患者施用，例如以治疗本文中描述的医学适应症。

在描述本发明的背景中(特别地在下列权利要求的背景中)，术语“一个/一种(a和an)”和“所述/该(the)”以及类似描述的使用，除非本文中另外指出或根据上下文明显矛盾，否则将被解释为包括单数和复数。除非本文中另外指出，否则本文中引述的数值范围仅意在用作逐个提及落在该范围内的每一个单独的数值的速记法，并且每一个单独的数值并入本说明书中，就如同其在本文中被逐个地引述一样。除非在本文中另外指出或另外地根据上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法可以以任何适当的顺序来进行。除非另外要求，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意在更好地阐明本发明并且不对本发明的范围加以限制。本说明书中的语言都不应当解释为，任何未要求的元素都是实施本发明所必需的。

虽然已在附图和上述描述中详细地举例说明和描述了本发明，但所述附图和上述描述被认为是对特征的示例而不是限制；应理解，仅显示和描述了优选实施方案，并且期望保护落在本发明的精神内的所有改变和变动。此外，本文中引用的所有参考资料表示本领域技术人员的水平，并且因此通过引用整体并入本文。

Claims (21)

1.制备用于递送给患者的接种有细胞的组合物的方法，其包括：

提供流体细胞外基底颗粒组合物，其含片层形式的细胞外基底颗粒和液体介质，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时，具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在占最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍，

将流体细胞外基底组合物和液体细胞悬浮液合并以形成细胞流体组合物，和

混合该细胞流体组合物。

2.权利要求1的方法，还包括将所述细胞流体组合物形成凝胶。

3.权利要求2的方法，其中所述的形成包括改变细胞流体组合物的pH。

4.权利要求2的方法，其中所述的形成包括改变细胞流体组合物的温度。

5.用于制备接种有细胞的组合物的方法，其包括：

将细胞悬浮液和颗粒化的细胞生长基底合并，所述颗粒化的细胞生长基底含有片层形式的细胞外基底颗粒，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时，具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在占最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍，和

在与颗粒化的细胞生长基底接触的条件下温育细胞悬浮液以形成含有附着于颗粒化的细胞生长基底的细胞的细胞化颗粒体，其中所述的温育是指在不发生细胞数量显著扩增的条件下保持一段时间。

6.权利要求5的方法，其中所述的温育是在细胞数量不扩增的情况下，有效地使所述悬浮液中的细胞的至少20％附着于所述颗粒的条件下保持一段时间。

7.包含细胞化颗粒体的细胞移植物在制备用于治疗患者的药物中的用途，所述的细胞化颗粒体包含附着于片层形式的细胞外基底颗粒上的细胞，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

8.细胞移植物材料，包含：

颗粒化的细胞生长基底材料，和附着于所述细胞生长基底材料的颗粒上的细胞，其中细胞包括间充质干细胞、内皮祖细胞、肌源性细胞、或其组合，所述颗粒化的细胞生长基底材料含有片层形式的细胞外基底颗粒，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时，具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

9.细胞生长基底组合物，包含：含具有紧凑形状的片层细胞生长基底颗粒的颗粒化材料，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时，具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

10.权利要求9的基底组合物，其中至少50％的片层基底颗粒具有这样的第一最大横截面尺寸轴:当在片层的平面中考虑时，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

11.权利要求9的基质组合物，其中至少70％的片层基底颗粒具有这样的第一最大横截面尺寸轴:当在片层的平面中考虑时，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

12.权利要求9的组合物，其中所述的基底颗粒的最大横截面尺寸在20微米至2000微米的范围。

13.细胞外基底组合物，包含：含具有紧凑形状的片层形式的细胞外基质颗粒的颗粒化细胞外基质材料，所述片层形式的细胞外基底颗粒的至少25％当在片层的平面中考虑时，具有这样的第一最大横截尺寸轴，该轴不超过在与最大横截面尺寸轴垂直并且以最大横截面尺寸轴为中心的线上获取的第二横截面尺寸轴的长度的2倍。

14.权利要求13的组合物，其中所述的细胞外基底颗粒的第一最大横截面尺寸轴在20微米至2000微米的范围。

15.权利要求14的组合物，其中所述的细胞外基底颗粒的第一最大横截面尺寸轴在20微米至500微米的范围。

16.权利要求9的组合物，还包含附着于颗粒的细胞。

17.权利要求16的组合物，其中所述细胞基本上覆盖了颗粒的整个外表面。

18.权利要求17的组合物，其中所述细胞形成了覆盖于颗粒的整个外表面的基本上汇合的单层。

19.权利要求18的组合物，其中所述细胞包括间充质干细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、肌源性细胞或其混合物。

20.权利要求19的组合物，其中所述细胞是克隆的。

21.权利要求13的组合物，其中所述片层形式的细胞外基质颗粒是圆形和/或椭圆形的。