WO2006028274A1

WO2006028274A1 - 細胞培養物の生産と該生産に用いる材料

Info

Publication number: WO2006028274A1
Application number: PCT/JP2005/016989
Authority: WO
Inventors: Nagahiro Saito; Osamu Takai; Yunying Wu; Hiroyuki Honda; Akira Ito
Original assignee: National University Corporation Nagoya University
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2005-09-08
Publication date: 2006-03-16
Also published as: JP4843793B2; US7883865B2; US20080032403A1; JPWO2006028274A1

Abstract

本発明は、微細なパターンの細胞培養物を生産可能な新たな方法、及びこの生産方法において好適に用いることができる細胞培養用基板とその製造方法を提供する。　ここで開示される細胞培養用基板は、基材と、上記基材上に形成された撥水性表面を有する撥水層と、上記基材上に形成された所定のパターンの親水性面とを備える。好ましくは、上記撥水性表面の水滴接触角は１５０°を越える。

Description

明細書細胞培養物の生産と該生産に用いる材料技術分野

本発明は、所望するパターンの細胞培養物を生産する方法、及ぴその方法に好適に用いることができる細胞培養用基板とその製造方法に関する。より詳細には、撥水面と親水面とで形成された微細パターンに沿う細胞培養物を生産可能な方法、及びその生産に用いられる細胞培養用基板とその製造方法に関する。背景技術

細胞や組織の培養技術の進展によって、種々の検体から採取し培養した細胞等を様々な視点から解析（診断）することが容易となった。また、所謂ティシュー一エンジニアリングの進歩によって、実際に失った体の一部分を再生する再生医学が急速に進展し、それを臨床に応用した再生医療が活発になってきており、すでに皮膚などで実用化されている。

ところで、再生医療、或いは細胞（又は組織）レベルでの診断の更なる進展には、所望する形態、構造、様式（以下「パターン」と総称する。）で細胞培養物 (培養された組織を包含する。以下同じ。）を生産することが必要である。近年、細胞をより生体と近！/、状態に培養するために、生体と同様の形態、構造に形成させる試みがなされている。

例えば、特開平 2— 841 74号公報、特開平 6— 33538 1号公報、特開 2002- 355031号公報、特表 2003— 52761 5号公報（WO 01 /070389) には、細胞が接着しやすい官能基、ポリマー膜、細胞成長促進分子、又は細胞接着促進剤を基板上にパタ一ン形成して成る細胞培養基板や細胞パターン形成方法が記載されている。また、特開 2004— 105043号公報には、細胞培養基板上の親水化領域をパターン化し、基板上の該パターン以外の部分に非細胞接着性処理を施し、該パターン領域に選択的に細胞パターンを形成する技術が記載されている。発明の開示

生体内における幾種かの組織や器官（例えば毛細血管）は、極めて微細な形態或いは構造を有している。従って、これら微細な組織又は器官についての組織化学的な解析や再生医学を進める上で、従来よりも微細で多様なパターンを有する細胞培養物の生産技術が望まれている。例えば、患者に応じてパターン化された毛細血管網や神経組織ネットワークを形成 ·生産することができれば、再生医療の進展に大きく寄与する。

そこで本発明は、かかる目的を達成すべく開発されたものであり、微細なパタ —ンの細胞培養物（所定のパターンに形状化された培養物（生体組織）を包含する。）を生産可能な新たな方法を提供することを目的とする。また、この生産方法において好適に用いることができる細胞培養用基板とその製造方法を提供することを他の目的とする。さらに本発明は、ここで開示された方法によって生産された所望する微細なパターンの細胞培養物（例えば血管等の管状に形成された組織化された培養物）を提供することを他の目的とする。

上記目的を達成すべく本発明は、基材と、上記基材上に形成された撥水性表面を有する撥水層と、上記基材上に形成された所定のパターンの親水性面とを備える、細胞培養用基板を提供する。

また、本発明は、そのような細胞培養用基板（換言すれば細胞培養物生産用基板）の製造方法を提供する。ここで開示される細胞培養用基板製造方法は、適当な基材を用意し、その基材上に撥水性表面を有する撥水層を形成すること、および、基材上に所定のパターンの親水性面を形成すること、を包含する。

典型的な一つの製造方法では、適当な基材を用意し、その基材上に撥水性表面を有する撥水層を形成する。そして、該撥水性表面のうち、所定のパターンに対応する部分を除去し、該部分に所定のパターンの親水性面を形成する。

なお、本明細書において「基板」或いは「基材」とは、所定のパターンで細胞培養を行うための支持材料（即ち、細胞培養床を有する基材）一般をいい、特定の形状、構造のものに限定されない。例えば、基板（基材）は、平面状、曲面状であってもよく、或いは、所望する三次元的な形状を採っていてもよい。上記撥水性表面に関して「除去」とは、当該所定のパターンに対応する部分の撥水性表面を構成する撥水層の一部を取り除くことの他、撥水層（撥水性表面）の分子レベルの変性或いは欠損を包含する用語である。

好適には、上記所定のパターンに対応する部分の除去（変性、欠損を含む。）はリソグラフィにより行われる。本明細書において「リソグラフィ」とは、光その他の電磁波エネルギー、イオンビームその他集束された熱エネルギー等を所定のパターンで被処理材上に照射することによつて該被処理材上に所望する微細なパターンを形成する微細加工技術をいう。半導体素子の製造において適当なフォトマスク及ぴ露光装置を用いて行われるウェハへの回路パターン形成（フォトリソグラフィ）は、ここでいぅリソグラフィに包含される典型例である。かかるリソグラフィの採用によって、撥水性表面の一部に対して微細な加工が可能であり、極めて微細なパターンの親水性面（即ち細胞培養面）を撥水層（即ち非細胞培養面）の一部に正確に形成することができる。また、細胞培養床となる基材に対して直接的に所定の親水性パターンを形成しているために、パターン位置の誤差やずれを防止し、正確に微細な所定パターンを得ることができる。

或いは、種々のレーザによるアブレーションによっても上記所定のパターンに対応する部分の除去を好適に行うことができる。

また、他の典型的な一つの細胞培養用基板製造方法では、親水性表面を有する基材を用意し（例えばゼラチン、コラーゲンのような親水性物質で表面がコーテイングされた基材）、その基材上に所定のパターンの親水性面を残してその周囲に撥水性表面を有する撥水層を形成する。好適には、上記所定のパターンの親水性面を残してその周囲に撥水層を形成することは、リソグラフィにより行われる。本発明によって提供される細胞培養用基板上では、所定パタ一ンの親水性面において選択的に培地を配置し得、さらに目的とする細胞を接着することができる。そして、該パターンの周囲の部分は撥水性表面を有する撥水層で形成されている。従って、例えば本発明によって提供される細胞培養用基板上に少量の培地を添加した場合、該撥水性表面上では培地（培養液）がはじかれてしまう。この場合、撥水性表面上での細胞の培養は事実上不可能である。

即ち、ここで開示される細胞培養用基板では、所定パターンの境界が明確に区切られ、所定パターン（好ましくは撥水層に対するリソグラフィの適用によって形成し得る微細なパターン）の親水性面上において、選択的に鮮明な境界をもつて培地を配置し、且つ該パターンに対応させて形状化された細胞培養物（細胞集合塊や組織化した培養物を包含する）を得ることができる。また、微細パターンの親水性面上に配置された水系培地（培養液）の撥水性面上への流出が抑止されるため、当該微細パターンの親水性面上において、典型的には水滴状に盛り上がつた培地を保持することができる。このため、本発明によって提供される細胞培養用基板を使用すると、接種する細胞の種類や性状にも影響されるが、平面方向のみならず高さ方向に増殖した三次元形状（例えば微小組織又は微小器官形状）の細胞培養物を得ることができる。なお、本明細書において「細胞培養物」とは、所定の組成及び形態の培地中で培養された細胞群（例えば細胞塊、組織）をいい特定の性状に限定されない。

本発明は他の側面として、細胞を培養するための基板であって所定のパターンで形成された親水性面と該パターン以外の部分に形成された撥水性表面とを有する基板を用意すること、上記親水性面上に選択的に培地を配置すること、および、該配置された培地中において目的の細胞（例えば E S細胞のような幹細胞、その他の浮遊性細胞）を培養すること、を包含する所望するパターンの細胞培養物を生産する方法を提供する。典型的には、ここで開示されるいずれかの細胞培養用基板を使用することによつて本態様の細胞培養物生産方法を好適に実施することができる。

かかる構成の方法では、基板の所定パターンの親水性面に選択的に培地を配置する。このとき、基板の該パターンの周囲の部分は撥水性表面であるために、その面では培地（典型的には培養液）がはじかれて保持されない。このため、該パターンに対応させて精密に培地を配置しなくても、境界を鮮明にして該パターンに沿って容易に培地を配置することができる。好ましくは水滴状に盛り上がった状態で培地を保持することができる。従って、本生産方法では、基板上において所定のパターンに配列された状態の細胞培養物を生産することができる。或いは、該パターンに沿つて配置された培地中にぉ、て微細で精密なパターンに形状化された二次元形状或いは三次元形状の細胞培養物（組織片であり得る）を生産することができる。

或いはまた、ここで開示される細胞培養用基板では、過剰に培地を添加した場合（撥水性表面上にも培地が満たされている場合）でも撥水性表面上では細胞が接着（付着）し難く、種々の接着性細胞（例えば血管内皮細胞、神経細胞、線維芽細胞）を所定パターンの親水性面上でのみ接着させ、当該親水性面のパターンに対応するパターンに形状化された培養物（細胞集合塊又は組織）として培養及び生産することができる。

従って、本発明は他の側面として、細胞を培養するための基板であって所定のパターンで形成された親水性面と該パターン以外の部分に形成された撥水性表面とを有する基板を用意すること、および、上記親水性面上に選択的に目的の接着性細胞を接着させた状態で該細胞を培養すること、を包含する所望するパターンの細胞培養物を生産する方法を提供する。典型的には、ここで開示されるいずれかの細胞培養用基板を使用することによって本態様の細胞培養物生産方法を好適に実施することができる。

かかる構成の方法では、上記構造上の特徴を有する基板を使用する結果、基板の所定パターンの親水性面に選択的に接着性細胞を接着させ得る。即ち、基板の該パターンの周囲の部分は撥水性表面であるため、その面では細胞の接着が阻害される。このため、特段の操作を要することなく、該パターンに対応させて精密に目的細胞を親水性面上に配置することができる。従って、本生産方法では、基板上において所定のパターンに配列された状態の接着性細胞から成る細胞培養物を形成 ·生産することができる。即ち、微細で精密なパターンに形状化された二次元形状或いは三次元形状の細胞培養物（例えば所定パターンで延伸する毛細血管のような管状又は紐状組織）を生産することができる。

本発明によって提供される細胞培養用基板の好ましい一態様では、上記撥水層は単分子層である。また、ここで開示される細胞培養用基板製造方法の好ましい一態様では、上記撥水層を単分子層として形成する。

撥水層が所定の化合物から構成される単分子層であることにより、当該撥水層をほぼ一定の厚さの薄い層とすることができる。また、単分子層であると、撥水性表面の撥水性能をより均一にすることができる。また、撥水性面と親水性面との凹凸形態をほぼ均等にし、培地を親水性面の全体に亘つてほぼ均一に配置することができる。さらに、単分子層は超微細な層であるため、より微細なパターンを形成することも可能である。

本発明によって提供される細胞培養基板の更に好ましい一態様では、上記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越える。また、ここで開示される細胞培養用基板製造方法の更に好ましい一態様では、上記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越えるように上記撥水層を形成する。このような超撥水性表面にすることによつて、より微細な且つ明確なパターンの細胞培養物を得ることができる。従って、本発明は他の側面として、上記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越えることを特徴とする細胞培養物生産方法を提供する。

本発明によって提供される細胞培養基板の好ましい他の一態様では、上記親水性面は三次元形状パターンに形成されている。また、ここで開示される細胞培養用基板製造方法として好ましい他の一態様では、上記親水性面を三次元形状パターンに形成する。ここで「三次元形状パターン」とは、一つの平面方向（二次元方向）への広がりに加えて該平面に対して少なくとも高さ方向への広がりを有する形状（態様）のパターンをいい、その程度は限定されない。例えば、リソダラフィによって撥水層の一部が厚み（深さ）方向に除去され、そこに形成された所定の凹みを有する溝状パターンは、ここでいう三次元形状パターンに包含される典型例である。かかる三次元パターンの親水性面を構成することによって、該パターンに対応して精密に形状化された所望の三次元形状の細胞培養物を生産することができる。従って、本発明は他の側面として、上記培地を三次元形状パターンで配置し、該パターンに対応する三次元形状に細胞培養物を生産する細胞培養物生産方法を提供する。

本発明によって提供される細胞培養基板の特に好ましい一態様では、上記親水性面は幅 1 0 0 μ ηι以下の溝状又は線状パターンに形成されている。また、ここで開示される細胞培養用基板製造方法として特に好ましい一態様では、上記親水性面を幅 1 0 0 m以下の溝状又は線状パターンに形成する。このようなパターンの親水性面の形成によって、例えば再生医療において望まれる所定パターンの毛細血管網のようなパターン化された管状の細胞培養物を好適に生産することができる。従って、本発明は他の側面として、上記親水性面が幅 1 0 0 z m以下の溝状又は線状パターンに形成され、該パターンに対応する管状細胞培養物を好適に生産する細胞培養物生産方法を提供する。

また、ここで開示される基板製造方法の好ましい他の一態様では、上記撥水層を、上記基板に結合可能な官能基と置換された又は置換されていないアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基とを備えた有機高分子化合物から形成することを特徴とする。

このような有機高分子化合物は、基板に結合可能な官能基を有することにより、基板表面に容易に有機化合物層を形成させることができる。また、かかる有機高分子化合物は、置換された又は置換されていないアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基を備えることにより、例えば水滴接触角が 1 3 0 ° 以上、好ましくは 1 5 0 ° 以上の高度な疎水性（即ち超撥水性）を有し得る。従って、形成された有機化合物層表面に水系培地（培養液）を付着させ得ない或いは接着性細胞を付着させ得ない好適な撥水性（超撥水性）を付与することができる。

この態様において、より好ましくは、上記アルキル基、アルケニル基又はアルキニル基の一部又は全部がフッ素で置換されている。フッ素置換した炭素鎖を有する化合物から疎水性有機化合物層（撥水層）を形成することにより、その表面における撥水性をより高めることができる。即ち、基板表面に超撥水性領域を形成することができる。上述したような有機化合物から成る単分子層が特に撥水層として好ましく、基板表面の全体に亘つてほぼ均一な超撥水性領域を形成することができる。

また、本発明は、他の側面として、所望する微細なパターンに形状化された或いは配列された細胞培養物を提供する。かかる構成の細胞培養物は、ここで開示したいずれかの生産方法によって得ることができる。このパターンは、好適にはマイクロレベル（典型的には 1 m以上 l mm未満）又はミリレベル（典型的には 1 mm以上 1 O mm未満）の寸法で制御され得る。好ましい一態様として、提供される細胞培養物は、所望する三次元形状パターンに形成されている。或いは、毛細血管網、神経網のように、パターン化され且つ管状若しくは紐状の細胞培養物が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、基材に撥水層及ぴ親水性面を形成する一つのプロセスを説明する図である。即ち、図 1 ( 1 ) は種々の反応性基（表面官能基）が導入された基材表面を示しており、図 1 ( 2 ) は基材表面に撥水層が形成された状態を示しており、図 1 ( 3 ) は所定のパターンの親水性面が形成された状態を示している。

図 2は、親水性面に培地を配置する一つの手段を説明する図である。即ち、図

2 ( 1 ) は培地の基材への供給状態を示しており、図 2 ( 2 ) は過剰に供給された培地を取り除く状態を示している。

図 3は、親水性面に培地を配置する他の一つの手段を説明する図である。即ち、図 3 ( 1 ) は培地（液体）中に基材を浸漬した状態を示しており、図 3 ( 2 ) は当該培地中から基材を取り出した状態を示している。

図 4は、親水性面に培地を配置する他の一つの手段を説明する図である。

図 5は、撥水層を構成する化学構造の一例を説明する図である。

図 6は、撥水層を構成する化学構造の他の一例を説明する図である。

図 7は、一つの実施例においてフォトリソグラフィで用いたマスクを示す。図 8は、撥水層及び親水性面が形成された基板の一例を示す模式図である。図 9は、一つの実施例において生産した細胞培養物（培養開始後 1日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 1 0は、一つの実施例において生産した細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 1 1は、一つの実施例において生産した細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 1 2は、一つの実施例において生産した細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 1 3は、一つの実施例において採用されたパターン形状を示す模式図である。図 1 4は、一つの実施例において生産した細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 1 5は、基板上に形成され得るパターン形状の一例を示す模式図である。 5 016989

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図 1 6は、基板上に形成され得るパターン形状の他の一例を示す模式図である。図 1 7は、基板上に形成され得るパターン形状の他の一例を示す模式図である。図 1 8は、基板上に形成され得るパターン形状の他の一例を示す模式図である。図 1 9は、基板上に形成され得るパターン形状の他の一例を示す模式図である。図 2 0は、 —つの実施例において親水性面に培地を配置した状態を示す模式図である。

図 2 1は、管状細胞培養物を示す模式図である。

図 2 2は、親水性面から成る溝状パターンが形成された基板の一例を示す模式図である。

図 2 3は、図 2 2に示す基板の親水性面に細胞が配置された状態を示す模式図である。

図 2 4は、図 2 2に示す基板の親水性面（溝状パターン）に沿って形成された管状細胞培養物を示す模式図である。

図 2 5は、親水性面から成る線状パターンが形成された基板の一例を示す模式図である。

図 2 6は、図 2 5に示す基板の親水性面（線状パターン）に沿って形成された管状細胞培養物を示す模式図である。

図 2 7は、親水性面から成る溝状パターンが形成された基板の一例を示す模式図である。

図 2 8は、図 2 7の基板を用いて得られ得る管状細胞培養物を示す模式図である。

図 2 9は、一つの実施例において生産した管状細胞培養物（培養開始後 7日目の毛細血管）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 3 0は、図 2 9に示す管状細胞培養物の先端部（A) を拡大して示す顕微鏡写真である。

図 3 1は、図 2 9に示す管状細胞培養物の中央部（B ) を拡大して示す顕微鏡写真である。

図 3 2は、一つの実施例において生産した管状細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。 6989

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図 3 3は、一つの実施例において生産した管状細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。

図 3 4は、一つの比較例において基板に接着した細胞培養物（培養開始後 3日目）の一部を示す位相差顕微鏡写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば、細胞培養用基板の親水性面及び撥水性表面の構成、親水性面のパターン形状及び実践するリソグラフィ技法）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば、培養する細胞、培地、細胞の培養方法、及び撥水層形成手段）は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。

ここで開示される細胞培養用基板（換言すれば細胞培養物生産用基板）を製造するために用いられる基材としては、細胞を培養するために用いられている従来公知の種々の基材を特に制限なく採用することができる。例えば、基材を構成する材質としては、ガラス、シリコン、セラミックス、金属、及ぴ高分子材料が挙げられる。一般的なシリカガラス製の培養基材（例えばペトリディッシュ）を好適に用いることができる。また、セラミックス、例えば、シリカ、アルミナ又はァパタイト製の基材が好適材料として挙げられる。また、金属、例えば、金、銀、又は銅製の基材が好適材料として挙げられる。また、高分子材料、例えば、ポリアセタール、ポリアミド、ポリカーボネート、 A B S樹脂、ポリイミド、フッ素系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、及ぴこれらの誘導体製の基材が好適材料として挙げられる。また、これら合成樹脂製の基材の他、絹ブイプロインブイム製基材を用いてもよい。

これらのうち、撥水層を容易に形成し得るものが好ましく使用できる。特にシリコンゃシリカ製基板は、表面に高分子を結合させ得る反応性基（典型的にはシラノール基のような親水基）を容易に導入し得、種々の高分子化合物層の形成が容易であるために好適である。例えば、表面酸化層（シリカ層）を備えたシリコン基材に種々の処理を施すことによって、その表面にシラノール基（S i - O H ) を導入することができる。、

一方、撥水層は、適当なリソグラフィ技法、或いはアブレーシヨン技法によつて、少なくともその表面の除去（分子レベルの変性或いは欠損を含む）が可能な従来公知の種々の高分子化合物（典型的には感光性樹脂）から形成することができる。例えば、基材に結合可能な官能基と、置換された又は置換されていないァルキル基、アルケニル基、アルキニル基等（じの数は1以上、好ましくは Cの数が 5以上、例えば 1 0〜3 0のような比較的長い炭素鎖）を有する高分子物質が好適に用いられる。

このようなアルキル（或いはアルケニル又はアルキニル）鎖を有する化合物は、基材表面に結合させた際に、それら鎖間のファンデルワールス力により、容易に高密度及ぴ高配向の単分子層（即ち自己組織化単分子層； self-assembled monolayer)を形成し得るため好ましい。また、アルキル基（例えば、 Cの数が 1 〜3 0、好ましくは Cの数が 1 0〜3 0 ) は、高い疎水性（撥水性）を発揮し得るために特に好ましい。

例えば、基材が、その表面（培養床）にシラノール基を備えたシリコン製である場合、撥水層を形成する化合物としては、比較的鎖長の長い主鎖又は側鎖を有し、メトキシ基のような培養床に結合可能な官能基（好ましくは培養床表面に存在する反応性基と結合する）を有する有機ケィ素化合物が好適である。例えば一般式： C _n H _{2 n + 1} S i ( O C _mH _{2∞+ 1} ) ₃で示されるアルキルトリアルコキシシラン（好ましくは nが 1 0〜3 0から選択される何れかの自然数であり、 mが 1 又は 2である）が好適例として挙げられる。

また、他の好ましい化合物の例としては、基材に結合可能な官能基と、一部又は全部がフッ素置換されたアルキル基、アルケュル基又はアルキニル基等を備えた有機化合物が挙げられる。比較的長いアルキル（或いはアルケニル又はアルキニル）鎖を有する化合物は、単分子層を容易に形成し得るため特に好ましい。フッ素の置換率は特に限定されないが、アルキル鎖を構成する水素原子の過半数（例えば 7 0個数％以上の水素原子）又は実質的にほぼ全ての水素原子がフッ素原子で置換されているものが好ましい。例えば、上記一般式で示されるアルキルトリアルコキシシランにおいて、アルキル鎖を構成する水素原子の 7 0個数％以上の水素原子がフッ素に置換されたもの（後述の実施例参照）が好適である。基材表面（培養床）に撥水性表面を有する撥水層として疎水性有機化合物層を形成する手段としては、従来公知の方法を特に制限なく適用することができる。典型的には、図 1 ( 1 ) に示すように、先ず、基材 1の表面に対して、化学処理、プラズマ処理、紫外光照射処理等の活性化処理を施し、有機化合物層を基材 1表面に化学的に結合させるための種々の反応性基（表面官能基）を基材 1表面に導入する。例えば、基材 1がシリコンである場合では、好ましくは例えば大気中又は減圧条件下で真空紫外光を照射して基材 1表面を親水化（具体的にはシラノール基即ち水酸基を導入）し得る。また、酸素を含む雰囲気中で照射処理した場合には、当該紫外光照射により雰囲気酸素から発生したオゾンによつて基材 1 表面に残存する有機含有物を除去することができる。

次いで、図 1 ( 2 ) に示すように、活性化された基材 1を有機化合物の気相中において処理し、有機化合物を基材 1上において成長させ、撥水層 3を形成することができる（後述の実施例参照）。有機化合物から成る原料ガスをプラズマ状態にし、この活性プラズマを利用して、気相中およぴ基材表面での化学反応により薄膜形成を行うプラズマ C V D法の採用が好ましい。この方法によると、室温付近の温度で基材の表面に撥水性表面（撥水層）を形成することができる。従つて、例えば耐熱性の低い高分子材料（合成樹脂）製の基材（例えばポリスチレン製ペトリディッシュ）に撥水層を形成するのに好適である。

好適には撥水層 3として、有機化合物が所定方向に配向する単分子層に形成する。単分子層とすることにより、層の厚さを一定とし、かつ超薄に形成することができる。このため、均一な撥水性能を付与することができるとともに、超微細なパターンを形成可能である。撥水層 3が単分子層よりも成長した場合には、所望により、過剰に吸着した分子を除去して単分子層に形成することができる。この単分子層形成手段としては、特に限定されず、使用した物質に応じて酸処理、アル力リ処理、水洗処理等を適宜組み合わせて行うことができる。

撥水層 3の表面と水滴のなす角である接触角（即ち水滴接触角）は 1 2 0 ° 以上が好ましく、 1 4 0 ° 以上がさらに好ましく、接触角（水接触角）が 1 5 0 ° 以上（例えば 1 50〜1 60° ) である超撥水性表面の形成が特に好ましい。このような高い接触角が実現される撥水性表面によると通常の培地から成る比較的高容積の液滴（水滴）をほぼ真球形状に保つことができる。なお、接触角は、従来公知の種々の手段によって測定することができる。例えば、蒸留水から成る水滴の静的接触角（例えば液滴直径約 2 mm) を液滴法により 25 °Cの雰囲気下で接触角計（例えば、協和界面科学株式会社製の「CA - X 1 50型」）を用いて測定することができる。

次に、図 1 (3) に示すように、所定のパターンの親水性面 5が形成されるように、撥水層 3の当該パターンに対応する部分を種々の技法、例えばリソグラフィによって除去する。例えば、フォトリソグラフィ法の適用が好ましい。例えば、所定パターンと同じ透過部（光透過可能な開口部）が形成されたフォトマスクを用意し、フォトマスク越しに所定の光源（例えばエキシマランプ）から高工ネルギ一光（例えば真空紫外光）を照射する。このことによって、後述する実施例に記載のように、光照射部分即ち上記パターン部分の撥水層 3 (少なくともその表面部分）のみを選択的に光化学反応によって除去（分解又は変性を包含する）することができる。同時に、この処理によって、基材 1表面を活性化させ、該表面 5に種々の親水性基を導入することができる。例えば、基材がシリコンである場合では、好ましくは例えば大気中又は減圧条件下で真空紫外光を照射して撥水層 3を除去すると同時に基材 1表面 5を親水化（具体的にはシラノール基即ち水酸基を導入）し得る。

この結果、所定パターンの親水性面 5を形成することができる。即ち、本発明の好ましい態様において、リソグラフィによって、撥水層 3の除去と同時に除去された基材 1表面に親水性面 5を形成することができる。尚、基材 1表面の親水性が十分でない場合には、さらに化学処理などを施すことによって、親水性を付与又は向上させることができる。また、リソグラフィとしては、フォトリソダラフィに限られず、従来公知のリソグラフィを採用することができる。好適な例としては、電子線リソグラフィ、 EUV (波長が 1 3· 5 nm近傍の極端紫外光、即ち E x t r eme U l t r a V i o l e t) リソグラフィ、及び集束ィォンビームリソグラフィが挙げられる。 9

14 リソグラフィの採用によって形成するパターンは、いずれの形状であってもよく、特に制限されない。即ち、平面的な形状、又は立体的な形状（即ち、三次元的形状）であってもよく、規則的な形状、又は不規則な形状であってもよい。平面的な形状としては、ラインとスペースとからなるパターン、水玉模様のパターン、格子パターン、又は血管の複雑な枝分かれ構造を模倣した線状又は溝状パターン、等が挙げられる。また、立体的な形状としては、管状（枝分かれしたものも含む）、凹状（特に半円形の断面を有するライン状の溝）、凸状（特に半球状）、又は種々の生体組織（又は器官）のパターンを構成する立体的形状等が挙げられる。或いは、本発明で提供される基板では、その表面に配置する培地及び細胞と基板の撥水性表面とが極めて強く反発し得ることから、親水性面上において培地或いは接着性細胞を立体的なパターン形状（典型的には液滴状に盛り上がった形態）に配置することができる。従って、そのような三次元形状パターンに配置された培地中において細胞培養物を立体的に形成（生産）することも可能である。パターンのサイズ（例えば溝状パターンの幅、ドット状パターンの直径）は、特に限定されず、所望の大きさに応じて選択することができる。例えば、溝状（線状）パターンの場合、リソグラフィ技法の採用によって、幅 1 0 mm以下、好ましくは 3 mm以下、より好ましくは l mm以下、さらに好ましくは 5 0 0 /z m 以下、さらにより好ましくは 1 0 0 μ m以下、特に好ましくは 5 0 m以下の微細なパターンを形成することができる。

培養する細胞としては特に制限はなく、培養可能な所望する細胞（典型的には真核細胞、例えば哺乳動物細胞）を特に制限なく用いることができる。特に種々の生体組織に見られる接着性細胞、例えば、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞、或いは癌細胞を所定のパターンに配列させて或いは所定のパターンに形状化して形成することができる。また、所定のパターンで配置された培地の液滴中において種々の浮遊性細胞、例えば胚性幹細胞（E S細胞）や骨髄性幹細胞を効率よく培養することもできる。

即ち、ここで開示される細胞培養物の生産方法によれば、以下のような細胞の培養が可能である。（1 ) 上皮細胞又は線維芽細胞を所定のパターン形状に培養すること、（2 ) 肝細胞又は骨芽細胞に含まれる複数の細胞種を所定の配列で所定のパターン形状に培養すること、（3) 血管内皮細胞を微細で複雑な血管形状と同様な立体的チューブ形状に培養すること、（4) 胚性幹細胞等の幹細胞を微細なプロック状に培養すること。

これら培養に用いられる培地としては、従来公知の種々の培地を特に制限なく用いることができる。例えば、種々の組成のイーグル培地、 R PM I培地、 Ham's 培地、 Fisher's 培地、又は M C D B培地を用いることができる。ィーグル培地としては、 BM培地、 MEM培地、 DMEM培地等が挙げられる。また、これら培地に血清を 5〜1 0%添加してもよい。このうち、哺乳動物細胞の培養には、特にイーグル培地が好ましい。

培地を親水性面上に配置する丰段としては、特に限定されない。好適には、図 2 (1 ) に示すように、撥水性表面 1 1及ぴ親水性面 1 3を含む基材 1 5の表面全体が覆われるように培地 1 7を基材 1 5上に供給する（流し込む）とよい。或いは培地供給後に、過剰に供給された培地 1 7を、図 2 (2) に示すように、ピペット 1 9などで図中矢印方向に吸い取って取り除くことによって、親水性面 1 3上のみに培地 1 7が配置され得る。

または図 3 (1 ) に示すように、撥水性表面 2 1及び親水性面 2 3を含む基板 2 5全面を培地 2 7中に浸漬することができる。その後、図 3 (2) に示すように、基板 2 5を培地 2 7中から取り出す。ここで細胞培養用基板 1 5、 2 5上において、撥水性表面 1 1、 2 1では培地 1 7、 2 7がはじかれるため、親水性面 1 3、 2 3に選択的にその境界を明瞭にして培地 1 7、 2 7が配置され得る。或いは、図 4に示すように、培地 3 7をピペット 3 9などで図中矢印方向に基板 3 5の所定パターンの親水性面 3 3に沿って配置することができる。

培地中において細胞を培養する手段としては、特に限定されない。即ち、培養方法、培養条件としては、培養する細胞やパターン形状などに応じて適宜選択することができる。例えば、培地の組成や濃度、培養温度或いは培養時間等を適宜決定すればよい。一般的な哺乳動物細胞、例えば、血管内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、又は胚性幹細胞の場合、室温から哺乳動物の体温（即ち、 20〜4 0 。C、好適には 3 3〜3 8°C) 程度の温度で半日から 4日間程度、又はそれ以上の期間（例えば 7日〜 1 4日程度）培養することによって、所望のパターン形状の細胞培養物を形成することができる。また、培地の pH上昇を防止するために、培養雰囲気中の C0₂濃度をほぼ一定（例えば、 3〜1 0%、特に 5%程度）に保持する CO ₂インキュベーターにおいて培養することが好適である。

以下に説明する実施例によって、本発明を更に詳細に説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。実施例

く実施例 1 >

< 1 >細胞培養用基板の製造

( 1 ) 基材の処理：

下記文献に記載の方法に従い、基材表面を洗浄及ぴ親水化処理した。

「サーフェイス. アンド. インターフェイス. アナラシス（S u r f a c e a d I n t e r f a c e An a l y s i s)」第 34卷、第 1号、第 5 5

0〜554頁、 200 2年。

即ち、まず、サイズが 2. 5 c mX 5 c mのシリカガラス製のペトリディッシを細胞培養用の基材として用意した。この基材（ペトリディッシュ）をそのまま用いてもよいが、本実施例では以下のようにして基材表面に積極的に反応性基を導入した。

即ち、この基材の表面を、エキシマランプ（ゥシォ電気株式会社、型式 UER 20— 1 72V、波長 λ = 1 72で出力 10 mW c m— ²の仕事密度）から生じる真空紫外線光（VUV) によって約 10分間暴露した。本実施例では、ランプから基材までの空気中における距離は約 10mmとした。この VUV照射によつて、雰囲気空気中に存在する酸素分子は光励起して酸素原子及びオゾン分子（以下「活性酸素種」という）を発生させた。一方、基材表面に潜在的に存在し得る不純物としての有機分子は、その炭素一炭素及び炭素一水素結合が解離的に励起するとともに、発生した活性酸素種による酸化によって、分解された。従って、基材表面の有機分子の光化学的脱離によって、光照射された基材表面は洗浄された。以上の処理により、基材（ペトリディッシュ）の表面に後述する有機高分子化合物層を形成するのに好適な水酸基（シラノール基）を導入した。 (2) 撥水層の形成：

有機高分子化合物、ここではフルォロアルキルシラン、具体的には F ₃ C (C F ₂) ₇ (CH₂) ₂S i (OCH₃) 3で示される、ヘプタデカフルオロー 1， 1, 2， 2—テトラヒドローデシルー 1—トリメトキシシラン（信越化学工業株式会社製）を用意した。そして、上記表面処理された基材を真空チャンバ一に入れ、 50°C以下の温度、チャンパ一内の全圧力（即ち A r励起ガスと原料ガス）を 6 5〜95 P aに設定してプラズマ CVDを行った。これにより、基材表面上にメチル基を終端官能基とするポリシロキサン膜が形成された。処理後の基材表面の接触角は 150° 又は 150° を越え得る（>150° ) 。なお、自己組織化プロセスにより上記膜表面の終端化学官能基を制御できる。例えば、上記表面処理された基材を親水化させ（上記文献）、そして上記表面処理された基材を約 0. 02 cm³の容量の上記有機高分子化合物液で満たされたガラスカップとともに 300 cm³容積の T e f 1 o n (登録商標）容器中に配置し、該容器をシールした後、 150°Cに保持した炉中に入れ、そこで 3時間保持した。

この処理によって、基材表面上の末端水酸基とヘプタデカフルオロー 1， 1， 2， 2—テトラヒドロ一デシルー 1—トリメトキシシランのメトキシ基、さらにこのメトキシ基間において脱離反応（脱アルコール反応）が起り、図 5に示すように、基材（ペトリディッシュ） 41の表面にフッ素置換されたアルキル基を側鎖とするポリシロキサン膜が形成された。

図示されるように、この膜の側鎖は一軸方向に延びる単分子層を形成しており、この単分子層が本実施例に係る撥水層に相当する。この撥水層表面において、蒸留水の静的接触角（液滴直径約 2 mm) を液滴法により 25°Cの雰囲気下で接触角計（協和界面科学株式会社製の「CA - X 1 50型」）を用いて測定したところ、水滴接触角は 150° を超えており、極めて高い撥水性（超撥水性）を示した。

なお、上記フルォロアルキルシランに変えて、アルキルトリアルコキシシラン、具体的には H₃C (CH₂) ₁₇S i (OCH₃) 3で示される n—ォクタデシルトリメトキシシラン（東京化成工業株式会社製）を用いることができる。この場合には、基材表面上の末端水酸基と n—ォクタデシルトリメトキシシランのメトキシ基、さらにこのメトキシ基間において脱離反応（脱アルコール反応）が起り、図 6に示すように、基材 41表面に炭素数 1 8の長鎖アルキル基を側鎖とするポリシロキサン膜が形成され得る。図示されるように、この膜の側鎖は一軸方向に延びる単分子層を形成する。この単分子層表面においても極めて高い撥水性（超撥水性）を有する。

(3) 撥水層のパターユング（リソグラフィ処理）：

一般的なフォトリソグラフィ技法によって、撥水層を微細加工した。即ち、図 7に示すような、紫外光遮断部として C uメッシュ部分（ここでは 2つの内径 1 mm、外径 3 mmのドーナッツ形状部分） 51を備えたフォトマスク 5 2を用意した。

次いで、波長 1 72 nmのエキシマランプ光を当該 Cuメッシュフォトマスク 52越しに上記基材 41の表面に照射した。これにより、基材 4 1の表面における C uメッシュ部分 5 1に対応する部分以外の部分は、照射エキシマランプ光の光エネルギーによって撥水層が分解 ·除去された。

この結果、基材 41の表面に図 8に示すような親水性面と撥水性面のパターン、即ちフォトマスク 52の C uメッシュ部分（ドーナッツ形状部分） 5 1に対応したドーナッツパターンの撥水層（撥水性表面） 53が残存するとともに、その部分以外に対応して親水性面 55を形成することができた。

く 2 >線維芽細胞培養物の生産

(1) 培養した細胞

細胞は、 Am e r i c a n Ty e Cu l t u r e C o l l e c t i o n (ATCC) よりマウス線維芽細胞（N I HZ3T 3) を購入して用いた。 (2) 培地

以下の成分により構成された培地を用意した。

·最小必須培地（MEM； M i n i mum E s s e n t i a l Me d i u m) ： 9. 53 g/L

•へぺス緩衝液（HEPE S ； 2— [4一（2—ヒドロキシェチル）一 1ーピペラジニル]エタンスルホンン酸）： 5. 96 g/L

• N a HC0₃ ： 2. 20 g/L .ぺニシリン一ストレプトマイシン（P e n i c i l i n-S t r e p t om y c i n ) ： 1 %

• MEM非必須アミノ酸溶液（MEM No n— E s s n e t i a l Am i n o Ac i d s S o l u t i o n) : 1%

· ゥシ胎仔血清（FB S ; F e t a l b o v i n e s e r um) : 1 0% (3) 培養方法

図 3と同様な手段によって、上記 < 1 >において得られた基材 41 (図 8) を上記成分組成の培地中に完全に浸漬した。その後すぐに、基材 4 1を培地から引き上げ、所定のドーナッツ形状以外の部分に形成された親水性面 55上に培地を選択的に配置した。

次いで、かかる基材 4 1上に所定のパターン（即ちドーナツ形状以外の部分）で配置された培地中に上記購入したマウス線維芽細胞を静かに配置した。尚、培養条件は、 C0₂インキュベーター内において、約 5%の C〇₂分 ffi下、約 3 7 °Cで行った。また、培地が乾燥しないように、適宜ピペットで培地を追加した。培養は、 3日間行った。

< 3 >細胞培養物の観察

位相差顕微鏡（OLYMPUS株式会社製、型式「 1 X 70」）によって、培養 1日目及び 3日目の培養物を観察した。結果を図 9、図 10、図 1 1及ぴ図 1 2に示す。図 9は、培養 1日目の培養物 5 7 (基材上のドーナッッ形状撥水層 5 9周辺の一部）の顕微鏡写真を示す。図 1 0は、その培養 3日目の培養物 57の顕微鏡写真を示す。図 1 1は、そのドーナッツ形状撥水層 59の中心円部（培養物 57) 周辺の顕微鏡写真を示す。図 1 2は、 2個のドーナッツ形状撥水層 59 が隣接する周辺の培養物 5 7の顕微鏡写真を示す。

図 9に示すように、培養 1日目から細胞の増殖はドーナッツ形状撥水層 59以外の部分でのみ認められ、図 10、図 1 1及ぴ図 1 2に示すように、培養 3日目では、ドーナッツ形状撥水層 59以外の部分で明瞭な境界をもって細胞培養物 5 7が生産されていることが判る。

<実施例 2 > < 1 >血管内皮細胞培養物の生産

基材 41上における「親水性面から成るパターン」を、上記実施例 1の「ドーナッツ形状を除く部分」から、図 1 3に示すような直径約 3 mmの複数の「ドットから成るパターン」とし、該ドットパターン 61に細胞を培養した。また、細胞としては、クラボウ（株）より購入した正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HU VEC) を用いた。培地としては、正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞増殖用低血清液体培地である「HuMe d i a - EG 2」をクラボウ（株）より購入して用いた。これら以外の条件は、上記実施例 1と同様とし、細胞培養物を生産した。く 2 >細胞培養物の観察

前述したものと同様な位相差顕微鏡によって、細胞培養 3日目の培養物を観察した。結果を図 14に示す。図 14から明らかなように、直径約 3 mmの複数のドットパターンにおいて細胞が明瞭な境界をもって増殖し、該パターンに対応した細胞培養物を生産し得ることが判る。 <好適な幾つかの実施形態 >

上記実施例 1及び実施例 2以外の本発明の具体的な実施形態のいくつかを以下に説明する。

例えば上記実施例 1と同様にして、図 15に示すような格子状パターン、或いは図 16に示すような複数の同心円状パターン、或いは図 17に示すようなチェッカーボードデザイン状パターン、或いは図 1 8に示すようなチェッカーボードデザイン状パターン部分に親水性面を形成し、該パターン部分 63、 65、 66 に線維芽細胞を培養することができる。或いは同様に、上皮細胞、肝細胞、骨芽細胞等を培養することもできる。

特に限定しないが、上皮細胞としては、例えば角膜上皮細胞、口腔粘膜細胞、羊膜上皮細胞、角化細胞、及び網膜色素細胞などを用いることができる。肝細胞としては、例えば肝実質細胞、内皮細胞、星細胞、及ぴクッパー細胞などを用いることができる。骨芽細胞としては、例えば間葉系幹細胞などの幹細胞から分化した細胞などを用いることができる。また、これら細胞の培養に用いることができる培地としては、例えば D— MEM、 MEM、 RPMI 1640、 Me d i u m l 9 9、 F— 1 0、及ぴ F— 1 2などを用いることができる。

これら図 1 5〜図 1 8に示すような「親水性面から成るパターン」は、特に種々の性状の異なる細胞培養物を 1つの基板上で生産する場合に有用である。また、所定の生理活性物質のスクリーニングゃ該物質と細胞との相互作用の解析に有用である。

好ましくはリソグラフィの採用によつて撥水層に包囲された状態の微細パタ一ンの親水性面を基板上に形成し得、さらに該パターンに沿って微細で緻密な細胞培養領域を形成し得る。このため、種々の形態で数多くの細胞培養物を 1つの基板上で生産することができる。

例えば、図 1 7においてチェッカーボードデザイン状パターン部分 6 6をそれぞれ（1 )、（2 )、 ( 3 ) 及び（4 ) の部分に分け、所望する 4種の相互に異なる種類（例えば種々の肝細胞）の細胞培養物を 1つの基板から同時に得ることができる。或いは、図 1 8に示すように、チェッカーボードデザイン状パターン部分 6 6を（A) 及び（B ) の部分に分け、それぞれ異なる 2種の骨芽細胞を 1つの基板で同時に培養することができる。

或いは、これら図示されるような規則的パターンの形成された基板を使用すると共に、異なる種類の核酸（D N A等）やタンパク質等のサンプルを所定のパタ —ンに配置しておき、更にそこで供試細胞を培養することによって各サンプルと細胞の相互作用を解析することができる。或いは、例えば抗菌性等の機能に関してスクリーニングに用いることもできる。

また、ここで開示される技術は、胚性幹細胞（E S細胞）をプロック状に生産する方法を提供する。

例えば、上記実施例 1と同様にして、図 1 9に示すような直径約 l mmの複数のドット状パターンに親水性面 7 1を形成する。そして、該パターン部分に胚性幹細胞を接種し、培養する。この場合において、培地 7 3は、図 2 0に示すように、親水性面 7 1上において撥水層 7 5とは強く反発する。このことによって、立体的に略球状の液滴を形成することができる。このため、この培地形状に対応して立体的な形状（例えば、直径が約 l〜5 mmの略球状）に胚性幹細胞の集合物を培養することができる。尚、胚性幹細胞としては、マウス胚性幹細胞、力二クィザル胚性幹細胞、及ぴヒト胚性幹細胞などを用いることができる。そのための培地としては、 D—MEM、 MEM、 RPMI 1640、 Me d i uml 99、 F— 10、及ぴ F— 12などを用いることができる。

また、ここで開示される技術は、複雑な形状の細胞培養物、例えば枝分かれ状パターンの組織（器官）の生産に好適である。

例えば、上記実施例 2と同様にして、図 1 (3) に示すような枝分かれ状パタ一ンに親水性面 5を形成し、当該枝分かれ状パターン部分に血管内皮細胞を培養することができる。このような枝分かれ状パターンの血管内皮細胞培養物を 2つ生産し、それらを張り合わせるようにして配置する。かかる張り合わせ物を更に培養することによって、血管内皮細胞群が内面に空洞を形成しつつ互いに結合する機能により、図 21に示すように、チューブ状の血管内皮細胞培養物（即ち血管） 67を得ることができる。

或いは、図 22に示すように、リソグラフィ技法によって基材 83の撥水層 8 2に断面 U字状の親水性面から成る溝 81を所定パターンで形成する。この溝 8 1に所定の血管内皮細胞を接種し培養することによって、チューブを長軸方向に 2つに分断した形状の長いひも状の血管内皮細胞培養物を生産することができる。例えば、溝 81における断面略半円形の半径を約 50 //mとし、図 23に示すように、この溝 81に上記血管内皮細胞（HUVEC) 87を複数個（図では模式的に 3個示してある）配置して極微細な断面半円形に細胞を培養することができる。このようにして立体的な断面 U字状パターンであって一部が分岐（枝分かれ）した形状の血管内皮細胞培養物を生産することができる。これらを更に培養すると、内部に空洞ができるようにして細胞同士が互いに結合する血管内皮細胞 87特有の性質によって、図 24に示すようなチューブ状の血管内皮細胞培養物 88を得ることができる。なお、上述のように、断面略半円形状の細胞培養物を 2つ接合させてチューブ状の当該培養物を形成してもよい。

このようなチューブ状の血管内皮細胞培養物 87は、上述のような溝状（断面 U字状）の親水性面を設ける代わりに平面的な線状の親水性面を設けても形成することができる。即ち、図 25に示すように、基材 83 A上に単分子層から成る超撥水層 82 A (好ましくは水滴接触角 150° 以上）を形成し、次いで、その 6989

23

一部に線状の親水性面 8 1 Aを所定のパターンで形成する。例えば線状親水性面 8 1 Aの幅を約 5 0 mとする。この場合、当該親水性面 8 1 Aのみに配置され得る培地は、典型的には当該親水性面 8 1 Aの線に沿って液滴状に盛り上がっており（例えば図 4参照）、その液滴中で血管內皮細胞 8 7 Aの立体的培養が可能となる。そして、当該親水性面 8 1 Aの線に沿って配置された液滴中で培養された血管内皮細胞 8 7 A同士が内部に空洞ができるようにして互いに結合し、図 2 6に示すようなチューブ状の血管内皮細胞培養物 8 8 Aを得ることができる。あるいは、図 2 2に示すような断面 U字状の親水性面から成る溝を所定パターンで形成した基板 9 5を 2枚張り合わせ、図 2 7に示すような基板 9 1を作製してもよい。このような立体的形状の基板を用いることによって、チューブ形状の血管内皮細胞培養物 9 8 (図 2 8参照）を容易に形成することができる。すなわち、かかる張り合わせ基板 9 1では、微細な溝が対向して成る微細な貫通孔 9 3 の表面部分にのみ親水性面が形成される。従って、該貫通孔 9 3の表面（即ち貫通孔 9 3の内部）において選択的に血管内皮細胞を培養することができる。尚、培地は貫通孔 9 3内に充填させておき、必要に応じて適宜追加するとよい。かかる貫通孔 9 3においては、その内壁面 9 7に血管内皮細胞を接種すると、血管内皮細胞特有の互いに内面を空洞として結合する機能により、チューブ形状を形成するように増殖し、図 2 8に模式的に示すようなチューブ状の血管内皮細胞培養物（即ち血管組織） 9 8を得ることができる。

このような実施形態によると、チューブ状の血管内皮細胞培養物（血管組織）を一体的に立体形成することができる（つまり接合していない）。また、該血管組織は、成形性のよい貫通孔 9 3に沿って形成されているため、その成形性（精度）に特に優れる。

以上の実施形態で説明したように、本発明では、リソグラフィ等の技法を採用して撥水層に包囲された状態で微細な溝状（又は管状）パターンの親水性面を基板上に形成することができる。このため、従来なし得なかった微細な直径の（さらに好ましくは複雑に枝分かれした形状の）血管内皮細胞培養物（即ち血管組織 ) を得ることができる。ぐ実施例 3 >

< 1 >管状細胞培養物生産用基板の製造

(1) 基材の処理と超撥水層の形成：

実施例 1と同様の処理を行い、線状の親水性面を有する基板を作製した。即ち、サイズが 2 c mX 2 c mのシリカガラス製のプレートを細胞培養用の基材として用意した。この基材の表面を、実施例 1で使用したものと同じエキシマランプから生じる真空紫外線光（VUV) によって約 10分間暴露した。本実施例では、ランプから基材までの空気中における距離は約 1 Ommとした。この VUV照射によって、基材の表面に水酸基（シラノール基）を導入した。次いで、実施例 1 と同様の材料を使用し、同様の処理を行うことによって、図 5に示すフッ素置換されたアルキル基を側鎖とするポリシロキサン膜から成る撥水層（単分子層）を基材表面に形成した。この撥水層表面における蒸留水の静的接触角（液滴直径約 2mm) を 25°Cの雰囲気下で上記接触角計を用いて測定したところ、水滴接触角は 1 50° 以上（典型的には 1 50〜 1 60° ) であり、極めて高い撥水性 (超撥水性）を示した。

(2) 線状親水性面の形成：

紫外光透過部として幅約 20 m、長さ約 5 mmの光透過可能なスリットが形成されているフォトマスク (ここでは Cu製）を使用し、波長 172 nmのェキシマランプ光を当該フォトマスク越しに基材の表面に照射した。これにより、上記スリットに対応した幅 20〜 30 μ m、長さ約 5 mmの線状親水性面が基材の表面に形成されたことを特徴とする管状細胞培養物（典型的には毛細血管）生産用基板が得られた。

く 2〉管状血管内皮細胞培養物の生産

上記のようにして得られた本実施例に係る基板を使用して、管状細胞培養物（毛細血管）の生産を行った。細胞は上記 HUVE Cを用いた。培地は HuMe d i a - EG2を用いた。即ち、予め所定のディッシュで継代培養しておいた HU VECをトリプシン処理し、生理食塩水に懸濁して、細胞懸濁液を調製した。直径 10 c mのぺトリディッシュ内に上記管状細胞培養物（典型的には毛細血管）生産用基板を配置し、次いで細胞数が 1 X 10⁶個、総液量が 1 5 mLとなるように上記細胞懸濁液をディッシュ内に添加した。

そして、このペトリディッシュを C0₂インキュベーター内において、約 5% の CO ₂分圧下、約 37°Cで行った。培養は 7日間行った。

く 3 >細胞培養物の観察

位相差顕微鏡（OLYMPUS株式会社製、型式「 1 X 70」）によって、培養 7日目の培養物を観察した。培養物の顕微鏡写真を図 29、図 30及ぴ図 31 に示す。

図 29に示すように（図中のスケールパーは 200 μιηである）、本実施例に係る基板上で培養した接着性細胞（HUVEC) は、超撥水性表面には接着せず、細胞の一部は線状親水性面に選択的に接着した状態で存在していた。更には、細胞相互が結合することにより微細な紐状組織を形成していた。また、図 29に示す紐状培養物の先端部（Α) 及び中央部（Β) のそれぞれ拡大倍率写真である図 30及ぴ図 3 1に示すように、当該紐状組織の中央には空洞が認められた。即ち、管状組織（毛細血管組織）の形成が認められた。

<実施例 4 >

< 1〉管状細胞培養物生産用基板の製造

直径 6 cmのポリスチレン製 I WAK I (商標）ペトリディッシュ（旭テクノグラス社製品）を基材として使用し、実施例 1と同様な処理を行い、基材表面に超撥水層を形成した。次いで、実施例 1と同様な処理を行い、線状の親水性面を有する基板（ディッシュ）を作製した。

< 2 >管状血管内皮細胞培養物の生産

上記のようにして得られた本実施例に係る基板を使用して、管状血管内皮細胞培養物の生産を行った。細胞は上記 HUVECを用いた。培地は HuMe d i a — EG2を用いた。即ち、予め所定のディッシュで継代培養しておいた HUVE Cをトリプシン処理し、生理食塩水に懸濁して、細胞懸濁液を調製した。

次いで細胞数が 4 X 10⁵個、総液量が 6mLとなるように上記細胞懸濁液をディッシュ内に添加した。

そして、このペトリディッシュを C0₂インキュベーター内において、約 5% P T/JP2005/016989

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の CO ₂分圧下、約 37°Cで行った。培養は 7日間行った。

< 3 >細胞培養物の観察

位相差顕微鏡（OLYMPUS株式会社製、型式「 1 X70」）によって、培養 3日目の培養物を観察した。培養物の顕微鏡写真を図 32に示す。

図 32に示すように（図中のスケールバーは 200 μ mである）、本実施例に係る基板上で培養した接着性細胞（HUVEC) は、超撥水性表面には接着せず、細胞の一部は線状親水性面に選択的に接着した状態で存在していた。更には、細胞相互が結合することにより直径がほぼ 50〜100 mの微細な管状組織の形成が認められた。

<実施例 5 >

< 1 >管状細胞培養物生産用基板の製造

直径 6 cmのポリスチレン製 I WAK I (商標）ペトリディッシュ（旭テクノグラス社製品）の表面をゼラチンでコートしたゼラチン ' コーティング基材を使用した。

このゼラチン . コーティング基材の表面に、直径 30 /Z mのワイヤ状マスク（材質は特に制限はない）を配置し、実施例 1と同様な処理を行い、この基材表面に超撥水層を形成した。次いで、マスクを取り除き、線状のゼラチンコーティング部（即ちここでは線状である立体的な親水性面）を有する基板（ディッシュ）を作製した。

< 2 >管状血管内皮細胞培養物の生産

上記のようにして得られた本実施例に係る基板を使用して、管状血管内皮細胞培養物の生産を行った。細胞は上記 HUVECを用いた。培地は HuMe d i a — EG 2を用いた。即ち、予め所定のディッシュで継代培養しておいた HUVE Cをトリプシン処理し、生理食塩水に懸濁して、細胞懸濁液を調製した。

次いで細胞数が 4 X 10⁵個、総液量が 6 mLとなるように上記細胞懸濁液をディッシュ内に添加した。

そして、このペトリディッシュを C0₂インキュベーター内において、約 5% の CO₂分圧下、約 37°Cで行った。培養は 7日間行った。また、比較対照として、上記マスクを使用した超撥水層の形成処理を行わなかったゼラチン .コーティング基材（即ちディッシュの表面全体にゼラチンがコーティングされているもの）を使用して同様の培養を行った。

く 3 >細胞培養物の観察

位相差顕微鏡（OLYMPUS株式会社製、型式「 1 X 70」）によって、培養 3日目の培養物を観察した。本実施例に係る基板を用いて得られた培養物の顕微鏡写真を図 33に示す。また、比較対照の基板を用いて得られた培養物の顕微鏡写真を図 34に示す。

図 33に示すように（図中のスケールパーは 200 μ mである）、本実施例に係る基板上で培養した接着性細胞（HUVEC) は、、超撥水性表面には接着せず、線状のゼラチンをコーティングした親水性表面に集約していた。細胞の一部は線状親水性面に選択的に接着した状態で存在していた。更には、細胞相互が結合することにより直径がほぼ 100〜200 μ mの微細な管状組織の形成が認められた。他方、図 34に示すように（図中のスケールパーは 200 mである）、基板の表面全体が親水性である場合には、図 33に示すような細胞の集約化およぴ管状組織化は認められず、培養細胞は基板表面に不規則に接着して存在していた。以上の各実施例の結果から、本発明によって提供される基材で HUVECその他の血管内皮細胞を培養 ·増殖することによって、所望するサイズ、好ましくは直径 200 m程度又はそれ以下（例えば 20〜 30 μ m) の管状細胞培養物（即ち毛細血管）を容易に生産し得ることが確認された。

また、特に例示はしていないが、本発明で提供される所定のパターンで親水性面（即ちパターン化された細胞培養領域）が形成された細胞培養物生産用基板を用いることによって、血管組織以外の管組織その他の複雑で微細な構造の組織や器官を、基板上における形状化された細胞培養物として得ることができる。

以上、本発明の具体例を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、請求の範囲を限定するものではない。請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . 細胞培養用基板を製造する方法であって：

基材上に撥水性表面を有する撥水層を形成すること；および

前記撥水性表面のうち、所定のパターンに対応する部分を除去し、該部分に所定のパターンの親水性面を形成すること

を包含する方法。

2 . 細胞培養用基板を製造する方法であって：

親水性面を有する基材を用意すること；および

前記基材上に所定のパターンの親水性面を残してその周囲に撥水性表面を有する撥水層を形成すること；

を包含する方法。

3 . 前記所定のパターンに対応する部分の除去はリソグラフィにより行われる、請求の範囲第 1項に記載の方法。

4 . 前記撥水層を単分子層として形成する、請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の方法。

5 . 前記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越えるように前記撥水層を形成する、請求の範囲第 1項〜第 4項のうちのいずれかに記載の方法。

6 . 前記所定のパターンの親水性面を三次元形状パターンに形成する、請求の範囲第 1項〜第 5項のうちのいずれかに記載の方法。

7 . 前記親水性面を幅 1 0 0 x m以下の溝状又は線状パターンに形成する、請求の範囲第 1項〜第 6項のうちのいずれかに記載の方法。

8 . 基材と、前記基材上に形成された撥水性表面を有する撥水層と、前記基材上に形成された所定のパタ一ンの親水性面とを備える、細胞培養用基板。

9 . 前記撥水層は単分子層である、請求の範囲第 8項に記載の基板。

1 0 . 前記撥水性表面の水滴接触角は 1 5 0 ° を越える、請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の基板。

1 1 . 前記親水性面は三次元形状パターンに形成されている、請求の範囲第 8項〜第 1 0項のうちのいずれかに記載の基板。

1 2 . 前記親水性面は幅 1 0 0 μ ΐη以下の溝状又は線状パターンに形成されている、請求の範囲第 8項〜第 1 1項のうちのいずれかに記載の基板。

1 3 . 所望するパターンの細胞培養物を生産する方法であって：

細胞を培養するための基板であって、所定のパターンで形成された親水性面と該パターン以外の部分に形成された撥水性表面とを有する基板を用意すること；前記親水性面上に選択的に培地を配置すること；および

該配置された培地中において目的の細胞を培養すること；

を包含する方法。

1 4 . 前記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越える、請求の範囲第 1 3項に記載の方法。

1 5 . 前記培地を三次元形状パターンで配置し、該パターンに対応する三次元形状に細胞培養物を生産する、請求の範囲第 1 3項又は第 1 4項に記載の方法。

1 6 . 前記親水性面は幅 1 0 0 / m以下の溝状又は線状パターンに形成され、該パターンに対応する管状細胞培養物を生産する、請求の範囲第 1 3項〜第 1 5項のうちのいずれかに記載の方法。

1 7 . 所望するパターンの細胞培養物を生産する方法であって：

細胞を培養するための基板であって、所定のパターンで形成された親水性面と該パターン以外の部分に形成された撥水性表面とを有する基板を用意すること；および

前記親水性面上に選択的に目的の接着性細胞を接着させた状態で、該細胞を培養すること；

を包含する方法。

1 8 . 前記撥水性表面の水滴接触角が 1 5 0 ° を越える、請求の範囲第 1 7項に記載の方法。

1 9 . 前記親水性面は幅 1 0 0 /z m以下の溝状又は線状パターンに形成され、該パターンに対応する管状細胞培養物を生産する、請求の範囲第 1 7項又は第 1 8 項に記載の方法。