WO2020158824A1 - 小腸上皮細胞を含む細胞構造物、その製造のための方法、及び、それを保持する基材 - Google Patents

小腸上皮細胞を含む細胞構造物、その製造のための方法、及び、それを保持する基材 Download PDF

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WO2020158824A1
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cells
adhesion
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culture
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裕一 田中
興治 藤本
奈月 掛川
英憲 阿久津
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大日本印刷株式会社
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography
    • C12N2535/10—Patterned coating

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell structure containing small intestinal epithelial cells and a method for producing a cell structure containing small intestinal epithelial cells.
  • the present disclosure also relates to substrates that retain cell structures that include small intestinal epithelial cells.
  • Pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells) can be induced to differentiate into target cells, and are expected to be applied in the field of regenerative medicine.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • a method of culturing pluripotent stem cells to induce differentiation to obtain a structure called an organoid close to human tissues has been studied.
  • Patent Document 1 describes a method for producing an intestinal epithelial organoid from embryonic stem cells.
  • Non-Patent Document 2 a technique for inducing cells other than epithelium from an organoid by administering TNF- ⁇ into a medium has been established.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 3 describe a method for inducing differentiation of intestinal tissue by culturing pluripotent stem cells on a substrate on which a pattern of cell adhesion parts is formed.
  • the intestine is a complex organ containing cells derived from the three germ layers (endoderm, ectoderm, mesoderm).
  • the intestines are endoderm-derived small intestinal epithelial cells (enterocytes, goblet cells, endocrine cells, brush cells, Paneth cells, M cells, etc.), mesoderm-derived lymphoid tissues, smooth muscle cells, Cajal intermediary cells, ectoderm
  • the intestinal plexus and the like derived from are complexly combined to exert functions such as secretion, absorption, and peristalsis.
  • the tissue obtained by the method described in Patent Document 1 contains only intestinal epithelial cells. Moreover, since activin is used for inducing differentiation from embryonic stem cells, only single germ layer-derived cells, here endoderm-derived cells, are formed. Therefore, in order to obtain intestinal tissue containing other cell types derived from mesoderm and ectoderm, it is necessary to induce differentiation of the other cell types separately as in Non-Patent Document 1. Further, the method described in Patent Document 1 includes a step of culturing by embedding in Matrigel for inducing epithelial differentiation, and there is a problem in productivity from this point as well.
  • Non-Patent Document 2 labor for culturing has been a problem. Since the tissue obtained by the method described in Patent Document 2 also contains only small intestinal epithelial cells, it has the same problem as the method described in Patent Document 1.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 3 are still improved for application to industrial production where uniformity is required, in that the culture period is long and the yield of intestinal tissue is low. There was room for
  • a cell culture substrate having a surface including a cell culture portion The cell culturing section includes a cell non-adhesive section and a cell adhesion section that extends continuously or intermittently along the periphery of the cell non-adhesion section and surrounds the cell non-adhesion section.
  • a method for producing a cell structure containing small intestinal epithelial cells comprising seeding stem cells on a cell culture substrate, and culturing the seeded stem cells to differentiate a part of the stem cells into small intestinal epithelial cells ..
  • the ratio X′/W′ of the distance X′ to the width W′ of the cell adhesion portion in the direction along the straight line passing through the cell non-adhesion portion is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0. Or more, more preferably 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.0 or less, more preferably 10.0 or less, according to any one of (1) to (3) Method.
  • the ratio X/W to the width W in the along direction is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more, more preferably 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.
  • a cell culture substrate comprising a support substrate having a surface including one or more cell culture parts arranged in the first cell non-adhesive part,
  • Each of the one or more cell culture parts has a central part, which is a second cell non-adhesive part, and a cell adhesion part that continuously or intermittently extends along the periphery of the central part and surrounds the central part.
  • the ratio X'/W' of X'to the width W'of the cell adhesion portion in the direction along the straight line passing through the central portion is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more, and more preferably Is 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.0 or less, more preferably 10.0 or less, (8) to (10).
  • the ratio X/W is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more, more preferably 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.0 or less, more preferably The method according to (8), (12) or (13), which is 10.0 or less.
  • a cell structure containing small intestinal epithelial cells When the expression level of the ABCG2 transporter and the expression level of the ABCB1 transporter of the cell structure are expressed as relative values with respect to the expression level of the ABCG2 transporter and the expression level of the ABCB1 transporter in the small intestinal tissue of the source animal, respectively.
  • a cell structure comprising small intestinal epithelial cells, wherein the relative value of the expression level of ABCG2 transporter in the cell structure is 90 times or more the relative value of the expression level of ABCB1 transporter.
  • a cell structure containing small intestinal epithelial cells When the expression level of CUBN and the expression level of Villin of the cell structure are expressed as a relative value with respect to the expression level of CUBN and the expression level of Villin in the small intestinal tissue of the source animal, respectively, A cell structure containing small intestinal epithelial cells, wherein the relative value of the expression level is in the range of 0.2 to 1.8 with respect to the relative value of the expression level of Villin.
  • each of the expression levels is an expression level based on the amount of mRNA.
  • a cell structure-supporting substrate comprising a cell culture substrate and a cell structure containing small intestinal epithelial cells adhered onto the cell culture part.
  • the cell structure contains an endoderm cell, an ectodermal cell, and a mesoderm cell.
  • (23) Between two intersections of a straight line passing through an intermediate point between two farthest points facing each other through the cell non-adhesive portion on the inner periphery of the cell adhesive portion and the inner periphery of the cell adhesive portion
  • the width of the cell adhesion part in the direction along a straight line passing through the midpoint between the two farthest points facing each other via the cell non-adhesion part on the inner circumference of the cell adhesion part is more than 30 ⁇ m.
  • the ratio X′/W′ of the distance X′ to the width W′ of the cell adhesion portion in the direction along the straight line passing through the cell non-adhesion portion is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0. Or more, more preferably 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.0 or less, more preferably 10.0 or less, according to any one of (19) to (24) Cell structure holding substrate.
  • a cell structure containing small intestinal epithelial cells can be produced in a high yield in a relatively short culture period.
  • the cell structure of the present disclosure can be used as an intestinal organoid for the development of a drug for preventing or treating an intestinal related disease or a pathological study of an intestinal related disease.
  • the cell structure-holding substrate of the present disclosure is easy to handle when the cell structure containing small intestinal epithelial cells is used for the development of a drug for preventing or treating an intestinal-related disease or a pathological study of an intestinal-related disease. Is.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an embodiment of the cell culture substrate having a plurality of annular cell adhesion portions used in Examples 1 and 8 in which the cell adhesion portion is an exposed surface of a support substrate. ..
  • FIG. 1(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 1(B) is a schematic sectional view taken along the line AA in FIG. 1(A).
  • FIG. 2 shows the cultures of Example 1 at the 1st, 6th, 11th, and 18th days of culture when the cells were cultured using the cell culture substrates having the annular cell adhesion parts having different inner diameters. The observation image of is shown.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an embodiment of the cell culture substrate having a plurality of annular cell adhesion portions used in Examples 1 and 8 in which the cell adhesion portion is an exposed surface of a support substrate. ..
  • FIG. 1(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 1(B) is a schematic section
  • FIG. 3 shows an observation image of the culture for 3 weeks when the culture was performed using the cell culture substrates having the ring-shaped cell adhesion portions having different inner diameters in Example 1.
  • FIG. 4 shows an observation image of a tissue having a bag-like structure that is formed and peeled off on a substrate having an inner diameter of 380 ⁇ m and a ring-shaped cell adhesion portion (the left is a photograph of the entire dish, the right is an observation image of the tissue).
  • FIG. 5 shows microscopic observation images of the cultures of Comparative Examples 1, 2, and 3 on the respective substrates for 3 weeks after the start of the culture.
  • FIG. 6 shows observed images of cells around one ring-shaped cell adhesion portion at each time point on the 4th, 9th, 13th, and 20th day of culture in Example 2.
  • FIG. 7 is images of the cultures of the cultures using cell culture substrates having different inner diameters obtained in Example 3, which were observed on the first and seventh days of culture, and the cell culture medium having a ring-shaped cell adhesion portion with an inner diameter of 280 ⁇ m.
  • cultivation using a material is shown.
  • FIG. 8 shows an observation image on day 4 of culture of the immunostained culture in Example 4.
  • FIG. 9 shows an observation image on day 7 of culture of the immunostained culture in Example 4.
  • FIG. 10 shows anti-CDX2 antibody, anti-Villin antibody and DAPI of the tissue formed by culturing stem cells on a cell culture substrate having an annular cell adhesion portion having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m in Example 5. The results of staining are shown.
  • FIG. 11 is an anti-smooth muscle actin (Smooth Muscle Actin) antibody, anti-PGP9. 5 shows the results of staining with 5 antibody and DAPI.
  • FIG. 12 is an observation image on day 18 of culture on a cell culture substrate having annular cell adhesion parts of various sizes in Example 6.
  • FIG. 13 shows the evaluation results of culturing on a cell culture substrate having a ring-shaped cell adhesion portion of each size in Example 6.
  • FIG. 14 shows an observation image of a tissue having a bag-like structure obtained by culturing on a cell culture substrate having an inner diameter of 580 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m and a ring-shaped cell adhesion portion in Example 6.
  • FIG. 15A shows a cell adhesion part used in Example 7, which is a square having an inside dimension of 280 ⁇ m to 300 ⁇ m on each side and a width of 50 ⁇ m to 60 ⁇ m.
  • FIG. 15B shows a cell adhesion part used in Example 7, which has an annular shape with an inner diameter of 280 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m, and lacks 1/8 in the circumferential direction.
  • FIG. 15C shows a cell-adhesive part used in Example 7, which is a rectangle having an inner dimension of 600 ⁇ m on the long side and 300 ⁇ m on the short side and a width of 50 ⁇ m.
  • FIG. 15D shows a cell adhesion part used in Example 7, which is a square having an inner size of 600 ⁇ m on each side and a width of 50 ⁇ m.
  • FIG. 16A shows an observation image of a culture obtained by culturing stem cells using a cell culture substrate having a cell adhesion part having the shape shown in FIG.
  • FIG. 16B shows an observation image of a culture obtained by culturing stem cells using a cell culture substrate having a cell adhesion part having the shape shown in FIG. 15B.
  • FIG. 16C shows an observation image of a culture obtained by culturing stem cells using a cell culture substrate having a cell adhesion part having the shape shown in FIG. 15C.
  • FIG. 16D shows an observation image of a culture obtained by culturing stem cells using a cell culture substrate having a cell adhesion part having the shape shown in FIG. 15D.
  • FIG. 16B shows an observation image of a culture obtained by culturing stem cells using a cell culture substrate having a cell adhesion part having the shape shown in FIG. 15B.
  • FIG. 17 shows the culture days 1, 7, and 11 of Example 8 in which the stem cells were cultured on a cell culture substrate having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m of a ring-shaped cell adhesion portion. An observed image is shown.
  • FIG. 18 is an observation image of a tissue having a bag-like structure obtained in Example 8 by culturing stem cells for 3 weeks on a cell culture substrate provided with an annular cell adhesion portion having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m. Show.
  • FIG. 19 shows the average value of the ABCG2/ABCB1 ratio in the cell structure obtained on the cell culture substrate under each condition obtained in Example 9.
  • FIG. 20 shows the average value of the CUBN/Villin ratio in the cell structure obtained on the cell culture substrate under each condition obtained in Example 9.
  • FIG. 21 is an observation image of immunostaining of cells adhered to a cell adhesion part in Example 10, when Edom iPS stem cells were cultured on a cell culture substrate having a circular cell adhesion part with a diameter of 1500 ⁇ m. ..
  • FIG. 22 is a dish for cell culture having a diameter of 3.5 cm (culture dish), a glass substrate without a pattern (both sizes of 1.5 cm ⁇ 2.5 cm) (plain glass), and a circle having a diameter of 1500 ⁇ m in Example 10.
  • FIG. 7 is an observation image of immunostaining of cells adhered on a substrate when Edom iPS stem cells were cultured on each cell culture substrate of the substrate (pattern substrate) having the cell adhesion part of FIG.
  • FIG. 23 shows an observation image of the tissue on the 7th day of culture, when Edom iPS cells were cultured on a substrate having a circular cell adhesion portion with a diameter of 1500 ⁇ m.
  • FIG. 24 shows that the expression level of Oct3/4 in each sample of the agglutination part and the non-aggregation part in Example 11 was determined as a correction value corrected by the expression level of GAPDH, and Oct3/ 4 shows the relative value of the expression level of Oct3/4 in the sample of the agglutination part, where the expression level of 4 is 1.
  • FIG. 25 shows the results of immunostaining in Example 12.
  • FIG. 26 is a schematic diagram of an embodiment of a cell culture substrate having a plurality of annular cell adhesion parts, in which the cell adhesion part is the surface of the cell adhesion layer.
  • FIG. 26(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 26(B) is a schematic sectional view taken along the line AA in FIG. 26(A).
  • FIG. 27 shows that in Example 4, when Edom iPS cells were cultured on a cell culture substrate having an inner diameter of 600 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m of a ring-shaped cell adhesion part, nerve cells and muscle cells of the culture on the 9th day of culture were cultured.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of immunostaining of.
  • the scale bar shows 100 ⁇ m.
  • FIG. 28 shows that in Example 4, when Edom iPS cells were cultured on a cell culture substrate having an inner diameter of 600 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m of a ring-shaped cell adhesion part, nerve cells and intestinal epithelium of the culture on the 9th day of culture were cultured. It is a photograph showing a result of immunostaining of endoderm cells.
  • the scale bar shows 100 ⁇ m.
  • FIG. 29 shows the results of the examination using the agglutination portion after one week of culture in Example 13.
  • the scale bar shows 40 ⁇ m.
  • FIG. 30 shows the results of examination using the agglutinating portion after two weeks of culture in Example 13.
  • FIG. 31 shows the observation results on day 4 of culture after medium replacement in Example 14.
  • FIG. 32 shows the observation results on the 10th day of culture after the medium replacement in Example 14.
  • FIG. 33 shows the above-mentioned cells of a cell structure-holding substrate including a cell culture substrate having a cell non-adhesive portion (central portion) and an annular cell adhesive portion surrounding it, and a cell structure containing small intestinal epithelial cells. It is a schematic diagram of embodiment in which a structure exists in the position which overlaps with a cell adhesion part.
  • FIG. 33(A) is a plan view of the cell structure-holding base material taken along the direction normal to the surface S, and FIG.
  • FIG. 33(B) is a cross section taken along line AA in FIG. 33(A). It is a schematic diagram.
  • FIG. 34 is a diagram illustrating a cell structure-holding base material including a cell culture base material having a cell non-adhesive portion (central portion) and an annular cell adhesion portion surrounding the cell culture portion, and a cell structure containing small intestinal epithelial cells, It is a schematic diagram of embodiment in which a structure exists in the position which overlaps with a cell adhesion part and the said cell non-adhesion part (central part).
  • FIG. 34(A) is a plan view of the cell structure-holding substrate taken along the direction of the normal to the surface S, and FIG.
  • FIG. 34(B) is a cross-section taken along the line AA in FIG. 34(A). It is a schematic diagram.
  • FIG. 35 is a schematic view of an embodiment of a cell culture substrate including a cell culture part including a cell non-adhesive part (central part) and a cell adhesion part surrounding the periphery on each of the upper surfaces of a plurality of protruding parts. is there.
  • FIG. 35(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 35(B) is a schematic sectional view taken along the line AA in FIG. 35(A).
  • FIG. 36 is a schematic diagram of an embodiment of a cell culture substrate including a cell culture portion including a cell non-adhesive portion (central portion) and a cell adhesive portion surrounding the cell non-adhesive portion (central portion) on each of the bottom surfaces of the plurality of depressions. is there.
  • FIG. 36(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 36(B) is a schematic sectional view taken along the line AA in FIG. 36(A).
  • FIG. 37 is a schematic view of an embodiment of a cell culture substrate in which a cell culture portion including a cell non-adhesive portion (center portion) and a cell adhesive portion surrounding the cell occupies the entire one surface.
  • FIG. 37(A) is a plan view of the cell culture substrate
  • FIG. 37(B) is a schematic sectional view taken along the line AA in FIG. 37(A).
  • the stem cells used in the present disclosure may be stem cells capable of differentiating into small intestinal epithelial cells, but preferably differentiate into endoderm cells (such as small intestinal epithelial cells), ectodermal cells and mesoderm cells. Stem cells having the ability, and more preferably pluripotent stem cells. As pluripotent stem cells, embryonic stem cells (ES cells) or induced pluripotent stem cells (iPS cells) are particularly suitable.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the embryonic stem cells (ES cells) used in the present disclosure are preferably mammalian ES cells, and for example, ES cells derived from rodents such as mice or primates such as humans can be used. it can. Particularly preferably, ES cells of mouse or human origin are used.
  • ES cell refers to a stem cell line made from an inner cell mass belonging to a part of an embryo at the blastocyst stage, which is the early stage of development of an animal, and is pluripotent that theoretically differentiates into all tissues in vitro. It can be propagated almost infinitely while maintaining.
  • the ES cells for example, cells in which a reporter gene has been introduced near the Pdx1 gene can be used in order to facilitate confirmation of the degree of differentiation.
  • a 129/Sv-derived ES cell line in which the LacZ gene is integrated at the Pdx1 locus or an ES cell SK7 line having a GFP reporter transgene under the control of the Pdx1 promoter can be used.
  • the ES cell PH3 strain having the mRFP1 reporter transgene under the control of the Hnf3 ⁇ endoderm-specific enhancer fragment and the GFP reporter transgene under the control of the Pdx1 promoter can also be used.
  • the ES cell lines SEES1, SEES2, SEES3, and SEES4 established in the Reproductive and Cell Medicine Research Department of the National Center for Child Health and Development and disclosed in Akutsu H, et al. Regen Ther. 2015;1:18-29 .
  • SEES5, SEES6 or SEES7 and cell lines obtained by introducing a further gene into these ES cell lines can also be used.
  • the induced pluripotent stem cells (iPS cells) used in the present disclosure are pluripotent cells obtained by reprogramming somatic cells.
  • the production of induced pluripotent stem cells was carried out by a group of Professor Shinya Yamanaka of Kyoto University, a group of Rudolf Jaenisch of Massachusetts Institute of Technology, a group of James Thomson of University of Wisconsin, and a group of Harvard University.
  • Several groups have been successful, including the group of Konrad Hochedlinger and others.
  • International Publication WO2007/069666 discloses a somatic cell nuclear reprogramming factor containing gene products of Oct family gene, Klf family gene and Myc family gene, and Oct family gene, Klf family gene, Sox family gene and Myc.
  • a somatic cell nuclear reprogramming factor containing a gene product of a family gene has been described, which further comprises a step of contacting the somatic cell with the above nuclear reprogramming factor to produce induced pluripotent stem cells by somatic cell nuclear reprogramming. How to do is described.
  • somatic cells used for producing iPS cells is not particularly limited, and any somatic cells can be used. That is, the somatic cell referred to in the present disclosure includes all cells other than endogerm cells constituting the living body, and may be a differentiated somatic cell or an undifferentiated stem cell.
  • the origin of somatic cells is not particularly limited and may be any of mammals, birds, fish, reptiles and amphibians, but is preferably mammals (for example, rodents such as mice, or primates such as humans), and particularly Preferred is mouse or human. When human somatic cells are used, any somatic cells of fetus, neonate or adult may be used.
  • somatic cells include, for example, fibroblasts (eg, skin fibroblasts), epithelial cells (eg, gastric epithelial cells, hepatic epithelial cells, alveolar epithelial cells), endothelial cells (eg blood vessels, lymphatic vessels).
  • fibroblasts eg, skin fibroblasts
  • epithelial cells eg, gastric epithelial cells, hepatic epithelial cells, alveolar epithelial cells
  • endothelial cells eg blood vessels, lymphatic vessels.
  • Nerve cells eg, neurons, glial cells
  • pancreatic cells blood cells, bone marrow cells, muscle cells (eg, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes), hepatocytes, non-hepatoparocytes, adipocytes
  • muscle cells eg, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes
  • hepatocytes non-hepatoparocytes
  • adipocytes examples thereof include osteoblasts, cells constituting periodontal tissue (eg periodontal ligament cells, cement blasts, gingival fibroblasts, osteoblasts), cells constituting kidneys, eyes and ears.
  • the iPS cells have a long-term self-renewal ability under predetermined culture conditions (for example, conditions for culturing ES cells), and under the predetermined differentiation-inducing conditions, multi-differentiation into ectoderm, mesoderm, and endoderm. It refers to stem cells that have the ability. Further, the iPS cells in the present disclosure may be stem cells having the ability to form teratoma when transplanted to a test animal such as a mouse.
  • the reprogramming gene is a gene encoding a reprogramming factor having a function of reprogramming somatic cells into iPS cells.
  • the following combinations can be mentioned as specific examples of the combination of reprogramming genes, but they are not limited to these.
  • (I) Oct gene, Klf gene, Sox gene, Myc gene ii) Oct gene, Sox gene, NANOG gene, LIN28 gene
  • iv Oct gene, Klf gene, Sox gene
  • the cell culture substrate used in the present disclosure has a surface including a cell culture part.
  • the cell culture section includes a cell non-adhesion section and a cell adhesion section that extends continuously or intermittently along the periphery of the cell non-adhesion section and surrounds the cell non-adhesion section.
  • One or more cell culture parts are included on the surface of the cell culture substrate. When two or more cell culture sections are included, each may have the above characteristics.
  • the “second cell non-adhesive portion” is used. It may be referred to as an "adhesive portion” or a "central portion”.
  • the cell culture substrate used in the present disclosure is one in which a cell non-adhesive portion and a cell adhesive portion are formed in a predetermined shape on the surface thereof.
  • the portion may be referred to as a "supporting substrate”. That is, it can be said that the cell culture substrate used in one or more embodiments of the present disclosure includes a supporting substrate having a surface including the one or more cell adhesion portions.
  • the support substrate used for the cell culture substrate is not particularly limited as long as it is a support substrate formed of a material capable of forming a cell non-adhesive portion and a cell adhesive portion on its surface. .. Specifically, glass, metals, ceramics, inorganic materials such as silicon, elastomers, plastics (for example, polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyurethane) Resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin) can be mentioned as a supporting base material containing an organic material. In particular, it is preferable to use a glass substrate as the supporting substrate.
  • the shape of the support substrate is not limited, and examples thereof include flat shapes such as flat plates, flat membranes, films, and porous membranes, and three-dimensional shapes such as cylinders, stamps, multiwell plates, and microchannels.
  • cell adhesiveness means the strength of cell adhesion, that is, the ease of cell adhesion.
  • the "cell adhesion part” means a region on the surface with good cell adhesion, and the “cell non-adhesion part” means a region on the surface with poor cell adhesion. Therefore, when cells are seeded on the surface where the cell adhesion part and the cell non-adhesion part are arranged in a predetermined pattern, the cells adhere to the cell adhesion part, but the cells do not adhere to the cell non-adhesion part.
  • the cells are arranged in a pattern on the surface of the cell culture substrate.
  • the "cell adhesion part” is defined as a part to be adhered when a cell to be actually cultured, preferably a stem cell, is seeded on a cell culture substrate
  • a “cell non-adhesion part” is a cell to be actually cultured, preferably a cell Stem cells are defined as the parts that do not adhere when seeded.
  • the surface of the cell culture substrate may be in a state of being coated with a protein or the like to enhance the cell adhesiveness.
  • stem cells are as described herein.
  • the cell non-adhesive portion may be covered with cells that have adhered to the cell adhesive portion and proliferated.
  • the cell adhesion extension rate in actual cell culture can be used.
  • the surface of the cell adhesion portion having cell adhesion properties is preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 60% or more, and more preferably a surface having a cell adhesion extension rate of 80% or more.
  • the cell adhesion spreading rate in the present disclosure is obtained by inoculating cells to be cultivated at a seeding density in the range of 4000 cells/cm 2 or more and less than 30,000 cells/cm 2 on the surface to be measured, at 37° C., and CO 2 concentration of 5%. It is defined as the proportion of cells that have been adhered and expanded at the time of storage for 14.5 hours in an incubator ( ⁇ (number of adhered cells)/(number of seeded cells) ⁇ 100(%)).
  • the cells were seeded by suspending them in DMEM medium containing 10% FBS and seeding them on the surface to be measured, and then slowly injecting the surface on which the cells were seeded so that the cells were distributed as evenly as possible. This is done by shaking. Further, the cell adhesion extension rate is measured after the medium is exchanged immediately before the measurement to remove the non-adherent cells.
  • measure the points excluding the areas where the cell density tends to be specific for example, the center of the prescribed area where the cell density tends to increase, the periphery of the prescribed area where the cell density tends to decrease). The place.
  • the cell adhesion part may be a region in which a cell adhesion layer is formed on the surface of the supporting base material, or when the surface of the supporting base material is cell adhesive (for example, the surface of a glass base material),
  • the surface of the material may be an exposed area, but is preferably an area where the cell-adhesive surface of the supporting substrate is exposed.
  • the cell non-adhesive portion can be an area where the cell non-adhesive layer is formed on the surface of the supporting substrate.
  • the cell adhesion part and the cell non-adhesion part can be formed by various materials and methods.
  • the cell non-adhesive portion is a portion in which the surface of the supporting substrate is covered with a cell non-adhesive layer such as a layer containing a hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer.
  • a cell non-adhesive layer such as a layer containing a hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer.
  • the average thickness of the cell non-adhesive layer constituting the cell non-adhesive part is preferably 0.8 nm to 500 ⁇ m, more preferably 0.8 nm to 100 ⁇ m, and further preferably 1 nm to 10 ⁇ m. The range of 1.5 nm to 1 ⁇ m is most preferable.
  • the average thickness is 0.8 nm or more, it is preferable that the region not covered with the cell non-adhesive layer of the support substrate is less affected by protein adsorption and cell adhesion. Further, if the average thickness is 500 ⁇ m or less, coating is relatively easy. Particularly, as described in Patent Document 5, when the cell non-adhesion layer is formed of a polyethylene glycol layer, an example of the film thickness is 5 nm to 10 nm. Specific examples of the hydrophilic organic compound are as described below.
  • Patent Document 4 As a method for producing a cell culture substrate containing polyethylene glycol (PEG) as a hydrophilic polymer as a cell non-adhesive layer, the methods described in Patent Document 4 and Non-Patent Document 10 can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the following two forms are particularly preferable forms of the method for forming the cell adhesion part and the cell non-adhesion part.
  • a cell non-adhesive layer is formed on the surface of a supporting substrate, and then a part of the cell non-adhesive layer is subjected to a predetermined treatment to develop cell adhesiveness to form a cell adhesive portion.
  • a cell-nonadhesive hydrophilic membrane containing a hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer is formed as a cell-nonadhesive layer on the surface of a supporting substrate, and then the hydrophilic layer which is a cell-nonadhesive layer is formed.
  • the permeable membrane is selectively subjected to an oxidation treatment and/or a decomposition treatment to modify the part into a cell adhesion part having cell adhesion property.
  • a cell-non-adhesive hydrophilic film is formed, and then the site where cell adhesion is desired is subjected to an oxidation treatment and/or a decomposition treatment to form a cell-adhesive site.
  • the cell non-adhesive portion is a portion in which the surface of the supporting substrate is covered with a layer containing a hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer.
  • the layer containing the hydrophilic organic compound such as the hydrophilic polymer is removed by the oxidation treatment and/or the decomposition treatment and the surface of the supporting substrate is exposed, or the layer containing the hydrophilic organic compound such as the hydrophilic polymer.
  • cell adhesion layer modified to have cell adhesion properties by being subjected to oxidation treatment and/or decomposition treatment.
  • the second form is a form in which a cell adhesion part and a cell non-adhesion part are formed depending on the density of the organic compound on the surface of the supporting base material.
  • the cell adhesion portion is a surface having a low density of hydrophilic organic compounds such as hydrophilic polymers (including the case where hydrophilic organic compounds are not included)
  • the non-adhesive part is a form in which the surface of the hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer has a high density.
  • the surface of a supporting substrate containing a hydrophilic organic compound such as a hydrophilic polymer at a high density has cell non-adhesiveness
  • the surface of the supporting substrate having a low density of the compound is a cell. It utilizes the fact that it has adhesiveness.
  • a part of the surface of the supporting substrate is selectively masked with a photoresist or the like, a film of the hydrophilic organic compound is formed in an unmasked region to form a cell non-adhesive portion, and then the masking is removed.
  • the cell adhesion part can be formed by exposing the surface of the supporting base material.
  • a supporting substrate having a cell non-adhesive surface (which may be the surface of the cell non-adhesive layer) is prepared, and a part of the surface is used for cell adhesion such as collagen or fibronectin. Proteins may be patterned and coated to form a cell-adhesive pattern.
  • a supporting substrate having a cell-adhesive surface (which may be the surface of the cell-adhesive layer) is prepared, and a part of the surface is made of silicone rubber (eg, Mitsubishi Chemical's Silica (registered trademark)), etc.
  • the cell-nonadhesive resin may be coated, and the rest may be a cell-adhesive pattern.
  • a support base material having a conductive layer having a predetermined pattern provided on the surface thereof is prepared, a cell non-adhesive layer is laminated on the surface of the support base material, and a voltage is applied to the conductive layer to form the conductive material.
  • the cell non-adhesive layer covering the conductive layer may be peeled off, and the exposed conductive layer may be used as a cell adhesive portion (specifically, JP2012-120443A and JP2013-179910A). reference).
  • a hydrophilic membrane containing a hydrophilic organic compound, preferably a hydrophilic polymer is provided as a cell non-adhesive layer on the surface of a supporting substrate.
  • the hydrophilic film is a thin film having water solubility and water swelling property, has cell non-adhesive property before being oxidized and/or decomposed, and has exposed the supporting substrate after being oxidized and/or decomposed.
  • the cell non-adhesive layer is a hydrophilic film formed of a hydrophilic organic compound
  • the binding layer is preferably a layer containing a material having a functional group (bonding functional group) capable of binding to the functional group of the organic compound of the hydrophilic film.
  • a functional group bonding functional group
  • the combination of the binding functional group of the material for the binding layer and the functional group of the hydrophilic organic compound epoxy group and hydroxyl group, phthalic anhydride and hydroxyl group, carboxyl group and N-hydroxysuccinimide, carboxyl group And carbodiimide, amino group and glutaraldehyde and the like.
  • a binding layer is formed of a material having a predetermined functional group on a supporting substrate before coating with a hydrophilic organic compound.
  • the water contact angle of the surface of the bonding layer before forming the thin film of the hydrophilic organic compound is as follows when the silane coupling agent having an epoxy group at the end is used as the material having the bonding functional group. For example, it is typically 45° or more, and desirably 47° or more.
  • Such a binding layer can be obtained by forming a coating film of a material having a binding functional group on the surface of a supporting substrate.
  • hydrophilic organic compounds include hydrophilic polymers (including hydrophilic oligomers), water-soluble organic compounds, surface-active substances, amphipathic substances, etc., and hydrophilic polymers are particularly preferable.
  • hydrophilic polymers include polyalkylene glycol, phospholipid polar group-containing zwitterionic polymers, polyacrylamide, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyvinyl alcohol, and polysaccharides. These embodiments of hydrophilic polymers also include those in the form of their derivatives.
  • the molecular shape of the hydrophilic polymer may be linear, branched or dendrimer.
  • polyethylene glycol specifically, polyethylene glycol, polypropylene glycol, a copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol, such as Pluronic F108 and Pluronic F127 are preferable.
  • a copolymer of methacryloyloxyethylphosphorylcholine and an acrylic monomer, and the like are preferable.
  • polyacrylamide examples include poly(N-isopropylacrylamide).
  • polymethacrylic acid examples include poly(2-hydroxyethyl methacrylate).
  • polysaccharide examples include dextran and heparin.
  • the surface of the support substrate having the cell non-adhesive layer has high cell non-adhesiveness in a state of being covered with the cell non-adhesive layer, and the exposed support after the oxidation treatment and/or the decomposition treatment of the cell non-adhesive layer. It is desirable that the surface of the base material or the surface of the layer formed by modifying the cell non-adhesive layer by oxidation treatment and/or decomposition treatment exhibits cell adhesiveness.
  • Polyethylene glycol (PEG) is particularly preferable as the hydrophilic polymer.
  • PEG contains at least an ethylene glycol chain (EG chain) consisting of one or more ethylene glycol units ((CH 2 ) 2 —O), but may be linear or branched.
  • the ethylene glycol chain has, for example, the following formula: -((CH 2 ) 2 -O) m- (M is an integer indicating the degree of polymerization) Refers to the structure represented by.
  • m is preferably an integer of 1 to 13, more preferably an integer of 1 to 10.
  • PEG also includes ethylene glycol oligomers.
  • PEG also includes those into which a functional group has been introduced.
  • the functional group include an epoxy group, a carboxyl group, an N-hydroxysuccinimide group, a carbodiimide group, an amino group, a glutaraldehyde group, and a (meth)acryloyl group.
  • the functional group is preferably introduced at the terminal, optionally via a linker.
  • Examples of PEG having a functional group introduced therein include PEG(meth)acrylate and PEG di(meth)acrylate.
  • the cell adhesion portion is subjected to an oxidation treatment and/or a decomposition treatment on the cell non-adhesion layer containing the hydrophilic organic compound formed on the surface of the support base material to expose the surface of the support base material having the cell adhesion property, Alternatively, it can be formed by modifying the cell non-adhesive layer and converting it into a cell adhesive layer.
  • oxidation has a narrow sense and means a reaction in which an organic compound reacts with oxygen so that the oxygen content is higher than before the reaction.
  • “decomposition” refers to a change in which a bond of an organic compound is broken and one organic compound produces two or more organic compounds.
  • the “decomposition treatment” typically includes, but is not limited to, decomposition by oxidation treatment, decomposition by ultraviolet irradiation, and the like.
  • decomposition treatment is decomposition accompanied by oxidation (that is, oxidative decomposition)
  • decomposition treatment and “oxidation treatment” refer to the same treatment.
  • disassembling and removing the cell non-adhesive layer is also included in the “decomposition treatment”.
  • ⁇ Decomposition by UV irradiation means that an organic compound absorbs UV light and decomposes through an excited state.
  • an organic compound when an organic compound is irradiated with ultraviolet light in a system in which oxygen-containing molecular species (oxygen, water, etc.) are present, the ultraviolet rays are absorbed by the compound and decomposed, and the molecular species are activated. May react with organic compounds. The latter reaction can be classified as "oxidation”. Then, the reaction in which the organic compound is decomposed by the oxidation by the activated molecular species can be classified into “decomposition by oxidation” instead of "decomposition by ultraviolet irradiation".
  • oxidation process and “decomposition process” may overlap as operations, and it is not possible to clearly distinguish them. Therefore, in this specification, the term “oxidation treatment and/or decomposition treatment” is used.
  • the density of the hydrophilic organic compound such as the hydrophilic polymer is low in the cell adhesion part of the surface of the supporting substrate (even when the hydrophilic organic compound is not contained. Surface) and the cell non-adhesive portion is a surface having a high density of the hydrophilic organic compound. That is, the density of the hydrophilic organic compound is different between the cell adhesion part and the cell non-adhesion part. The higher the density, the less likely cells are to adhere. In the cell adhesion part, the density of the hydrophilic organic compound is low enough to allow cells to adhere.
  • Preferred examples of the hydrophilic organic compound and the hydrophilic polymer are as described above for the first embodiment.
  • the support base material may be added as needed. It is preferred to form a tie layer and then a hydrophilic membrane of a hydrophilic organic compound.
  • the binding layer is preferably a layer containing a material containing a functional group (bonding functional group) capable of binding to the functional group of the hydrophilic organic compound.
  • Examples of the combination of the functional group contained in the material for the bonding layer and the functional group contained in the hydrophilic organic compound include epoxy groups and hydroxyl groups, phthalic anhydride and hydroxyl groups, carboxyl groups and N-hydroxysuccinimide, and carboxyl groups and carbodiimide. , Amino groups and glutaraldehyde. In each combination, either may be a functional group on the bonding layer side.
  • a binding layer is formed of a material having a predetermined functional group on a supporting substrate before coating with a hydrophilic material.
  • the density of the material in the tie layer is an important factor defining the bond strength. The density can be easily evaluated using the contact angle of water on the surface of the bonding layer as an index. The water contact angle is a value measured 30 seconds after pure water was dropped from a microsyringe using CA-Z manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.
  • the density of the material having a binding functional group in the bonding layer of the cell adhesion part is low.
  • the water contact angle of the surface of the bonding layer before forming the thin film of the hydrophilic organic compound is a silane coupling agent having an epoxy group at the end as a material having a bonding functional group forming the bonding layer. Taking, for example, 10° to 43°, preferably 15° to 40°.
  • the surface of the binding layer is subjected to an oxidation treatment and/or a decomposition treatment. There is a method.
  • Examples of the method for oxidizing and/or decomposing the surface of the bonding layer include a method of subjecting the surface of the bonding layer to ultraviolet irradiation, a method of treating with a photocatalyst, and a method of treating with a oxidizing agent.
  • the entire surface of the bonding layer may be oxidized and/or decomposed, or may be partially treated. Partial processing can be performed by using a mask such as a photomask or a stencil mask, or by using a stamp.
  • the oxidation treatment and/or the decomposition treatment may be performed by a direct drawing method such as a method using a laser such as an ultraviolet laser.
  • the cell adhesion part can be formed by forming a thin film of a hydrophilic organic compound on the bonding layer thus formed.
  • the density of the material having a binding functional group in the binding layer of the cell non-adhesive part is high.
  • the water contact angle of the surface of the bonding layer before forming the thin film of the hydrophilic organic compound in the cell non-adhesive part is as follows when the silane coupling agent having an epoxy group at the end is used as the material having the bonding functional group. For example, it is typically 45° or more, and desirably 47° or more.
  • Such a binding layer can be obtained by forming a coating film of a material having a binding functional group on the surface of a supporting substrate. When the surface of the bonding layer is partially oxidized and/or decomposed, the remaining portion not subjected to the treatment becomes the bonding layer having the water contact angle.
  • a cell non-adhesive layer can be formed by forming a thin film of a hydrophilic organic compound on the binding layer thus formed.
  • a part of the surface of the supporting substrate is selectively masked with a photosensitive photoresist or the like, and the hydrophilic organic compound film is formed in the unmasked region to form a cell non-adhesive part.
  • the cell adhesion portion may be formed by removing the masking and exposing the surface of the supporting substrate.
  • the carbon content of the cell adhesion part (including the bonding layer when the bonding layer is present) is lower than the carbon content of the cell non-adhesive part (including the bonding layer when the bonding layer is present).
  • the carbon content in the cell adhesion part is 20 to 99% of the carbon content in the cell non-adhesion part.
  • the thickness falling within this range is the thickness of the hydrophilic organic compound layer contained in the cell adhesion part and the cell non-adhesion part (when the binding layer is present, the total thickness of the binding layer and the hydrophilic film). Is particularly preferable when 10) or less.
  • Carbon content (atomic concentration, %) is as defined below.
  • the value of the ratio (%) of carbon bonded to oxygen among the carbons in the cell adhesion part is determined by the non-cell adhesion part (the bonding layer is present). In some cases (including the bonding layer in some cases), it is preferable that the ratio is a smaller value than the ratio (%) of carbon bonded to oxygen among the carbons.
  • the value of the ratio (%) of carbon bonded to oxygen in the carbon in the cell adhesion part is the ratio of carbon bonded to oxygen in the carbon in the cell non-adhesion part (%) The value is preferably 35 to 99%.
  • the thickness of the hydrophilic film (when the binding layer is present, the total thickness of the binding layer and the hydrophilic film) is 10 ⁇ m or less.
  • the ratio of carbon bonded to oxygen (atomic concentration, %)” is as defined below.
  • the evaluation method of the hydrophilic organic compound layer (including the bonding layer when the bonding layer is present) included in the cell adhesion part and the cell non-adhesion part includes contact angle measurement, ellipsometry, atomic force microscope observation, electron Microscopic observation, Auger electron spectroscopy measurement, X-ray photoelectron spectroscopy measurement, various mass spectrometric methods, and the like can be used.
  • X-ray photoelectron spectroscopy X-ray photoelectron spectroscopy (XPS/ESCA) has the most excellent quantification. Relative quantitative value is obtained by this measuring method, and is generally calculated by element concentration (atomic concentration, %).
  • X-ray photoelectron spectroscopy analysis method in the present disclosure will be described in detail.
  • the carbon content of the cell adhesion part and the cell non-adhesion part is defined as "the carbon content obtained from the analysis value of the C1s peak obtained by using an X-ray photoelectron spectrometer.” Further, in the present disclosure, the “proportion of carbon bonded to oxygen” in the cell adhesion part and the cell non-adhesion part is “bonded with oxygen determined from the analysis value of C1s peak obtained using an X-ray photoelectron spectrometer. The percentage of carbon that is present is defined as The specific measurement can be performed as described in JP-A 2007-327736.
  • the cell culture substrate 1 used in the present disclosure is It has a surface S including the cell culture section 20.
  • the cell culture section 20 extends continuously or intermittently along the cell non-adhesive portion (central portion) 21 and the peripheral edge P of the cell non-adhesive portion 21 (in FIG. 1, continuously extends.
  • the cell adhesion part 22 surrounding the cell non-adhesion part 21 is provided.
  • the present embodiment is an example in which one or more cell culture parts 20 are included on the surface S of the cell culture substrate 1, and each of the one or more cell culture parts 20 has the above characteristics.
  • one or more cell culture parts 20 are scattered in an island shape in the cell non-adhesive part 10.
  • the cell non-adhesive portion 10 may be referred to as a “first cell non-adhesive portion”, and the cell non-adhesive portion 21 of the cell adhesive portion 20 may be referred to as a “second cell non-adhesive portion”.
  • the "cell non-adhesive portion 21" may be referred to as the "central portion 21" or the "central portion 21 which is the cell non-adhesive portion”.
  • the first cell non-adhesive portion 10 is not an essential component, and an example of the cell culture substrate that does not include the first cell non-adhesive portion 10 will be described separately with reference to FIGS. 35 to 37.
  • a portion of the cell culture substrate 1 on which the first cell non-adhesive portion 10 and the cell adhesive portion 20 are arranged is referred to as a “support substrate 30”.
  • the first cell non-adhesive portion 10 and the central portion 21 that is the second cell non-adhesive portion are the first cell non-adhesive layer 10A laminated on the surface of the support substrate 30, It is the surface of the second cell non-adhesive layer 21A.
  • the cell adhesion part 22 is the exposed surface of the support base material 30.
  • the cell adhesion portion 22 may be the surface of the cell adhesion layer 22A laminated on the surface of the support base material 30.
  • the thickness of the cell non-adhesive layer 10A, the cell non-adhesive layer 21A and the cell adhesive layer 22A, the cell adhesive portion 22, and the cell non-adhesive layer 10A are sufficiently small with respect to the dimensions of the cells and cell structures to be cultured, so that one or more cell culture parts 20 are provided.
  • the surface S containing S can support cells as a substantially flat surface.
  • FIG. 1B shows an example in which the supporting base material 30 is in direct contact with the first cell non-adhesive layer 10A and the second cell non-adhesive layer 21A, but as described above, the bonding layer. May be interposed therebetween.
  • FIG. 26B shows an example in which the supporting base material 30, the first cell non-adhesion layer 10A, the second cell non-adhesion layer 21A, and the cell adhesion layer 22A are in direct contact with each other. As described above, the bonding layer may be interposed therebetween.
  • the first cell non-adhesive portion 10 the first cell non-adhesive layer 10A, the second cell adhesive portion 21, the second cell non-adhesive layer 21A, the cell adhesive portion 22, and the cell adhesive layer 22A.
  • Specific examples and manufacturing methods are as described above.
  • the present inventors have surprisingly found that when culturing stem cells on the cell culture substrate 1 having such a structure, the stem cells adhere to the cell adhesion portion 22 surrounding the cell non-adhesion portion (central portion) 21 and proliferate. As a result, dense aggregates of cells are formed, and in the aggregates of the formed cells, it is possible to differentiate into intestinal epithelial cells expressing a marker of trophectoderm cells, and a bag-like cell structure (tissue) is easily formed. I found that.
  • the obtained cell structure contains small intestinal epithelial cells and has a function as an intestinal organoid.
  • the cell structure containing small intestinal epithelial cells can be released from the cell culture substrate and recovered in a relatively short time, and the recovery efficiency is high.
  • the present inventors have found that it is extremely high.
  • the shape and size of the cell culture section 20 are not particularly limited, but in a preferred embodiment, a distance X between two intersections A1 and A2 of a peripheral edge P of the central portion 21 and a straight line L passing through the center of gravity C of the central portion 21. Is more than 80 ⁇ m and 880 ⁇ m or less, more preferably 180 ⁇ m or more and 880 ⁇ m or less, and particularly preferably 180 ⁇ m or more and 600 ⁇ m or less. If the distance X is too small, the central portion 21 is immediately covered by the trophectoderm cells during the growth culture, and it is difficult to obtain a pouch-like structure specific to the outer peripheral portion of the cell structure.
  • the distance X indicates the diameter of the circle when the shape of the central portion 21 is a circle as shown in FIGS. 1 and 15B, and when the circle is a perfect circle, the distance X is equal to the straight line L in any case. Is the same.
  • the central portion 21 has a rectangular shape as shown in FIGS.
  • the distance X becomes maximum when the straight line L is in the diagonal direction, and becomes minimum when the straight line L is in the lateral direction.
  • the distance X is preferably within the above range over the entire circumference (that is, with respect to all the straight lines L).
  • the width W of the cell adhesion unit 22 in the direction along the straight line L passing through the center of gravity C of the central portion 21 is more than 30 ⁇ m and 400 ⁇ m or less, and more preferably 40 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or more. Or less, and particularly preferably 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less. If the width W is too small, there is a problem in that cells are likely to peel off during culture. Further, in order to guide the bag-shaped cell structure, it is desirable that a plurality of cells adhere to each other in the width direction of the cell adhesion portion 22 to form an aggregated portion, and for that purpose, the width W is preferably large.
  • the width W is preferably 40 ⁇ m or more, and more preferably 60 ⁇ m or more.
  • the width W is too large, the density of the cells adhered to the cell adhesion portion 22 tends to be uneven, and it is difficult to form uniform cell agglomerations in the width direction, and a cell structure having a uniform structure can be obtained. Hateful.
  • the width W is in the above range, the cell structure can be cultivated in a high yield in a relatively short time.
  • the width W refers to the width of the cell adhesion portion 22 in the diameter direction of the circle when the shape of the central portion 21 is a circle as shown in FIGS.
  • the width W is the same no matter what.
  • the width W becomes maximum when the straight line L is in the diagonal direction, and becomes minimum when the straight line L is in the lateral direction.
  • the width W is preferably within the above range over the entire circumference (that is, for all the straight lines L).
  • the cell adhesion section 22 has a distance X between two intersections A1 and A2 of a peripheral edge P of the central section 21 and a straight line L passing through the center of gravity C of the central section 21.
  • the ratio X/W to the width W in the direction along the straight line L is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more, more preferably 1.3 or more, and preferably 20.0 or less. It is preferably 15.0 or less, more preferably 10.0 or less.
  • the ratio X/W is preferably in the above range over the entire circumference (that is, for all the straight lines L).
  • the shape and dimensions of the cell adhesion part 22 can be defined by the following intermediate point C′, distance X′, width W′, and straight line L′.
  • the midpoint C', the distance X', the width W', and the straight line L' will be described with reference to FIGS. 15A and 15B.
  • the distance between the two intersections A5 and A6 between the straight line L'and the inner circumference Q of the cell adhesion portion 22 is defined as a distance X'.
  • the width of the cell adhesion portion 22 in the direction along the straight line L′ passing through the intermediate point C′ is defined as the width W′.
  • the distance X′ is preferably more than 80 ⁇ m and 880 ⁇ m or less, more preferably 180 ⁇ m or more and 880 ⁇ m or less, particularly preferably 180 ⁇ m or more and 600 ⁇ m or less, and particularly preferably 180 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less. If the distance X'is too small, the central portion 21 is immediately covered with cells during the growth culture, and it is difficult to obtain a pouch-like structure specific to the outer peripheral portion of the cell structure. On the other hand, if the distance X′ is too large, it takes a long time for the cells to grow and completely cover the central portion 21, so that the production efficiency of the cell structure decreases.
  • the distance X′ refers to the diameter of the circle when the shape of the central portion 21 is a circle as shown in FIGS. 1 and 15B, and when the circle is a perfect circle, the straight line L′ is used for any distance. X'is the same.
  • the distance X′ is maximum when the straight line L′ is in the diagonal direction and is minimum when the straight line L′ is in the lateral direction. Become.
  • the distance X′ is preferably within the above range over the entire circumference (that is, for all straight lines L′).
  • the width W′ is preferably more than 30 ⁇ m and 400 ⁇ m or less, more preferably 40 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, and particularly preferably 60 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less. If the width W'is too small, there is a problem that the cells are likely to peel off during the culture. Further, in order to guide the bag-shaped cell structure, it is desirable that a plurality of cells adhere to each other in the width direction of the cell adhesion portion 22 to form an aggregated portion, and for that purpose, the width W′ is preferably large. Therefore, as described above, the width W′ is preferably 40 ⁇ m or more, and more preferably 60 ⁇ m or more.
  • the width W′ refers to the width of the cell adhesion portion 22 in the diameter direction of the circle when the shape of the central portion 21 is a circle as shown in FIGS. 1 and 15B, and is a straight line when the circle is a perfect circle.
  • the width W' is the same regardless of L'.
  • the width W′ is maximum when the straight line L′ is in the diagonal direction, and is minimum when the straight line L′ is in the lateral direction. ..
  • the width W′ is preferably within the above range over the entire circumference (that is, for all straight lines L′).
  • the ratio X′/W′ is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more, more preferably 1.3 or more, preferably 20.0 or less, more preferably 15.0 or less, more preferably Is 10.0 or less.
  • the ratio X'/W' is in the above range, the cell structure can be cultured in a high yield in a relatively short time.
  • the ratio X'/W' is preferably in the above range over the entire circumference (that is, for all straight lines L').
  • the central portion 21 has a circular shape
  • the cell adhesion portion 22 has an annular shape that concentrically surrounds the circular central portion 21 and has high symmetry, so that a uniform cell structure can be obtained. Is particularly preferable.
  • the present invention is not limited to such an example, and as shown in FIGS. 15A, 15C, and 15D, the central portion 21 has a rectangular shape (square or rectangular), and the cell adhesion portion 22 has a rectangular central portion 21.
  • the inner and outer contours along the peripheral edge P may be rectangular.
  • the central portion may be elliptical and the cell adhesion portion may be elliptic annular shape extending along the central portion.
  • the inner and outer contours of the cell adhesion part have similar shapes, but the invention is not limited to this.
  • the inner contour of the cell adhesion part (that is, the outer contour of the central part) is a polygon such as a rectangle.
  • the outer contour of the cell culture part may be circular or elliptical, or conversely, the inner contour of the cell adhesion part (that is, the outer contour of the central part) is circular or elliptical, and the outer contour of the cell culture part is It may be a polygon such as a rectangle.
  • the central portion 21 may have a semicircular shape.
  • the cell adhesion portion 22 continuously extends along the peripheral edge P of the central portion 21 that is the second cell non-adhesion portion, and extends over the entire circumference. Surround the central part 21.
  • the cell adhesion portion may have a shape that extends intermittently. Specifically, as shown in the example of FIG. 15B, the cell adhesion portion 22 intermittently extends along the peripheral edge P of the central portion 21 that is the second cell non-adhesion portion and surrounds the central portion 21. Even with such a structure, the cells adhered on the cell adhesion part 22 can grow and form a tissue that connects the cut parts of the cell adhesion part 22.
  • the interrupted portion is preferably one half of the entire peripheral edge P of the central portion 21 per location. Or less, more preferably 1 ⁇ 4 or less, more preferably 1 ⁇ 6 or less, more preferably 1 ⁇ 8 or less, and in the case of containing a plurality of interruptions, the total of the interruptions is
  • the length of the entire circumference of the peripheral edge P of the central portion 21 is preferably 1/2 or less, more preferably 1/4 or less, more preferably 1/6 or less, and more preferably 1/8 or less. ..
  • the cell adhesion part has a structure that extends so as to surround the cell non-adhesive central part, and when the cells adhere and grow on the cell adhesion part, the cells are densely packed. Differentiation into cells having the properties of vegetative ectoderm cells is likely to be promoted, and proliferated cells are likely to stack. As a result, it is possible to efficiently obtain a bag-shaped cell structure in which cells having the properties of trophectoderm cells are distributed in the outer peripheral portion.
  • each cell culture unit 20 When there are a plurality of cell culture parts 20 as in the cell culture substrate 1, they are isolated from each other, preferably 0.20 mm or more, more preferably 0.30 mm or more apart from each other. By isolating each cell culture unit 20 by a certain distance or more, the cells in each cell culture unit 20 are uniformly cultured at a constant interval without forming intercellular bonds with the cells of the other adjacent cell culture units 20, An experimental system with high reproducibility can be constructed.
  • the cell culture substrate 1 according to the embodiment shown in FIG. 1, FIG. 15A, FIG. 15B, FIG. 15C, FIG. 15D, and FIG. 26 includes one or more cell culture parts 20 in the first cell non-adhesive part 10. It has a special structure. An embodiment of the cell culture substrate that does not include the first cell non-adhesive portion 10 will be described separately with reference to FIGS. 35 to 37.
  • the cell culture substrate 1 according to one embodiment of the present disclosure shown in FIG. 35 has a surface S including the cell culture section 20. Then, the cell culture section 20 extends continuously or intermittently along the cell non-adhesive section 21 and the peripheral edge P of the cell non-adhesive section 21 (in FIG. 35, an example of continuous extension). (Shown), and a cell adhesion portion 22 surrounding the cell non-adhesion portion 21.
  • a portion where the cell adhesion portion 20 is arranged on the surface is referred to as a “support substrate 30”.
  • the cell culture substrate 1 shown in FIG. 35 has a support substrate 30 having one or more protrusions 31, and a cell non-adhesive portion 21 and a cell adhesion portion 22 surrounding the cell adhesive portion 21 on the upper surface S of each protrusion 31.
  • the upper surface S of the protrusion 31 is circular, but may have another shape.
  • the cell adhesion portion 22 exists on the peripheral portion of the upper surface S of the protrusion 31 and the supporting base material does not exist outside the cell adhesion portion 22, so that the cell adhesion portion 22 is adhered to the cell adhesion portion 22.
  • the cells do not spread to the outside of the cell adhesion part 22 and spread on the cell adhesion part 22 and the cell non-adhesion part 21 inside thereof to form a cell structure.
  • the cell culture section 20 (consisting of the cell non-adhesion section 21 and the cell adhesion section 22) is present on the upper surface S of the horizontally isolated protrusion 31, the inside of each cell culture section 20.
  • Cells are cultured without forming intercellular bonds with the cells of the other adjacent cell culture section 20, and it is easy to construct a highly reproducible experimental system.
  • protrusions 31 are preferably spaced apart from each other by 0.20 mm or more, more preferably 0.30 mm or more.
  • the cell culture substrate 1 according to the embodiment of the present disclosure shown in FIG. 36 has a surface S including the cell culture section 20. Then, the cell culture section 20 extends continuously or intermittently along the cell non-adhesive portion 21 and the peripheral edge P of the cell non-adhesive portion 21 (in FIG. 36, an example of continuous extension). (Shown), and a cell adhesion portion 22 surrounding the cell non-adhesion portion 21.
  • a portion where the cell adhesion portion 20 is arranged on the surface is referred to as a “support substrate 30”.
  • the cell culture substrate 1 shown in FIG. 36 has a supporting substrate 30 having one or more recessed portions 32, and the cell non-adhesive portion 21 and the cell adhesive portion 22 surrounding the cell non-adhesive portion 21 on the bottom surface S of each recessed portion 32.
  • the bottom surface S of the recess 32 is circular, but it may have another shape.
  • the cell adhesion portion 22 exists on the peripheral edge of the bottom surface S of the depression 32, and the outer side of the cell adhesion portion 22 is the peripheral wall surface of the depression 32.
  • the cultured cells when cultured, do not spread outside the cell adhesion part 22 but spread on the cell adhesion part 22 and the cell non-adhesion part 21 inside thereof to form a cell structure.
  • the cell culture section 20 (consisting of the cell non-adhesive section 21 and the cell adhesion section 22) is present on the bottom surface S of the hollow section 32 that is horizontally isolated, Cells are cultured without forming intercellular bonds with the cells of the other adjacent cell culture section 20, and it is easy to construct a highly reproducible experimental system.
  • the present embodiment when there are a plurality of recesses 32, they are preferably spaced apart from each other by 0.20 mm or more, more preferably 0.30 mm or more.
  • the cell culture substrate 1 according to the embodiment of the present disclosure shown in FIG. 37 has a surface S including the cell culture section 20. Then, the cell culture section 20 extends continuously or intermittently along the cell non-adhesive section 21 and the peripheral edge P of the cell non-adhesive section 21 (in FIG. 37, an example of continuous extension). (Shown), and a cell adhesion portion 22 surrounding the cell non-adhesion portion 21.
  • the portion where the cell adhesion portion 20 is arranged on the surface is referred to as a “support substrate 30”.
  • one cell culture portion 20 is formed on the entire flat surface S of the support substrate 30, and the cell adhesion portion 22 is arranged at the peripheral portion of the surface S.
  • the surface S of the support substrate 30 is circular, but may have another shape.
  • the cell adhesion portion 22 exists on the peripheral portion of the surface S of the support base material 30, and the support base material does not exist outside the cell adhesion portion 22, so that the cell adhesion portion 22 adheres to the cell adhesion portion 22.
  • the cultured cells when cultured, do not spread outside the cell adhesion part 22 but spread on the cell adhesion part 22 and the cell non-adhesion part 21 inside thereof to form a cell structure.
  • one cell culture substrate 1 since one cell culture substrate 1 has only the cell culture section 20 (consisting of the cell non-adhesion section 21 and the cell adhesion section 22), the cells in the cell culture section 20 are Are cultured without forming cell-cell junctions with other cells, making it easy to construct a highly reproducible experimental system.
  • the cell constructs produced by the present disclosure include small intestinal epithelial cells.
  • the small intestinal epithelial cells are typically small intestinal epithelial cells expressing trophectoderm cell markers.
  • the present disclosure discloses that, during cell culture, cells aggregate at a high density in a cell adhesion part extending so as to surround a cell non-adhesion part, and differentiate into a small intestinal epithelial cell expressing a trophectoderm cell marker, which is the outer peripheral part. It is based on the surprising finding that a bag-shaped cell structure distributed in a can be obtained. In the examples, it was confirmed that cytokeratin 7, which is a marker for trophectoderm cells, and CDX2, which is a marker for small intestinal epithelial cells and trophectoderm cells, are strongly expressed in cells aggregated at the cell adhesion part. ing.
  • small intestinal epithelial cells express transcription factors CDX2 and HNF4 in the cell nucleus, villin in the chorionic layer, and E-cadherin, which is an endodermal marker, as indicators.
  • the presence of these markers can be detected by tissue immunostaining using an antibody or PCR evaluation using mRNA.
  • the cell structure of the present disclosure contains small intestinal epithelial cells and is useful as an intestinal organoid having a function equivalent to that of the intestine.
  • "Intestinal organoid” refers to a function similar to that of the intestine of a cell origin organism, in particular, mammalian intestine, particularly human intestine (specifically, peristaltic function, mucus secretion function, substance absorption function, etc.).
  • a cell structure (tissue) having The cell structure of the present disclosure is useful for the development of a drug for preventing or treating intestinal-related diseases and for the pathological study of intestinal-related diseases.
  • the overall shape of the cell structure of the present disclosure is not particularly limited, but is usually granular. “Granular” also includes spheres.
  • Non-patent Document 4 it has been shown that CDX2 is strongly expressed in mouse ES cells to differentiate into trophectoderm cells. Also in this example, it was confirmed that the markers CDX2 and Cytokeratin7 were strongly expressed in the agglutination site, and it is considered that they are similarly differentiated into cells having the properties of trophectoderm cells.
  • Non-Patent Document 5 describes that a tissue having a bag-like structure containing CDX2-positive cells can be obtained from human iPS cells. Therefore, according to the present disclosure, it is considered that stem cells may be differentiated into CDX2-positive cells in the agglutination portion where the cells are densely packed on the cell adhesion portion by culturing, which may also contribute to the formation of the bag-like structure.
  • non-patent documents 6 to 8 show that ES cells and iPS cells have the ability to differentiate into trophectoderm cells.
  • Non-Patent Document 9 it has been shown in a study using mouse ES cells that the Oct gene is differentiated into trophectoderm when the expression of the Oct gene is reduced, and it is presumed that similar differentiation occurs in the cell structure of the present disclosure. To be done.
  • the expression of the ABCG2 transporter is equal to or higher than that of the small intestine cDNA of the origin animal (human small intestine when the origin animal is human). ..
  • the expression of ABCG2 transporter is remarkably higher than that of the intestinal organoids obtained so far.
  • ⁇ As a role of ABCG2 transporter in the intestine, it contributes to excretion in the intestine, for example, excretion of uric acid, and its functional decline is considered to cause symptoms such as gout.
  • it is necessary to see not only suction but also excretion.
  • the site, sex, age, race, etc. of the cDNA of the small intestine of the animal of origin, particularly the human small intestine which can be used as a reference for relative values. Is desirable, and it is desirable that the adult age is reached.
  • various commercially available products can be used, and those obtained by collecting from human tissues obtained after receiving informed consent may be used.
  • PCR Ready First Strand cDNA-Human Adult Normal Tissue Small Intestine (BioChain) or PCRiReadS, which is a product obtained from the ileum to reliably obtain expression of CUBN, is included.
  • Human Adult Normal Tissue Ileum (BioChain) can be used.
  • the expression of ABCG2 transporter was not sufficient in the intestinal organoids that have been induced so far.
  • Examples of past analysis include, for example, the case of Non-Patent Document 10, which also shows only the expression in the human intestine and below.
  • the expression of ABCG2 transporter was the expression in the human intestine or less. The value obtained when the pattern culture described so far in Non-Patent Document 2 using iPS cells performed in the subsequent Examples was performed was equivalent to the value in ES cells.
  • Non-patent Documents 11 and 12 describe that the ABCG2 transporter is strongly expressed in placenta, that is, trophectoderm cells.
  • Non-patent Document 13 by culturing mouse intestinal tissue, an organoid-like tissue is induced by in vitro culture without using Lgr5-positive intestinal epithelial stem cells as used in Non-patent Document 1.
  • Trop2-positive cells are expressed in the intestine of the mouse embryo and are the origin of differentiation into organoids.
  • This Trop2 marker is also strongly expressed in trophectoderm cells and has similar properties. Therefore, it is considered that the developmental mechanism of the intestinal epithelial cells in the present disclosure is close to this.
  • Non-Patent Document 14 describes the closeness of the properties of trophectoderm cells and small intestinal epithelial cells.
  • Non-Patent Document 13 it is suggested that the same phenomenon as in Non-Patent Document 13 is occurring, and it is considered that the intestinal epithelial cells expressing the trophectoderm cell marker are induced to differentiate from trophectoderm cells, and also differentiation-inducing culture. Since the period is short, the cell structure (tissue) is obtained in the cell state in the initial stage, and it is considered that the expression level of the ABCG2 transporter in the constituting cells is likely to be high.
  • the cell structure of the present disclosure further includes the expression levels of the ABCG2 transporter and the ABCB1 transporter in the cell structure, the expression level of the ABCG2 transporter and the expression level of the ABCB1 transporter in the intestinal tissue of the source animal, respectively.
  • the relative value of the expression level of the ABCG2 transporter in the cell structure is 90 times or more, preferably 100 times or more the expression level of the expression level of the ABCB1 transporter. Is.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, but is, for example, 1000 times or less.
  • the cell constructs of the present disclosure are useful as a model for the juvenile human intestine.
  • Non-Patent Document 15 describes the expression of ABCB1 transporter and ABCG2 transporter in placenta and fetus. According to this, it is described that the ABCB1 transporter in the human small intestine is low until 20 weeks after implantation, and becomes as high as that in the adult when it becomes a newborn. On the other hand, it is said that the ABCG2 transporter shows high expression equivalent to that of the adult from 5.5 weeks after implantation. Therefore, it is considered that the expression of ABCG2 transporter is higher than that of ABCB1 transporter in the juvenile intestine.
  • the human small intestine cDNA that can be used as a reference when the source animal of the stem cells used for the preparation of the cell structure is human is as described above.
  • Non-Patent Document 16 describes the production of an intestinal organoid having a higher ABCG2 transporter than that of the human intestine by suspension culture. However, this product is also highly expressed by the ABCB1 transporter due to induction, which is different from the product obtained in the present disclosure.
  • the product described in Non-Patent Document 16 is composed of only small intestinal epithelial cells.
  • a method for measuring the intensity of expression of ABCG2 transporter and ABCB1 transporter a method for measuring mRNA by a genetic method (for example, qPCR method including real-time PCR, and band density obtained by electrophoresis on agarose gel) Method) and a method of measuring protein expression using an antibody (for example, flow cytometry), but a genetic method for measuring the amount of mRNA is preferable.
  • a genetic method for example, qPCR method including real-time PCR, and band density obtained by electrophoresis on agarose gel
  • an antibody for example, flow cytometry
  • the transporter is mainly expressed in epithelial cells, but expression is also recognized in stromal cells. Therefore, when the expression level of a protein expressed only in epithelial cells (eg, CDX2 or Villin) is used as a standard for the expression level of ABCG2 transporter, the value varies depending on the amount of stromal cells in the cell structure. Will occur. The above problem can be avoided by evaluating the ratio of ABCG2 transporter and ABCB1 transporter co-expressed in the cell.
  • a protein expressed only in epithelial cells eg, CDX2 or Villin
  • Cubilin a protein encoded by the gene CUBN, is a receptor that is rarely expressed in the duodenum and jejunum but is found in the ileum and acts to absorb cobalamin (vitamin B12) (Jensen et al., Physiological Reports e12086). 2014).
  • One of the features of one embodiment of the cell structure induced by the present disclosure is high expression level of CUBN. It is considered that the cell structure containing small intestinal epithelial cells in which the expression amount of CUBN is high has at least a property close to that of the ileum. Cubilin is expressed in the small intestinal epithelial cells.
  • the expression level of the gene CUBN it is preferable to evaluate it as a relative value to the expression level of a marker characteristic of the small intestine epithelial cells.
  • markers characteristic of small intestinal epithelial cells include CDX2, Villin and Ecadherin, and Villin is preferable.
  • a preferred embodiment of the cell structure of the present disclosure is A cell structure containing small intestinal epithelial cells,
  • the relative value of the expression level is in the range of 0.2 to 1.8, more preferably 0.24 to 1.72 with respect to the relative value of the expression level of Villin.
  • -A cell structure having this characteristic has at least a property close to that of the ileum.
  • the human small intestine cDNA that can be used as a reference when the source animal of the stem cells used for the preparation of the cell structure is human is as described above.
  • the cell structure of the present disclosure more preferably includes endodermal cells, ectodermal cells, and mesoderm cells.
  • endoderm is a tissue of organs such as the lung, thyroid, pancreas, and liver, cells of the secretory gland opening to the digestive tract, peritoneum, pleura, larynx, ear canal, trachea, bronchus, urinary tract (bladder, urethra). Usually, part of the ureter).
  • endoderm-specific genes include AFP, SERPINA1, SST, ISL1, IPF1, IAPP, EOMES, HGF, ALBUMIN, PAX4, TAT and the like.
  • Endodermal cells that can be included in the cell structure of the present disclosure include intestinal epithelial cells in particular.
  • the intestinal organoid preferably contains, as small intestinal epithelial cells, one or more selected from intestinal cells, goblet cells, intestinal endocrine cells and Paneth cells, and as small intestinal epithelial cells, intestinal cells, goblet cells, intestinal endocrine cells and Paneth cells It is particularly preferable to include all of The presence of endoderm cells in the cell structure of the present disclosure can be judged based on the positive expression of markers of endoderm cells. Examples of enterocyte markers include CDX2, goblet cell markers MUC2, intestinal endocrine cell markers CGA, and Paneth cell markers DEFA6.
  • ECAD ECAD
  • Na+/K+-ATPase ECAD
  • villin are markers for intestinal epithelial cells.
  • the definitive endoderm markers FOXA2, SOX17 or CXCR4 can also be used as markers for discriminating endoderm cells.
  • GATA4, GATA6, or T B (Brachyury), which is a marker for early endoderm and mesoderm, can also be used as a marker for discriminating endoderm lineage cells.
  • the ectoderm is the epidermis of the skin and epithelium of the male urethral end, hair, nails, cutaneous glands (including mammary glands and sweat glands), and sensory organs (salivary glands including the epithelium at the end of the oral cavity, pharynx, nose, and rectum, salivary glands) And so on.
  • Part of the ectoderm invades into a groove during development to form a neural tube, which is also a source of neurons and melanocytes in the central nervous system such as the brain and spinal cord. It also forms the peripheral nervous system.
  • ES cells or iPS cells into ectodermal cells can be confirmed by measuring the expression level of ectodermal-specific genes.
  • genes specific to ectoderm include ⁇ -TUBLIN, NESTIN, GALANIN, GCM1, GFAP, NEUROD1, OLIG2, SYNAPTPHYSIN, DESMIN, TH, and the like.
  • the ectodermal cells that can be included in the cell structure of the present disclosure include cells that specifically constitute the intestinal plexus.
  • the presence of ectodermal cells in the cell structure of the present disclosure can be judged based on the positive expression of the ectodermal cell marker.
  • enteric plexus marker PGP9.5 and neural progenitor cell marker SOX1 can be used as markers for discriminating ectodermal cells.
  • the mesoderm is a body cavity and the mesothelium, muscle, skeleton, skin dermis, connective tissue, heart, blood vessels (including vascular endothelium), blood (including blood cells), lymphatic vessels, spleen, kidneys, ureters, Form gonads (testis, uterus, gonadal epithelium).
  • the differentiation of ES cells or iPS cells into mesodermal cells can be confirmed by measuring the expression level of a gene specific to mesoderm. Examples of genes specific to mesoderm include FLK-1, COL2A1, FLT1, HBZ, MYF5, MYOD1, RUNX2, PECAM1 and the like.
  • the mesodermal cells that can be included in the cell structure of the present disclosure include smooth muscle cells and Cajal intervening cells.
  • the presence of mesodermal cells in the intestinal organoid can be judged based on the positive expression of the mesodermal cell marker.
  • ⁇ -smooth muscle actin (SMA) which is a smooth muscle cell marker
  • CD34 and CKIT when double positive
  • GATA4, GATA6, or T can also be used as a marker for distinguishing mesodermal cells.
  • the cell structure of the present disclosure preferably contains intestinal epithelial cells on at least a part of the outer surface.
  • a substance on the outside of the cell structure can be absorbed inside through the small intestinal epithelial cells on the outer surface, which is preferable.
  • the intestinal epithelial cells on the outer surface are further transporter-positive, it is more preferable because the substance can be taken in via the transporter. That is, the intestinal organoid containing transporter-positive small intestinal epithelial cells has a substance absorption ability similar to that of the intestine.
  • the method for producing a cell structure containing small intestinal epithelial cells of the present disclosure includes Seeding stem cells on a cell culture substrate having the above characteristics, and culturing the seeded stem cells to differentiate some of the stem cells into small intestinal epithelial cells.
  • the small intestinal epithelial cells are typically small intestinal epithelial cells expressing trophectoderm cell markers.
  • the cell culture substrate used in the present disclosure is preferably pre-coated with a pre-coating agent for the purpose of promoting the adhesion of stem cells to the cell adhesion part.
  • the precoat treatment agent is a component that is applied to a cell culture substrate in advance and promotes adhesion of cells to cell adhesion parts.
  • Examples of the precoat treatment agent include extracellular matrix (collagen, fibronectin, proteoglycan, laminin, vitronectin), gelatin, lysine, peptide, gel matrix containing them, serum and the like.
  • ⁇ Stem cells can be cultured under conditions that maintain undifferentiated state before seeding.
  • the medium used for culturing at this time is not particularly limited as long as it is a medium that does not induce differentiation of stem cells, but for example, it has the property of maintaining the undifferentiated state of mouse embryonic stem cells and mouse induced pluripotent stem cells. And a medium containing basic FGF known to have the property of maintaining the undifferentiated state of human iPS cells, and the like.
  • the step of culturing the stem cells seeded on the cell culture substrate and differentiating a part thereof into the intestinal epithelial cells may be carried out in a medium capable of proliferating and inducing differentiation of the stem cells, and the medium is not particularly limited. Specific examples thereof include the media used in Patent Document 1, Patent Document 2 and Non-Patent Document 4, and commercially available media such as StemFit (Ajinomoto Co.), StemFlex (Life Technologies), and ReproFF (ReproCell).
  • the medium may be a serum-containing medium or a serum-free medium containing a known component having a property of substituting for serum. Note that the factors (FGF2, IGF-1, heregulin) contained in Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 4 contribute to the proliferation of pluripotent stem cells, as described in Non-Patent Documents 17 and 18. Has been done.
  • MEM medium MEM medium, BME medium, DMEM medium, DMEM-F12 medium, ⁇ MEM medium, IMDM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI1640 medium and the like
  • Various growth factors, antibiotics, amino acids and the like may be added to the medium.
  • 0.1-2% pyruvate, 0.1-2% non-essential amino acids, 0.1-2% penicillin/streptomycin, 0.1-1% glutamine, 0.1-2% ⁇ -mercaptoethanol, 1 mM to 20 mM ROCK inhibitor (eg Y27632) may be added.
  • the seeding density of stem cells on the cell culture substrate may be in accordance with a conventional method and is not particularly limited. In the present disclosure, it is preferable to seed the stem cells on the cell culture substrate at a density of 3 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or more, and preferably at a density of 3 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 5 cells/cm 2. Is more preferable, and seeding at a density of 3 ⁇ 10 4 to 2.5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 is even more preferable.
  • the culture temperature is usually 37°C. It is preferable to culture in a CO 2 concentration atmosphere of about 5% using a CO 2 cell culture device or the like.
  • the culture period after seeding the stem cells on the cell culture substrate varies depending on the initial seeding density of cells and the shape and size of the cell adhesion part, but is preferably about 2 to 4 weeks.
  • the present inventors have found that when stem cells are cultured on a cell culture substrate having the structure described herein to induce differentiation, a cell structure containing differentiation-induced small intestinal epithelial cells is obtained 2 to 4 weeks after seeding. It was found that they can be spontaneously floated, exfoliated, and recovered, and the recovery rate of the cell structure thus recovered is remarkably high.
  • the method of the present disclosure is It is advantageous.
  • the cell structure differentiated by the method of the present disclosure spontaneously floats and detaches from the cell culture substrate, but is mild enzyme treatment (eg, Accutase or TrypLE etc.) or EDTA treatment, which does not destroy the cell structure, medium
  • mild enzyme treatment eg, Accutase or TrypLE etc.
  • EDTA treatment which does not destroy the cell structure
  • Various techniques such as spraying a liquid such as the above and physical peeling with a scraper may be used to promote the peeling of the cell structure from the cell culture substrate.
  • suspension culture may be continued.
  • the period of suspension culture is not limited.
  • the cell structure according to the embodiment of the present invention which has the characteristics of a small human intestine in which the expression level of the ABCG1 transporter is higher than that of the ABCB1 transporter, is obtained by exfoliating and recovering 2 to 4 weeks after seeding. be able to.
  • a cell culture substrate having a surface including a cell culture part
  • the cell culturing section includes a cell non-adhesive section and a cell adhesion section that extends continuously or intermittently along the periphery of the cell non-adhesion section and surrounds the cell non-adhesion section.
  • the present invention relates to a cell culture substrate, and a cell structure-retaining substrate including a cell structure containing small intestinal epithelial cells adhered onto the cell culture part.
  • the cell structure-holding base material holds a cell structure containing small intestinal epithelial cells on the base material, so that the cell structure containing small intestinal epithelial cells can be developed into a drug for preventing or treating intestinal-related diseases. It is easy to handle when it is used for tests for the purpose of pathological study of intestinal related diseases.
  • the cell structure-holding substrate can also be used as a scaffold when culturing a virus or microorganism that grows in small intestine tissue, such as norovirus.
  • further culturing the cell structure on the cell structure-retaining base material further includes a small intestine epithelial cell. It is also possible to mature the cell structure, release it from the cell culture substrate and collect it.
  • the proliferative property of cells constituting the cell structure is higher in the state where the cell structure is adhered to the cell culture substrate than in the state where the cell structure is suspended in the medium.
  • the structure-holding substrate is suitable for the above applications.
  • the cell structure adheres to the cell culture substrate in a state where cells have expanded and spread. Therefore, the cell structure holding substrate of the present disclosure is suitable as a scaffold for culturing a virus or microorganism that grows in the small intestine tissue.
  • the cell structure holding substrate it is preferable that the cell structure is in contact with a buffer solution or a culture medium so that the cell structure can survive.
  • FIG. 33 One embodiment of the cell structure holding substrate will be described based on FIG. 33, and another embodiment will be described based on FIG. 34.
  • the cell structure holding substrate 100 includes a cell culture substrate 1 and a cell structure 101 containing small intestinal epithelial cells.
  • the cell culture substrate 1 has a surface S including the cell culture section 20. Then, the cell culture section 20 extends continuously or intermittently along the cell non-adhesive portion (central portion) 21 and the peripheral edge P of the cell non-adhesive portion 21 (in FIG. 33, it continuously extends.
  • the cell adhesion part 22 surrounding the cell non-adhesion part 21 is provided.
  • the surface S further includes a first cell non-adhesive portion 10, and one or more cell culture portions 20 are arranged in the first cell non-adhesive portion 10.
  • a portion of the cell culture substrate 1 on which the first cell non-adhesive portion 10 and the cell adhesive portion 20 are arranged on the surface is referred to as a “support substrate 30”.
  • the characteristics of the cell culture substrate and the method for producing the same are described in the present specification, particularly in the above ⁇ 2.
  • the thickness of the first cell non-adhesive portion 10, the second cell non-adhesive portion (center portion) 21, the cell adhesive portion 22 and/or the step between them is sufficiently small with respect to the size of the cell structure 101. Therefore, in FIG. 33(B), the surface S of the supporting base material 30 including the first cell non-adhesive portion 10, the second cell non-adhesive portion (central portion) 21, and the cell adhesive portion 22 is flat. Shown as a plane.
  • the cell structure 101 including small intestinal epithelial cells has the following structure when the cell structure-holding base material 100 is viewed along the normal direction of the surface S: It exists at a position at least overlapping with the cell adhesion portion 22.
  • the stem cells When the stem cells are seeded on the cell culture substrate 1 and the cells are cultured, the stem cells adhere to the cell adhesion portion 22 and proliferate to form an agglutination portion in which the cells are densely aggregated. Then, the cells at the agglutination portion are differentiated into small intestinal epithelial cells expressing the marker of trophectoderm cells at the agglomeration portion of the formed cells to form the cell structure 101 shown in FIG.
  • the small intestinal epithelial cells existing at the position overlapping the cell adhesion part 22 when the cell structure holding substrate 100 is viewed along the normal direction of the surface S are selected from CDX2, cytokeratin 7 and E-cadherin 1 It is preferable that the cells express the above markers.
  • the cell structure holding substrate 100 includes a cell culture substrate 1 and a cell structure 101 containing small intestinal epithelial cells, and the cell structure 101 containing small intestinal epithelial cells has a surface S.
  • the cell structure-holding base material 100 is viewed along the normal direction, the cell structure-holding base material 100 exists at a position overlapping with the cell adhesion portion 22 and the cell non-adhesion portion (central portion) 21.
  • the features of the cell culture substrate 1 are the same as those of the embodiment shown in FIG. 33, and the description thereof will be omitted.
  • the surface S of the supporting base material 30 including the first cell non-adhesive portion 10, the second cell non-adhesive portion (central portion) 21, and the cell adhesive portion 22 is a flat plane. Show as.
  • the cell adhesion part 22 is covered with a cell structure 101 containing small intestinal epithelial cells.
  • the cell non-adhesive portion (central portion) 21 is covered with the cells that have migrated from the cell structure 101 on the cell adhesive portion 22, and the cell non-adhesive portion (central portion) 21 and the cell adhesive portion 22 are removed.
  • the covering cell structure 101 is formed.
  • the cell structure 101 in the embodiment shown in FIG. 34 preferably overlaps with the cell non-adhesive part (central part) 21 when the cell structure holding substrate 100 is viewed along the normal direction of the surface S.
  • a large number of small intestinal epithelial cells are contained in the position 101a overlapping the cell adhesion portion 22 as compared with 101b.
  • This uses the cell structure 101 adhered on the cell culture substrate 1 with antibodies against markers of small intestinal epithelial cells (eg one or more markers selected from CDX2, cytokeratin 7 and E-cadherin). It can be confirmed by immunostaining and observing.
  • the small intestinal epithelial cells in the mRNA of the cell sample collected from the position 101a overlapping the cell adhesion portion 22 of the cell structure 101 The amount of the marker mRNA is compared with the amount of the marker intestinal epithelial cell marker mRNA in the mRNA of the cell sample collected from the position 101b overlapping with the cell non-adhesive portion (central portion) 21 of the cell structure 101, and the former is the latter.
  • the cell structure 101 in the embodiment shown in FIG. 34 preferably overlaps with the cell non-adhesive part (central part) 21 when the cell structure holding substrate 100 is viewed along the normal direction of the surface S.
  • 101b contains nerve cells and muscle cells, and more preferably contains a large number of nerve cells and muscle cells at a position 101b overlapping the cell non-adhesive portion (central portion) 21 rather than a position 101a overlapping the cell adhesion portion 22.
  • cell structure 101 in the embodiment shown in FIG. 34 preferably includes endoderm cells (including small intestinal epithelial cells), ectodermal cells and mesoderm cells, and has a bag-like structure. It is preferable to have ⁇ 4. Cell structure> It is more preferable to have the characteristics described in ⁇ 1.
  • the cell structure-holding substrate according to one or more embodiments of the present disclosure can be produced by seeding stem cells on the surface of a cell culture substrate and culturing.
  • Preferred embodiments of stem cells and culture conditions are the above ⁇ 1.
  • the cell culture substrate is It is preferable that the material is exposed to conditions in which the culturing and maturation of the cell structure are difficult to proceed to obtain a product for the cell structure holding substrate.
  • condition in which the culture and maturation of the cell structure are difficult to proceed include low temperature conditions and conditions in a medium or a buffer solution that does not contain a trophic factor or contains a low concentration.
  • a cell non-adhesive part which is a region where the surface of the glass substrate is coated with polyethylene glycol 400, inside and outside the annular pattern of the cell adhering part, was prepared.
  • the cell culture substrate is provided with a plurality of cell adhesion parts each having the annular pattern formed at intervals of 300 to 500 ⁇ m (see FIG. 1).
  • the cell adhesion part having a circular pattern is referred to as a “circular cell adhesion part”.
  • the cell culture substrate was prepared by the procedure described in Patent No. 5070565 (Patent Document 6) and Okochi et al., Langmuir Volume 25, pages 6947-6953, 2009 (Non-patent Document 19). The outline will be described below.
  • a photomask in which a titanium oxide photocatalyst was applied to the entire surface was prepared.
  • the photomask has a plurality of openings each having a shape corresponding to the ring-shaped cell adhesion portion having the above-mentioned size and formed at intervals of 300 to 500 ⁇ m, and has a circumference of about 1.5 cm and a width of 5 cm. The size one was used.
  • the illuminance of the exposure machine was measured in advance at a wavelength of 350 nm and used as a guide for setting the exposure time.
  • the photocatalytic layer of this photomask was brought into contact with the hydrophilic thin film on the substrate surface, and the photocatalyst layer was placed in the exposure machine so that light was irradiated from the photomask side.
  • the hydrophilic thin film on the substrate surface was partially oxidatively decomposed by exposing for 50 seconds with a mercury lamp having an illuminance of 350 nm and an illuminance of 20 mW/cm 2 .
  • This substrate was cut into a size of 25 mm ⁇ 15 mm and used as a cell adhesion substrate. Before being used for cell culture, the cell culture substrate was subjected to EOG sterilization for 22 hours.
  • the cell culture substrate was placed on the bottom of a 3.5 cm Petri dish (Corning), and vitronectin (Life Technologies) diluted 1/100 with phosphate buffered saline (PBS) was used for 30 minutes or more at room temperature. After contacting and coating, the plate was washed 3 times with PBS before use.
  • the cell culture substrate thus obtained has a sectional structure as shown in FIG.
  • Edom iPS cells by transiently expressing the Yamanaka 4 factor in cells obtained from menstrual blood using a Sendai virus vector (PLoS Genet. 2011 May; 7(5): e1002085. Published online 2011 May 26. doi: 10.1371/journal.pgen.1002085PMCID: PMC3102737).
  • Edom iPS cells were pre-grown in StemFit medium (Ajinomoto) in vitronectin-coated cell culture dishes (Corning). The grown cells were treated with EDTA (Invitrogen) diluted 1/1000 with PBS at 37° C.
  • Non-Patent Document 3 The XF hESC medium described in Non-Patent Document 3 was used as the medium.
  • Y27632 was added to the medium, but the medium was replaced the next day, and the medium was maintained without Y27632. From the 4th day onward, medium exchange was performed once every 3 to 4 days. During the culturing, the tissue spontaneously detached from the cell culture substrate was collected and maintained in another petri dish by suspension culture in the same medium.
  • FIG. 2 shows observation images of the culture on the first day, the sixth day, the eleventh day, and the eighteenth day of culturing when culturing using each cell culture substrate having a ring-shaped cell adhesion portion having a different inner diameter.
  • the magnification of the photograph on the first day of culture is higher than that of the other ones. It was observed that the cells first proliferated at the ring-shaped cell adhesion portion, and then the inner cell non-adhesion portion surrounded by the ring-shaped cell adhesion portion was covered with the grown cells.
  • Fig. 3 shows an observed image of the culture after 3 weeks of culture.
  • the observation image shown in FIG. 3 shows that the tissue having a bag-like structure was formed at a high rate by the culture on each cell culture substrate.
  • FIG. 4 shows an observed image of a tissue having a bag-like structure formed on a substrate having an inner diameter of 380 ⁇ m and having a ring-shaped cell adhesion portion (left is a photograph of the entire dish, right is an observed image of the tissue).
  • the white dot-like objects that can be seen in the dish are tissues having a bag-like structure.
  • the photograph on the right side of FIG. 4 is an image observed with a microscope of the structure having the bag-like structure obtained in this example.
  • the observation image of the tissue having a bag-like structure obtained in this example is obtained by culturing iPS cells in a similar medium, Uchida et al., JCI Insight Volume 2, e86492 2017, intestinal function. It is similar to the observation image of the bag-shaped tissue (intestinal organoid) having the above, and from the results of Examples 4 and 5 described later, the tissue having the bag-shaped structure obtained in this Example is also the intestinal organoid. It turns out that
  • tissue recovery rate The ratio of the collected tissue having a bag-like structure to the number of ring-shaped cell adhesions on the cell culture substrate (hereinafter sometimes referred to as “tissue recovery rate”) was 80% or more, which was a high yield. It was
  • Comparative Example 2 a cell culture substrate having the same structure as that of Comparative Example 1 was prepared except that each of the plurality of circular cell adhesion parts had a diameter of 282 ⁇ m.
  • the method for producing the cell culture substrate of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 is the same as the method for producing the cell culture substrate of Example 1, and the shape of the opening of the photomask may be appropriately changed according to the cell adhesion portion. Good.
  • Comparative Example 3 a glass substrate having no adhesive pattern was prepared.
  • FIG. 5 shows microscope observation images of the cultures of Comparative Examples 1, 2, and 3 on the respective substrates for 3 weeks after the start of culture.
  • Comparative Example 1 the start of peeling from the surface of the tissue having a bag-like structure was observed 3 to 4 weeks after the start of culture, and the tissue recovery rate was 4 to 5%. In Comparative Example 1, compared with Example 1, the culture period until exfoliation was long and the tissue recovery rate was low.
  • Comparative Example 2 a tissue having a bag-like structure was obtained 2 to 3 weeks after the start of culture, but many cell aggregates with dark observation images were obtained.
  • the tissue recovery rate of the tissue having the bag-like structure was 10% or less.
  • a tissue having a large bag-like structure which is formed by fusion of cultures in a plurality of adjacent circular patterns, is formed as shown by an arrow in "Comparative Example 2" in FIG. There were things.
  • Comparative Example 3 there were cases where one or two small bag-shaped structures were obtained, but it was necessary to grow cells on the entire surface of the substrate before formation of a tissue having a bag-shaped structure, It took one month or more, and the number of tissues having a bag-like structure to be formed was significantly smaller than that in the case of Example 1. In this case, the tissue recovery rate cannot be calculated because the number of patterns of the cell adhesion part is not defined.
  • the above results show that the tissue having a bag-like structure can be obtained in a short culture period by culturing iPS cells on a substrate having a plurality of cell adhesion portions each having a circular pattern, as in Example 1. In addition, it shows that the structure improvement rate is remarkably high.
  • Example 2 In order to carry out the follow-up observation of the pattern culture in Example 1, the following time-lapse observation was carried out.
  • a cell culture substrate having a plurality of ring-shaped cell adhesive parts having an inner diameter of 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m used in Example 1 was fixed on the bottom surface of a dish to prepare a device, which was used in the same manner as in Example 1. Edom iPS cells were seeded and cultured under the conditions.
  • Photographers were photographed every 12 hours from the 4th day to the 21st day of culture using BioStation (Nikon). The photographing operation was performed according to the attached manual, and the medium was exchanged once every 2 to 3 days.
  • FIG. 6 shows observation images of cells around one ring-shaped cell adhesion part at each of the 4th, 9th, 13th, and 20th days of culture. From this, it was confirmed that the cells first grew and stacked on a circular pattern, and then formed a bag-like structure by the 21st day of culture.
  • Example 3 An attempt was made to form a tissue with a bag-like structure using other cell types.
  • the SEES2 cell line of human ES cells was cultivated using the same cell culture substrate as in Example 1 having an annular cell adhesion portion with an inner diameter of 180 ⁇ m, 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m.
  • StemFit medium Alignment Co., Inc.
  • 1/1000 diluted rhLIF Wi-Fit medium
  • growth culture was carried out in a vitronectin-coated cell culture dish (Corning Co.).
  • the cells that were proliferated and cultivated were treated with Accutase (Life Technologies, Inc.) at 37° C. for 5 minutes to be separated and collected, and then seeded on the substrate and cultured in the same manner as in Example 1.
  • FIG. 7 shows observation images on the 1st and 7th days of the culture using each cell culture substrate and the culture using the cell culture substrate having an annular cell adhesion portion with an inner diameter of 280 ⁇ m, which was recovered after 3 weeks of culture.
  • the observation image of the tissue which has the opened bag-like structure is shown.
  • the observation image of the tissue having a bag-like structure and the tissue recovery rate were the same as in Example 1 using iPS cells.
  • a tissue having a bag-shaped structure can be efficiently prepared by culturing stem cells on a cell culture substrate containing a ring-shaped cell adhesion portion, and ES cells are used for the formation of such a tissue.
  • the iPS cells are used as in Example 1, the same occurs when the cells are present, indicating that the type of pluripotent stem cells does not matter.
  • Example 4 In order to examine the culture process in Example 1, cell culture was performed on the same cell culture substrate having an annular cell adhesion portion with an inner diameter of 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m as in Example 1, and the expression of the marker was examined by immunostaining. ..
  • the cell culture substrate provided with a ring-shaped cell adhesion portion having an inner diameter of 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m and the conditions for cell culture are as described in Example 1.
  • the cell culture substrate containing the tissue on the 4th day of culture, the 7th day of culture, or the 12th to 14th day of culture was fixed with 4% paraformaldehyde (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 20 minutes, washed with PBS, and then washed with 1%. After performing a blocking operation for 30 minutes at room temperature with PBS containing BSA and 0.1% Triton, the above-mentioned substrate was subjected to mouse IgG1-labeled anti-Cytokeratin 7 antibody (Abcam dilution ratio 1/500), mouse IgG3b-labeled anti-Oct3/4 antibody.
  • mouse IgG1-labeled anti-Cytokeratin 7 antibody Abcam dilution ratio 1/500
  • mouse IgG3b-labeled anti-Oct3/4 antibody mouse IgG3b-labeled anti-Oct3/4 antibody.
  • the substrate after the incubation was further washed with PBS three times, and then the cell nuclei of the cells on the substrate were stained with DAPI (Sigma, dilution ratio 1/1000) at room temperature for 10 minutes, then sealed, and confocal. It was observed under a microscope. The type of antibody was appropriately selected.
  • Fig. 8 shows an observation image on day 4 of culture. From this, it was suggested that at the stage of the 4th day of culture, Ki67-positive and Oct3/4-positive undifferentiated cells having a proliferative ability were present on the circular cell adhesion portion, and the aggregation portion could be formed. ..
  • Fig. 9 shows an observation image on day 7 of culture.
  • the observation image in the upper part of FIG. 9 shows that tissues in which Oct3/4-positive undifferentiated cells having pluripotency are mainly present inside and CDX2-positive cells are present at the outer periphery are formed.
  • the observation image in the lower part of FIG. 9 shows that the CDX2-positive cells were Cytokeratin7-positive trophectoderm cells.
  • the tissue formed by culturing pluripotent stem cells on the cell culture substrate having the ring-shaped cell adhesion part of Example 1 the part where the cells in the outer peripheral part form a particularly dense agglutination part is nourished. It was suggested that the cells consisted of ectodermal cells, and then expanded to infiltrate the undifferentiated cells inside.
  • a cell culture substrate having an annular cell adhesion portion having an inner diameter of 600 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m was prepared under the conditions described in Example 1.
  • Edom iPS cells were cultured under the conditions described in Example 1.
  • mouse IgG2a-labeled anti-E-cadherin antibody (BD Pharmingen dilution ratio 1/1000), which is an endoderm cell marker
  • Rabbit IgG-labeled anti- ⁇ III tublin antibody (Abcam dilution ratio 1/1000) as a nerve cell marker
  • mouse IgG2a-labeled anti-Smooth Muscle Actin antibody (SMA; Sigma dilution ratio 1/500) as a muscle cell marker
  • SMA mouse IgG2a-labeled anti-Smooth Muscle Actin antibody
  • FIGS. 27 and 28 The results are shown in FIGS. 27 and 28. From FIG. 27 and FIG. 28, that the bag-shaped cell structure containing E-cadherin-positive cells is induced in the outer peripheral portion, and the inside thereof (on the central portion of the circular pattern (cell non-adhesive portion)), It was confirmed that it was occupied by migrated nerve cells or muscle cells. From this, E-cadherin-positive cells constituting the outer periphery of the bag-shaped cell structure were induced on the ring-shaped cell adhesion part, and the cell-non-adhesive center part migrated to nerve cells, muscle cells, etc. It is considered to be covered by.
  • the bag-shaped cell structure seen in FIG. 28 is contracted more than the outer dimension of the ring-shaped cell adhesion portion. This contraction is considered to be an effect of cell migration and the like.
  • Example 5 In Example 1, the cells were cultured on a cell culture substrate having an inner diameter of 280 ⁇ m or an inner diameter of 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m, and the spontaneously detached tissue was recovered 3 to 4 weeks after the start of the culture, and another dish was collected.
  • the tissue having a bag-like structure obtained by suspension culture for 6 weeks after the start of culture was evaluated by immunostaining in order to examine the presence or absence of enterocytes and cells derived from the three germ layers in the tissue.
  • the tissue was fixed overnight using iPGell (GenoStaff) and 4% paraformaldehyde solution (Wako Pure Chemical Industries) according to the protocol attached to the product. After embedding the fixed tissue in paraffin, a tissue section with a thickness of 4 to 6 ⁇ m was prepared. Uchida et al., JCI Insight Volume 2 e86492
  • the antibody staining was performed by the method described in 2017. The antibody staining method is as follows.
  • Rabbit IgG labeled anti-CDX2 antibody (Abcam; dilution ratio 1/1000) and mouse IgG labeled anti-Villin antibody (SantaCruz Biotechnologies; dilution ratio 1/200), or mouse IgG labeled anti-Smooth Muscle Actin antibody ( Primary antibody staining was performed by incubating with Sigma; dilution ratio 1/500) or a rabbit IgG-labeled anti-PGP9.5 antibody (DAKO; dilution ratio 1/200) overnight at 4°C.
  • Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody and Alexa546-labeled anti-mouse IgG antibody (both Molecular Probes; dilution ratio 1/1000) diluted with PBS after washing the tissue section after primary antibody staining with PBS for 5 minutes 3 times Secondary antibody staining was performed by incubating at room temperature for 1 hour. The tissue section after the secondary antibody staining was washed with PBS three times for 5 minutes, and then the cell nuclei were stained with (DAPI; Sigma; dilution ratio 1/1000) and mounted.
  • FIG. 10 shows the results of staining of a tissue formed by culturing on a cell culture substrate having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m of a circular cell adhesion portion in Example 1 with anti-CDX2 antibody, anti-Villin antibody and DAPI. Show.
  • the results shown in FIG. 10 indicate that the tissue formed in Example 1 contains an intestinal epithelial tissue having a chorionic layer in which the cell nucleus is CDX2-positive and the epithelium is Villin-positive.
  • FIG. 10 shows the results of staining of a tissue formed by culturing on a cell culture substrate having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m of a circular cell adhesion portion in Example 1 with anti-CDX2 antibody, anti-Villin antibody and DAPI. Show.
  • the results shown in FIG. 10 indicate that the tissue formed in Example 1 contains an intestinal epithelial tissue having
  • Example 11 anti-smooth muscle actin (Smooth Muscle Actin) antibody and anti-PGP9.5 antibody of a tissue formed by culturing on a cell culture substrate having an inner diameter of 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m and having a ring-shaped cell adhesion portion in Example 1. And the results of staining with DAPI.
  • the results shown in FIG. 11 indicate that, in addition to endoderm-derived intestinal epithelial tissue, the tissue formed in Example 1 was mesoderm-derived smooth muscle actin-positive muscle tissue and ectoderm-derived PGP9.5-positive. It shows having nerve fiber-like tissue.
  • FIG. 10 and FIG. 11 indicate that the tissue formed in Example 1 contains the tissue derived from three germ layers.
  • Example 6 The following analysis was performed in order to examine the appropriate size of the ring cell adhesion part and the width of the adhesion part.
  • a cell culture substrate having annular cell adhesion parts having different inner diameters and widths was prepared by the same method as in Example 1, and Edom iPS cells were cultured by the same method as in Example 1, and a bag-shaped structure was visually evaluated.
  • ++ tissue having a bag-like structure is efficiently obtained
  • + differentiation of the tissue having a bag-like structure has occurred, but there is a large amount of exfoliation, or tissue generation is a comparative example, depending on the quality of the tissue. It is equivalent to 1 and slow), and-(tissue cannot be obtained because of cell exfoliation in the culture process or coating due to cell proliferation cannot be obtained).
  • FIG. 12 shows an observation image of a typical example.
  • FIG. 12 is an observation image on the 18th day of culturing on a cell culture substrate having a ring-shaped cell adhesion portion of each size.
  • the evaluation was “++” (left column)
  • the tissue having the bag-like structure was peeled off and could be collected within 3 weeks.
  • FIG. 13 also includes the analysis result contents in the first embodiment.
  • the inner diameter of the ring-shaped cell adhesion part is preferably 180 ⁇ m to 880 ⁇ m, more preferably 180 ⁇ m to 600 ⁇ m
  • the width of the ring-shaped cell adhesion part is preferably in the range of 30 ⁇ m to 400 ⁇ m, more preferably 40 ⁇ m. To 400 ⁇ m, particularly preferably 60 to 300 ⁇ m.
  • FIG. 14 shows an observed image of a tissue having a bag-like structure obtained by culturing on a cell culture substrate having an inner diameter of 580 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m of a cell adhesion part.
  • Example 7 The following examination was performed regarding the shape of the cell adhesion part.
  • the shape of the cell adhesion part in the examined cell culture substrate is as shown in FIGS. 15A, 15B, 15C and 15D.
  • Inner size is a rectangle with a long side of 600 ⁇ m and short side is 300 ⁇ m, and a cell adhesion part with a width of 50 ⁇ m
  • (15D) is 600 ⁇ m square with a side size of 50 ⁇ m and a cell adhesion part with a width of 50 ⁇ m.
  • the method is as described in Example 1.
  • FIGS. 16A, 16B, 16C, and 16D show observed images of cultures in which Edom iPS cells were cultured using the cell culture substrate having the cell adhesion parts having the shapes (15A) to (15D).
  • the tissue having a bag-like structure was obtained in a short period of time, as in the other examples.
  • the annular cell adhesion part in which (1/8) in the circumferential direction is missing in (15B) the missing part is covered with the proliferated cells, so that a complete annular cell adhesion part is formed over the entire circumference.
  • a tissue having a bag-like structure was formed.
  • the shape of the cell adhesion part is not particularly limited and does not necessarily have to be circular. Moreover, it suffices that a closed system is obtained by culturing, and the initial pattern does not necessarily have to be a closed pattern. Furthermore, since the intestinal structure was obtained also in the rectangular cell adhesion part surrounding the cell non-adhesion part, the cell non-adhesion part surrounded by the cell adhesion part may not have the same length and width, It was suggested that the cell non-adhesive portion surrounded by the cell adhesive portion may have an elliptical shape or a semicircular shape, for example.
  • Example 8 In Example 1, the cell non-adhesive part was formed by coating with polyethylene glycol. In this example, it was examined whether another compound was used instead of polyethylene glycol to obtain the same effect. Therefore, a cell culture substrate having a plurality of annular cell adhesion parts having an inner diameter of 280 ⁇ m or 380 ⁇ m and a width of 60 ⁇ m was produced by the following method.
  • the cell culture substrate in this example has a cross-sectional structure as shown in FIG. 1(B) as in Example 1.
  • Example 2 The same as in Example 1, the substrate was cut into a size of 15 mm ⁇ 25 mm and seeded with iPS cells for examination.
  • the film thickness of the Lipidure (registered trademark) coating forming the cell non-adhesive portion on the substrate was measured by a step gauge to find that it was 288 nm on average.
  • FIG. 17 shows observation images of the culture on each substrate on the 1st, 7th, and 11th days of culture. The magnification of the observed images on the first and seventh days of culture is higher than that on the 11th day of culture.
  • FIG. 18 shows a tissue having a bag-like structure obtained after culturing for 3 weeks.
  • Example 1 the surface of the substrate was coated with polyethylene glycol, which is a compound that suppresses cell adhesion, to form a cell non-adhesion part.
  • polyethylene glycol which is a compound that suppresses cell adhesion
  • Example 9 The characteristics of the tissue obtained by the cell culture on the cell culture substrate provided with the annular cell adhesion part were analyzed.
  • a cell culture substrate having an annular pattern and an annular pattern having an inner diameter of 800 ⁇ m and a width of 200 ⁇ m and produced by the procedure described in Example 1 was used as a substrate for the example.
  • Edom iPS cells were cultured using these substrates in the same procedure as in Example 1, and after adherent culture for 2 to 4 weeks, the medium adhered to the cell culture substrate was sprayed with a medium to forcefully detach it.
  • the tissue that had been subjected to suspension culture for 1 to 3 weeks after detachment was used for the following analysis.
  • Comparative Example 1 the tissue obtained in the above Comparative Example 1 (using a cell culture substrate having a plurality of circular cell adhesion parts having a diameter of 1500 ⁇ m) was similarly analyzed (referred to as Comparative Example 1).
  • Edom iPS cells were cultured in the same procedure as in Example 1 using the base material prepared by the procedure described in Example 1 with an annular cell adhesive section having an inner diameter of 600 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m as a cell adhesive section, A tissue was adhered for 1 month or more without being naturally detached, and the tissue was forcibly detached by spraying the medium, and the suspension culture was further carried out for 1 to 2 weeks, and the tissue was similarly analyzed (referred to as Comparative Example 4).
  • RNA concentration and purity were measured by Nanodrop. Uchida et al., JCI Insight, Volume 2, e86 492, 2017 It was performed by the method described in.
  • PCR Ready First Strand cDNA-Human Adult Normal Tissue Small Chain Intestine (BioChain) is used as the cDNA derived from the human small intestine whose site is not limited, and PCR ReadySaturalFir-FirstFir cDNA is derived from the human ileum.
  • the correction was performed by the value of GAPDH, the values of ABCB1 amount and ABCCG2 amount in the small intestine were each set to 1, and the ABCB1 amount and ABCCG2 amount in each tissue were calculated.
  • the amount ratio (ABCG2/ABCB1) was determined.
  • the value of GAPDH was similarly corrected, and the amount of Villin and the amount of CUBN in the ileum having the expression of CUBN were set to 1, and the amount of Villin and the amount of CUBN in each tissue were calculated, and the calculated amount of Villin and CUBN were calculated. From the amount of CUBN, the ratio of the amount of CUBN to the amount of Villin (CUBN/Villin) was determined.
  • FIG. 19 shows the average value of the ABCG2/ABCB1 ratio under each condition.
  • the notations in the graph mean the inner diameter (unit: ⁇ m)-width (unit: ⁇ m) of the ring-shaped cell adhesion portion, except for Comparative Examples 1 and 4.
  • the range of the ABCG2/ABCB1 ratio in Comparative Example 1 was 0.084 to 3.65, and the ABCG2/ABCB1 ratio of Comparative Example 4 was 0.44. From this result, the expression ratio of ABCG2 to ABCB1 is high in the tissue exfoliated relatively early obtained in the present disclosure, and the intestinal organoids described in Uchida et al., JCI Insight Volume 2 e86492 2017. It was suggested that tissues with different properties could be obtained. Further, it is considered preferable that the range of the ABCG2/ABCB1 ratio is larger than 90.
  • FIG. 20 shows the average value of the measurement results of CUBN/Villin.
  • the value range of CUBN/Villin is preferably in the range of 0.2 to 1.8.
  • Each tissue having a CUBN/Villin value in the above range does not have a fixed detachment time from the cell culture substrate and a suspension culture period, and is detached after 2 to 4 weeks of adherent culture and further suspended after detachment. It contains tissues that have been cultured for 1 to 3 weeks. This confirms that the tissues having the CUBN/Villin value in the above range are not limited to the tissues in the specific range in the period of the adherent culture and the period of the suspension culture.
  • Example 10 The following analysis was performed on the property change of the high cell density portion (aggregation portion) in the tissue.
  • the tissue obtained in the above Comparative Example 1 using a substrate having a circular cell adhesion portion with a diameter of 1500 ⁇ m was immunostained by the method described in Example 3.
  • the primary antibodies used were mouse IgG-labeled anti-Oct3/4 antibody (Santa Cruz Biotechnologies; dilution ratio 1/200) which is an undifferentiated marker and rabbit IgG-labeled anti-Ki67 antibody (Abcam; dilution ratio 1/500) which was a cell proliferation marker. ).
  • the primary antibody used here was a mouse IgG-labeled anti-CDX2 antibody (Biogenex; dilution ratio 1/500), and the secondary antibody was Alexa546-labeled anti-mouse IgG antibody. Cell nuclei were stained with DAPI.
  • FIG. 23 shows an observation image of the tissue on the 7th day of culture when Edom iPS cells were cultured according to the procedure of Example 1 on the substrate having a circular cell adhesion portion with a diameter of 1500 ⁇ m in Comparative Example 1.
  • the agglutination portion refers to a portion of the tissue adhered to the cell adhesion portion, which is surrounded by an ellipse in the left photograph of FIG.
  • the non-aggregated portion refers to a portion of the tissue adhered to the cell adhesion portion where cells are not dense as shown in the right photograph of FIG. 23 (in the case of the right photograph of FIG. 23, the entire tissue is the non-aggregated portion).
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • the primers used here are as follows. Oct3/4 (forward primer) 5'-CGAGGAATTTGCCAAGCTCTGA-3' (SEQ ID NO: 11) Oct3/4 (reverse primer) 5'-TTCGGGCACTGCAGGAACAAATTC-3' (SEQ ID NO: 12) GAPDH (forward primer) 5'-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3' (same as SEQ ID NO: 9) GAPDH (reverse primer) 5'-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3' (same as SEQ ID NO: 10)
  • the Oct3/4 expression level was determined as a correction value corrected by the GAPDH expression level for each of the agglutinated and non-aggregated samples. Then, when the expression level of Oct3/4 in the non-aggregated sample was set to 1, the relative value of the Oct3/4 expression level in the aggregated sample was determined.
  • Example 12 The following analysis was performed in order to investigate the properties of epithelial cells in the obtained intestinal organoid.
  • Edom iPS cells were cultured on a cell culture substrate in the same manner as in Example 1 to prepare a bag-shaped tissue (intestinal organoid).
  • immunostaining was performed by the method described in the same manner as the method described in Example 5 above.
  • the mouse IgG1-labeled anti-Cytokeratin 7 antibody (KRT7; Abcam, dilution ratio 1/500) and the rabbit IgG-labeled anti-CDX2 antibody used in Example 4 were used.
  • Fig. 25 The results are shown in Fig. 25. From FIG. 25, the CDX2-positive cells of epithelial cells in the saccular tissue also expressed KRT7. Furthermore, it was suggested that this property did not depend on the pattern shape, but was derived from CDX2-positive trophectoderm cells found in the agglutinates observed inside the pattern.
  • Example 13 The following analysis was performed in order to examine whether nerve cells migrate from the cell aggregates formed during the culture on the cell culture substrate having the pattern of cell adhesion portions.
  • Edom iPS cells were cultured under the same conditions as in Example 1.
  • a cell culture substrate having a plurality of circular cell adhesion parts with a diameter of 1500 ⁇ m used in Comparative Example 1 in consideration of the ease of collection work and the distinction between the agglutination part and the non-aggregation part. Wood was used.
  • the culture was observed under a stereomicroscope, and the formed cell aggregates were collected by a glass capillary and placed on a culture dish (AGC) with a diameter of 3.5 cm coated with Vitronectin. The seeds were sown again in an appropriate number of lumps.
  • APC culture dish
  • the XF hESC culture medium described in Non-Patent Document 3 was used as in Example 1. Then, after maintaining the culture for several days, the nerve cells were identified by immunostaining.
  • the dyeing method is the same as in Example 4.
  • the primary antibodies used were mouse IgG1 labeled anti-Nestin antibody (Sigma dilution ratio 1/500) and rabbit IgG labeled anti- ⁇ III tublin antibody (Abcam dilution ratio 1/1000).
  • FIG. 29 shows the results of immunostaining of the culture in which the agglutinate collected one week after the start of the culture was cultured again for 4 days.
  • the presence of nerve marker-positive cells was found at the outer periphery of the aggregate. That is, it is considered that the nerve cells are generated from the aggregation part.
  • Fig. 30 shows the results of immunostaining of the culture obtained by culturing the agglutinate collected 2 weeks after the start of the culture again for 1 day. At this time point, it was suggested that the nerve cells with high migration ability were contained in the aggregation part. It is presumed that the nerve cells having high migration ability may spread and cover the cell non-adhesive part (central part).
  • Example 14 The following studies were conducted in order to find out the conditions under which the cells and bag-shaped cell structures obtained on the cell culture substrate are maintained in a state of being adhered to the substrate without peeling.
  • Edom iPS cells were cultured under the same conditions as in Example 1, using the cell culture substrate prepared by the method described in Example 1 and provided with a plurality of annular cell adhesion portions having an inner diameter of 600 ⁇ m and a width of 100 ⁇ m.
  • Non-Patent Document 3 control, the same as that up to the 11th day
  • Hanks buffer solution containing calcium ion and magnesium ion HBSS(+), Nacalai Tesque, Inc.
  • a medium GF( ⁇ ) medium
  • bFGF trophic factors bFGF, hereglin, and IGF-1
  • XF-KSR Knockout Serum
  • FIG. 31 shows an observed image of the culture after 4 days of culture after the medium was replaced
  • FIG. 32 shows an observed image of the culture after 10 days of culture after the medium was replaced.
  • Cell detachment was observed in HBSS(+), which was unsuitable, whereas in the medium (GF(-) and 1% XF-KSR) from which trophic factors were removed, small bag-like structures and cells were It was confirmed that the material was maintained in an adhered state on the cell culture part.
  • a bag-shaped structure having a normal size and shape was observed at the stage of FIG. 32, which is 3 weeks after the start of culture, and it is considered that the culture itself was normal.

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Abstract

本開示の小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを備え、細胞培養部２０が、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを含む細胞培養基材１に幹細胞を播種すること、並びに、播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む。

Description

小腸上皮細胞を含む細胞構造物、その製造のための方法、及び、それを保持する基材
　本開示は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法に関する。
　本開示はまた、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を保持する基材に関する。
　胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等の多能性幹細胞は目的細胞に分化誘導することができ、再生医療の分野での応用が期待されている。多能性幹細胞を培養して分化誘導させ、ヒトの組織に近いオルガノイドと呼ばれる構造物を得る方法が研究されている。
　例えば、特許文献１では、胚性幹細胞から腸管上皮オルガノイドを作製する方法が記載されている。
　また非特許文献２にあるようにＴＮＦ－αを培地中に投与してオルガノイドから上皮以外の細胞を誘導する技術も確立されている。
　人工多能性幹細胞から小腸上皮細胞を分化誘導する他の方法としては、特許文献２に記載されている方法が挙げられる。
　一方、特許文献３及び非特許文献３には細胞接着部のパターンが形成された基材上で多能性幹細胞を培養し腸管組織を分化誘導する方法が記載されている。
ＷＯ２０１１／１４０４４１ 特許第６２９６３９９号公報 特許第６１５１０９７号公報 特開２０１２－１２０４４３号公報 特開２０１３－１７９９１０号公報 特許第５０７０５６５号公報
Workman et al., Nature Medicine 第23巻 49～59ページ 2017年 Hahn et al., Scientific Reports 第7巻2435 2017年 Uchida et al., JCI Insight 第2巻e86492 2017年 Lee et al., Stem Cell Reports 第6巻257～272ページ  2016年 Okeyo et al., Tissue Eng PartC 第21巻1105～1115ページ2015年 Golos et al., Placenta 第34S巻S56～S61ページ2013年 Chen et al., Biochemical and Biophysical Research Communications第436巻677～684ページ2013年 Kojima et al., Laboratory Investigation 第97巻1188～1200ページ2017年 Niwa et al., Nature Genetics 第24巻　372～376ページ  2000年 Onozato et al., Drug and Metabolism Disposition Epub ahead of print 2018年 角田ら　日本レーザー医学会誌　第28巻 355～361ページ　2008年 Mao et al., Pharmaceutical Research 第25巻 1244～1255ページ 2008年 Mustata et al., Cell Reports 第5巻 421～432ページ 2013年 Boyd, Placenta 第27巻S24～S26ページ 2013年 Han et al., Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology 第14巻 817-829ページ 2018年 Kabeya et al., Drug Metabolism and Disposition 第46巻 1411～1419ページ 2018年 Singh et al., Cell Stem Cell 第10巻 312～326ページ 2012年 Akutsu et al., Regenerative Therapy 第1巻 18～29ページ 2015年 Okochi et al., Langmuir　第25巻　6947～6953ページ 2009年
　腸は三胚葉（内胚葉、外胚葉、中胚葉）に由来する細胞を含む複雑な器官である。腸は、内胚葉に由来する小腸上皮細胞（腸細胞、杯細胞、内分泌細胞、刷子細胞、パネート細胞、M細胞等）、中胚葉に由来するリンパ組織、平滑筋細胞、カハール介在細胞、外胚葉に由来する腸管神経叢等が複雑に組み合わされて、分泌、吸収、蠕動運動等の機能を奏する。
　特許文献１記載の方法で得られた組織は小腸上皮細胞のみを含む。また胚性幹細胞からの分化誘導にアクチビンを使用しているがゆえにほぼ単一の胚葉由来の細胞、ここでは内胚葉由来細胞しかできてない。このため、中胚葉や外胚葉由来の他種細胞を含む腸組織を得るためには、他種細胞を、非特許文献１にあるように別途分化誘導する必要があった。また特許文献１記載の方法は、上皮分化誘導のためにマトリゲルに包埋して培養する工程を含み、この点からも生産性に課題があった。
　非特許文献２に記載の方法に関しても培養の手間が課題となっていた。
　特許文献２に記載の方法で得られた組織もまた、小腸上皮細胞のみを含むため、特許文献１に記載の方法と同様の課題があった。
　一方、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法によれば、単一の培養により腸管上皮組織のみならず筋組織や神経組織なども分化誘導することができる。この方法はまた、多くのパターンが形成された一つの基材上で同時に多くの腸管組織を培養することできるため、生産効率が高い。また生物由来物質を用いずに培養を達成しているため移植用途にも適用しやすい。
　しかしながら、特許文献３及び非特許文献３に記載の方法は、培養期間が長い、腸組織の収率が低いといった点で、均一性が求められる工業的生産への応用のためには、なお改善の余地があった。
　すなわち、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、比較的短い培養期間で、高収率で製造するための手段が求められていた。
　また、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究を目的とした試験に利用するのに適した形態の、小腸上皮細胞を含む細胞構造物は従来提供されていなかった。
　本開示は、以下の発明を包含する。
（１）細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
　前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
　播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
（２）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記細胞非接着部の周縁と前記細胞非接着部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１）に記載の方法。
（６）前記細胞接着部の、前記細胞非接着部の重心を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１）又は（５）に記載の方法。
（７）前記細胞非接着部の周縁と前記細胞非接着部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離Ｘの、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部の重心を通る直線に沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１）、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）第１の細胞非接着部と、
　前記第１の細胞非接着部中に配置された１以上の細胞培養部と
を含む表面を有する支持基材を含む細胞培養基材であって、
　前記１以上の細胞培養部の各々が、第２の細胞非接着部である中央部と、前記中央部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記中央部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
　播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
（９）前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（８）に記載の方法。
（１０）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）前記細胞接着部の内周上の前記中央部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記中央部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（８）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記中央部の周縁と前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（８）に記載の方法。
（１３）前記細胞接着部の、前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（８）又は（１２）に記載の方法。
（１４）前記中央部の周縁と前記中央部の重心を通る直線との２つの交点の間の距離Ｘの、前記細胞接着部の、前記中央部の重心を通る直線に沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（８）、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
　前記細胞構造物のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記相対値に対して、９０倍以上である、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
（１６）小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
　前記細胞構造物のＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＣＵＢＮの発現量の前記相対値が、Ｖｉｌｌｉｎの発現量の前記相対値に対して、０．２～１．８の範囲にある、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
（１７）前記発現量が、それぞれ、ｍＲＮＡ量に基づく発現量である、（１５）又は（１６）に記載の細胞構造物。
（１８）内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、（１５）～（１７）のいずれかに記載の細胞構造物。
（１９）細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
　前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材、並びに
　前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
を含む、細胞構造物保持基材。
（２０）前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、少なくとも前記細胞接着部と重なる位置に前記小腸上皮細胞が存在する、（１９）に記載の細胞構造物保持基材。
（２１）前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、前記細胞構造物が、前記細胞接着部及び前記細胞非接着部と重なり、
　前記小腸上皮細胞が、前記細胞非接着部と重なる位置よりも前記細胞接着部と重なる位置に多く存在する、（２０）に記載の細胞構造物保持基材。
（２２）前記細胞構造物が、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、（１９）～（２１）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２３）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、（１９）～（２２）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２４）前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、（１９）～（２３）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
（２５）前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離Ｘ’の、前記細胞接着部の、前記細胞非接着部を通る直線に沿った方向の幅Ｗ’に対する比Ｘ’／Ｗ’が、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である、（１９）～（２４）のいずれかに記載の細胞構造物保持基材。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－０１４７６６号の開示内容を包含する。
　本開示の方法によれば、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、比較的短い培養期間で、高収率で製造することができる。
　本開示の細胞構造物は腸オルガノイドとして、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に用いることができる。
　本開示の細胞構造物保持基材は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に利用する際の取り扱いが容易である。
図１は、実施例１、実施例８で用いた、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が支持基材の露出した表面である実施形態の模式図である。図１（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図１（Ｂ）は図１（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図２は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。 図３は、実施例１での、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養３週間の培養物の観察像を示す。 図４は、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。 図５は、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。 図６は、実施例２での、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。 図７は、実施例３での、内径の異なる細胞培養基材を用いた培養の培養物の培養１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図８は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養４日目の観察像を示す。 図９は、実施例４での、免疫染色した培養物の培養７日目の観察像を示す。 図１０は、実施例５での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。 図１１は、実施例５での、内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。 図１２は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。 図１３は、実施例６での、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養の評価結果を示す。 図１４は、実施例６での、内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図１５Ａは、実施例７で用いた、内寸が一辺２８０μｍ～３００μｍの正方形で、幅５０μｍ～６０μｍの細胞接着部を示す。 図１５Ｂは、実施例７で用いた、内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部を示す。 図１５Ｃは、実施例７で用いた、内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。 図１５Ｄは、実施例７で用いた、内寸が一辺６００μｍの正方形で、幅５０μｍの細胞接着部を示す。 図１６Ａは、図１５Ａに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｂは、図１５Ｂに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｃは、図１５Ｃに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１６Ｄは、図１５Ｄに示す形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いて幹細胞を培養した培養物の観察像を示す。 図１７は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を培養した培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。 図１８は、実施例８での、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で幹細胞を３週間培養して得られた袋状構造を有する組織の観察像を示す。 図１９は、実施例９で求めた各条件の細胞培養基板上で得た細胞構造物でのＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の平均値を示す。 図２０は、実施例９で求めた各条件の細胞培養基板上で得た細胞構造物でのＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎ比の平均値を示す。 図２１は、実施例１０での、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する細胞培養基材上でＥｄｏｍ　ｉＰＳ幹細胞を培養したときの、細胞接着部に接着した細胞の免疫染色の観察像である。 図２２は、実施例１０での、直径３．５ｃｍの細胞培養用ディッシュ（培養ディッシュ）、パターンの無いガラス基材（共に１．５ｃｍ×２．５ｃｍサイズ）（素ガラス）、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材（パターン基材）の各細胞培養基材上で、Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ幹細胞を培養したときの、基材上に接着した細胞の免疫染色の観察像である。 図２３は、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材上でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養７日目の組織の観察像を示す。 図２４は、実施例１１での、凝集部及び非凝集部の各試料について、Ｏｃｔ３／４の発現量を、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した補正値として求め、非凝集部の試料でのＯｃｔ３／４の発現量を１としたときの、凝集部の試料のＯｃｔ３／４の発現量の相対値を示す。 図２５は、実施例１２での免疫染色の結果を示す。 図２６は、複数の環状の細胞接着部を備える細胞培養基材の、細胞接着部が細胞接着層の表面である実施形態の模式図である。図２６（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図２６（Ｂ）は図２６（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図２７は、実施例４において、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養９日目の培養物の、神経細胞及び筋肉細胞の免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。 図２８は、実施例４において、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養したときの、培養９日目の培養物の、神経細胞及び腸上皮系内胚葉細胞の免疫染色の結果を示す写真である。スケールバーは１００μｍを示す。 図２９は、実施例１３における培養１週間後の凝集部を用いた検討結果を示す。スケールバーは４０μｍを示す。 図３０は、実施例１３における培養２週間後の凝集部を用いた検討結果を示す。スケールバーは４０μｍを示す。 図３１は、実施例１４における培地置換後の培養４日目の観察結果を示す。 図３２は、実施例１４における培地置換後の培養１０日目の観察結果を示す。 図３３は、細胞非接着部（中央部）及びそれを囲う環状の細胞接着部を有する細胞培養基材と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物とを含む細胞構造物保持基材の、前記細胞構造物が細胞接着部と重なる位置に存在する実施形態の模式図である。図３３（Ａ）は細胞構造物保持基材を、表面Ｓの法線方向に沿って見た平面図であり、図３３（Ｂ）は図３３（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図３４は、細胞非接着部（中央部）及びそれを囲う環状の細胞接着部を有する細胞培養基材と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物とを含む細胞構造物保持基材の、前記細胞構造物が細胞接着部及び前記細胞非接着部（中央部）と重なる位置に存在する実施形態の模式図である。図３４（Ａ）は細胞構造物保持基材を、表面Ｓの法線方向に沿って見た平面図であり、図３４（Ｂ）は図３４（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図３５は、複数の突出部の上面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３５（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３５（Ｂ）は図３５（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図３６は、複数の窪み部の底面のそれぞれに、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部とを含む細胞培養部を備える細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３６（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３６（Ｂ）は図３６（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。 図３７は、細胞非接着部（中央部）とその周囲を囲う細胞接着部と含む細胞培養部が１つの表面の全体を占める細胞培養基材の一実施形態の模式図である。図３７（Ａ）は細胞培養基材の平面図であり、図３７（Ｂ）は図３７（Ａ）におけるＡ－Ａ線に沿った断面模式図である。
＜１．幹細胞＞
　本開示で用いる幹細胞としては、小腸上皮細胞への分化能を有する幹細胞であればよいが、好ましくは、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞等）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞への分化能を有する幹細胞であり、より好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好適である。
　本開示において使用される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、好ましくは哺乳動物由来のＥＳ細胞であり、例えば、マウスなどのげっ歯類又はヒトなどの霊長類由来のＥＳ細胞などを使用することができる。特に好ましくは、マウス又はヒト由来のＥＳ細胞を使用する。ＥＳ細胞は、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株を指し、生体外にて、理論上すべての組織に分化する分化多能性を保ちつつ、ほぼ無限に増殖させることができる。ＥＳ細胞としては、例えば、その分化の程度の確認を容易とするために、Ｐｄｘ１遺伝子付近にレポーター遺伝子を導入した細胞を用いることができる。例えば、Ｐｄｘ１座にＬａｃＺ遺伝子を組み込んだ１２９／Ｓｖ由来ＥＳ細胞株又はＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンをもつＥＳ細胞ＳＫ７株などを使用することができる。あるいは、Ｈｎｆ３β内胚葉特異的エンハンサー断片制御下のｍＲＦＰ１レポータートランスジーン及びＰｄｘ１プロモーター制御下のＧＦＰレポータートランスジーンを有するＥＳ細胞ＰＨ３株を使用することもできる。また、国立成育医療研究センターの生殖・細胞医療研究部で樹立し、Akutsu H, et al. Regen Ther. 2015;1:18-29 に開示したＥＳ細胞株である、ＳＥＥＳ１、ＳＥＥＳ２、ＳＥＥＳ３、ＳＥＥＳ４、ＳＥＥＳ５、ＳＥＥＳ６又はＳＥＥＳ７や、これらのＥＳ細胞株に更なる遺伝子を導入した細胞株を使用することもできる。
　本開示において使用される人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。人工多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Ｒｕｄｏｌｆ　Ｊａｅｎｉｓｃｈ）らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームス・トムソン（Ｊａｍｅｓ　Ｔｈｏｍｓｏｎ）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Ｋｏｎｒａｄ　Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。例えば、国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。
　ｉＰＳ細胞の作製に用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。即ち、本開示で言う体細胞とは、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、又はヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。体細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞、肺胞上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。
　ｉＰＳ細胞は、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において外胚葉、中胚葉及び内胚葉への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、本開示におけるｉＰＳ細胞はマウスなどの試験動物に移植した場合にテラトーマを形成する能力を有する幹細胞でもよい。
　体細胞からｉＰＳ細胞を製造するためには、まず、少なくとも１種類以上の初期化遺伝子を体細胞に導入する。初期化遺伝子とは、体細胞を初期化してｉＰＳ細胞とする作用を有する初期化因子をコードする遺伝子である。初期化遺伝子の組み合わせの具体例としては、以下の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
（ｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子
（ｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、ＮＡＮＯＧ遺伝子、ＬＩＮ２８遺伝子
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０　ｌａｒｇｅＴ遺伝子
（ｉｖ）Ｏｃｔ遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子
＜２．細胞培養基材の細胞非接着部及び細胞接着部＞
　本開示で用いる細胞培養基材は、細胞培養部を含む表面を有する。
　そして、前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む。
　前記細胞培養部は、前記細胞培養基材の表面上に１以上含まれる。２以上の細胞培養部が含まれる場合、各々が前記特徴を備えていてもよい。
　前記細胞培養部中の前記細胞非接着部は、前記細胞培養部以外の部分に存在する細胞非接着部（後述する第１の細胞非接着部）と区別するために、「第２の細胞非接着部」或いは「中央部」と称する場合がある。
　すなわち、本開示で用いる細胞培養基材は、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部とが、所定の形状となるように形成されたものである。
　以下の説明では、本開示で用いる細胞培養基材の、細胞非接着部及び細胞接着部を含む細胞培養部以外の特徴を説明するために、前記細胞培養基材のうち前記細胞接着部以外の部分を指して「支持基材」と称する場合がある。すなわち、本開示の一以上の実施形態で用いる細胞培養基材は、前記一以上の細胞接着部を含む表面を有する支持基材を含む、ということができる。
　そこで先ず、支持基材の実施形態、並びに、細胞非接着部と細胞接着部の形状以外の特徴について以下に説明する。
　細胞培養基材に用いられる支持基材としては、その表面に、細胞非接着部と細胞接着部を形成することが可能な材料で形成された支持基材であれば特に限定されるものではない。具体的には、ガラス、金属、セラミック、シリコン等の無機材料、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を含む支持基材を挙げることができる。特に、ガラス基材を支持基材として用いることが好ましい。支持基材の形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状が挙げられる。
　本開示において「細胞接着性」とは、細胞を接着する強度、すなわち細胞の接着しやすさを意味する。「細胞接着部」とは細胞接着性が良好な表面上の領域を意味し、「細胞非接着部」とは、細胞の接着性が悪い表面上の領域を意味する。従って、細胞接着部と細胞非接着部とが所定のパターンで配置された表面上に細胞を播種すると、細胞接着部には細胞が接着するが、細胞非接着部には細胞が接着しないため、細胞培養基材の表面に細胞がパターン状に配列されることになる。
　「細胞接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を細胞培養基材に播種した際に接着する部分と定義され、「細胞非接着部」は、実際に培養する細胞、好ましくは幹細胞、を播種した際に接着しない部分と定義される。細胞培養基材に細胞を播種する際に、細胞培養基材の表面は、タンパク質等でコーティングされ、細胞接着性が高められた状態であってもよい。「幹細胞」の具体例は本明細書に記載の通りである。細胞非接着部は、細胞接着部に接着し増殖した細胞により被覆されてもよい。
　細胞接着部であるか細胞非接着部であるかを判断する指標として、実際に細胞培養した際の細胞接着伸展率を用いることができる。細胞接着性を有する細胞接着部の表面は、細胞接着伸展率が６０％以上の表面であることが好ましく、細胞接着伸展率が８０％以上の表面であることが更に好ましい。細胞接着伸展率が高いと、効率的に細胞を培養することができる。本開示における細胞接着伸展率は、播種密度が４０００　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上３００００　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２未満の範囲内で培養しようとする細胞を測定対象表面に播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％のインキュベータ内に保管し、１４．５時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合（｛（接着している細胞数）／（播種した細胞数）｝×１００（％））と定義する。
　上記測定において、細胞の播種は、１０％ＦＢＳ入りＤＭＥＭ培地に懸濁させて測定対象表面上に播種し、その後、細胞ができるだけ均一に分布するよう、細胞が播種された測定対象表面をゆっくりと振とうすることにより行うものである。さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。細胞接着伸展率の測定では、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所（例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁）を除いた箇所を測定箇所とする。
　細胞接着部は、支持基材の表面に細胞接着層が形成された領域であってもよいし、支持基材の表面が細胞接着性である場合（例えばガラス基材の表面）は、支持基材の表面が露出した領域であってもよいが、好ましくは、支持基材の細胞接着性の表面が露出した領域である。細胞非接着部は、支持基材の表面に細胞非接着層が形成された領域であることができる。細胞接着部および細胞非接着部は、種々の材料や方法により形成可能である。好ましくは、細胞非接着部は、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層等の細胞非接着層により被覆された部分である。細胞非接着部を構成する細胞非接着層の平均厚さは、特許文献４に記載されているように、０．８ｎｍ～５００μｍが好ましく、０．８ｎｍ～１００μｍがより好ましく、１ｎｍ～１０μｍがより好ましく、１．５ｎｍ～１μｍが最も好ましい。平均厚さが０．８ｎｍ以上であれば、タンパク質の吸着や細胞の接着において、支持基材の細胞非接着層で覆われていない領域の影響を受けにくいため好ましい。また、平均厚さが５００μｍ以下であればコーティングが比較的容易である。特に、特許文献５に記載されているように、細胞非接着層を、ポリエチレングリコールの層により形成する場合、その膜厚の一例として５ｎｍ～１０ｎｍが例示できる。親水性有機化合物の具体例は、後述する通りである。
　細胞非接着層として親水性ポリマーとしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む細胞培養基材の製造方法としては、特許文献４及び非特許文献１０に記載された方法を用いることができる。
　細胞接着部および細胞非接着部の形成方法の特に好ましい形態として、以下の２つの形態が挙げられる。
　第１の形態では、支持基材の表面に細胞非接着層を形成し、次いで、細胞非接着層の一部に所定の処理を施し、細胞接着性を発現させて細胞接着部とする形態である。具体的には、支持基材の表面に、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む細胞非接着性の親水性膜を細胞非接着層として形成し、次いで、細胞非接着層である前記親水性膜の一部を選択的に、酸化処理及び／又は分解処理を施して、前記一部を、細胞接着性を有する細胞接着部に改質する例が挙げられる。この形態では細胞非接着性の親水性膜を形成し、次いで、細胞の接着が望まれる部位に対して、酸化処理及び／又は分解処理を施すことにより、当該部位を、細胞接着性を有する部位に転換して細胞接着部とする。第１の形態により形成された細胞培養基材では、細胞非接着部が、支持基材の表面が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層により被覆された部分であり、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理により除去されて支持基材の表面が露出した部分、或いは、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を含む層が酸化処理及び／又は分解処理を受けて細胞接着性に改質された層（＝細胞接着層）により被覆された部分である。
　第２の形態は、支持基材の表面上での有機化合物の密度の高低によって細胞接着部および細胞非接着部とする形態である。第２の形態により形成された細胞培養基材では、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が高い表面である形態である。第２の形態は、親水性ポリマー等の親水性有機化合物を高密度で含む支持基材の表面が細胞非接着性を有するのに対して、前記化合物の密度が低い支持基材の表面が細胞接着性を有することを利用したものである。支持基材表面に前記化合物が結合しやすい第１領域と結合しにくい第２領域とを設け、該基材表面に前記化合物の膜を形成すると、第１領域は細胞非接着部となり、第２領域は細胞接着領域となる。或いは、支持基材表面の一部をフォトレジスト等で選択的にマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成することができる。
　また、上記の形態に限らず、細胞非接着性の表面（細胞非接着性層の表面であってよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をコラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質をパターニングして被覆し、細胞接着性のパターンを形成してもよい。或いは、細胞接着性の表面（細胞接着性層の表面であってもよい）を有する支持基材を用意し、前記表面の一部をシリコーンゴム（例えば三菱ケミカル製　珪樹（登録商標））等の細胞非接着性の樹脂により被覆し、残部を細胞接着性のパターンとしてもよい。或いは、表面に所定のパターンの導電性層が設けられた支持基材を用意し、該支持基材の表面に細胞非接着性層を積層し、前記導電性層への電圧印加により、前記導電性層上を被覆する前記細胞非接着性層を剥離させて、露出した前記導電性層を細胞接着部としてもよい（具体的には特開２０１２－１２０４４３号公報、特開２０１３－１７９９１０号公報参照）。
　以下では、支持基材表面上に細胞接着部と細胞非接着部を形成して、細胞接着部と細胞非接着部とを含む表面を有する細胞培養基材を製造する上記の第１の形態及び第２の形態について、順に説明する。
　まず、第１の形態について説明する。
　第１の形態では、まず、支持基材表面に、細胞非接着層として、親水性有機化合物、好ましくは親水性ポリマー、を含む親水性膜を設ける。当該親水性膜は、水溶性や水膨潤性を有する薄膜であり、酸化及び／又は分解される前は細胞非接着性を有し、酸化及び／又は分解された後の支持基材の露出した表面、或いは、酸化処理及び／又は分解処理を受けて改質された薄膜の表面が細胞接着性を呈するものであれば特に限定されない。
　細胞非接着層が、親水性有機化合物により形成される親水性膜である場合、支持基材の表面と親水性膜との間には、必要に応じて結合層を設けることが好ましい。結合層は、親水性膜の前記有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を有する材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する結合性官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ－ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性有機化合物によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。細胞非接着層における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。
　親水性有機化合物としては、親水性ポリマー（親水性オリゴマーを包含する）、水溶性有機化合物、界面活性物質、両親媒性物質等が挙げられ、親水性ポリマーが特に好ましい。
　具体的な親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール、リン脂質極性基を有する両性イオンポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルアルコール、多糖類等を挙げることができる。親水性ポリマーのこれらの具体例は、その誘導体の形態のものも包含する。親水性ポリマーの分子形状は、直鎖状、分岐を有するもの、デンドリマー等を挙げることができる。
　ポリアルキレングリコールとしては具体的には、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１０８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７等が好ましい。
　リン脂質極性基を有する両性イオンポリマーとしては具体的には、ポリ（メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリン）（＝ＭＰＣポリマー）、メタクリロイルオキシエチルフォスフォリルコリンとアクリルモノマーの共重合体等が好ましい。
　ポリアクリルアミドとしては具体的にはポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）が例示できる。
　ポリメタクリル酸としては具体的にはポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）が例示できる。
　多糖類としては具体的にはデキストラン、ヘパリン等が例示できる。
　細胞非接着層を備える支持基材の表面は、細胞非接着層により被覆された状態では高い細胞非接着性を有し、細胞非接着層の酸化処理及び／又は分解処理後には、露出した支持基材の表面が、或いは、細胞非接着層が酸化処理及び／又は分解処理により改質されて形成される層の表面が細胞接着性を示すものであることが望ましい。
　親水性ポリマーとしては特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましい。ＰＥＧは、１つ以上のエチレングリコール単位（（ＣＨ２）２－Ｏ）からなるエチレングリコール鎖（ＥＧ鎖）を少なくとも含むが、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。エチレングリコール鎖は、例えば、次式：
－（（ＣＨ２）２－Ｏ）ｍ－
（ｍは重合度を示す整数である）
で表される構造を指す。ｍは、好ましくは１～１３の整数であり、より好ましくは１～１０の整数である。
　ＰＥＧにはエチレングリコールオリゴマーも包含される。また、ＰＥＧには、官能基が導入されたものも包含される。官能基としては、例えば、エポキシ基、カルボキシル基、Ｎ－ハイドロキシスクシイミド基、カルボジイミド基、アミノ基、グルタルアルデヒド基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。官能基は、場合によりリンカーを介して、好ましくは末端に導入されたものである。官能基が導入されたＰＥＧとして、例えば、ＰＥＧ（メタ）アクリレート、ＰＥＧジ（メタ）アクリレートが挙げられる。
　細胞接着部は、支持基材の表面に形成された親水性有機化合物を含む細胞非接着層に酸化処理及び／又は分解処理を施して、細胞接着性を有する支持基材の表面を露出させる、或いは、細胞非接着層を改質して細胞接着層に転換することで形成することができる。
　本開示において「酸化」とは狭義の意味であり、有機化合物が酸素と反応して酸素の含有量が反応以前よりも多くなる反応を意味する。
　本開示において「分解」とは有機化合物の結合が切断されて１種の有機化合物から２種以上の有機化合物が生じる変化を指す。「分解処理」としては典型的には、酸化処理による分解、紫外線照射による分解などが挙げられるがこれらには限定されない。「分解処理」が酸化を伴う分解（つまり酸化分解）である場合、「分解処理」と「酸化処理」とは同一の処理を指す。また細胞非接着層を分解して除去することも「分解処理」に含まれる。
　紫外線照射による分解とは、有機化合物が紫外線を吸収し、励起状態を経て分解することを指す。なお、有機化合物が、酸素を含む分子種（酸素、水など）とともに存在している系中に紫外線を照射すると、紫外線が化合物に吸収されて分解が起こる以外に、該分子種が活性化して有機化合物と反応する場合がある。後者の反応は「酸化」に分類できる。そして活性化された分子種による酸化により有機化合物が分解する反応は、「紫外線照射による分解」ではなく「酸化による分解」に分類できる。
　以上のように「酸化処理」と「分解処理」は操作としては重複する場合があり、両者を明確に区別することはできない。そこで本明細書では「酸化処理及び／又は分解処理」という用語を使用する。
　次に、第２の形態について説明する。第２の形態により形成される細胞培養基材では、支持基材の表面のうち、細胞接着部が、親水性ポリマー等の親水性有機化合物の密度が低い（親水性有機化合物を含まない場合も包含する）表面であり、細胞非接着部が、親水性有機化合物の密度が高い表面である。すなわち、細胞接着部と細胞非接着部とは、親水性有機化合物の密度が相違する。同密度が高いほど細胞は接着しにくくなる傾向がある。細胞接着部では、親水性有機化合物の密度が、細胞が接着できる程度に低い。親水性有機化合物及び親水性ポリマーの好ましい例は第１の形態について既述の通りである。
　第２の形態では、細胞接着部及び細胞非接着部を、密度を制御した親水性膜により形成する場合には、支持基材との密着性を高めるために支持基材上に必要に応じて結合層を形成し、次いで親水性有機化合物からなる親水性膜を形成するのが好ましい。結合層は、親水性有機化合物が有する官能基と結合可能な官能基（結合性官能基）を含む材料を含む層であることが好ましい。結合層の材料が有する官能基と、親水性有機化合物が有する官能基との組み合わせとしては、エポキシ基と水酸基、フタル酸無水物と水酸基、カルボキシル基とＮ－ハイドロキシスクシイミド、カルボキシル基とカルボジイミド、アミノ基とグルタルアルデヒド等が挙げられる。それぞれの組み合わせにおいて、いずれが結合層側の官能基であってもよい。これらの方法においては、親水性材料によるコーティングを行う前に、支持基材上に、所定の官能基を有する材料により結合層を形成する。結合層における前記材料の密度は結合力を規定する重要な因子である。前記密度は、結合層の表面における水の接触角を指標として簡便に評価することができる。なお、水接触角は、協和界面科学社製  ＣＡ－Ｚを用い、マイクロシリンジから純水を滴下して３０秒後に測定した値である。
　細胞接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は低い。細胞接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合層を構成する結合性官能基を有する材料として、エポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には、１０°～４３°、望ましくは１５°～４０°である。このような結合層を形成する方法としては、結合性官能基を有する材料の被膜（結合層）を支持基材の表面に形成した後、当該結合層の表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法が挙げられる。結合層表面を酸化処理及び／又は分解処理する方法としては、結合層表面を紫外線照射処理する方法、光触媒処理する方法、酸化剤で処理する方法などが挙げられる。結合層表面の全面を酸化処理及び／又は分解処理してもよいし、部分的に処理してもよい。部分的な処理は、フォトマスクやステンシルマスク等のマスクを用いたり、スタンプを用いるたりすることにより行うことができる。また、紫外線レーザー等のレーザーを用いた方式等の直描方式で酸化処理及び／又は分解処理を施してもよい。諸条件などについても、親水性膜の酸化処理及び／又は分解処理により細胞接着部を形成する方法の場合と同様の条件を適用できる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞接着部が形成できる。
　細胞非接着部の結合層における、結合性官能基を有する材料の密度は高い。細胞非接着部における、親水性有機化合物の薄膜を形成する前の結合層の表面の水接触角は、結合性官能基を有する材料としてエポキシ基を末端に有するシランカップリング剤を使用する場合を例にとると、典型的には４５°以上、望ましくは４７°以上である。このような結合層は、結合性官能基を有する材料の被膜を支持基材の表面に形成することにより得られる。結合層表面を部分的に酸化処理及び／又は分解処理した場合には、処理を受けない残余の部分が前記水接触角を有する結合層となる。こうして形成された結合層上に親水性有機化合物の薄膜を形成することにより、細胞非接着層が形成できる。
　第２の形態ではまた、支持基材表面の一部を選択的に感光性フォトレジスト等によりマスキングし、マスキングされていない領域に前記親水性有機化合物の膜を形成して細胞非接着部を形成し、その後マスキングを除去して支持基材の表面を露出させることで細胞接着部を形成してもよい。
　続いて、上記の第１の形態又は第２の形態、或いは他の方法により形成された細胞接着部と細胞非接着部の特徴について更に説明する。
　細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）の炭素量と比較して低いことが好ましい。具体的には、細胞接着部の炭素量が、細胞非接着部の炭素量に対して２０～９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「炭素量（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。
　また、細胞接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値は、細胞非接着部（結合層が存在する場合には結合層も含む）における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して小さい値であることが好ましい。具体的には、細胞接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値が、細胞非接着部における炭素のうちで酸素と結合している炭素の割合（％）の値に対して３５～９９％であることが好ましい。この範囲内に該当することは、親水性膜の厚さ（結合層が存在する場合には結合層の厚さと親水性膜の厚さの合計）が１０μｍ以下の場合に特に好適である。「酸素と結合している炭素の割合（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）」は下記に定義する通りである。
　細胞接着部及び細胞非接着部に含まれる親水性有機化合物層（結合層が存在する場合には結合層も含む）の評価手法としては、接触角測定、エリプソメトリー、原子間力顕微鏡観察、電子顕微鏡観察、オージェ電子分光測定、Ｘ線光電子分光測定、各種質量分析法などを用いることができる。これらの手法の中で、最も定量性に優れているのはＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）である。この測定方法で求められるのは相対的定量値であり、一般的に元素濃度（ａｔｏｍｉｃ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、％）で算出される。以下、本開示におけるＸ線光電子分光分析方法を詳細に説明する。
　細胞接着部及び細胞非接着部の「炭素量」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる炭素量」と定義される。また、本開示において細胞接着部及び細胞非接着部の「酸素と結合している炭素の割合」は、「Ｘ線光電子分光装置を用いて得られるＣ１ｓピークの解析値から求められる酸素と結合している炭素の割合」と定義される。具体的な測定は、特開２００７－３１２７３６に記載されるとおりに実施できる。
＜３．細胞培養基材の細胞培養部の形状の特徴＞
　本開示で用いる細胞培養基材の特徴について主に図１を参照して説明する。
　本開示で用いる細胞培養基材１は、
　細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。
　そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部（中央部）２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図１では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。本実施形態は、細胞培養基材１の表面Ｓ上に細胞培養部２０が１以上含まれ、１以上の細胞培養部２０の各々が、上記の特徴を有する例である。
　図１に示す例では、１以上の細胞培養部２０は、細胞非接着部１０中に島状に点在している。この例では、細胞非接着部１０を「第１の細胞非接着部」と称し、細胞接着部２０の細胞非接着部２１を「第２の細胞非接着部」と称する場合がある。また、以下の説明では「細胞非接着部２１」を「中央部２１」或いは「細胞非接着部である中央部２１」と称する場合がある。第１の細胞非接着部１０は必須の構成ではなく、第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の例は図３５～３７を参照して別途説明する。
　また、細胞培養基材１のうち、第１の細胞非接着部１０及び細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
　図１に示す例では、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部である中央部２１は、支持基材３０の表面上に積層された第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａの表面である。
　図１に示す例では、細胞接着部２２は、露出した支持基材３０の表面である。なお図２１に示す例のように、細胞接着部２２は、支持基材３０の表面上に積層された細胞接着層２２Ａの表面であってもよい。
　図１（Ｂ）及び図２１（Ｂ）では、説明の便宜上、細胞非接着層１０Ａ、細胞非接着層２１Ａ及び細胞接着層２２Ａの厚さ、並びに、細胞接着部２２と、細胞非接着層１０Ａ又は細胞非接着層２１Ａとの段差を強調して示しているが、培養される細胞及び細胞構造物の寸法に対して、前記厚さ及び段差は十分に小さいため、１以上の細胞培養部２０を含む表面Ｓは実質的に平坦な表面として細胞を支持することができる。
　図１（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。同様に、図２６（Ｂ）では、支持基材３０と、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着層２２Ａとは直接接している例を示しているが、既述のように結合層が間に介在していてもよい。
　支持基材３０、第１の細胞非接着部１０、第１の細胞非接着層１０Ａ、第２の細胞接着部２１、第２の細胞非接着層２１Ａ、細胞接着部２２、細胞接着層２２Ａの具体例及び製造方法は既述の通りである。
　本発明者らは驚くべきことに、このような構造の細胞培養基材１上で幹細胞を培養するとき、細胞非接着部（中央部）２１を囲う細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖することで細胞が密に凝集した凝集部が形成され、形成された細胞の凝集部において栄養外胚葉細胞のマーカーを発現する腸上皮細胞に分化でき袋状の細胞構造物（組織）が形成され易いことを見出した。得られた細胞構造物は、小腸上皮細胞を含み、腸オルガノイドとしての機能を有する。上記構造の細胞培養基材を用いて幹細胞の分化誘導を行うと、小腸上皮細胞を含む細胞構造物が比較的短時間で細胞培養基材から遊離し回収することができ、しかも、回収効率が極めて高いことを本発明者らは見出した。
　細胞培養部２０の形状及び寸法は特に限定されないが、好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘが、８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下である。距離Ｘが小さすぎると、増殖培養時に栄養外胚葉細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘが大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘが上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記距離Ｘは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても距離Ｘは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は距離Ｘは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）距離Ｘが上記範囲である。
　細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、細胞接着部２２の、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌに沿った方向の幅Ｗが、３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗが小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗは大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗは４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗが大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記幅Ｗは、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌをどのようにとっても幅Ｗは同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗは、直線Ｌが対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌが短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）幅Ｗが上記範囲である。
　細胞培養部２０の別の好ましい実施形態では、中央部２１の周縁Ｐと、中央部２１の重心Ｃを通る直線Ｌとの二つの交点Ａ１、Ａ２の間の距離Ｘの、細胞接着部２２の前記直線Ｌに沿った方向の幅Ｗに対する比Ｘ／Ｗが、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ／Ｗが上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌに対して）前記比Ｘ／Ｗが上記範囲である。
　上記の重心Ｃ、距離Ｘ、幅Ｗ、直線Ｌの代わりに下記の中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’により細胞接着部２２の形状及び寸法を規定することができる。中間点Ｃ’、距離Ｘ’、幅Ｗ’、直線Ｌ’について図１５Ａ及び図１５Ｂを参照して説明する。細胞接着部２２の内周Ｑ上の、中央部２１を間に介して対向する最も離れた二つの点Ａ３，Ａ４の中間点Ｃ’を通る直線を直線Ｌ’とする。この直線Ｌ’と、細胞接着部２２の内周Ｑとの２つの交点Ａ５，Ａ６の間の距離を距離Ｘ’とする。また、細胞接着部２２の、中間点Ｃ’を通る直線Ｌ’に沿った方向の幅を幅Ｗ’とする。
　前記距離Ｘ’は、好ましくは８０μｍ超８８０μｍ以下であり、より好ましくは、１８０μｍ以上８８０μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上６００μｍ以下、特に好ましくは１８０μｍ以上５００μｍ以下である。距離Ｘ’が小さすぎると、増殖培養時に細胞によりすぐに中央部２１が被覆されてしまい、細胞構造物の外周部に特異的な袋状構造が得られにくい。一方、距離Ｘ’が大きすぎると、細胞が増殖して中央部２１を完全に被覆するまでの時間が長時間になるため、細胞構造物の生産効率が低下する。距離Ｘ’が上記の範囲にあるとき、袋状構造の細胞構造物を比較的短時間で高収率で培養することができる。前記距離Ｘ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても距離Ｘ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は、距離Ｘ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）距離Ｘ’が上記範囲である。
　前記幅Ｗ’は、好ましくは３０μｍ超４００μｍ以下であり、より好ましくは４０μｍ以上４００μｍ以下であり、特に好ましくは６０μｍ以上３００μｍ以下である。幅Ｗ’が小さすぎると培養中に細胞が剥離し易いという問題がある。また、袋状の細胞構造物の誘導のためには、細胞接着部２２の幅方向に複数個の細胞が接着して凝集部を形成することが望ましく、そのためには幅Ｗ’は大きいほうが好ましいことから、上記の通り幅Ｗ’は４０μｍ以上が好ましく、６０μｍ以上がより好ましい。一方、幅Ｗ’が大きすぎると、細胞接着部２２に接着した細胞の密度の偏りが生じ易く、幅方向に均一な細胞の凝集部が形成され難くなり、均一な構造の細胞構造物が得られにくい。幅Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。前記幅Ｗ’は、中央部２１の形状が図１及び図１５Ｂに示すように円である場合は円の直径方向の細胞接着部２２の幅を指し、円が真円である場合は、直線Ｌ’をどのようにとっても幅Ｗ’は同じである。図１５Ａ、１５Ｃ、１５Ｄに示すように中央部２１が矩形である場合は幅Ｗ’は、直線Ｌ’が対角線方向の場合に最大になり、直線Ｌ’が短手方向の場合に最小になる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）幅Ｗ’が上記範囲である。
　比Ｘ’／Ｗ’は、好ましくは０．５以上、より好ましくは１．０以上、より好ましくは１．３以上であり、好ましくは２０．０以下、より好ましくは１５．０以下、より好ましくは１０．０以下である。前記比Ｘ’／Ｗ’が上記の範囲にあるとき、細胞構造物を比較的短時間に高収率で培養することができる。本開示では好ましくは、全周に亘り（すなわち全ての直線Ｌ’に対して）前記比Ｘ’／Ｗ’が上記範囲である。
　図１及び図１５Ｂでは、中央部２１が円形であり、細胞接着部２２が円形の中央部２１を同心円的に囲う環状形状であり、対称性が高いため、均一な細胞構造物を得るためには特に好ましい。しかし、このような例には限定されず、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄに示すように、中央部２１が矩形（正方形又は長方形）であり、細胞接着部２２が、矩形の中央部２１の周縁Ｐに沿った、内郭と外郭が矩形の形状であってもよい。また、図示しないが、中央部が楕円形で、細胞接着部が、中央部に沿って延在する楕円の環状形状であってもよい。また、上記で挙げた例では、細胞接着部の内郭と外郭が相似形状であるが、それには限定されず、例えば細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が矩形等の多角形であり、細胞培養部の外郭が円形又は楕円形であってもよいし、逆に、細胞接着部の内郭（すなわち中央部の外郭）が円形又は楕円形であり、細胞培養部の外郭が矩形等の多角形であってもよい。また、中央部２１は、半円形状であってもよい。
　図１、図１５Ａ、図１５Ｃ、図１５Ｄの例では、細胞接着部２２は、第２の細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って連続的に延在し、全周に亘って中央部２１を囲う。しかし、細胞接着部は、断続的に延在する形状であってもよい。具体的には図１５Ｂの例に示すように、細胞接着部２２は、第２の細胞非接着部である中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在し中央部２１を囲う。このような構造であっても細胞接着部２２上に接着した細胞は、増殖を経て、細胞接着部２２の切れ目の部分を繋ぐような組織を形成することができる。細胞接着部２２が、中央部２１の周縁Ｐに沿って断続的に延在する実施形態では、中断部分は、１か所あたり、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さであり、また、複数の中断部分を含む場合は、中断部分の合計が、中央部２１の周縁Ｐの全周の好ましくは２分の１以下、より好ましくは４分の１以下、より好ましくは６分の１以下、より好ましくは８分の１以下の長さである。
　本開示で用いる細胞培養基材では、細胞接着部が、細胞非接着性の中央部を囲うように延在している構造であることで、その上に細胞が接着し増殖すると細胞が密になり栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞への分化が促進され易く、且つ、増殖した細胞が積層し易い。この結果、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物を効率的に得ることができる。
　これに対して、特許文献２および非特許文献３に記載の手法では、細胞接着部が円形形状であるため、栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が増殖により内部にまで進展してしまい、外周部に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞が分布した袋状の細胞構造物が得られにくく、内胚葉系細胞にも分化誘導され難い。そのため後述する比較例1の結果の通り回収率が下がっていたと考えられる。また細胞接着部が円形形状である場合、細胞接着部の面積が大きいため凝集部を作るために時間を要していたと考えられる。
　細胞培養基材１のように複数の細胞培養部２０が存在する場合、それらは互いに隔離されており、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。各細胞培養部２０を一定距離以上隔離することにより、各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく均一に一定間隔で培養され、再現性の高い実験系を構築できる。
　図１、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄ、図２６に示す実施形態に係る細胞培養基材１は、第１の細胞非接着部１０中に、１以上の細胞培養部２０が含まれた構造を有している。第１の細胞非接着部１０を備えていない細胞培養基材の実施形態を、図３５～３７を参照して別途説明する。
　図３５～３７に示す細胞培養基材１の、図１又は図２６に示す細胞培養基材１との相違点について以下に説明する。図３５～３７に示す細胞培養基材１における、細胞培養部２０を構成する細胞非接着部（中央部）２１及び細胞接着部２２の特徴及び形成方法は、図１又は図２６に示す細胞培養基材１における細胞非接着部２１及び細胞接着部２２と同様であるため、図３５（Ｂ）、図３６（Ｂ）及び図３７（Ｂ）での細胞培養基材１の断面において、細胞非接着部２１及び細胞接着部２２の断面の特徴については描写を省略する。このほか、図３５～３７に示す細胞培養基材１について言及しない特徴については図１及び図２６に示す細胞培養基材１と同様であるため説明を省略する。
　図３５に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３５では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３５に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
　図３５に示す細胞培養基材１は、１以上の突出部３１を有する支持基材３０を有し、各突出部３１の上面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、突出部３１の上面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、突出部３１の上面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
　図３５に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した突出部３１の上面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において突出部３１が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。
　図３６に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３６では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３６に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
　図３６に示す細胞培養基材１は、１以上の窪み部３２を有する支持基材３０を有し、各窪み部３２の底面Ｓに、細胞非接着部２１とその周囲を囲う細胞接着部２２とを含む。この実施形態では、窪み部３２の底面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、窪み部３２の底面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側は窪み部３２の周壁面であるため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
　図３６に示す実施形態によれば、水平方向に隔離した窪み部３２の底面Ｓに細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）が存在するため各細胞培養部２０内の細胞が隣接する他の細胞培養部２０の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。本実施形態において窪み部３２が複数存在する場合、それらは、好ましくは０．２０ｍｍ以上、より好ましくは０．３０ｍｍ以上互いに離れて配置されている。
　図３７に示す本開示の一実施形態に係る細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３７では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３７に示す細胞培養基材１のうち、細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
　図３７に示す細胞培養基材１は、支持基材３０の平坦な表面Ｓの全体に１つの細胞培養部２０が形成されており、細胞接着部２２は、表面Ｓの周縁部に配置されている。この実施形態では、支持基材３０の表面Ｓは円形であるが、他の形状を有していても良い。この実施形態では、平面視において、支持基材３０の表面Ｓの周縁部に細胞接着部２２が存在し、細胞接着部２２の外側には支持基材が存在しないため、細胞接着部２２に接着した細胞は、培養されると、細胞接着部２２よりも外側には広がらず、細胞接着部２２及びその内側の細胞非接着部２１上に広がり細胞構造物を形成する。
　図３７に示す実施形態によれば、１つの細胞培養基材１には細胞培養部２０（細胞非接着部２１及び細胞接着部２２からなる）のみが存在するため、細胞培養部２０内の細胞が他の細胞と細胞間結合を形成することなく培養され、再現性の高い実験系を構築しやすい。
＜４．細胞構造物＞
　本開示で製造される細胞構造物は、小腸上皮細胞を含む。
　前記小腸上皮細胞は、典型的には、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞である。
　本開示は、細胞培養時に、細胞非接着部を囲うように延在する細胞接着部において細胞が高密度で凝集し、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化し、それが外周部に分布した袋状構造の細胞構造物が得られるという驚くべき知見に基づくものである。実施例では、栄養外胚葉細胞のマーカーであるサイトケラチン７と、小腸上皮細胞及び栄養外胚葉細胞のマーカーであるＣＤＸ２とが、細胞接着部に凝集した細胞で強く発現していることを確認している。
　なお、小腸上皮細胞は、細胞核に転写因子のＣＤＸ２及びＨＮＦ４、絨毛層にｖｉｌｌｉｎが発現し、かつ内胚葉系マーカーのＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎなどが発現していることを指標に確認することができる。これらのマーカーの存在は、抗体を使用した組織免疫染色やｍＲＮＡによるＰＣＲ評価などで検出可能である。
　本開示の細胞構造物は、小腸上皮細胞を含んでおり、腸と同等の機能を有する腸オルガノイドとして有用である。「腸オルガノイド」とは、細胞の起源生物の腸、特にヒト等の哺乳動物の腸、特にヒト腸に類似した機能（具体的には、蠕動運動する機能、粘液分泌機能、物質吸収機能等）を有する細胞構造体（組織）を指す。本開示の細胞構造物は、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究に有用である。
　本開示の細胞構造物の全体の形状は特に限定されないが粒状であることが通常である。「粒状」は球状も包含する。
　非特許文献４にあるようにマウスＥＳ細胞でＣＤＸ２が強く発現することで栄養外胚葉細胞に分化する事が示されている。本実施例においてもマーカーとなるＣＤＸ２やＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７が凝集部において強く発現していることが確認されており、同様に栄養外胚葉細胞の性質を有する細胞に分化していると考えられる。
　さらにヒトｉＰＳ細胞からＣＤＸ２陽性細胞を含む袋状構造を有する組織が得られることは非特許文献５に記載されている。よって本開示では、培養により細胞接着部上で細胞が密集した凝集部において、幹細胞からＣＤＸ２陽性細胞に分化し、それが同様に袋状構造の形成に寄与している可能性が考えられる。
　また、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が栄養外胚葉細胞への分化能を有することは非特許文献６～８にも示されている。
　以上の過去知見、並びに、後に示されるように本開示では細胞接着部に凝集した細胞ではＯｃｔ３／４遺伝子の低下が観察されていることから、本開示においては、幹細胞が細胞接着部に接着し増殖して凝集部を形成し、凝集部から栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞に分化していることが推定される。
　非特許文献９では、マウスＥＳ細胞を用いた検討ではＯｃｔ遺伝子の発現が低下すると栄養外胚葉に分化することが示されており、本開示の細胞構造物でも同様の分化が生じていると推定される。
　また本開示で誘導された細胞構造物の特徴として、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が、起源動物の小腸（起源動物がヒトである場合はヒト小腸）ｃＤＮＡと発現して同等以上であることが挙げられる。これまで得られていた腸オルガノイドと比較して、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が顕著に高い。
　腸においてＡＢＣＧ２トランスポーターの役割として腸での排出、例えば尿酸の排出に寄与しており、その機能低下は痛風などの症状を引き起こすと考えられている。薬物動態を観察するためには吸引だけではなく排出も見る必要がある。ここで相対値の基準として用いることができる起源動物の小腸、特にヒト小腸のｃＤＮＡに関しては部位や性別、年齢、人種等に特に制限は設けないが、部位に関しては後腸である空腸や回腸が望ましく、年齢に関しては成人年齢に達していることが望ましい。また各種市販品を用いることもでき、かつインフォームドコンセントを受けた上で得られたヒト組織より採取して得たものでも良い。ヒト小腸のｃＤＮＡの市販品としてはＰＣＲ　Ｒｅａｄｙ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　－　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ：Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）、またはＣＵＢＮの発現を確実に得るために回腸より取得した製品であるＰＣＲ　Ｒｅａｄｙ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ－Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｌｅｕｍ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用いることができる。
　しかし、これまで誘導されてきた腸オルガノイドではＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が十分ではなかった。過去の解析事例として例えば非特許文献１０の例が挙げられ、これもヒト腸以下の発現しか見られない。また非特許文献３に記載されているヒトＥＳ細胞を用いて得た腸オルガノイドでもＡＢＣＧ２トランスポーターの発現はヒト腸以下の発現であった。なお後の実施例で行ったｉＰＳ細胞を用いた非特許文献２記載のこれまでのパターン培養を行った場合での値はＥＳ細胞での値と同等であった。
　なおＡＢＣＧ２トランスポーターが、胎盤すなわち栄養外胚葉細胞に強く発現している事が非特許文献１１および１２に記載されている。
　例えば非特許文献１３にはマウスの腸組織を培養することにより非特許文献１で用いられているようなＬｇｒ５陽性な腸管上皮幹細胞を用いなくても生体外培養によりオルガノイド様組織が誘導される事が報告されている。ここではＴｒｏｐ２陽性細胞がマウス胎児腸に発現しておりオルガノイドへの分化の元となっている。このＴｒｏｐ２マーカーは栄養外胚葉細胞にも強く発現しており、性質は近い。ゆえに本開示での小腸上皮細胞への発生メカニズムはこれに近いと考えられる。
　また、栄養外胚葉細胞と小腸上皮細胞の性質の近さに関しては非特許文献１４でも述べられている。
　従って本開示では、非特許文献１３と同様の現象が起きていると示唆され、栄養外胚葉細胞から栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞が分化誘導されると考えられ、また分化誘導培養の期間が短いため、初期段階の細胞状態のまま細胞構造物（組織）が得られているため、構成している細胞のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量が高くなりやすいと考えられる。
　本開示の細胞構造物は更に、細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記発現量に対して、９０倍以上、好ましくは１００倍以上である。前記比の上限は特に限定されないが、例えば１０００倍以下である。本開示の細胞構造物は幼弱なヒト腸のモデルとして有用である。例えば非特許文献１５で胎盤や胎児におけるＡＢＣＢ１トランスポーターおよびＡＢＣＧ２トランスポーターの発現について記載がある。これによると、ヒト胎児小腸においてはＡＢＣＢ１トランスポーターに関しては着床後２０週間までは低く、新生児になると成体と同程度に高くなるという記載がある。対してＡＢＣＧ２トランスポーターでは着床後５．５週間より成体と同等の高い発現が認められるとある。そのため幼弱な腸ではＡＢＣＢ１トランスポーターよりもＡＢＣＧ２トランスポーターの発現が高くなると考えられる。
　細胞構造物の調製に用いる幹細胞の起源動物がヒトである場合に基準として用いることができるヒト小腸のｃＤＮＡについては既述の通りである。
　なお非特許文献１６中には浮遊培養によりＡＢＣＧ２トランスポーターがヒト生体腸よりも高い腸オルガノイドの作製について記載がある。しかし、この製品は誘導によりＡＢＣＢ１トランスポーターの発現も高いものであり、本開示で得られる物とは異なる。また、非特許文献１６に記載の製品は小腸上皮細胞のみからなっている。
　トランスポーターの発現を人為的に上昇させる手法として他には遺伝子導入による過剰発現が挙げられるが、培養細胞では達成されていてもオルガノイドや動物腸のような３次元組織では、所定のトランスポーターの発現を上昇させた例はない。この点でも本開示の細胞構造物は特徴を有する。
　ＡＢＣＧ２トランスポーター及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現の強度を測定する手法として遺伝子学的手法によるｍＲＮＡを計測する方法（例えばリアルタイムＰＣＲをはじめとするｑＰＣＲ法やアガロースゲルによる電気泳動によって得られたバンドの濃さによる比較）や抗体を用いたタンパク質の発現を計測する方法（例えばフローサイトメトリー）などが挙げられるが望ましくはｍＲＮＡ量を測定する遺伝子学的手法である。
　ここで、ＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量を、それ単独ではなく、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する比で規定する理由は以下の通りである。
　また、本開示の細胞構造物では、上記トランスポーターは主に上皮細胞で発現しているが、間質細胞でも発現が認められる。そのためＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の基準として、上皮細胞のみに発現するタンパク質（例えばＣＤＸ２やＶｉｌｌｉｎ）の発現量を用いると、細胞構造物内の間質細胞の量の大小に応じて値にバラつきが生じてしまう。細胞に共に発現するＡＢＣＧ２トランスポーターとＡＢＣＢ１トランスポーターとの比率を評価することで、上記の問題を回避することができる。
　なお、遺伝子ＣＵＢＮがコードしているタンパク質のｃｕｂｉｌｉｎは十二指腸、空腸には発現がほとんど見られないが回腸では見られるコバラミン（ビタミンＢ１２）の吸収に働くレセプターである（Jensen et al., Physiological Reports　e12086 2014年）。本開示で誘導された細胞構造物の一実施形態の特徴として、ＣＵＢＮの発現量が高いことが挙げられる。ＣＵＢＮの発現量が高い小腸上皮細胞を含む細胞構造物は、回腸に近い性質を少なくとも有していると考えられる。ｃｕｂｉｌｉｎは小腸上皮細胞に発現しているため、遺伝子ＣＵＢＮの発現量を評価するためには、小腸上皮細胞に特徴的なマーカーの発現量に対する相対値として評価することが好ましい。小腸上皮細胞に特徴的なマーカーとしてはＣＤＸ２、Ｖｉｌｌｉｎ、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎが例示でき、望ましくはＶｉｌｌｉｎである。
　そこで本開示の細胞構造物の好ましい実施形態は、
　小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
　前記細胞構造物のＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＣＵＢＮの発現量の前記相対値が、Ｖｉｌｌｉｎの発現量の前記相対値に対して、０．２～１．８、より好ましくは０．２４～１．７２の範囲にある。
　この特徴を有する細胞構造物は回腸に近い性質を少なくとも有する。
　細胞構造物の調製に用いる幹細胞の起源動物がヒトである場合に基準として用いることができるヒト小腸のｃＤＮＡについては既述の通りである。
　本開示の細胞構造物は、より好ましくは、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む。
　内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から内胚葉系細胞への分化は、内胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。内胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＡＦＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＳＴ、ＩＳＬ１、ＩＰＦ１、ＩＡＰＰ、ＥＯＭＥＳ、ＨＧＦ、ＡＬＢＵＭＩＮ、ＰＡＸ４、ＴＡＴ等を挙げることができる。
　本開示の細胞構造物に含まれ得る内胚葉系細胞としては特に小腸上皮細胞が挙げられる。腸オルガノイドは、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞から選択される１以上を含むことが好ましく、小腸上皮細胞として、腸細胞、杯細胞、腸管内分泌細胞及びパネート細胞を全て含むことが特に好ましい。本開示の細胞構造物に内胚葉系細胞が存在することは内胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。腸細胞マーカーとしてはＣＤＸ２、杯細胞マーカーとしてはＭＵＣ２、腸管内分泌細胞マーカーとしてはＣＧＡ、パネート細胞マーカーとしてはＤＥＦＡ６が挙げられる。そのほか、ＥＣＡＤ、Ｎａ＋／Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ、ビリンが腸上皮細胞のマーカーである。また、胚体内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４も内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、内胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
　外胚葉は皮膚の表皮や男性の尿道末端部の上皮、毛髪、爪、皮膚腺（乳腺、汗腺を含む）、感覚器（口腔、咽頭、鼻、直腸の末端部の上皮を含む、唾液腺）水晶体などを形成する。外胚葉の一部は発生過程で溝状に陥入して神経管を形成し、脳や脊髄などの中枢神経系のニューロンやメラノサイトなどの元にもなる。また末梢神経系も形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から外胚葉系細胞への分化は、外胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。外胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、β－ＴＵＢＬＩＮ、ＮＥＳＴＩＮ、ＧＡＬＡＮＩＮ、ＧＣＭ１、ＧＦＡＰ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＯＬＩＧ２、ＳＹＮＡＰＴＰＨＹＳＩＮ、ＤＥＳＭＩＮ、ＴＨ等を挙げることができる。
　本開示の細胞構造物に含まれ得る外胚葉系細胞としては特に腸管神経叢を構成する細胞が挙げられる。本開示の細胞構造物に外胚葉系細胞が存在することは外胚葉系細胞のマーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。外胚葉系細胞を判別するためのマーカーとしては腸管神経叢マーカーＰＧＰ９．５や、神経前駆細胞マーカーＳＯＸ１が利用できる。
　中胚葉は体腔及びそれを裏打ちする中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓、血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）を形成する。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から中胚葉系細胞への分化は、中胚葉に特異的な遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。中胚葉に特異的な遺伝子としては、例えば、ＦＬＫ－１、ＣＯＬ２Ａ１、ＦＬＴ１、ＨＢＺ、ＭＹＦ５、ＭＹＯＤ１、ＲＵＮＸ２、ＰＥＣＡＭ１等を挙げることができる。
　本開示の細胞構造物に含まれ得る中胚葉系細胞としては特に平滑筋細胞、カハール介在細胞が挙げられる。腸オルガノイドに中胚葉系細胞が存在することは、中胚葉系細胞マーカーの発現が陽性であることに基づき判断できる。中胚葉系細胞マーカーとしては、平滑筋細胞マーカーのα－平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カハール介在細胞マーカーのＣＤ３４及びＣＫＩＴ（二重陽性の場合）が利用できる。また、初期内胚葉及び中胚葉のマーカーであるＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６又はＴ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）も、中胚葉系細胞を判別するためのマーカーとして利用できる。
　本開示の細胞構造物は、好ましくは、外表面の少なくとも一部に小腸上皮細胞を含む。この実施形態によれば、細胞構造物の外側にある物質を、外表面の小腸上皮細胞を介して内部に吸収することができるため好ましい。また、この実施形態において、外表面の小腸上皮細胞が更にトランスポーター陽性であるとき、トランスポーターを介した物質の取り込みが可能となるため更に好ましい。すなわち、トランスポーター陽性の小腸上皮細胞を含む腸オルガノイドは、腸と類似した物質吸収能を有する。
＜５．小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法＞
　本開示の、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法は、
　上記の特徴を有する細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
　播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む。
　前記小腸上皮細胞は、典型的には、栄養外胚葉細胞マーカーを発現する小腸上皮細胞である。
　本開示で用いる細胞培養基材は、幹細胞の細胞接着部への接着を促進する目的で、プレコート剤によりプレコート処理されていることが好ましい。プレコート処理剤とは、細胞培養基材に予め適用して、細胞接着部への細胞の接着を促進するための成分である。プレコート処理剤としては、細胞外マトリックス（コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、ビトロネクチン）、ゼラチン、リジン、ペプチド、それらを含むゲル状マトリックス、血清等が挙げられる。プレコート処理を実施することにより、接着性の低い幹細胞の細胞接着部への接着を促進でき、細胞の接着培養及び分化誘導を効果的に実施できる。
　幹細胞は、播種前に未分化性を維持した条件で培養することができる。このときの培養に用いる培地は、幹細胞を分化誘導させない培地であれば特に限定されないが、例えば、マウス胚性幹細胞及びマウス人工多能性幹細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒを含む培地や、ヒトｉＰＳ細胞の未分化性を維持する性質を有していることが知られているｂａｓｉｃ　ＦＧＦを含む培地等が挙げられる。
　細胞培養基材に播種された幹細胞を培養してその一部を小腸上皮細胞に分化させる工程は、幹細胞を増殖させ、分化誘導することができる培地中で行えばよく、培地は特に限定されない。例えば、具体例として特許文献１、特許文献２、非特許文献４で使用した培地や、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＲｅｐｒｏＦＦ（リプロセル社）などの市販の培地が挙げられる。また培地は、血清含有培地であってもよいし、血清に代替する性質を有する既知成分を含有した無血清培地であってもよい。なお特許文献１、特許文献２、非特許文献４に含まれている因子（ＦＧＦ２、ＩＧＦ－１、ヘレグリン）が多能性幹細胞の増殖に寄与している事は非特許文献１７及び１８に記載されている。
　培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ－１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。培地には、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを加えてもよい。例えば、０．１～２％のピルビン酸、０．１～２％の非必須アミノ酸、０．１～２％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．１～１％のグルタミン、０．１～２％のβメルカプトエタノール、１ｍＭ～２０ｍＭのＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を添加してもよい。
　細胞培養基材への幹細胞の播種密度は常法に従えばよく特に限定されるものではない。本開示においては、幹細胞を細胞培養基材に対し３×１０４　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上の密度で播種することが好ましく、３×１０４～５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがより好ましく、３×１０４～２．５×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種することがさらに好ましい。
　培養温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置などを利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
　幹細胞を細胞培養基材へ播種した後の培養期間は、細胞の初期播種密度や細胞接着部の形状、大きさによって差異が生じるが、２～４週間程度であることが好ましい。本発明者らは、本明細書に記載の構造の細胞培養基材上で幹細胞を培養し分化誘導するとき、播種後２～４週間で、分化誘導された小腸上皮細胞を含む細胞構造物が自然に浮遊して剥離し、回収できること、そしてこうして回収された細胞構造物の回収率は顕著に高いことを見出した。非特許文献３に記載の、円形の細胞接着部を有する基材上では３０日以上経過後に細胞構造物が剥離し、しかもその回収率が非常に低いことと比較して、本開示の方法は有利である。
　また本開示の方法で分化誘導された細胞構造物は細胞培養基材から自然に浮遊して剥離するが、細胞構造物を破壊しない温和な酵素処理（例えばＡｃｃｕｔａｓｅやＴｒｙｐＬＥなど）やＥＤＴＡ処理、培地等の液体の吹きかけ、スクレーパーによる物理的な剥離等の各種手法を用いて、細胞培養基材からの細胞構造物の剥離を促進してもよい。
　細胞構造物が細胞培養基材から剥離した後、更に浮遊培養を継続してもよい。浮遊培養の期間は限定されない。
　ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対しＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の高い幼弱なヒト小腸の特徴を有する実施形態の本開示の細胞構造物は、播種後２～４週間で剥離し回収することで得ることができる。
＜６．細胞構造物保持基板＞
　本開示の別の態様は、
　細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
　前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
細胞培養基材、並びに
　前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
を含む、細胞構造物保持基材に関する。
　前記細胞構造物保持基材は、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を基材上に保持するため、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を、腸関連疾患を予防又は治療するための薬剤の開発や、腸関連疾患の病理研究を目的とした試験に利用する際の取り扱い性が容易である。また、前記細胞構造物保持基材は、ノロウイルス等の、小腸組織に増殖するウイルス又は微生物を培養する際の足場として利用することも可能である。
　また、上記で説明したような小腸上皮細胞を含む細胞構造物を培養するための培地中で、前記細胞構造物保持基材上の細胞構造物の培養を更に継続して、小腸上皮細胞を含む細胞構造物を成熟させ、細胞培養基材から遊離させて回収することも可能である。
　細胞構造物を構成する細胞の増殖性は、細胞構造物が細胞培養基材に接着された状態のほうが、細胞構造物が培地中に浮遊している状態よりも高いことから、本開示の細胞構造物保持基材は上記の用途に適している。
　また、細胞構造物は細胞が進展して広がった状態で細胞培養基材に接着している。このため、本開示の細胞構造物保持基材は、小腸組織に増殖するウイルス又は微生物を培養するための足場として適している。
　前記細胞構造物保持基材は、細胞構造物が生存できるように、細胞構造物が緩衝液又は培地と接触していることが好ましい。
　前記細胞構造物保持基材の一実施形態を図３３に基づいて説明し、別の一実施形態を図３４に基づいて説明する。
　図３３に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００は、細胞培養基材１と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１とを含む。
　細胞培養基材１は、細胞培養部２０を含む表面Ｓを有する。そして、細胞培養部２０は、細胞非接着部（中央部）２１と、細胞非接着部２１の周縁Ｐに沿って連続的に又は断続的に延在し（図３３では連続的に延在している例を示す）、細胞非接着部２１を囲う細胞接着部２２とを備える。図３３に示す例では、表面Ｓは更に第１の細胞非接着部１０を含み、第１の細胞非接着部１０中に１以上の細胞培養部２０が配置されている。細胞培養基材１のうち、第１の細胞非接着部１０及び細胞接着部２０が表面に配置される部分を「支持基材３０」とする。
　細胞培養基材の特徴及びその製造方法は本明細書、特に前記＜２．細胞培養基材の細胞非接着部及び細胞接着部＞及び＜３．細胞培養基材の細胞培養部の形状の特徴＞において説明した通りであり、説明を省略する。細胞構造物１０１の寸法に対して、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、細胞接着部２２の厚さ及び／又は相互間の段差は十分に小さいため、図３３（Ｂ）では、支持基材３０の、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、及び、細胞接着部２２を含む表面Ｓは平坦な平面として示す。
　図３３に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００では、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１は、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、少なくとも細胞接着部２２と重なる位置に存在する。細胞培養基材１に幹細胞を播種して細胞培養を行うと、細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖して、細胞が密に凝集した凝集部が形成される。そして、凝集部の細胞は、形成された細胞の凝集部において栄養外胚葉細胞のマーカーを発現する小腸上皮細胞に分化して、図３３に示す細胞構造物１０１を形成する。表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に細胞接着部２２と重なる位置に存在する小腸上皮細胞は、ＣＤＸ２、サイトケラチン７及びＥ－カドヘリンから選択される１以上のマーカーを発現する細胞であることが好ましい。
　図３４に示す実施形態に係る細胞構造物保持基材１００は、細胞培養基材１と、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１とを含み、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１が、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞接着部２２及び細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置に存在する。この実施形態において、細胞培養基材１の特徴は、図３３に示す実施形態と同様であり説明を省略する。図３４（Ｂ）においても、支持基材３０の、第１の細胞非接着部１０、第２の細胞非接着部（中央部）２１、及び、細胞接着部２２を含む表面Ｓは平坦な平面として示す。
　細胞培養基材１に幹細胞を播種して細胞培養を行うと、細胞接着部２２に幹細胞が接着し増殖して、細胞が密に凝集した凝集部が形成されて、図３３に示すように、細胞接着部２２が、小腸上皮細胞を含む細胞構造物１０１により被覆される。更に培養を続けると、細胞接着部２２上の細胞構造物１０１から遊走した細胞により細胞非接着部（中央部）２１が被覆されて、細胞非接着部（中央部）２１及び細胞接着部２２を被覆する細胞構造物１０１が形成される。
　図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１は、好ましくは、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂよりも、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａにおいて、多くの小腸上皮細胞を含む。このことは、細胞培養基材１上に接着された細胞構造物１０１を、小腸上皮細胞のマーカー（例えばＣＤＸ２、サイトケラチン７及びＥ－カドヘリンから選択される１以上のマーカー）に対する抗体を使用して免疫染色し観察することで確認することができる。また、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合の、細胞構造物１０１の細胞接着部２２と重なる位置１０１ａから採取した細胞試料のｍＲＮＡ中の小腸上皮細胞のマーカーのｍＲＮＡ量と、細胞構造物１０１の細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂから採取した細胞試料のｍＲＮＡ中の小腸上皮細胞のマーカーのｍＲＮＡ量とを比較して、前者が後者よりも大きい場合に、細胞構造物１０１が、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂよりも、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａにおいて、多くの小腸上皮細胞を含むと判断することができる。
　図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１は、好ましくは、表面Ｓの法線方向に沿って細胞構造物保持基材１００を見た場合に、細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂに、神経細胞及び筋肉細胞を含み、より好ましくは、細胞接着部２２と重なる位置１０１ａよりも細胞非接着部（中央部）２１と重なる位置１０１ｂにおいて、多くの神経細胞及び筋肉細胞を含む。
　図３４に示す実施形態における細胞構造物１０１の別の好ましい例は、内胚葉系細胞（小腸上皮細胞を含む）、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含むことが好ましく、袋状の構造を有することが好ましく、上記の＜４．細胞構造物＞で説明した特徴を有することが更に好ましい。
　本開示の一以上の実施形態に係る細胞構造物保持基材は、細胞培養基材の表面に幹細胞を播種し培養することで製造することができる。幹細胞及び培養条件の好ましい態様は上記の＜１．幹細胞＞及び＜５．小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法＞に記載した通りである。ただし、細胞構造物保持基材を製造する目的では、細胞培養基材の細胞培養部上に接着した細胞構造物が細胞培養基材から遊離する前の所望の段階に達した後に、細胞培養基材を、細胞構造物の培養及び成熟が進行しにくい条件に曝して、細胞構造物保持基材の製品とすることが好ましい。
　上記の「細胞構造物の培養及び成熟が進行しにくい条件」としては、低温条件や、栄養因子を含有しない又は低濃度で含む培地又は緩衝液中の条件が挙げられる。
　以下、具体的な実験結果を参照して本開示を説明するが、本開示の範囲は実験結果の範囲には限定されない。
＜実施例１＞
（細胞培養基材の作製）
　細胞培養基材として、ガラス基材上に形成された、ポリエチレングリコール４００の層が酸化分解されて形成された領域である、内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ且つ幅６０μｍの環状パターンからなる細胞接着部（図１参照）と、前記細胞接着部の環状パターンの内側及び外側の、ガラス基材の表面がポリエチレングリコール４００で被覆された領域である細胞非接着部とを備える細胞培養基材を作製した。前記細胞培養基材は、複数個の、３００～５００μｍ間隔で形成された前記環状パターンからなる細胞接着部を備える（図１参照）。以下の説明では、環状パターンからなる細胞接着部を「環状細胞接着部」と称する。
　細胞培養基材は、特許第５０７０５６５号（特許文献６）及びOkochi et al., Langmuir　第25巻　6947～6953ページ 2009年（非特許文献１９）に記載の手順により作製した。以下にその概要を説明する。
（一段階目の反応）
　トルエン３９．０ｇ、エポキシシランＴＳＬ８３５０（ＧＥ東芝シリコーン製）０．４８ｇ、トリエチルアミン０．９７gを混合し、室温で１０分間攪拌した。このシラン溶液にＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を洗浄面が上向きとなるように浸漬した。室温で１６時間放置した後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス基板表面にエポキシ基を含む薄膜が形成された。
（二段階目の反応）
　５０ｇの平均分子量４００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）を攪拌しながら２５μｌの濃硫酸を一滴ずつ添加した。そのまま数分間攪拌してから、全量をガラス皿に移した。ここに上記の基板を浸漬し、８０℃で２０分間反応させた。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。これにより、ガラス表面に均一な親水性薄膜が形成された。
（酸化処理）
　表面全域に酸化チタン系光触媒を塗布したフォトマスクを作製した。フォトマスクは、複数個の、３００～５００μｍ間隔で形成された上記寸法の環状細胞接着部に対応する形状の開口部が形成され、且つ、周囲に幅約１．５ｃｍの開口部を有する５インチサイズのものを用いた。あらかじめ露光機の照度を３５０ｎｍの波長で計測し、露光時間の設定の目安とした。このフォトマスクの光触媒層と基板表面の親水性薄膜を接触させ、フォトマスク側から光が照射されるよう露光機内に設置した。波長３５０ｎｍの照度が２０ｍＷ／ｃｍ２の水銀ランプで５０秒間露光し、基板表面の親水性薄膜を部分的に酸化分解した。この基板を２５ｍｍ×１５ｍｍの大きさに切断し、細胞接着基板として使用した。細胞培養に使用する前に、細胞培養基材に対しＥＯＧ滅菌処理を２２時間施した。
　前記細胞培養基材を、３．５ｃｍペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の底面上に設置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１／１００希釈したビトロネクチン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と室温で３０分間以上接触させてコーティングした後に、ＰＢＳで３回洗浄してから使用した。
　こうして得られた細胞培養基材は図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。
（培養）
　国立研究開発法人国立成育医療研究センターは、月経血から取得した細胞に山中４因子をセンダイウイルスベクターによって一過的に発現させて、ヒトｉＰＳ細胞株であるＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を樹立している（PLoS Genet. 2011 May; 7(5): e1002085. Published online 2011 May 26. doi: 10.1371/journal.pgen.1002085PMCID: PMC3102737）。Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中でＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用いてあらかじめ増殖させた。増殖した細胞を、ＰＢＳで１／１０００に希釈したＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて３７℃で１０分間処理することにより前記ディッシュから剥離し、前記細胞培養基材に１×１０６個播種し培養した。培地として、非特許文献３記載のＸＦ　ｈＥＳＣ培地を用いた。播種当日は前記培地にＹ２７６３２を含ませたが、翌日培地交換しＹ２７６３２を含まない前記培地で維持した。４日目以降、培地交換を３～４日に１回行った。培養中、細胞培養基材から自然剥離した組織を回収し、別のペトリディッシュ内で同じ培地で浮遊培養させて維持した。
　図２に、内径の異なる環状細胞接着部を有する各細胞培養基材を用いて培養したときの培養１日目、６日目、１１日目、１８日目の培養物の観察像を示す。培養１日目の写真は他の物と比較して拡大倍率が高い。先に環状細胞接着部で細胞が増殖し、続いて、環状細胞接着部で囲われた内側の細胞非接着部が増殖した細胞により被覆される様子が観察された。
　図３に、培養３週の培養物の観察像を示す。図３に示す観察像は、各細胞培養基材上での培養により、袋状構造を有する組織が高い割合で形成されたことを示す。
　この培養の結果、袋状構造を有する組織が培養開始後２～３週間で表面から自然剥離し回収できることが示された。図４に、内径３８０μｍの環状細胞接着部を有する基材上で形成され剥離した袋状構造を有する組織の観察像（左がディッシュ全体の写真、右が組織の観察像）を示す。図４の左の写真において、ディッシュに見える白い点状の物が、袋状構造を有する組織である。図４の右の写真は、本実施例で得た袋状構造を有する組織の顕微鏡による観察像である。本実施例で得た袋状構造を有する組織の観察像は、ｉＰＳ細胞を類似した培地中で培養して得た、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載の、腸機能を有する袋状の組織（腸オルガノイド）の観察像と類似していること及び後述する実施例４、実施例５の結果から、本実施例で得た袋状構造を有する組織もまた、腸オルガノイドであることが分かる。
　細胞培養基材上の環状細胞接着部の数に対する、回収された袋状構造を有する組織の割合（以下「組織回収率」と称することがある）は８０％以上であり、高収率であった。
＜比較例１～３＞
　比較例１として、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載されている、ポリエチレングリコール層で被覆された領域である細胞非接着部と、ポリエチレングリコール層が酸化分解されて形成された直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部とが形成された細胞培養基材を用意した。
　比較例２として、複数の円形の細胞接着部の各々の直径が２８２μｍである点を除いて比較例１と同じ構造の細胞培養基材を用意した。
　比較例１及び比較例２の細胞培養基材の製造方法は、実施例１の細胞培養基材の製造方法と同様であり、フォトマスクの開口部の形状を細胞接着部に応じて適宜変更すればよい。
　比較例３として接着パターンが作られていないガラス基材を用意した。
　比較例１～３の各基材上で、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。
　図５に、比較例１、比較例２、比較例３の各基材上での培養開始後３週間の培養物の顕微鏡観察像を示す。
　比較例１では、袋状構造を有する組織の表面からの剥離開始が、培養開始後３～４週間で観察され、組織回収率は４～５％であった。前記実施例１と比較し比較例１では剥離までの培養期間が長く、組織回収率が低かった。
　比較例２では、培養開始後２～３週間で袋状構造を有する組織が得られたが、観察像が暗い細胞凝集塊が多く得られた。袋状構造を有する組織の組織回収率は１０％以下であった。また、図５の「比較例２」にて矢印で示す組織のように、隣接する複数の円形パターンでの培養物が融合して形成される、寸法の大きな袋状構造を有する組織が形成されることもあった。
　比較例３では、小さな袋状構造が１～２個程度得られる場合もあったが、袋状構造を有する組織が形成されるまでに基材の表面全体での細胞増殖が必要であり培養に１ヶ月以上の時間を要し、形成される袋状構造を有する組織の数は、実施例１での場合と比較して著しく少なかった。なお細胞接着部のパターンの数が定められていないため、この場合では組織回収率の計算はできていない。
　以上の結果は、実施例１のように、環状パターンからなる細胞接着部を複数備えた基材でのｉＰＳ細胞の培養により、袋状構造を有する組織を、短い培養期間で得ることができ、且つ、組織向上率が顕著に高いことを示す。
＜実施例２＞
　実施例１でのパターン培養の経過観察を行うため、下記のタイムラプス観察を実施した。
　実施例１で用いた内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材を、ディッシュの底面上に固定した器材を作製した、この器材を用いて、実施例１と同様の条件で、Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ細胞の播種及び培養を行った。
　培養４日目から２１日目まで１２時間おきにＢｉｏＳｔａｔｉｏｎ（ニコン社）を用いて撮影を行った。撮影作業は添付のマニュアルに従い、培地交換は２～３日に１回行った。
　図６に、培養４日目、９日目、１３日目、２０日目の各時点での１つの環状細胞接着部周辺の細胞の観察像を示す。これより、細胞はまず環状パターン上で増殖及び積層し、その後、培養２１日目までに袋状構造を形成することが確認された。
＜実施例３＞
　他の細胞種を用いて袋状構造を有する組織の形成を試みた。
　ヒトＥＳ細胞のＳＥＥＳ２細胞株を、実施例１と同じ内径１８０μｍ、２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備えた細胞培養基材を用いて培養した。まず、１／１０００で希釈したｒｈＬＩＦ（和光純薬工業社）を添加したＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社）を用い、ビトロネクチンコートした細胞培養用ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）中で増殖培養した。増殖培養した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を３７℃５分間処理することで剥離処理して回収し、前記基材に播種し、実施例１と同様の手順で培養した。
　図７に、各細胞培養基材を用いた培養の１日目及び７日目の観察像と、内径２８０μｍの環状細胞接着部を有する細胞培養基材を用いた培養で培養３週間後に回収された袋状構造を有する組織の観察像を示す。袋状構造を有する組織の観察像、及び、組織回収率はｉＰＳ細胞を用いた実施例１と同様であった。
　この結果は、環状細胞接着部を含む細胞培養基材上での幹細胞の培養により袋状構造を有する組織が効率良く作成することができること、並びに、このような組織の形成は、ＥＳ細胞を用いた場合でも実施例１のようにｉＰＳ細胞を用いた場合と同様に生じ、多能性幹細胞の種類を問わないことを示す。
＜実施例４＞
　実施例１での培養過程を検討するために、実施例１と同じ内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で細胞培養を行い、マーカーの発現を免疫染色により調べた。
　内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材及び細胞培養の条件は実施例１に記載の通りである。
　培養４日目、培養７日目または培養１２～１４日目の組織を含む細胞培養基材を４％パラホルムアルデヒド（和光純薬社）により室温で２０分間固定した後にＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢＳにより室温で３０分間ブロッキング操作を行った後に、前記基材を、マウスＩｇＧ１標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７抗体（Ａｂｃａｍ社　希釈率１／５００）、マウスＩｇＧ３ｂ標識抗Ｏｃｔ３／４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社　希釈率１／２００）、ウサギＩｇＧ標識抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ社　希釈率１／５００）又はウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社　希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートした。インキュベート後の前記基材をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社　希釈率１／１０００）またはＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社　希釈率１／１０００）と室温で３０分インキュベートした。インキュベート後の前記基材を更にＰＢＳで３回洗浄し、次いで、前記基材上の細胞の細胞核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ社　希釈率１／１０００）により室温で１０分間染色させた後に封入し、共焦点顕微鏡で観察した。なお抗体の種類に関しては適切に取捨選択を行った。
　図８に、培養４日目の観察像を示す。これより培養４日目の段階で、環状細胞接着部上に、Ｋｉ６７陽性且つＯｃｔ３／４陽性な、増殖能を有する未分化細胞が存在しており、凝集部が形成され得ることが示唆された。
　図９に、培養７日目の観察像を示す。図９の上段の観察像は、主に内部に多分化能を有するＯｃｔ３／４陽性の未分化細胞が存在し、外周部にＣＤＸ２陽性細胞が存在する組織が形成されたことを示す。図９の下段の観察像は、前記ＣＤＸ２陽性細胞は、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７陽性の栄養外胚葉細胞であったことを示す。
　以上の結果より、実施例１の環状細胞接着部を有する細胞培養基材上で多能性幹細胞を培養し形成される組織において、外周部の細胞が特に密な凝集部を形成する部分は栄養外胚葉細胞からなっており、その後増殖により未分化細胞が内部に浸潤していることが示唆された。
　更に、内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材を、実施例１に記載の条件により作製した。この細胞培養基材上で、実施例１に記載の条件によりＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養した。培養９日目に細胞培養基材の細胞接着部に接着している細胞構造物を固定し、内胚葉系細胞マーカーのマウスＩｇＧ２ａ標識抗Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社　希釈率１／１０００）、神経細胞マーカーのウサギＩｇＧ標識抗βＩＩＩ ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ社　希釈率１／１０００）、筋肉細胞マーカーのマウスＩｇＧ２ａ標識抗Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ａｃｔｉｎ抗体（ＳＭＡ；Ｓｉｇｍａ社　希釈率１／５００）および上記２次抗体を用いて上記の手順により染色したうえで共焦点顕微鏡のＢＺ－Ｘ７１０（キーエンス社）で観察した。
　結果を図２７及び図２８に示す。図２７及び図２８から、外周部にＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞を含む袋状の細胞構造物が誘導されていること、並びに、その内部（環状パターンの中央部（細胞非接着部）上）が、遊走した神経細胞又は筋肉細胞により占められていること確認された。このことから、環状の細胞接着部上で、袋状の細胞構造物の外周部を構成するＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性細胞が誘導され、細胞非接着性の中央部は、遊走した神経細胞、筋肉細胞等により被覆されていると考えられる。なお図２８で見られる袋状の細胞構造物は、環状の細胞接着部の外郭寸法よりも収縮している。この収縮は、細胞遊走等の影響だと考えられる。
＜実施例５＞
　実施例１において、内径２８０μｍ又は内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養し、培養開始後３～４週間で自然に剥離した組織を回収し、別のディッシュ内で培養開始後６週間まで浮遊培養して得られた袋状構造を有する組織について、組織中の腸細胞及び三胚葉由来細胞の有無を検討するために免疫染色による評価を行った。
　ｉＰＧｅｌｌ（ＧｅｎｏＳｔａｆｆ社）および４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業社）を用いて組織を製品添付のプロトコールに従い１晩固定した。固定した組織をパラフィン包埋した後に厚さ４～６μｍの組織切片を作製した。Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された方法で抗体染色を行った。抗体染色の方法は下記の通りである。
　前記組織切片を、ウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／１０００）及びマウスＩｇＧ標識抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；希釈率１／２００）、又はマウスＩｇＧ標識抗Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／５００）、又はウサギＩｇＧ標識抗ＰＧＰ９．５抗体（ＤＡＫＯ社；希釈率１／２００）と４℃で１晩インキュベートすることで１次抗体染色を行った。１次抗体染色後の前記組織切片を、ＰＢＳで５分３回洗浄した後にＰＢＳで希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体及びＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体（共にＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社；希釈率１／１０００）と室温で１時間インキュベートすることで２次抗体染色を行った。２次抗体染色後の前記組織切片をＰＢＳで５分３回洗浄した後に細胞核を（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ社；希釈率１／１０００）で染色し、封入した。
　図１０に、実施例１において内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗ＣＤＸ２抗体、抗Ｖｉｌｌｉｎ抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１０に示す結果は、実施例１で形成された組織が、細胞核がＣＤＸ２陽性かつ上皮がＶｉｌｌｉｎ陽性な、絨毛層を有する腸管上皮組織を含むことを示す。図１１に、実施例１において内径３８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上で培養し形成された組織の、抗平滑筋アクチン（Ｓｍｏｏｔｈ　Ｍｕｓｃｌｅ　Ａｃｔｉｎ）抗体、抗ＰＧＰ９．５抗体及びＤＡＰＩによる染色の結果を示す。図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、内胚葉由来の腸管上皮組織に加えて、中胚葉由来の平滑筋アクチン陽性な筋組織や、外胚葉由来のＰＧＰ９．５陽性な神経線維様組織を有することを示す。図１０及び図１１に示す結果は、実施例１で形成された組織が、三胚葉由来組織を含むことを示す。
＜実施例６＞
　環状細胞接着部の適切なサイズ及び接着部の幅を検討するために下記の解析を行った。
　内径と幅が異なる環状細胞接着部を備える細胞培養基材を、実施例１と同じ方法で作製し、実施例１と同じ方法でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞の培養を行い、目視による評価で袋状構造を有する組織の出来具合により＋＋（袋状構造を有する組織が効率良く得られている）、＋（袋状構造を有する組織の分化は起きているが剥離が多い、或いは、組織の生成が比較例１と同等で遅い）、－（培養過程での細胞剥離や細胞増殖による被覆ができない等の理由で組織が得られない）の３段階に分類した。
　代表的な例の観察像を図１２に示す。図１２は、各寸法の環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養１８日目の観察像である。評価が「＋＋」の場合（左列）は、３週間以内に袋状構造を有する組織が剥離して回収できた。
　結果を図１３に示す。なお図１３には、実施例１での解析結果内容も含まれている。この結果は、環状細胞接着部の内径は好ましくは１８０μｍ～８８０μｍ、より好ましくは１８０μｍ～６００μｍであることを示し、環状細胞接着部の幅は好ましくは３０μｍ～４００μｍの範囲であり、より好ましくは４０μｍ～４００μｍの範囲であり、特に好ましくは６０μｍ～３００μｍであることを示す。
　内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での培養により得られた袋状構造を有する組織の観察像を図１４に示す。
＜実施例７＞
　細胞接着部の形状に関して下記の検討を行った。
　検討した実施例の細胞培養基材における細胞接着部の形状は図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ、図１５Ｄの通りである。
（１５Ａ）内寸が一辺２８０μｍ～３００μｍの正方形で、幅５０～６０μｍの細胞接着部
（１５Ｂ）内径２８０μｍ、幅６０μｍの環状で、周方向の１／８が欠落している、細胞接着部
（１５Ｃ）内寸が長辺６００μｍ、短辺３００μｍの長方形で、幅５０μｍの細胞接着部
（１５Ｄ）内寸が一辺６００μｍの正方形で、幅５０μｍの細胞接着部
　細胞培養基材の製造方法及び細胞培養方法は実施例１に記載の通りである。
　前記（１５Ａ）～（１５Ｄ）の形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いてＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養した培養物の観察像を図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄにそれぞれ示す。いずれの形状の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いた場合も、他の実施例と同様に短期間で袋状構造を有する組織が得られた。また（１５Ｂ）の、周方向の１／８が欠落した環状の細胞接着部であっても、欠落した部分が増殖した細胞に被覆されるため、全周に亘り完全な環状の細胞接着部と同様に、袋状構造を有する組織が形成された。
　以上の結果より、細胞接着部の形状には特に制限は無く、必ずしも円形である必要はないことが分かる。また、培養によって閉鎖系になればよく、必ずしも初期パターンが閉鎖パターンでなくても良い。さらに細胞非接着部を囲う長方形の形状の細胞接着部でも同様に腸構造物が得られたことから、細胞接着部で囲われる細胞非接着部は、縦横の長さが等しくなくても良く、細胞接着部で囲われる細胞非接着部が例えば楕円や半円形状であってもよいことが示唆された。
＜実施例８＞
　実施例１では細胞非接着部をポリエチレングリコールの被覆により形成した。本実施例では、ポリエチレングリコールの代わりに他の化合物を用いて同様の効果が得られるかを検討した。そこで、内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部を備える細胞培養基材を以下の方法で作製した。
　基材としてガラス（１７０μｍ厚）を１２５ｍｍ四方に切り出し、前洗浄としてアルカリ洗浄液であるパーケム（パーカーコーポレーション社、ＰＫ－ＬＣＧ２３）で４８時間以上浸漬し、純水でリンスした。その後、窒素雰囲気中で真空紫外線（１７２ｎｍ）を６分照射した。次に、環状パターンの形成プロセスとして、前記洗浄したガラス基材上に感光性ドライフィルムレジスト（ニチゴー・モートン社、ＮＩＴ９１５）を１００℃のホットプレー上でラミネートし、５分間加熱保持した。その後、上記寸法の環状パターンと同寸法の開口を有するフォトマスクを介してＵＶ光（ブロードバンド）を２００ｍＪ照射した。炭酸ナトリウム水溶液で２分処理することによりレジストでのパターンを形成し、１００℃で５分のベーク後に１８０℃５分のステップベークを行った。この状態で、１５ｍｍ×２５ｍｍ四方に切り出し、別途９９．５％エタノールに０．５ｗｔ％Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標、日油株式会社）を溶解させた溶液を準備し、これを、切り出した前記基材上に２００μｌ程度キャストコートにより被覆した。一日間の自然乾燥後、ＡＺリムーバー１００（東京応化社）中に５分間超音波を印加した状態で前記基材を浸漬し、レジストを除去後、リンスを行った。最後に、ＥＯＧ滅菌処理を２２時間行った。こうして、ガラス基材の表面が露出した内径２８０μｍ又は３８０μｍ、幅６０μｍの複数の環状細胞接着部と、環状細胞接着部の内側及び外側の、ガラス基材の表面がＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）で被覆された細胞非接着部とを有する基材を得た。この実施例での細胞培養基材は、実施例１と同様に図１（Ｂ）に示すような断面構造を有する。
　前記基材を実施例１と同じく１５ｍｍ×２５ｍｍサイズに切断しｉＰＳ細胞を播種して検討した。
　なお、前記基材上の細胞非接着部を形成するＬｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）の被膜の膜厚を段差計で測定したところ、平均２８８ｎｍであった。
　図１７に各基材上での培養物の培養１日目、７日目、１１日目の観察像を示す。なお培養１日目と７日目の観察像の拡大倍率は、培養１１日目の観察像よりも高倍率である。図１８に、３週間培養した後に得られた袋状構造を有する組織を示す。
　実施例１等では、細胞接着を抑制する化合物であるポリエチレングリコールにより基材表面を被覆して細胞非接着部とした。本実験の結果は、細胞接着を抑制する化合物として、ポリエチレングリコール以外の物質を用いた場合でも、ポリエチレングリコールと同様に細胞非接着部を形成することができることを示す。
＜実施例９＞
　環状細胞接着部を備える細胞培養基材上での細胞培養により得られた組織の特徴を解析した。
　細胞接着部として、内径１８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径２８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径３８０μｍ幅６０μｍの環状パターン、内径６００μｍ幅１００μｍの環状パターン、内径６００μｍ幅２００μｍの環状パターン、内径８００μｍ幅１００μｍの環状パターン、内径８００μｍ幅２００μｍの環状パターンを備え実施例１に記載の手順で作製した細胞培養基材を実施例の基材として用いた。これらの基材を用い実施例１と同様の手順でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養し、２～４週間の接着培養の後に、細胞培養基材上に接着した組織に培地を吹きかけて強制的に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１～３週間行った組織を以下の解析に用いた。
　比較のために、上記の比較例１（直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部を備える細胞培養基材を用いた）で得られた組織を同様に解析した（比較例１とする）。更に比較のために、細胞接着部として内径６００μｍ幅１００μｍの環状細胞接着部を備え実施例１に記載の手順で作製した基材を用い実施例１と同様の手順でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を培養し、１カ月以上自然剥離することなく接着していた組織に培地を吹きかけて強制的に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１～２週間行った組織を同様に解析した（比較例４とする）。
　各条件で得られた組織をＰＢＳで洗浄した後に、ＱＩＡｚｏｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）９００μｌを加えた上でホモジェナイザーにより組織を溶解させた。次にＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）及びクロロホルム（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）を用いて添付の使用説明書に従った操作によりｍＲＮＡを抽出しＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水に懸濁した。ＲＮＡ濃度および純度をＮａｎｏｄｒｏｐにより測定した。１００～２００ｎｇのＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ　ＶＩＬＯ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた逆転写操作によりｃＤＮＡを作製したうえでリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の操作をUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載の方法で行った。なお比較対象としてはヒト小腸（この小腸に関しては後にあるような部位の限定はされていない製品である）または十二指腸、空腸および回腸由来のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用い、１μｌをＵｌｔｒａＰｕｒｅ　Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　Ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）２００μｌに希釈した。ここで、部位が限定されないヒト小腸由来のｃＤＮＡとしてはＰＣＲ　Ｒｅａｄｙ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　－　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ：Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用い、ヒト回腸由来のｃＤＮＡとしてはＰＣＲ　Ｒｅａｄｙ　Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ－Ｈｕｍａｎ　Ａｄｕｌｔ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｔｉｓｓｕｅ：Ｉｌｅｕｍ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社）を用いた。補正はＧＡＰＤＨの値により行ったうえで小腸でのＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量の値をそれぞれ１として、各組織でのＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量を求め、求めたＡＢＣＢ１量及びＡＢＣＧ２量から更にＡＢＣＢ１量に対するＡＢＣＧ２量の比（ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１）を求めた。また同様に補正をＧＡＰＤＨの値により行ったうえでＣＵＢＮの発現を有する回腸でのＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量の値をそれぞれ１として、各組織でのＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量を求め、求めたＶｉｌｌｉｎ量及びＣＵＢＮ量から更にＶｉｌｌｉｎ量に対するＣＵＢＮ量の比（ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎ）を求めた。
　ここで使用したプライマーは下記の通りである。
ABCB1（フォワードプライマー）　5’-AAGGCCTAATGCCGAACACA-3’（配列番号１）
ABCB1（リバースプライマー）　5’-GTCTGGCCCTTCTTCACCTC-3’（配列番号２）
ABCG2（フォワードプライマー）　5’-GTTTATCCGTGGTGTGTCTGG-3’（配列番号３）
ABCG2（リバースプライマー）　5’-CTGAGCTATAGAGGCCTGGG-3’（配列番号４）
Villin（フォワードプライマー）5’-CGGAAAGCACCCGTATGGAG-3’（配列番号５）
Villin（リバースプライマー）5’-CGTCCACCACGCCTACATAG-3’（配列番号６）
CUBN（フォワードプライマー）5’-AATGGATGTGTGCAGCTCAG-3’（配列番号７）
CUBN（リバースプライマー）5’-GGGGTTGCTCAAACACTCAT-3’（配列番号８）
GAPDH（フォワードプライマー）　5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’（配列番号９）
GAPDH（リバースプライマー）　5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’（配列番号１０）
　図１９に、各条件での、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の平均値を示す。グラフ中の表記は比較例１、比較例４を除いて、環状細胞接着部の内径（単位μｍ）－幅（単位μｍ）を意味している。なお比較例１でのＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の範囲は０．０８４～３．６５、比較例４のＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比は０．４４であった。この結果より、本開示で得られた比較的早期に剥離した組織ではＡＢＣＢ１に対するＡＢＣＧ２の発現比率が高くなっており、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された腸オルガノイドとは性質が異なる組織が得られる事が示唆された。また、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の範囲は９０より大きいことが好ましいと考えられる。
　なお比較例４の結果より本開示のパターン基材でも長期接着培養を行えば、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比の低い、Uchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年に記載された腸オルガノイドと同等の組織を得ることもできる。
　またUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年の記載によるとヒトＥＳ細胞を用いて比較例１のパターンで３０日以上の長期培養した結果ではＡＢＣＢ１トランスポーターの量がＡＢＣＧ２トランスポーター量よりも高い結果であり、ＡＢＣＧ２／ＡＢＣＢ１比は１以下になることが示唆される。
　また図２０にはＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの測定結果の平均値を記載している。この結果は、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値の範囲が０．２～１．８の範囲にあることが好ましいことを示す。なお、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値が上記範囲にある各組織は、細胞培養基材からの剥離時期及び浮遊培養の期間が一定ではなく、２～４週間の接着培養の後に剥離し、剥離後更に浮遊培養を１～３週間行った組織を含んでいる。このことは、ＣＵＢＮ／Ｖｉｌｌｉｎの値が上記範囲にある組織は、接着培養の期間及び浮遊培養の期間が特定の範囲の組織には限定されないことを裏付ける。
＜実施例１０＞
　組織における細胞密度の高い部分（凝集部）の性質変化に関して下記の解析を行った。
　直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材を用いる上記の比較例１で得られた組織を、実施例３記載の方法に免疫染色した。使用した１次抗体は未分化性マーカーのマウスＩｇＧ標識抗Ｏｃｔ３／４抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；希釈率１／２００）及び細胞増殖マーカーのウサギＩｇＧ標識抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ社；希釈率１／５００）である。
　結果を図２１に示す。この結果は、組織中で細胞密度の高い部分（凝集部）において未分化細胞の発現が低下していることを示唆する。
　また容器による差の有無に関しても下記の検討を行った。
　直径３．５ｃｍの細胞培養用ディッシュ（培養ディッシュ）、パターンの無いガラス基材（共に１．５ｃｍ×２．５ｃｍサイズ）（素ガラス）、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材（パターン基材）にＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を播種して実施例１と同様の方法で培養した。なお細胞密度を統一するために細胞培養用ディッシュに関しては５×１０６個の細胞を播種した。
　上記各基材上で７日間培養した後に実施例４記載の方法に従って免疫染色を行った。ここで使用した１次抗体はマウスＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ社；希釈率１／５００）、２次抗体はＡｌｅｘａ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体である。細胞核はＤＡＰＩで染色した。
　結果を図２２に示す。この結果は、基材の種類に関係なく、形成された組織中の細胞密度の高い部分（凝集部）では、ＣＤＸ２陽性な栄養外胚葉細胞が分化していることを示唆する。
＜実施例１１＞
　実施例９の解析に関連して遺伝子学的解析を行った。
　比較例１の直径１５００μｍの円形の細胞接着部を有する基材上でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を実施例１の手順で培養したときの、培養７日目の組織の観察像を図２３に示す。凝集部とは、細胞接着部に接着した組織のうち、図２３左写真の楕円で囲まれた、細胞が密集した箇所を指す。非凝集部とは、細胞接着部に接着した組織のうち、図２３右写真のように、細胞が密集していない部分を指す（図２３右写真の場合は組織の全体が非凝集部である）。培養７日目の組織から凝集部の細胞と非凝集部の細胞を、それぞれガラスキャピラリーを用いて採取した。凝集部の細胞及び非凝集部の細胞の各試料から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを取得し、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ水に懸濁した。ＲＮＡ濃度および純度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）により測定した。１００～２００ｎｇのＲＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ　ＶＩＬＯ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた逆転写操作によりｃＤＮＡを作製したうえでリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の操作をUchida et al., JCI Insight 第2巻 e86492 2017年及び実施例９記載の方法で行った。
　ここで使用したプライマーは下記の通りである。
Oct3/4（フォワードプライマー）　5’-CGAGGAATTTGCCAAGCTCTGA-3’（配列番号１１）
Oct3/4（リバースプライマー）　5’-TTCGGGCACTGCAGGAACAAATTC-3’（配列番号１２）
GAPDH（フォワードプライマー）　5’-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3’（配列番号９と同じ）GAPDH（リバースプライマー）　5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGAG-3’（配列番号１０と同じ）
　凝集部及び非凝集部の各試料について、Ｏｃｔ３／４の発現量を、ＧＡＰＤＨの発現量で補正した補正値として求めた。そして、非凝集部の試料でのＯｃｔ３／４の発現量を１としたときの、凝集部の試料のＯｃｔ３／４の発現量の相対値を求めた。
　結果を図２４のグラフに示す。この結果は、非凝集部に対し凝集部では、未分化性マーカーであるＯｃｔ３／４遺伝子の発現が有意に低下していることを示唆する。この結果から、細胞接着部を備える基材上で多能性幹細胞を培養するとき、細胞が細胞接着部に密集して接着して形成される凝集部では、未分化マーカーのＯｃｔ３／４４遺伝子の発現が低下し、栄養外胚葉細胞になり易いことが示された。
　なお実施例１０及び１１で観察された多能性幹細胞の培養物の凝集部の特性は、多能性幹細胞が培養時に密集して形成する凝集部に共通する特性であるため、環状細胞接着部に、多能性幹細胞が密集して形成する凝集部もまた、同様の特性を備えると考えられる。
＜実施例１２＞
　得られた腸オルガノイド中の上皮細胞の性質を調べるため、以下の解析を行った。
　実施例１と同様の方法で作製した内径５８０μｍ、幅６０μｍの環状細胞接着部を複数備えた細胞培養基材、及び、比較例１で作製した直径１５００μｍの円形の複数の細胞接着部を備えた細胞培養基材上で、Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を、実施例１と同様で培養して袋状組織（腸オルガノイド）を作製した。得られた組織を用いて、上記実施例５記載の方法と同様に記載の方法で免疫染色を行った。抗体として、上記実施例４で用いたマウスＩｇＧ１標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７抗体（ＫＲＴ７；Ａｂｃａｍ社　希釈率１／５００）及びウサギＩｇＧ標識抗ＣＤＸ２抗体を用いた。２次抗体も実施例４と同じものを用いて、細胞核はＤＡＰＩで染色した。
　結果を図２５に示す。図２５から、袋状組織は上皮細胞のＣＤＸ２陽性細胞がＫＲＴ７も発現していた。さらに、この性質はパターン形状によって依存するものではなく、パターン内部で見られた凝集部に見られるＣＤＸ２陽性な栄養外胚葉細胞由来である事が示唆された。
＜実施例１３＞
　細胞接着部のパターンを備える細胞培養基材上での培養時に形成される細胞凝集部から神経細胞が遊走するかどうか検討するために以下の解析を行った。
　Ｅｄｏｍ　ｉＰＳ細胞を実施例１等同じ条件で培養した。ただし細胞培養基材としては、回収作業のやりやすさと凝集部と非凝集部の見分けやすさを考慮して、比較例１で用いた、直径１５００μｍの円形の細胞接着部を複数有する細胞培養基材を用いた。
　培養開始から１週間後及び２週間後に実体顕微鏡下で培養物を観察し、形成された細胞凝集部をガラスキャピラリーにより回収し、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎによりコーティングされた直径３．５ｃｍの培養ディッシュ（ＡＧＣ社）に適当数、塊の状態で再度播種した。培地は実施例１と同じく非特許文献３記載のＸＦ　ｈＥＳＣ培養培地を用いた。その後、数日間、培養を維持した後に免疫染色による神経細胞の同定を行った。
　染色の方法は実施例４と同じである。使用した１次抗体はマウスＩｇＧ１標識抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ社　希釈率１／５００）およびウサギＩｇＧ標識抗βＩＩＩ　ｔｕｂｌｉｎ抗体（Ａｂｃａｍ社　希釈率１／１０００）である。
　培養開始から１週間後の時点で回収した凝集部を再度４日間培養した培養物の免疫染色の結果を図２９に示す。凝集部の外周部で神経マーカー陽性な細胞の存在が見られた。すなわち凝集部より神経細胞の発生が起きると考えられる。
　培養開始から２週間後の時点で回収した凝集部を再度１日培養した培養物の免疫染色の結果を図３０に示す。この時点では遊走能が高い神経細胞が凝集部に含まれていることが示唆された。遊走能が高い神経細胞が、細胞非接着部（中央部）上に広がり被覆し得ると推定される。
＜実施例１４＞
　細胞培養基板上で得られた細胞及び袋状の細胞構造物が、剥離せずに基板上に接着した状態で維持される条件を見出すために下記の検討を行った。
　実施例１に記載の方法で作製した内径６００μｍ、幅１００μｍの環状細胞接着部を複数備える細胞培養基材を用い、実施例１と同様の条件でＥｄｏｍ　ｉＰＳ細胞の培養を行った。
　培養開始から１１日目の時点で、非特許文献３記載のＸＦ　ｈＥＳＣ培地（コントロール、１１日目までと同じ）、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含むハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ（＋）、ナカライテスク社）、前記ＸＦ　ｈＥＳＣ培地より栄養因子であるｂＦＧＦ、ｈｅｒｅｇｌｉｎ、ＩＧＦ－１を除いた培地（ＧＦ（－）培地）、および、前記ＸＦ　ｈＥＳＣ培地において前記栄養因子を除いた上にＸＦ－ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ＸＦ　ＣＴＳ　（ＸＦ－ＫＳＲ；　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））濃度を１％とした培地（１％ＸＦ－ＫＳＲ培地）にそれぞれ置換して培養継続し、適宜、観察した上で写真取得を行った。
　培地を置換した後に４日間培養した時点での培養物の観察像を図３１に示し、培地を置換した後に１０日間培養した時点での培養物の観察像を図３２に示す。ＨＢＳＳ（＋）では細胞剥離が見られ不適であったのに対して、栄養因子を除去した培地（ＧＦ（－）及び１％ＸＦ－ＫＳＲ）では小さな袋状構造物及び細胞が、細胞培養基材の細胞培養部上に接着した状態で維持されていることが確認された。なおコントロールでは培養開始後３週間である図３２の段階で通常通りの大きさおよび形状での袋状構造物が見られており培養自体は正常であったと考えられる。
　また培養を更に継続するとコントロールでは袋状の細胞構造物および付随する細胞の自然剥離が見られたのに対して、栄養因子を除去した培地（ＧＦ（－）及び１％ＸＦ－ＫＳＲ）では細胞及び袋状の細胞構造物の接着状態が維持されることが観察された。このことは、栄養因子を除去した培地中では、袋状の細胞構造物を細胞培養基材上に接着した状態で維持することができること、前記細胞構造物中での細胞や組織が維持されることを示唆する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
    　前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
    細胞培養基材上に幹細胞を播種すること、並びに
    　播種された前記幹細胞を培養して、前記幹細胞の一部を小腸上皮細胞に分化させることを含む、小腸上皮細胞を含む細胞構造物の製造方法。
  2. 　前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
    　前記細胞構造物のＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量及びＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＡＢＣＧ２トランスポーターの発現量の前記相対値が、ＡＢＣＢ１トランスポーターの発現量の前記相対値に対して、９０倍以上である、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
  5. 　小腸上皮細胞を含む細胞構造物であって、
    　前記細胞構造物のＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量を、それぞれ、起源動物の小腸組織でのＣＵＢＮの発現量及びＶｉｌｌｉｎの発現量に対する相対値として表したとき、前記細胞構造物でのＣＵＢＮの発現量の前記相対値が、Ｖｉｌｌｉｎの発現量の前記相対値に対して、０．２～１．８の範囲にある、小腸上皮細胞を含む細胞構造物。
  6. 　前記発現量が、それぞれ、ｍＲＮＡ量に基づく発現量である、請求項４又は５に記載の細胞構造物。
  7. 　内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の細胞構造物。
  8. 　細胞培養部を含む表面を有する細胞培養基材であって、
    　前記細胞培養部が、細胞非接着部と、前記細胞非接着部の周縁に沿って連続的に又は断続的に延在し、前記細胞非接着部を囲う細胞接着部とを含む、
    細胞培養基材、並びに
    　前記細胞培養部上に接着された、小腸上皮細胞を含む細胞構造物
    を含む、細胞構造物保持基材。
  9. 　前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、少なくとも前記細胞接着部と重なる位置に前記小腸上皮細胞が存在する、請求項８に記載の細胞構造物保持基材。
  10. 　前記表面の法線方向に沿って前記細胞構造物保持基材を見た場合に、前記細胞構造物が、前記細胞接着部及び前記細胞非接着部と重なり、
    　前記小腸上皮細胞が、前記細胞非接着部と重なる位置よりも前記細胞接着部と重なる位置に多く存在する、請求項９に記載の細胞構造物保持基材。
  11. 　前記細胞構造物が、内胚葉系細胞、外胚葉系細胞及び中胚葉系細胞を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
  12. 　前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線と、前記細胞接着部の内周との２つの交点の間の距離が、８０μｍ超、且つ、８８０μｍ以下である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
  13. 　前記細胞接着部の、前記細胞接着部の内周上の前記細胞非接着部を介して対向する最も離れた２つの点の中間点を通る直線に沿った方向の幅が、３０μｍ超、且つ、４００μｍ以下である、８～１２のいずれか１項に記載の細胞構造物保持基材。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028274A1 (ja) * 2004-09-08 2006-03-16 National University Corporation Nagoya University 細胞培養物の生産と該生産に用いる材料
WO2014132933A1 (ja) * 2013-02-26 2014-09-04 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法
JP2018531011A (ja) * 2015-10-08 2018-10-25 ウニベルジテ・デュ・ルクセンブルクＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｕ Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ 中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法
JP2019000014A (ja) * 2017-06-13 2019-01-10 大日本印刷株式会社 腸オルガノイド及びその作製方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2638176B1 (en) 2010-11-09 2017-08-23 Arcedi Biotech APS Enrichment and identification of fetal cells in maternal blood and ligands for such use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028274A1 (ja) * 2004-09-08 2006-03-16 National University Corporation Nagoya University 細胞培養物の生産と該生産に用いる材料
WO2014132933A1 (ja) * 2013-02-26 2014-09-04 公立大学法人名古屋市立大学 人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法
JP2018531011A (ja) * 2015-10-08 2018-10-25 ウニベルジテ・デュ・ルクセンブルクＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄｕ Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ 中脳オルガノイドを作製するための手段及び方法
JP2019000014A (ja) * 2017-06-13 2019-01-10 大日本印刷株式会社 腸オルガノイド及びその作製方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOSOYA, KENICHI ET AL.: "Transporter mRNA Expression in a Conditionally Immortalized Rat Small Intestine Epithelial Cell Line (TR -SIE)", DRUG METAB. PHARMACOKIN., vol. 19, no. 4, 2004, pages 264 - 269, XP055726018 *
UCHIDA, HAJIME: "A xenogeneic-free system generating functional human gut organoids from pluripotent stem cells", JCI INSIGHT, vol. 2, no. 1, 12 January 2017 (2017-01-12), pages e86492, XP055645928 *

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