JP6139054B2 - 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関し、詳しくは、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることの可能な細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する。

生物は自己の生命を維持するため、生体の欠失した細胞・組織を速やかに補完・修復する能力を有しており、この能力を「再生能」と呼ぶ。高等動物における「再生能」の例としては、皮膚や血管等の創傷治癒が一般によく知られているが、肝臓や腎臓といった大型の実質臓器においても、組織傷害に対して速やかにその組織恒常性を回復させるべく、細胞の増殖や組織の再構築が起こることが知られている。近年、この生物個体が生来有している「再生能」を利用して、各種疾病や創傷を治癒・改善させる試みが進められており、これらは「再生医療」と呼ばれ、新しい医療技術として注目されている。

「再生医療」を実施するにあたり、中心的な役割を果たすのが「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」である。一般に「幹細胞」とは、ある特定の、または複数の機能的細胞に分化する能力、及び自らと同じ細胞を繰り返し産生できる自己複製能とを有する未分化な細胞と定義することができる。各種組織・細胞には固有の幹細胞が存在し、例えば、赤血球やリンパ球、巨核球等の一連の血液細胞は、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる幹細胞から当該細胞に由来する前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）を経て産生され、骨格筋細胞は、筋衛星細胞（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ）や筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）と呼ばれる幹細胞／前駆細胞から生じる。その他、脳や脊髄等の神経組織に存在し、神経細胞やグリア細胞を産生する神経幹細胞、表皮細胞や毛根細胞を産生する表皮幹細胞、肝細胞や胆管細胞を作る卵円形細胞（肝幹細胞）、心筋細胞を作る心幹細胞等がこれまでに特定されている。

幹細胞又は当該細胞に由来する前駆細胞を用いた再生医療法の一部は既に実用化されており、白血病や再生不良性貧血等、血球系細胞の不足・機能不全に起因する疾患の治療のため、造血幹細胞又は造血前駆細胞を注入移植する方法がよく知られている。ところが、脳や心臓、肝臓等の実質臓器内に存在する幹細胞の場合、生体組織からの採取及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が技術的に困難であり、しかも一般にこれらの幹細胞は増殖能が低い。一方、当該幹細胞を死体組織から回収することも可能であるが、この様にして得られた細胞を医療に用いることは、倫理的に問題がある。そのため、神経疾患や心疾患等を対象とした再生治療を実施するためには、この様な対象組織内に存在する幹細胞以外の細胞を用いて、所望する細胞種を作製する技術の開発が必要である。

この様な観点に基く試みとしては、まず「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）」を利用する方法が挙げられる。「多能性幹細胞」とは、試験管内（以下、ｉｎ ｖｉｔｒｏと称する）培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）が最もよく知られており、様々な研究に利用されている。

ＥＳ細胞は、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離できる。また、当該細胞は、マウス胎児組織に由来する初代培養の線維芽細胞（Ｍｕｒｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；以下、ＭＥＦ細胞）や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を用いて作製したフィーダー細胞上で、適切な細胞密度を保ち、頻繁に培養液を交換しながら継代培養を繰り返すことにより、未分化幹細胞の性質を保持したまま細胞株として樹立することが可能である。また、ＥＳ細胞の別の特徴としてテロメラーゼを有することが挙げられ、染色体のテロメア長を保持する活性を呈する当該酵素の存在により、ＥＳ細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるほぼ無制限な細胞分裂能を有している。

この様にして作製されたＥＳ細胞株は、正常核型を維持しながらほぼ無限に増殖と継代を繰り返すと共に、様々な種類の細胞に分化する能力、すなわち、多分化能を有している。例えば、ＥＳ細胞を動物個体の皮下や腹腔内、精巣内等に移植すると、奇形腫（テラトーマ）と呼ばれる腫瘍が形成されるが、当該腫瘍は神経細胞や骨・軟骨細胞、腸管細胞、筋細胞等、様々な種類の細胞・組織が混ざり合ったものである。また、マウスの場合、ＥＳ細胞を胚盤胞期胚に注入移植したもの又は８細胞期胚と凝集させて作らせた集合胚を偽妊娠マウスの子宮内に移植することにより、体内のすべて、若しくは一部の器官・組織内に、ＥＳ細胞に由来した分化細胞をある割合で含む仔個体、いわゆるキメラマウスを作出することができる。この技術は、所望の遺伝子を人為的に破壊、若しくは改変を加えたマウス個体、いわゆるノックアウトマウスを作製するための基幹技術として頻用されている。

さらに、ＥＳ細胞は、試験管内培養においても、多種多様な細胞種に分化誘導できることが知られている。細胞種によりその詳細な方法は異なるが、ＥＳ細胞を浮遊培養により凝集させ、擬似胚状態の細胞塊、いわゆる胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ；以下、ＥＢと略す）を形成させることによって分化を誘導する方法が一般的に用いられる。この様な方法により、胎児期の内胚葉や外胚葉、中胚葉の性質を有した細胞や、血球細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、グリア細胞、神経細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、脂肪細胞等の分化細胞を作製することができる。この様にしてｉｎ ｖｉｔｒｏ培養下で作製された分化細胞は、臓器・組織中に存在する細胞と、構造的から機能的にほぼ同じ形質を有しており、実験動物を用いた移植実験により、ＥＳ細胞由来細胞が臓器・組織中に定着し、正常に機能することが示されている。

以上、ＥＳ細胞の特性や培養法、及びそのｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化能に関する総説として、複数の参考書籍、例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）（非特許文献１参照）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２参照）等を参照することができる。

また、ＥＧ細胞は、始原生殖細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ）と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞等のフィーダー細胞上で、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＬＩＦと略す）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：以下、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２）若しくはフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製することができる（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２参照；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６参照）。ＥＧ細胞は、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有しており、分化多能性を有していることが確認されている（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＆ Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。そのため、以下、「ＥＳ細胞」と表記した場合は、「ＥＧ細胞」も含むことがある。

１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎらが初めて霊長類（アカゲザル）からＥＳ細胞を樹立したことにより、多能性幹細胞を用いた再生医療の実用化が現実味を帯びてきた（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５）。続いて同様の方法により、彼らはヒト初期胚からＥＳ細胞株を単離・樹立することに成功した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）。その後、オーストラリアとシンガポールの研究グループからも同様の報告（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、 Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）がなされており、現在、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上のヒトＥＳ細胞株が登録されている。一方、Ｇｅａｒｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．は、ヒト始原生殖細胞からヒトＥＧ細胞株を樹立することに成功している（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；米国特許第６，０９０，６２２号）。

これらの多能性幹細胞を研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞の未分化性及び高い増殖能を保持する方法で継代培養することが不可欠である。一般的にＥＳ／ＥＧ細胞は、ＭＥＦ細胞若しくはその類似細胞（ＳＴＯ細胞など）をフィーダーとして用いることにより、当該細胞の未分化性及び増殖能を維持することができる。培養液に添加する牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ；以下、ＦＢＳ）の存在も重要であり、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養に適したＦＢＳを選定し、当該ＦＢＳを通常、１０〜２０％量添加することが肝要である。さらに、マウス胚に由来するＥＳ／ＥＧ細胞の場合、その未分化状態を維持する因子としてＬＩＦが同定されており（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）、培養液中にＬＩＦを添加することにより、より効果的に未分化状態を保つことができる（以上、参考書籍として、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（非特許文献１）や、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）（非特許文献２）等を参照のこと）。

ところが、これらの古典的なＥＳ／ＥＧ細胞の培養法は、特にヒトＥＳ（又はＥＧ）細胞を、再生医療またはその他の実用的な目的のために使用する場合、適した方法であるとは言えない。その理由として、第一に、ヒトＥＳ細胞はＬＩＦに対する反応性を有しておらず、フィーダー細胞が存在しないと当該細胞は死滅するか又は未分化性を失って異種細胞に分化してしまう（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）ことが挙げられる。また、フィーダー細胞の使用自体にも問題があり、この様な共培養系は生産コストを高めるとともに培養スケールの拡大を困難にし、しかもＥＳ細胞を実際に使用する際に、ＥＳ細胞をフィーダー細胞から分離・精製する必要が生じてくる。また、将来的にヒトＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を再生医療用、特に細胞移植治療用の細胞ソースとして使用する場合、ＭＥＦ細胞やＦＢＳ等、非ヒト動物に由来する細胞や製品の使用は、ＥＳ細胞が異種動物由来のウイルスに感染する可能性や、異種抗原として認識され得る抗原分子に対する汚染等が危惧され、好ましくない（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：２２８，２００５）。

そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法を、より洗練され、将来的な実用化に適した方法に改良するため、ＦＢＳ代替品の開発（国際公開番号ＷＯ９８／３０６７９）や、ＭＥＦ細胞の代わりにヒト細胞をフィーダーとして用いる試み（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：９３３，２００２；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：１３１，２００３；Ｈｏｖａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄ．１８：１４０４，２００３；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６８：２１５０，２００３）が精力的に進められている。

また、フィーダーを使用しない培養法の開発も目覚しい。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ及びその共同研究者らは、ＥＳ細胞をマトリゲル又はラミニンでコーティングした培養プレートに播種し、ＭＥＦ細胞の培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）を培養液に添加することにより、ヒトＥＳ細胞を未分化かつ分化多能性を保有した状態で長期間培養できることを報告した（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１（非特許文献３）；国際公開番号第０１／５１６１６号（特許文献１）参照）。さらに、同グループは、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２や幹細胞増殖因子（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＳＣＦ）を添加した無血清培地を開発することにより、より効果的なＥＳ細胞培養系の構築に成功した（国際公開番号第 ０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。同様の無血清培地を用いた、フィーダー不要のＥＳ細胞培養系が、イスラエルの研究グループからも報告されている（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．７０：８３７，２００４（非特許文献４）参照）。

また、最近では、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２と、骨形成因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）アンタゴニストであるノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を添加することにより、ヒトＥＳ細胞の未分化性を維持する方法も報告された（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２：１８５，２００５）。一方、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ：ＧＳＫ）−３阻害剤を培養液に添加するだけで、特に成長因子等の添加をしなくても、フィーダー細胞を使わずにマウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持できることも示されている（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４（非特許文献５）参照）。

この様に、フィーダー細胞を使用しない多能性幹細胞の培養法に関し、新しい方法が考案されつつあるが、当該細胞の実用化及び産業的な使用のためには、多能性幹細胞の増殖効果及び培養法の至便性を、より一層、高めることが必要である。

マウスＥＳ／ＥＧ細胞の未分化状態を維持し、かつ、その増殖能を高める因子としては、上記のＬＩＦが公知であり、ＬＩＦに類似するＩＬ−６ファミリー分子もその範疇に含まれる（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４５：１６３，１９９４；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６参照）が、その他の例はほとんど報告されていない。最近、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２やＳＣＦを添加した無血清培地が、ヒトＥＳ細胞の増殖能を著明に亢進することが報告された（国際公開番号第０３／０２０９２０号（特許文献２）参照）。

従来はそもそもＥＳ細胞の特性、すなわち、当該細胞の増殖性が他の細胞と比較して旺盛であることから増殖能に係る知見を得る試みは少なく、かつ、再生医療現場のニーズから当該細胞の増殖性を高める必要性がある。

現状における多能性幹細胞の培養に関する課題の１つとして、当該細胞は一般に堅固なコロニーを形成するため、継代培養等の際の取り扱いが困難であることが挙げられる。未分化なＥＳ／ＥＧ細胞は、通常、細胞同士が互いに強く接着した状態を呈し、１つ１つの細胞の境界が不明瞭になるほどの細胞集塊、すなわち、コロニーを形成する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞の継代や、分化誘導等の実験に供する際には、トリプシン等のタンパク質分解酵素溶液で処理し、できるだけ短時間でコロニーを分散させる必要がある。しかしながら、その場合、ＥＳ／ＥＧ細胞のコロニーを分散させ、単一細胞とするためには、比較的高濃度のタンパク質分解酵素処理及び／又は激しい機械的撹拌を施す必要があり、これらの操作はＥＳ／ＥＧ細胞の生存性や生着性を著しく低下させる。

さらに、ＥＳ／ＥＧ細胞は、密集した状態で培養を続けると自発的に分化が進んでしまうので、継代時に単一細胞になるまで分散させること、また、コロニーが過度な大きさに成長する前に継代を行なうことが必要である。例えばマウスＥＳ細胞の場合、通常、２〜３日ごとに継代をする必要があるが、その際、適切な方法で継代を行なわないと、未分化状態を逸脱した細胞が集団中に出現して、使用に適さない細胞となってしまう。これは、単にＥＳ／ＥＧ細胞の未分化性を維持する因子、例えば、上記のＬＩＦやＧＳＫ−３阻害剤を十分量添加しただけでは解決できず、過剰なコロニーの成長は、分化形質を有した細胞の出現を誘起する。そのため、ＥＳ／ＥＧ細胞がコロニーを形成しない状態で、すなわち、細胞が１つずつ分散した状態で増殖させる方法は、ＥＳ／ＥＧ細胞を産業上の利用に供する場合、きわめて有用であると考えられる。しかしながら、この様な試み及び／又は成功例は、これまで皆無であった。

また、近年、胚の破壊を伴わないで、皮膚や臓器の細胞から作製することのできる分化万能性細胞、いわゆる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、誘導多能性幹細胞）が作製された（特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
ｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒトにおいて樹立されている。胚の破壊という倫理面の問題を伴わないで得られることや、ヒトｉＰＳ細胞は、治療対象となる患者由来の細胞を用いて作製された後、各組織の細胞へと分化させることができるため、特に再生医学の領域において、拒絶反応のない移植材料として期待されている。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の性質を有しており、上記したようなＥＳ細胞と同様の問題を抱えている。

以前、発明者らは、胚性癌腫細胞の一種であり、通常はコロニーを形成して増殖することが知られているＦ９細胞を、Ｅ−カドヘリンをコーティングした培養プレート（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）参照）に播種することにより、当該細胞のコロニーが形成されなくなることを見い出した（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２００２．０４．１４〜１６、台北、台湾；第１回日本再生医療学会、２００２．４．１８〜１９．、京都、日本）。すなわち、Ｆ９細胞の細胞接着分子として知られるＥ−カドヘリンを無処理のポリスチレン製培養プレートに固相化した培養プレート（以下、Ｅ−ｃａｄプレート）上において、Ｆ９細胞は分散型の細胞形態を呈した。

Ｆ９細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞の特異マーカーとして知られるアルカリ性フォスファターゼ（ＡＬｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下、ＡＬＰ）やＳＳＥＡ−１、Ｏｃｔ−３／４等を発現する等、一部、ＥＳ細胞に似た形質を呈する（Ｌｅｈｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３３：１０５，１９８９，Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，３５：３８９，１９９１）。しかしながら、Ｆ９細胞の場合、フィーダー細胞やＬＩＦ等は当該細胞の未分化性を維持するために必要とはされず、その未分化維持機構には差異が認められる。また、ＥＳ細胞は三胚葉への分化能を有しているのに対し、Ｆ９細胞の分化は内胚葉系細胞に限られており、キメラ形成能も有さない。すなわち、Ｆ９細胞は、ある種の実験ではＥＳ／ＥＧ細胞のモデル系として使用される場合もあるけれども、培養法や培養条件に関しては、ＥＳ／ＥＧ細胞と異なる点が多い。

そのため、上記Ｅ−ｃａｄプレートを、フィーダー細胞を必要としないＥＳ細胞培養法に適用し得るか、また、その様な方法で培養したＥＳ細胞が未分化性及び分化多能性を保持した状態で継代培養し得るか、さらには当該ＥＳ細胞の増殖能を促進し得るか等の点に関しては、科学的根拠に基づいて予測することはできなかった。実際、Ｅ−ｃａｄプレートで培養したＦ９細胞の増殖能は、従来の細胞培養用プレートで培養したＦ９細胞とほぼ同等であり、ＥＳ細胞の増殖能を促進し得ることを類推できる事実は得られなかった。

Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞で発現していることが公知であり、また、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞では、その細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：３１８５，１９９６）。しかしながら、ＥＳ／ＥＧ細胞の培養法において、Ｅ−カドヘリンを接着基質として使用する試みは、これまで皆無であった。

上記の効率的な増殖法に加え、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞を、研究材料若しくは再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞に対し、所望する外来遺伝子を効率的に細胞内に導入し、発現させるための方法の構築も必要とされる。特にＥＳ細胞を様々な疾患治療等の再生医療に応用していくためには、当該細胞の増殖能や分化能などの細胞特性、又は薬剤感受性などを変えることも１つの手段として考えられ、その実現のためには、適当な外来遺伝子を細胞内に導入し、発現させる方法が好適である。また、マウスＥＳ細胞の場合、その遺伝子を人為的に改変することにより、いわゆるトランスジェニックマウスやノックアウトマウス等の作製ができることも広く公知であり、この場合も効率的な遺伝子導入法はきわめて有用である。

一般的に細胞に外来遺伝子を導入する場合、リン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストラン、更にはカチオン性脂質製剤等を用いる方法が頻用される。しかし、これらの方法をＥＳ細胞に適用した場合、他の細胞系と比較してその効率は低いことが知られている（Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。また、外来遺伝子を導入するための方法として、各種ウイルスベクターを用いた方法も報告されている。例えば、レトロウイルス・ベクター（Ｃｈｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０：７４１９，２０００）やアデノウイルス・ベクター（Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ５：５１，２００３）、レンチウイルス・ベクター（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７７８，２０００；Ａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１６２，２００２；国際公開番号第ＷＯ０２／１０１０５７）、センダイウイルス・ベクター（Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：２０３，２００５；日本国特許公開番号第２００４−３４４００１）等が公知である。しかしながら、ウイルスベクターの構築及び作製には比較的煩雑かつ長期の作業を必要とするとともに、用いるウイルスによっては生物学的安全性の問題も懸念され、簡便かつ汎用的な方法とは言えない。

そのため、ＥＳ細胞に外来遺伝子を導入する場合、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる方法が頻用される。本法は、細胞に電気パルスをかけることにより、細胞膜に一過的に孔を開け、外来遺伝子を細胞内に導入させる方法であり、汎用性が高い。最近では、方法の改良法として、外来遺伝子を細胞核内にまで導入し、その発現効率を著しく向上させる、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎと呼ばれる方法も確立されている（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２６：１５８９，２００４；Ｌａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：５３１，２００４（非特許文献８）参照）。ただし、これらの方法は特別な電気パルス発生装置を必要とし、至適条件の設定も難しい。また、細胞をいったんトリプシン等の蛋白分解酵素で処理して単一細胞に分散させる必要もあり、細胞傷害性も比較的高い。
そのため、ＥＳ細胞をはじめとする多能性幹細胞の遺伝子導入法において、安価に購入できる、又は簡便に作製できる遺伝子導入剤を用い、細胞を培養器上で培養したままの状態で効率的に外来遺伝子を導入し得る方法は、きわめてその有用性が高いと考えられる。

国際公開２００１／５１６１６号 国際公開２００１／５１６１６号 国際公開２００７／０６９６６６号 国際公開２００９／０５７８３１号 国際公開２００９／０７５１１９号

Manipulatingthe Mouse Embryo:A laboratory manual(Hogan et al.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1994 Embryonic Stem Cells(Turksen編、HumanaPress,2002) Xu et al.,Nature Biotech.19:971,2001 Amit et al.,Biol.Reprod.70:837,2004 Sato et al.,Nature Med.10:55,2004 Nagaoka et al.,Biotechnol.Lett.24:1857,2002 Nagaoka et al.,Protein Eng.16:243,2003 Lakshmipathy et al.,Stem Cells 22:531,2004

上記のようなＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった分化万能性細胞を、拒絶反応のない移植材料として用いるためには、特定の細胞に分化させる必要がある。分化万能性細胞を任意の細胞に分化させるに当たっては、分化誘導の効率はもとより、分化誘導後の細胞の均一性が求められる。即ち、分化誘導後に、目的外のものに分化した細胞や未分化の細胞など目的の細胞以外の細胞が混入していることは、移植後の癌化の危険性を避けるためにも好ましくない。
例えば、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）の形成や、フィーダー細胞の使用を含む従来の分化誘導方法では、細胞塊（ｃｅｌｌ ｃｏｌｏｎｙ）が形成され、その中において３種すべての胚葉系統の細胞が誘導されてしまい、目的の細胞のみを高い純度で得ることができないといった問題があった。

そこで本発明の目的は、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることが可能であり、分化後の細胞の選抜にも用いることができる細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することにある。

本発明者等は鋭意検討した結果、表面に、特定のタンパク質とポリマーを、固定またはコーティングした細胞培養基材とすることにより上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法に関する、以下の［１］〜［１１］である。

［１］表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質を固定またはコーティングした後、糖側鎖を有するポリマーを固定またはコーティングした細胞培養基材であって、
前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、（１）Ｅ−カドヘリン、（２）Ｅ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質であって、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質、または、（３）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上であり、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質であり、
前記糖側鎖がラクトースまたはガラクトースであることを特徴とする細胞培養基材。
［２］前記ポリマーの主鎖がポリスチレンである［１］の細胞培養基材。
［３］前記糖側鎖を有するポリマーが、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）である［１］または［２］の細胞培養基材。
［４］前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質が、Ｅ−カドヘリンと、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である［１］〜［３］のいずれかの細胞培養基材。
［５］前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質と、糖側鎖を有するポリマーとが海島構造を形成している［１］〜［４］のいずれかの細胞培養基材。
［６］［１］〜［５］のいずれかの細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
［７］［１］〜［５］のいずれかの細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
［８］多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる［７］の多能性幹細胞の分化誘導方法。
［９］［１］〜［５］のいずれかの細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とする細胞培養方法。
［１０］前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）である［９］の細胞培養方法。

本発明により、フィーダー細胞を用いずに多能性幹細胞を培養することができ、多能性幹細胞を高い純度で、特定の細胞に分化させることの可能であり、分化後の細胞の選抜にも用いることができる細胞培養基材およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法を提供することが可能となる。

ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層の調製方法と、共固定化基層上でのＥＳ細胞の肝細胞への分化誘導方法を表す模式図である。（Ａ）ＰＶＬＡの分子式を表す。ガラクトース残基は、肝細胞細胞膜上のＡＳＧＰＲに結合する。（Ｂ）ポリスチレン表面への、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化方法を表す模式図である。（Ｃ）マウスＥＳ細胞の肝細胞への分化誘導ステップを表す模式図である。分化状態は４つの段階に分けることができる。内胚葉系中胚葉、胚体内胚葉、肝前駆細胞、肝細胞である。分化誘導開始後の日数、使用培地、成長因子については、上部の表記載の通りである。拡大部分はそれぞれ、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層やＰＶＬＡ単独コート基層に対する細胞接着の様子を表す模式図である。 ＰＶＬＡ、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃのポリスチレン表面に対する吸着量の変化を表すグラフ図であり、（Ａ）がＰＶＬＡの、（Ｂ）がＥ−ｃａｄ−Ｆｃの、Ｌａｎｇｍｕｉｒ吸着式から作成した吸着等温曲線である。（Ｃ）は、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共吸着を示すグラフである。１００μｇ／ｍＬ ＰＶＬＡ（立ち上がりが一番遅いグラフ）は、１００μｇ／ｍＬのＰＶＬＡ単独の吸着を示すグラフであり、１０μｇ／ｍＬ Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ（２番目に立ち上がるグラフ）は、１０μｇ／ｍＬのＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独の吸着を示すグラフである。７．５μｇ／ｍＬ Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ ｔｈｅｎ １００μｇ／ｍＬ ＰＶＬＡ（立ち上がりが一番早いグラフ）は、７．５μｇ／ｍＬのＥ−ｃａｄ−Ｆｃを吸着させた後に、１００μｇ／ｍＬのＰＶＬＡを吸着させたときのグラフである。それぞれ、吸着後、３回洗浄しており、洗浄後も安定に吸着していることを示す。 （Ａ）初代培養肝細胞の、様々な基層上での培養を示す写真図である。写真は上から、ゼラチン基層、コラーゲン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＰＶＬＡ単独基層、ＰＶＬＡおよびＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層上で培養した（１日後、３日後、５日後、７日後）、初代培養肝細胞の蛍光顕微鏡写真である。ＡＬＢと表記された列の写真はそれぞれ、抗アルブミン抗体による免疫染色の結果を示す。Ｍｅｒｇｅｄと表紙された列の写真はそれぞれ、ＤＡＰＩによる核染色と、上記免疫染色とをマージさせたものである。（Ｂ）抗アルブミン抗体を用いたウェスタンブロットの結果を表す写真図である。抗β−アクチン抗体をコントロールとして用いた。それぞれの日数（Ｄａｙ１、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、Ｄａｙ７）において、Ｇと表記されたレーンはゼラチン基層、ＥはＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＰはＰＶＬＡ単独基層、ＥＰはＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞を表す。（Ｃ）アルブミン（ＡＬＢ）、ＨＮＦ−４α、ＡＳＧＰＲ、ｍＴＯ、Ｇ６Ｐ、Ｅ−カドヘリンそれぞれの遺伝子発現を調べたＲＴ−ＰＣＲの結果を示すアガロース電気泳動の写真図である。それぞれのレーンの表記は、上記（Ｂ）と同様である。（Ｄ）培地中に分泌されたアルブミンの量を調べるために行ったアルブミンＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは細胞数により標準化したものである。（Ｅ）グリコーゲン蓄積量を調べる為に行ったＰＡＳ反応の結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは、細胞数で標準化したものである。 （Ａ）ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＰＶＬＡ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦＣとＰＶＬＡの共固定化基層上で２日間培養した未分化マウスＥＳ細胞（ＥＢ３）の顕微鏡写真である。（Ｂ）ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上での、未分化細胞の培養時間ごとの細胞数の変化を示すグラフ図である。 （Ａ）未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４）、中胚葉マーカー（Ｂｒａ）、内胚葉マーカー（Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７）、外胚葉マーカー（Ｐａｘ６、ＴＨ）のそれぞれの遺伝子発現レベルを調べたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す、アガロース電気泳動の写真図である。Ｇと表記されたレーンはゼラチン基層、ＥはＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＰはＰＶＬＡ単独基層、ＥＰはＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞を表す。ＥＳと表記されたレーンは、未分化ＥＳ細胞であることを示し、Ｄａｙ４は分化誘導開始から４日後、Ｄａｙ６は６日後の細胞を用いたことを表す。ＰＨは初期肝細胞のレーンであり、コントロールである。（Ｂ）Ｓｏｘ１７遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。ゼラチン基層上で１日培養した初代培養肝細胞の結果をコントロールとして用いた。（Ｃ）抗Ｓｏｘ１７抗体、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いた免疫染色の結果を示す顕微鏡写真図である。それぞれ、ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した、分化誘導開始から５日目の細胞である。（Ｄ）分化誘導開始後５日目の細胞を用いて抗Ｓｏｘ１７抗体と抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色を行い、それぞれのタンパク質を発現している細胞の割合を調べた結果を示すグラフ図である。各抗体について、左のバーがＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層、右のバーがゼラチン基層上で培養した細胞を表す。 （Ａ）肝前駆細胞マーカー遺伝子（ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＣＫ１８、ＨＮＦ−４α）について行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す、アガロース電気泳動の写真図である。β−アクチンをコントロールとした。それぞれの日数（Ｄａｙ４〜Ｄａｙ１８）において、Ｇと表記されたレーンはゼラチン基層、ＥはＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＥＰはＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞を表す。（Ｂ）ＡＦＰ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｃ）ＡＬＢ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｄ）ＣＫ１８遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｅ）ＨＮＦ−４α遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｆ）分化誘導開始１０日目の細胞について、抗ＡＦＰ抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す、蛍光顕微鏡の写真図である。（Ｇ）分化誘導開始１６日目の細胞について、抗ＡＬＢ抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す、蛍光顕微鏡の写真図である。（Ｈ）抗ＡＦＰ抗体、抗ＡＬＢ抗体を用いて免疫染色を行い、それぞれのタンパク質を発現している細胞の割合を調べた結果を示すグラフ図である。各抗体について、左のバーがＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層、右のバーがゼラチン基層上で培養した細胞を表す。抗ＡＦＰ抗体による免疫染色は分化誘導開始１０日目の細胞を用い、抗ＡＬＢ抗体による免疫染色は分化誘導開始１６日目の細胞を用いた。（Ｉ）分化誘導開始１６日目の細胞について、抗アルブミン抗体を用いて行ったウェスタンブロットの結果を示す写真図である。β−アクチンをコントロールとした。Ｇと表記されたレーンはゼラチン基層、ＥはＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＥＰはＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞を表す。 （Ａ）初期肝細胞分化マーカー（ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＣＫ１８、ＨＮＦ−４α）遺伝子、肝細胞分化の最終段階マーカー（ＡＳＧＰＲ、ｍＴＯ）遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す、アガロース電気泳動の写真図である。β−アクチンをコントロールとした。（Ｂ）ＡＳＧＰＲ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｃ）ｍＴＯ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲの結果をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて処理し、相対的発現量を数値化したものを示すグラフ図である。β−アクチンの結果を用いて標準化処理した。初代培養肝細胞（ＰＨ）、未分化ＥＳ細胞（ＥＳ）、自発的分化細胞（ＳＤ）をコントロールとした。（Ｄ）抗ＡＬＢ抗体、抗ＡＳＧＰＲ抗体を用いた免疫染色の結果を示す顕微鏡写真図である。それぞれ、ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した、分化誘導開始から２４日目の細胞である。（Ｅ）培地中に分泌されたアルブミンの量を調べるために行ったアルブミンＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは細胞数により標準化したものである。ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した、分化誘導開始２０日目（ｄａｙ２０）、２４日目（ｄａｙ２４）の細胞を用いた。ＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞をコントロールとして用いた。（Ｆ）グリコーゲン蓄積量を調べる為に行ったＰＡＳ反応の結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは、細胞数で標準化したものである。ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した、分化誘導開始２０日目（ｄａｙ２０）、２４日目（ｄａｙ２４）の細胞を用いた。ＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞をコントロールとして用いた。（Ｇ）培地中における尿素レベルをＵｒｅａ ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて測定した結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは、細胞数で標準化したものである。ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した、分化誘導開始２０日目（ｄａｙ２０）、２４日目（ｄａｙ２４）の細胞を用いた。ＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞をコントロールとして用いた。 （Ａ）ゼラチン基層、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞について、分化誘導開始１８日、２０日、２２日、２４日目において、キレート剤（ＣＤＢ）を用いて分化細胞を分離し、ＰＶＬＡコートした培養皿上に播種し、結着アッセイを行い、細胞の相対的な結着率を計算した結果を表すグラフ図である。コラーゲン基層上で培養した初代培養肝細胞を分離し、ＰＶＬＡコートした培養皿に播種し、結着アッセイを行った結果をコントロールとし、結着率１００％とした（Ｃ）。また、コントロールとして、初代培養肝細胞をＰＶＬＡ単独基層上で培養した細胞を用いた（Ｐ）。（Ｂ）ゼラチン基層上、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で分化させたマウスＥＳ細胞、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で分化誘導培養後、分離し、ＰＶＬＡコートした培養皿上に播種してから３日培養した細胞、それぞれの形態を示す顕微鏡写真図である。（Ｃ）中胚葉マーカー（Ｂｒａ）、内胚葉マーカー（Ｇａｔａ６、Ｓｏｘ１７）、肝細胞マーカー（ＡＳＧＰＲ、ｍＴＯ、Ｇ６Ｐ）、膵臓マーカー（Ｐｄｘ１）遺伝子について行ったＲＴ−ＰＣＲの結果を示す、アガロース電気泳動の写真図である。β−アクチンをコントロールとした。Ｇと表記されたレーンはゼラチン基層、ＥはＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独基層、ＰはＰＶＬＡ単独基層、ＥＰはＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で培養した細胞を表す。Ｂｅｆｏｒｅは、それぞれの基層上で２４日間分化誘導培養したものを表し、Ａｆｔｅｒは、Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で２２日間分化誘導培養後、分離し、ＰＶＬＡ単独基層に再播種し、３日間培養した細胞を表す。ゼラチン基層上で維持したマウスＥＳ細胞（ＥＳ）、ＰＶＬＡ基層上で１日培養した初代培養肝細胞（ＰＨ）をコントロールとして用いた。（Ｄ）培地中に分泌されたアルブミンの量を調べるために行ったアルブミンＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは細胞数により標準化したものである。Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で２２日間分化誘導培養後、分離し、ＰＶＬＡ単独基層に再播種し、３日間培養した細胞（Ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｎ ＰＶＬＡ）とＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞を用いた。（Ｅ）グリコーゲン蓄積量を調べる為に行ったＰＡＳ反応の結果を示すグラフ図である。Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で２２日間分化誘導培養後、分離し、ＰＶＬＡ単独基層に再播種し、３日間培養した細胞（Ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｎ ＰＶＬＡ）とＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞を用いた。グラフは、Ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｎ ＰＶＬＡの値を１００とした相対値を表す。（Ｆ）培地中における尿素レベルをＵｒｅａ ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて測定した結果を示すグラフ図である。それぞれのグラフは、細胞数で標準化したものである。Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化基層上で２２日間分化誘導培養後、分離し、ＰＶＬＡ単独基層に再播種し、３日間培養した細胞（Ｒｅ−ｓｅｅｄｉｎｇ ｏｎ ＰＶＬＡ）とＰＶＬＡ単独基層上で３日間培養した初代培養肝細胞を用いた。

［定義］
本明細書中に使用するとき、用語「多能性幹細胞」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞をいう。「多能性幹細胞」は、初期胚より単離されるＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びその類似細胞であり、胎児期の始原生殖細胞から単離されるＥＧ細胞を含むが、これに限定されない。本明細書中、「ＥＳ細胞」と表記した場合は「ＥＧ細胞」も含むこともある。

本明細書中に使用するとき、用語「未分化性」とは、多能性幹細胞において、少なくとも１つ以上の未分化マーカー、例えばＡＬＰ活性やＯｃｔ−３／４遺伝子（産物）の発現、または種々の抗原分子の発現により確認することができる未分化な状態を呈する性質を意味する。多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。

本明細書中に使用するとき、用語「分化多能性」とは、様々な種類の細胞に分化する能力をいう。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。

本明細書中に使用するとき、用語「液体培地」とは、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができる液体培地をすべて含む。

本発明の培養基材としては、培養皿（ディッシュ）、９６穴、４８穴などのマイクロプレート、プレートやフラスコ等、従来から細胞培養に用いられているもののいずれをも使用できる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料、またはポリスチレンやポリプロピレン等の有機材料のいずれかからなることができるが、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるものが好ましい。

カドヘリンファミリーに属するタンパク質を、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、カドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間〜一昼夜、より好ましくは１時間〜１２時間、接触させることで達成できる。また、前もって接着性分子に人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。

上述の様に作製した培養基材は、多能性幹細胞の通常の培養法にそのまま使用することができる。すなわち、適当数の多能性幹細胞を、通常用いられる液体培地又は細胞培養液に懸濁し、それを当該培養基材に添加すればよい。その後の液体培地の交換や継代も、従来法と同様に行なうことができる。

本明細書中に使用するとき、用語「同種親和性の結合」とは、細胞接着において、細胞−細胞又は細胞−基材間の接着性分子を介した結合において、同じ種類の接着性分子同士が結合又は会合することによりなされているものを意味する。

本明細書中に使用するとき、用語「フィーダー細胞」とは、支持細胞とも称され、単独では生存・培養できない細胞を培養する際に、あらかじめ培養され、培地中に不足する栄養分や増殖因子の補給などの役割を担う別の細胞をいう。「フィーダー細胞」には、ＭＥＦ細胞や、ＳＴＯ細胞等の間質系細胞を含むが、これに限定されない。

本明細書中に使用するとき、用語「分散状態」とは、細胞が培養基材表面に接着した状態で生育している場合において、明確なコロニーを形成せず、個々の細胞が他の細胞と接触していない、または、一部接触していても、その接触領域がごく小さい状態を意味する。

本明細書中に使用するとき、用語「遺伝子」とは遺伝物質を指し、転写単位を含む核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、天然由来又は人為的に設計された配列であり得る。また、遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムやｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ／ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等の機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。

糖側鎖を有するポリマーとは、好ましくはエチレン性不飽和結合を重合させて得られる主鎖と、糖側鎖とを有するポリマーである。糖側鎖としては、グルコース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられるが、ラクトースまたはガラクトースが好ましい。ラクトース中のβ−ガラクトース、β−ガラクトース側鎖が、アシアロ糖タンパク質レセプターにより特異的に認識され、細胞の結着に寄与しうるからである。糖側鎖を有するポリマーは、スチレン誘導体ポリマーであることが好ましく、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）（以下、「ＰＶＬＡ」とも称する）が最も好ましい。

糖側鎖を有するポリマーを、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、糖側鎖を有するポリマーを含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間〜一昼夜、より好ましくは１時間〜１２時間、接触させることで達成できる。また、前もって糖側鎖を有するポリマーに人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。

本発明の上記効果や他の利点および特徴を、以下の好適な実施態様の詳細な説明において詳述する。

［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材は、表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、糖側鎖を有するポリマーを、固定またはコーティングしたことを特徴とするものである。

カドヘリンとは、接着結合又はアドヘレンス・ジャンクション（ａｄｈｅｒｅｎｓ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）と呼ばれるＣａ^２＋依存性の細胞間接着・結合に関与する接着分子であり、Ｅ（上皮）型、Ｎ（神経）型、Ｐ（胎盤）型の３種が代表例として知られている。これらのカドヘリン分子は、７００〜７５０アミノ酸残基からなる膜結合型糖タンパク分子であり、その細胞外領域には、約１１０アミノ酸残基からなる繰り返し構造、いわゆるＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＥＣ）ドメインと呼ばれる領域が５個存在する。例えば、ヒトＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号１に示す）の場合、ＥＣ１、 ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５７〜２６２、２６５〜３７５、３７８〜４８６、４８７〜５９５、５９６〜７００に相当する（数値は配列番号１に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。また、マウスＥ−カドヘリン（そのアミノ酸配列を配列番号２に示す）の場合、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５の各ドメインは、それぞれ１５９〜２６４、２６７〜３７７、３８０〜４８８、４８９〜５９７、５９８〜７０２に相当する（数値は配列番号２に示すアミノ酸配列内の残基の番号である）。これらのＥＣドメインは、異なるカドヘリン分子種の間で相同性を有しており、特にＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２）の相同性が高い。この様な類似の構造を呈するカドヘリン分子としては、現在、５０種類以上のものが知られており、これらの分子を総称してカドヘリン・ファミリーと呼ぶ。以上、カドヘリンに関する総説としては、Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：６１９，１９９５；Ｍａｒｒｓ ＆ Ｎｅｌｓｏｎ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１６５：１５９，１９９６；Ｙａｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３：１１９，１９９７；Ｙａｇｉ ＆ Ｔａｋｅｉｃｈｉ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１１６９，２０００；Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４８：３９９，２０００、等を参照のこと。

Ｅ−カドヘリン（別名、カドヘリン−１）は、肝臓や腎臓、肺等の内臓臓器の実質細胞やケラチノサイト等の上皮細胞に広く発現し、その細胞間接着を担う重要な接着分子であることが知られている（総説として、Ｍａｒｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：２２７，１９９３；Ｍａｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６０：７６３，１９９５；Ｅｌ−Ｂａｈｒａｗｙ ＆ Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．４３：２２４，１９９８；Ｎｏｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２：７７，１９９９）。また、Ｅ−カドヘリンは、未分化なマウスＥＳ細胞にも強く発現しており、Ｅ−カドヘリン遺伝子の発現を遺伝子工学的に欠失させたＥＳ細胞は、細胞間接着が著しく阻害されることが知られている（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：３１８５，１９９６）。また、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の公的な遺伝子発現データベースに登録されている情報から、Ｅ−カドヘリン遺伝子がヒトＥＳ細胞株でも発現していることが確認できる。

カドヘリンファミリーに属するタンパク質を作製する方法としては、特にこれを限定しないが、分子生物学的手法を用いてリコンビナント・タンパク質を作製・精製し、これを使用することが望ましい。その他にも、同様の効果を示す方法であれば、いずれをも用いることができ、例えば、多能性幹細胞のカドヘリンファミリーに属するタンパク質を、生体組織・細胞から抽出、精製して使用すること、又は当該ペプチドを化学的に合成して使用することも可能である。

カドヘリンファミリーに属するタンパク質に関し、そのリコンビナント・タンパク質を作製するための方法、及び当該分子をコードする遺伝子を取得する方法は、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、上記で挙げた参考書籍を参照することができるが、特にこれを限定しない。Ｅ−カドヘリンを例とした場合、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、既にヒト（配列番号１）、マウス（配列番号２）、ラット等の動物で単離・同定され、その塩基配列が、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能である（アクセス番号：（ヒト）ＮＭ＿００４３６０；（マウス）ＮＭ＿００９８６４；（ラット）ＮＭ＿０３１３３４）。そのため、当業者であれば、Ｅ−カドヘリン遺伝子に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。また、Ｅ−カドヘリン遺伝子のｃＤＮＡは、理化学研究所ジーンバンク（日本・筑波）やＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社／ＲｅｓＧｅｎ等からも購入することができる。使用するカドヘリンファミリーに属するタンパク質をコードする遺伝子としては、多能性幹細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましく、例えば、マウスＥＳ細胞を用いて本発明を実施する場合、マウスのＥ−カドヘリンｃＤＮＡの使用が望ましい。しかし、異種動物由来のもの、即ち、ヒトやサル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、又は鳥類（例えば、ニワトリ等）、又は両生類（例えば、アフリカツメガエル等）由来のＥ−カドヘリンｃＤＮＡも使用することができる。

カドヘリンファミリーに属するタンパク質のリコンビナント・タンパク質を作製するための好適な方法の一例は、当該分子をコードする遺伝子を、ＣＯＳ細胞や２９３細胞、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞に導入し、発現させることを特徴としている。好ましくは、当該遺伝子は、広範な哺乳動物細胞における遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。また、転写・発現させる遺伝子は、さらにポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。好適なプロモーターとしては、ＳＶ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ）４０ウイルスやサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏ Ｖｉｒｕｓ；ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター等が挙げられる。

上記のリコンビナント・タンパク質を作製するために用いる遺伝子は、当該分子をコードする遺伝子の全長領域を含むものである必要はなく、部分的な遺伝子配列であっても、その部分配列がコードするタンパク質またはペプチド分子が、本来の当該分子と同程度、又はそれ以上の接着活性を有するものであればよい。例えば、本発明の好適な事例に用いられるＥ−カドヘリンの場合、細胞外領域をコードする、Ｎ末端側から６９０〜７１０アミノ酸残基を含む部分配列から作製されるリコンビナント・タンパク質、すなわちＥＣ１〜ＥＣ５ドメインを含むタンパク質を使用することができる。また、一般的にカドヘリン分子は、最もＮ末端側に位置するドメイン（ＥＣ１）が、当該分子の結合特異性、すなわち、同種親和性を規定している（Ｎｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１：１４７，１９９０）ため、少なくともＥＣ１を含み、それ以外のドメインの１個又は数個を除いたタンパク質分子を作製、使用することも可能である。さらには、上記のタンパク質分子と、アミノ酸レベルで８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を示し、かつ、接着活性を有するタンパク質も使用することができる。

また、上記のリコンビナント・タンパク質は、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質として作製することも可能である。例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域やＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タンパク質、ＭＢＰ（Ｍａｎｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、アビジン・タンパク質、Ｈｉｓ（オリゴ・ヒスチジン）タグ、ＨＡ（ＨｅｍＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｒｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）タグ等との融合タンパク質として作製し、プロテインＡ／Ｇカラムや特異的抗体カラム等を用いることにより、リコンビナント・タンパク質の精製を容易に、しかも効率よく行なうことができる。特にＦｃ融合タンパク質は、ポリスチレン等を材料とした培養基材に吸着する能力が高まるため、本発明の実施において好適である。

イムノグロブリンのＦｃ領域をコードする遺伝子は、既にヒトをはじめとする哺乳動物で、多数、単離・同定されている。その塩基配列も数多く報告されており、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含む塩基配列の配列情報は、ＮＣＢＩ等の公的なＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、それぞれ、アクセス番号：ＡＪ２９４７３０、ＡＪ２９４７３１、ＡＪ２９４７３２、及びＡＪ２９４７３３として登録されている。したがって、当業者であれば、Ｆｃ領域に特異的なプライマー又はプローブを設計し、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、Ｆｃ領域部分をコードするｃＤＮＡを取得・使用することが可能である。この場合、使用するＦｃ領域をコードする遺伝子としては、動物種やサブタイプは特にこれを限定しないが、プロテインＡ／Ｇとの結合性が強いヒトＩｇＧ１やＩｇＧ２、又はマウスＩｇＧ２ａやＩｇＧ２ｂ等のＦｃ領域をコードする遺伝子が好ましい。また、Ｆｃ領域に変異を導入することによりプロテインＡとの結合性を高める方法も知られており（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）、当該法により遺伝子改変を加えたＦｃタンパク質も使用することもできる。

なお、本発明を実施するための好適に用いられるＥ−カドヘリンの場合、当該リコンビナント・タンパク質の作製法の一例として、発明者らの既報告論文を挙げることができる（Ｎａｇａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２４：１８５７，２００２（非特許文献６）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：２４３，２００３（非特許文献７）参照）。

また、マウス又はヒトのＥ−カドヘリンの細胞外領域をコードするｃＤＮＡに、ヒトＩｇＧのＦｃ領域部分をコードする配列及びＨｉｓタグ配列のｃＤＮＡを連結させた融合遺伝子をマウス細胞に導入し、これを発現させて作製した精製リコンビナント・タンパク質（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ−Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｔｅｃｈｎｅ社）が市販されており、マウス又はヒト由来のＥ−カドヘリン・タンパク質として使用することもできる（Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質）。

糖側鎖を有するポリマーとは、好ましくはエチレン性不飽和結合を重合させて得られる主鎖と、糖側鎖とを有するポリマーである。糖側鎖としては、グルコース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられるが、ラクトースまたはガラクトースが好ましい。ラクトース中のβ−ガラクトース、β−ガラクトースが、アシアロ糖タンパク質レセプターにより特異的に認識され、細胞の結着に寄与しうるからである。糖側鎖を有するポリマーは、ポリスチレン主鎖を有するスチレン誘導体ポリマーであることが好ましく、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）（以下、「ＰＶＬＡ」とも称する）が最も好ましい。

細胞培養用の培養基材としては、例えば、ディッシュ（培養皿とも称する）、シャーレやプレート（６穴、２４穴、４８穴、９６穴、３８４穴、９６００穴などのマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレート等）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、セルファクトリー、ローラーボトル、スピンナーフラスコ、フォロファイバー、マイクロキャリア、ビーズ等が挙げられる。これらの培養基材は、ガラス等の無機材料又はポリスチレン等の有機材料のいずれからなっていてもよいが、蛋白質やペプチド等に対する吸着性が高いポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の材料や、又は吸着性を高める処理、例えば親水処理や疎水処理等を施した材料の使用が好適である。また、滅菌可能な耐熱性及び耐水性を有している材料からなるのが好ましい。そのための好適な基材の一例としては、主に大腸菌等の培養に頻用される、細胞培養用の処理を特にしていないポリスチレン製ディッシュ及び／又はプレート（以下、無処理ポリスチレン製プレートと称する）を挙げることができ、当該培養基材は一般に市販されている。

本発明で開示される方法の実施において、カドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を、上記の培養基材固相表面に固定又はコーティングする方法としては、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。接着性分子がタンパク質性やペプチド性の分子、又は糖鎖を含む高分子化合物等である場合、プレート等の培養基材固相表面に当該分子の溶液を接触させ、一定時間後に溶媒を除去することにより、簡便に当該分子を吸着させることができる。さらに具体的には、例えば、蒸留水やＰＢＳ等を溶媒とする接着性分子の溶液を、ろ過、滅菌した後、プレート等の培養基材に接触させ、数時間から一昼夜放置するだけで、当該接着性分子が固定又はコーティングされた細胞培養用基材が得られる。好ましくは、蒸留水やＰＢＳ等で数回洗浄し、ＰＢＳ等の平衡塩溶液等で置換してから使用する。

また、接着性分子に前もって人為的に抗原性分子が付加・融合させている場合は、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもでき、接着性分子を効率的に基材表面に修飾することができるため、より好ましい。この場合、特異抗体を前もって培養基材表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって固定又はコーティングしておく必要がある。例えば、接着性分子にＩｇＧのＦｃ領域タンパク質を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、培養基材に前もって修飾しておく抗体としては、ＩｇＧのＦｃ領域を特異的に認識するものを使用することができる。接着性分子に各種タンパク質やタグ配列ペプチドを融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、融合させた分子に特異的な抗体を、培養基材に前もって修飾することにより、使用することができる。

本発明の実施において、細胞培養基材の固相表面に固定又はコーティングされるカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質は少なくとも１種であるが、２種以上のカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質を組み合わせて用いてもよい。その場合、各々のタンパク質の溶液を混合し、その混合溶液を上述の方法に基き、修飾すればよい。

上記のカドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質溶液の濃度は、当該タンパク質の吸着量及び／又は親和性、さらには当該タンパク質の物理学的性質によって適宜、検討する必要があるが、Ｅ−カドヘリンの細胞外領域にＦｃ領域を融合させたリコンビナント・タンパク質の場合、０．０１〜１０００μｇ／ｍＬ程度までの濃度範囲とし、好ましくは、０．１〜２００μｇ／ｍＬ程度、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍＬ、そして最も好ましくは５〜１０μｇ／ｍＬである。

糖側鎖を有するポリマーを、培養基材の固相表面に固定又はコーティングする方法としては、上記カドヘリンファミリーに属するタンパク質の場合と同様に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法を適用することができるが、操作の容易さから吸着による方法が好ましい。吸着とは、糖側鎖を有するポリマーを含む溶液と、基材表面とを一定時間、好ましくは数時間〜一昼夜、より好ましくは１時間〜１２時間、接触させることで達成できる。また、前もって糖側鎖を有するポリマーに人為的に抗原性分子を付加・融合させておき、当該抗原性分子に対する特異抗体との結合を利用することもできる。この場合、特異抗体を、前もって培養基材の固相表面に、吸着等の物理学的方法や共有結合等の化学的方法によって、固定又はコーティングしておく必要がある。

上記培養基材の表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質や融合タンパク質、糖側鎖を有するポリマーを固定またはコーティングする過程の一態様として、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質とＰＶＬＡを用いた場合の模式図を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質、ＰＶＬＡの順でコーティングしている。この順でコーティングすると、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質によるコーティングの隙間に、ＰＶＬＡがコーティングされ、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質が海、ＰＶＬＡが島となるような海島構造を形成することと考えられる。

本発明の細胞培養基材は、後述するように、種々の多能性幹細胞の未分化性を維持したままの培養や、分化誘導因子を加えて、多能性幹細胞を分化させる培養や、多能性幹細胞を分化させた細胞群から、所望の細胞を選抜、濃縮する培養方法に好適に用いることができる。

［細胞培養方法］
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とするものである。

本発明の実施において、分子生物学や組換えＤＮＡ技術等の遺伝子工学の方法及び一般的な細胞生物学の方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＆ Ｓｔｒｉｌｉｎｇ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００３）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ第３版（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ａｎｔｉｂｏｉｄｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．＆ Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８７）等を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＳｉｇｍａ社やＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社等の市販業者から入手可能である。

また、多能性幹細胞を用いた細胞培養、及び発生・細胞生物学実験の一般的方法について、実施者は、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。

マウス及びヒトの多能性幹細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することにより、これらの多能性幹細胞を使用し得る。また、その他の動物種に関しても、例えばサル（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７８０号；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７８４４，１９９６）やラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８，１９９４；Ｌｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号第９９／２７０７６号）、ニワトリ（Ｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：２３３９，１９９６；米国特許第５，３４０，７４０号；米国特許第５，６５６，４７９号）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５６３，１９９４；Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５７：１０８９，１９９７）等に関してＥＳ細胞又はＥＳ細胞様細胞の樹立方法が知られており、各記載の方法に従って、本発明に用いられるＥＳ細胞を作製することができる。

ＥＳ細胞とは、胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）と呼ばれる細胞集塊をｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に移し、細胞塊の解離と継代を繰り返すことにより、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。マウス由来ＥＳ細胞としては、Ｅ１４、Ｄ３、ＣＣＥ、Ｒ１、Ｊ１、ＥＢ３等、様々なものが知られており、一部はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社やＣｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社等から購入することも可能である。ヒト由来ＥＳ細胞は、現在、全世界で５０種以上が樹立されており、米国・国立衛生研究所（ＮＩＨ）のリスト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｉｎｄｅｘ．ａｓｐ）には２０種以上の株が登録されている。その一部はＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社やＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎから購入することが可能である。

ＥＳ細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもＥＳ細胞を作製することが可能である（Ｍｕｎｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：９８９，２０００；Ｗａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：７４０，２００１；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：１６６９，２００４）。また、異種動物の卵細胞、又は脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞（ｃｙｔｏｐｌａｓｔｓやｏｏｐｌａｓｔｏｉｄｓと称される）に、所望する動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にＥＳ細胞を作製する方法も考案されている（国際公開番号第９９／４５１００号；第０１／４６４０１号；０１／９６５３２号；米国特許公開第０２／９０７２２号；０２／１９４６３７号）。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからＥＳ細胞を作製する試み（米国特許公開第０２／１６８７６３号；Ｖｒａｎａ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１１９１１−６）や、ＥＳ細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したＥＳ細胞を作る方法も報告されている（国際公開番号第００／４９１３７号；Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１：１５５３，２００１）。本発明で使用されるＥＳ細胞は、この様な方法により作製されたＥＳ細胞又はＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。

ＥＧ細胞は、始原生殖細胞と呼ばれる胎児期の生殖細胞を、ＥＳ細胞の場合と同様、ＭＥＦ細胞やＳＴＯ細胞、Ｓｌ／Ｓｌ^４−ｍ２２０細胞等のフィーダー上で、ＬＩＦ及びｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、又はフォルスコリン等の薬剤で刺激することにより作製されたものであり（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｋｏｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１２３５，１９９６）、ＥＳ細胞ときわめて類似した性質を有している（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＆ Ｏｄｏｒｉｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５３，２０００）。ＥＳ細胞の場合と同様、ＥＧ細胞と体細胞を融合させて作製したＥＧ細胞（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：６５１０，１９９７；Ａｎｄｒｅｗら）やＥＧ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学的手法により改変したものも、本発明の方法に使用することができる。

ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、体細胞を初期化することによって得られる多能性を有する細胞である。上記特許文献３，４，５に記載された方法により作製することができる。また、ｉＰＳ細胞は、上記特許文献記載の方法以外にも多数の変法による作製方法が知られている。国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報には、Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子、並びにＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子及びＭｙｃファミリー遺伝子の遺伝子産物を含む体細胞の核初期化因子が記載されており、さらに体細胞に上記核初期化因子を接触させる工程を含む、体細胞の核初期化により誘導多能性幹細胞を製造する方法が記載されている。この他に、上記初期化因子の一つないし複数を使用せずに、他の因子を用いたり、初期化因子に変えて、または、加えて、別の物質や遺伝子を使用する方法が知られているが、ｉＰＳ細胞の定義に入るものであればいずれの方法により作製されたものであっても使用することができる。

本発明で用いるｉＰＳ細胞は、体細胞を初期化することにより製造することができる。ここで用いる体細胞の種類は特に限定されず、任意の体細胞を用いることができる。体細胞は、生体を構成する細胞の内生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。体細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類、またはヒトなどの霊長類）であり、特に好ましくはマウス又はヒトである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。

また、多能性幹細胞は、ＥＳ細胞やＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞のみに限らず、哺乳動物の胚や胎児、臍帯血、又は成体臓器や骨髄等の成体組織、血液等に由来する、ＥＳ／ＥＧ細胞に類似した形質を有するすべての多能性幹細胞が含まれる。例えば生殖細胞を特殊な培養条件下で培養することにより得られるＥＳ様細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞ときわめて良く似た形質を呈しており（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１９：１００１，２００４）、多能性幹細胞として使用することができる。その他の例としては、骨髄細胞から単離され、三胚葉すべての系譜の細胞に分化能を有する多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｕｌｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ／ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＣ）を挙げることができる。また、毛根鞘細胞やケラチノサイト（国際公開番号第０２／５１９８０号）、腸管上皮細胞（国際公開番号第０２／５７４３０号）、内耳細胞（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：１２９３，２００３）等を特別な培養条件下で培養することにより得られた多能性幹細胞や、血液中の単核球細胞（又はその細胞核分に含まれる幹細胞）をＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ；マクロファージコロニー刺激因子）＋ＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ）処理（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：２４２６，２００３）、又はＣＲ３／４３抗体処理（Ａｂｕｌｊａｄａｙｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎｉｏｎ １９：３５５，２００３）することにより作製される多能性幹細胞等に関しても、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質を有する幹細胞であればすべて含まれる。この場合、ＥＳ／ＥＧ細胞と類似の形質とは、当該細胞に特異的な表面（抗原）マーカーの存在や当該細胞特異的な遺伝子の発現、さらにはテラトーマ形成能やキメラマウス形成能といった、ＥＳ／ＥＧ細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。

本発明の実施において、多能性幹細胞は、上記本発明の細胞培養基材に播種される。多能性幹細胞の培養方法や培養条件は、当該培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。多能性幹細胞の通常の培養方法や培養条件は、上記の参考書籍、すなわち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）や、参考文献（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７０：８４１，１９９２；Ｔｈｏｍｓｏｎら、米国特許第５，８４３，７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．米国特許第６，０９０，６２２号；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９，２０００；国際公開番号第００／２７９９５号）等を参照することができるが、特にこれらに限定されない。

多能性幹細胞を培養するための液体培地としては、多能性幹細胞を継代培養する従来の方法に適用することができるものであれば、すべて使用可能である。その具体例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地等が挙げられ、通常、２ｍＭ程度のグルタミン及び／又は１００μＭ程度の２−メルカプトエタノールを添加して使用する。また、ＥＳ細胞培養用培地として市販されているＫｎｏｃｋＯｕｔ ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）や、ＥＳ ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＴＸ−ＷＥＳ（Ｔｈｒｏｍｂ−Ｘ社）等も用いることができる。これらの培地にはＦＢＳを５〜２５％程度添加することが好ましいが、無血清培養することも可能で、例えば、１５〜２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を代用することができる。また、ＭＥＦ細胞の培養上清やｂＦＧＦ／ＦＧＦ−２、ＳＣＦ等を添加した培地を使用してもよく、その詳細な方法は公知である（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：９７１，２００１；国際公開番号第０１／５１６１６号；国際公開番号第０３／０２０９２０号；Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７０：８３７，２００４）。

上記の多能性幹細胞を培養するための液体培地には、多能性幹細胞の未分化状態を維持する作用を有する物質・因子を添加することが望ましい。具体的な物質・因子としては、特にこれを限定しないが、マウスＥＳ／ＥＧ細胞の場合、ＬＩＦが好適である。ＬＩＦは既報告論文（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｈｏｏｐｅｒ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６８８，１９８８；Ｒａｔｈｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３０８，１９９０）や、ＮＣＢＩの公的なＤＮＡデータベースにアクセス番号Ｘ１３９６７（ヒトＬＩＦ）、Ｘ０６３８１（マウスＬＩＦ）、ＮＭ＿０２２１９６（ラットＬＩＦ）等で公知のタンパク質性因子であり、そのリコンビナント・タンパク質は、例えばＥＳＧＲＯ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）の商品名で購入することができる。また、ＧＳＫ−３阻害剤を培養液に添加することにより、特に他の成長因子・生理活性因子等の添加をしなくても、マウス及びヒトＥＳ細胞の未分化性を効率的に維持することができる（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１０：５５，２００４）。この場合、ＧＳＫ−３の活性を阻害できる作用を有した物質であれば、すべて使用可能であり、例えばＷｎｔファミリー分子（Ｍａｎｏｕｋｉａｎ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８４：２０３，２００２；Ｄｏｂｌｅ ＆ Ｗｏｏｄｇｅｔｔ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１６：１１７５，２００３）等を挙げることができる。

本発明の実施において、従来の方法に基づき継代維持した多能性幹細胞を、上記の方法により作製された培養基材に播種し、かつ、上記の培養条件・方法に基いて培養することにより、当該細胞を分散した状態で、しかも当該細胞が本来有する未分化な状態を保持したまま継代培養することが可能である。この様な状態で培養した多能性幹細胞は、細胞分裂の際に物理的な抑制がかからないため、及び／又は細胞間接触に起因する細胞増殖抑制機構が作用しないため、及び／又は細胞の生存性が高まり、死細胞数が減少するため、細胞の著しい増加や増殖が認められる。一つの事例として、本発明の方法によりマウスＥＳ細胞を培養した場合、従来の方法で培養した場合と比較して、少なくとも１．２５倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上の増殖能を呈することが可能である。また、当該条件で４代ほど継代すると、従来法と比べて少なくとも３倍、好ましくは１０倍以上の細胞を回収することが可能である。増殖能は、単位時間における細胞数の増加率や倍化速度等の指標で表すことができ、その計測・算出方法としては、一般の細胞を用いた実験で使用され、公知となっている方法であれば、いずれも用いることができる。

上述のように、多能性幹細胞における未分化な状態とは、多能性幹細胞が、ほぼ永続的または長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉すべての系譜の細胞に分化する能力をもった状態を意味する。また、好ましくは、多能性幹細胞のその他の特性、例えば、テロメアーゼ活性の維持やテラトーマ形成能、又はキメラ形成能等の性質のうち、少なくとも１つを有していることが望ましい。これらの性質・特性を調べる方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、上記の参考書籍、即ち、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれらに記載の方法には限定されない。

また、未分化状態の多能性幹細胞は、以下に記載する少なくとも１つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも１つ、好ましくは複数のマーカー分子の存在が確認できる細胞と定義することもできる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、未分化状態の多能性幹細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカーとしては、例えばＡＬＰ活性や、Ｏｃｔ−３／４またはＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２等の遺伝子産物の発現が利用できる。また、各種抗原分子も用いることができ、マウスＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−１、ヒトＥＳ細胞ではＳＳＥＡ−３やＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＧＣＴＭ−２等が未分化マーカーとして挙げられる。これらの未分化マーカーの発現は、ＥＳ細胞が分化することにより低減、消失する。

あるいは、未分化状態の多能性幹細胞マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカー・タンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。未分化状態の多能性幹細胞に特異的なマーカー・タンパク質（例えば、Ｏｃｔ−３／４やＲｅｘ−１／Ｚｆｐ４２、Ｎａｎｏｇ等）をコードする遺伝子の核酸配列は既知であり、ＮＣＢＩの公共データベース等において利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。

［分化誘導方法］
本発明の多能性幹細胞の分化誘導方法は、上記本発明の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする。

多能性幹細胞の分化誘導のための培養方法や培養条件は、上記本発明の細胞培養基材を使用することを除き、多能性幹細胞の通常の分化誘導培養方法や培養条件をそのまま使用することができる。また、液体培地については上記したものと同様のものを使用することができる。

分化誘導因子（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒとも称される）は、多能性幹細胞の分化を誘導する為に、培地に添加されるペプチド、ホルモン、サイトカイン、タンパク質、糖タンパク質などの化合物であり、分化させたい細胞のタイプや、分化のステージに応じて様々な種類の分化誘導因子が用いられる。本発明においては、既知の方法やプロトコルに従い、目的の細胞に応じて公知の分化誘導因子を液体培地に添加することができる。

例えば、肝細胞への分化を例にとると、肝細胞は、ＥＳ細胞をＭｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ（内胚葉系中胚葉系細胞）、Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ（内胚葉系細胞）、Ｈｅｐａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ（肝前駆細胞）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（肝細胞）という順で分化させて得ることができる。肝細胞への分化には、Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、Ｎｏｄａｌ、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、塩基性繊維芽細胞増殖因子）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、肝細胞増殖因子）、ＯＳＭ（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）、ＤＥＸ（ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α）といった分化誘導因子が用いられるが、公知の文献等記載の技術に従い、これら以外の因子を用いてもよい。肝細胞以外の細胞についても、それぞれの細胞への分化に必要な分化誘導因子を用いることにより、分化を誘導することができる。

［他の細胞培養方法］
本発明の他の細胞培養方法は、上記の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とするものである。前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）であることが好ましい。特定の細胞培養基材を用いること以外の培養方法については上記と同様に、公知の細胞培養方法によることができる。

本発明の細胞培養基材を用いて多能性幹細胞を肝細胞に分化させると、高い純度で肝細胞が得られる。分化誘導後、細胞培養基材から、肝細胞を引き剥がし、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することにより、肝細胞の純度をさらに高めることができる。これは、肝細胞の細胞表面に発現するＡＳＧＰＲ（アシアロ糖タンパク質レセプター）が、ガラクトース側鎖を認識するため、肝細胞のみがガラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に接着するためである。

カドヘリンファミリーに属するタンパク質による細胞接着と、ガラクトース側鎖を含むポリマーによる細胞接着は、ともにＣａ^２＋依存性であるため、分化誘導後、細胞培養基材から、肝細胞を引き剥がす方法として、キレート剤を用いることが好ましい。キレート剤は公知のものをいずれも使用することができ、細胞に悪影響を与えないものが好ましい。

多能性幹細胞への遺伝子導入法としての利用
本発明の別の態様として、本発明記載の方法は、所望する外来遺伝子を、多能性幹細胞の細胞内に効率的に導入する方法として使用することができる。導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、例えば増殖因子や受容体、酵素、転写因子等の天然の蛋白質や、例えば、遺伝子工学的手法を用いて改変、作製した、人工的な蛋白質である。また、導入遺伝子としては、リボザイムやｓｉＲＮＡ等の機能的ＲＮＡでも良い。更には、外来遺伝子として、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）やβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子も利用可能である。

好適な実施態様の１つとして、導入する外来遺伝子は、遺伝子の転写及び発現を可能にする核酸配列、いわゆるプロモーター配列と、当該プロモーターの制御下に転写・発現が可能になる様な形で連結される。又、この場合、当該遺伝子は、更にポリＡ付加シグナルと連結されることが望ましい。多能性幹細胞において外来遺伝子の転写および発現を可能にするプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスやＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルス等のウイルスに由来するプロモーターや、β−アクチン・プロモーター、ＥＦ１αプロモーター等が挙げられる。また、目的の如何によっては、ある種の細胞／組織又はある分化段階の細胞で特異的に遺伝子の転写および発現を可能にする核酸配列、いわゆる細胞／組織特異的プロモーター配列や分化段階特異的プロモーター、或いはＲＮＡの発現に適したＰｏｌ．ＩＩＩプロモーター等も使用できる。これらプロモーターの塩基配列は、ＮＣＢＩ等の公共のＤＮＡデータベースにおいて利用可能であり、一般的な分子生物学的手法を用いることにより、所望の遺伝子配列を利用した遺伝子ベクターを作製することが可能である。また、これらのプロモーターを利用可能なベクターが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社や、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｍｂｉｏｎ社等から購入可能である。

上記の遺伝子（ベクター）の導入のための方法としては、特にこれを制限せず、例えばリン酸カルシウムやＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション法を挙げることができる。また、遺伝子導入対象の細胞が細胞内に取りこむことが可能であり、かつ、細胞毒性の低い脂質製剤、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ社）等を用いて、目的とする遺伝子とリポソーム−核酸複合体を形成させた上でトランスフェクションする方法も好適である。更には、レトロウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターに目的の遺伝子を組み込み、その組み換えウイルスを細胞に感染させる方法等も使用可能である。この場合、ウイルスベクターとは、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの全長若しくは一部を欠損・変異させた核酸配列に、目的とする遺伝子を組み込み、発現することができる様にした構築物である。

本発明の方法により増殖させた多能性幹細胞の利用
本発明に係る培養方法（増殖方法）により増殖させた多能性幹細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収法を用いることにより、未分化な状態を維持した多能性幹細胞を、効率的かつ多量に得ることができる。また、本発明に係る遺伝子導入法により、所望する遺伝子を導入・発現させた多能性幹細胞を効率的かる多量に得ることができる。この様にして得られた多能性幹細胞を、以下、本発明により調製された多能性幹細胞と呼ぶ。

多能性幹細胞の回収法としては、多能性幹細胞の一般的な継代培養法において用いられる、公知の酵素消化による方法が挙げられる。その具体例としては、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄し、適当なタンパク質分解酵素を含む溶液（例えば、トリプシンやディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を含む溶液）を加え、３７℃で適当時間、好ましくは１〜２０分間、より好ましくは３〜１０分間程度培養した後、上記のＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、酵素を用いない方法も使用することができ、例えば、多能性幹細胞を培養している培養容器から培地を除き、ＰＢＳを用いて数回、好ましくは２〜３回洗浄した後、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を終濃度０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭになる様に添加し、３７℃で適当時間、好ましくは１〜６０分間、好ましくは１０〜３０分間程度処理して細胞を剥離させ、更にＥＳ細胞培養用培地等の適当な溶液に懸濁し、単一細胞状態とする方法が挙げられる。また、ＥＤＴＡの代わりにエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液を、同様の方法で用いることもできる。

また、本発明は、本発明により調製された多能性幹細胞から適当な分化誘導処理により作製した分化細胞をも提供する。分化細胞としては、一般的に多能性幹細胞から分化誘導することができる種の細胞であれば、特にこれを限定しない。具体的には、外胚葉細胞または外胚葉由来の細胞、中胚葉細胞または中胚葉由来の細胞、内胚葉細胞または内胚葉由来の細胞等が挙げられる。

外胚葉由来の細胞とは、神経組織、松果体、副腎髄質、色素体および表皮組織といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。中胚葉由来の細胞とは、筋組織、結合組織、骨組織、軟骨組織、心臓組織、血管組織、血液組織、真皮組織、泌尿器および生殖器といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。内胚葉由来の細胞とは、消化管、呼吸器、胸腺、甲状腺、副甲状腺、膀胱、中耳、肝臓および膵臓といった組織・器官を構成する細胞であるが、これらに限定されない。

本発明により調製された多能性幹細胞、及び／又は当該細胞から作製した分化細胞は、各種生理活性物質（例えば、薬物）や機能未知の新規遺伝子産物などの薬理評価や活性評価に有用である。例えば、多能性幹細胞や種々の分化細胞の機能調節に関する物質や薬剤、及び／又は多能性幹細胞や種々の分化細胞に対して毒性や障害性を有する物質や薬剤のスクリーニングに利用することができる。特に現状では、ヒト細胞を用いたスクリーニング法はほとんど確立しておらず、本発明により調製された多能性幹細胞に由来する各種分化細胞は、当該スクリーニング法を実施するための有用な細胞ソースとなる。

さらに、本発明は、本発明で開示された方法により調製された多能性幹細胞を用いてキメラ胚またはキメラ動物を作製する方法、及び作製したキメラ胚またはキメラ動物をも提供する。キメラ胚またはキメラ動物を作製する方法は、既に標準的なプロトコールが確立されており、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）等を参照することにより、容易に実施することができるが、特にこれを限定しない。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されることはない。

本発明の実施例において行った実験方法は以下の通りである。

＜ＰＶＬＡの合成＞
ＰＶＬＡ（図１（Ａ））をＫｏｂａｙａｓｈｉ Ａ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ， Ａｋａｉｋｅ Ｔ． Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｅｄ． １９９２；３：４９９−５０８記載の方法に準拠して合成した。ｐ−ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｅ をガブリエル合成により合成し、オリゴサッカライドを酸化してグルコアミドを得た。Ｎ−ｐ−ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ−Ｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１→４）−Ｄ−ｇｌｕｃｏａｍｉｄｅ （ＶＬＡ）を水に溶解し、窒素雰囲気下で、２時間、６０℃で、開始剤として１％ Ｋ_２Ｓ_２Ｏ_８（ｗ／ｖ）を用いて重合した。沈殿したポリマーを抽出し、フリーズドライを行って、ポリマー粉末を得た。

＜Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの合成＞
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質の発現と精製を、Ｎａｇａｏｋａ Ｍ， Ａｋａｉｋｅ Ｔ．， ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ． ２００３；１６：２４３−２４５．に準拠して行った。本実施例において、マウスのＥ−カドヘリン全長（理研 ＢＲＣ ＤＮＡバンク、コード１１８４）から得た細胞外ドメインｃＤＮＡと、変異導入ＩｇＧ１−Ｆｃドメイン ｃＤＮＡ （Ｔ２５２Ｍ／Ｔ２５４Ｓ）をライゲーションし、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させた。

＜水晶発振子マイクロバランス測定法（ＱＣＭ）＞
ＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ４装置（Ｉｎｉｔｉｕｍ Ｃｏ． Ｌｔｄ 製）を温度調節装置に設置した。ＱＣＭセルの電極を純水、クロロホルムで洗浄し、硫酸／過酸化水素（体積比３／１）で処理し、その後、２％ＳＤＳ溶液（ナカライテスク）で処理した。高速回転法によりポリスチレンの薄膜フィルムで電極をコーティングした。ＱＣＭ装置にセルをセットし、２時間安定化させた後、サンプル溶液（５００μｌ）を加えた。表面は少なくとも３０分間安定化し、ＰＢＳで３回リンスして、不安定な吸着物を除去した。吸着曲線を作成するために、ＰＶＬＡ溶液の濃度を、２、４、６、８、１０、５０、１００および２００μｇ／ｍＬと変え、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液の濃度を１、２、４、６、８、１０、１５μｇ／ｍＬと変えた。単分子層の形成に必要な濃度を確かめた後、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共被覆（ｃｏ−ｃｏａｔｉｎｇ）をテストした。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液（７．５μｇ／ｍＬ）をＱＣＭセルに加え、安定化と３回の洗浄処理を施した後、ＰＶＬＡ溶液（１００μｇ／ｍＬ）を加えて、同様に安定化、洗浄処理を行った。
単位面積当たりの質量変化を、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ方程式により計算した。即ち、１ｃｍ^２の領域において、１Ｈｚの振動数の変化が０．６０６ｎｇ／ｃｍ^２の質量変化に値する。濃度依存的な吸着は、データの２重逆数をＬｉｎｅｗｅａｂｅｒ−Ｂｕｒｋ方程式を用いた直線回帰を行った後、Ｌａｎｇｍｕｉｒ方程式を用いて記述した。

＜ＰＶＬＡコートされた培養皿の作製＞
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の０．２２μｍフィルターを用いた滅菌の後、１．５ｍＬのＰＶＬＡ水溶液（１００μｇ／ｍＬ）を未処理のポリスチレン培養皿（３５ｍｍ、Ｉｗａｋｉ製）に加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、上記培養皿をリン酸塩バッファー（ＰＢＳ）で洗浄し、１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。その後、ＰＶＬＡコートされた培養皿をＰＢＳでリンスした。
上記と同様の方法により、ゼラチンコートしたポリスチレン培養皿をゼラチン水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて作製した。また、コラーゲンコートした培養皿をコラーゲン水溶液（タイプＩ、０．１ｍｇ／ｍＬ， ｐＨ ３．０）を用いて作製した。

＜Ｅ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡを共固定化した培養皿の作製＞
図１（Ｂ）に記載の共固定化基層を作製する為に、精製したＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液（７．５μｇ／ｍＬ）を未処理のポリスチレン培養皿に加えた。３７℃、２時間のインキュベーションの後、培養皿をＰＢＳで洗浄し、ＰＶＬＡ溶液（１００μｇ／ｍＬ）で処理し、３７℃で２時間インキュベーションした。共固定化培養皿を１％ＢＳＡでブロッキングし、ＰＢＳで洗浄し、用いた。

＜肝細胞の単離と培養＞
Ｓｅｇｌｅｎ ＰＯ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． １９７３；８２：３９１−３９８、および、Ｉｓｅ Ｈ， Ｓｕｇｉｈａｒａ Ｎ，Ｎｅｇｉｓｈｉ Ｎ， Ｎｉｋａｉｄｏ Ｔ， Ａｋａｉｋｅ Ｔ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２００１； ２８５：１７２−１８２記載の方法に準拠して、２段階ｉｎ ｓｉｔｕコラゲナーゼ灌流法により、初代培養肝細胞を、雄のＩＣＲマウス（６〜８週、ＳＬＣ）の肝組織から単離した。
マウスをペントバルビタールにより麻酔し、門脈にカニューレ挿入し、肝臓を、ＥＧＴＡを含有するＣａ^２＋フリープレ灌流溶液（ｐＨ７．４）で灌流し、その後、トリプシンインヒビター（０．０５ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ製）とコラゲナーゼ（０．１５ｍｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ製）を含有するコラゲナーゼ溶液（ｐＨ７．４）で灌流した。灌流した組織は、Ｈａｎｋ溶液で分離し、１００μｍナイロンセルストレイナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ製）で集めた。肝細胞は、１０％パーコール溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた密度勾配遠心分離（５０ｘｇ、１０分間、４℃）により精製した。トリパンブルー法を用いて細胞の生存を確認した。生存初代培養肝細胞を、５０ｎｇ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク製）を含有するＷｉｌｌｉａｍｓＥ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、３×１０^４ 細胞／ｃｍ^２の密度でゼラチン、コラーゲン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ、ＰＶＬＡ、共固定化培養皿上に播種した。培地は、４時間後に除き、結着しなかった細胞や死細胞を除去した。

＜未分化ＥＳ細胞の維持＞
フィーダーフリーのマウスＥＳ細胞系統（ＥＢ３）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、ナカライテスク製）、１ｍＭ ピルビン酸塩、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ ＬＩＦ （組み換え白血病抑制因子、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製）、抗生物質（５０ｎｇ／ｍＬペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン）を添加したＧｒａｓｇｏｗ最小培地（ＧＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を含む、ゼラチンコートされた培養皿において維持した。
ｍＥＳ細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）により分離し、毎日培地を交換しながら、３日ごとに継代し、少なくとも３回継代培養した（９日間）。

＜ｍＥＳ細胞の肝細胞への分化＞
分化のプロセスは、図１（Ｃ）に記載の通りで、４つのステップに分けて行った。内胚葉系中胚葉への分化、胚体内胚葉への分化、肝前駆細胞への分化、肝細胞への分化である。従って、分化誘導用培地は３種類用いた。１０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、１％ ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ ＮＥＡＡ、１ｍＭ ピルビン酸塩、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび抗生物質を含有するＧＭＥＭを基本培地とした。
まず、上記基本培地に１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ製）を加えたものを培地Ａとし、内胚葉系中胚葉分化に用いた。ゼラチン上で維持されていた未分化ＥＳ細胞（０日後）を、Ａｃｃｕｔａｓｅにより分離し、５０００細胞／ｍＬの濃度（３５ｍｍ培養皿全体では、１００００細胞）となるように、培地Ａを加えた共固定化培養皿に播き、３日間培養した。その後、内胚葉への分化の為に、基本培地に、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）とｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ 、Ｐｒｏｍｅｇａ製）を加えたものを培地Ｂとし、用いた。上記で分化させた細胞（３日後）をさらに、培地Ｂ中で２日間培養した。自発的な分化が起きるようなコントロールとして、上記と並行して基本培地で５日間培養した（５日間）。
ＨＧＦ （１０ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ製）、オンコスタチンＭ （１０ｎｇ／ｍＬ、ＯＳＭ、Ｓｉｇｍａ製）および、デキサメタゾン （１ｍＭ、ＤＥＸ、Ｓｉｇｍａ製）を基本培地に加えて、培地Ｃとし、肝細胞への分化に用いた。
６日目に、細胞をエンザイムフリーの細胞分離バッファー（ＣＤＢ、Ｇｉｂｃｏ製）を用いて分離し、培地Ｃを含むＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化培養皿に、５０００細胞／ｍＬの密度で播いた。
１４日後、分化した細胞をＣＤＢを用いて分離し、培地Ｃを含むＥ−ｃａｄ−ＦｃとＰＶＬＡの共固定化培養皿に、５０００細胞／ｍＬの密度で播いた。
Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独コートされた培養皿についても、ｍＥＳ細胞を上記と同様に培養した。ゼラチンコートされた培養皿については、未分化ＥＳ細胞をゼラチンコートされた培養皿で２日間維持した後、同様に培養し、安定なコロニーを形成させた。
分化誘導開始後１８日、２０日、２２日、２４日後において、分化した細胞をＣＤＢにより分離し、培地Ｃを含む３５ｍｍ ＰＶＬＡコートされた培養皿に、１００００細胞／ｍＬの密度（培養皿全体では２００００細胞）で播いた。ＰＶＬＡに結着した細胞の割合を、ＡＳＧＰＲポジティブ細胞の数と、再播種の最適なタイミングの評価に用いた。

＜結着アッセイ＞
９６ウェルプレート上で、細胞を４時間培養した後、培地と結着しなかった細胞を除いた。結着した細胞は、ＰＢＳにより３回洗浄し、Ｍｉｄｌｆｏｒｍ ２０Ｎ （４％ ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４、和光純薬製）により１５分間固定した。その後、０．１％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。最後に、リンスの後、２％ ＳＤＳを加えて３０分間インキュベートし、５７０ｎｍの波長に対する吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。

＜半定量的ＲＴ−ＰＣＲ＞
ＴＲＩｚｏｌエージェント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）により細胞破砕液からＲＮＡを抽出し、蒸留水に懸濁し、ｄＮＴＰとオリゴ−ｄＴプライマー、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウィルス逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
ＰＣＲは、ｄＮＴＰミックス（Ｔａｋａｒａ製）、ＴｏｐＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ製）、ＭｇＣｌ_２を含むＰＣＲバッファーを用いて行った。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｔｙｐｈｏｏｎ ８６００ ｉｍａｇｅｒによりスキャンした。ハウスキーピング遺伝子マーカーと比較したバンド強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて計算した（ｖｅｒ５．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ製）。

＜免疫蛍光アッセイ＞
細胞をＭｉｌｄｆｏｒｍ ２０Ｎ （８％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。固定した細胞を、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により５分間処理し、ＰＢＳで洗浄した。Ｉｍａｇｅ−ｉＴ ｓｉｇｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）の存在下で３０分間インキュベーションし、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ ソリューション（ナカライテスク製）を用いて１時間ブロッキングした。その後、細胞を室温下で２時間、一次抗体でインキュベートし、ＰＢＳで慎重に洗浄した後に、２次抗体で、２時間室温下でインキュベートした。その後、細胞をＤＡＰＩで核染色した。染色した細胞をＰＢＳに懸濁し、倒立型蛍光顕微鏡（オリンパス製）により観察した。
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ、ＡＬＢをそれぞれ発現する細胞の数を算定するために、３つの独立の培養皿中の、異なる５箇所から採取した５０〜１００細胞を観察した。

＜ウェスタンブロット＞
細胞のタンパク質を、１％ ＰＭＳＦ、１％ プロテアーゼインヒビターカクテルを含むｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）により抽出した。細胞破砕液を１５０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離し、タンパク質サンプル溶液を得た。サンプルバッファーで処理したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ（７．５％、１０％アクリルアミドゲル）、ＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）にトランスファーした。ＰＶＤＦメンブレンを、マウスの抗β−アクチン抗体と、ゴートの抗マウスアルブミン抗体（Ａｂｃａｍ）で２時間室温下においてインキュベートした。その後、ＨＲＰ結合２次抗体（１／１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で２時間、室温でインキュベートした。ＨＲＰ活性をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ 検出エージェント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）により検出した。

＜アルブミンＥＬＩＳＡアッセイ＞
培地中に分泌されたアルブミンを、マウスアルブミンＥＬＩＳＡキット（Ｓｈｉｂａｙａｋｉ製）を用いて検出した。培地を、２４時間ごとに回収し、８０００ｘｇ、５分間遠心し、希釈してサンプル溶液とした。その後、抗アルブミン抗体処理したマイクロプレートを２５０μｌの洗浄バッファーでリンスしたものに、５０μｌのサンプル溶液（１０倍希釈）もしくはスタンダードソリューションで、１時間インキュベートした。
マイクロプレートをリンスし、ＨＲＰ結合抗体溶液で室温下１時間インキュベートした。洗浄バッファーでリンスした後、発色基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＴＭＢ）で２０分間処理し、５０μｌの１Ｍ 硫酸で処理した。４５０ｎｍの波長に対する吸光度を、マイクロプレートリーダーにより測定した。標準曲線を作成してアルブミン濃度を計算し、細胞数で標準化した。

＜グリコーゲン蓄積（ＰＡＳ反応）＞
初代培養肝細胞と、分化した細胞をそれぞれＭｉｌｄｆｏｒｍ ２０Ｎ （８％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で１０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を１％過ヨウ素酸（和光純薬製）で５分間酸化し、再び洗浄した。細胞をＳｃｈｉｆｆ反応液（和光純薬製）で１０分間処理し、ＰＢＳで洗浄した。２％ ＳＤＳ溶液で３０分間処理した後、５５０ｎｍの波長に対する吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定し、細胞数で標準化した。未分化ＥＳ細胞をコントロールとして用いた。

＜尿素アッセイ＞
培地中における尿素レベルをＵｒｅａ ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて測定した。培地を毎日回収し、８０００ｘｇ、５分間遠心し、上清をサンプルとして用いた。水（ブランク）、希釈スタンダードソリューション（２ｍｇ／ｄＬ）、およびサンプル液を９６穴プレートに導入した。２００μＬの反応試薬溶液を加え、室温で５０分間インキュベートした。４９２ｎｍにおけるＯＤ（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。最後に、１０^５細胞ごとの単位量を標準曲線を用いて算出し、細胞数で標準化した。

（結果）
＜ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共吸着＞
まず、ポリスチレン表面に対する、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの結合能をＱＣＭを用いて調べた。サンプル溶液の添加により、水晶の振動波長は斬減し、ある時点以降安定化した。
振動数（周波数）の変化は、飽和点に達するまでは、コーティング濃度の増加にともなって減少した。細胞外マトリックス分子による表面の完全飽和は、ポリスチレン表面上における単分子層吸着とみることができる。ＱＣＭの結果から、ＰＶＬＡの単分子層濃度が１００μｇ／ｍＬであることが分かった。また、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの単分子層濃度が、ＥＬＩＳＡアッセイにより明らかにされた数値と同様の、１０μｇ／ｍＬであることが分かった。その後、吸着分の質量変化を、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ方程式により計算し、直線回帰によりノーマライズした。ＧＦＩ値（Ｇｏｏｄｎｅｓｓ ｏｆ Ｆｉｔ、適合度指標）は、決定係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｒ^２値）として記載されている。統計値の回帰直線は、実測値によく近似した。一方、最大吸着量Δｍ_ｍａｘとＬａｎｇｍｕｉｒの吸着式における定数Ｋαも得た。吸着等温線の理論によれば、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃタンパク質の吸着エネルギーは、ＰＶＬＡよりも大きい。即ち、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの方が、ＰＶＬＡよりも早く吸着する。ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの吸着曲線を、Ｌａｎｇｍｕｉｒの吸着式により示す（図２（Ａ）、（Ｂ））。
加えて、固定化基層を形成する為のＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共吸着についてもＱＣＭにより評価した（図２（Ｃ））。まず、単分子層濃度（１０μｇ／ｍＬ）よりも低い７．５μｇ／ｍＬのＥ−ｃａｄ−Ｆｃ溶液をＱＣＭのセルに導入した。安定化とリンスの後、ＰＶＬＡ溶液（１００μｇ／ｍｌ）を加えたところ、吸着値が上昇した。結果、ＰＶＬＡはＥ−ｃａｄ−Ｆｃの固定後に残ったスペースを占めることが明らかになり、ポリスチレンに対する吸着能は、ＰＶＬＡよりもＥ−ｃａｄ−Ｆｃの方が高いという推論が裏付けられた。

＜初代培養肝細胞の機能および吸着への、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層の影響＞
Ｅ−カドヘリンは、ＰＶＬＡに結合した肝細胞のスフェロイド形成に重要な機能を果たす。凝集塊中の細胞は、単細胞層のカルチャー中の細胞よりも、生存期間が長く、分化機能発現能も高い。これらの現象を考慮し、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層への、初代培養肝細胞の結合および機能を調べた。

様々なマトリックス上での初代培養肝細胞の形態とアルブミン発現を、蛍光染色により調べた（図３（Ａ））。初代培養肝細胞は、ゼラチン、コラーゲン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層、のそれぞれの表面上で、単一細胞層を形成した。一方、ＰＶＬＡ単独をコーティングしたディッシュの上では、いくつかに分かれて球状（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）の構造を形成した。全てのマトリックスにおいて、細胞の殆どが高いアルブミン発現レベルを示した。培養３日後、ＰＶＬＡ上の肝細胞は、安定な多層の球状構造を形成した。ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上の細胞は、単一細胞層の凝集塊となるように集合しだし、ゼラチン、コラーゲン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ上の細胞は特に形態に変化は見られなかった。凝集塊中の細胞のアルブミン発現は高いレベルで維持されていた。一方、ゼラチン、コラーゲン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ上の細胞では、アルブミンの発現が著しく下がった。既存の培養システム上では、細胞は広がって存在していたのに対し、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃ共固定化基層上の凝集塊中の細胞は、アルブミン発現レベルが長期間に渡って高く維持されていた（図３（Ａ）、（Ｂ））。これは、肝細胞の凝集塊の形成及び機能維持において、ＰＶＬＡが基層として重要な役割を果たすことを示唆している。

それぞれのマトリックス上の細胞を用いて、アルブミン（ＡＬＢ）、肝細胞核因子４α（ＨＮＦ−４α）、アシアログリコプロテイン受容体（ＡＳＧＰＲ）、マウストリプトファンオキシゲナーゼ（ｍＴＯ）、グルコース６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐ）についてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層、ＰＶＬＡ単独コーティング上の細胞は、ゼラチン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独固定化表面上の細胞よりも、肝細胞特異的な遺伝子の発現レベルが高かった（図３（Ｃ））。

さらに、それぞれのマトリックス上で培養した肝細胞の機能を評価するために、肝細胞特異的に生成されるアルブミンの産生量をモニターした。初代培養肝細胞を、ゼラチン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独、ＰＶＬＡ単独、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層のそれぞれにおいて、１０％ＦＢＳ存在下で、１週間培養した。図３（Ｄ）に示すように、ＰＶＬＡ単独、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層とは対照的に、ゼラチン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独のマトリックス上の肝細胞によるアルブミン産生量は、速やかに減少し、脱分化が示唆された。

また、新たに培養された肝細胞においては、貯蔵されたグリコーゲンの量は、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層と、ゼラチンやＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスとではほぼ同様のレベルであったが、共固定化基層では長時間の培養を通じて高いレベルに保たれていたのに対し、ゼラチンやＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスでは長時間の培養を通じて明らかに減少した。これにより、肝細胞の機能維持において、ＰＶＬＡが重要な役割を果たすことが示唆された。

ＰＶＬＡが肝細胞機能維持に寄与し、Ｅ−カドヘリンが初代培養肝細胞およびＥＳ細胞の結着と分化を促進するという知見を考慮し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、活性の高い肝細胞を高い純度で集めるために、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層マトリックスを用いることにした。

＜共固定化基層上における未分化のマウスＥＳ細胞＞
融合タンパク質であるＥ−ｃａｄ−Ｆｃは、ＥＳ細胞を分散状態および分化全能性を維持するための、フィーダー細胞フリーの細胞外マトリックスとして開発された。
本実施例において、ＰＶＬＡとＥ−ｃａｄ−Ｆｃの共固定化基層マトリックスシステムの使用適合性を確認する為に、上記共固定化基層マトリックス上での、マウスＥＳ細胞（ｍＥＳ細胞）の挙動を調べた。

まず初めに、２日間培養後の、未分化ｍＥＳ細胞（ＥＢ３）の形態から、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃマトリックスと同様に、共固定化基層マトリックスにおいても、単一細胞レベルでの分散状態を維持できることがわかった（図４（Ａ））。一方、ＰＶＬＡ単独コーティングマトリックスには未分化ｍＥＳ細胞は結着しなかった。その後、種々のマトリックス上における未分化ｍＥＳ細胞の増殖を評価し、それぞれのマトリックス上での結着細胞数により標準化した（図４（Ｂ））。その結果、共固定化基層マトリックスは、ゼラチンマトリックスよりも細胞増殖能が高く、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスよりも低かった。これは、ＰＶＬＡの存在が一部の細胞の増殖にわずかに影響を与えたことを示唆している。

未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４）を用いて転写を調べることにより、それぞれのマトリックス上でのｍＥＳ細胞が未分化であることを確認した（図５（Ａ））。共固定化基層マトリックス上でのＥＳ細胞は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックス上におけるものと同様のレベルの未分化マーカーを発現した。

＜ｍＥＳ細胞の肝細胞への分化＞
ＥＳ細胞由来の肝細胞を得る為に、ｍＥＳ細胞（ＥＢ３）を、共固定化基層マトリックス上に播種し、均一な細胞群を形成させた。共固定化基層マトリックス上に分散させた細胞を、アクチビンＡおよびｂＦＧＦ存在下で培養し、内胚葉細胞に分化させた。その後さらに、ＨＧＦ、オンコスタチンＭおよびデキサメタゾンを含む低血清培地で培養した。Ｅ−カドヘリンとゼラチンマトリックスを用いた分化誘導は常に並行しておこなった。

経時的に採取した細胞を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、細胞の均一性と肝細胞様の形質への分化の程度を調べた。ＲＴ−ＰＣＲは、内胚葉特異的な遺伝子（Ｇａｔａ６およびＳｏｘ１７）、肝前駆細胞特異的な遺伝子（ＡＦＰ、アルブミン、サイトケラチン１８およびＨＮＦ４α）、肝細胞特異的な遺伝子（ＡＳＧＰＲ、アルブミン、トリプトファンオキシゲナーゼ）、および、未分化ｍＥＳ細胞マーカー（Ｏｃｔ３／４）、中胚葉マーカー（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、外胚葉マーカー（Ｐａｘ６、チロシンヒドロキシラーゼ）について行った。

図５（Ａ）および（Ｂ）示すように、内胚葉特異的な遺伝子発現は、早い段階で増加するとともに、Ｏｃｔ３／４の発現量は緩やかに減少した。結果、Ｅ−カドヘリン単独マトリックス、および、共固定化基層マトリックスを用いた場合に、効率的で、均一性を保った分化が見られた。一方、ゼラチンコーティングマトリックス上の細胞は、Ｓｏｘ１７の発現量が少量であった。ゼラチンコーティングマトリックス上の細胞は、外胚葉マーカーも発現していた。共固定化基層マトリックス上の細胞は、外胚葉マーカーの発現は見られなかった。この結果より、内胚葉への分化におけるＥ−カドヘリンの重要な役割が示唆された。

内胚葉形質の細胞へ分化した細胞の割合を調べる為、Ｓｏｘ１７、Ｅ−カドヘリンおよびＯｃｔ３／４の免疫染色を行った。共固定化基層マトリックス上の細胞は、分散状態を保ち、多くがＳｏｘ１７とＥ−カドヘリンを発現していた。分化誘導後５日以内に、分化したＥＳ細胞は核が肥大し、共固定化基層マトリックス上の細胞のうち９５．３±３．７％がＳｏｘ１７を発現した一方、Ｏｃｔ３／４を発現していたものは４１．４±１５．８％に過ぎなかった（図５（Ｃ）、（Ｄ））。対照的に、ゼラチン上の細胞は、８．６±５．９％がＳｏｘ１７を発現し、８５．３±９．６％がＯｃｔ３／４を発現した。Ｅ−カドヘリンの安定した発現により、Ｅ−カドヘリンマトリックスが、内胚葉分化へ適していることが示唆される。これらの結果は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃの利点を維持している共固定化基層マトリックスが、内胚葉分化において、好適な基層であることを示唆している。

さらに、肝前駆細胞や肝細胞への分化におけるＰＶＬＡの存在の影響についても調べた。
肝細胞分化早期および中期の特異的分化マーカーを決定する為に、ＡＦＰ、ＡＬＢ、サイトケラチン１８、ＨＮＦ４αおよびＥ−カドヘリンの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた（図６（Ａ））。ＡＦＰを除いた肝細胞特異的遺伝子は全て、分化誘導時間経過に伴って漸増した。ＡＦＰは発現レベルの最大値が分化誘導１０日後に記録された（図６（Ｂ））。ＡＬＢ、サイトケラチン１８、ＨＮＦ４αの発現量についても、４日ごとに半定量的に調べた（図６（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ））。

共固定化基層マトリックス上の細胞において、誘導開始８日後からアルブミンの発現が見られ、サイトケラチン１８は、４日後から発現が見られた。その後、分化した細胞は、１２日後からＨＮＦ４αを発現しだした。３つのマーカー全てについて、共固定化基層上の細胞の方が、ゼラチン上のものよりも転写レベルが高かった。

肝細胞へ分化した細胞の割合を調べる為、ＡＦＰ、ＡＬＢについて免疫染色を行った（図６（Ｆ）、（Ｇ）。
図６（Ｆ）が示すように、９３．８±６．０％という高い割合で、共固定化基層上の単一細胞レベルに分散した細胞は、ＡＦＰを強く発現した一方、ゼラチン上のコロニーは、僅かな割合の細胞がＡＦＰを発現した（１５．６％±７．１％）。分化誘導１６日後では、共固定化基層上の細胞は、９０．０％±９．６％という高い割合でＡＬＢポジティブであった。一方、ゼラチン上の細胞は２０．５％±５．３％がＡＬＢを発現しているに過ぎなかった（図６（Ｇ）、（Ｈ））。共固定化基層は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスと同様の結果であり、ゼラチンと比較して優れた細胞濃縮性能を有することが裏付けられた。

共固定化基層上、および、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックス上の細胞のアルブミンの発現は、ウェスタンブロットにより確認した（図６（Ｉ）。

図７（Ａ）が示すように、ＡＳＧＰＲおよびｍＴＯを含む成熟肝細胞特異的遺伝子マーカーの発現が、分化の後半段階において増加した。分化の進行に伴い、２４日後に、ＡＳＧＰＲの発現量がピークになった（図７（Ｂ））。興味深いことに、ＡＳＧＰＲの発現は、共固定化基層上の細胞では１０日後から始まったのに対し、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックス上の細胞では１２日後から、ゼラチンマトリックス上の細胞では１６日後から始まった。共固定化基層上の細胞は、ＡＳＧＰＲの発現量がほかの２つのマトリックスよりも常に高かった。これは、ＰＶＬＡがＡＳＧＰＲの発現促進に寄与している可能性を示唆している。これらの結果と一致するように、共固定化基層上の細胞は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスやゼラチンと比較して、ｍＴＯの発現レベルも高かった。特に、２２日以降において差が顕著であった（図７（Ｃ））。

一方、分化誘導２４日後に行った免疫染色の結果から、ＡＬＢおよびＡＳＧＰＲの発現量は、共固定化基層、およびＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスでは、ゼラチンと比較して明らかに高かった（図７（Ｄ））。

肝細胞は、様々な代謝機能を有する成熟細胞である。分化最終ステージのｍＥＳ細胞（誘導後２０日、２４日）の機能レベルを評価し、共固定化基層マトリックスの分化誘導効率への影響を確認した。共固定化基層上の細胞のアルブミン分泌（図７（Ｅ））、グリコーゲン蓄積（図７（Ｆ））、および尿素生成レベル（図７（Ｇ））は、ゼラチンやＥ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックスよりも高かった。

＜マウスＥＳ細胞由来の肝細胞のＡＳＧＰＲ発現に基づいた濃縮＞
本発明により、ＥＳ細胞由来の肝細胞を単離し、未分化の細胞や他の系列に分化する可能性のある細胞を除去する、マトリックス依存的選択的細胞濃縮方法が提供される。Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃは、ＰＶＬＡによるＡＳＧＰＲ選択的な結合をサポートしうる。

Ｅ−カドヘリンによる結合と、ＰＶＬＡ−ＡＳＧＰＲの結合の両方が、Ｃａ^２＋依存的であることから、分化誘導１８日、２０日、２２日、２４日後において、キレート剤（ＣＤＢ）を用いて分化細胞を分離し、ＰＶＬＡコーティングしたディッシュ上に播種した。結着した細胞数を計算し（図８（Ａ））、細胞膜上に発現したＡＳＧＰＲの存在を評価した。ＡＳＧＰＲポジティブの細胞の割合は、それぞれのマトリックスにおいて、分化誘導開始から経時的に増加した。共固定化基層上の細胞は、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独や、ゼラチンコートされたディッシュよりもＡＳＧＰＲポジティブの細胞の割合が高かった。２４日後において、共固定化基層由来の細胞の結着率は５９．７％±１１．６％であり、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックス由来の細胞の結着率は４５．０±２．５％であり、ゼラチンコートされたディッシュ由来の細胞の結着率は、２３．２±３．３％であった。結着細胞の割合の変化は、２２日後と２４日後の間では小さかった。よって、再播種のタイミングは、分化誘導後２２日後が最適であるといえる。

共固定化基層においては、最終ステージにある分化細胞であっても、単一細胞層を維持していたが、凝集への傾向が見られた（図８（Ｂ））。
しかしながら、ＰＶＬＡコートされたディッシュへの再播種から３日培養した場合、分化細胞は、一部が凝集し、多層の凝集塊を形成していた。この様子は、初代培養肝細胞の培養３日後に形成される組織様のスフェロイドに類似していた。

＜ＡＳＧＰＲにより濃縮したＥＳ細胞由来の肝細胞の特徴＞
ゼラチン、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ単独マトリックス、共固定化基層それぞれにおいて分化誘導してから２４日後の細胞について、各種マーカーの転写量を、再播種した細胞（上記と同様にＰＶＬＡコートしたディッシュ上に再播種し３日間培養した細胞）と比較した（図８（Ｃ））。ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉特異的遺伝子）、Ｐｄｘ１（膵臓マーカー）のＲＴ−ＰＣＲから、キレート剤による細胞分離と再播種による細胞選択プロセスにより、肝細胞以外のマーカーを発現しない細胞が濃縮されたことが分かる。また、Ｇａｔａ６およびＳｏｘ１７（内胚葉および肝前駆細胞）の転写が見られなくなったことから、分化の早期ステージにある細胞が除去されたことが分かる。成熟した肝細胞のマーカー（ＡＳＧＰＲ、ｍＴＯ、Ｇ６Ｐ）の転写量は維持ないしは増加したことからも、成熟肝細胞選択的な結着が起こった事が分かる。
これらの結果より、肝細胞の選択的濃縮が達成できたことが分かる。
分化したＥＳ細胞が、初代培養肝細胞として機能しうるかについて調べるために、アルブミン分泌、グリコーゲン蓄積、および尿素生成について測定した。ＰＶＬＡコートしたディッシュに再播種した肝細胞は、それぞれの代謝機能を維持していた。

Claims (10)

1. 表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質を固定またはコーティングした後、糖側鎖を有するポリマーを固定またはコーティングした細胞培養基材であって、
   前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質が、（１）Ｅ−カドヘリン、（２）Ｅ−カドヘリンと相同性を有するタンパク質であって、ＥＣ１ドメイン、ＥＣ２ドメイン、ＥＣ３ドメイン、ＥＣ４ドメインおよびＥＣ５ドメインのうち１つ以上を含み、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質、または、（３）Ｅ−カドヘリンの細胞外領域とアミノ酸配列の同一性が９０％以上であり、かつＥ−カドヘリンと同種親和性の結合能を有するタンパク質であり、
   前記糖側鎖がラクトースまたはガラクトースであることを特徴とする細胞培養基材。
2. 前記ポリマーの主鎖がポリスチレンである請求項１記載の細胞培養基材。
3. 前記糖側鎖を有するポリマーが、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）である請求項１または２記載の細胞培養基材。
4. 前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質が、Ｅ−カドヘリンと、免疫グロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質である請求項１〜３のいずれか一項記載の細胞培養基材。
5. 前記カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質を含む融合タンパク質と、糖側鎖を有するポリマーとが海島構造を形成している請求項１〜４のいずれか一項記載の細胞培養基材。
6. 請求項１〜５のいずれか一項記載の細胞培養基材と、液体培地とを用いて、未分化性および分化多能性を維持しながら多能性幹細胞を増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
7. 請求項１〜５のいずれか一項記載の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を分化させることを特徴とする多能性幹細胞の分化誘導方法。
8. 多能性幹細胞を肝細胞へ分化させる請求項７記載の多能性幹細胞の分化誘導方法。
9. 請求項１〜５のいずれか一項記載の細胞培養基材と、分化誘導因子を含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞を肝細胞に分化させ、細胞培養基材から該肝細胞を分離し、ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーを表面に固定またはコーティングした細胞培養基材に播き、培養することを特徴とする細胞培養方法。
10. 前記ガラクトースまたはラクトース側鎖を含むポリマーが、ポリ（ｐ−Ｎ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）である請求項９記載の細胞培養方法。