JP5611035B2 - 胚性幹細胞および人工多能性幹細胞由来からの高心臓形成性前駆細胞および心筋細胞の効率的製造および使用 - Google Patents
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Description
本願は、2008年3月26日出願の米国仮出願第61/064,777号の優先権を主張する。この優先権主張出願の全開示内容は本願の一部とみなし、明らかに、参照によりそのまま本明細書に組み入れるものとする。
技術分野
本発明は、心筋細胞および/または心臓前駆細胞を生産するための方法に関する。より具体的には、該方法は、中胚葉細胞に分化された人工多能性幹(iPS)細胞または胚性幹(ES)細胞をシクロスポリン−Aの存在下で培養することを含む。
最近、胚性幹(ES)細胞とは異なるがES細胞様である新規な多能性幹細胞、すなわち、人工多能性幹(iPS)細胞が、特定された転写因子をコードする遺伝子による形質導入により、成体体細胞から生成された(Takahashi, K.およびYamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T.およびYamanaka, S., Nature 448, 313-317 (2007); Takahashi, K.ら, Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J.ら, Science 318, 1917-1920 (2007))。成体ヒト組織からのiPS細胞の樹立が、細胞移植による再生医療、ならびに患者特異的細胞モデルおよび創薬系の生成を通じて、iPS細胞の臨床応用を促進しつつある(Yamanaka, S., Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007); Laflamme, M.A.およびMurry, C.E., Nat. Biotechnol. 23, 845-856 (2005); Kovacic, J.C.,ら, Cell Stem Cell 1, 628-633 (2007))。
従って、本発明は、次のように要約される。
定義
本明細書で用いる用語は全て、特に断りのない限り、当業者にとって通例の意味を有する。以下の用語は次のような意味を有する。
1.ES細胞またはiPS細胞からの心筋細胞および/または心臓前駆細胞の生成
本発明は、中胚葉細胞に分化されたiPS細胞またはES細胞をシクロスポリン−A(「CSA」と呼ぶ)の存在下で培養することを含む、心筋細胞および/または心臓前駆細胞を生産するための方法を提供する。
本発明では、心筋細胞および/または心臓前駆細胞を誘導するための出発細胞としてすべてのES細胞を使用することができる。本明細書において「心筋細胞および/または心臓前駆細胞」とは、心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物もしくは集団を含むものとする。
上記のように、Takahashi, K.およびYamanaka, S. (Cell 126, 663-676 (2006);国際公開WO2007/069666)によってマウスiPS細胞が最初に樹立され、その後、Takahashi, K.ら(Cell 131, 861-872 (2007))および、Yu, J.ら(Science 318, 1917-1920 (2007))によりそれぞれヒトiPS細胞が樹立された。
本発明によれば、中胚葉細胞に分化しているESまたはiPS細胞をCSAの存在下で培養すると、それらのESまたはiPS細胞が心筋細胞および/または心臓前駆細胞に分化する。
(1)拍動細胞であること(図1a);
(2)心臓トロポニン−T(cTnT)に関して陽性であること(図1b、c);
(3)筋節形成を示すこと(図1e);
(4)純化された心筋細胞の活動電位がペースメーカー電位を有する細胞の存在を示すこと(図1f);および
(5)心室型細胞はペースメーカー電位および自己拍動が無いこと(図1g);
(6)純化されたCSA誘導心筋細胞がα−ミオシン重鎖(MHC)、ミオシン軽鎖(MLC)2vおよび2a、Nkx2.5、GATA4およびT−boxタンパク質3(Tbx3)などの心臓マーカーmRNA発現を示すこと(図5)
により確認することができる。
本発明はさらに、心筋細胞および/または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤について候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、中胚葉細胞に分化されたiPS細胞を候補薬剤の存在下で培養すること、および該薬剤を拍動コロニーおよび/またはFlk1+/CXCR4+/血管内皮カドヘリン−細胞の形成に基づいて選択することを含む方法を提供する。
本発明はさらに、上記の1.3節に記載されている手順によって調製された心筋細胞、心臓前駆細胞またはその混合物を被験体の心臓に移植することを含む、心疾患を有する被験体を治療するための方法を提供する。
本発明者らの心筋細胞分化系では、一連の4つの分化段階の細胞集団、すなわち、未分化ES細胞、Flk1+中胚葉細胞、FCV心臓前駆細胞および心筋細胞を同定および純化ことができる(図4)(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K. ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。純化されたFlk1+細胞をOP9間質細胞上で培養すると、培養4日(Flk−4日目(Flk-d4))で自己拍動心筋細胞が出現する。細胞移植試験に用いる前に、心筋細胞分化に対するin vitroでの効果を確認するためにFlk1+細胞にCSAを加えたところ、CSA(1〜3μg/mL)は、Flk−6日目(Flk-d6)において拍動細胞を増加させる顕著な効果を示した(図4の実験1)(図1a)。CSAの添加は対照よりも、心臓トロポニン−T(cTnT)陽性心筋細胞の出現におよそ13倍の増加を誘導した(図1b、c)。CSAにより誘導された心筋細胞は明瞭なcTnT発現(図1d)と筋節形成(図1e)を示した。純化された心筋細胞の活動電位はペースメーカー電位を有する細胞の存在(図1f)、ならびにペースメーカー電位および自己拍動を欠いた心室型細胞(図1g)の存在を示した。純化されたCSA誘導心筋細胞は、α−ミオシン重鎖(MHC)、ミオシン軽鎖(MLC)2vおよび2a、Nkx2.5、GATA4、T−boxタンパク質3(Tbx3)などの種々の心臓マーカーmRNA発現を示した(図5)。これらの結果は、CSA処理により機能的心筋細胞が首尾よく誘導され、増殖されたことを示す。至適条件において、およそ60%のFlk1+細胞由来細胞がMHCプロモーターにより駆動されるGFPに陽性(GFP+)の心筋細胞となった(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))(図1h)。CSA処理は、同じ数のFlk1+細胞から出発してFACS純化心筋細胞の収量におよそ17倍の増加をもたらした(図1i)。結果として、1個のES細胞からおよそ200個の心筋細胞を得ることができた(図6)。
本発明者らはさらに、iPS細胞に対するCSAの心臓形成効果を調べた。最近、本発明者らは、マウスES細胞と同じ分化方法を用い、マウスiPS細胞(Okita, K.ら, Nature448, 313-317 (2007))が心筋細胞を生じ得ることを証明した(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005); Narazaki, Gら Circulation 118, 498-506 (2008))。純化されたiPS細胞由来Flk1+細胞に対するCSA処理は、対照よりおよそ12倍心筋細胞の出現を著しく増加させた(図2a、b)。CSA処理はまた、iPS細胞においてFCV心臓前駆細胞集団を劇的に増加させた。iPS細胞由来Flk1+細胞からのFCV細胞の最大パーセンテージはCSAにより28%まで増加した(図2c)。
抗体
マウスE−カドヘリン(ECCD2)、マウスFlk1(AVAS12)に対するモノクローナル抗体(MoAb)を本発明者らの研究室でこれまでに記載されているように作製し、標識した(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.らFASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。心臓トロポニン−T(cTnT)に対するMoAb(1:2000)はNeoMarkers (Fremont, CA)から購入した。ヒトiPS細胞を染色するため、cTnTに対するMoAb(1:100)をSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入した。マウスα−アクチニンに対するMoAb(1:800)はSigma (St Louis, Mo)から購入した。PEコンジュゲートAVAS12のMoAbはeBioscience (San Diego, CA)から購入した。マウスCD31に対するMoAb(免疫染色用、1:200)およびビオチン化CXCR4はBD Pharmingen (San Diego, CA)から購入した。GFPに対するポリクローナルウサギ抗体(1:500)はMBL (Nagoya, Japan)から購入した。
シクロスポリン−A(Novartis Pharmaから恵与された。)をジメチルスルホキシド(DMSO)(Nacalai Tesque, Kyoto Japan)に30mg/mLで溶かした。使用時に分化培地で1〜3μg/mLの希釈溶液を作製した。FK506(Astellas Pharma Incから譲渡)をDMSOに10mg/mLで溶かし、分化培地で10ng〜1μg/mLの希釈溶液を作製した。11R−VIVITはCalbiochem(Darmstadt, Germany)から入手した。Wnt3a、Dkk−1およびTGF−βはR&D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。アネキシンV−FITCまたはPEはBD pharmingen (San Diego, CA)から購入した。Click−iT(商標)EdU Alexa Fluor488イメージングキットはInvitrogen(Carlsbad, California)から入手した。PKH67蛍光色素はSigma (St. Louis, MO)から購入した。
マウスα−ミオシン重鎖(MHC)プロモーターにより駆動されるEGFP遺伝子を有するEMG7マウスES細胞を本研究に用いた(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。Nanogプロモーターにより駆動されるGFP/IRES/ピューロマイシン耐性遺伝子を有する生殖系コンピテントマウスiPS細胞系統20D−17、38C−2および38D−2(Nanog−iPS細胞)をこれまでに記載されているように維持した。簡潔には、iPS細胞を、15%FCS、非必須アミノ酸、1mmol/Lピルビン酸ナトリウム、5.5mmol/L 2−メルカプトエタノール、50ユニット/mLペニシリンおよび50mg/mLストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)中、ピューロマイシン耐性遺伝子が安定的に組み込まれているマイトマイシン−C−処理マウス胚繊維芽細胞(MEF)のフィーダー層上で維持した。OP9間質細胞は記載のように維持した(Nishikawa, S.I.ら Development 125, 1747-1757 (1998))。
END−2細胞(Dr. Mummeryから恵与された。)は、これまでに記載されているように培養した(Mummery, C.ら Circulation 107, 2733-2740 (2003))。Myc陰性ヒトiPS細胞系統253G1および253G4もこれまでに記載されているように維持した(Nakagawa, M.ら Nat. Biotechnol. 26, 101-106(2008))。ヒトiPS細胞からの心筋細胞分化の誘導は、これまでに記載されている方法(Mummery, C.ら Circulation 107, 2733-2740 (2003); Passier, R.ら Stem Cells 23, 772-780 (2005))に基づき、未分化ヒトiPS細胞の凝集塊をEND−2細胞上で共培養することにより行った。心筋細胞分化に対するCSAの効果を検討するため、2μg/mLのCSAを0日目または共培養開始の8日後に培養培地に加えた。12日目の拍動コロニー数を顕微鏡観察によりスコアリングした。細胞内Ca++測定およびアクチニンの免疫染色のため、拍動コロニーを機械的に切り取り、トリプシン−EDTA処理で穏やかに分離し、ゼラチンコーティングディッシュ上に再度プレーティングした。
hOCT3/4−S、CACCATGGCGGGACACCTGGCTTCAG(配列番号1);
hOCT3/4−AS、ACCTCAGTTTGAATGCATGGGAGAGC(配列番号2);
hSOX2−S、CACCATGTACAACATGATGGAGACGGAGCTG(配列番号3);
hSOX2−AS、TCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTGC(配列番号4);
hKLF4−S、CACCATGGCTGTCAGTGACGCGCTGCTCCC(配列番号5);
hKLF4−AS、TTAAAAATGTCTCTTCATGTGTAAGGCGAG(配列番号6);
hMYC−S、CACCATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAA(配列番号7);
hMYC−AS、TCACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAG(配列番号8)
を用いるRT−PCRにより、ヒト組織ライブラリーから個々にクローニングした。
Flk1+細胞の誘導およびFlk1+細胞の選別は、これまでに記載されているように行った(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。簡潔には、マウスES細胞(またはiPS細胞)を、分化培地(10%ウシ胎児血清を添加したα最小必須培地(GIBCO, Grand Island, NY))中、IV型コラーゲンコーティングディッシュ(Biocoat, BecktonDickinson)またはマイトマイシンC処理コンフルエントOP9細胞シート(MMC−OP9)上、1〜2.5×103細胞/cm2の細胞密度で96〜108時間培養した。(iPS細胞については、細胞をまずゼラチンコーティングディッシュにプレーティングし、30分間培養して接着したフィーダー細胞を排除し、次に、非接着細胞を回収し、分化させた)。細胞を回収し、Flk1+細胞を純化するためにFACSを行った。その後、純化されたFlk1+細胞をMMC−OP9上に1〜10×103細胞/cm2の細胞密度でプレーティングし、心臓分化を誘導するための分化培地で培養した。培地は2日ごとに交換した。FCV細胞の誘導およびFCV細胞の選別は記載されているように行った(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。純化されたFCV前駆細胞を再びMMC−OP9細胞上にプレーティングした。プレーティング前にMMC−OP9細胞を予めPKH67蛍光色素(Sigma)で染色した。CSA(1〜3μg/mL)をOP9細胞上の未分化ES細胞、Flk1+細胞またはFCV細胞に加えた。CSAは2日ごとに培地の交換とともに繰り返し加えた。同じ希釈率のDMSO単独も対照として用いた。
分化中のES細胞(またはiPS細胞)についてのFACSはこれまでに記載されているように行った(Yamashita, J.ら Nature 408, 92-96 (2000); Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。ES細胞分化の96〜108時間後、培養細胞を採取し、アロフィコシアニン(APC)結合AVAS12およびFITC結合ECCD2で染色した。ヨウ化プロピジウム(Sigma)を排除する、生存したFlk1+/E−カドヘリン−細胞をFACS Vantage(Becton Dickinson)により選別した。FCV前駆細胞のFACSでは、PKH67染色OP9細胞(Flk−2日目)上で純化されたFlk1+細胞の分化2日後に、培養細胞を採取し、PE結合AVAS12とビオチン化CXCR4の組合せで染色し、その後、ストレプトアビジン結合APCを加え、FACS分析を行った。PKH陰性集団を分析し、ES細胞由来細胞として選別した。Flk1+/CXCR4+集団(血管内皮カドヘリン陰性であった(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005)))をFCV心臓前駆細胞として評価し、選別した。心筋細胞のFACSについては、OP9細胞上でのFlk1+細胞の培養6日後(Flk−6日目)に細胞を採取し、GFP+集団を分化心筋細胞として評価し、選別した。
ECおよび心筋細胞の免疫染色は記載のように行った(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。簡潔には、4%パラホルムアルデヒド(PFA)固定細胞を2%スキムミルク(BD, bioscience)でブロッキングし、一次抗体とともにインキュベートした。免疫組織化学については、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)(Invitrogen)と結合させた抗マウスIgGを二次抗体として用いた。免疫蛍光染色については、Alexa 488または546と結合させた抗マウス、ラットおよびウサギIgを二次抗体として用いた。核をDAPI(Invitrogen)で可視化した。心臓に左心室の頂端から逆向きの灌流を行い、4%緩衝パラホルムアルデヒドで4℃にて2時間固定し、O.C.T化合物(Tissue-Tek; Miles, Inc.)に包埋し、厚さ6μmの横断切片を得た。Zenon Alexa Fluor 546標識キット(molecular Probes)で標識した一次抗体抗cTnTと抗GFPの混合物でcTnTおよびGFPの二重染色を行った後、二次抗体Alexa Fluor488結合抗ウサギIg(1:500)(Molecular Probes)を用いた。染色された細胞を、倒立蛍光顕微鏡Eclipse TE2000−U(Nikon, Tokyo, Japan)、デジタルカメラシステムAxioCam HRc(Carl Zeiss, Germany)またはBIOREVO BZ−9000(Keyence Osaka, Japan)を用いて写真撮影した。
心筋細胞の分化を、記載のように(Yamashita, J.K.ら, FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))Alexa Fluor 546を用いたcTnT染色の蛍光強度により定量的に評価した。染色細胞の画像をデジタルCCDカメラCool SNAP−HQ(Roper, Atlanta, CA)に取り込み、画像インフォマティクスソフトウエアImage−Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)を用いて計算した。24ウェルプレートの各ウェルにおいて倍率40倍の19視野を、Image−Pro Plus(Media Cybernetics)のStage−Proモジュールにより制御される倒立蛍光顕微鏡に取り付けた電動X−YステージProScan Stages(Planetron, Tokyo, Japan)で自動的に選択した。19視野から得られた全蛍光強度の合計を出現した心筋細胞の量として定義した。
実験手順は全て、日本の「実験動物の管理と使用に関する指針」に関する法律を遵守する京都大学動物実験指針に従って行った。本発明者らは、体重235〜255gのF344/nruヌードラット(Kyoto University, Japan)を用いた。心筋梗塞は、これまでに記載されているように(Tambara, K.ら Circulation 108 suppl II, 259-263 (2003))、左開胸術による左冠動脈の基部近位の結紮により作出した。
結紮後4週間で、中程度のサイズの心筋梗塞(MI)(梗塞サイズ:20〜40%)を有する6匹のラットを細胞移植実験に用いた。左開胸から、漏出を防ぐために注入点において6.0ポリプロピレン糸でマットレス縫合(mattress sultures)した後に、4×105細胞を含む100μL培養培地を、27ゲージの針を用い、傷病部位の中心部の心外膜下に注入した。注入後、MI領域の隆起を確認した。麻酔または外科術については記載されている(Tambara, K.ら Circulation 108 suppl II, 259-263 (2003))。
FACSで純化されたGFP陽性心筋細胞集団をゼラチンコーティングカバーガラス上に播種した。これらの細胞を2〜4日間培養した後、カバーガラスをパッチクランプレコーディングチャンバーに移した。GFP蛍光(励起480±20nmおよび発光535±25nm)を示す細胞をパッチクランプ増幅器(Axopatch200B, Axon Instruments/Molecular Devices Corp., Union City, CA)による膜電位の測定に用いた。実験は全て36〜37℃で行った。
ヒトiPS細胞に1μM Quest Fluo−8(ABD Bioquest, Inc. Sunnyvale, CA)を30分間加えた。拍動コロニーのFluo−8蛍光(励起495±10nmおよび発光535±20nm)を、背面照射型電子増倍管CCDカメラ(ImagEM Hamamatsu Photonics K.K. Hamamatsu, Japan)で、16ミリ秒ごとに測定した。3枚の連続画像の平均をとった。iPSコロニーの蛍光強度(バックグラウンド蛍光を差し引いたもの)の変化を、記録開始時のもの(F0)との強度比(F1/F0)として表した。測定は室温で行った。
種々の細胞集団から全RNAを、RNeasy Mini Kit(QIAGEN, Valencia, CA)を用いて単離した。cDNAをスーパースクリプトIII第一鎖合成系(Invitrogen)を用いて合成した。PCR反応はKOD plus(Toyobo, Tokyo, Japan)を用いて行った。用いたプライマーは表Iおよび表IIに示す。
FCV前駆細胞については、PKH67標識を用いずに、OP9細胞上で純化されたFlk1+細胞を2日分化させた後、細胞を採取し、PE結合AVAS12およびビオチン化CXCR4に対する抗体で細胞を染色した。GFP+心筋細胞はFlk−6日目にFACSにより純化した。次に、キットの染色プロトコールに従い、本発明者らはアネキシンV−FITCを加え、暗所、室温で15分間インキュベートし、FACS分析を行った。
本発明者らは、FACSによるFCV細胞選別の2時間前に培養培地にEdU溶液(Invitrogen)(10μM)を加え、選別されたFCV細胞をサイトスピン(Thermo Shandon)(Waltham, MA)を用いてスライド上にプレーティングし、4%PFAで固定し、製造者の指示に従ってClick−iT(商標)反応カクテルとともにインキュベートすることによりEdUを検出した。EdU+/DAPI+ FCV細胞の数を定量するため、無作為に選択した10視野で細胞を計数した。GFP+心筋細胞については、本発明者らは、Flk−3日目において固定する2時間前に培養培地にEdU溶液を加えた。cTnT+/EdU+/DAPI+核を計数した。
単一に選別されたFCV細胞は、Cloncyte(BecktonDickinson, Franklin Lakes, NJ)を用い、96ウェルプレートの個々のウェルのOP9上にプレーティングされた(Yamashita, J.K.ら FASEB J. 19, 1534-1536 (2005))。4日後、Abcam(Cambridge, UK)のカルポニンに対する一次抗体(1:500)、cTnT(1:2000)およびCD31(1:200)で三重染色を行った後、Alexa488結合抗ラットIg、Alexa546結合抗マウスIg、およびAPC結合抗ウサギIgを添加した。APCおよびDAPI染色ではそれぞれ青およびグレーの画像が得られた。
選別されたFCV細胞を、サイトスピン(Thermo Shandon)を用いてスライド上にプレーティングし、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)から入手したAVAS12に対する抗体(1:2000)およびNkx2.5に対する抗体(1:250)、ならびにアイオワ大学(IOWA city, IA)から入手したislet1に対する抗体(1:500)で染色した。Alexa 488または546と結合させたマウス、ラットおよびウサギIgを二次抗体に用いた。
Flk1+細胞を6日間、OP9と共培養した。浮遊細胞および接着細胞を採取し、ビオチン結合抗CD45(eBioscience, San Diego, CA)または抗CD31抗体で染色した後、ストレプトアビジン−APCを加えた。染色された細胞をFACS vantageで分析した。
データは、ウィンドウズ用のStatViewソフトウエア(version 5.0, SAS Institute Inc, Cary, NC)を用いて処理した。値は平均±SDとして報告する。全群の値の比較はANOVAによって行った。少なくとも3回の独立した実験を行った。p<0.05を有意とみなした。
Claims (10)
- 心筋細胞および/または心臓前駆細胞を製造するための方法であって、下記の工程:
(i)人工多能性幹(iPS)細胞または胚性幹(ES)細胞をシクロスポリン−Aの非存在下で培養して、中胚葉細胞を誘導する工程、および
(ii)工程(i)で得られた中胚葉細胞をシクロスポリン−Aの存在下で培養する工程
を含み、該中胚葉細胞がFlk1陽性(Flk1+)細胞であることを特徴とする、方法。 - 心臓前駆細胞が心筋に分化する能力を有する、請求項1に記載の方法。
- 心臓前駆細胞がFlk1+/CXCR4+/血管内皮カドヘリン−細胞集団である、請求項1または2に記載の方法。
- 心筋細胞または心臓前駆細胞が心筋組織を組み立てる能力を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- iPS細胞またはES細胞が哺乳類に由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- iPS細胞が、少なくともOctおよびSoxファミリーメンバーの転写因子をコードする遺伝子による形質導入により、哺乳類の体細胞から生成される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 転写因子がKlfファミリーメンバーをさらに含むか、またはKlfファミリーメンバーとMycファミリーメンバーの組合せをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 哺乳類がヒトまたはマウスである、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 体細胞が組織または器官からのものである、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋細胞および/または心臓前駆細胞を誘導し得る薬剤のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、iPS細胞から分化された中胚葉細胞を候補薬剤の存在下で培養すること、および該薬剤を拍動コロニーおよび/またはFlk1+/CXCR4+/血管内皮カドヘリン−細胞の形成に基づいて選択することを含む、方法。
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