JP6090855B2 - 心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤ならびに心筋細胞および/または心筋前駆細胞の増殖方法 - Google Patents
心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤ならびに心筋細胞および/または心筋前駆細胞の増殖方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6090855B2 JP6090855B2 JP2013523110A JP2013523110A JP6090855B2 JP 6090855 B2 JP6090855 B2 JP 6090855B2 JP 2013523110 A JP2013523110 A JP 2013523110A JP 2013523110 A JP2013523110 A JP 2013523110A JP 6090855 B2 JP6090855 B2 JP 6090855B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- inhibitor
- cardiomyocyte
- myocardial progenitor
- myocardial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5061—Muscle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞および/または心筋前駆細胞である、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、i) GSK3β阻害剤、CaMK2 阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、ii) GSK3β阻害剤、ERK 活性化剤およびp38阻害剤から成る、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記ERK脱リン酸化阻害剤がSU1498であり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記CaMK2 阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、i) BIO、SU1498およびSB203580、もしくは、ii) BIO、KN93およびSB203580から成る、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を提供することである。
本発明の他の態様は、心筋細胞および/または心筋前駆細胞を、GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2 阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する培地で培養する工程を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞の増殖方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋細胞および/または心筋前駆細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、i) GSK3β阻害剤、CaMK2 阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、ii) GSK3β阻害剤、ERK 活性化剤およびp38阻害剤から成る、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少させる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記GSK3β阻害剤がCHIR99021またはBIOであり、前記Raf活性化剤がZM336372であり、前記ERK 活性化剤がSU1498であり、前記CaMK2 阻害剤がKN62またはKN93であり、前記p38阻害剤がSB203580である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記薬剤が、i) BIO、SU1498およびSB203580、もしくは、ii) BIO、KN93およびSB203580から成る、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、以下の工程を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法を提供することである。
(1)試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞および/または心筋前駆細胞に接触させる工程、
(2)工程(1)の後に心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び
(3)心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数が、試験物質と接触させないときの心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数よりも大きい場合に、該試験物質を心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、以下の工程を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤の
スクリーニング方法を提供することである。
(1)試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞および/または心筋前駆細胞に接触させる工程、
(2)工程(1)の後に心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び
(3)心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数が、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖能を有する陽性コントロール物質と接触させたときの心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数と比べて同等または大きい場合に、該試験物質を心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。
本発明の他の態様は、前記陽性コントロール物質がGSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤、Raf活性化剤、CaMK2 阻害剤およびp38阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物である、前記方法を提供することである。
本発明に係る「GSK-3β阻害剤」とは、GSK(グリコーゲンシンターゼキナーゼ)-3β蛋白質のキナーゼ活性(例えばβカテニンに対するリン酸化能)を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、その具体例としては、インジルビン誘導体であるBIO(別名、GSK-3βインヒビターIX;6-ブロモインジルビン3'-オキシム)、マレイミド誘導体であるSB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3βインヒビターVII(4-ジブロモアセトフェノン)、CHIR99021、6-[(2-{[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチルイミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イル]アミノ}エチル)アミノ]ピリジン-3-カルボニトリル(WO1999/65897)、および、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts(別名、GSK-3βペプチドインヒビター;Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2)、ならびにこれらの誘導体などが挙げられる。これらの化合物はCalbiochem社、Biomol社やStemgen社等から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれらに限定されない。
本発明に係る「ERK脱リン酸化阻害剤」とは、ERKと脱リン酸化酵素との結合を阻害し、ERKの脱リン酸化を阻害する物質として定義され、SU1498((E)-3-(3,5-ジイソプロピル-4-ヒドロキシフェニル)-2-[(3-フェニル-n-プロピル)アミノカルボニル]アクリロニトリル)またはAG1296(6,7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン)が例示される。本発明におけるERKは、ERK1/2が例示される。本剤によってリン酸化が維持されるERKのリン酸化部位としては、例えばJ Biol Chem. 279, 5716 (2004)に記載の202番目および204番目のチロシンが例示されるがこれに限定されない。これらの化合物はCalbiochem社から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれらに限定されない。
本発明に係る「Raf活性化剤」とは、細胞内のRafを活性化する物質として定義され、ZM336372(3-(ジメチルアミノ)-N-[3-[(4-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]-4-メチルフェニル]ベンズアミド)が例示される。本発明におけるRafは、Raf-1が例示される。ZM336372は、Calbiochem社から市販されており、容易に使用することが可能であるが、特にこれに限定されない。
本発明に係る「CaMK2阻害剤」とは、CaMK2の機能を阻害する物質もしくはCaMK2遺伝子の発現を阻害する物質として定義され、(1)KN62(1-[N,O-ビス(5-イソキノリンスルホニル)-N-メチル-L-チロシル]-4-フェニルピペラジン)またはKN93(2-[N-(2-ヒドロキシエチル)]-N-(4-メトキシベンゼンスルホニル)]アミノ-N-(4-クロロシンナミル)-N-メチルベンジルアミン)に例示される化学的阻害物質、(2)カルモジュリン結合部位と競合的に作用するドミナントネガティブ変異体(例えば、CaMK(281-302Ala286)(アミノ酸配列:MHRQEAVDCLKKFNARRKLKGA:SEQ ID No:13)およびこれをコードする核酸、(3)CaMK2に対するsiRNA及びshRNA等が例示される。本発明において、好ましいCaMK2のアイソフォームは、Camk2dおよびCamk2gである。
囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM〜約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。
本明細書に係る「p38阻害物質」とは、p38タンパク質の機能を阻害する物質として定義され、例えば、p38の化学的阻害物質、p38のドミナントネガティブ変異体もしくはそれをコードする核酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
培地など)中に、該阻害物質濃度がp38の阻害に十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該阻害物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。阻害物質濃度は用いる阻害物質の種類によって異なるが、例えば、約10nM〜約10μMの範囲で適宜選択される。接触期間は対象細胞が増殖するために十分な時間であれば特に制限はないが、例えば、2日から5日の範囲で適宜選択される。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培地で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹橋正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹 (iPS) 細胞は、ある特定の核初期化物質を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のmRNAおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi および S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676、K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872、J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920、M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106、国際公開WO 2007/069666および国際公開WO 2010/068955)。核初期化物質は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子またはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはその遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Oct3/4, Klf4, Klf1, Klf2, Klf5, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18, c-Myc, L-Myc, N-Myc, TERT, SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, Bmil, Lin28, Lin28b, Nanog, EsrrbまたはEsrrgが例示される。これらの初期化物質は、iPS細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも1つ、2つもしくは3つ含む組み合わせであり、好ましくは4つを含む組み合わせである。
参照することにより取得できる。当業者は、当該cDNA配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名 マウス ヒト
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
papillomavirus)の起点とその複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、EBNA-1およびoriPもしくはLarge TおよびSV40ori配列を含むことが挙げられる(WO 2009/115295、WO 2009/157201およびWO 2009/149233)。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、IRESまたは口蹄病ウイルス(FMDV)2Aコード領域により結合されていてもよい(Science, 322:949-953, 2008ならびにWO 2009/092042およびWO 2009/152529)。
3, 132-135 (2008))、LIFまたはbFGFなどの増殖因子、ALK5阻害剤(例えば、SB431542)(Nat. Methods, 6: 805-8 (2009))、mitogen-activated protein kinase signalling阻害剤、glycogen synthase kinase-3阻害剤(PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295などのmiRNA (R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009))、等を使用することができる。
上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培地で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにES細胞様コロニーを生じさせることができる。また、iPS細胞の誘導効率を高めるために、5-10%と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
培地(選択培地)で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et
al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
体細胞と卵子もしくはES細胞とを融合させることにより、融合させたES細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である(Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001; Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73)。
本発明において、心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。また、心筋前駆細胞とは、前記心筋細胞の前駆細胞であって、拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞および血管平滑筋を生じる能力を有する細胞を意味する。ここで、心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していても良く、また、単離されていても良い。
カーのいずれか1つ以上の発現量またはこれらのマーカーのプロモーターに結合されたレポーター遺伝子の発現量を指標とすることができる。
125, 1747-1757 (1998))またはEND-2細胞(Mummery C, et al, Circulation. 107:2733-40 (2003))が例示される。浮遊培養は、細胞接着特性を向上させるための人工的な処理(例えば、細胞外マトリクスなどによるコート処理)がされていない培養皿、または接着を人工的に抑制するための処理(例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)によるコート処理)がされた培養皿を用いて行うことができる。しかしながら、これらの例には限定されない。他の態様では、浮遊培養と付着培養との組み合わせ法がなされる。好ましくは、浮遊培養の後に付着培養がなされる。
本発明は、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法を提供する。
(1−1)試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞および/または心筋前駆細胞に接触させる工程、
(1−2)工程(1−1)の後に心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び
(1−3)心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数が、試験物質と接触させないときの心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数(参照の数)よりも大きい場合に、該試験物質を心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。
(2−1)試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞および/または心筋前駆細胞に接触させる工程、
(2−2)工程(2−1)の後に心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び
(2−3)心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数が、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖能を有する陽性コントロール物質と接触させたときの心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数(参照の数)と比べて同等または大きい場合に、該試験物質を心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。
(1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67)に適用できる。分子ライブラリーの合成法の例が知られている (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51))。
化合物ライブラリーは、溶液(Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21)、ビーズ(Lam (1991) Nature 354: 82-4)、チップ (Fodor (1993) Nature 364: 555-6)、細菌 (米国特許5,223,409 B)、胞子 (米国特許5,571,698 B, 米国特許 5,403,484 B および米国特許5,223,409 B)、プラスミド (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9) またはファージ (Scott および Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990)
Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; US 2002-103360)として調製されてもよい。
本発明は、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤をスクリーニングするためのキットを提供する。該キットは上記細胞、試薬、及び培地を含んでもよい。該キットはさらに、分化誘導プロトコルを記載した文書または仕様説明書を含んでもよい。
マウスES細胞は、E14Tg2aの一方のアリルにおいてOct3/4遺伝子領域へIRESBSDpAをKnock inすることで作製されたES細胞株EB3(Niwa H, et al, Nat Genet.24:372-6 (2000))へalpha-MHCのプロモーターによりGFPの発現が制御されるベクターを導入したEMG-7(Yamashita J, FASEB J, 2005)を用いた。ヒトiPS細胞(253G1)は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した(Nakagawa M, et al. Nat Biotechnol. 26:101-6 (2008))。尚、253G1は、理研BRCより入手可能である。
マウスES細胞株EMG-7を0.1%ゼラチンコートディッシュ上で10%FBS含有alpha MEM培地を用いて108から110時間培養した。続いて、Flk1陽性細胞をFACSを用いて単離し、OP9細胞上で3μg/ ml のCyclosporine Aを含有する培地(10%FBS含有alpha MEM)を用いて6日間培養して心筋細胞へ分化誘導した。この細胞をFlkd6と称す。
を用いて16日間END-2細胞と共培養することで行った。
心筋細胞増殖促進剤のスクリーニング
EMG-7から分化誘導した上述のFlkd6からalpha-MHC-GFPを指標としてFACSで純化した。得られた細胞に282個の候補薬剤を加えて培養し、5日後に、無添加群と比較してalpha-MHC-GFP陽性細胞数が1.5倍以上であった薬剤を9種選択した。そのうち作用機序が異なるものを7剤選択した。さらに、これらの7剤のうち添加後のalpha-MHC-GFP細胞数を有意に増加させる1μM のBIO (Calbiochem)、5μM のSU1498(Calbiochem)および5μM のKN93(wako)を再選択した(図1a)。これらの3剤をFlkd6へ添加して2日間培養(Flkd6+2)または5日間培養(Flkd6+5)した時のalpha-MHC-GFP陽性細胞数をFACSで測定したところ、特にFlkd6+5において陽性細胞数の有意な増加が確認された(図1b)。
心筋細胞増殖促進剤の細胞周期へ与える影響
細胞周期へ与える影響を確認するため、ヒストン3のリン酸化(pH3)(M期)およびエチニルウリジン(EdU)(S期)の陽性細胞数を確認した(図2a〜d)。BIOは添加後早期からS期M期を促進することが確認された。
同じ作用を有する他剤の効果
GSK3β阻害剤およびCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ2(CaMK2) 阻害剤について、同様にFlkd6+5においてその効果を確認したところ、CHIR99021 (Stemgen)およびKN62(wako)においても同様の効果を有することを確認した(図3a, b)。さらに、CaMK2の各サブタイプのsiRNA(表1)により遺伝子を抑制したところ、Camk2dおよびCamk2gを抑制した時に有意に心筋細胞増殖促進効果が高かった(図3c)。また、SU1498のメカニズムを確認するため、MEK阻害剤であるPD98059と同時に添加したところその効果がなくなったことから(図3d)、SU1498はERKのリン酸化を保持することにより心筋細胞の増殖を促進させていると示唆された。これより、Raf 活性化剤であるZM336372(Calbiochem)についても検討したところ、SU1498と同様に心筋細胞増殖促進効果を有していることが確認された(図3d)。
組み合わせによる効果および細胞周期関連遺伝子の発現について
p38の阻害剤にも心筋細胞の増殖の促進効果が報告されていることから(Engel FB, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 103:15546-51 (2006))、p38阻害剤であるSB203580を含めて、以下の組み合わせによる効果を検討した。濃度は、実施例1に記載したものと同様である。
(1)BIO+ SU1498
(2)BIO+ KN93
(3)SU1498+ KN93
(4)BIO+ SU1498+ KN93
(5)SB203580
(6)BIO+ SU1498+SB203580
(7)BIO+ KN93+SB203580
させることも確認された(図4bからi)。
ヒトiPS細胞由来の心筋細胞に対する効果
253G1を上述の方法で心筋細胞へ分化し、各薬剤を4日間添加したときのtroponin T type 2(cTnT)陽性細胞数を検出したところ、BIO、SU1498、BIO+ SU1498+SB203580およびBIO+KN93+SB203580において対照より比較的多く、特にBIO+ SU1498+SB203580の場合、有意に当該細胞数が多かった(図5a)。この時のpH3およびEdUの免疫染色の陽性率を検討したところ、EdUの陽性率において、対照(11.3±1.0%)に比べて、BIO(16.0±0.5%)、SU1498(14.3±0.4%)、SB203580(14.6±2.1%)、BIO+ SU1498+SB203580(19.9±1.4%)およびBIO+KN93+SB203580(16.3±4.3%)と陽性率が高かった(図5b)。
Claims (12)
- CaMK2阻害剤を含有する心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。
- 前記CaMK2阻害剤がKN62またはKN93である、請求項1に記載の心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。
- i) GSK3β阻害剤およびCaMK2阻害剤、もしくは、ii) GSK3β阻害剤およびERK脱リン酸化
阻害剤を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。 - i) BIOおよびSU1498、もしくは、ii) BIOおよびKN93を含む、請求項3に記載の心筋細胞
および/または心筋前駆細胞増殖剤。 - i) GSK3β阻害剤、CaMK2阻害剤およびp38阻害剤、もしくは、ii) GSK3β阻害剤、ERK脱リン酸化阻害剤およびp38阻害剤を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。
- i) BIO、SU1498およびSB203580、もしくは、ii) BIO、KN93およびSB203580を含む、請求
項5に記載の心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。 - ERK脱リン酸化阻害剤、およびRaf活性化剤からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物を含有する心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤であって、前記ERK脱リン酸化阻害剤がSU1498であり、前記Raf活性化剤がZM336372である、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。
- 前記心筋細胞および心筋前駆細胞がそれぞれヒト心筋細胞およびヒト心筋前駆細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤。
- 前記心筋細胞および/または心筋前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られる心筋
細胞および/または心筋前駆細胞である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の心筋細胞
および/または心筋前駆細胞増殖剤。 - CyclinA2、CyclinD2、CyclinD3、Cdk2およびcdk4の発現を増強させ、Ink4bの発現を減少
させるための、請求項1〜9のいずれか一項に記載の心筋細胞および/または心筋前駆細
胞増殖剤。 - 心筋細胞および/または心筋前駆細胞を、請求項1〜10のいずれか一項に記載の心筋細
胞および/または心筋前駆細胞増殖剤を含有する培地で培養する工程を含む、心筋細胞お
よび/または心筋前駆細胞の増殖方法。 - 以下の工程を含む、心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤のスクリーニング方法。
(1)試験物質を、多能性幹細胞を分化誘導して得られた心筋細胞および/または心筋前
駆細胞に接触させる工程、
(2)工程(1)の後に心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数を計測する工程、及び
(3)心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数が、請求項1〜7のいずれか一項に記載
の心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤から選択される陽性コントロール物質と接
触させたときの心筋細胞および/または心筋前駆細胞の数と比べて同等または大きい場合
に、該試験物質を心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤として選択する工程。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41481210P | 2010-11-17 | 2010-11-17 | |
US61/414,812 | 2010-11-17 | ||
PCT/JP2011/077266 WO2012067266A1 (en) | 2010-11-17 | 2011-11-17 | Cardiomyocyte- and/or cardiac progenitor cell-proliferating agent and method for proliferating cardiomyocytes and/or cardiac progenitor cells |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013544071A JP2013544071A (ja) | 2013-12-12 |
JP2013544071A5 JP2013544071A5 (ja) | 2015-01-08 |
JP6090855B2 true JP6090855B2 (ja) | 2017-03-08 |
Family
ID=46084181
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013523110A Expired - Fee Related JP6090855B2 (ja) | 2010-11-17 | 2011-11-17 | 心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤ならびに心筋細胞および/または心筋前駆細胞の増殖方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9074188B2 (ja) |
EP (1) | EP2640829A4 (ja) |
JP (1) | JP6090855B2 (ja) |
WO (1) | WO2012067266A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011503232A (ja) | 2007-11-20 | 2011-01-27 | ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド | 免疫応答の調節 |
EP2691513A4 (en) * | 2011-03-31 | 2014-09-03 | Iheart Japan Corp | NEW CARDIOMYOCYTE MARKER |
SG11201500918YA (en) * | 2012-08-07 | 2015-04-29 | Singapore Health Serv Pte Ltd | Method, combination and/or composition for inducing cardiomyocyte differentation |
US10130637B2 (en) | 2012-11-02 | 2018-11-20 | Duke University | Inhibition of histone methyltransferase for cardiac reprogramming |
WO2015119575A2 (en) * | 2014-02-06 | 2015-08-13 | Singapore Health Services Pte Ltd | Improved method, combination and/or composition for inducing cardiomyocyte or neuronal differentation |
SG11201606427SA (en) * | 2014-02-07 | 2016-09-29 | Agency Science Tech & Res | 2,4,5-tri-substituted azole-based casein kinase 1 inhibitors as inducers for cardiomyogenesis |
WO2016154362A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Tolerogenic nanoparticles for treating diabetes mellitus |
WO2017181166A1 (en) * | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Microrna-294 and ln28a as a driver of cardiac tissue proliferation in response to pathological injury |
WO2019006512A1 (en) * | 2017-07-07 | 2019-01-10 | The University Of Queensland | REGENERATION OF CARDIOMYOCYTES |
WO2019178478A1 (en) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Reagents and methods with wnt agonists and bioactive lipids for generating and expanding cardiomyocytes |
AU2019435745A1 (en) * | 2019-03-18 | 2021-10-14 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Cardiomyocyte proliferation |
AU2020322415A1 (en) * | 2019-07-30 | 2022-02-24 | National Cerebral And Cardiovascular Center | KLF induced cardiomyogenesis |
WO2022006094A1 (en) * | 2020-06-30 | 2022-01-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | MOLECULES REGULATING HUMAN iPSC-DERIVED CARDIOMYOCYTES PROLIFERATION BY INHIBITING CELL-CELL CONTACT |
CN112481200A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-03-12 | 扬州大学 | 一种提升大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞效率的方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
EP1087963B1 (en) | 1998-06-19 | 2004-08-25 | Chiron Corporation | Inhibitors of glycogen synthase kinase 3 |
US20020103360A1 (en) | 1998-09-01 | 2002-08-01 | Yang Pan | Novel protein related to melanoma-inhibiting protein and uses thereof |
WO2005049822A1 (ja) | 2003-11-21 | 2005-06-02 | Daiichi Asubio Pharma Co.,Ltd. | 心筋細胞の増殖方法 |
US20060281791A1 (en) | 2005-04-29 | 2006-12-14 | Children's Medical Center Corporation | Methods of increasing proliferation of adult mammalian cardiomyocytes through p38 map kinase inhibition |
CN101228264B (zh) | 2005-06-22 | 2017-12-26 | 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 | 使灵长类多能干细胞分化成心肌细胞系细胞 |
BRPI0619794B8 (pt) | 2005-12-13 | 2022-06-14 | Univ Kyoto | Uso de um fator de reprogramação, agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática e métodos para preparar uma célula- tronco pluripotente induzida método e para preparar uma célula somática e uso de células-tronco pluripotentes induzidas |
GB0615327D0 (en) * | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
WO2009118928A1 (en) | 2008-03-26 | 2009-10-01 | Kyoto University | Efficient production and use of highly cardiogenic progenitors and cardiomyocytes from embryonic and induced pluripotent stem cells |
JP2010158206A (ja) | 2009-01-08 | 2010-07-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | ヒト心筋前駆細胞の選別方法 |
-
2011
- 2011-11-17 JP JP2013523110A patent/JP6090855B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-11-17 EP EP11842105.6A patent/EP2640829A4/en not_active Withdrawn
- 2011-11-17 US US13/885,515 patent/US9074188B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-11-17 WO PCT/JP2011/077266 patent/WO2012067266A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2640829A4 (en) | 2014-06-11 |
US9074188B2 (en) | 2015-07-07 |
EP2640829A1 (en) | 2013-09-25 |
JP2013544071A (ja) | 2013-12-12 |
US20130244262A1 (en) | 2013-09-19 |
WO2012067266A1 (en) | 2012-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6090855B2 (ja) | 心筋細胞および/または心筋前駆細胞増殖剤ならびに心筋細胞および/または心筋前駆細胞の増殖方法 | |
JP7282304B2 (ja) | 新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法 | |
JP7356658B2 (ja) | ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法 | |
JP5896360B2 (ja) | ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法 | |
JP6143268B2 (ja) | ヒト多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法 | |
KR102219743B1 (ko) | 신규 연골 세포 유도 방법 | |
JP6143027B2 (ja) | アストロサイトの誘導方法 | |
US9796962B2 (en) | Method for generating pancreatic hormone-producing cells | |
WO2016108288A1 (ja) | 骨格筋前駆細胞の製造方法 | |
JP7357369B2 (ja) | 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法 | |
JP6780197B2 (ja) | 新規成熟心筋細胞マーカー |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141114 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141114 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160129 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160621 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160819 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170110 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170202 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6090855 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |