JP7357369B2 - 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法 - Google Patents
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Description
腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の3つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の2つの組織の相互作用で発生する。(非特許文献1, 2)。さらに、近年、中間中胚葉は、前方と後方の2つの部位に分かれており、前方中間中胚葉から尿管芽、後方中間中胚葉から間葉が発生することが報告された(非特許文献3)。
[1]腎前駆細胞を含有する細胞集団からMET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を抽出する工程を含む、腎前駆細胞の濃縮方法。
[2]腎前駆細胞がOSR1(odd-skipped related 1)およびSIX2(別名SIX Homeobox 2)陽性である、[1]に記載の方法。
[3]MET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を抽出する工程が抗MET抗体および/または抗AGTR2抗体を用いて行われる、[1]または[2]に記載の方法。
[4]前記腎前駆細胞がヒト腎前駆細胞である、[1]から[3]のいずれかに記載の方法。
[5]前記腎前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された腎前駆細胞を含有する細胞集団である、[1]から[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記多能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞である、[5]に記載の方法。
[7]腎前駆細胞を含有する細胞集団においてMET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を検出する工程を含む、腎前駆細胞の検出方法。
[8]腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、[7]に記載の方法。
[9]METに特異的に結合する試薬および/またはAGTR2に特異的に結合する試薬を含む、腎前駆細胞の抽出または検出用キット。
[10]腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、[9]に記載のキット。
[11]METに特異的に結合する試薬が抗MET抗体であり、AGTR2に特異的に結合する試薬が抗AGTR2抗体である、[9]または[10]に記載のキット。
[12]多能性幹細胞から腎前駆細胞を含有する細胞集団を得る工程、および得られた細胞集団からMETおよび/またはAGTR2が陽性であることを指標として腎前駆細胞を抽出する工程を含む、腎前駆細胞の製造方法。
[13]腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、[12]に記載の方法。
[14]多能性幹細胞から腎前駆細胞を含有する細胞集団を得る工程が、以下の工程(i)~(vi)を含む、[12]または[13]に記載の方法。
(i)多能性幹細胞を、FGF(Fibroblast growth factor)2、BMP(Bone morphogenetic protein)4、GSK(Glycogen synthase kinase)-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程;
(ii)工程(i)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程;
(iii)工程(ii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGF(Transforming growth factor)β阻害剤を含む培地で培養する工程;
(iv)工程(iii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK(Rho-kinase)阻害剤を含む培地で培養する工程;
(v)工程(iv)で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびFGF9を含む培地で培養する工程;および
(vi)工程(v)で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程。
[15][12]~[14]のいずれかに記載の方法により腎前駆細胞を誘導する工程、および得られた腎前駆細胞を培養し、腎オルガノイドを形成させる工程を含む、腎オルガノイドの製造方法。
[16]METおよび/またはAGTR2からなる腎前駆細胞マーカー。
[17]腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、[16]に記載の腎前駆細胞マーカー。
[18]腎前駆細胞マーカーとしてのMETおよび/またはAGTR2の使用。
[19]腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、[18]に記載の使用。
[20][12]~[14]のいずれかに記載の方法により得られた腎前駆細胞又は[15]に記載の方法により得られた腎オルガノイドを含む、腎疾患の治療剤又は予防剤。
[21][12]~[14]のいずれかに記載の方法により得られた腎前駆細胞又は[15]に記載の方法により得られた腎オルガノイドの治療又は予防有効量を、治療又は予防を必要とする患者に投与する工程を含む、腎疾患の治療又は予防方法。
[22][12]~[14]のいずれかに記載の方法により得られた腎前駆細胞又は[15]に記載の方法により得られた腎オルガノイドの、腎疾患の治療又は予防のための医薬の製造における使用。
[23]腎疾患の治療又は予防に使用するための、[12]~[14]のいずれかに記載の方法により得られた腎前駆細胞又は[15]に記載の方法により得られた腎オルガノイド。
後腎は成体腎を形成する胎児腎組織の一つであり腎臓再生において必須のコンポーネントである。また後腎ネフロン前駆細胞やそこから派生する糸球体、尿細管に発生する腎疾患は多いため腎疾患モデル作製にとっても有用である。従って、本発明の方法は、腎疾患に対する治療方法探索の観点においても貢献しうる。
本発明の腎前駆細胞の濃縮方法は、腎前駆細胞を含有する細胞集団からMET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を抽出する工程を含む。本発明の腎前駆細胞の濃縮方法は、腎前駆細胞の選別方法と言い換えることもできる。
本発明で腎前駆細胞を含有する細胞集団を得るために使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば、胚性幹(ES)細胞、精子幹細胞(「GS細胞」)、胚性生殖細胞(「EG細胞」)、人工多能性幹(iPS)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞およびiPS細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚(例えば胚盤胞)の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41~46頁,羊土社(東京、日本))。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008);国際公開WO 2007/069666)。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720に記載の組み合わせが例示される。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター(以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007)、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター(WO 2010/008054)などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など)、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件(0.1%以上、15%以下の酸素濃度)によりiPS細胞を樹立しても良い(Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。
なお、上記患者としては腎疾患患者が挙げられ、具体的には、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)患者やAlport症候群患者が例示される。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している(T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502)。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。
多能性幹細胞から腎前駆細胞を含む細胞集団への分化誘導方法としては、特に制限されず、公知の方法を使用することができる。例えば、特許文献1に開示された方法が挙げられる。
より好ましくは、以下に示す、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を誘導し、さらに、腎前駆細胞に誘導する工程を含む方法が挙げられる。
多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導に際して、以下の工程(i)~(v)を含む方法を用いることができる。
(i)多能性幹細胞を、FGF2、BMP(骨形成タンパク質)4、GSK-3β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程;
(ii)工程(i)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培養する工程;
(iii)工程(ii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGFβ阻害剤を含む培地で培養する工程;
(iv)工程(iii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンおよびROCK阻害剤を含む培地で培養する工程;および
(v)工程(iv)で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびFGF9を含む培地で培養する工程。
この工程では、多能性幹細胞から後期後方エピブラストが誘導される。後期後方エピブラストは、CDX1、OCT4、NANOG、E-CDH(CDH1)の少なくとも1つ以上のマーカーが陽性である細胞として特徴づけられ、好ましくはこれらすべてのマーカーが陽性である細胞として特徴づけられる。後期後方エピブラストはさらに、EOMESおよびBRACHYURYが陰性であることが好ましい。
多能性幹細胞の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液(例えば、Accutase(商標)およびAccumax(商標)(Innovative Cell Technologies,Inc)が挙げられる)またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いて解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法である。工程(i)で用いるヒト多能性幹細胞としては、使用したディッシュに対して70%~80%コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
工程(i)で用いるレチノイン酸またはその誘導体の濃度は、例えば、1nMから100nM、好ましくは、5nMから50nM、より好ましくは、5nMから25nMである。
この工程では、後期後方エピブラストから中胚葉系譜原始線条が誘導される。中胚葉系譜原始線条は、CDX1およびBRACHYURYが陽性である細胞として特徴づけられる。中胚葉系譜原始線条はさらに、OCT4、NANOGおよびE-CDHが陰性であることが好ましい。
この工程では、中胚葉系譜原始線条から中胚葉系譜後期原始線条が誘導される。中胚葉系譜後期原始線条は、CDX2およびBRACHYURYが陽性である細胞として特徴づけられる。
培養液中におけるTGFβ阻害剤の濃度は、ALKを阻害する濃度であれば特に限定されないが、0.5μMから100μM、好ましくは、1μMから50μM、さらに好ましくは、5μMから25μMである。
この工程では、中胚葉系譜後期原始線条から後腎系譜後期原始線条が誘導される。後腎系譜後期原始線条は、HOX11およびBRACHYURYが陽性である細胞として特徴づけられる。
この工程では、後腎系譜後期原始線条から後期後方中間中胚葉が誘導される。中間中胚葉は、OSR1、HOX11およびWT1が陽性である細胞として特徴づけられる。
BMP阻害剤としては、Chordin、NOGGIN、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN193189(すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline)が例示される。
BMP阻害剤としてより好ましくはNOGGINであり、その濃度は、例えば、1~100ng/mlとすることができる。
中間中胚葉細胞から腎前駆細胞への分化誘導は、例えば、工程(v)で得られたような中間中胚葉細胞をGSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する工程(工程(vi)腎前駆細胞分化誘導工程ともいう)によって行うことができる。
腎前駆細胞を含有する細胞集団より腎前駆細胞の抽出または検出を行うために使用される試薬としては、METまたはAGTR2に特異的結合する試薬であれば特に制限されず、抗体、アプタマー、ペプチドまたは特異的に認識する化合物などを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその断片である。
また、これらのマーカーの遺伝子発現を調べる場合は、これらのマーカー遺伝子にハイブリダイズするプライマーやプローブを使用することができる。
本発明において、METに特異的に結合する試薬および/またはAGTR2に特異的に結合する試薬を含む、腎前駆細胞の濃縮(抽出)または検出用キットを提供する。本抽出キットに含まれる検出試薬は、上記したとおりのMETに特異的に結合する抗体またはAGTR2に特異的に結合する抗体などの物質である。本発明における抽出キットは、METおよび/またはAGTR2の検出試薬と共に、当該検出試薬の使用方法を記載した指示書を含むこともできる。
本発明はまた、上述した方法により得られた腎前駆細胞を用いて得られる腎臓オルガノイドを提供する。iPS細胞からの腎臓オルガノイドの製造は例えば、Nature, 526, 564-568 (2015)で報告されている。本発明においては、例えば、上記方法で得られた腎前駆細胞を培養して細胞塊を作製し、それを、3T3-Wnt4細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、またはマウス胎仔腎細胞と共培養すること、またはCHIR99021などのGSK-3β阻害剤を含む基礎培地を使用した半気相培養(参考文献Nature, 526, 564-568 (2015))によって得ることができる。培地は、GSK-3β阻害剤に加えて、FGF9やFGF2を含むことができる。
本発明において、腎疾患治療剤に含まれる腎前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
以下のプロトコールにてiPS細胞から腎前駆細胞を分化誘導した。なお、iPS細胞は4A6細胞株(OSR1-GFP/SIX2-tdTomato double reporterヒトiPS細胞株)(Stem Cells Transl Med. 2015 Sep; 4(9): 980-992.)を使用した。
2.24時間後(day1)にvitamin A free B27 supplement(Thermo Fisher Scientific Inc.)を添加したDMEM/F12 Glutamax(Thermo Fisher Scientific Inc.)を基礎培地とし、1μM CHIR99021, 10 nM Retinoic acid, 1 ng/ml BMP4, 100 ng/ml FGF2を添加した培地で培地交換。(後期後方エピブラストの作製・・・(i)
3.Day2に同基礎培地に3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2 を添加した培地に培地交換(中胚葉系譜原始線条の作製・・・(ii)
4.Day2.5, およびDay3に同基礎培地に 3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10μM A83-01 を添加した培地に培地交換(中胚葉系譜後期原始線条の作製・・・(iii)5.Day4, Day5, およびDay6に同基礎培地に 3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10 ng/ml ACTIVIN, 30μM Y27632を添加した培地に培地交換(後腎系譜後期原始線条の作製・・・(iv)
6.Day7, およびDay8に同基礎培地に200 ng/ml FGF9, 100 nM Retinoic acid, 25 ng/ml NOGGINを添加した培地に培地交換(後期後方中間中胚葉の作製・・・(v)
7.Day9, Day10, およびDay11に同基礎培地に200 ng/ml FGF9, 1 μM CHIR99021を添加した培地に培地交換(腎前駆細胞の作製・・・(vi)
1.24-well plate上で二次元培養にて分化誘導したヒトiPS細胞由来の腎前駆細胞(<1>に記載のプロトコルにて調製)に対して、上清を除去後、PBS 500 μlで1 washする。2.Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc., Cat# AM105) 100 μlを添加し、37℃ 10分間incubationする。
3.10% FBS 900 μlで中和後、細胞数を測定する。
4.1.0 x 10 6 cellsを1.5 ml tubeに分注し、200gで 5分間遠心する。
5.上清を除去し、PBS 100 μlに1.0 x 106 cellsを懸濁する。
6.懸濁液に、APCで蛍光標識したMET (HGFR)抗体 (R&D systems, Cat#; FAB3582A)を10μl添加し、氷上で30分間静置(15分後に1回Tapping)する。
7.PBS 1 ml添加し(Wash)、500gで 5分間遠心する。
8.上清を除去し、再度PBS 1 ml添加し(Wash)、500gで5分間遠心する。
9.上清を除去し、DAPIを終濃度1 μg/mlに調整した2% FBS (フェノールレッド不含有) 1mlで懸濁する。
10.フローサイトメトリー(AriaII)で解析する。
Alport症候群患者由来iPS細胞株(CiRA00878-3)またはADPKD患者由来iPS細胞株(CiRA00007)を上記<1>に記載の手順で分化誘導させ腎前駆細胞を含む細胞集団を取得し、上記<2>に記載の手順で抗MET抗体を用いて腎前駆細胞を濃縮した。濃縮された腎前駆細胞を1.0×105の大きさの細胞塊とし、1 μM CHIR99021および200 ng/ml FGF9を添加した基礎培地で1~2日間培養した。その細胞塊を5 μM CHIR99021および200 ng/ml FGF2を添加した基礎培地で2日間半気相培養し、さらに、基礎培地のみで8日間半気相培養を行った。
図1に示すように、MET抗体による単離によって、腎前駆細胞マーカーであるOSR1とSIX2両陽性細胞が効率よく濃縮されることがわかった。
分化誘導後の細胞集団において、19.9%がMET陽性であったが、MET陽性細胞を単離することにより、その96.9%がOSR1とSIX2の両陽性の腎前駆細胞であり、METをマーカーとすることで腎前駆細胞を高効率で濃縮できた。
腎前駆細胞(OSR1+SIX2+細胞)と、非腎前駆細胞(OSR1-SIX2-細胞)における遺伝子の発現量を比較し、腎前駆細胞で2倍以上発現の高い遺伝子(FC≧2)をGO 解析で探索したところ、AGTR2が同定された(表1)。AGTR2は腎前駆細胞のマーカーとしてMETと同様に使用できると考えられた。
Claims (15)
- 腎前駆細胞を含有する細胞集団からMET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を抽出する工程を含む、腎前駆細胞の濃縮方法。
- 腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、請求項1に記載の方法。
- MET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を抽出する工程が抗MET抗体および/または抗AGTR2抗体を用いて行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記腎前駆細胞がヒト腎前駆細胞である、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記腎前駆細胞を含有する細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導された腎前駆細胞を含有する細胞集団である、請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞である、請求項5に記載の方法。
- 腎前駆細胞を含有する細胞集団においてMET陽性細胞および/またはAGTR2陽性細胞を検出する工程を含む、腎前駆細胞の検出方法。
- 腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、請求項7に記載の方法。
- METに特異的に結合する試薬および/またはAGTR2に特異的に結合する試薬を含む、腎前駆細胞の抽出または検出用キット。
- 腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、請求項9に記載のキット。
- METに特異的に結合する試薬が抗MET抗体であり、AGTR2に特異的に結合する試薬が抗AGTR2抗体である、請求項9または10に記載のキット。
- 多能性幹細胞から腎前駆細胞を含有する細胞集団を得る工程、および得られた細胞集団からMETおよび/またはAGTR2が陽性であることを指標として腎前駆細胞を抽出する工程を含
む、腎前駆細胞の製造方法。 - 腎前駆細胞がOSR1およびSIX2陽性である、請求項12に記載の方法。
- 多能性幹細胞から腎前駆細胞を含有する細胞集団を得る工程が、以下の工程(i)~(vi)を含む、請求項12または13に記載の方法。
(i)多能性幹細胞を、FGF(Fibroblast growth factor)2、BMP(Bone morphogenetic protein)4、GSK(Glycogen synthase kinase)-3β阻害剤およびレチノイン酸またはそ
の誘導体を含む培地で培養する工程;
(ii)工程(i)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤およびBMP7を含む培地で培
養する工程;
(iii)工程(ii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7およびTGF(Transforming growth factor)β阻害剤を含む培地で培養する工程;
(iv)工程(iii)で得られた細胞を、FGF2、GSK-3β阻害剤、BMP7、アクチビンお
よびROCK(Rho-kinase)阻害剤を含む培地で培養する工程;
(v)工程(iv)で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびFGF9を含む培地で培養する工程;および
(vi)工程(v)で得られた細胞を、GSK-3β阻害剤およびFGF9を含む培地で培養する
工程。 - 請求項12~14のいずれか一項に記載の方法により腎前駆細胞を誘導する工程、および得られた腎前駆細胞を培養し、腎オルガノイドを形成させる工程を含む、腎オルガノイドの製造方法。
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