WO2022149616A1 - ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 - Google Patents

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 Download PDF

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義史 小林
誠 兩坂
啓 辻本
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リジェネフロ株式会社
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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells, a method for expanding and culturing nephron progenitor cells, and a method for producing renal organoids.
  • kidney transplantation is one of the radical treatments for chronic kidney disease including end-stage chronic renal failure, but the supply has not caught up with the demand due to a serious shortage of donor organs.
  • the kidney is derived from the intermediate mesoderm, which is a tissue in the early embryonic period. In vertebrates, the intermediate mesoderm forms three kidneys, the anterior kidney, the middle kidney, and the posterior kidney, and in mammals, the posterior kidney becomes the adult kidney.
  • the posterior kidney is a tissue that will differentiate into the nephron of the adult kidney called the mesenchymal and the interstitial space, and a tissue that will differentiate into the lower renal pelvis, ureter, and part of the bladder from the collecting duct of the adult kidney called the ureteral bud. It occurs through the interaction of two tissues.
  • NPCs nephron progenitor cells
  • Non-Patent Document 3 includes BMP7, fibroblast growth factor (FGF) 2, heparin, Y-27632, CHIR99021, leukemia inhibitory factor (LIF), A83-01, LDN193189. It has been reported that mNPC was grown over a year using the containing medium (NPSR medium).
  • FGF fibroblast growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • nephron progenitor cells In order to utilize the expanded cultured nephron progenitor cells for regenerative medicine, etc., it is necessary to maintain the properties of the expanded culture as nephron precursor cells such as differentiation potential. Therefore, it is desired to develop a culture method capable of efficiently expanding and culturing nephron progenitor cells while maintaining the properties of nephron progenitor cells.
  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of expanding and culturing Neflon progenitor cells while maintaining differentiation potential, a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells using the medium, and the expansion. It is an object of the present invention to provide a method for producing a kidney organoid from Neflon progenitor cells obtained by a culture method.
  • a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells which comprises a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least one fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20.
  • the JAK2 inhibitor is TG101348.
  • the medium according to any one of [1] to [4], wherein the GSK-3 ⁇ inhibitor is CHIR99021.
  • a method for expanding and culturing nephron progenitor cells which comprises the step of culturing nephron progenitor cells in the medium according to any one of [1] to [10].
  • Neflon precursor cell obtained by a method comprising the following steps (i) to (vi): (I) A step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing FGF2, BMP4, GSK-3 ⁇ inhibitor and retinoic acid or a derivative thereof; (ii) The cells obtained in the above step (i) are FGF2, GSK.
  • Step of culturing in a medium containing -3 ⁇ inhibitor and BMP7 (iii) The cells obtained in the above step (ii) are cultivated in a medium containing GSK-3 ⁇ inhibitor, BMP7 and TGF ⁇ inhibitor and not containing FGF2. Culturing step; (iv) The step of culturing the cells obtained in the above step (iii) in a medium containing FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor, actibin and ROCK inhibitor; (v) Obtaining in the above step (iv).
  • [21] Enlarge the nephron progenitor cell according to [19] or [20], wherein at least one of the steps (i) to (vi) is performed using a culture vessel having a cell adhesion surface of 400 cm 2 or more. How to incubate. [22] The step of expanding and culturing the Neflon progenitor cells by the method of expanding and culturing the Neflon progenitor cells according to any one of [11] to [21] and the differentiation of the expanded Neflon progenitor cells into renal organoids. And how to make kidney organoids, including.
  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of expanding and culturing Neflon progenitor cells while maintaining differentiation ability, a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells using the medium, and the above-mentioned expanding culture method. It has the effect of being able to provide a method for producing renal organoids from the Neflon progenitor cells obtained in.
  • hNPC The results of subculturing hNPC (Bulk) using hNPSR medium (see Table 1) or CFY medium (see Table 2) and confirming the expression of SIX2 and OSR1 in each subculture are shown.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • results of an attempt to prepare a renal organoid from hNPC (Bulk) subcultured using hNPSR medium or CFY medium are shown.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • the results of subculturing hNPC (Bulk) using hNPSR medium or CFY medium supplemented with DMSO, measuring the number of cells, and calculating the cumulative number of cells are shown.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • Kidney organoids were subcultured from hNPC (Bulk) using CFY medium supplemented with DMSO (CFY + DMSO) or CFY medium supplemented with 3 nM TG101348 (CFY + TG (3)). The result of the attempt to make the above is shown.
  • HNPC HNPC (c-MET (+)) was cultured in CFY medium supplemented with DMSO (CFY + DMSO) or CFY medium supplemented with 3 nM TG101348 (CFY + TG (3)), and in each passage.
  • the result of measuring the cell number and calculating the cumulative cell number is shown.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • Subculture of hNPC (c-MET (+)) was performed using a medium (CFY + DMSO) in which DMSO was added to the CFY medium or a medium (CFY + TG (3)) in which 3 nM TG101348 was added to the CFY medium, and each subculture was performed.
  • the results of confirming the expression of SIX2 and OSR1 are shown in the above.
  • the hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • Subculture of hNPC was performed using a medium in which DMSO was added to the CFY medium (CFY + DMSO) or a medium in which 3 nM TG101348 was added to the CFY medium (CFY + TG (3)).
  • a medium in which DMSO was added to the CFY medium CFY + DMSO
  • urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (S-Cre) are shown.
  • "normal” indicates a normal mouse
  • "raw food” indicates an AKI mouse to which physiological saline was administered under the renal capsule
  • “NPC transplantation” indicates an AKI mouse transplanted with hNPC (Bulk).
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • immunodeficient mice that developed acute kidney injury (AKI) by administration of cisplatin a cell mass of hNPC (Bulk) that was bipassed in CFY medium was transplanted under the renal capsule, and urea nitrogen (BUN) in the blood was transplanted.
  • AKI acute kidney injury
  • the induction from hiPSC to hNPC by the differentiation induction method B the result of confirming the differentiation induction efficiency of SIX2-positive cells when the FGF2 concentration is changed in step 3 (preparation of the late primitive streak of the mesoderm lineage) is shown.
  • the differentiation induction efficiency of SIX2-positive cells was confirmed in step 5 (preparation of late posterior intermediate mesoderm) when the FGF9 concentration was changed and when heparin was added. The results are shown.
  • the additive of the basal medium was changed from B27 (B27 Supplement (50 ⁇ ).
  • Minus vitamin A, Invitrogen to AS401 (StemFit (registered trademark) for Difference, Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.) ) Is shown, and the result of confirming the differentiation-inducing efficiency of SIX2-positive cells is shown.
  • Basic medium hereinafter, when the medium is described as having 10% AS401 added, it refers to a medium containing 10% by volume of AS401 with respect to the entire volume of the medium. The same applies to the medium to which 20% AS401 is added.
  • differentiation induction method C (Small)
  • the method for inducing differentiation in Large scale is also referred to as “differentiation induction method C (Large)”.
  • DMEM / F12 Glutamax (Thermo Fisher Scientific Inc.) supplemented with 10% AS401 was used as the basal medium.
  • the fluorescence image which confirmed the SIX2 expression of hNPC derived from the HLA homostock hiPSC (Ff14s04) strain by the differentiation induction method C (Small) by immunostaining is shown.
  • stage6 of hNPC induced by differentiation induction method C (Small) or differentiation induction method C (Large) in day2 and expression of SIX2, and morphological photographs of day7 after expansion culture are shown.
  • the cell yield of hNPC induced to differentiate by the differentiation induction method C (Large) is shown.
  • the fluorescence image which confirmed the SIX2 expression of the differentiation-induced hNPC by the differentiation-inducing method C (Large) by immunostaining is shown.
  • a morphological photograph of hNPC being expanded and cultured in a different medium of an additive (B27 or AS401) is shown.
  • the scale bar is 300 ⁇ m.
  • AS 10% Modified CFY medium to which 10% AS401 was added instead of B27 (hereinafter, also referred to as "CFY medium (-B27, + 10% AS401)”); AS 20%: 20% AS401 was added instead of B27.
  • Modified CFY medium hereinafter, also referred to as "CFY medium (-B27, + 20% AS401)”
  • B27 CPHY medium. The growth rate of hNPC expanded and cultured in different media of the additive (B27 or AS401) is shown.
  • AS10% CPHY medium (-B27, + 10% AS401); AS20%: CPHY medium (-B27, + 20% AS401); B27: CHY medium.
  • B27 Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in CFY medium
  • AS10 Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in CFY medium (-B27, + 10% AS401)
  • AS20 CFY medium (-B27, + 20% AS401)
  • Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in Ctl No transplantation.
  • B27 Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in CFY medium
  • AS10 Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in CFY medium (-B27, + 10% AS401)
  • AS20 CFY medium (-B27, + 20% AS401)
  • Transplanted hNPC cell mass expanded and cultured in Ctl No transplantation.
  • B27 CPHY medium
  • AS10 CPHY medium (-B27, + 10% AS401).
  • the expression of the NPC marker of hNPC expanded and cultured using the FGF9 of the CFY medium changed to FGF2 (hereinafter, also referred to as "CFY medium (-FGF9, + FGF2)") or the CPHY medium is shown.
  • FGF9 FGF9, + FGF2
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A (differentiation induction method described in International Publication No. 2018/216743) was used.
  • hNPC The results of observing the renal organoids induced to differentiate from hNPC with an optical microscope are shown.
  • hNPC was expanded and cultured using CFY medium (-FGF9, + FGF2) or CFY medium.
  • CFY medium -FGF9, + FGF2
  • CFY medium As the hNPC, one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • the results of FACS analysis of cells for each passage are shown when the passage method of exchanging the medium with CF medium (medium obtained by removing Y-27632 from CFY medium) 2 days after passage was repeated for 3 passages.
  • P1 1 passaged cells
  • P2 2 passaged cells
  • P3 3 passaged cells.
  • the hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • NPC markers (OSR1 (+) SIX2 (+), OSR1 (OSR1 (+) SIX2 (+), OSR1 +) Indicates the number of SIX2 (-), c-MET (+)) positive cells and the total number of cells.
  • hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • the expression of the NPC marker is shown in the case of two passages by the passage method of exchanging the medium with CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY) two days after the passage.
  • CF medium CFY ⁇ CF
  • CFY ⁇ CFY CFY medium
  • the results of observing the renal organoids induced to differentiate from hNPC with an optical microscope are shown.
  • the hNPC one passaged by a passage method in which the medium was exchanged with CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY) 2 days after the passage was used.
  • the hNPC one induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method A was used.
  • the first aspect of the present invention is a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells.
  • the medium of this embodiment contains a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20.
  • the medium of this embodiment further comprises a JAK inhibitor.
  • NPCs are cells that can differentiate into organ structures such as glomerular and tubular structures of the kidney in vitro. The ability of nephron progenitor cells to differentiate into organ structures is described, for example, in Osafune K, et al. (2006), it can be evaluated by the method described in Development 133: 151-61. SIX2 is known as a characteristic factor for maintaining the state as a nephron progenitor cell (Cell Stem Cell 3: 169-181 (2008)), and as an example of a nephron progenitor cell cultured by the method of this embodiment. , SIX2-positive nephron progenitor cells.
  • pluripotent stem cells having a reporter gene eg, tdTomato
  • a reporter gene eg, tdTomato
  • the SIX2 promoter eg, OSR1-GFP / SIX2-tdTomato reporter human iPS cells described in Examples below
  • SIX2-positive Neflon precursor cells can be isolated by a method known in the art (for example, a method using a cell sorter) using the expression of SIX2-positive as an index. It is also possible to confirm the expression of SIX2 in nephron progenitor cells by a method for analyzing gene expression such as quantitative RT-PCR (NatCommun 4,1367, (2013)).
  • SIX2-positive nephron progenitor cells include cells expressing the SIX2 protein and cells expressing the protein encoded by the gene under the control of the SIX2 promoter.
  • the human SIX2 gene (NCBI Gene ID: 10736) is a gene having a nucleotide sequence registered at NCBI accession number: NM_016932.5
  • the mouse SIX2 gene (NCBI Gene ID: 20472) is the NCBI accession number. : Examples include, but are not limited to, genes having a nucleotide sequence registered in NM_011380.2.
  • the nephron progenitor cells cultured in the medium of this embodiment are preferably OSR1 positive and HOX11, WT1, SIX2 and SALL1 positive.
  • the organism from which the nephron progenitor cells are derived is not particularly limited, and may be any animal having a kidney.
  • the nephron progenitor cells are preferably of mammalian origin, more preferably of human origin. That is, human nephron progenitor cells are preferred.
  • Neflon progenitor cells may be those isolated from the posterior renal mesenchyme of a living body or those induced to differentiate from pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.).
  • the nephron progenitor cells to be expanded and cultured in the medium of this embodiment are preferably derived from pluripotent stem cells, and more preferably derived from iPS cells.
  • Induction of differentiation of nephron progenitor cells from pluripotent stem cells can be performed by a known method.
  • Examples of the method for inducing nephron progenitor cells from pluripotent stem cells include the methods described in International Publication No. 2014/200115, International Publication No. 2017/0436666, International Publication No. 2018/216743 and the like.
  • Neflon progenitor cells Isolation of Neflon progenitor cells from a cell population collected from the posterior mesenchyme or a cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells is described, for example, in OSR1, HOX11, WT1, SIX2, which are markers of the Neflon progenitor cells described above.
  • OSR1, HOX11, WT1, SIX2 markers of the Neflon progenitor cells described above.
  • the expression of SALL1 can be used as an index.
  • expression of c-MET or AGTR2 can be used as an index (International Publication No. 2020/022261).
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured in the medium of this embodiment may be provided as a cell population containing other cell types, or may be provided as a cell population of purified nephron progenitor cells.
  • the ratio of the number of nephron progenitor cells is 30%, 40% or more, 50% or more, 60% or more with respect to the total number of cells (100%). , 70% or more, 80% or more, or 90% or more is preferable.
  • “Expanded culture” means a culture in which nephron progenitor cells are proliferated while maintaining the properties of the nephron progenitor cells. That is, the expanded-cultured nephron progenitor cells can be differentiated into organ structures such as glomerular-like structure and tubular structure of the kidney in vitro. In the medium of this embodiment, the nephron progenitor cells can be expanded and cultured while maintaining the properties of the nephron progenitor cells even after repeated passages.
  • the medium of this embodiment may be a medium obtained by adding a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20 to the basal medium used for animal culture. ..
  • a JAK inhibitor was added to the basal medium used for animal culture in addition to a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20. There may be.
  • the basal medium is not particularly limited, and those usually used for animal culture can be used without particular limitation.
  • Examples of the basal medium include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Medium Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulvecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12), and Ham's F12 (F12).
  • Examples include, but are not limited to, a medium, Fisher's medium, and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferase, KnockOut Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, for example.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acids insulin, collagen precursors
  • Trace elements 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol and the like may contain one or more serum substitutes.
  • the basal medium may be, for example, a mixed medium of DMEM / F12 medium (for example, a mixed medium in which DMEM: F12 is mixed at a ratio of 1: 1) to which amino acids, non-essential amino acids, serum substitutes and the like are added. ..
  • the basal medium preferably contains 10% by volume of AS401 with respect to the total volume of the basal medium.
  • a medium containing 10% by volume AS401 with respect to the entire volume of the medium may be described as a medium containing 10% AS401.
  • 10% AS401 may be added to a mixed medium of DMEM / F12 medium.
  • the basal medium for example, 10% AS401 and GlutaMAX-I (Invitrogen) may be added to a mixed medium of DMEM / F12 medium.
  • DMEM / F12 Glutamax (Thermo Fisher Scientific Inc.) may be used as the medium obtained by adding GlutaMAX to the mixed medium of DMEM / F12 medium.
  • the basal medium may be DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% AS401.
  • the medium of this embodiment contains a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least one fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20.
  • the medium of this embodiment contains a GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the function of GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 ⁇ , for example, the kinase activity (for example, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitor include BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoinsylbin 3'-oxym), which is an indylbin derivative, and SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl)-), which is a maleimide derivative.
  • GSK3 ⁇ Peptide Inhibitor Myr-N-GKEAPAPPQSpP-NH2
  • CHIR99021 (6- [2- [2- [4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin) -2-Ilamino] ethylamino] pyridine-3-carbonitrile), and derivatives thereof and the like.
  • These compounds can be obtained from, for example, Stemgent, Calbiochem, Biomol, etc., or may be prepared by themselves.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor may be an antisense nucleic acid against GSK-3 ⁇ , an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of GSK3 ⁇ in the medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 3 ⁇ M, and particularly. It is preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M.
  • the medium of this embodiment contains a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor is a substance that inhibits the function of Rho-kinase (ROCK).
  • Examples of the ROCK inhibitor include Y-27632 (see, eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)).
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenta et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • H-1152 eg, Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • Wf-536 see, eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003)
  • their derivatives as well as antisense nucleic acids for ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA).
  • RNA interference-inducing nucleic acids eg, siRNA
  • Dominant negative variants and their expression vectors.
  • other known low molecular weight compounds can also be used as the ROCK inhibitor (for example, US Patent Application Publication No. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, 2004/0002508). , 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and International Publication No. 2003/062227, 2003/059913, 2003/0622225, 2002/076976. No. 2004/039796).
  • the ROCK inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • Preferred ROCK inhibitors include Y-27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is, for example, 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 75 ⁇ M, and more preferably 5 to 50 ⁇ M.
  • the medium of this embodiment contains at least one fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20.
  • the medium of this embodiment may contain Fibroblast Growth Factor (FGF) 9.
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • the organism from which FGF9 is derived is not particularly limited.
  • FGF9 for example, human FGF9 can be used.
  • human FGF9 NCBI Gene ID: 22544
  • FGF9 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • FGF20 belongs to the same subfamily as FGF9 and shows an action overlapping with the action of FGF9 in the developing kidney of mice (Barak, H. et al. FGF9 and FGF20 Maintain the Stemness of Nephron Progenitors in Machine. From Dev. Cell 22, 1191-1207 (2012).), It is considered that FGF9 can be replaced.
  • the concentration of FGF9 in the medium is, for example, 1 to 800 ng / ml, preferably 5 to 500 ng / ml, more preferably 10 to 400 ng / ml, and further preferably 100 to 300 ng / ml.
  • the medium of this embodiment may contain FGF20 in place of or with FGF9.
  • FGF20 and FGF9 are known to act similarly during renal development and are interchangeable.
  • the organism from which FGF20 is derived is not particularly limited.
  • a human FGF20 can be used.
  • Examples of the human FGF20 include a protein having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_062825.1.
  • FGF20 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of FGF20 in the medium is, for example, 1 to 800 ng / ml, preferably 5 to 500 ng / ml, more preferably 10 to 400 ng / ml, and further preferably 100 to 300 ng / ml.
  • the medium of this embodiment may contain any one of FGF9 and FGF20, or may contain both.
  • the total concentration of FGF9 and FGF20 may be, for example, 1 to 800 ng / ml, preferably 5 to 500 ng / ml, more preferably 10 to 10 to It is 400 ng / ml, more preferably 100 to 300 ng / ml.
  • the medium of this embodiment may contain other components in addition to the above components.
  • Other components include, for example, JAK inhibitors.
  • the medium of this embodiment may contain a JAK inhibitor.
  • a JAK inhibitor is a substance that inhibits the activity of one or more enzymes of the Janus kinase family (eg, JAK1, JAK2, JAK3, TYK2). JAK inhibitors inhibit signal transduction of the JAK-STAT system by inhibiting the enzymatic activity of the Janus kinase family.
  • the medium contains a JAK inhibitor in addition to at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and a FGF9 inhibitor and a FGF20, the proliferation of nephron progenitor cells can be promoted. More promoted.
  • the JAK inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of enzymes of the Janus kinase family.
  • the JAK inhibitor is preferably one that inhibits the enzyme activity of at least one selected from the group consisting of JAK1, JAK2, and JAK3, and more preferably one that inhibits the enzyme activity of JAK2 (JAK2 inhibitor).
  • the JAK3 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK3.
  • Examples of the JAK3 inhibitor include TCS21311 (CAS number 1260181-14-3), WHI-P154 (CAS 211555-04-3), PF-06651600 (CAS number 1792180-81-4), FM-381 (CAS number). 2226521-65-7), CP690550 (CAS No.
  • JAK3 INHIBITOR IV (CAS number 58753-54-1), ZM449829 (CAS number 4452-06-6), AZD1480 (CAS number 935666-88-9) ), Selective JAK3 inhibitor 1 (CAS No. 14432235-95-7), and derivatives thereof, but are not limited thereto.
  • TCS21311 is preferable as the JAK3 inhibitor.
  • the JAK2 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK2.
  • Examples of the JAK2 inhibitor include NVP-BSK805 2HCl (CAS No. 1949219-79-0), TG101209 (CAS No. 936091-14-4), TG101348 (CAS No. 936091-26-8), 1, 2, 3, and so on. 4,5,6-hexabromocyclohexane (CAS No. 1837-91-8), CEP-337779 (CAS No. 1257704-57-6), NSC33994 (CAS No. 82058-16-0), and derivatives thereof.
  • TG101348 is preferable as the JAK2 inhibitor.
  • the JAK inhibitor may be a JAK2 / 3 inhibitor.
  • a JAK2 / 3 inhibitor is an inhibitor that inhibits JAK2 and JAK3.
  • Examples of the JAK2 / 3 inhibitor include AG490 (CAS No. 133550-30-8), AT9283 (CAS No. 896466-04-9), LY3009104 (CAS No. 1187594-09-7), and derivatives thereof. However, but not limited to these.
  • the JAK inhibitor may be a JAK1 / 2 inhibitor.
  • JAK1 / 2 inhibitors are inhibitors that inhibit JAK1 and JAK2.
  • Examples of JAK1 / 2 inhibitors include CYT387 (CAS No. 1056634-68-4), S-Ruxolitinib (INCB018424) (CAS No. 941685-37-6), and LY2784544 (CAS No. 1229236-86-5), and Examples thereof include, but are not limited to, these derivatives.
  • JAK inhibitors are not limited to low molecular weight compounds as described above, but are antisense nucleic acids for the Janus kinase family (JAK1, JAK2, JAK3, TYK2), RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, etc. And their expression vectors and the like.
  • the JAK inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • a JAK2 inhibitor is preferable, and TG101348 is more preferable.
  • the concentration of the JAK inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected according to the type of the JAK inhibitor.
  • the JAK inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the JAK inhibitor can be used, for example, at a concentration of 0.01 nM or more, 0.05 nM or more, 0.1 nM or more, 0.5 nM or more, or 1 nM or more.
  • Examples of the upper limit of the concentration of the JAK inhibitor include 100 nM or less, 50 nM or less, 30 nM or less, 20 nM or less, 10 nM or less, 5 nM or less, and the like.
  • the concentration of TG101348 in the medium may be, for example, 0.5 to 50 nM, 1 to 30 nM, 1 to 20 nM, 1 to 10 nM, or 1 to 5 nM.
  • the medium of this embodiment can contain components other than the above as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the medium of this embodiment preferably does not contain signal transduction inhibitors, enzyme inhibitors, cytokines, growth factors and the like other than the above.
  • the medium of this embodiment comprises a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20.
  • the medium comprises a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, a FGF9, and a JAK inhibitor.
  • the medium comprises a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, a FGF9, and a JAK2 inhibitor.
  • the medium of this embodiment comprises CHIR99021, Y-27632, and FGF9.
  • the medium of this embodiment comprises CHIR99021, Y-27632, FGF9, and TG101348. The FGF9 may be replaced with FGF20.
  • the medium of this embodiment contains a combination of a GSK-3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and at least a fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20, thereby maintaining the differentiation potential of nephron progenitor cells. , Can proliferate nephron progenitor cells well.
  • the medium of this embodiment contains a JAK inhibitor in addition to the above-mentioned components, so that the proliferation of nephron progenitor cells becomes better.
  • the medium of this embodiment is a medium for subculture of nephron progenitor cells. It can also be said that the medium of this embodiment is a maintenance medium for nephron progenitor cells.
  • a second aspect of the present invention is a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells, which comprises a step of culturing Neflon progenitor cells in the medium of the first aspect.
  • nephron progenitor cells to be cultured by the method of this embodiment include the same as those mentioned in the section (Neflon progenitor cells: NPC) of the above ⁇ medium for expanding and culturing nephron progenitor cells>.
  • the nephron progenitor cells are preferably human nephron progenitor cells.
  • the nephron progenitor cells are preferably derived from pluripotent stem cells, and more preferably derived from iPS cells.
  • the nephron progenitor cell is a nephron progenitor cell derived from a human iPS cell.
  • Nephron progenitor cells can be cultured under the culture conditions normally used for culturing animal cells.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the nephron progenitor cells can proliferate, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • Nephron progenitor cells can usually be cultured in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. Specific examples of the CO 2 concentration include about 5%.
  • the culture may be adhesive culture or suspension culture, but suspension culture is preferable.
  • the culture period is not particularly limited and can be any period.
  • by using the medium of the first aspect it is possible to culture for a long period of time while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • the culture of the nephron progenitor cells can be continued while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • Subculture can be performed by collecting a cell mass of nephron progenitor cells from the culture medium and seeding the cells in a new medium.
  • a cell dispersion containing an enzyme such as protease, collagenase, and DNase may be used to disperse the cell mass and then seeded in a new medium.
  • the interval between passages is not particularly limited, but may be, for example, about 2 to 10 days, or about 3 to 7 days.
  • the method of this embodiment comprises subculturing nephron progenitor cells.
  • the method for expanding and culturing nephron progenitor cells may include the following steps (A) and (B).
  • the nephron progenitor cells are cultured in the medium of the first aspect for 30 to 60 hours.
  • the culture time in the medium of the first aspect may be about 2 days. Examples of the culture time in the medium of the first aspect include 35 to 55 hours, 40 to 50 hours, and the like.
  • the culture time is the time from the time when the nephron progenitor cells are seeded in the medium of the first aspect.
  • the cells obtained in step (A) contain a GSK-3 ⁇ inhibitor and at least one fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20, and a ROCK inhibitor.
  • a medium that does not contain hereinafter referred to as "ROCK inhibitor-free medium”.
  • the medium used in the step (B) include a medium obtained by removing the ROCK inhibitor from the medium of the first aspect.
  • the culture in the step (B) can be started by exchanging the medium in the culture in the step (A) with a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium may be exchanged at intervals of about once every two days.
  • the medium used for the medium exchange can be a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium exchange in the step (B) can be performed 1 to 5 times, 2 to 4 times, 2 times, or 3 times. Since the medium used in the step (B) does not contain a ROCK inhibitor, it can be carried out at a lower cost as compared with the case of using a medium containing a ROCK inhibitor.
  • the method of this embodiment may further include the following step (C) after the step (B).
  • step (C) A step of subculturing the cells obtained in step (B) into the medium of the first aspect.
  • the method of this embodiment may further include the following steps (D) and (E) after the step (C).
  • (D) The step of culturing the cells passaged in the step (C) in the medium of the first aspect for 30 to 60 hours; and (E) Inhibiting the cells obtained in the step (D) with GSK-3 ⁇ .
  • the medium subcultured in the step (C) can be cultured as it is for 30 to 60 hours.
  • the culture time in the step (D) may be about 2 days. Examples of the culture time in the step (D) include 35 to 55 hours, 40 to 50 hours, and the like.
  • the culture time is the time from the time when the nephron progenitor cells are subcultured.
  • the cells obtained in the step (D) are cultured in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the same ROCK inhibitor-free medium as in the step (B) can be used.
  • the culture in the step (E) can be carried out in the same manner as in the step (B).
  • the nephron progenitor cells used in the method of this embodiment may be those derived from pluripotent stem cells (for example, iPS cells).
  • the nephron progenitor cell may be obtained by, for example, the differentiation induction method described in International Publication No. 2018/216743.
  • the nephron progenitor cells used in the method of this embodiment may be obtained by, for example, a method including the following steps (i) to (vi).
  • Iii) A step of culturing the cells obtained in the above step (ii) in a medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor, BMP7 and TGF ⁇ inhibitor, and not containing FGF2;
  • Late posterior epiblasts are characterized as cells that are positive for at least one or more markers of CDX1, OCT4, NANOG, E-CADHERIN (CDH1), preferably all of these markers. .. Late posterior epiblasts are further preferably negative for EOMES and BRACHYURY.
  • pluripotent stem cells are separated by any method known in the art and preferably cultured by adhesive culture.
  • Methods for separating pluripotent stem cells include, for example, mechanical separation or separation solutions having protease activity and collagenase activity (eg, Accutase (TM) and Accumax (TM) (Innovative Cell Technologies, Inc)).
  • separation using a separation solution having only collagenase activity can be mentioned.
  • a method of dissociating using a separation solution having protease activity and collagenase activity and mechanically finely dispersing the cells into a single cell is preferable.
  • the human pluripotent stem cells used in step (i) it is preferable to use colonies cultured to 70% to 80% confluence with respect to the dish used.
  • the medium used in step (i) can be prepared by adding FGF2, BMP4, GSK-3 ⁇ inhibitor and retinoic acid or a derivative thereof to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the medium used in step (i) may contain a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor can be added to the basal medium in addition to the above components to prepare the medium used in step (i).
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • ROCK inhibitors include Y-27632.
  • concentration of the ROCK inhibitor used in the step (i) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used.
  • concentration of the ROCK inhibitor is, for example, 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 75 ⁇ M, and more preferably 5 to 50 ⁇ M.
  • GSK-3 ⁇ inhibitor As the GSK-3 ⁇ inhibitor, the same ones as described above can be used.
  • Preferred GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in step (i) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the GSK-3 ⁇ inhibitor used.
  • the GSK-3 ⁇ inhibitor is CHIR99021
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, and more preferably 0.5 to 3 ⁇ M. It is particularly preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M.
  • FGF2 basic FGF: bFGF
  • human FGF2 is preferable.
  • human FGF2 include a protein having an amino acid sequence of NCBI (National Center for Biotechnology Information) accession number: ABO43041.1. As long as FGF2 has differentiation-inducing activity, fragments and functional variants thereof are included.
  • FGF2 may be commercially available, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. You may.
  • concentration of FGF2 used in this step include, for example, 1 to 1000 ng / ml, preferably 10 to 500 ng / ml, and more preferably 50 to 250 ng / ml.
  • BMP4 is preferably human BMP4.
  • Examples of the human BMP4 include a protein having an amino acid sequence of NCBI (National Center for Biotechnology Information) accession number: AAH20546.1. As long as BMP4 has differentiation-inducing activity, fragments and functional variants thereof are included.
  • BMP4 may be commercially available, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. You may.
  • concentration of BMP4 used in this step include 0.1 to 100 ng / ml, preferably 0.5 to 50 ng / ml, and more preferably 0.5 to 5 ng / ml.
  • the retinoin acid may be retinoin acid itself or a retinoic acid derivative that retains the differentiation-inducing function of natural retinoin acid.
  • a retinoic acid derivative for example, 3-dehydroretinoic acid, 4-[[(5,6,7,8-tellahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) carbononyl] amino] -Benzoic acid ( AM580) (Tamura K, et al., Cell Differ. Dev.
  • retinol palmitate examples thereof include retinol palmitate, retinol, retinal, 3-dehydroretinal, 3-dehydroretinal and the like.
  • concentration of retinoic acid or a derivative thereof used in the step (i) is, for example, 1 to 100 nM, preferably 5 to 50 nM, and more preferably 5 to 25 nM.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time in step (i) may be a period sufficient for the late posterior epiblast to be induced to differentiate, but is, for example, 1 to 2 days of culture, preferably 1 day.
  • the mesoderm lineage primitive streak is derived from the late posterior epiblast.
  • the mesoderm lineage primitive streak is characterized as cells positive for CDX1 and BRACHYURY.
  • the mesoderm lineage primitive streak is further preferably negative for OCT4, NANOG and CDH1.
  • the cell population obtained in the above-mentioned step (i) may be isolated and adherently cultured in a separately prepared coated culture vessel, or may be obtained by adhesive culture in the step (i).
  • the cells may be cultured as they are by exchanging the medium.
  • the medium used in step (ii) can be prepared by adding FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor and BMP7 to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • FGF2 As FGF2, the same as above can be used.
  • concentration of FGF2 used in the step (ii) include the same as those mentioned in the step (i).
  • GSK-3 ⁇ inhibitor As the GSK-3 ⁇ inhibitor, the same ones as described above can be used.
  • Preferred GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (ii) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the GSK-3 ⁇ inhibitor used, and examples thereof include 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.01 to 100 ⁇ M. It is 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to 7.5 ⁇ M, and particularly preferably 2 to 5 ⁇ M.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (ii) is preferably higher than the concentration in the step (i).
  • human BMP7 is preferable.
  • the human BMP7 include a protein having an amino acid sequence of NCBI (National Center for Biotechnology Information) accession number: NM_001719.2.
  • BMP7 includes fragments and functional variants thereof as long as it has differentiation-inducing activity.
  • BMP7 a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • concentration of BMP7 used in the step (ii) include 0.1 to 100 ng / ml, preferably 0.5 to 50 ng / ml, and more preferably 0.5 to 5 ng / ml. ..
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (ii) may be a period sufficient for the mesoderm lineage primitive streak to be induced to differentiate, but is, for example, 10 hours to 2 days, or 1 to 2 days, preferably. 0.5 to 1 day.
  • the mesoderm lineage late primitive streak is derived from the mesoderm lineage primitive streak.
  • the late primitive streak of the mesoderm lineage is characterized as cells positive for CDX2 and BRACHYURY.
  • the cell population obtained in the above-mentioned step (ii) may be isolated and adherently cultured in a separately prepared coated culture vessel, or obtained by adhesive culture in the step (ii).
  • the cells may be cultured as they are by exchanging the medium.
  • the medium used in the step (iii) can be prepared by adding a GSK-3 ⁇ inhibitor, a BMP7 and a TGF ⁇ inhibitor to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (iii) can be the same as in the step (iii).
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor includes, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to 7.5 ⁇ M, and particularly preferably 2 to 5 ⁇ M. ..
  • the same BMP7 as above can be used.
  • the concentration of BMP7 used in the step (iii) can be the same as that in the step (iii).
  • a TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD.
  • the TGF ⁇ inhibitor include a substance that inhibits binding to the ALK family, which is a TGF ⁇ receptor, or a substance that inhibits the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • NM_010094, Human: NM_020997 as an example SB431542, SB202190 (above, RK Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20), SB505124 (GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093.
  • the TGF ⁇ inhibitor can preferably be A83-01.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor used in the step (iii) is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits ALK.
  • the concentration of the TGF ⁇ inhibitor is, for example, 0.5 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 50 ⁇ M, and more preferably 5 to 25 ⁇ M.
  • the medium used in the step (iii) does not contain FGF2. Since the late primitive streak of the mesoderm lineage is induced even if FGF2 is not contained, it can be carried out at a lower cost than the method using a medium containing FGF2.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (iii) may be a period sufficient for inducing differentiation of the late mesoderm lineage primitive streak, but is, for example, 1 to 3 days, preferably 1 to 2 days.
  • Step (iv) the late primitive streak of the mesoderm lineage is derived from the late primitive streak of the posterior renal lineage.
  • the late primordial streak of the posterior renal lineage is characterized as cells positive for HOX11 and BRACHYURY.
  • the cell population obtained in the above-mentioned step (iii) may be isolated and adherently cultured in a separately prepared coated culture vessel, or obtained by adhesive culture in the step (iii).
  • the cells may be cultured as they are by exchanging the medium.
  • the medium used in the step (iv) can be prepared by adding FGF2, GSK-3 ⁇ inhibitor, activin and ROCK inhibitor to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • the concentration range of the FGF2 and GSK-3 ⁇ inhibitors used in the step (iv) can be the same as in the step (ii).
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor used in the step (iv) is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 1 to 7.5 ⁇ M, and particularly. It is preferably 2 to 5 ⁇ M.
  • Examples of the concentration of FGF2 used in the step (iv) include, for example, 1 ng / ml to 1000 ng / ml, preferably 30 ng / ml or more, and more preferably 30 to 100 ng / ml.
  • the activin may be a human-derived activin, another animal-derived activin, or a functional variant of these activins.
  • the activin may be activin A, activin B, or activin AB.
  • As the activin for example, a commercially available product such as R & D systems can be used.
  • Preferred activin includes activin A.
  • concentration of activin used in the step (iv) include, for example, 1 to 100 ng / ml, preferably 5 to 50 ng / ml, and more preferably 5 to 25 ng / ml.
  • ROCK inhibitors include Y-27632.
  • concentration of the ROCK inhibitor used in the step (iv) can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the ROCK inhibitor used.
  • concentration of the ROCK inhibitor is, for example, 0.1 to 100 ⁇ M, preferably 1 to 75 ⁇ M, and more preferably 5 to 50 ⁇ M when the ROCK inhibitor is Y-27632.
  • the medium used in the step (iv) may not contain BMP7. By using a medium containing no BMP7, the step (iv) can be carried out at a lower cost.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (iv) may be a period sufficient for the late renal lineage primitive streak to be induced to differentiate, but is, for example, 1 to 5 days of culture, preferably 3 days.
  • Step (v) the late posterior intermediate mesoderm is derived from the anaphase primitive streak.
  • Intermediate mesophyll is characterized as cells positive for OSR1, HOX11 and WT1.
  • the cell population obtained in the above-mentioned step (iv) may be isolated and adherently cultured in a separately prepared coated culture vessel, or may be obtained by adhesive culture in the step (iv).
  • the cells may be cultured as they are by exchanging the medium.
  • the medium used in step (v) can be prepared by adding retinoic acid or a derivative thereof to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the medium used in step (v) may contain a BMP inhibitor.
  • a BMP inhibitor can be added to the basal medium in addition to the above components to prepare the medium used in step (v).
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • a BMP inhibitor is a substance that inhibits the function of BMP.
  • the BMP inhibitor include proteinaceous inhibitors such as Chordin, NOGGIN, and Follistatin, and Dorsomorphin (that is, 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-. Pyrazolo [1,5-a] pyrimidine), its derivatives (P.B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P. B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol. , 4: 33-41; J. Hao et al.
  • BMP inhibitors include NOGGIN.
  • concentration of the BMP inhibitor used in the step (v) is preferably 1 to 100 ng / ml when the BMP inhibitor is NOGGIN. It is 10 to 50 ng / ml.
  • the medium used in step (v) does not contain FGF9. Since the late posterior intermediate mesoderm is induced even if FGF9 is not contained, it can be carried out at a lower cost than the method using a medium containing FGF9.
  • the medium used in step (v) may not contain FGF20.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • Step (v) The culture time may be a period sufficient for the late posterior intermediate mesoderm to be induced to differentiate, but is, for example, 1 to 3 days of culture, preferably 2 days.
  • Nephron progenitor cells are induced from the late posterior intermediate mesoderm. Nephron progenitor cells are OSR1 positive and HOX11, WT1, SIX2 and SALL1 positive.
  • the cell population obtained in the above-mentioned step (v) may be isolated and adherently cultured in a separately prepared coated culture vessel, or may be obtained by adhesive culture in the step (v).
  • the cells may be cultured as they are by exchanging the medium.
  • a GSK-3 ⁇ inhibitor and at least one fibroblast growth factor selected from the group consisting of FGF9 and FGF20 are added to the basal medium used for culturing animal cells.
  • the medium used in step (vi) may contain heparin.
  • heparin can be added to the basal medium in addition to the above-mentioned components to prepare the medium used in the step (vi).
  • the basal medium the basal medium as described above can be used, and may contain serum or may be serum-free. If necessary, serum substitutes, lipids, amino acids, vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be contained.
  • Heparin is preferably in the form of a salt.
  • heparin salts include salts with alkali metals such as lithium, sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium; salts with metals such as aluminum, zinc, copper and iron; Examples include ammonium salts; salts with organic bases; and salts with amino acids.
  • heparin is preferably an alkali metal salt, more preferably a sodium salt.
  • concentration of heparin used in the step (vi) include 0.01 to 100 ⁇ g / ml, preferably 0.05 to 50 ⁇ g / ml, and more preferably 0.1 to 10 ⁇ g / ml. ..
  • the concentration of the GSK-3 ⁇ inhibitor includes, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 3 ⁇ M, and particularly preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M. Is.
  • concentration of FGF9 or FGF20 include 1 to 500 ng / ml, and 10 to 300 ng / ml and 50 to 200 ng / ml.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Culturing is carried out in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture time of the step (vi) may be a period sufficient for the nephron progenitor cells to be induced to differentiate, but the culture is, for example, 1 to 5 days, preferably 2 days.
  • the basal medium used in the above steps (i) to (vi) the same medium as described in the above ⁇ medium for expanding and culturing nephron progenitor cells> can be used.
  • the basal medium for example, a mixed medium of DMEM / F12 medium supplemented with B27, AS401, GlutaMAX-I (Invitrogen) and the like can be used.
  • Specific examples of the basal medium include a medium in which B27, 10% AS401, or 20% AS401 is added to DMEM / F12 Glutamax, and a medium in which 10% AS401 is added to DMEM / F12 Glutamax is preferable.
  • the culture vessel used in the above steps (i) to (vi) is not particularly limited.
  • the culture vessel include a 24-well plate, a 12-well plate, a petri dish, a culture flask, a bioreactor, a cell culture bag, and the like.
  • the culture vessel it is preferable to use a culture vessel capable of adhesive culture.
  • the area of the cell adhesion surface (for example, the bottom surface of the culture vessel) of the culture vessel include 1 to 1000 cm 2 .
  • a culture vessel having a cell adhesion surface of 400 cm 2 or more may be used.
  • the area of the cell adhesion surface of the culture vessel include 400 to 800 cm 2 , 400 to 700 cm 2 , 400 to 600 cm 2 , and the like.
  • the nephron progenitor cells can be induced to differentiate even by using a large-capacity culture vessel as described above.
  • a large-capacity culture vessel By using a large-capacity culture vessel, the cell yield of nephron progenitor cells can be increased.
  • the culture vessel may be changed at the timing of medium replacement or the timing of cell seeding.
  • a medium-capacity culture vessel for example, cell adhesion surface 50 to 200 cm 2
  • a large-capacity culture vessel (cell adhesion surface 400 cm) is used. 2 or more) may be used.
  • Adhesive culture means that cells are cultured in a state of being adhered to a culture substrate, and for example, it means that cells are cultured in a coated culture vessel.
  • the coating agent is preferably an extracellular matrix, and examples thereof include substances such as collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrin and laminin, or fragments thereof. These extracellular matrices may be used in combination, and may be, for example, preparations from cells such as BD Matrigel TM.
  • the extracellular matrix is preferably laminin or a fragment thereof.
  • laminin is a protein having a heterotrimer structure having one ⁇ chain, one ⁇ chain, and one ⁇ chain, and is an extracellular matrix protein in which isoforms having different subunit chain compositions are present. ..
  • Laminin is a combination of 5 ⁇ chains, 4 ⁇ chains and 3 ⁇ chains heterotrimerics and has about 15 isoforms.
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4 or ⁇ 5
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 or ⁇ 4
  • the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2 or ⁇ 3.
  • Laminin is more preferably laminin 511 consisting of ⁇ 5, ⁇ 1 and ⁇ 1 (Nat Biotechnol 28,611-615 (2010)).
  • Laminin may be a fragment, and is not particularly limited as long as it is a fragment having integrin-binding activity.
  • E8 fragment laminin 511E8
  • EMBO J. EMBO which is a fragment obtained by digestion with elastase. , 3: 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987, WO2011 / 043405
  • Laminin 511E8 is commercially available and can be purchased from, for example, Nippi Co., Ltd.
  • the nephron progenitor cells obtained in the steps (i) to (vi) can be expanded and cultured by culturing them in the medium of the first aspect.
  • the nephron progenitor cells obtained in the steps (i) to (vi) are subjected to a method including the steps (A) and (B), optionally steps (C) to (E) for expanded culture. can do.
  • the same culture vessel as the culture vessel described in the above steps (i) to (vi) can be used.
  • the nephron progenitor cells are cultured using the medium of the first aspect, the nephron progenitor cells can be satisfactorily proliferated while maintaining the differentiation potential. Moreover, since the differentiation potential of the nephron progenitor cells is maintained even after subculture, the nephron progenitor cells can be maintained for a long period of time.
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured by the method of this embodiment can be administered to a subject having renal disease and used for treating renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases.
  • the nephron progenitor cells cultured by the method of this embodiment maintain the renal organoid forming ability, they can be used for the production of renal organoids described later.
  • a third aspect of the present invention is a method for producing a renal organoid.
  • the method for producing a renal organoid of this embodiment includes a step of expanding and culturing a nephron precursor culture (expansion culture step) and a step of differentiating the expanded cultured nephron precursor cells into renal organoids (differentiation) by the method of the second aspect. Step) and.
  • the expansion culture step is performed by the method of the second aspect. By this step, nephron progenitor cells can be satisfactorily proliferated to a desired number while maintaining the differentiation potential.
  • nephron progenitor cells into renal organoids can be performed by known methods. For example, the methods reported in Nature, 526, 564-568 (2015) can be used.
  • the cell mass of the nephron progenitor cells obtained in the expansion culture step may be co-cultured with feeder cells such as 3T3-Wnt4 cells, mouse fetal spinal cells, or mouse fetal kidney cells.
  • the cell mass of Neflon progenitor cells is subjected to semi-gastric culture using a basal medium containing a GSK-3 ⁇ inhibitor (preferably gas-liquid phase culture; see Nature, 526,564-568 (2015)). It may be cultured.
  • the medium used in the semi-gastric culture may contain FGF9, FGF2, etc. in addition to the GSK-3 ⁇ inhibitor.
  • Examples of the basal medium, GSK-3 ⁇ inhibitor, and FGF2 include the same as above.
  • a preferred basal medium is KSR.
  • Preferred GSK-3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • Preferred FGF2 includes human FGF2.
  • Preferred FGF9 includes human FGF9.
  • Examples of human FGF9 include a protein having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_002001.1.
  • FGF9 includes fragments and functional variants thereof as long as it has the activity of inducing differentiation into renal organoids.
  • Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used. In the above, FGF9 may be replaced with FGF20. Alternatively, FGF9 and FGF20 may be used in combination.
  • the culture conditions in the differentiation step the culture conditions usually used for culturing animal cells can be used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it can induce differentiation into renal organoids, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. Specific examples of the CO 2 concentration include about 5%.
  • the renal organoid obtained by the production method of this embodiment can be administered to a subject having a renal disease and used for treating the renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases.
  • the production method of this embodiment may include other steps in addition to the above steps.
  • a step of inducing nephron progenitor cells from pluripotent stem cells may be mentioned before the expansion culture step. Induction of nephron progenitor cells from pluripotent stem cells can be performed by known methods.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising nephron progenitor cells obtained by the method of the second aspect or renal organoids obtained by the production method of the third aspect.
  • the present invention also provides a renal disease therapeutic agent comprising said nephron progenitor cells or said renal organoids.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing renal disease, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the nephron precursor cells or the renal organoid to a subject having renal disease or a subject at risk of renal disease. ..
  • the present invention also provides a method for producing cells for treating renal disease, which comprises the step of culturing nephron progenitor cells in the medium of the first aspect.
  • a method of administering the Neflon precursor cell to a subject requiring treatment or prevention of renal disease for example, a method of sheeting the Neflon precursor cell and attaching it to the target kidney; the Neflon precursor cell in physiological saline.
  • the transplantation site is not particularly limited as long as it is within the kidney, but is preferably under the renal capsule.
  • Examples of the method for administering the renal organoid to a subject in need of treatment or prevention of renal disease include a method of transplanting into the body of the subject (for example, intraperitoneally).
  • the renal disease to be treated or prevented is not particularly limited, and examples thereof include acute renal disorder, chronic renal failure, and chronic kidney disease that does not lead to chronic renal failure.
  • the number of cells of the nephron progenitor cell to be transplanted or the size of the renal organoid is not particularly limited as long as it can be engrafted after transplantation, and is appropriately adjusted according to the size of the diseased site, the body, age, sex, etc. of the administration target. be able to.
  • hNPC nephron progenitor cells
  • the suspended cells were counted by TC20, and the cells required for flow cytometry were transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged at 200 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and suspended at a ratio of 100 ⁇ L of 2% FBS to 1.0x10 6 cells.
  • ⁇ Purification of c-MET positive cells To 100 ⁇ L of 2% FBS in which hNPC induced as described above was suspended, 10 ⁇ L of human-HGFR / c-MET antibody (R & D systems, FAB 3582A) to which the fluorescent substance APC was conjugated was added and placed on ice. It was allowed to stand for 30 minutes. After 30 minutes, the supernatant was removed by centrifugation at 200 g for 5 minutes, washed with 1 mL of PBS, and again centrifuged at 200 g for 5 minutes. This operation was performed twice. The cells from which the supernatant had been removed were suspended in 2% FBS diluted with DAPI 1,000 times, passed through a 40 ⁇ m filter, and then c-MET-positive cells were extracted using flow cytometry.
  • human-HGFR / c-MET antibody R & D systems, FAB 3582A
  • hNPC in which c-MET-positive cells have not been purified is referred to as "hNPC (Bulk)".
  • the hNPC obtained by purifying c-MET-positive cells may be referred to as "hNPC (c-MET (+))”.
  • hNPSR medium hNPSR medium
  • CFY medium a medium obtained by adding a JAK inhibitor (JAK2 inhibitor: TG101348 (final concentration 3 nM)) dissolved in DMSO or DMSO to CFY medium were used.
  • JAK inhibitor JAK2 inhibitor: TG101348 (final concentration 3 nM)
  • the composition of the hNPSR medium is shown in Table 1.
  • the hNPSR medium was prepared by adding the reagents shown in Table 1 to the Basic medium shown in Table 1.
  • the composition of the CFY medium is shown in Table 2.
  • the CFY medium was prepared by adding the reagents shown in Table 2 to the Basic medium shown in Table 2.
  • hNPC ⁇ Cell proliferation> hNPC was suspended in 50 ⁇ L of test medium to give 2.0 x 10 4 cells per well, seeded on a low-adhesion 96-well plate (Nunc), centrifuged at 300 g for 3 minutes, 37 ° C., 25 % CO. The cells were statically cultured in the incubator of. A cell mass was formed 6 hours after the start of static culture.
  • ⁇ Subculture> The cell mass of human iPS cell-derived NPC (hNPC) cultured in the test medium was transferred to a 1.5 ml tube, the supernatant was completely removed, 30 ⁇ L of Accumax (Incubative Cell Technologies, Inc.) was added, and the temperature was 37 ° C., CO 2 The cells were allowed to stand in a 5% incubator for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were suspended in 470 ⁇ L of 10% FBS and the number of cells was measured by TC20 (Bio-Rad). 2.0x10 4 cells of human iPS cell-derived NPCs per well were suspended in test medium and seeded on low-adhesion 96-well plates (Nunc).
  • Low-attainment 96-well plates seeded with cells were centrifuged at 300 g for 3 minutes and statically cultured in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO. Forty-eight hours after the start of static culture, 100 ⁇ L of the test medium was additionally administered to each well. Forty-eight hours after the additional administration of the medium, the same operation as above was performed to measure the cell number and subculture.
  • the cell mass of hNPC subcultured was placed on Transwell (Corning), and the surrounding medium was removed.
  • a Transwell with a cell mass was set in a culture dish previously filled with 5% KSR (Knock-out serum reaction) (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 200 ng / mL FGF2 and 5 ⁇ M CHIR99021.
  • KSR Knock-out serum reaction
  • the medium was replaced with 5% KSR without the addition of growth factors and small molecule compounds.
  • the medium was exchanged with 5% KSR to which growth factors and small molecule compounds were not added, and on the 10th day after the start of differentiation culture, the cells were fixed at 4 ° C. for 3 hours using 4% PFA as Transwell. .. After fixation, the cells were replaced with PBS and allowed to stand at 4 ° C. overnight for immunostaining.
  • OSR1 and SIX2 A human iPS cell having an OSR1-GFP reporter gene in which a GFP coding region was introduced at the OSR1 locus and a SIX2-tdTomato reporter gene in which the tdTomato coding region was linked to the SIX2 gene was established.
  • the expression of OSR1 and SIX2 was confirmed by conducting a culture test using the human iPS cells and detecting each fluorescence of GFP and tdTomato with a fluorescence microscope.
  • Cisplatin adjusted to 1 mg / mL with physiological saline was subcutaneously injected into CB17-Prkdc scid / J mice (hereinafter referred to as "NOD-SCID mice") at a dose of 21 mg / kg to induce cisplatin-induced acute kidney injury.
  • a fault (AKI) model was created. Twenty-four hours after cisplatin administration, the left kidney was exposed extracorporeally by making an approximately 1 cm skin incision in the lower left dorsal region of NOD-SCID mice under general anesthesia with isoflurane, followed by an approximately 1 cm incision in the retroperitoneum.
  • a 24-gauge surflo indwelling needle was punctured into the exposed kidney, and an outer cylinder was placed under the renal capsule.
  • the renal capsule and renal parenchyma were detached by injecting air or physiological saline with a syringe through the outer cylinder.
  • the outer cylinder of the 24-gauge surflo indwelling needle was removed, and the hNPC (Bulk) cell mass (equivalent to about 3.0 x 106 cells) that had been expanded and cultured for 1 or 2 passages in CFY medium from the same puncture site. ) was inserted into the outer cylinder of the aspirated 22-gauge surflo indwelling needle, and cells were slowly injected (cell transplantation).
  • Example 1 Subculture of hNPC (Bulk) was performed using CFY medium and hNPSR medium, and cell proliferation, expression of NPC markers, and ability to form renal organoids were confirmed in the cultured cells.
  • Fig. 2 The results are shown in Fig. 2.
  • hNPSR medium renal organoids were formed from the first passage hNPC (Bulk).
  • renal organoids were not formed from the 2nd and 3rd generation hNPCs (Bulk).
  • CFY medium renal organoids were formed from any of the 1st to 3rd passages of hNPC (Bulk). From this result, it was confirmed that by using CFY medium, hNPC (Bulk) can be subcultured while maintaining the ability to form renal organoids.
  • ⁇ Cell proliferation in subculture of hNPC (Bulk) using CFY medium was carried out using a medium obtained by adding DMSO to hNPSR medium or CFY medium, and the number of cells was measured.
  • FIG. 3 shows the cumulative number of cells calculated from the cells in each subculture.
  • the cumulative number of cells in passage number 1 is as follows: the number of cells grown in passage number 0 is a, the volume of the culture solution of passage number 0 is b, the volume of the culture solution of P0 used for passage is c, and P1.
  • the cumulative number of cells in the subsequent subcultures is calculated in the same manner.
  • hNPC hNPC
  • Example 2 Subculture of hNPC (Bulk) was performed using a medium in which a JAK inhibitor was added to CFY medium, and cell proliferation, expression of NPC markers, and renal organoid formation ability were confirmed in the cultured cells.
  • HNPC Cell proliferation promoting effect by JAK inhibitor> HNPC (Bulk) was cultured using a medium in which DMSO was added to the CFY medium or a medium in which 3 nM TG101348 (JAK2 inhibitor) was added to the CFY medium, and the number of cells was measured.
  • hNPC (Bulk) ⁇ Maintenance culture of hNPC (Bulk) with CHY medium supplemented with JAK inhibitor> Using a medium in which DMSO was added to the CFY medium or a medium in which 3 nM TG101348 (JAK2 inhibitor) was added to the CFY medium, hNPC (Bulk) was subcultured, and it is an NPC marker in each subculture. It was confirmed whether the expression of OSR1 and SIX2 was maintained.
  • Kidney organoids were prepared from cells of the second passage by subculturing hNPC (Bulk) using a medium in which DMSO was added to the CFY medium or a medium in which 3 nM TG101348 (JAK2 inhibitor) was added to the CFY medium. I tried.
  • Kidney organoids were formed from cells of the second passage in both the CFY medium supplemented with DMSO (+ DMSO) and the CFY medium supplemented with 3 nM TG101348 (+ TG (3)). From the results here, it was confirmed that hNPC (Bulk) can be subcultured using a medium obtained by adding a JAK inhibitor to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • Example 3 Subculture of hNPC (c-MET (+)) was performed using a medium obtained by adding a JAK inhibitor to CFY medium, and cell proliferation, expression of NPC markers, and renal organoid formation ability were confirmed in the cultured cells.
  • Subculture of hNPC (c-MET (+)) was performed using a medium in which DMSO was added to the CFY medium or a medium in which 3 nM TG101348 (JAK2 inhibitor) was added to the CFY medium, and the number of cells was measured and accumulated. The number of cells was calculated.
  • Kidney organoids were formed from the cells of the first passage in both the CFY medium supplemented with DMSO (+ DMSO) and the CFY medium supplemented with 3 nM TG101348 (+ TG (3)). From this result, it was confirmed that hNPC (c-MET (+)) can be subcultured using a medium obtained by adding a JAK inhibitor to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • Example 4 The cell mass of hNPC (Bulk) expanded and cultured in CFY medium was transplanted under the renal capsule of AKI mice, and the therapeutic effect of hNPC (Bulk) was confirmed.
  • FIGS. 11 and 12 The transplantation results of the 1-passage and 2-passage hNPC cell clusters are shown in FIGS. 11 and 12, respectively.
  • "normal” is a normal mouse
  • "raw food” is an AKI mouse to which physiological saline is administered under the renal capsule
  • “NPC transplantation” is a cell mass of hNPC (Bulk) under the renal capsule.
  • the AKI mice transplanted to are shown.
  • AKI mice to which physiological saline was administered had significantly higher BUN and S-Cre values than normal mice, confirming renal dysfunction.
  • NPCs induced to differentiate by the following differentiation induction method A based on the method described in International Publication No. 2018/216743 were used.
  • Undifferentiated hiPSC cells were unicellularized by accutase treatment, then suspended in 500 ⁇ L AK02N medium (Ajinomoto) supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 and 1.25 ⁇ L iMatrix (Nippi), and 1.0 ⁇ 10 on a 24-well plate. Seed at a density of 4 cells / well to 5.0 ⁇ 10 4 cells / well and incubated for 24 hours at 37 ° C.
  • Example 5 It was examined whether hNPC was induced to differentiate from human iPS cells (hiPSC) by the following protocol.
  • hiPSC OSR1-GFP / SIX2-tdTomato reporter human iPS cells derived from 201B7 were used.
  • ⁇ Method of inducing differentiation of hNPC from hiPSC (differentiation induction method B)> 1.
  • 1. 1 ⁇ M CHIR99021, 10 nM retinoic acid, 1 ng / ml BMP4, 100 ng / ml using DMEM / F12 Glutamax (Invitrogen) to which B27 was added after unicellularizing undifferentiated hiPSC by TripLE Select Enzyme (Gibco) treatment.
  • FIG. 13 shows the results of confirming the differentiation-inducing efficiency of SIX2-positive cells for the differentiation-induced hNPC.
  • the percentage of SIX2-positive cells in non-DAPI-stained live cells is shown.
  • step 4 when the concentration of FGF2 was 10 ng / mL or less, the efficiency of induction to hNPC decreased. The presence of heparin did not affect the induction efficiency of hNPC.
  • hNPC was induced to differentiate from hiPSC. Further, in the differentiation induction method B 3 (preparation of the late primitive streak of the mesoderm lineage: step 3), 30 ng / ml FGF2; or 10 ng / ml FGF2 was used instead of 100 ng / ml FGF2, and the differentiation induction method was further performed. From hiPSC in the same manner as in differentiation induction method B, except that in B4 (preparation of late renal lineage primitive streak: step 4), 30 ng / ml FGF2 was used instead of 100 ng / ml FGF2. Differentiation was induced for hNPC.
  • FIG. 14 shows the results of confirming the differentiation-inducing efficiency of SIX2-positive cells for the differentiation-induced hNPC.
  • the percentage of SIX2-positive cells in non-DAPI-stained live cells is shown.
  • step 3 the concentration of FGF2 did not affect the efficiency of induction to hNPC.
  • Example 7 According to the protocol of the differentiation induction method B, hNPC was induced to differentiate from hiPSC. Further, in 5 of the differentiation induction method B (preparation of late posterior middle mesoderm: step 5), instead of 200 ng / ml FGF9, 100 ng / ml FGF9; 100 ng / ml FGF9 and 0.18 U / ml (1 ⁇ g / mL).
  • FIG. 15 shows the results of confirming the differentiation-inducing efficiency of SIX2-positive cells for the differentiation-induced hNPC.
  • the percentage of SIX2-positive cells in non-DAPI-stained live cells is shown.
  • step 5 the concentration of FGF9 did not affect the efficiency of induction to hNPC.
  • Example 8 According to the protocol of the differentiation induction method B, hNPC was induced to differentiate from hiPSC. Further, in 2 to 6 of the differentiation induction method B, DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% or 20% AS401 (StemFit (registered trademark) for Differation, Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.) was used as the basal medium, and further described above. In differentiation induction method B 3 (preparation of mesoderm lineage late primordial striatum: step 3), 100 ng / ml FGF2 was replaced with 0 ng / ml FGF2, and further differentiation induction method B 4 (postrenal lineage late primordial primordial streak) was used.
  • DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% or 20% AS401 (StemFit (registered trademark) for Differation, Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.) was used as the basal medium, and further described above.
  • differentiation induction method B 3 preparation of
  • Preparation of streaks In step 4), instead of 100 ng / ml FGF2, 30 ng / ml FGF2 was used, and in 5 of the differentiation induction method B (preparation of late posterior intermediate mesoderm: step 5), 200 ng / ml FGF9. In place of 0 ng / ml FGF9, and in 6 of the differentiation induction method B (preparation of hNPC: step 6), 100 ng / ml FGF9 and 0.18 U / ml (1 ⁇ g / mL) were used instead of 200 ng / ml FGF9. Differentiation was induced from hiPSC by the same method as the differentiation induction method B except that heparin was used.
  • FIG. 16 shows the results of confirming the differentiation-inducing efficiency of SIX2-positive cells for the differentiation-induced hNPC.
  • FIG. 16 shows the proportion of SIX2-positive cells in live cells not stained with DAPI. It was confirmed that the hNPC induction efficiency tended to improve by using the basal medium supplemented with 10% AS401.
  • Example 9 Differentiation was induced for hNPC in the same manner as in Example 8 except that a clinical hiPSC stock strain was used as the hiPSC (differentiation induction method B).
  • DMEM / F12 Glutamax supplemented with B27 or 10% AS401 was used as the basal medium.
  • FIG. 17 shows the results of confirming the expression of SIX2 for the differentiation-induced hNPC. It was confirmed that the hNPC induction efficiency tended to be improved by using the basal medium supplemented with 10% AS401.
  • hNPC was induced to differentiate from hiPSC (hereinafter referred to as "differentiation induction method C").
  • As the basal medium DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% AS401 was used.
  • iPS cells were seeded on a 24-well plate (greener bio-one, 662160) on Stage 1, and the cells were re-seeded on a 24-well plate after the end of the first day of Stage 4.
  • hNPC was collected and expanded and cultured in CPHY medium using a low-adhesion 96-well plate (Prime Surface Plate 96U (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., MS-9096U)).
  • iPS cells were seeded in a T150 flask or a T75 flask (Iwaki) in Stage 1, and cells were placed in 512 cm 2 plates (Sumitomo Bakelite, adherent cell culture peel-off culture vessel 512, MS-28500) after the end of the first day of Stage 4. Was re-seeded.
  • hNPCs were harvested and expanded in CFY medium using low-adhesion 96-well plates.
  • FIG. 19 shows the results of immunostaining the SIX2 expression of hNPC derived from the HLA homostock hiPSC (Ff14s04) strain by the Small scale differentiation induction method (differentiation induction method C (Small)).
  • FIG. 20 shows a morphological photograph and SIX2 expression level of cells subjected to the differentiation induction method of Small scale (differentiation induction method C (Small)) or Large scale (differentiation induction method C (Large)) in FIG. From the morphological photograph of Stage 6 and the expression level of SIX2, it was confirmed that hNPC was induced to differentiate in both Small scale and Large scale cultures. From the morphological photograph on the 7th day after the expansion culture, it was confirmed that the hNPC induced to differentiate from any of the Small scale and Large scale cultures can be expanded and cultured with the CFY medium.
  • FIG. 21 The cell yield after Stage 6 in the differentiation induction method C (Large) is shown in FIG. 21. It was confirmed that 108 scale hNPC can be produced by the method of this example.
  • FIG. 22 shows a fluorescent image in which SIX2 expression of hNPC after Stage 6 was confirmed by immunostaining.
  • CFY medium (CFY medium (-B27, + 10% AS401) supplemented with 10% AS401 instead of B27, or CFY supplemented with 20% AS401 instead of B27, to compare the effects of additives.
  • Medium (CFY medium (-B27, + 20% AS401) and CFY medium were prepared.
  • HNPC was induced to differentiate from hiPSC by the differentiation induction method C (Small).
  • Basal medium DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% AS401 was used.
  • the hNPC after Stage 6 was recovered and expanded and cultured in CFY medium, CFY medium (-B27, + 10% AS401), or CFY medium (-B27, + 20% AS401) using a low-adhesion 96-well plate.
  • FIG. 23 shows a morphological photograph of hNPC in expanded culture.
  • CFY medium or CFY medium (-B27, + 20% AS401) was used, the morphology of the hNPC mass changed to an elliptical shape.
  • CFY medium (-B27, + 10% AS401) was used, the morphology of the hNPC mass was maintained in a circular shape.
  • FIG. 24 shows the growth rate.
  • hNPC showed the best growth rate in CFY medium (-B27, + 10% AS401). From these results, it was considered that CFY medium (-B27, + 10% AS401) was the most suitable for the expansion culture of hNPC.
  • Example 13 Differentiation was induced from hiPSC by the differentiation induction method C (Small).
  • Basal medium DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% AS401 was used.
  • the hNPC after Stage 6 was recovered and expanded and cultured in CFY medium, CFY medium (-B27, + 10% AS401), or CFY medium (-B27, + 20% AS401) using a low-adhesion 96-well plate.
  • the cell mass equivalent to 3 ⁇ 10 6 cells of hNPC on the 7th day of the expanded culture was transplanted under the renal capsule of AKI mice, and the therapeutic effect by hNPC was confirmed.
  • FIGS. 25 and 26 The results of measuring urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (S-Cre) in blood are shown in FIGS. 25 and 26, respectively. No significant difference was detected between the 4 groups including the Ctl group, but an improvement tendency was observed in both BUN and S-Cre in the transplanted group. It was
  • Example 14 Differentiation was induced from hiPSC by the differentiation induction method C (Small).
  • Basal medium DMEM / F12 Glutamax supplemented with 10% AS401 was used.
  • the hNPC after Stage 6 was recovered and expanded and cultured in CFY medium or CFY medium (-B27, + 10% AS401) using a low-adhesion 96-well plate.
  • FIG. 27 shows the results of confirming the gene expression of the hNPC cell mass on the 7th day of the expanded culture.
  • Expansion culture in CFY medium (-B27, + 10% AS401) tended to increase the expression of NPC markers and angiogenesis-related genes.
  • Example 15 In order to confirm the effect of FGF9 on the CFY medium, a medium (CFY medium (-FGF9, + FGF2)) to which 300 ng / ml of FGF2 was added instead of FGF9 of the CFY medium was prepared. Differentiation was induced from hiPSC by the differentiation induction method A. As the basal medium, DMEM / F12 Glutamax supplemented with B27 (B-27 Supplement, minus vitamin A, Invitrogen) was used. The hNPC after Stage 6 was recovered and expanded and cultured in CFY medium or CFY medium (-FGF9, + FGF2) using a low-adhesion 96-well plate.
  • CFY medium CFY medium (-FGF9, + FGF2)
  • the cell mass was observed with an optical microscope and a fluorescence microscope, and the morphology observed with the optical microscope was compared with the expression of the NPC markers (OSR1, SIX2) observed with the fluorescence microscope.
  • the results are shown in FIG.
  • the expression of NPC markers was higher in the expanded culture in the medium containing FGF9.
  • Example 16 Differentiation was induced from hNPC expanded and cultured using CFY medium or CFY medium (-FGF9, + FGF2) to renal organoids. The results are shown in FIG. The area of the renal organoid (light-colored part) was increased and the formation of the renal organoid was better when the culture was expanded in the medium containing FGF9.
  • Example 17 In order to confirm the effect of the ROCK inhibitor (Y-27632) on the CFY medium, a medium (CF medium) obtained by removing the ROCK inhibitor from the CFY medium was prepared.
  • the hNPC maintained in CFY medium was subcultured into CFY medium. Two days after the passage, the medium was changed to CFY medium or CF medium (first medium change). Then, two days after the first medium exchange, the medium was further exchanged with CFY medium or CF medium (second medium exchange). Two days after the second medium change, the medium was subcultured to CFY medium. In this cycle, subculture was performed up to 3 subcultures.
  • NPC marker-positive cells were analyzed by flow cytometry. The results are shown in FIGS. 30 and 31. Whether the medium after 2 days from the passage was CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY) did not affect the expression of NPC markers.
  • Example 18 The hNPC maintained in CFY medium was subcultured into CFY medium. Two days after the passage, the medium was changed to CFY medium or CF medium (first medium change). Then, two days later, the medium was further exchanged with CFY medium or CF medium (second medium exchange). Two days after the second medium change, the medium was subcultured to CFY medium. In this cycle, subculture was performed up to 3 subcultures.
  • NPC marker (OSR1, SIX2) -positive cells and c-MET (cell surface antigen protein specifically expressed in NPC) in living cells not stained with DAPI by flow cytometry after cells were collected at the timing of passage. ) The proportion of positive cells was analyzed. The results are shown in FIG. 32 (passage number 1) and FIG. 33 (passage number 2). Ratio of each cell group (OSR1 (+) SIX2 (+), OSR1 (+) SIX2 (-), c-MET (+)) measured by flow cytometry to the total number of live cells not stained with DAPI. It is shown by the number of cells according to. Whether the medium after 2 days from the passage was CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY) did not affect the expression of NPC markers.
  • CF medium CFY ⁇ CF
  • CFY ⁇ CFY CFY medium
  • Example 19 The hNPC maintained in CFY medium was subcultured into CFY medium. Two days after the passage, the medium was changed to CFY medium or CF medium (first medium change). Then, two days later, the medium was further exchanged with CFY medium or CF medium (second medium exchange). Two days after the second medium change, the medium was subcultured to CFY medium. In this cycle, subculture was performed up to 2 subcultures.
  • the cell mass after the second passage was observed with an optical microscope and a fluorescence microscope, and the morphology observed with the optical microscope was compared with the expression of the NPC markers (OSR1, SIX2) observed with the fluorescence microscope.
  • the results are shown in FIG. Whether the medium after 2 days from the passage was CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY) did not affect the expression of NPC markers.
  • Example 20 The hNPC maintained in CFY medium was subcultured into CFY medium. Two days after the passage, the medium was changed to CFY medium or CF medium (first medium change). Then, two days later, the medium was further exchanged with CFY medium or CF medium (second medium exchange). Two days after the second medium change, the medium was subcultured to CFY medium. In this cycle, subculture was performed up to one subculture.
  • Kidney organoids were formed regardless of whether the medium after 2 days from the passage was CF medium (CFY ⁇ CF) or CFY medium (CFY ⁇ CFY). The formation of renal organoids was equivalent to that of the CF medium (CFY ⁇ CF) 2 days after passage and the one using CFY culture after 2 days (CFY ⁇ CFY).
  • a medium for expanding and culturing Neflon precursor cells capable of expanding and culturing Neflon precursor cells while maintaining differentiation ability, an NPC expansion culture method using the medium, and the expansion culture method.
  • a method for producing a renal organoid from the Neflon precursor cells obtained in the above is provided.
  • the nephron progenitor cells and renal organoids obtained by the method of the present invention can be applied to the treatment or prevention of renal diseases.

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Abstract

ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。また、前記培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。また、前記ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。

Description

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法
　本発明は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法に関する。
　本願は、２０２１年１月８日に、日本に出願された特願２０２１－００２２０３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　現在、本邦において慢性腎臓病（ＣＫＤ）の患者数は、約１，３００万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は３４万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。
　腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の３つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の２つの組織の相互作用で発生する。さらに、後腎間葉の中にネフロンを構成する糸球体と数種類の尿細管上皮細胞に分化する多分化能を有するネフロン前駆細胞（Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ＮＰＣ）の存在が示されている（非特許文献１，２）。
　マウスネフロン前駆細胞（ｍｏｕｓｅ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ｍＮＰＣ）の拡大培養法としては、骨形成因子（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）７を用いた方法が報告されている。例えば、非特許文献３には、ＢＭＰ７、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、Ａ８３－０１、ＬＤＮ１９３１８９を含む培地（ＮＰＳＲ培地）を用いて、１年以上にわたってｍＮＰＣを増殖させたことが報告されている。
Ｏｓａｆｕｎｅ　Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｍｏｕｓｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｂｙ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ａｓｓａｙ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２００６；１３３：１５１－６１． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｉｘ２　ｄｅｆｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ　ｎｅｐｈｒｏｎ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２００８；３：１６９－８１． Ｚ．Ｌｉ，Ｔ．Ａｒａｏｋａ，Ｊ．Ｃ．Ｉ．Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，　Ｇｅｎｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　３Ｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ，　ｉｎ：Ｓ．　Ｖａｉｎｉｏ（Ｅｄ．），Ｋｉｄｎｅｙ　Ｏｒｇａｎｏｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｒｏｔｏｃ，Ｈｕｍｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２０１９：ｐｐ．１５１－１５９．
　拡大培養したネフロン前駆細胞を、再生医療等に利用するためには、拡大培養中、分化能等のネフロン前駆細胞としての性質が維持されている必要がある。そのため、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、ネフロン前駆細胞を効率よく拡大培養可能な培養方法の開発が望まれる。
　そこで、本発明は、分化能を保持したままネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
［２］ＪＡＫ阻害剤をさらに含む、［１］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
［３］前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ２阻害剤である、［２］に記載の培地。
［４］前記ＪＡＫ２阻害剤が、ＴＧ１０１３４８である、［３］に記載の培地。
［５］前記ＧＳＫ－３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の培地。
［６］前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の培地。
［７］前記培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１をさらに含む、［１］～［６］のいずれか１つに記載の培地。
［８］前記ネフロン前駆細胞が、ヒトのネフロン前駆細胞である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の培地。
［９］前記ネフロン前駆細胞が、多能性幹細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、［１］～［８］のいずれか１つに記載の培地。
［１０］前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［９］に記載の培地。
［１１］［１］～［１０］のいずれか１つに記載の培地でネフロン前駆細胞を培養する工程を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１２］前記ネフロン前駆細胞を培養する工程が、前記ネフロン前駆細胞を継代培養することを含む、［１１］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１３］（Ａ）［１］～［１０］のいずれか１つに記載の培地でネフロン前駆細胞を３０～６０時間培養する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程と、を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１４］（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた細胞を、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の培地に継代する工程をさらに含む、［１３］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１５］（Ｄ）前記工程（Ｃ）で継代した細胞を、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の培地で３０～６０時間培養する工程と、（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程と、をさらに含む、［１４］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１６］前記ネフロン前駆細胞が、ヒトのネフロン前駆細胞である、［１１］～［１５］のいずれか１つに記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１７］前記ネフロン前駆細胞が、多能性幹細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、［１１］～［１６］のいずれか１つに記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１８］前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［１７］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１９］前記ネフロン前駆細胞が、下記工程（ｉ）～（ｖｉ）を含む方法により得られたネフロン前駆細胞である、［１７］又は［１８］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法：（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ－３β阻害剤及びレチノイン酸又はその誘導体を含む培地で培養する工程；（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＢＭＰ７及びＴＧＦβ阻害剤を含み、且つＦＧＦ２を含まない培地で培養する工程；（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤、アクチビン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸又はその誘導体を含み、且つＦＧＦ９を含まない培地で培養する工程；並びに（ｖｉ）前記工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む培地で培養する工程。
［２０］前記工程（ｉｖ）で用いる培地が、ＢＭＰ７を含まない培地である、［１９］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［２１］前記工程（ｉ）～（ｖｉ）の少なくとも１つの工程を、細胞接着面が４００ｃｍ２以上である培養容器を用いて行う、［１９］又は［２０］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［２２］［１１］～［２１］のいずれか１つに記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
　本発明は、分化能を保持したままネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供できるという効果を奏する。
ｈＮＰＳＲ培地（表１参照）又はＣＦＹ培地（表２参照）を用いて、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、各継代において、ＳＩＸ２及びＯＳＲ１の発現を確認した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地を用いて継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）から腎臓オルガノイドの作製を試みた結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、細胞数を測定して累積細胞数を算出した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、各継代において細胞数を測定した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の培養を行い、細胞数を測定した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、各継代において、ＳＩＸ２及びＯＳＲ１の発現を確認した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、２継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）、又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の培養を行い、各継代において細胞数を測定して累積細胞数を算出した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、各継代において、ＳＩＸ２及びＯＳＲ１の発現を確認した結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた結果を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 シスプラチンを投与して急性腎障害（ＡＫＩ）を発症させた免疫不全マウス（ＡＫＩマウス）に、ＣＦＹ培地で１継代したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊を腎被膜下に移植して、血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニン（Ｓ－Ｃｒｅ）を測定した結果を示す。図中、「正常」は、正常マウス、「生食」は、生理食塩水を腎被膜下に投与したＡＫＩマウス、「ＮＰＣ移植」は、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を移植したＡＫＩマウスを示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 シスプラチンを投与して急性腎障害（ＡＫＩ）を発症させた免疫不全マウスに、ＣＦＹ培地で２継代したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊を腎被膜下に移植して、血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニン（Ｓ－Ｃｒｅ）を測定した結果を示す。図中、「正常」は、正常マウス、「生食」は、生理食塩水を腎被膜下に投与したＡＫＩマウス、「ＮＰＣ移植」は、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を移植したＡＫＩマウスを示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 分化誘導法Ｂ（実施例５参照）によるヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）からｈＮＰＣへの誘導において、工程４（後腎系譜後期原始線条の作製）で、ＦＧＦ２濃度を変化させた場合およびヘパリンを添加した場合のＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を示す。 分化誘導法ＢによるｈｉＰＳＣからｈＮＰＣへの誘導において、工程３（中胚葉系譜後期原始線条の作製）で、ＦＧＦ２濃度を変化させた場合のＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を示す。 分化誘導法ＢによるｈｉＰＳＣからｈＮＰＣへの誘導において、工程５（後期後方中間中胚葉の作製）で、ＦＧＦ９濃度を変化させた場合およびヘパリンを添加した場合のＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を示す。 分化誘導法ＢによるｈｉＰＳＣからｈＮＰＣへの誘導において、基礎培地の添加物をＢ２７（Ｂ２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）．ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からＡＳ４０１（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、味の素ヘルシーサプライ株式会社）に変更した場合のＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を示す。１０％　ＡＳ４０１：基礎培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１を含む基礎培地；２０％　ＡＳ４０１：基礎培地の容量全体に対し、２０容量％のＡＳ４０１を含む基礎培地；Ｂ２７：Ｂ２７を添加した基礎培地。以下、１０％　ＡＳ４０１を添加した培地と記載する場合、培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１を含む培地を指す。２０％　ＡＳ４０１を添加した培地についても同様である。 分化誘導法Ｂによる臨床用ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣへの誘導において、基礎培地の添加物をＢ２７からＡＳ４０１に変更した場合のＳＩＸ２発現を確認した結果を示す。ｉＰＳＣ：臨床用ｈｉＰＳＣ；ＮＰＣ（Ｂ２７）：Ｂ２７を添加した基礎培地を用いて誘導されたＮＰＣ；ＮＰＣ（ＡＳ１０）：１０％　ＡＳ４０１を添加した基礎培地を用いて誘導されたｈＮＰＣ。 実施例１０～１４において用いた、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣへの分化誘導条件（分化誘導法Ｃ）を示す。以下、図１８のＳｍａｌｌ　ｓｃａｌｅでの分化誘導法を「分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）」、Ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅでの分化誘導法を「分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）」とも記載する。分化誘導法Ｃでは、特記しない限り、基礎培地として、１０％　ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を用いた。 分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）により、ＨＬＡホモストックｈｉＰＳＣ（Ｆｆ１４ｓ０４）株から誘導されたｈＮＰＣのＳＩＸ２発現を免疫染色にて確認した蛍光画像を示す。 分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）又は分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）により分化誘導されたｈＮＰＣのＳｔａｇｅ６のｄａｙ２における形態及びＳＩＸ２の発現、並びに拡大培養後ｄａｙ７の形態写真を示す。 分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）で分化誘導したｈＮＰＣの細胞収量を示す。 分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）で分化誘導したｈＮＰＣのＳＩＸ２発現を免疫染色にて確認した蛍光画像を示す。 添加物（Ｂ２７又はＡＳ４０１）の異なる培地で拡大培養中のｈＮＰＣの形態写真を示す。スケールバーは３００μｍ。ＡＳ　１０％：Ｂ２７に替えて１０％　ＡＳ４０１を添加した改変ＣＦＹ培地（以下、「ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）」ともいう）；ＡＳ　２０％：Ｂ２７に替えて２０％　ＡＳ４０１を添加した改変ＣＦＹ培地（以下、「ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）」ともいう）；Ｂ２７：ＣＦＹ培地。 添加物（Ｂ２７又はＡＳ４０１）の異なる培地で拡大培養したｈＮＰＣの増殖率を示す。ＡＳ１０％：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）；ＡＳ２０％：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）；Ｂ２７：ＣＦＹ培地。 添加物（Ｂ２７又はＡＳ４０１）の異なる培地で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を、ＡＫIマウスの腎被膜下に移植して、血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した結果を示す。Ｂ２７：ＣＦＹ培地で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；ＡＳ１０：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；ＡＳ２０：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；Ｃｔｌ：移植なし。ｐｒｅ：シスプラチン投与前；ｐｏｓｔ　ＴＸ：シスプラチン投与後。 添加物（Ｂ２７又はＡＳ４０１）の異なる培地で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を、ＡＫIマウスの腎被膜下に移植して、血清クレアチニン（Ｓ－Ｃｒｅ）を測定した結果を示す。Ｂ２７：ＣＦＹ培地で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；ＡＳ１０：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；ＡＳ２０：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）で拡大培養したｈＮＰＣの細胞塊を移植；Ｃｔｌ：移植なし。ｐｒｅ：シスプラチン投与前；ｐｏｓｔ　ＴＸ：シスプラチン投与後。 添加物（Ｂ２７又はＡＳ４０１）の異なる培地で拡大培養したｈＮＰＣの遺伝子発現を確認した結果を示す。Ｂ２７：ＣＦＹ培地；ＡＳ１０：ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）。 ＣＦＹ培地のＦＧＦ９をＦＧＦ２に変更した培地（以下、「ＣＦＹ培地（－ＦＧＦ９，＋ＦＧＦ２）」ともいう）、又はＣＦＹ培地を用いて拡大培養したｈＮＰＣのＮＰＣマーカーの発現を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法Ａ（国際公開第２０１８/２１６７４３号に記載の分化誘導方法）によりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ｈＮＰＣから分化誘導された腎臓オルガノイドを光学顕微鏡で観察した結果を示す。ｈＮＰＣは、ＣＦＹ培地（－ＦＧＦ９，＋ＦＧＦ２）、又はＣＦＹ培地を用いて拡大培養した。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 継代から２日後にＣＦ培地（ＣＦＹ培地からＹ－２７６３２を除いた培地）に培地交換する継代方法を３継代繰り返した時の、継代毎の細胞のＦＡＣＳ解析結果を示す。Ｐ１：１継代した細胞；Ｐ２：２継代した細胞；Ｐ３：３継代した細胞。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 継代後の培地交換をＣＦＹ培地で行い、３継代繰り返した時の、継代毎の細胞のＦＡＣＳ解析結果を示す。Ｐ１：１継代した細胞；Ｐ２：２継代した細胞；Ｐ３：３継代した細胞。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 継代から２日後にＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）又はＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）に培地交換する継代方法で１継代したときの、ＮＰＣマーカー（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋），ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（－）、ｃ－ＭＥＴ（＋））陽性細胞数および全体の細胞数を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 継代から２日後にＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）又はＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）に培地交換する継代方法で２継代したときの、ＮＰＣマーカー（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋），ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（－）、ｃ－ＭＥＴ（＋））陽性細胞数および全体の細胞数を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 継代から２日後にＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）又はＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）に培地交換する継代方法で２継代したときの、ＮＰＣマーカーの発現を示す。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。 ｈＮＰＣから分化誘導された腎臓オルガノイドを光学顕微鏡で観察した結果を示す。ｈＮＰＣは、継代から２日後にＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）又はＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）に培地交換する継代方法で１継代したものを用いた。ｈＮＰＣは、分化誘導法ＡによりｈｉＰＳＣから分化誘導したものを用いた。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地＞
　本発明の第１の態様は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地である。本態様の培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子を含む。一実施形態において、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤をさらに含む。
（ネフロン前駆細胞：ＮＰＣ）
　ＮＰＣは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化し得る細胞である。ネフロン前駆細胞の器官構造への分化能は、例えば、Ｏｓａｆｕｎｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３３：１５１－６１に記載の方法によって評価し得る。ネフロン前駆細胞としての状態を維持するための特徴的な因子としてＳＩＸ２が知られており（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　３：１６９－１８１（２００８））、本態様の方法で培養されるネフロン前駆細胞の例として、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞が挙げられる。例えば、ＳＩＸ２プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＮａｔＣｏｍｍｕｎ　４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、ネフロン前駆細胞におけるＳＩＸ２の発現を確認することもできる。本明細書において、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞には、ＳＩＸ２タンパク質を発現している細胞、及びＳＩＸ２プロモーター制御下にある遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。ヒトのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０７３６）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９３２．５で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子、マウスのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２０４７２）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１１３８０．２で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。本態様の培地で培養されるネフロン前駆細胞は、好ましくは、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２及びＳＡＬＬ１が陽性である。
　ネフロン前駆細胞が由来する生物は、特に限定されず、腎臓を有する動物であればよい。ネフロン前駆細胞は、哺乳類由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。すなわち、ヒトのネフロン前駆細胞が好ましい。
　ネフロン前駆細胞は、生体の後腎間葉から単離されたものであってもよく、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）から分化誘導したものであってもよい。本態様の培地で拡大培養されるネフロン前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導されたものであることが好ましく、ｉＰＳ細胞から誘導されたものであることがより好ましい。
　多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の分化誘導は、公知の方法により行うことができる。多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０１４／２００１１５号、国際公開第２０１７／０４３６６６号、国際公開第２０１８／２１６７４３号等に記載の方法が挙げられる。
　後腎間葉から採取された細胞集団又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団からのネフロン前駆細胞の単離は、例えば、上記ネフロン前駆細胞のマーカーであるＯＳＲ１、ＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２、又はＳＡＬＬ１の発現を指標として行うことができる。あるいは、c-ＭＥＴ、又はＡＧＴＲ２の発現を指標として行うことができる（国際公開第２０２０／０２２２６１号）。
　本態様の培地で拡大培養されるネフロン前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化されたネフロン前駆細胞の細胞集団として提供されてもよい。ネフロン前駆細胞と他の細胞種とを含む細胞集団である場合、ネフロン前駆細胞数の割合は、全細胞数（１００％）に対して、３０％、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましい。
（拡大培養）
　「拡大培養」とは、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を増殖させる培養を意味する。すなわち、拡大培養したネフロン前駆細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化することができる。本態様の培地は、継代を繰り返しても、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を拡大培養することができる。
（培地）
　本態様の培地は、動物培養に用いられる基礎培地に、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子を添加した培地であってよい。また、動物培養に用いられる基礎培地に、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子に加えて、ＪＡＫ阻害剤を添加したものであってもよい。
≪基礎培地≫
　基礎培地は、特に限定されず、動物培養に通常用いられるものを特に制限なく使用することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。また、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、及びこれらの同等物などの１つ以上の物質を含んでいてもよい。
　基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地（例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を１：１で混合した混合培地）に、アミノ酸、非必須アミノ酸、血清代替物等を添加したものであってもよい。
　基礎培地には、適宜、サプリメントを添加してもよい。サプリメントとしては、例えば、ＡＳ４０１（ＳｔｅｍＦｉｔ　ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、味の素ヘルシーサプライ株式会社）、Ｂ２７（Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，　ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））等が挙げられる。基礎培地は、基礎培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１を含むことが好ましい。本明細書において、培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１を含む培地を、１０％　ＡＳ４０１を添加した培地と記載する場合がある。
　基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地に、１０％　ＡＳ４０１を添加したものであってもよい。基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地に、１０％　ＡＳ４０１、及びＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したものであってもよい。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地にＧｌｕｔａＭＡＸを添加した培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を用いてもよい。基礎培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘに、１０％　ＡＳ４０１を添加したものであってもよい。１０％　ＡＳ４０１を添加した基礎培地を用いることにより、ネフロン前駆細胞の増殖率、細胞塊の形状、及びＮＰＣマーカー（ＳＩＸ２、ＯＳＲ１）及び腎保護因子（ＶＥＧＦＡ）の発現等が向上する。
　本態様の培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む。
≪ＧＳＫ－３β阻害剤≫
　本態様の培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤を含む。ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２）、及びＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン－３－カルボニトリル）、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ－３βに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＧＳＫ－３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。培地におけるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、ＧＳＫ－３β阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＧＳＫ－３β阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＧＳＫ３βの濃度としては、ＧＳＫ－３βがＣＨＩＲ９９０２１である場合、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、０．５～３μＭであり、特に好ましくは、０．５～１．５μＭである。
≪ＲＯＣＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を阻害する物質である。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６－９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３－２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０－９９４（１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５－２３２（２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ－２７６３２が挙げられる。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である場合、例えば、０．１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、１～７５μＭ、より好ましくは、５～５０μＭである。
　本態様の培地は、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む。
≪ＦＧＦ９≫
　本態様の培地は、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）９を含んでもよい。ＦＧＦ９が由来する生物は特に限定されない。ＦＧＦ９としては、例えば、ヒトＦＧＦ９を用いることができる。ヒトＦＧＦ９（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２２５４）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２００１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。また、ＦＧＦ２０はＦＧＦ９と同じサブファミリーに属し、マウスの発生期腎臓においてＦＧＦ９の作用と重複した作用を示す知見（Ｂａｒａｋ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．ＦＧＦ９　ａｎｄ　ＦＧＦ２０　Ｍａｉｎｔａｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｔｅｍｎｅｓｓ　ｏｆ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍａｎ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ　２２，１１９１－１２０７（２０１２）．）から、ＦＧＦ９を代替可能と考えられる。
　培地におけるＦＧＦ９の濃度は、例えば、１～８００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、５～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～４００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１００～３００ｎｇ／ｍｌである。
≪ＦＧＦ２０≫
　本態様の培地は、ＦＧＦ９に替えて、又はＦＧＦ９と共に、ＦＧＦ２０を含んでもよい。上述のように、ＦＧＦ２０及びＦＧＦ９は、腎発生期において同様に作用することが知られており、相互に代替可能である。ＦＧＦ２０が由来する生物は特に限定されない。ＦＧＦ２０としては、例えば、ヒトＦＧＦ２０を用いることができる。ヒトＦＧＦ２０（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２６２８１）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０６２８２５．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ２０はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＦＧＦ２０は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＦＧＦ２０の濃度は、例えば、１～８００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、５～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～４００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１００～３００ｎｇ／ｍｌである。
　本態様の培地は、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０のいずれか１種を含んでもよく、両方を含んでもよい。本態様の培地が、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０の両方を含む場合、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０の合計の濃度として、例えば、１～８００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、５～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～４００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１００～３００ｎｇ／ｍｌである。
≪他の成分≫
　本態様の培地は、上記成分に加えて、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ＪＡＫ阻害剤が挙げられる。
・ＪＡＫ阻害剤
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤を含んでいてもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ　ｋｉｎａｓｅ）ファミリー（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）の１種類以上の酵素の活性を阻害する物質である。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素活性を阻害することにより、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ系のシグナル伝達を阻害する。培地が、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９阻害剤及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子に加えて、ＪＡＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより促進される。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３からなる群より選択される少なくとも１種の酵素活性を阻害するものが好ましく、ＪＡＫ２の酵素活性を阻害するもの（ＪＡＫ２阻害剤）がより好ましい。
　ＪＡＫ３阻害剤は、ＪＡＫ３の活性を阻害できるものであれば特に限定されない。ＪＡＫ３阻害剤としては、例えば、ＴＣＳ２１３１１（ＣＡＳ番号　１２６０１８１－１４－３）、ＷＨＩ－Ｐ１５４（ＣＡＳ　２１１５５５－０４－３）、ＰＦ－０６６５１６００（ＣＡＳ番号　１７９２１８０－８１－４）、ＦＭ－３８１（ＣＡＳ番号　２２２６５２１－６５－７）、ＣＰ６９０５５０（ＣＡＳ番号　５４０７３７－２９－９）、７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステル、ＪＡＫ３　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ　ＩＶ（ＣＡＳ番号５８７５３－５４－１）、ＺＭ４４９８２９（ＣＡＳ番号４４５２－０６－６）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ番号９３５６６６－８８－９）、及びＳｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＪＡＫ３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１（ＣＡＳ番号１４４３２３５－９５－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１が好ましい。
　ＪＡＫ２阻害剤は、ＪＡＫ２の活性を阻害できるものであれば、特に限定されない。ＪＡＫ２阻害剤としては、例えば、ＮＶＰ－ＢＳＫ８０５　２ＨＣｌ（ＣＡＳ番号１９４２９１９－７９－０）、ＴＧ１０１２０９（ＣＡＳ番号９３６０９１－１４－４）、ＴＧ１０１３４８（ＣＡＳ番号９３６０９１－２６－８）、１，２，３，４，５，６－ヘキサブロモシクロヘキサン（ＣＡＳ番号１８３７－９１－８）、ＣＥＰ－３３７７９（ＣＡＳ番号１２５７７０４－５７－６）、及びＮＳＣ３３９９４（ＣＡＳ番号８２０５８－１６－０）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＪＡＫ２阻害剤は、ＴＧ１０１３４８が好ましい。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ２／３阻害剤であってもよい。ＪＡＫ２／３阻害剤は、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ２／３阻害剤としては、例えば、ＡＧ４９０（ＣＡＳ番号１３３５５０－３０－８）、ＡＴ９２８３（ＣＡＳ番号８９６４６６－０４－９）、及びＬＹ３００９１０４（ＣＡＳ番号１１８７５９４－０９－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１／２阻害剤であってもよい。ＪＡＫ１／２阻害剤は、ＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ１／２阻害剤としては、例えば、ＣＹＴ３８７（ＣＡＳ番号１０５６６３４－６８－４）、Ｓ－Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＩＮＣＢ０１８４２４）（ＣＡＳ番号９４１６８５－３７－６）、及びＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ番号１２２９２３６－８６－５）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ヤヌスキナーゼファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＪＡＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ２阻害剤が好ましく、ＴＧ１０１３４８がより好ましい。
　本態様の培地におけるＪＡＫ阻害剤の濃度は、ＪＡＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、０．０１ｎＭ以上、０．０５ｎＭ以上、０．１ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上、又は１ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＪＡＫ阻害剤の濃度の上限値としては、例えば、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下等が挙げられる。ＪＡＫ阻害剤が、ＴＧ１０１３４８である場合、ＴＧ１０１３４８の培地における濃度は、例えば、０．５～５０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、１～１０ｎＭ、又は１～５ｎＭ等が挙げられる。
　本態様の培地は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の成分を含むことができる。本態様の培地は、上記以外のシグナル伝達阻害剤、酵素阻害剤、サイトカイン、増殖因子等を含まないことが好ましい。
　一実施態様において、本態様の培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子を含む。一実施態様において、本培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ９、及びＪＡＫ阻害剤を含む。一実施態様において、本培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ９、及びＪＡＫ２阻害剤を含む。一実施形態において、本態様の培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ-２７６３２、及びＦＧＦ９を含む。一実施形態において、本態様の培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ－２７６３２、ＦＧＦ９、及びＴＧ１０１３４８を含む。前記ＦＧＦ９は、ＦＧＦ２０で代替してもよい。
　本態様の培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも線維芽細胞増殖因子を組み合わせて含むことで、ネフロン前駆細胞の分化能を維持したまま、良好にネフロン前駆細胞を増殖させることができる。本態様の培地は、前記成分に加えて、ＪＡＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。
　本態様の培地を用いることにより、ネフロン前駆細胞の継代を繰り返しても、ネフロン前駆細胞の分化能を維持したまま、良好にネフロン前駆細胞を増殖させることができる。したがって、本態様の培地は、ネフロン前駆細胞の継代培養用培地であるともいえる。また、本態様の培地は、ネフロン前駆細胞の維持培地であるともいえる。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法＞
　本発明の第２の態様は、前記第１の態様の培地でネフロン前駆細胞を培養する工程を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法である。
　本態様の方法で培養するネフロン前駆細胞としては、上記＜ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地＞の（ネフロン前駆細胞：ＮＰＣ）の項であげたものと同様のものが挙げられる。ネフロン前駆細胞は、ヒトのネフロン前駆細胞であることが好ましい。ネフロン前駆細胞は、多能性幹細胞から誘導されたものであることが好ましく、ｉＰＳ細胞から誘導されたものであることがより好ましい。一実施形態において、ネフロン前駆細胞は、ヒトｉＰＳ細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いる限り、培養方法は特に限定されない。ネフロン前駆細胞は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件で培養することができる。培養温度は、ネフロン前駆細胞が増殖できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ネフロン前駆細胞は、通常ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養することができる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　培養は、接着培養でもよく、浮遊培養でもよいが、浮遊培養が好ましい。
　培養期間は、特に限定されず、任意の期間とすることができる。本態様の方法では、第１の態様の培地を用いることにより、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、長期間培養することができる。長期間培養する場合、適宜、継代することが好ましい。前記第１の態様の培地を用いて継代を繰り返すことで、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、ネフロン前駆細胞の培養を続けることができる。継代は、培養液からネフロン前駆細胞の細胞塊を採取し、新たな培地に播種することにより、行うことができる。継代の際には、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、及びＤＮａｓｅ等の酵素を含む細胞分散液を用いて、細胞塊を分散した後、新たな培地に播種してもよい。継代の間隔は、特に限定されないが、例えば、２～１０日程度、又は３～７日程度とすることができる。一実施形態において、本態様の方法は、ネフロン前駆細胞を継代培養することを含む。
　本態様のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の工程を含んでもよい。
　（Ａ）前記第１の態様の培地でネフロン前駆細胞を３０～６０時間培養する工程；及び
　（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程。
　工程（Ａ）では、第１の態様の培地で、ネフロン前駆細胞を３０～６０時間培養する。第１の態様の培地での培養時間は、２日程度であってもよい。第１の態様の培地での培養時間としては、例えば、３５～５５時間、及び４０～５０時間等が挙げられる。前記培養時間は、ネフロン前駆細胞が、第１の態様の培地に播種された時点からの時間である。
　工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地（以下、「ＲＯＣＫ阻害剤非含有培地」という）で培養する。工程（Ｂ）で用いる培地としては、第１の態様の培地から、ＲＯＣＫ阻害剤を除いた培地が挙げられる。工程（Ｂ）での培養は、工程（Ａ）の培養における培地を、ＲＯＣＫ阻害剤非含有培地に培地交換することにより、開始することができる。工程（Ｂ）では、２日に１回程度の間隔で、培地交換を行ってもよい。培地交換に用いる培地は、ＲＯＣＫ阻害剤非含有培地とすることができる。工程（Ｂ）での培地交換は、１～５回程度、２～４回程度、２回、又は３回とすることができる。工程（Ｂ）で用いる培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含まないため、ＲＯＣＫ阻害剤を含む培地を用いる場合と比較して、安価に行うことができる。
　本態様の方法は、前記工程（Ｂ）の後、下記工程（Ｃ）をさらに含んでもよい。
　（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた細胞を、第１の態様の培地に継代する工程。
　本態様の方法は、前記工程（Ｃ）の後、下記工程（Ｄ）及び（Ｅ）をさらに含んでもよい。
　（Ｄ）前記工程（Ｃ）で継代した細胞を、第１の態様の培地で３０～６０時間培養する工程；及び
　（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程。
　工程（Ｄ）では、工程（Ｃ）で継代した培地で、そのまま３０～６０時間培養することができる。工程（Ｄ）での培養時間は、２日程度であってもよい。工程（Ｄ）での培養時間としては、例えば、３５～５５時間、及び４０～５０時間等が挙げられる。前記培養時間は、ネフロン前駆細胞を継代した時点からの時間である。
　工程（Ｅ）では、工程（Ｄ）で得られた細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤非含有培地で培養する。工程（Ｅ）では、工程（Ｂ）と同じＲＯＣＫ阻害剤非含有培地を用いることができる。工程（Ｅ）での培養は、工程（Ｂ）と同様に行うことができる。
　本態様の方法で用いられるネフロン前駆細胞は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。ネフロン前駆細胞は、例えば、国際公開第２０１８/２１６７４３号に記載の分化誘導法で得られたものであってもよい。
　また、本態様の方法で用いられるネフロン前駆細胞は、例えば、下記工程（ｉ）～（ｖｉ）を含む方法で得られたものであってよい。
　（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ－３β阻害剤及びレチノイン酸又はその誘導体を含む培地で培養する工程；
　（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
　（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＢＭＰ７及びＴＧＦβ阻害剤を含み、且つＦＧＦ２を含まない培地で培養する工程；
　（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤、アクチビン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；
　（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸又はその誘導体を含み、且つＦＧＦ９を含まない培地で培養する工程；及び
　（ｖｉ）前記工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞からネフロン前駆細胞を誘導する工程。
（工程（ｉ））
　この工程では、多能性幹細胞から後期後方エピブラストが誘導される。後期後方エピブラストは、ＣＤＸ１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｅ－ＣＡＤＨＥＲＩＮ（ＣＤＨ１）の少なくとも１つ以上のマーカーが陽性である細胞として特徴づけられ、好ましくはこれらすべてのマーカーが陽性である細胞として特徴づけられる。後期後方エピブラストはさらに、ＥＯＭＥＳ及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陰性であることが好ましい。
　工程（ｉ）では、多能性幹細胞を当該分野で公知の任意の方法で分離し、好ましくは接着培養により培養する。多能性幹細胞の分離の方法としては、例えば、力学的分離、又はプロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）及びＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる）又はコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いて解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法である。工程（ｉ）で用いるヒト多能性幹細胞としては、使用したディッシュに対して７０％～８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
　工程（ｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ－３β阻害剤及びレチノイン酸若しくはその誘導体を添加して調製することができる。工程（ｉ）において使用される培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでもよい。この場合、基礎培地に、前記成分に加えてＲＯＣＫ阻害剤を添加して、工程（ｉ）において使用される培地を調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ－２７６３２が挙げられる。工程（ｉ）で用いるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能である。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ-２７６３２である場合、例えば、０．１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、１～７５μＭ、より好ましくは、５～５０μＭである。
　ＧＳＫ－３β阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。好ましいＧＳＫ－３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。工程（ｉ）で用いるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ－３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能である。ＧＳＫ－３β阻害剤の濃度としては、ＧＳＫ－３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である場合、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、０．５～３μＭであり、特に好ましくは０．５～１．５μＭである。
　ＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ：ｂＦＧＦ）は、ヒトＦＧＦ２が好ましい。ヒトＦＧＦ２としては、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセッション番号：ＡＢＯ４３０４１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ２は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含されるＦＧＦ２は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＦＧＦ２の濃度としては、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、１０～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０～２５０ｎｇ／ｍｌである。
　ＢＭＰ４は、ヒトＢＭＰ４が好ましい。ヒトＢＭＰ４としては、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセッション番号：ＡＡＨ２０５４６．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ４は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含されるＢＭＰ４は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＢＭＰ４の濃度としては、例えば、０．１～１００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５～５ｎｇ／ｍｌである。
　レチノイン酸は、レチノイン酸そのものでもよいし、天然のレチノイン酸が有する分化誘導機能を保持するレチノイン酸誘導体でもよい。レチノイン酸誘導体として、例えば、３－デヒドロレチノイン酸、４－［［（５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２：１７－２６（１９９０））、４－［（１Ｅ）－２－（５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－１－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｙｌ］－Ｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４３：５２６８－５２７２（１９８３））、及びＴａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４０：９１４－９１９（１９８０）に記載されている化合物、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３－デヒドロレチノール、３－デヒドロレチナール等が挙げられる。
　工程（ｉ）で用いるレチノイン酸又はその誘導体の濃度としては、例えば、１～１００ｎＭが挙げられ、好ましくは、５～５０ｎＭ、より好ましくは、５～２５ｎＭである。
　工程（ｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉ）の培養時間は後期後方エピブラストが分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～２日の培養であり、好ましくは１日である。
（工程（ｉｉ））
　この工程では、後期後方エピブラストから中胚葉系譜原始線条が誘導される。中胚葉系譜原始線条は、ＣＤＸ１及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。中胚葉系譜原始線条はさらに、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＣＤＨ１が陰性であることが好ましい。
　工程（ｉｉ）では、前述の工程（ｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養容器にて接着培養してもよいし、工程（ｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
　工程（ｉｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ７を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ＦＧＦ２は、上記と同様のものを用いることができる。工程（ｉｉ）で用いるＦＧＦ２の濃度としては、工程（ｉ）で挙げたものと同様ものが挙げられる。
　ＧＳＫ－３β阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。好ましいＧＳＫ－３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。工程（ｉｉ）で用いるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度としては、使用するＧＳＫ－３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、１～７．５μＭであり、特に好ましくは２～５μＭである。工程（ｉｉ）で用いるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、工程（ｉ）における濃度より高いことが好ましい。
　ＢＭＰ７は、ヒトＢＭＰ７が好ましい。ヒトＢＭＰ７としては、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセッション番号：ＮＭ＿００１７１９．２のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ７は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含される。ＢＭＰ７は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　工程（ｉｉ）で用いられるＢＭＰ７の濃度としては、例えば、０．１～１００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、０．５～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５～５ｎｇ／ｍｌである。
　工程（ｉｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば、１０時間～２日、又は１～２日の培養であり、好ましくは０．５～１日である。
（工程（ｉｉｉ））
　この工程では、中胚葉系譜原始線条から中胚葉系譜後期原始線条が誘導される。中胚葉系譜後期原始線条は、ＣＤＸ２及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。
　工程（ｉｉｉ）では、前述の工程（ｉｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養容器にて接着培養してもよいし、工程（ｉｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
　工程（ｉｉｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＧＳＫ－３β阻害剤、ＢＭＰ７及びＴＧＦβ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ＧＳＫ－３β阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。工程（ｉｉｉ）で用いられるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度は、工程（ｉｉ）と同様とすることができる。ＧＳＫ－３β阻害剤の濃度としては、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、１～７．５μＭであり、特に好ましくは２～５μＭである。
　ＢＭＰ７は、上記と同様のものを用いることができる。工程（ｉｉｉ）で用いられるＢＭＰ７の濃度は、工程（ｉｉ）と同様とすることができる。
　ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質である。ＴＧＦβ阻害剤としては、ＴＧＦβ受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃａｎｃｅｒ，　２００３，　２：２０）、ＳＢ５０５１２４　（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、　ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、　ＳＤ９０８、ＳＤ２０８　（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、　ＬＹ５８０２７６　（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８３－０１（ＷＯ２００９１４６４０８）　及びこれらの誘導体などが例示される。ＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、Ａ８３－０１であり得る。
　工程（ｉｉｉ）で用いられるＴＧＦβ阻害剤の濃度は、ＡＬＫを阻害する濃度であれば特に限定されない。ＴＧＦβ阻害剤の濃度としては、ＴＧＦβ阻害剤がＡ８３－０１である場合、例えば、０．５～１００μＭが挙げられ、好ましくは、１～５０μＭ、さらに好ましくは、５～２５μＭである。
　工程（ｉｉｉ）で使用される培地は、ＦＧＦ２を含まない。ＦＧＦ２を含まなくても中胚葉系譜後期原始線条が誘導されるため、ＦＧＦ２を含む培地を用いる方法よりも安価に行うことができる。
　工程（ｉｉｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～３日の培養であり、好ましくは１～２日である。
（工程（ｉｖ））
　この工程では、中胚葉系譜後期原始線条から後腎系譜後期原始線条が誘導される。後腎系譜後期原始線条は、ＨＯＸ１１及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。
　工程（ｉｖ）では、前述の工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養容器にて接着培養してもよいし、工程（ｉｉｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
　工程（ｉｖ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤、アクチビン及びＲＯＣＫ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ＦＧＦ２、及びＧＳＫ－３β阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。工程（ｉｖ）で用いられるＦＧＦ２、及びＧＳＫ－３β阻害剤の濃度範囲は、工程（ｉｉ）と同様とすることができる。工程（ｉｖ）で用いられるＧＳＫ－３β阻害剤の濃度としては、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、１～７．５μＭであり、特に好ましくは２～５μＭである。工程（ｉｖ）で用いられるＦＧＦ２の濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは３０ｎｇ／ｍｌ以上であり、より好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍｌである。
　アクチビンは、ヒト由来のアクチビンであってもよく、他の動物由来のアクチビンであってもよく、これらのアクチビンの機能的改変体であってもよい。アクチビンは、アクチビンＡであってもよく、アクチビンＢであってもよく、アクチビンＡＢであってもよい。アクチビンは、例えば、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社等の市販されているものを使用することができる。好ましいアクチビンとしては、アクチビンＡが挙げられる。工程（ｉｖ）で用いるアクチビンの濃度としては、例えば、１～１００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、５～５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５～２５ｎｇ／ｍｌである。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、上記と同様のものを用いることができる。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ－２７６３２が挙げられる。工程（ｉｖ）で用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能である。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度としては、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である場合、例えば、０．１～１００μＭ、好ましくは、１～７５μＭ、さらに好ましくは、５～５０μＭである。
　工程（ｉｖ）で使用される培地は、ＢＭＰ７を含まないものであってもよい。ＢＭＰ７を含まない培地を用いることにより、より安価に工程（ｉｖ）を実施することができる。
　工程（ｉｖ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｖ）の培養時間は後腎系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～５日の培養であり、好ましくは３日である。
（工程（ｖ））
　この工程では、後腎系譜後期原始線条から後期後方中間中胚葉が誘導される。中間中胚葉は、ＯＳＲ１、ＨＯＸ１１およびＷＴ１が陽性である細胞として特徴づけられる。
　工程（ｖ）では、前述の工程（ｉｖ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養容器にて接着培養してもよいし、工程（ｉｖ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
　工程（ｖ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にレチノイン酸若しくはその誘導体を添加して調製することができる。工程（ｖ）において使用される培地は、ＢＭＰ阻害剤を含んでもよい。この場合、基礎培地に、前記成分に加えてＢＭＰ阻害剤を添加して、工程（ｖ）において使用される培地を調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰの機能を阻害する物質である。ＢＭＰ阻害剤としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、ＮＯＧＧＩＮ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、などのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ　（すなわち、６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３－４１；Ｊ．Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）及びＬＤＮ１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。
　好ましいＢＭＰ阻害剤としてはＮＯＧＧＩＮが挙げられる。工程（ｖ）で用いられるＢＭＰ阻害剤の濃度としては、ＢＭＰ阻害剤がＮＯＧＧＩＮである場合、例えば、１～１００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは。１０～５０ｎｇ／ｍｌである。
　工程（ｖ）で使用される培地は、ＦＧＦ９を含まない。ＦＧＦ９を含まなくても後期後方中間中胚葉が誘導されるため、ＦＧＦ９を含む培地を用いる方法よりも安価に行うことができる。工程（ｖ）で使用される培地は、ＦＧＦ２０を含まなくてもよい。
　工程（ｖ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｖ）培養時間は後期後方中間中胚葉が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～３日の培養であり、好ましくは２日である。
（工程（ｖｉ）
　この工程では、後期後方中間中胚葉からネフロン前駆細胞が誘導される。ネフロン前駆細胞は、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２及びＳＡＬＬ１が陽性である。
　工程（ｖｉ）では、前述の工程（ｖ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養容器にて接着培養してもよいし、工程（ｖ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
　工程（ｖｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地にＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を添加して調製することができる。工程（ｖｉ）において使用される培地は、ヘパリンを含んでもよい。この場合、基礎培地に、前記成分に加えてヘパリンを添加して、工程（ｖｉ）において使用される培地を調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
　ヘパリンは、塩の形態であることが好ましい。ヘパリンの塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄などの金属との塩；アンモニウム塩；有機塩基との塩；及びアミノ酸との塩等が挙げられる。中でも、ヘパリンは、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
　工程（ｖｉ）で用いられるヘパリンの濃度としては、例えば、０．０１～１００μｇ／ｍｌが挙げられ、好ましくは、０．０５～５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．１～１０μｇ／ｍｌである。
　ＧＳＫ－３β阻害剤、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０は、上記と同様のものを用いることができる。ＧＳＫ－３β阻害剤の濃度としては、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、０．５～３μＭ、特に好ましくは０．５～１．５μＭである。ＦＧＦ９又はＦＧＦ２０の濃度（或いはＦＧＦ９及びＦＧＦ２０の合計濃度）としては、例えば、１～５００ｎｇ／ｍｌが挙げられ、１０～３００ｎｇ／ｍｌ、５０～２００ｎｇ／ｍｌである。
　工程（ｖｉ）において、培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われる。ＣＯ2濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。工程（ｖｉ）の培養時間はネフロン前駆細胞が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１～５日の培養であり、好ましくは２日である。
　上記工程（ｉ）～（ｖｉ）において用いる基礎培地は、上記＜ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地＞で記載したものと同様のものを用いることができる。基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地に、Ｂ２７、ＡＳ４０１、及びＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等を添加したものを用いることができる。基礎培地の具体例としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘに、Ｂ２７、１０％　ＡＳ４０１、又は２０％　ＡＳ４０１を添加した培地が挙げられ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘに、１０％　ＡＳ４０１を添加した培地が好ましい。
　上記工程（ｉ）～（ｖｉ）において用いる培養容器は、特に限定されない。培養容器としては、例えば、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、バイオリアクター、及び細胞培養用バッグ等が挙げられる。培養容器としては、接着培養が可能な培養容器を用いることが好ましい。培養容器の細胞接着面（例えば、培養容器の底面）の面積としては、例えば、１～１０００ｃｍ２が挙げられる。培養容器は、細胞接着面が４００ｃｍ２以上である培養容器を用いてもよい。培養容器の細胞接着面の面積としては、例えば、４００～８００ｃｍ２、４００～７００ｃｍ２、及び４００～６００ｃｍ２等が挙げられる。工程（ｉ）～（ｖｉ）を含む分化誘導方法では、前記のような大容量の培養容器を用いても、ネフロン前駆細胞を分化誘導することができる。大容量の培養容器を用いることにより、ネフロン前駆細胞の細胞収量を増加させることができる。工程（ｉ）～（ｖｉ）では、培地交換のタイミング、又は細胞の播種のタイミングで、培養容器を変更してもよい。例えば、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）では、中容量の培養容器（例えば、細胞接着面５０～２００ｃｍ２）を用い、工程（ｉｖ）～（ｖｉ）では大容量の培養容器（細胞接着面４００ｃｍ２以上）を用いてもよい。
　接着培養とは細胞が培養基材に接着した状態で培養されることを意味し、例えば、コーティング処理された培養容器にて培養することを意味する。コーティング剤としては、細胞外基質が好ましく、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン及びラミニンといった物質又はこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの細胞からの調製物であってもよい。細胞外基質は好ましくは、ラミニン又はその断片である。本発明においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖及び３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４又はα５であり、β鎖は、β１、β２、β３又はβ４であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２又はγ３が例示される。ラミニンは、より好ましくは、α５、β１及びγ１からなるラミニン５１１である（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２８，６１１－６１５（２０１０））。ラミニンは断片であってもよく、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメント（ラミニン５１１Ｅ８）（ＥＭＢＯ　Ｊ．，　３：１４６３－１４６８，１９８４、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１０５：５８９－５９８，１９８７、ＷＯ２０１１／０４３４０５）であってもよい。ラミニン５１１Ｅ８は市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
　前記工程（ｉ）～（ｖｉ）により得られたネフロン前駆細胞を、第１の態様の培地で培養することにより、拡大培養することができる。あるいは、前記工程（ｉ）～（ｖｉ）により得られたネフロン前駆細胞を、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）、任意に工程（Ｃ）～（Ｅ）を含む方法に供することにより、拡大培養することができる。工程（Ａ）～（Ｅ）でも、上記工程（ｉ）～（ｖｉ）で説明した培養容器と同様の培養容器を用いることができる。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いてネフロン前駆細胞を培養するため、分化能を維持したまま、ネフロン前駆細胞を良好に増殖させることができる。また、継代培養してもネフロン前駆細胞の分化能が維持されるため、ネフロン前駆細胞を長期間維持することができる。本態様の方法で拡大培養されたネフロン前駆細胞は、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。また、本態様の方法で培養されたネフロン前駆細胞は、腎臓オルガノイド形成能を維持しているため、後述の腎臓オルガノイドの製造のために用いることができる。
＜腎臓オルガノイドの製造方法＞
　本発明の第３の態様は、腎臓オルガノイドの製造方法である。本態様の腎臓オルガノイドの製造方法は、前記第２の態様の方法により、ネフロン前駆培養を拡大培養する工程（拡大培養工程）と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程（分化工程）と、を含む。
（拡大培養工程）
　拡大培養工程は、前記第２の態様の方法により行う。本工程により、分化能を維持したまま、ネフロン前駆細胞を所望の数まで良好に増殖させることができる。
（分化工程）
　ネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドへの分化は、公知の方法により行うことができる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）で報告されている方法等を用いることができる。例えば、前記拡大培養工程で得られたネフロン前駆細胞の細胞塊を、３Ｔ３－Ｗｎｔ４細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、又はマウス胎仔腎細胞と共培養してもよい。あるいは、ネフロン前駆細胞の細胞塊を、ＧＳＫ－３β阻害剤を含む基礎培地を使用した半気相培養（好ましくは、気相－液相培養；Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）参照）で培養してもよい。前記半気相培養で使用する培地は、ＧＳＫ－３β阻害剤に加えて、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２等を含んでいてもよい。基礎培地、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＦＧＦ２としては、上記と同様のものが挙げられる。好ましい基礎培地としてはＫＳＲが挙げられる。好ましいＧＳＫ－３β阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。好ましいＦＧＦ２としてはヒトＦＧＦ２が挙げられる。好ましいＦＧＦ９としては、ヒトＦＧＦ９が挙げられる。ヒトＦＧＦ９としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２００１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９は腎臓オルガノイドへの分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含される。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。前記において、ＦＧＦ９は、ＦＧＦ２０に代替してもよい。あるいは、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２０を併用してもよい。
　分化工程における培養条件は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件を用いることができる。培養温度は、腎臓オルガノイドに分化誘導できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　本態様の製造方法により得られた腎臓オルガノイドは、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。
（他の工程）
　本態様の製造方法は、上記工程に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、前記拡大培養工程の前に、多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導する工程が挙げられる。多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の誘導は、公知の方法により行うことができる。
＜他の態様＞
　本発明は、前記第２の態様の方法で得られたネフロン前駆細胞又は前記第３の態様の製造方法で得られた腎臓オルガノイドを含む医薬組成物もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドを含む腎疾患治療剤もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドの治療有効量を、腎疾患を有する対象又は腎疾患のリスクを有する対象に投与する工程を含む、腎疾患を治療又は予防する方法もまた提供する。本発明は、前記第１の態様の培地でネフロン前駆細胞を培養する工程を含む、腎疾患治療用細胞の製造方法もまた提供する。
　腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記ネフロン前駆細胞の投与方法としては、例えば、前記ネフロン前駆細胞をシート化して、対象の腎臓に貼付する方法；前記ネフロン前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液を対象の腎臓に移植する方法；前記ネフロン前駆細胞を三次元培養（例えば、Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ　１１，２０１２；２３（３）：６３７－６５１）し、得られた細胞塊を対象の腎臓に直接移植する方法；前記ネフロン前駆細胞をマトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた細胞塊を対象の腎臓に移植する方法等が挙げられる。移植部位は、腎臓内であれば特に限定されないが、好ましくは、腎被膜下である。腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記腎臓オルガノイドの投与方法としては、対象の体内（例えば、腹腔内）に移植する方法等が挙げられる。
　治療又は予防対象となる腎疾患は、特に限定されないが、例えば、急性腎障害、慢性腎不全、慢性腎不全にまで至らない慢性腎臓病等が挙げられる。移植する前記ネフロン前駆細胞の細胞数又は前記腎臓オルガノイドの大きさは、移植後に生着できれば特に限定されず、疾患部位の大きさ、投与対象の体躯、年齢、性別等に合わせて、適宜調整することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料と方法］
＜動物実験＞
　全ての動物実験は、京都大学動物実験委員会の承認を得て行った。ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ　マウスは、日本チャールス・リバー株式会社から購入した。京都大学ｉＰＳ細胞研究所の実験動物施設で、特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件で飼育した。マウスには、餌及び水を自由給餌した。
＜ヒトｉＰＳ細胞からのネフロン前駆細胞（ｈＮＰＣ）の誘導＞
　健常人由来ヒトｉＰＳ細胞株である４Ａ６株（２０１Ｂ７由来）を国際公開第２０１８／２１６７４３号に記載の方法を用いて２４ウェルプレート上でヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣに分化誘導後、Ａｃｃｕｍａｘ　１００μＬを添加し３０分間、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターに静置した。３０分後、１０％ＦＢＳ　９００μＬで懸濁した。懸濁した細胞をＴＣ２０で細胞数を測定し、フローサイトメトリーに必要な細胞を１．５ｍｌチューブに移し、２００ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を除去して、１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓに対して、２％ＦＢＳ　１００μＬの比率となるように懸濁した。
＜ｃ－ＭＥＴ陽性細胞の純化＞
　上記のように誘導したｈＮＰＣを懸濁した２％ＦＢＳ　１００μＬに対して、蛍光物質であるＡＰＣが接合されたｈｕｍａｎ－ＨＧＦＲ／ｃ－ＭＥＴ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ　３５８２Ａ）１０μＬを添加し、氷上で３０分静置した。３０分後、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再び、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した。この操作を２回行った。上清を除いた細胞を、ＤＡＰＩを１，０００倍で希釈した２％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍのＦｉｌｔｅｒに通した後、フローサイトメトリーを用いて、ｃ－ＭＥＴ陽性の細胞を抽出した。
　本明細書では、ｃ－ＭＥＴ陽性細胞の純化を行っていないｈＮＰＣを「ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）」という。ｃ－ＭＥＴ陽性細胞の純化を行ったｈＮＰＣを「ｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））」という場合がある。
＜拡大培養用培地＞
　拡大培養用の試験培地として、ｈＮＰＳＲ培地、ＣＦＹ培地、及びＣＦＹ培地にＤＭＳＯ若しくはＤＭＳＯに溶解したＪＡＫ阻害剤（ＪＡＫ２阻害剤：ＴＧ１０１３４８（最終濃度３ｎＭ））を添加した培地を用いた。
　ｈＮＰＳＲ培地の組成を表１に示す。ｈＮＰＳＲ培地は、表１に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表１に示す試薬を添加して作製した。ＣＦＹ培地の組成を表２に示す。ＣＦＹ培地は、表２に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表２に示す試薬を添加して作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜細胞増殖＞
　ｈＮＰＣを、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓとなるように、５０μＬの試験培地で懸濁し、低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始６時間後には細胞塊が形成された。
　静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ培地を１００μＬずつ追加投与した。培地を追加投与してから４８時間後に、各ウェルから１００μＬの上清を除去し、新しい培地１００μＬを添加した。以後、同様の操作を４８時間毎に行った。浮遊培養開始後７日に、各ウェルの細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
＜継代培養＞
　試験培地で培養したヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣ（ｈＮＰＣ）の細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓのヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣを、試験培地で懸濁し播種した。細胞を播種したＬｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始４８時間後に、試験培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加投与した。培地の追加投与後４８時間で、上記と同様の操作を行い、細胞数の測定と継代を行った。
＜腎臓オルガノイドの作製＞
　試験培地で、継代培養したｈＮＰＣの細胞塊を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にのせ、周囲の培地を除去した。次に、あらかじめ、２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２及び５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たした培養皿に、細胞塊がのったＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした。４８時間後に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲに培地交換した。以後、４８時間毎に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲで培地交換し、分化培養開始１０日目に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのまま４％ＰＦＡを用いて４℃で３時間固定した。固定後、ＰＢＳに置換し、４℃で一晩静置し、免疫染色を行った。
＜ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現確認＞
　ＯＳＲ１遺伝子座にＧＦＰコード領域を導入したＯＳＲ１－ＧＦＰレポーター遺伝子を有し、且つＳＩＸ２遺伝子にｔｄＴｏｍａｔｏコード領域を連結したＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子が導入されたヒトｉＰＳ細胞を樹立した。ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現は、前記ヒトｉＰＳ細胞を用いて培養試験を行い、ＧＦＰ及びｔｄＴｏｍａｔｏの各蛍光を蛍光顕微鏡で検出することで確認した。
＜腎臓オルガノイドのイメージング＞
　腎臓オルガノイドの明視野画像を、ＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－Ｘ７００又は共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ７１０）で撮影した。画像解析は、Ｉｍａｇｅ　Ｊ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５１ｊ８（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）を用いて行った（Ｃ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．９（２０１２）６７１－６７５．）。
＜ｈＮＰＣの投与試験＞
　８～１２週齢のオスのＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ　マウス（以下「ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス」という）に対して、生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに調整したシスプラチンを、２１ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射し、シスプラチン誘発性急性腎障害（ＡＫＩ）モデルを作製した。シスプラチン投与２４時間後に、イソフルランで全身麻酔下のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの左下背側部を約１ｃｍ皮膚切開し、続いて、後腹膜を約１ｃｍ切開することで左腎を体外に露出した。露出した腎臓に、２４ゲージのサーフロー留置針を穿刺し、腎被膜下に外筒を留置した。外筒を介してシリンジで空気を送気又は生理食塩水を注入することで、腎被膜と腎実質を剥離した。続いて２４ゲージのサーフロー留置針の外筒を抜去し、同じ穿刺部位から、ＣＦＹ培地で１継代又は２継代拡大培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊（約３．０　ｘ　１０６細胞相当）を、吸引した２２ゲージのサーフロー留置針の外筒を挿入し、ゆっくりと細胞を注入した（細胞移植）。生食群では、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の代わりに、１５μＬの生理食塩水を腎被膜下に注入した。
　細胞を注入後、２２ゲージのサーフロー留置針の外筒を抜去し、穿刺部位から細胞の流出及び出血がないことを確認後、露出した腎臓を後腹膜内に戻し、後腹膜及び皮膚を４－０ブレードシルク縫合糸で縫合した。
　シスプラチン投与９６時間後（細胞移植７２時間後）に、眼下静脈叢より１００～２００μＬの採血を行い、遠心分離して血清を得た。続いて、遠心分離して得られた血清を用いて、富士ドライケムＮＸ５００で、血清クレアチニン（Ｓ－Ｃｒｅ）及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。
（実施例１）
　ＣＦＹ培地及びｈＮＰＳＲ培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、培養細胞について、細胞増殖、ＮＰＣマーカーの発現、及び腎オルガノイド形成能を確認した。
＜ＣＦＹ培地によるｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の維持培養＞
　ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地を用いて、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、各継代培養において、ＮＰＣマーカーであるＳＩＸ２及びＯＳＲ１の発現が維持されるかを確認した。
　結果を図１に示す。ｈＮＰＳＲ培地で継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）は、ＯＳＲ１の発現は３継代目まで検出されたが、ＳＩＸ２の発現は２継代目からほとんど検出されなくなった。一方、ＣＦＹ培地で継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）は、１～３継代のいずれでも、ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の両方の発現が検出された。この結果から、ＣＦＹ培地による継代培養は、ＮＰＣマーカーの発現が維持されやすいことが確認された。すなわち、ＣＦＹ培地を用いることにより、ＮＰＣとしての性質を維持したまま、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を継代培養できることが確認された。
＜ＣＦＹ培地で継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）からの腎臓オルガノイドの作製＞
　ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地を用いて継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図２に示す。ｈＮＰＳＲ培地で継代培養した場合、１継代目のｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）からは腎臓オルガノイドが形成された。しかしながら、２継代目及び３継代目のｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）からは腎臓オルガノイドが形成されなかった。一方、ＣＦＹ培地で継代培養した場合、１～３継代のいずれのｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）からでも腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地を用いることにより、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を継代培養できることが確認された。
＜ＣＦＹ培地を用いたｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養における細胞増殖＞
　ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、細胞数を測定した。
　結果を図３及び図４に示す。図３は、各継代培養における細胞から算出した累積細胞数を示す。継代数１における累積細胞数は、継代数０で増殖させた細胞数をａ、継代数０の培養液の容量をｂ、継代に用いたＰ０の培養液の容量をｃ、Ｐ１で増殖させて得た細胞数をｄとした場合、継代数１の累積細胞数＝ａ×［ｄ／（ａ×ｃ／ｂ）］×ｂ／ｃで算出することができる。以降の継代培養における累積細胞数も同様に算出される。
　図３及び図４に示すように、ｈＮＰＳＲ培地又はＣＦＹ培地のいずれを用いた場合でも、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の増殖が促進された。ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の増殖促進効果は、ＣＦＹ培地と比較して、ｈＮＰＳＲ培地の方が高かった。
（実施例２）
　ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、培養細胞について、細胞増殖、ＮＰＣマーカーの発現、及び腎オルガノイド形成能を確認した。
＜ＪＡＫ阻害剤による細胞増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の培養を行い、細胞数を測定した。
　結果を図５に示す。ＣＦＹ培地にＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））で培養した場合、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）での培養と比較して、細胞増殖が促進された。この結果から、ＪＡＫ阻害剤を添加することにより、ＣＦＹ培地におけるｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の増殖促進効果が向上することが確認された。
＜ＪＡＫ阻害剤添加ＣＦＹ培地によるｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の維持培養＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地、又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いて、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、各継代培養において、ＮＰＣマーカーであるＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現が維持されるかを確認した。
　結果を図６に示す。ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（＋ＤＭＳＯ）、ＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（＋ＴＧ（３））のいずれにおいても、３継代目まで、ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の両方の発現が維持された。この結果から、ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いて、ＮＰＣとしての性質を維持したまま、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を継代培養できることが確認された。
＜ＪＡＫ阻害剤添加ＣＦＹ培地で継代培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）からの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地、又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の継代培養を行い、２継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図７に示す。ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（＋ＤＭＳＯ）、ＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（＋ＴＧ（３））のいずれにおいても、２継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。ここの結果から、ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）を継代培養できることが確認された。
（実施例３）
　ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、培養細胞について、細胞増殖、ＮＰＣマーカーの発現、及び腎オルガノイド形成能を確認した。
＜ｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養におけるＪＡＫ阻害剤の増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、細胞数を測定して累積細胞数を算出した。
　結果を図８に示す。ＣＦＹ培地にＴＧ１０１３４８を添加した培地（ＣＦＹ＋ＴＧ（３））で培養した場合、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（ＣＦＹ＋ＤＭＳＯ）での培養と比較して、いずれの継代においても細胞増殖が促進された。この結果から、ＪＡＫ阻害剤を添加することにより、ＣＦＹ培地におけるｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の増殖促進効果が向上することが確認された。
＜ＪＡＫ阻害剤添加ＣＦＹ培地によるｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の維持培養＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地、又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いて、ｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、各継代培養において、ＮＰＣマーカーであるＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現が維持されるかを確認した。
　結果を図９に示す。ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（＋ＤＭＳＯ）、ＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（＋ＴＧ（３））のいずれにおいても、３継代目まで、ＯＳＲ及びＳＩＸ２の両方の発現が維持された。この結果から、ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いて、ＮＰＣとしての性質を維持したまま、ｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））を継代培養できることが確認された。
＜ＪＡＫ阻害剤添加ＣＦＹ培地で継代培養したｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））からの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地、又はＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８（ＪＡＫ２阻害剤）を添加した培地を用いてｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））の継代培養を行い、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図１０に示す。ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地（＋ＤＭＳＯ）、ＣＦＹ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地（＋ＴＧ（３））のいずれにおいても、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地にＪＡＫ阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｈＮＰＣ（ｃ－ＭＥＴ（＋））を継代培養できることが確認できた。
（実施例４）
　ＣＦＹ培地で拡大培養したｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊を、ＡＫＩマウスの腎被膜下に移植し、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）による治療効果を確認した。
　１継代及び２継代したｈＮＰＣ細胞塊の移植結果を、それぞれ図１１及び図１２に示す。図１１及び図１２中、「正常」は、正常マウス、「生食」は、生理食塩水を腎被膜下に投与したＡＫＩマウス、「ＮＰＣ移植」は、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊を腎被膜下に移植したＡＫＩマウスを示す。生理食塩水を投与したＡＫＩマウスは、正常マウスと比較して、ＢＵＮ及びＳ－Ｃｒｅの数値が有意に高くなっており、腎機能障害が確認された。一方、ｈＮＰＣ（Ｂｕｌｋ）の細胞塊を移植したマウスでは、１継代ｈＮＰＣ及び２継代ｈＮＰＣのいずれにおいても、生理食塩水を投与したマウスと比較して、ＢＵＮ及びＳ－Ｃｒｅの数値が有意に低くなっており、腎機能の改善がみられた。これらの結果から、ＣＦＹ培地で拡大培養したｈＮＰＣを移植することにより、腎機能障害を改善できることが確認された。
　上述の実施例１～４では、国際公開第２０１８/２１６７４３号に記載の方法に基づく、以下の分化誘導法Ａにより分化誘導したＮＰＣを用いた。
＜分化誘導法Ａ＞
　１．未分化ｈｉＰＳＣ細胞をａｃｃｕｔａｓｅ処理にて単細胞化した後に１０μＭのＹ－２７６３２および１．２５　μＬ　ｉＭａｔｒｉｘ（ニッピ）を添加した５００　μＬのＡＫ０２Ｎ培地（味の素）に懸濁し、２４ｗｅｌｌプレートに１．０×１０４細胞／ｗｅｌｌ～５．０×１０４細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し２４時間３７℃でインキュベート。
　２．２４時間後（ｄａｙ１）にＢ２７（Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を基礎培地とし、１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１０ｎＭ　レチノイン酸、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ４、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２を添加した培地で培地交換。（後期後方エピブラストの作製・・・１）
　３．Ｄａｙ２に同基礎培地に、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２　を添加した培地に培地交換　（中胚葉系譜原始線条の作製・・・２）
　４．Ｄａｙ３に同基礎培地に、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２、１０μＭ　Ａ８３－０１を添加した培地に培地交換（中胚葉系譜後期原始線条の作製・・・３）
　５．Ｄａｙ４、Ｄａｙ５、Ｄａｙ６に同基礎培地に、３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍｌ　アクチビン、３０μＭ　Ｙ－２７６３２を添加した培地に培地交換（後腎系譜後期原始線条の作製・・・４）
　６．Ｄａｙ７、Ｄａｙ８に、同基礎培地に２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９、１００ｎＭ　レチノイン酸、２５ｎｇ／ｍｌ　ＮＯＧＧＩＮを添加した培地に培地交換（後期後方中間中胚葉の作製・・・５）
　７．Ｄａｙ９、Ｄａｙ１０、Ｄａｙ１１に、同基礎培地に２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９、１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加した培地に培地交換（腎前駆細胞（ネフロン前駆細胞）の作製・・・６）
（実施例５）
　以下のプロトコールにてヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）からｈＮＰＣが分化誘導されるか検討した。ｈｉＰＳＣは２０１Ｂ７由来のＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞を使用した。
＜ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導する方法（分化誘導法Ｂ）＞
　１．未分化ｈｉＰＳＣをＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ　Ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｉｂｃｏ）処理にて単細胞化した後にＢ２７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を基礎培地とし、１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１０ｎＭ　レチノイン酸、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ４、１００ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ２、１０μＭ　Ｙ－２７６３２、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ）を添加した培地で、１．０×１０４細胞／ｗｅｌｌ～５．０×１０４細胞／ｗｅｌｌの密度で播種し２４時間３７℃でインキュベート。（後期後方エピブラストの作製：工程１）
　２．Ｄａｙ１に、同基礎培地に５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２を添加した培地に培地交換（中胚葉系譜原始線条の作製：工程２）
　３．Ｄａｙ２に、同基礎培地に５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２、１０μＭ　Ａ８３－０１を添加した培地に培地交換（中胚葉系譜後期原始線条の作製：工程３）
　４．Ｄａｙ３に、同基礎培地に５μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２、１ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ７、１０ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡ、３０μＭ　Ｙ－２７６３２を添加した培地に培地交換（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）
　５．Ｄａｙ６に、同基礎培地に１００ｎＭ　レチノイン酸、２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９、２５ｎｇ／ｍｌ　Ｎｏｇｇｉｎを添加した培地に培地交換（後期後方中間中胚葉の作製：工程５）
　６．Ｄａｙ８に、同基礎培地に１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９を添加した培地に培地交換（ｈＮＰＣの作製：工程６）
　また、前記分化誘導法Ｂの４（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２；３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリン；１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２；１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリン；又は０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２としたこと以外は、分化誘導法Ｂと同様の方法で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　分化誘導されたｈＮＰＣについて、ＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を図１３に示す。ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞におけるＳＩＸ２陽性細胞の割合を示した。前記４（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）において、ＦＧＦ２の濃度を１０ｎｇ／ｍＬ以下とすると、ｈＮＰＣへの誘導効率が低下した。ヘパリンの存在はｈＮＰＣの誘導効率に影響しなかった。
（実施例６）
　前記分化誘導法Ｂのプロトコールに従って、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　また、前記分化誘導法Ｂの３（中胚葉系譜後期原始線条の作製：工程３）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２；又は１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２とし、さらに前記分化誘導法Ｂの４（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２としたたこと以外は、分化誘導法Ｂと同様の方法で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　分化誘導されたｈＮＰＣについて、ＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を図１４に示す。ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞におけるＳＩＸ２陽性細胞の割合を示した。前記３（中胚葉系譜後期原始線条の作製：工程３）において、ＦＧＦ２の濃度は、ｈＮＰＣへの誘導効率に影響しなかった。
（実施例７）
　前記分化誘導法Ｂのプロトコールに従って、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　また、前記分化誘導法Ｂの５（後期後方中間中胚葉の作製：工程５）において、２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９に替えて、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９；１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリン；２５ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９；２５ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリン；１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９；１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリン；又は０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９とし、さらに前記分化誘導法Ｂの４（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２としたこと以外は、分化誘導法Ｂと同様の方法で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　分化誘導されたｈＮＰＣについて、ＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を図１５に示す。ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞におけるＳＩＸ２陽性細胞の割合を示した。前記５（後期後方中間中胚葉の作製：工程５）において、ＦＧＦ９の濃度は、ｈＮＰＣへの誘導効率に影響しなかった。ヘパリンの存在はｈＮＰＣの誘導効率に影響しなかった。
（実施例８）
　前記分化誘導方法Ｂのプロトコールに従って、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　また、前記分化誘導法Ｂの２～６において、基礎培地として、１０％若しくは２０％　ＡＳ４０１（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）　ｆｏｒ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、味の素ヘルシーサプライ株式会社）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用い、さらに前記分化誘導法Ｂの３（中胚葉系譜後期原始線条の作製：工程３）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２とし、さらに前記分化誘導法Ｂの４（後腎系譜後期原始線条の作製：工程４）において、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２に替えて、３０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ２とし、さらに前記分化誘導法Ｂの５（後期後方中間中胚葉の作製：工程５）において、２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９に替えて、０ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９とし、前記分化誘導法Ｂの６（ｈＮＰＣの作製：工程６）において、２００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９に替えて、１００ｎｇ／ｍｌ　ＦＧＦ９及び０．１８Ｕ／ｍｌ（１μｇ／ｍＬ）　ヘパリンとしたこと以外は、分化誘導法Ｂと同様の方法で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。
　分化誘導されたｈＮＰＣについて、ＳＩＸ２陽性細胞の分化誘導効率を確認した結果を図１６に示す。図１６では、ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞におけるＳＩＸ２陽性細胞の割合を示した。１０％　ＡＳ４０１を添加した基礎培地を用いたもので、ｈＮＰＣの誘導効率が向上する傾向が確認された。
（実施例９）
　ｈｉＰＳＣとして、臨床用ｈｉＰＳＣストック株を用いたこと以外は、実施例８と同様に、ｈＮＰＣを分化誘導した（分化誘導法Ｂ）。本実施例では、基礎培地として、Ｂ２７、若しくは１０％　ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。
　分化誘導されたｈＮＰＣについて、ＳＩＸ２の発現を確認した結果を図１７に示す。１０％ＡＳ４０１を添加した基礎培地を用いたもので、ｈＮＰＣの誘導効率が向上する傾向が確認された。
（実施例１０）
　図１８に示す条件で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した（以下、「分化誘導法Ｃ」という）。基礎培地は、１０％　ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。Ｓｍａｌｌ　ｓｃａｌｅでは、Ｓｔａｇｅ　１で２４ｗｅｌｌプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ，６６２１６０）にｉＰＳ細胞を播種し、Ｓｔａｇｅ４の１日目終了後に２４ｗｅｌｌプレートに細胞を再播種した。Ｓｔａｇｅ６の２日目終了後に、ｈＮＰＣを回収し、低接着９６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ　プレート　９６Ｕ（住友ベークライト株式会社、ＭＳ－９０９６Ｕ））を用いてＣＦＹ培地で拡大培養した。Ｌａｒｇｅ　ｓｃａｌｅでは、Ｓｔａｇｅ　１でＴ１５０フラスコ又はＴ７５フラスコ（Ｉｗａｋｉ）にｉＰＳ細胞を播種し、Ｓｔａｇｅ４の１日目終了後に５１２ｃｍ２プレート（住友ベークライト、接着細胞培養ピールオフ培養容器５１２、　ＭＳ－２８５００）に細胞を再播種した。Ｓｔａｇｅ６の２日目終了後に、ｈＮＰＣを回収し、低接着９６ｗｅｌｌプレートを用いてＣＦＹ培地で拡大培養した。
　図１９は、Ｓｍａｌｌ　ｓｃａｌｅの分化誘導法（分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ））で、ＨＬＡホモストックｈｉＰＳＣ（Ｆｆ１４ｓ０４）株から誘導されたｈＮＰＣのＳＩＸ２発現を免疫染色にて確認した結果を示す。
　図２０は、図１８におけるＳｍａｌｌ　ｓｃａｌｅ（分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ））又はＬａｒｇｅ　ｓｃａｌｅ（分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ））の分化誘導法を実施した細胞の形態写真及びＳＩＸ２発現量を示す。Ｓｔａｇｅ　６の形態写真及びＳＩＸ２の発現量から、Ｓｍａｌｌ　ｓｃａｌｅ及びＬａｒｇｅ　ｓｃａｌｅのいずれの培養でも、ｈＮＰＣが分化誘導されることが確認された。拡大培養後７日目の形態写真から、Ｓｍａｌｌ　ｓｃａｌｅ及びＬａｒｇｅ　ｓｃａｌｅのいずれの培養から分化誘導されたｈＮＰＣでも、ＣＦＹ培地による拡大培養が可能なことが確認された。
（実施例１１）
　分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。基礎培地は、１０％ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。
　分化誘導法Ｃ（Ｌａｒｇｅ）でのＳｔａｇｅ　６後の細胞収量を図２１に示す。本実施例の方法により、１０８スケールのｈＮＰＣを製造できることが確認された。
　図２２は、Ｓｔａｇｅ　６後のｈＮＰＣのＳＩＸ２発現を免疫染色にて確認した蛍光画像を示す。
（実施例１２）
　拡大培養において、添加物の影響を比較するために、Ｂ２７に替えて１０％　ＡＳ４０１を添加したＣＦＹ培地（ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）、又はＢ２７に替えて２０％　ＡＳ４０１を添加したＣＦＹ培地（ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）、及びＣＦＹ培地を調製した。
　分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。基礎培地は、１０％　ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。Ｓｔａｇｅ　６後のｈＮＰＣを回収し、低接着９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＣＦＹ培地、ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）、又はＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）で拡大培養した。
　図２３に、拡大培養中のｈＮＰＣの形態写真を示す。ＣＦＹ培地又はＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）を用いた場合、ｈＮＰＣ塊の形態が楕円形に変化した。一方、ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）を用いた場合、ｈＮＰＣ塊の形態は円形に維持された。
　図２４に、増殖率を示す。ｈＮＰＣは、ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）で最も良好な増殖率を示した。
　これらの結果から、ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）が、ｈＮＰＣの拡大培養に最も適していると考えられた。
（実施例１３）
　分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。基礎培地は、１０％　ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。Ｓｔａｇｅ　６後のｈＮＰＣを回収し、低接着９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＣＦＹ培地、ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）、又はＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋２０％　ＡＳ４０１）で拡大培養した。
　拡大培養７日目のｈＮＰＣの細胞塊３×１０６　ｃｅｌｌｓ相当を、ＡＫＩマウスの腎被膜下に移植し、ｈＮＰＣによる治療効果を確認した。
　血液中の尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニン（Ｓ－Ｃｒｅ）を測定した結果を図２５及び図２６にそれぞれ示す。Ｃｔｌ群を含めた４群間での有意差は検出されなかったが、移植群でＢＵＮ、Ｓ－Ｃｒｅとも改善傾向が認められた。　
（実施例１４）
　分化誘導法Ｃ（Ｓｍａｌｌ）で、ｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。基礎培地は、１０％ＡＳ４０１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。Ｓｔａｇｅ　６後のｈＮＰＣを回収し、低接着９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＣＦＹ培地、又はＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）で拡大培養した。
　拡大培養７日目のｈＮＰＣの細胞塊の遺伝子発現を確認した結果を図２７に示す。ＣＦＹ培地（－Ｂ２７，＋１０％　ＡＳ４０１）で拡大培養した方が、ＮＰＣマーカー及び血管新生関連遺伝子の発現が高い傾向にあった。
（実施例１５）
　ＣＦＹ培地におけるＦＧＦ９の効果を確認するため、ＣＦＹ培地のＦＧＦ９に替えて３００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した培地（ＣＦＹ培地（－ＦＧＦ９，＋ＦＧＦ２））を調製した。
　分化誘導法ＡにてｈｉＰＳＣからｈＮＰＣを分化誘導した。基礎培地は、Ｂ２７（Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｍｉｎｕｓ　ｖｉｔａｍｉｎ　Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘを用いた。Ｓｔａｇｅ　６後のｈＮＰＣを回収し、低接着９６ｗｅｌｌプレートを用いて、ＣＦＹ培地又はＣＦＹ培地（－ＦＧＦ９，＋ＦＧＦ２）で拡大培養した。
　拡大培養後７日目に、光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡で細胞塊を観察し、光学顕微鏡で観察される形態と、蛍光顕微鏡で観察されるＮＰＣマーカー（ＯＳＲ１、ＳＩＸ２）の発現とを比較した。結果を図２８に示す。ＦＧＦ９を含む培地で拡大培養した方が、ＮＰＣマーカーの発現が高かった。
（実施例１６）
　ＣＦＹ培地又はＣＦＹ培地（－ＦＧＦ９，＋ＦＧＦ２）を用いて拡大培養したｈＮＰＣから腎臓オルガノイドへの分化誘導を行った。
　結果を図２９に示す。ＦＧＦ９を含む培地で拡大培養した方が、腎臓オルガノイド（色が薄い部分）の面積が増加しており、腎臓オルガノイドの形成が良好であった。
（実施例１７）
　ＣＦＹ培地におけるＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）の効果を確認するため、ＣＦＹ培地からＲＯＣＫ阻害剤を除いた培地（ＣＦ培地）を調製した。
　ＣＦＹ培地で維持していたｈＮＰＣをＣＦＹ培地に継代した。継代２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地に培地交換（１回目培地交換）した。次いで、１回目培地交換から２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地にさらに培地交換（２回目培地交換）した。２回目培地交換から２日後に、ＣＦＹ培地に継代した。このサイクルで３継代まで継代培養した。
　継代のタイミングで細胞を採取し、フローサイトメトリーでＮＰＣマーカー陽性細胞（ＯＳＲ１、ＳＩＸ２）を解析した。
　結果を図３０及び図３１に示す。継代から２日後以降の培地がＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）及びＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）のいずれであっても、ＮＰＣマーカーの発現に影響しなかった。
（実施例１８）
　ＣＦＹ培地で維持していたｈＮＰＣをＣＦＹ培地に継代した。継代２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地に培地交換（１回目培地交換）した。次いで、２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地にさらに培地交換（２回目培地交換）した。２回目培地交換から２日後に、ＣＦＹ培地に継代した。このサイクルで３継代まで継代培養した。
　継代のタイミングで細胞を採取し、フローサイトメトリーで、ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞における、ＮＰＣマーカー（ＯＳＲ１、ＳＩＸ２）陽性細胞、及びｃ－ＭＥＴ（ＮＰＣに特異的に発現する細胞表面抗原タンパク質）陽性細胞の割合を解析した。
　結果を図３２（継代数１）及び図３３（継代数２）に示す。ＤＡＰＩ染色されなかった生細胞の総細胞数における、フローサイトメトリーで測定した各細胞群（ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋），ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（－），ｃ－ＭＥＴ（＋））の割合に合わせた細胞数で示した。継代から２日後以降の培地がＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）及びＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）のいずれであっても、ＮＰＣマーカーの発現に影響しなかった。
（実施例１９）
　ＣＦＹ培地で維持していたｈＮＰＣをＣＦＹ培地に継代した。継代２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地に培地交換（１回目培地交換）した。次いで、２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地にさらに培地交換（２回目培地交換）した。２回目培地交換から２日後に、ＣＦＹ培地に継代した。このサイクルで２継代まで継代培養した。
　２継代後の細胞塊を光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡で観察し、光学顕微鏡で観察される形態と、蛍光顕微鏡で観察されるＮＰＣマーカー（ＯＳＲ１、ＳＩＸ２）の発現とを比較した。結果を図３４に示す。継代から２日後以降の培地がＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）及びＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）のいずれであっても、ＮＰＣマーカーの発現に影響しなかった。
（実施例２０）
　ＣＦＹ培地で維持していたｈＮＰＣをＣＦＹ培地に継代した。継代２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地に培地交換（１回目培地交換）した。次いで、２日後に、ＣＦＹ培地又はＣＦ培地にさらに培地交換（２回目培地交換）した。２回目培地交換から２日後に、ＣＦＹ培地に継代した。このサイクルで１継代まで継代培養した。
　１継代後のｈＮＰＣを、腎臓オルガノイドに分化誘導した。光学顕微鏡により、腎臓オルガノイドの形態を観察した。結果を図３５に示す。継代から２日後以降の培地がＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）及びＣＦＹ培地（ＣＦＹ→ＣＦＹ）のいずれであっても、腎臓オルガノイドが形成された。腎臓オルガノイドの形成は、継代から２日後以降の培地をＣＦ培地（ＣＦＹ→ＣＦ）としても、２日後以降もＣＦＹ培を用いたもの（ＣＦＹ→ＣＦＹ）と同等であった。
　本発明によれば、分化能を保持したままネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたＮＰＣの拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法が提供される。本発明の方法で得られたネフロン前駆細胞及び腎臓オルガノイドは、腎疾患の治療又は予防に適用することができる。

Claims (22)

  1. 　ＧＳＫ－３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む、
    　ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
  2. 　ＪＡＫ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
  3. 　前記ＪＡＫ阻害剤が、ＪＡＫ２阻害剤である、請求項２に記載の培地。
  4. 　前記ＪＡＫ２阻害剤が、ＴＧ１０１３４８である、請求項３に記載の培地。
  5. 　前記ＧＳＫ－３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～４のいずれか一項に記載の培地。
  6. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の培地。
  7. 　前記培地の容量全体に対し、１０容量％のＡＳ４０１をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の培地。
  8. 　前記ネフロン前駆細胞が、ヒトのネフロン前駆細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の培地。
  9. 　前記ネフロン前駆細胞が、多能性幹細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の培地。
  10. 　前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項９に記載の培地。
  11. 　請求項１～１０のいずれか一項に記載の培地でネフロン前駆細胞を培養する工程を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  12. 　前記ネフロン前駆細胞を培養する工程が、前記ネフロン前駆細胞を継代培養することを含む、請求項１１に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  13. 　（Ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の培地でネフロン前駆細胞を３０～６０時間培養する工程と、
    　（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程と、
    　を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  14. 　（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られた細胞を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の培地に継代する工程をさらに含む、請求項１３に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  15. 　（Ｄ）前記工程（Ｃ）で継代した細胞を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の培地で３０～６０時間培養する工程と、
    　（Ｅ）前記工程（Ｄ）で得られた細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含み、且つＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養する工程と、
    　をさらに含む、請求項１４に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  16. 　前記ネフロン前駆細胞が、ヒトのネフロン前駆細胞である、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  17. 　前記ネフロン前駆細胞が、多能性幹細胞から誘導されたネフロン前駆細胞である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  18. 　前記多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１７に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  19. 　前記ネフロン前駆細胞が、下記工程（ｉ）～（ｖｉ）を含む方法により得られたネフロン前駆細胞である、請求項１７又は１８に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法：
    　（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ－３β阻害剤及びレチノイン酸又はその誘導体を含む培地で培養する工程；
    　（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤及びＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
    　（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、ＢＭＰ７及びＴＧＦβ阻害剤を含み、且つＦＧＦ２を含まない培地で培養する工程；
    　（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ－３β阻害剤、アクチビン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；
    　（ｖ）前記工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸又はその誘導体を含み、且つＦＧＦ９を含まない培地で培養する工程；並びに
    　（ｖｉ）前記工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ－３β阻害剤、並びにＦＧＦ９及びＦＧＦ２０からなる群より選択される少なくとも１種の線維芽細胞増殖因子を含む培地で培養する工程。
  20. 　前記工程（ｉｖ）で用いる培地が、ＢＭＰ７を含まない培地である、請求項１９に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  21. 　前記工程（ｉ）～（ｖｉ）の少なくとも１つの工程を、細胞接着面が４００ｃｍ２以上である培養容器を用いて行う、請求項１９又は２０に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  22. 　請求項１１～２１のいずれか一項に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程と、
    　前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、
    　を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
PCT/JP2022/000564 2021-01-08 2022-01-11 ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 WO2022149616A1 (ja)

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