WO2021125340A1 - ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 - Google Patents

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 Download PDF

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WO2021125340A1
WO2021125340A1 PCT/JP2020/047504 JP2020047504W WO2021125340A1 WO 2021125340 A1 WO2021125340 A1 WO 2021125340A1 JP 2020047504 W JP2020047504 W JP 2020047504W WO 2021125340 A1 WO2021125340 A1 WO 2021125340A1
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WO
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inhibitor
medium
progenitor cells
culturing
bmp7
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PCT/JP2020/047504
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English (en)
French (fr)
Inventor
健二 長船
啓 辻本
利和 荒岡
Original Assignee
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells, a method for expanding and culturing nephron progenitor cells, and a method for producing renal organoids.
  • the present application claims priority based on No. 62 / 950,120 filed in the United States on December 19, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Kidney transplantation is one of the radical treatments for chronic kidney disease including end-stage chronic renal failure, but supply is not keeping up with demand due to a serious shortage of donor organs.
  • the kidney is derived from the intermediate mesoderm, which is a tissue in the early embryonic period. In vertebrates, the intermediate mesoderm forms three kidneys, the anterior kidney, the middle kidney, and the posterior kidney, and in mammals, the posterior kidney becomes the adult kidney.
  • the posterior kidney is a tissue that will differentiate into the nephron of the adult kidney called the mesenchymal and the stroma, and a tissue that will differentiate into the lower renal pelvis, ureter, and part of the bladder from the collecting duct of the adult kidney called the ureteral bud. It occurs as a result of the interaction of two tissues.
  • NPCs nephron progenitor cells
  • Non-Patent Document 3 includes BMP7, fibroblast growth factor (FGF) 2, heparin, Y-27632, CHIR99021, leukemia inhibitory factor (LIF), A83-01, LDN193189. It has been reported that mNPCs were grown over a year using the containing medium (NPSR medium).
  • FGF fibroblast growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • BMP7 is used in all the methods for expanding the nephron progenitor cells reported so far. Since BMP7 is expensive, the culture cost can be reduced if it can be replaced with a cheaper low molecular weight compound.
  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of expanding and culturing Neflon progenitor cells without using BMP7, a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells using the medium, and the expansion. It is an object of the present invention to provide a method for producing a kidney organoid from Neflon progenitor cells obtained by a culture method.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells which contains FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and JAK inhibitor.
  • Culture medium [2] The medium according to [1], wherein the JAK inhibitor is at least one selected from the group consisting of a JAK1 inhibitor, a JAK2 inhibitor, and a JAK3 inhibitor.
  • the JAK3 inhibitors include TCS21311, WHI-P154, PF-06651600, FM-381, CP690550, and 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-carboxylic acid, 4- [3-[(. The medium according to [2], which is at least one selected from the group consisting of 2-methyl-1-oxo-2-propen-1-yl) amino] phenyl]-and ethyl ester. [4] The medium according to [2], wherein the JAK2 inhibitor is at least one selected from the group consisting of CEP33779 and TG101348.
  • a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells which contains FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and TCS21311. .. [11] The medium according to [10], further comprising BMP7. [12] A medium for expanding and culturing nephron progenitor cells containing a JAK inhibitor. [13] The medium according to [12], wherein the JAK inhibitor is at least one selected from the group consisting of a JAK1 inhibitor, a JAK2 inhibitor, and a JAK3 inhibitor.
  • the JAK3 inhibitors include TCS21311, WHI-P154, PF-06651600, FM-381, CP690550, and 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-carboxylic acid, 4- [3-[(. The medium according to [13], which is at least one selected from the group consisting of 2-methyl-1-oxo-2-propen-1-yl) amino] phenyl]-and ethyl ester. [15] The medium according to [13], wherein the JAK2 inhibitor is at least one selected from the group consisting of CEP33779 and TG101348.
  • [16] Further comprising at least one selected from the group consisting of FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, and BMP inhibitor, [12]-[ 15] The medium according to any one of. [17] The medium according to any one of [12] to [16], further comprising BMP7. [18] A method for expanding and culturing nephron progenitor cells using the medium according to any one of [1] to [17].
  • a kidney organoid comprising a step of expanding the Neflon progenitor cell by the method of expanding the Neflon progenitor cell according to [18] and a step of differentiating the expanded Neflon progenitor cell into a renal organoid. Manufacturing method.
  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of expanding and culturing Neflon progenitor cells without using BMP7, a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells using the medium, and the method for expanding and culturing Neflon progenitor cells. It has the effect of providing a method for producing renal organoids from the Neflon progenitor cells obtained in.
  • BF bright-field image
  • Six2-GFP fluorescence image
  • Scale bar 200 ⁇ m.
  • the circled wells are wells treated with the JAK3 inhibitor CP-690550.
  • NPSR medium without BMP7
  • TCS21311 added to NPSR medium without BMP7 (+ TCS21311)
  • NPSR medium (+ BMP7) NPSR medium (+ BMP7)
  • BF fluorescence image
  • Scale bar 300 ⁇ m.
  • NPSR medium without BMP7 (-BMP7)
  • mNPC cell mass maintained in NPSR medium (+ BMP7) Day 3 of culture (upper panel)
  • day 7 are bright-field images of the kidney organoids.
  • Scale bar 300 ⁇ m.
  • the bar graph pattern shows the activity of the pathway predicted from the analyzed dataset. The shades of the pattern represent the predicted overall decrease in activity, and the white outlines indicate the unpredictable pathways.
  • the protein level of phosphorylated Stat3 (pStat3) of mNPC cultured in NPSR medium, NPSR medium without BMP7 (no BMP), or medium with TCS21311 added to NPSR medium without BMP7 (TCS21311) is shown. Protein levels of pStat3 were evaluated by capillary western blot assay.
  • BMP7 BMP7
  • TCS21311 medium with TCS21311 added to NPSR medium without BMP7
  • TCS213111 BMP7
  • NPSR NPSR medium
  • TCS + NPSR NPSR medium
  • NPSR medium NPSR medium
  • NPSR + TCS NPSR medium
  • + SEM + SEM
  • FIG. 3 is a fluorescence microscopic image showing the results of immunostaining analysis of SIX2 (tdTomato), OSR1 (GFP) and HOXD11 of hiPSC-derived NPCs maintained in NPSR medium supplemented with TCS21311 for 10 days.
  • SIX2 tdTomato
  • OSR1 GFP
  • HOXD11 hiPSC-derived NPCs maintained in NPSR medium supplemented with TCS21311 for 10 days.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which CEP33779 having a final concentration of 0 to 16 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which TG101348 having a final concentration of 0 to 12 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO (100%) or CEP33779 having a final concentration of 2 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • CEP33779 was dissolved in DMSO and added to NPSR medium.
  • the cumulative number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO or CEP33779 having a final concentration of 2 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • CEP33779 was dissolved in DMSO and added to NPSR medium.
  • TG101348 was dissolved in DMSO and added to NPSR medium.
  • the cumulative number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO (100%) or TG101348 having a final concentration of 3 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • the first aspect of the present invention is a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells.
  • the medium of this embodiment comprises a JAK inhibitor.
  • the medium of this embodiment is a group consisting of FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, and BMP inhibitor in addition to the JAK inhibitor. Includes at least one selected from.
  • the medium of this embodiment comprises FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and TCS21311. Further, in one embodiment, the medium of this embodiment further contains BMP7 in addition to the above components.
  • NPCs are cells that can differentiate into organ structures such as glomerular and tubular structures of the kidney in vitro. The ability of nephron progenitor cells to differentiate into organ structures is described, for example, in Osafune K, et al. (2006), Evaluation can be evaluated by the method described in Development 133: 151-61. SIX2 is known as a characteristic factor for maintaining the state as a nephron progenitor cell (Cell Stem Cell 3: 169-181 (2008)), and as an example of a nephron progenitor cell cultured by the method of this embodiment. , SIX2-positive nephron progenitor cells.
  • pluripotent stem cells having a reporter gene for example, tdTomato
  • the SIX2 promoter for example, OSR1-GFP / SIX2-tdTomato reporter human iPS cells described in Examples below
  • the reporter gene is concerned.
  • SIX2-positive Neflon progenitor cells can be isolated by a method known in the art (for example, a method using a cell sorter) using the expression of SIX2-positive as an index.
  • the expression of SIX2 in nephron progenitor cells can be confirmed by a method for analyzing gene expression such as quantitative RT-PCR (Nat Commun 4,1367, (2013)).
  • SIX2-positive Neflon progenitor cells include cells expressing the SIX2 protein and cells expressing the protein encoded by the gene under the control of the SIX2 promoter.
  • the human SIX2 gene (NCBI Gene ID: 10736) is a gene having a nucleotide sequence registered at NCBI accession number: NM_016932.5
  • the mouse SIX2 gene (NCBI Gene ID: 20472) is the NCBI accession number. : Examples include, but are not limited to, genes having a nucleotide sequence registered in NM_011380.2.
  • the nephron progenitor cells cultured in the medium of this embodiment are preferably OSR1 positive and HOX11, WT1, SIX2 and SALL1 positive.
  • the nephron progenitor cells may be those isolated from the posterior renal mesenchyme of a living body, or those induced to differentiate from pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.).
  • Induction of differentiation of nephron progenitor cells from pluripotent stem cells can be performed by a known method.
  • Examples of the method for inducing nephron progenitor cells from pluripotent stem cells include the methods described in International Publication No. 2014/200115, International Publication No. 2017/0436666, International Publication No. 2018/216743, and the like.
  • nephron progenitor cells Isolation of nephron progenitor cells from a cell population collected from the posterior mesenchyme or a cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells is described, for example, in OSR1, HOX11, WT1, SIX2, which are markers of the nephron progenitor cells.
  • OSR1, HOX11, WT1, SIX2 which are markers of the nephron progenitor cells.
  • SALL1 can be used as an index.
  • MET or AGTR2 can be used as an index (International Publication No. 2020/022261).
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured in the medium of this embodiment may be provided as a cell population containing other cell types, or may be provided as a cell population of purified nephron progenitor cells.
  • the ratio of the number of nephron progenitor cells is 30%, 40% or more, 50% or more, 60% or more with respect to the total number of cells (100%). , 70% or more, 80% or more, or 90% or more is preferable.
  • “Expansion culture” means a culture in which nephron progenitor cells are proliferated while maintaining the properties of the nephron progenitor cells. That is, the expanded-cultured nephron progenitor cells can be differentiated into organ structures such as glomerular-like structure and tubular-like structure of the kidney in vitro. In the medium of this embodiment, the nephron progenitor cells can be expanded and cultured while maintaining the properties of the nephron progenitor cells even after repeated passages.
  • the medium of this embodiment may be a basal medium used for animal culture to which a JAK inhibitor is added. Further, in addition to the JAK inhibitor, at least one selected from the group consisting of FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, and BMP inhibitor is further added. It may be the one that has been used.
  • the basal medium is not particularly limited, and those usually used for animal culture can be used without particular limitation.
  • Examples of the basal medium include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulvecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12) medium, and Ham's F12 (F12) medium.
  • Examples include, but are not limited to, a medium, Fisher's medium, and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferase, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum substitute during ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, for example.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acids insulin, collagen precursors
  • Trace elements 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol and the like may contain one or more serum substitutes.
  • the basal medium may be, for example, a mixed medium of DMEM / F12 medium (for example, a mixed medium in which DMEM: F12 is mixed at a ratio of 1: 1) to which amino acids, non-essential amino acids, serum substitutes and the like are added. ..
  • the medium of this embodiment contains a JAK inhibitor.
  • a JAK inhibitor is a substance that inhibits the activity of one or more enzymes of the Janus kinase family (eg, JAK1, JAK2, JAK3, TYK2). JAK inhibitors inhibit signal transduction of the JAK-STAT system by inhibiting the enzymatic activity of the Janus kinase family.
  • the JAK inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of enzymes of the Janus kinase family.
  • the JAK inhibitor preferably inhibits the enzyme activity of at least one selected from the group consisting of JAK1, JAK2, and JAK3, and more preferably one that inhibits the enzyme activity of JAK3. That is, the JAK inhibitor is preferably at least one selected from the group consisting of a JAK1 inhibitor, a JAK2 inhibitor, and a JAK3 inhibitor, and more preferably a JAK3 inhibitor.
  • JAK3 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK3.
  • JAK3 inhibitors include TCS21311 (CAS number 1268014-14-3), WHI-P154 (CAS 211555-04-3), PF-06651600 (CAS number 1792180-81-4), FM-381 (CAS number). 2226521-65-7), CP690550 (CAS No.
  • JAK3 INHIBITOR IV (CAS number 58753-54-1), ZM449829 (CAS number 4452-06-6), AZD1480 (CAS number 935666-88-9) ), Selective JAK3 inhibitor 1 (CAS No. 1443235-95-7), and derivatives thereof, but are not limited thereto.
  • TCS21311 is preferable as the JAK3 inhibitor.
  • JAK2 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK2.
  • JAK2 inhibitors include NVP-BSK805 2HCl (CAS No. 1949219-79-0), TG101209 (CAS No. 936091-14-4), TG101348 (CAS No. 936091-26-8), 1, 2, 3, 4,5,6-Hexabromocyclohexane (CAS No. 1837-91-8), CEP-33779 (CAS No. 1257704-57-6), NSC33994 (CAS No. 82058-16-0), and derivatives thereof. These include, but are not limited to.
  • the JAK inhibitor may be a JAK2 / 3 inhibitor.
  • a JAK2 / 3 inhibitor is an inhibitor that inhibits JAK2 and JAK3.
  • Examples of JAK2 / 3 inhibitors include AG490 (CAS No. 133550-30-8), AT9283 (CAS No. 896466-04-9), LY3009104 (CAS No. 1187594-09-7), and derivatives thereof. These include, but are not limited to.
  • the JAK inhibitor may be a JAK1 / 2 inhibitor.
  • the JAK1 / 2 inhibitor is an inhibitor that inhibits JAK1 and JAK2.
  • Examples of JAK1 / 2 inhibitors include CYT387 (CAS number 1056634-68-4), S-Ruxolitinib (INCB018424) (CAS number 941685-37-6), and LY2784544 (CAS number 1229236-86-5), and Examples thereof include, but are not limited to, these derivatives.
  • JAK inhibitors are not limited to the above low molecular weight compounds, but antisense nucleic acids against the Janus kinase family (JAK1, JAK2, JAK3, TYK2), RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, etc. And their expression vectors and the like.
  • JAK inhibitor One type of JAK inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • a JAK3 inhibitor is preferable, and TCS21311 is more preferable.
  • the concentration of the JAK inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected according to the type of the JAK inhibitor.
  • the JAK inhibitor is preferably used at a concentration near IC50, for example.
  • JAK inhibitors are, for example, 0.001 ⁇ M or more, 0.002 ⁇ M or more, 0.003 ⁇ M or more, 0.004 ⁇ M or more, 0.005 ⁇ M or more, 0.006 ⁇ M or more, 0.007, 0.008 ⁇ M or more, 0.009 ⁇ M or more.
  • the concentration of the JAK inhibitor examples include 100 ⁇ M or less, 50 ⁇ M or less, 30 ⁇ M or less, 20 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, 5 ⁇ M or less, 3 ⁇ M or less, and the like.
  • the concentration of TCS21311 in the medium may be, for example, 0.001 to 10 ⁇ M, 0.01 to 3 ⁇ M, 0.01 to 2 ⁇ M, 0.01 to 1 ⁇ M, or the like.
  • the concentration of CEP33779 in the medium may be, for example, 0.5 to 20 nM, 1 to 8 nM, 1 to 4 nM, 1 to 3 nM, or the like.
  • the concentration of TG101348 in the medium may be, for example, 0.5 to 50 nM, 1 to 30 nM, 1 to 20 nM, 1 to 10 nM, or 1 to 5 nM.
  • FGF2 Fibroblast Growth Factor 2
  • bFGF basic FGF
  • the organism from which FGF2 is derived is not particularly limited.
  • FGF2 for example, human FGF2 can be used.
  • human FGF2 NCBI Gene ID: 2247) include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001348594.1.
  • FGF2 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • FGF2 a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of FGF2 in the medium is, for example, 1 to 1000 ng / mL, preferably 10 to 500 ng / mL, more preferably 20 to 400 ng / mL, and even more preferably 50 to 350 ng / mL.
  • Heparin The medium of this embodiment preferably contains heparin.
  • the inclusion of heparin in addition to the JAK inhibitor results in better proliferation of nephron progenitor cells.
  • Heparin is preferably in the form of salts.
  • heparin salts include salts with alkali metals such as lithium, sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium; salts with metals such as aluminum, zinc, copper and iron; Examples thereof include ammonium salts; salts with organic bases; and salts with amino acids.
  • heparin is preferably an alkali metal salt, more preferably a sodium salt.
  • the concentration of heparin in the medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ g / mL, preferably 0.05 to 50 ⁇ g / mL, and more preferably 0.1 to 10 ⁇ g / mL.
  • the medium of this embodiment preferably contains a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor is a substance that inhibits the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK inhibitors include Y-27632 (see, eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)), Fasudil.
  • HA1077 see, eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), H-1152 (see, eg, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)), Wf- 536 (see, eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003)) and their derivatives, as well as antisense nucleic acids against ROCK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant. Negative variants and their expression vectors can be mentioned.
  • other known low molecular weight compounds can also be used as the ROCK inhibitor (for example, US Patent Application Publication No.
  • ROCK inhibitors include Y-27632.
  • concentration of the ROCK inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is preferably used at a concentration near IC50, for example.
  • concentration of the ROCK inhibitor in the medium is, for example, 0.1-100 ⁇ M, preferably 1-75 ⁇ M, more preferably 5-50 ⁇ M.
  • the medium of this embodiment preferably contains a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • GSK3 ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the function of GSK (Glycogen Synthesis Kinase) 3 ⁇ , for example, kinase activity (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitor include BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoinsilvin 3'-oxime), which is an indylbin derivative, and SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl)-), which is a maleimide derivative.
  • GSK3 ⁇ Peptide Inhibitor Myr-N-GKEAPAPPQSpP-NH2
  • CHIR99021 (6- [2- [2- [4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin -2-Ilamino] ethylamino] pyridine-3-carbonitrile), and derivatives thereof and the like.
  • These compounds can be obtained from, for example, Stemgent, Calbiochem, Biomol, etc., or may be prepared by themselves.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor may be an antisense nucleic acid against GSK3 ⁇ , an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof.
  • GSK3 ⁇ inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor is preferably used at a concentration near IC50, for example.
  • the concentration of GSK3 ⁇ in the medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 3 ⁇ M, and particularly preferably 0.5 to 1.5 ⁇ M. ..
  • the medium of this embodiment preferably contains a leukemia inhibitory factor (LIF).
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the inclusion of LIF in addition to the JAK inhibitor results in better proliferation of nephron progenitor cells.
  • the organism from which LIF is derived is not particularly limited. Examples of the LIF include humans (Japanese Patent Publication No. 1-502985), mice (Japanese Patent Publication No. 1-502985), sheep (Japanese Patent Publication No. 4-502554), and pigs (Japanese Patent Publication No. 4-502554). No.), cows (Japanese Patent Publication No. 8-154681) and the like can be used. Of these, human or mouse LIF is preferred.
  • Examples of human LIF include proteins having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001244064.1 or NP_0023001.
  • Examples of the mouse LIF include a protein having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001034626.1 or NP_032527.1.
  • the LIF can be appropriately selected depending on the organism from which the nephron progenitor cells are derived. For example, when the nephron progenitor cells are derived from mice, it is preferable to use mouse LIF. When the nephron progenitor cells are of human origin, it is preferable to use human LIF.
  • LIF may be a fragment and a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • LIF a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of LIF in the medium is, for example, 1 to 1000 ng / mL, preferably 10 to 500 ng / mL, and more preferably 50 to 250 ng / mL.
  • the concentration of LIF in the medium is, for example, 10 to 5000 units / mL, preferably 100 to 3000 units / mL, and more preferably 500 to 2000 units / mL.
  • the medium of this embodiment preferably contains an ALK inhibitor.
  • ALK inhibitors are substances that inhibit the function of the ALK (Activin receptor-Like Kinase) family.
  • ALK inhibitors include substances that inhibit the binding of TGF ⁇ to the ALK family, substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by the ALK family, and the like.
  • ALK inhibitors include inhibitors of ALK4, ALK5 or ALK7.
  • ALK inhibitors examples include Lefty-1 (as NCBI accession numbers, mouse: NP_034224.1 and human: NP_066277.1 are exemplified), SB431542, SB202190 (above, RK Lindemann et al., Mol.
  • ALK inhibitors may be antisense nucleic acids against the ALK family, RNA interference-inducing
  • ALK inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred ALK inhibitors include A83-01.
  • the concentration of the ALK inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ALK inhibitor.
  • the ALK inhibitor is preferably used at a concentration near IC50, for example.
  • the concentration of the ALK inhibitor in the medium is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 500 nM, more preferably 1 to 100 nM, and particularly preferably 10 to 80 nM.
  • the medium of this embodiment preferably contains a BMP inhibitor.
  • a BMP inhibitor is a substance that inhibits BMP (Bone Morphogenetic Protein) signal transduction.
  • the BMP inhibitor may be, for example, a substance that inhibits the kinase activity of ALK2 or ALK3, which is a receptor for BMP.
  • Examples of the BMP inhibitor include proteinin inhibitors such as Chordin, Noggin, and Follistatin; Dorsomorphin (6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo.
  • the BMP inhibitor may be an antisense nucleic acid against BMP, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof.
  • the BMP inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred BMP inhibitors include LDN193189, Dorsomorphin, Noggin, and DMH1, with LDN193189 being more preferred.
  • the concentration of the BMP inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ALK inhibitor.
  • the ALK inhibitor is preferably used at a concentration near IC50, for example.
  • the concentration of the ALK inhibitor in the medium is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 500 nM, more preferably 0.5 to 100 nM, and particularly preferably 1 to 50 nM.
  • the medium of this embodiment may contain BMP7.
  • BMP7 The inclusion of BMP7 in addition to the JAK inhibitor results in better proliferation of nephron progenitor cells.
  • the organism from which BMP7 is derived is not particularly limited.
  • BMP7 for example, human BMP7 can be used.
  • human BMP7 (NCBI Gene ID: 655) include proteins having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001710.1.
  • BMP7 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • BMP7 a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of BMP7 in the medium is, for example, 0.1 to 500 ng / mL, preferably 1 to 300 ng / mL, and more preferably 10 to 100 ng / mL.
  • the medium of this embodiment can contain components other than the above as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the medium of this embodiment preferably contains a JAK inhibitor, FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, and BMP inhibitor.
  • the medium of this embodiment can contain TCS21311 as a JAK inhibitor.
  • the medium of this embodiment can include TCS2133, FGF2, heparin, Y-27632, LIF, CHIR99021, ADN193189, and A83-01.
  • the medium of this embodiment can satisfactorily proliferate the nephron progenitor cells while maintaining the differentiation potential of the nephron progenitor cells, and it is not necessary to use expensive BMP7. Therefore, the cost can be reduced as compared with the conventional medium for expanding and culturing nephron precursors containing BMP7.
  • the medium of this embodiment may further contain BMP7.
  • the medium of this embodiment may contain a JAK inhibitor, FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukocyte inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and BMP7.
  • the medium of this embodiment contains TCS21311, WHI-P154, PF-06651600, FM-381, CP690550, 7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-carboxylic acid, 4-[as JAK inhibitors.
  • the medium of this embodiment can contain JAK inhibitors such as FGF2, heparin, Y-27632, LIF, CHIR99021, ADN193189, A83-01, and BMP7.
  • JAK inhibitors such as FGF2, heparin, Y-27632, LIF, CHIR99021, ADN193189, A83-01, and BMP7.
  • the medium of this embodiment can proliferate the nephron progenitor cells more satisfactorily while maintaining the differentiation potential of the nephron progenitor cells.
  • a second aspect of the present invention is a method of expanding and culturing nephron progenitor cells using the medium of the first aspect.
  • Nephron progenitor cells can be cultured under the culture conditions usually used for culturing animal cells.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the nephron progenitor cells can proliferate, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • Nephron progenitor cells can usually be cultured in an atmosphere of CO 2-containing air.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. A specific example of the CO 2 concentration is about 5%.
  • the culture period is not particularly limited and can be any period.
  • by using the medium of the first aspect it is possible to culture for a long period of time while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • the culture of the nephron progenitor cells can be continued while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • Subculture can be performed by collecting a cell mass of nephron progenitor cells from the culture medium and seeding the cells in a new medium.
  • a cell dispersion containing an enzyme such as protease, collagenase, and DNAase may be used to disperse the cell mass and then seeded in a new medium.
  • the interval between passages is not particularly limited, but may be, for example, about 2 to 10 days, or about 3 to 7 days.
  • the nephron progenitor cells are cultured using the medium of the first aspect, so that the nephron progenitor cells can be efficiently proliferated.
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured by the method of this embodiment can be administered to a subject having renal disease and used for treating renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases. It can also be used for the production of renal organoids, which will be described later.
  • a third aspect of the present invention is a method for producing a renal organoid.
  • the method for producing a renal organoid of this embodiment includes a step of expanding the nephron precursor culture (expansion culture step) and a step of differentiating the expanded cultured nephron progenitor cells into renal organoids (differentiation) by the method of the second aspect. Step) and.
  • the expansion culture step is carried out by the method of the second aspect. By this step, the nephron progenitor cells can be efficiently proliferated to a desired number.
  • nephron progenitor cells into renal organoids can be performed by known methods. For example, the methods reported in Nature, 526, 564-568 (2015) and the like can be used.
  • the cell mass of nephron progenitor cells obtained in the expansion culture step may be co-cultured with feeder cells such as 3T3-Wnt4 cells, mouse fetal spinal cells, or mouse fetal kidney cells.
  • the cell mass of Neflon progenitor cells is cultured in a semi-gas phase culture using a basal medium containing a GSK3 ⁇ inhibitor (preferably a gas-liquid phase culture; see Nature, 526,564-568 (2015)). You may.
  • the medium used in the semi-gas phase culture may contain FGF9, FGF2, etc. in addition to the GSK3 ⁇ inhibitor.
  • Examples of the basal medium, GSK3 ⁇ inhibitor, and FGF2 include the same as above.
  • a preferred basal medium is KSR.
  • Preferred GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • Preferred FGF2 includes human FGF2.
  • Preferred FGF9 includes human FGF9.
  • Examples of human FGF9 include a protein having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_002001.1.
  • FGF9 includes fragments and functional variants thereof as long as it has the activity of inducing differentiation into renal organoids. Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the culture conditions in the differentiation step the culture conditions usually used for culturing animal cells can be used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it can induce differentiation into renal organoids, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. A specific example of the CO 2 concentration is about 5%.
  • the renal organoid obtained by the production method of this embodiment can be administered to a subject having a renal disease and used for treating the renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing nephron progenitor cells obtained by the method of the second aspect or renal organoids obtained by the production method of the third aspect.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for renal disease containing the nephron progenitor cells or the renal organoids.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing renal disease, which comprises the step of administering a therapeutically effective amount of the nephrone progenitor cell or the renal organoid to a subject having renal disease or a subject at risk of renal disease. ..
  • a method of administering the Neflon progenitor cell to a subject requiring treatment or prevention of renal disease for example, a method of sheeting the Neflon progenitor cell and attaching the Neflon progenitor cell to the target kidney; A method of transplanting a cell suspension suspended in or the like into a target kidney; the Neflon progenitor cells are three-dimensionally cultured (for example, Dev Cell. Sep 11, 2012; 23 (3): 637-651) to obtain the results.
  • a method of directly transplanting the obtained cell mass into the target kidney; a method of three-dimensionally culturing the Neflon progenitor cell on a scaffold composed of Matrigel or the like and transplanting the obtained cell mass into the target kidney can be mentioned. Be done.
  • the transplantation site is not particularly limited as long as it is within the kidney, but is preferably under the renal capsule.
  • Examples of the method for administering the renal organoid to a subject who needs treatment or prevention of renal disease include a method of transplanting into the body of the subject (for example, intraperitoneally).
  • the renal disease to be treated or prevented is not particularly limited, and examples thereof include acute renal failure, chronic renal failure, and chronic kidney disease that does not lead to chronic renal failure.
  • the number of cells of the nephron progenitor cells to be transplanted or the size of the renal organoid is not particularly limited as long as it can survive after transplantation, and is appropriately adjusted according to the size of the diseased site, the body, age, sex, etc. of the administration target. be able to.
  • HiPSC human iPS cells
  • mNPC mouse nephron progenitor cells
  • the NPSR medium shown in Table 1 was used for culturing mNPC.
  • the hNPSR medium shown in Table 2 was used for culturing hiPSC-derived NPCs.
  • Kidney organoids were fixed overnight at 4 ° C. with 4% PFA (Nacalai Tesque) / PBS ( ⁇ ). The immobilized organoids were washed twice with PBS (-), treated with 30% sucrose (Nacalai tesque) / PBS (-) overnight at 4 ° C., then frozen with OCT compound (Sakura Finetek) and frozen. Sections were prepared. Frozen sections were incubated with 2% donkey serum (Millipore) / 0.25% Triton X-100 (Nacalai Tesque) / PBS (-) solution at room temperature for 30 minutes.
  • the primary antibody was diluted with 2% donkey serum / PBS (-) solution and incubated with the sample overnight at 4 ° C. Then, it was incubated with a secondary antibody at 4 ° C. for 2 hours.
  • the antibodies or lectins used are shown in Table 3.
  • Brn1 Brain1
  • Cdh1 Cadherin1
  • LTL Lotus tetragonolobus lectin
  • Erk1 / 2 Extracellular signal-regulated kinase 1/2
  • Six2 Sine Oculis homeobox homolog 2
  • Podxl Podocalyxin1
  • Smad1 Mothers against decapentaplegic homolog1
  • Stat3 Signal transducer and activator of transduction 3
  • Wt1 Wilms tumor 1.
  • Custom-prepared small molecule libraries were fed plates in array form with a stock of 1 mM in dimethyl sulfoxide (DMSO) per well. Individual compounds were diluted using a Multidrop dispenser (Thermo Fisher Scientific) and transferred to an assay plate using Biomek NX (Beckman Coulter) at a final concentration of 1 ⁇ M. 72 hours after cell seeding, cells were washed with PBS ( ⁇ ) and analyzed using Array Scan (Thermo Fisher Scientific). The roundness, size, and mean GFP signal of the mNPC cell mass were used as quantification parameters. Each assay plate was designed to contain positive and negative controls containing NPSR medium with or without BMP7, respectively.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ⁇ Cell viability assay> For cell viability assay using quantification of ATP, mNPCs were dissociated and seeded on a low-adhesion U-bottom 384-well plate (Sumitomo Bakelite) at 2.5 ⁇ 10 3 cells / well. A custom-made JAK inhibitor library was used. Each compound was diluted and transferred to assay plates using Biomek NX at final concentrations of 0.01 ⁇ M, 0.03 ⁇ M, 0.1 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M or 3 ⁇ M. After 72 hours from cell seeding, cells were washed and the amount of ATP analyzed using CellTiter-Glo TM 2.0 Cell Viability Assay kit (Promega). Each assay plate was designed to contain positive and negative controls, each containing DMSO-added NPSR medium with or without BMP7.
  • RNA sequencing> Previously reported RNA-seq data (GSE78772) was used (Z. Li, et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.). The mRNA-seq data of cell clusters of NPCs cultured with or without BMP7 were compared. The quantification of the transcript is described in GRCm38.
  • the p6 cDNA gene annotation (Ensembl) was performed using Salmon (R. Patro, et al., Nat Methods. 14 (2017) 417-419.). The output from Salmon was processed with R / Bioconductor package zipport to obtain gene expression values. The gene expression level was indicated by log2 (RPKM + 1). Gene ontology (GO) analysis was performed using Metascape (Y.
  • ⁇ Protein assay> The mNPC cell clumps are dissociated on ice by EDTA-free protease inhibitor cocktail set DMSO solution (Wako) and Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (Wako) and centrifuged in Phosphatase Inhibitor Cocktail Solution (Wako). The cell residue was removed. Protein concentration was analyzed by XL-Bradford assay (Apro Science) and measured using Power scan (BioTek Instrument Inc.).
  • Protein measurements of Stat3, Phospho-Stat3 (Tyr705), Phospho-Stat3 (Ser727), Erk1 / 2, Phospho-Erk1 / 2, Smad1 and Phosfo-Smad1 / 5 do not include NPSR medium containing BMP7, STAT7. , And a cell lysate of the mNPC cell mass in NPSR medium containing 3 ⁇ M TCS21311. Protein expression was quantified by capillary western blot assay (J.Q. Chen, et al., Anal Biochem. 442 (2013) 97-103.) (Wes Separation Module for 12-230 kDa, Protein Simple).
  • Protein (0.5 ⁇ g / sample) was separated via a sizing matrix within the capillary, immobilized on the inner capillary wall, and the primary antibody at a concentration of 1:50 in antibody dilution buffer (Protein Simple) (see Table 3). And then detected using chemiluminescence after incubating with anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody. The signal reflected as the subcurve area (AUC) of the target protein was automatically generated at the end of the run. The amount of phosphorylated protein was quantified as the ratio of AUC from each sample standardized by AUC of the corresponding total target protein. A total protein assay was performed using a Total Protein Detection Module (Protein Simple). Prior to the AUC measurement, a linear regression analysis of each target protein was used to confirm the linear dynamic range of sample concentration.
  • the gene expression level data was analyzed using the threshold cycle method, and the value was standardized by the expression level of ⁇ -actin, which is a housekeeping gene.
  • the PCR reaction was performed 3 times for each sample.
  • the primer sequences are shown in Table 4.
  • Cells treated with JAK3 inhibitors, JAK2 / 3 inhibitors, JAK1 / 2 inhibitors, or JAK2 inhibitors showed higher viability than cells treated with DMSO, but at higher concentrations of the JAC3 inhibitor TCS21311. However, it showed a much stronger effect than other JAK inhibitors (Fig. 4).
  • TCS21311 is an alternative to BMP7 in mNPC maintenance cultures.
  • TCS21311 is a target molecule or pathway other than JAK3-STAT3 signaling. It suggests that it has.
  • BMP7 the phosphorylation of Smad1 / 5 and Erk1 / 2 decreased, whereas the addition of TCS21311 made only the phosphorylation of Smad1 / 5 reversible.
  • potential downstream targets include the Smad 1/5 pathway (FIGS. 12-15).
  • TCS21311 treatment was compared to NPSR conditions. Therefore, TCS21311 did not significantly change the expression level of Six2 or Cited1 (S. Tanigawa, et al., Cell Rep. (2016) 1-13.), which are markers of the undifferentiated state of NPCs. It was suggested that the undifferentiated state of NPCs could be maintained in the NPSR medium containing no BMP7 (Fig. 16).
  • 0.3 ⁇ M TCS21311 resulted in the highest cell viability of the JAK3 inhibitors tested.
  • the total number of cells in each mNPC cell mass cultured for 4 days in NPSR medium supplemented with 0.3 ⁇ M TCS21311 was significantly higher than that in mNPC cell mass cultured in NPSR medium alone (FIG. 18).
  • TCS21311 has a proliferative effect on mNPC in maintenance culture.
  • TCS21311 NPSR medium promotes the growth of hiPSC-derived NPCs>
  • OSR1-GFP / SIX2-tdTomato knock-in hiPSCs T. Toyohara, et al., Stem Cells Transl Med. 4 (2015) 980-992) From.
  • Differentiation into NPC was induced. Induction of differentiation into NPCs was carried out by the method described in Morizane's method or Tsujimoto's method.
  • OSR1 (GFP) (+) SIX2 (tdTomato) (+) NPCs were purified by sorting by flow cytometry and used in in vitro expansion culture experiments.
  • the hiPSC-derived OSR1 (+) SIX2 (+) NPCs were then maintained in NPSR medium or NPSR medium supplemented with 0.3 ⁇ M TCS21311.
  • TCS21311 the proliferative effect of TCS21311 on the hiPSC-derived NPCs obtained by the Tsujimoto method could be confirmed (FIG. 20).
  • hiPSC-derived OSR1 (+) SIX2 (+) NPCs were successfully maintained in NPSR medium supplemented with TCS21311 for 10 days.
  • Low-adhesion 96-well plates (Nunc) were seeded with 2.0 x 10 4 cells of mNPC per well.
  • a JAK2 inhibitor (CEP33779, TG101348) was added to 50 ⁇ L of mNPSR to prepare the following concentration gradient centering on the IC50 (CEP33779 is 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 nM, TG 101348). Is 0.75, 1.5, 3, 6, 12 nM).
  • the mNPSR medium alone and 96-well plates seeded with cells suspended in a medium supplemented with JAK2 inhibitor mNPSR medium was centrifuged for 3 min at 300 g, 37 ° C., and static culture at CO 2 5% incubator. A cell mass was formed 6 hours after the start of static culture.
  • Table 3 shows the composition of the mNPSR medium used in the experiment.
  • the mNPSR medium was prepared by adding the reagents shown in Table 5 to the Basal medium shown in Table 3.
  • a low-adhesion 96-well plate (Nunc) 2.0x10 4 cells of mNPC per well was suspended and seeded in mNPSR medium supplemented with CEP33779 (final concentration 2 nM), TG101348 (final concentration 3 nM), or DMSO. did.
  • the low adhesive 96-well plates seeded with cells were centrifuged for 3 min at 300 g, 37 ° C., and static culture at CO 2 5% incubator. Forty-eight hours after the start of static culture, 100 ⁇ L of mNPSR medium supplemented with the same concentration of JAK2 inhibitor or DMSO as when the cells were seeded was additionally added to each well. Forty-eight hours after the additional addition of the medium, the same operation as above was carried out to measure the number of cells and subculture.
  • ⁇ Preparation of renal organoids> The cell mass of the subcultured mNPC was placed on Transwell (Corning) in a medium obtained by adding CEP33779 (final concentration 2 nM) or TG101348 (final concentration 3 nM) to the mNPSR medium, and the surrounding medium was removed. Next, a Transwell with a cell mass was set in a culture dish previously filled with 5% KSR (Knock-out Thermo Fisher Scientific) supplemented with 200 ng / mL FGF2 and 5 ⁇ M CHIR99021. After 48 hours, the medium was changed to 5% KSR without the addition of growth factors and low molecular weight compounds.
  • the medium was exchanged with 5% KSR to which no growth factor and low molecular weight compound was added, and on the 10th day after the start of differentiation culture, the medium was fixed at 4 ° C. for 3 hours using 4% PFA as Transwell. .. After fixation, it was replaced with PBS and allowed to stand overnight at 4 ° C. for immunostaining.
  • FIG. 24 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which CEP33779 was added to the mNPSR medium. From the literature information, the IC50 of CEP33778 is predicted to be around 2 nM. CEP33779 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at a concentration near IC50.
  • FIG. 25 shows the results of the cell proliferation assay in the mNPSR medium supplemented with TG101348.
  • TG101348 is predicted to be around 3 to 6 nM.
  • TG101348 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at a concentration near IC50.
  • the growth promoting effect was confirmed at two concentrations.
  • the growth promotion at 3 nM was a concentration near the IC50 of JAK2 inhibition, and was considered to be the growth promotion by JAK2 inhibition.
  • FIG. 26 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 2 nM CEP33779 was added to the mNPSR medium.
  • Cell proliferation was promoted in mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with 2 nM CEP33779 as compared with mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with DMSO.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in a medium in which DMSO was added to the mNPSR medium (FIG. 27).
  • FIG. 28 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 3 nM TG101348 was added to the mNPSR medium.
  • Cell proliferation was promoted in mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with 3 nM TG101348 as compared with mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with DMSO.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in a medium in which DMSO was added to the mNPSR medium (FIG. 29).
  • Renal organoids were induced to differentiate from 4-passaged mNPC in mNPSR medium supplemented with 2 nM CEP33779 or 3 nM TG101348. As a result, it was confirmed that none of the JAK2 inhibitors affected the formation of renal organoids (Fig. 30).
  • ⁇ Proliferation assay using mNPC derived from ADPKD model mouse> The cell proliferation assay was performed in the same manner as above, except that mNPC extracted from the fetal kidney of ADPKD (autosomal dominant polycystic kidney disease) model mouse was used as the mNPC. As the JAK2 inhibitor, 3 nM TG101348 was used. It was confirmed that the addition of TG101348 also promoted proliferation of mNPCs derived from ADPKD model mice (Fig. 31).
  • a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of expanding and culturing Neflon progenitor cells without using BMP7 a method for expanding and culturing NPC using the medium, and the method for expanding and culturing NPC.
  • a method for producing a renal organoid from the Neflon progenitor cells obtained in the above is provided.
  • the nephron progenitor cells and renal organoids obtained by the method of the present invention can be applied to the treatment or prevention of renal diseases.

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Abstract

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＪＡＫ阻害剤を含む、培地。また、前記培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。また、前記培地拡大培養する方法により、ネフロン前駆培養を拡大培養する工程と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。

Description

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法
　本発明は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法に関する。
　本願は、２０１９年１２月１９日に、米国に出願された６２／９５０，１２０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　現在、本邦において慢性腎臓病（ＣＫＤ）の患者数は、約１，３００万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は３０万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。
　腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の３つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の２つの組織の相互作用で発生する。さらに、後腎間葉の中にネフロンを構成する糸球体と数種類の尿細管上皮細胞に分化する多分化能を有するネフロン前駆細胞（Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ＮＰＣ）の存在が示されている（非特許文献１，２）。
　マウスネフロン前駆細胞（ｍｏｕｓｅ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ｍＮＰＣ）の拡大培養法としては、骨形成因子（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）７を用いた方法が報告されている。例えば、非特許文献３には、ＢＭＰ７、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、Ａ８３－０１、ＬＤＮ１９３１８９を含む培地（ＮＰＳＲ培地）を用いて、１年以上にわたってｍＮＰＣを増殖させたことが報告されている。
Osafune K., et al., Identification of multipotent progenitors in the embryonic mouse kidney by a novel colony-forming assay. Development 2006; 133: 151-61. Kobayashi A., et al., Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell 2008; 3: 169-81. Z. Li, T. Araoka, J.C.I. Belmonte, Gene Editing in 3D Cultured Nephron Progenitor Cell Lines, in: S. Vainio (Ed.), Kidney Organog Methods Protoc, Hummana Press, New York, 2019: pp. 151-159.
　これまでに報告されているネフロン前駆細胞の拡大培養法では、いずれの方法でもＢＭＰ７が用いられている。ＢＭＰ７は高価であるため、より安価な低分子化合物に代替することができれば、培養コストを低減することができる。
　また、培養コスト、培養時間の低減のためには、より効率よくネフロン前駆細胞を増殖させることができる拡大培養法の開発が望まれる。
　そこで、本発明は、ＢＭＰ７を用いることなく、ネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＪＡＫ阻害剤を含む、培地。
［２］前記ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、及びＪＡＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］に記載の培地。
［３］前記ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＰＦ－０６６５１６００、ＦＭ－３８１、ＣＰ６９０５５０、及び７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種である、［２］に記載の培地。
［４］前記ＪＡＫ２阻害剤は、ＣＥＰ３３７７９、及びＴＧ１０１３４８からなる群より選択される少なくとも１種である、［２］に記載の培地。
［５］前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の培地。
［６］前記ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の培地。
［７］前記ＡＬＫ阻害剤は、Ａ８３－０１である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の培地。
［８］前記ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の培地。
［９］ＢＭＰ７をさらに含む、［１］～［８］のいずれか１つに記載の培地。
［１０］ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＴＣＳ２１３１１を含む、培地。
［１１］ＢＭＰ７をさらに含む、［１０］に記載の培地。
［１２］ＪＡＫ阻害剤を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
［１３］前記ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、及びＪＡＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種である、［１２］に記載の培地。
［１４］前記ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＰＦ－０６６５１６００、ＦＭ－３８１、ＣＰ６９０５５０、及び７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種である、［１３］に記載の培地。
［１５］前記ＪＡＫ２阻害剤は、ＣＥＰ３３７７９、及びＴＧ１０１３４８からなる群より選択される少なくとも１種である、［１３］に記載の培地。
［１６］ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される、少なくとも１種をさらに含む、［１２］～［１５］のいずれか１つに記載の培地。
［１７］ＢＭＰ７をさらに含む、［１２］～［１６］のいずれか１つに記載の培地。
［１８］［１］～［１７］のいずれか１つに記載の培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
［１９］［１８］に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆培養を拡大培養する工程と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
　本発明は、ＢＭＰ７を用いることなく、ネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供できるという効果を奏する。
ＮＰＳＲ培地（＋ＢＭＰ７）又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（－ＢＭＰ７）で３日間培養したｍＮＰＣの明視野画像（ＢＦ）及び蛍光画像（Ｓｉｘ２－ＧＦＰ）である。スケールバー：２００μｍ。 ＢＭＰ７代替化合物のスクリーニングストラテジーの概略図である。 ＢＭＰ７代替化合物の一次スクリーニングの３８４ウェルプレートにおける３日目のｍＮＰＣ細胞塊の代表的な画像を示す。左端の上側８ウェル及び右端の下側８ウェルは陽性対照（ＢＭＰ７あり）であり、右端の上側８ウェル及び左端の下側８ウェルは陰性対照（ＢＭＰ７なし）である。丸で囲ったウェルは、ＪＡＫ３阻害剤ＣＰ－６９０５５０で処理したウェルである。 ＮＰＳＲ培地、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地に様々なＪＡＫ阻害剤を添加して培養したｍＮＰＣの相対的細胞生存率を示すグラフである。細胞生存率はＡＴＰアッセイにより測定した。ＪＡＫ阻害剤はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。測定結果は、ＤＭＳＯ（１００％）を添加したＮＰＳＲ培地で培養したコントロールにより正規化し、平均±ＳＥＭとして示した（ＴＣＳ２１３１１についてはｎ＝６、その他についてはｎ＝３）。 ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（－ＢＭＰ７）、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（＋ＴＣＳ２１３１１）、又はＮＰＳＲ培地（＋ＢＭＰ７）で、４日間維持されたｍＮＰＣ細胞塊の代表的な明視野画像（ＢＦ）および蛍光画像（Ｓｉｘ２－ＧＦＰ）を示す。スケールバー：３００μｍ。 ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（－ＢＭＰ７）、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（＋ＴＣＳ２１３１１）、又はＮＰＳＲ培地（＋ＢＭＰ７）で維持されたｍＮＰＣ細胞塊に由来する培養３日目（上パネル）及び７日目（下パネル）の腎臓オルガノイドの明視野画像である。スケールバー：３００μｍ。 ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で維持したｍＮＰＣ由来の腎臓オルガノイドにおけるＷｔ１、Ｌｏｔｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｌｅｃｔｉｏｎ（ＬＴＬ）、Ｃｄｈ１、Ｐｏｄｘｌ、及びＢｒｎ１のレクチン染色及び免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。スケールバー：２００μｍ。 ＢＭＰ７を含むＮＰＳＲ培地及びＢＭＰを除いたＮＰＳＲ培地で培養されたｍＮＰＣにおける差次的発現遺伝子の上位５００個の遺伝子オントロジー解析の結果を示す。 ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地で培養したｍＮＰＣと比較して、ＮＰＳＲ培地で培養したｍＮＰＣにおいて差次的に発現する遺伝子の古典的経路解析の結果を示す。－ｌｏｇ（ｐ値）スコアが１０以上の場合を示した。棒グラフのパターンは、解析したデータセットから予測される経路の活性を示す。パターンの濃淡は、予測された全体的な活性の低下を表し、白抜きは予測の対象とならない経路を示す。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（ｎｏ　ＢＭＰ）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのリン酸化Ｓｔａｔ３（ｐＳｔａｔ３）のタンパク質レベルを示す。ｐＳｔａｔ３のタンパク質レベルは、キャピラリーウエスタンブロットアッセイにより評価した。グラフ中の値は、総Ｓｔａｔ３タンパク質レベルで正規化されたｐＳｔａｔ３シグナルの曲線下面積の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ＮＰＳＲで培養したコントロールに対する相対値として示した。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（Ｎｏ　ＢＭＰ７）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのＳｔａｔ３及びリン酸化Ｓｔａｔ３のタンパク質レベルを評価したキャピラリーウエスタンブロットアッセイの代表的な画像である。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（ｎｏ　ＢＭＰ７）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地で培養したｍＮＰＣにおけるＳｍａｄ７発現及びＳｏｃｓ３発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析結果を示す。３つの独立した実験からのデータを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。ＮＰＳＲで培養したコントロールに対する相対値として示した。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（ｎｏ　ＢＭＰ）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのリン酸化Ｓｍａｄ１／５（ｐＳｍａｄ１／５）及びリン酸化Ｅｒｋ１／２（ｐＥｒｋ１／２）のタンパク質レベルを示す。ｐＳｍａｄ１／５及びＥｒｋ１／２のタンパク質レベルは、キャピラリーウエスタンブロットアッセイにより評価した。グラフ中の値は、Ｓｍａｄ１／５又はＥｒｋ１／２の総タンパク質レベルで正規化されたｐＳｍａｄ１／５又はｐＥｒｋ１／２シグナルの曲線下面積の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）を示す。ＮＰＳＲで培養したコントロールに対する相対値として示した。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（Ｎｏ　ＢＭＰ７）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのＥｒｋ１／２及びリン酸化Ｅｒｋ１／２のタンパク質レベルを評価したキャピラリーウエスタンブロットアッセイの代表的な画像である。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（Ｎｏ　ＢＭＰ７）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのＳｍａｄ１／５及びリン酸化Ｓｍａｄ１／５のタンパク質レベルを評価したキャピラリーウエスタンブロットアッセイの代表的な画像である。 ＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地（Ｎｏ　ＢＭＰ７）、又はＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地（ＴＣＳ２１３１１）で培養したｍＮＰＣのＣｉｔｅｄ１発現及びＳｉｘ２発現のｑＲＴ－ＰＣＲ解析の結果を示す。３つの独立した実験からのデータを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。ＮＰＳＲで培養したコントロールに対する相対値として示した。 ＢＭＰ７を除いたＮＰＳＲ培地に様々なＪＡＫ阻害剤を添加して培養したｍＮＰＣの相対的細胞生存率を示すグラフである。細胞生存率はＡＴＰアッセイにより測定した。ＪＡＫ阻害剤はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。測定結果は、ＤＭＳＯ（１００％）を添加したＮＰＳＲ培地で培養したコントロールにより正規化し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 ＮＰＳＲ培地（ＮＰＳＲ）又はＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地（ＴＣＳ＋ＮＰＳＲ）で培養したｍＮＰＣの培養４日目の細胞塊の細胞数を、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示す。Ｐは継代数を示す。＊：Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－検定によるｐ＜０．０５。 ＮＰＳＲ培地にＴＣＳ２１３１１を添加した培地で２回継代したｍＮＰＣに由来する腎臓オルガノイドのＰｏｄｘｌ、ＬＴＬ及びＣｄｈ１のレクチン染色及び免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。スケールバー：２００μｍ。 ＮＰＳＲ培地（ＮＰＳＲ　ｍｅｄｉｕｍ）又はＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地（ＮＰＳＲ＋ＴＣＳ）で培養したｈｉＰＳＣ由来のＮＰＣ細胞塊の培養０日目及び４日目における細胞数を、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝４）として示した。 ＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で培養したｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣ細胞塊の培養０日目及び１０日目における細胞数を、平均＋ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 ＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で１０日間維持されたｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣ細胞塊におけるＤＡＰＩ（－）生細胞中のＳＩＸ２（ｔｄＴｏｍａｔｏ）（＋）細胞の割合を示す。 ＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で１０日間維持したｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣのＳＩＸ２（ｔｄＴｏｍａｔｏ）、ＯＳＲ１（ＧＦＰ）及びＨＯＸＤ１１の免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～１６ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～１２ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（１００％）又は終濃度２ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＣＥＰ３３７７９はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ又は終濃度２ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＣＥＰ３３７７９はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（１００％）又は終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＴＧ１０１３４８はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（１００％）又は終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度２ｎＭのＣＥＰ３３７７９又は終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で４回継代した後のｍＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＬｏｔｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）のレクチン染色およびＣｄｈ１、Ｐｏｄｘｌの免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（１００％）又は終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で、ＡＤＰＫＤ（常染色体優性多発性嚢胞腎）モデルマウス由来のｍＮＰＣを培養したときの細胞数を示す。ＣＥＰ３３７７９はＤＭＳＯに溶解してＮＰＳＲ培地に添加した。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地＞
　本発明の第１の態様は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地である。一実施形態において、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤を含む。また、一実施形態において、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む。また、一実施形態において、本態様の培地は、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＴＣＳ２１３１１を含む。また、一実施態様において、本態様の培地は、上記成分に加えて、ＢＭＰ７をさらに含む。
（ネフロン前駆細胞：ＮＰＣ）
　ＮＰＣは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化し得る細胞である。ネフロン前駆細胞の器官構造への分化能は、例えば、Ｏｓａｆｕｎｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３３：１５１－６１に記載の方法によって評価し得る。ネフロン前駆細胞としての状態を維持するための特徴的な因子としてＳＩＸ２が知られており（Cell Stem Cell 3:169－181 (2008)）、本態様の方法で培養されるネフロン前駆細胞の例として、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞が挙げられる。例えば、ＳＩＸ２プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Nat Commun 4,1367,(2013)）等の遺伝子発現を分析する方法によって、ネフロン前駆細胞におけるＳＩＸ２の発現を確認することもできる。本明細書において、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞には、ＳＩＸ２タンパク質を発現している細胞、およびＳＩＸ２プロモーター制御下にある遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。ヒトのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０７３６）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９３２．５で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子、マウスのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２０４７２）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１１３８０．２で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。本態様の培地で培養されるネフロン前駆細胞は、好ましくは、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２及びＳＡＬＬ１が陽性である。
　ネフロン前駆細胞は、生体の後腎間葉から単離されたものであってもよく、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）から分化誘導したものであってもよい。
　多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の分化誘導は、公知の方法により行うことができる。多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０１４／２００１１５号、国際公開第２０１７／０４３６６６号、国際公開第２０１８／２１６７４３号等に記載の方法が挙げられる。
　後腎間葉から採取された細胞集団又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団からのネフロン前駆細胞の単離は、例えば、上記ネフロン前駆細胞のマーカーであるＯＳＲ１、ＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２、又はＳＡＬＬ１の発現を指標として行うことができる。あるいは、ＭＥＴ、又はＡＧＴＲ２の発現を指標として行うことができる（国際公開第２０２０／０２２２６１号）。
　本態様の培地で拡大培養されるネフロン前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化されたネフロン前駆細胞の細胞集団として提供されてもよい。ネフロン前駆細胞と他の細胞腫とを含む細胞集団である場合、ネフロン前駆細胞数の割合は、全細胞数（１００％）に対して、３０％、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましい。
（拡大培養）
　「拡大培養」とは、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を増殖させる培養を意味する。すなわち、拡大培養したネフロン前駆細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化することができる。本態様の培地は、継代を繰り返しても、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を拡大培養することができる。
（培地）
　本態様の培地は、動物培養に用いられる基礎培地に、ＪＡＫ阻害剤を添加したものであってもよい。また、ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される、少なくとも１種をさらに添加したものであってもよい。
≪基礎培地≫
　基礎培地は、特に限定されず、動物培養に通常用いられるものを特に制限なく使用することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。また、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、及びこれらの同等物などの１つ以上の物質を含んでいてもよい。
　基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地（例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を１：１で混合した混合培地）に、アミノ酸、非必須アミノ酸、血清代替物等を添加したものであってもよい。
≪ＪＡＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤を含む。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ　ｋｉｎａｓｅ）ファミリー（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）の１種類以上の酵素の活性を阻害する物質である。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素活性を阻害することにより、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ系のシグナル伝達を阻害する。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３からなる群より選択される少なくとも１種の酵素活性を阻害するものが好ましく、ＪＡＫ３の酵素活性を阻害するものがさらに好ましい。すなわち、ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、及びＪＡＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、ＪＡＫ３阻害剤であることがより好ましい。
　ＪＡＫ３阻害剤は、ＪＡＫ３の活性を阻害できるものであれば特に限定されない。ＪＡＫ３阻害剤としては、例えば、ＴＣＳ２１３１１（ＣＡＳ番号　１２６０１８１－１４－３）、ＷＨＩ－Ｐ１５４（ＣＡＳ　２１１５５５－０４－３）、ＰＦ－０６６５１６００（ＣＡＳ番号　１７９２１８０－８１－４）、ＦＭ－３８１（ＣＡＳ番号　２２２６５２１－６５－７）、ＣＰ６９０５５０（ＣＡＳ番号　５４０７３７－２９－９）、７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステル、ＪＡＫ３　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ　ＩＶ（ＣＡＳ番号５８７５３－５４－１）、ＺＭ４４９８２９（ＣＡＳ番号４４５２－０６－６）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ番号９３５６６６－８８－９）、及びＳｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＪＡＫ３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１（ＣＡＳ番号１４４３２３５－９５－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１が好ましい。
　ＪＡＫ２阻害剤は、ＪＡＫ２の活性を阻害できるものであれば、特に限定されない。ＪＡＫ２阻害剤としては、例えば、ＮＶＰ－ＢＳＫ８０５　２ＨＣｌ（ＣＡＳ番号１９４２９１９－７９－０）、ＴＧ１０１２０９（ＣＡＳ番号９３６０９１－１４－４）、ＴＧ１０１３４８（ＣＡＳ番号９３６０９１－２６－８）、１，２，３，４，５，６－ヘキサブロモシクロヘキサン（ＣＡＳ番号１８３７－９１－８）、ＣＥＰ－３３７７９（ＣＡＳ番号１２５７７０４－５７－６）、及びＮＳＣ３３９９４（ＣＡＳ番号８２０５８－１６－０）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ２／３阻害剤であってもよい。ＪＡＫ２／３阻害剤は、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ２／３阻害剤としては、例えば、ＡＧ４９０（ＣＡＳ番号１３３５５０－３０－８）、ＡＴ９２８３（ＣＡＳ番号８９６４６６－０４－９）、及びＬＹ３００９１０４（ＣＡＳ番号１１８７５９４－０９－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１／２阻害剤であってもよい。ＪＡＫ１／２阻害剤は、ＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ１／２阻害剤としては、例えば、ＣＹＴ３８７（ＣＡＳ番号１０５６６３４－６８－４）、Ｓ－Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＩＮＣＢ０１８４２４）（ＣＡＳ番号９４１６８５－３７－６）、及びＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ番号１２２９２３６－８６－５）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ヤヌスキナーゼファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＪＡＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ３阻害剤が好ましく、ＴＣＳ２１３１１がさらに好ましい。
　本態様の培地におけるＪＡＫ阻害剤の濃度は、ＪＡＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、０．００１μＭ以上、０．００２μＭ以上、０．００３μＭ以上、０．００４μＭ以上、０．００５μＭ以上、０．００６μＭ以上、０．００７、０．００８μＭ以上、０．００９μＭ以上、０．０１μＭ以上の濃度で用いることができる。ＪＡＫ阻害剤の濃度の上限値としては、例えば、１００μＭ以下、５０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、５μＭ以下、３μＭ以下等が挙げられる。ＪＡＫ阻害剤が、ＴＣＳ２１３１１である場合、ＴＣＳ２１３１１の培地における濃度は、例えば、０．００１～１０μＭ、０．０１～３μＭ、０．０１～２μＭ、又は０．０１～１μＭ等が挙げられる。ＪＡＫ阻害剤が、ＣＥＰ３３７７９である場合、ＣＥＰ３３７７９の培地における濃度は、例えば、０．５～２０ｎＭ、１～８ｎＭ、１～４ｎＭ、又は１～３ｎＭ等が挙げられる。ＪＡＫ阻害剤が、ＴＧ１０１３４８である場合、ＴＧ１０１３４８の培地における濃度は、例えば、０．５～５０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、１～１０ｎＭ、又は１～５ｎＭ等が挙げられる。
≪ＦＧＦ２≫
　本態様の培地は、ＦＧＦ２を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＦＧＦ２を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）２は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）とも呼ばれる。ＦＧＦ２が由来する生物は特に限定されない。ＦＧＦ２としては、例えば、ヒトＦＧＦ２を用いることができる。ヒトＦＧＦ２（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２２４７）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１３４８５９４．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ２はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＦＧＦ２は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＦＧＦ２の濃度は、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、２０～４００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは、５０～３５０ｎｇ／ｍＬである。
≪ヘパリン≫
　本態様の培地は、ヘパリンを含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ヘパリンを含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ヘパリンは、塩の形態であることが好ましい。ヘパリンの塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄などの金属との塩；アンモニウム塩；有機塩基との塩；及びアミノ酸との塩等が挙げられる。中でも、ヘパリンは、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
　培地におけるヘパリンの濃度は、例えば、０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは、０．０５～５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１～１０μｇ／ｍＬである。
≪ＲＯＣＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を阻害する物質である。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（例、Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983(2000); Narumiya et al.,Methods Enzymol.325, 273-284 (2000)参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Uenata et al.,Nature 389:990-994(1997）参照）、Ｈ－１１５２（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232(2002)参照）、Ｗｆ－５３６（例、Nakajima et al.,Cancer Chemother Pharmacol. 52(4):319-324(2003)参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ－２７６３２が挙げられる。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、０．１～１００μＭ、好ましくは、１～７５μＭ、さらに好ましくは、５～５０μＭである。
≪ＧＳＫ３β阻害剤≫
　本態様の培地は、ＧＳＫ３β阻害剤を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＧＳＫ３β阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２）、及びＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン－３－カルボニトリル）、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。培地におけるＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、ＧＳＫ３β阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＧＳＫ３β阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＧＳＫ３βの濃度としては、例えば、０．０１～１００μＭ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、０．５～３μＭであり、特に好ましくは、０．５～１．５μＭである。
≪ＬＩＦ≫
　本態様の培地は、白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＬＩＦを含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＬＩＦが由来する生物は、特に限定されない。ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特表平１－５０２９８５号公報）、マウス（特表平１－５０２９８５号公報）、ヒツジ（特表平４－５０２５５４号公報）、ブタ（特表平４－５０２５５４号公報）、ウシ（特表平８－１５４６８１号公報）等のＬＩＦを用いることができる。中でも、ヒト又はマウスのＬＩＦが好ましい。ヒトＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：３９７６）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１２４４０６４．１又はＮＰ＿００２３００．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。マウスＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１６８７８）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３４６２６．１又はＮＰ＿０３２５２７．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＬＩＦは、ネフロン前駆細胞が由来する生物に応じて適宜選択することができる。例えば、ネフロン前駆細胞がマウス由来である場合、マウスＬＩＦを用いることが好ましい。ネフロン前駆細胞がヒト由来である場合、ヒトＬＩＦを用いることが好ましい。ＬＩＦはネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片及び機能的改変体であってもよい。ＬＩＦは市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＬＩＦの濃度は、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、５０～２５０ｎｇ／ｍＬである。また、培地におけるＬＩＦの濃度は、例えば、１０～５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、好ましくは、１００～３０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは、５００～２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬである。
≪ＡＬＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＡＬＫ阻害剤を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＡＬＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ）ファミリーの機能を阻害する物質である。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＴＧＦβのＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質等が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５又はＡＬＫ７の阻害剤が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩアクセッション番号として、マウス：ＮＰ＿０３４２２４．１、ヒト：ＮＰ＿０６６２７７．１が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃａｎｃｅｒ，　２００３，　２：２０）、ＳＢ５０５１２４　（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８　（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６　（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、ＷＯ２００９１４６４０８）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫファミリーに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＡＬＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＡＬＫ阻害剤としては、Ａ８３－０１が挙げられる。培地におけるＡＬＫ阻害剤の濃度は、ＡＬＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＬＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＡＬＫ阻害剤の濃度としては、例えば、０．０１～１０００ｎＭ、好ましくは、０．１～５００ｎＭ、さらに好ましくは、１～１００ｎＭであり、特に好ましくは、１０～８０ｎＭである。
≪ＢＭＰ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＢＭＰ阻害剤を含むことが好ましい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＢＭＰ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナル伝達を阻害する物質である。ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰの受容体であるＡＬＫ２又はＡＬＫ３のキナーゼ活性を阻害する物質であってもよい。ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤；Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）（Ｐ．　Ｂ．　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　（２００７），　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　１１６：ＩＩ＿６０；　Ｐ．Ｂ．　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　（２００８），　Ｎａｔ．　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，　４：３３－４１；　Ｊ．　Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　（２００８），　ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，　３（８）：ｅ２９０４)、及びＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ１(ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１；４－［６－（４－ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＢＭＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＢＭＰ阻害剤としては、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１が挙げられ、ＬＤＮ１９３１８９がより好ましい。培地におけるＢＭＰ阻害剤の濃度は、ＡＬＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＬＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。培地におけるＡＬＫ阻害剤の濃度としては、例えば、０．０１～１０００ｎＭ、好ましくは、０．１～５００ｎＭ、さらに好ましくは、０．５～１００ｎＭであり、特に好ましくは、１～５０ｎＭである。
≪ＢＭＰ７≫
　本態様の培地は、ＢＭＰ７を含んでいてもよい。ＪＡＫ阻害剤に加えて、ＢＭＰ７を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＢＭＰ７が由来する生物は特に限定されない。ＢＭＰ７としては、例えば、ヒトＢＭＰ７を用いることができる。ヒトＢＭＰ７（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６５５）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１７１０．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ７はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＢＭＰ７は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＢＭＰ７の濃度は、例えば、０．１～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、１０～１００ｎｇ／ｍＬである。
　本態様の培地は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の成分を含むことができる。
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤を含むことが好ましい。一例として、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤としてＴＣＳ２１３１１を含むことができる。一例としては、本態様の培地は、ＴＣＳ２１３３、ＦＧＦ２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＤＮ１９３１８９、及びＡ８３－０１を含むことができる。
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の分化能を維持したまま、良好にネフロン前駆細胞を増殖させることができ、高価なＢＭＰ７を用いる必要がない。そのため、ＢＭＰ７を含む従来のネフロン前駆細の胞拡大培養用培地と比較して、コストを低減することができる。
　本態様の培地は、さらにＢＭＰ７を含んでいてもよい。一例として、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＢＭＰ７を含んでいてもよい。一例として、本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤として、ＴＣＳ２１３１１、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＰＦ－０６６５１６００、ＦＭ－３８１、ＣＰ６９０５５０、７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステル、ＣＥＰ３３７７９、及びＴＧ１０１３４８からなる群より選択される少なくとも１種を含むことができる。一例としては、本態様の培地は、前記のようなＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＡＤＮ１９３１８９、Ａ８３－０１、及びＢＭＰ７を含むことができる。
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤に加えてＢＭＰ７を含むことで、ネフロン前駆細胞の分化能を維持したまま、より良好にネフロン前駆細胞を増殖させることができる。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法＞
　本発明の第２の態様は、前記第１の態様の培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法である。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いる限り、培養方法は特に限定されない。ネフロン前駆細胞は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件で培養することができる。培養温度は、ネフロン前駆細胞が増殖できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ネフロン前駆細胞は、通常ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養することができる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　培養期間は、特に限定されず、任意の期間をすることができる。本態様の方法では、第１の態様の培地を用いることにより、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、長期間培養することができる。長期間培養する場合、適宜、継代することが好ましい。前記第１の態様の培地を用いて継代を繰り返すことで、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、ネフロン前駆細胞の培養を続けることができる。継代は、培養液からネフロン前駆細胞の細胞塊を採取し、新たな培地に播種することにより、行うことができる。継代の際には、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、及びＤＮＡａｓｅ等の酵素を含む細胞分散液を用いて、細胞塊を分散した後、新たな培地に播種してもよい。継代の間隔は、特に限定されないが、例えば、２～１０日程度、又は３～７日程度とすることができる。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いてネフロン前駆細胞を培養するため、効率よくネフロン前駆細胞を増殖させることができる。本態様の方法で拡大培養されたネフロン前駆細胞は、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。また、後述の腎臓オルガノイドの製造のために用いることができる。
＜腎臓オルガノイドの製造方法＞
　本発明の第３の態様は、腎臓オルガノイドの製造方法である。本態様の腎臓オルガノイドの製造方法は、前記第２の態様の方法により、ネフロン前駆培養を拡大培養する工程（拡大培養工程）と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程（分化工程）と、を含む。
（拡大培養工程）
　拡大培養工程は、前記第２の態様の方法により行う。本工程により、ネフロン前駆細胞を所望の数まで効率よく増殖させることができる。
（分化工程）
　ネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドへの分化は、公知の方法により行うことができる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）で報告されている方法等を用いることができる。例えば、前記拡大培養工程で得られたネフロン前駆細胞の細胞塊を、３Ｔ３－Ｗｎｔ４細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、又はマウス胎仔腎細胞と共培養してもよい。あるいは、ネフロン前駆細胞の細胞塊を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む基礎培地を使用した半気相培養（好ましくは、気相－液相培養；Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）参照）で培養してもよい。前記半気相培養で使用する培地は、ＧＳＫ３β阻害剤に加えて、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２等を含んでいてもよい。基礎培地、ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ２としては、上記と同様のものが挙げられる。好ましい基礎培地としてはＫＳＲが挙げられる。好ましいＧＳＫ３β阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。好ましいＦＧＦ２としてはヒトＦＧＦ２が挙げられる。好ましいＦＧＦ９としては、ヒトＦＧＦ９が挙げられる。ヒトＦＧＦ９としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２００１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９は腎臓オルガノイドへの分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含される。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　分化工程における培養条件は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件を用いることができる。培養温度は、腎オルガノイドに分化誘導できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　本態様の製造方法により得られた腎臓オルガノイドは、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。
＜他の態様＞
　本発明は、前記第２の態様の方法で得られたネフロン前駆細胞又は前記第３の態様の製造方法で得られた腎臓オルガノイドを含む医薬組成物もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドを含む腎疾患治療剤もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドの治療有効量を、腎疾患を有する対象又は腎疾患のリスクを有する対象に投与する工程を含む、腎疾患を治療又は予防する方法もまた提供する。
　腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記ネフロン前駆細胞の投与方法としては、例えば、前記ネフロン前駆細胞をシート化して、対象の腎臓に貼付する方法；前記ネフロン前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液を対象の腎臓に移植する方法；前記ネフロン前駆細胞を三次元培養（例えば、Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ　１１，２０１２；２３（３）：６３７－６５１）し、得られた細胞塊を対象の腎臓に直接移植する方法；前記ネフロン前駆細胞をマトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた細胞塊を対象の腎臓に移植する方法等が挙げられる。移植部位は、腎臓内であれば特に限定されないが、好ましくは、腎被膜下である。腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記腎臓オルガノイドの投与方法としては、対象の体内（例えば、腹腔内）に移植する方法等が挙げられる。
　治療又は予防対象となる腎疾患は、特に限定されないが、例えば、急性腎障害、慢性腎不全、慢性腎不全にまで至らない慢性腎臓病等が挙げられる。移植する前記ネフロン前駆細胞の細胞数又は前記腎臓オルガノイドの大きさは、移植後に生着できれば特に限定されず、疾患部位の大きさ、投与対象の体躯、年齢、性別等に合わせて、適宜調整することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［材料及び方法］
＜動物実験＞
　全ての動物実験は、京都大学動物実験委員会の承認を得て行った。Ｂ６；１２９－Ｓｉｘ２ｔｍ３（ＥＧＦＰ／ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ａｍｃ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｃ．から購入した（A. Kobayashi, et al., Cell Stem Cell. 3 (2008) 169-181.）。ＡＤＰＫＤモデルマウスであるＰｋｄ１－／－（ｄｅｌ２－６）マウスは、藤田医科大学より提供いただいた（S Muto, et al., Hum Mol Genet.11 (2002) 1731-1742.）。すべてのマウスは、京都大学ｉＰＳ細胞研究所の実験動物施設で、特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件で飼育した。マウスには、餌及び水を自由給餌した。
＜細胞培養＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣｓ）を用いた実験は、京都大学医学部大学院医学研究科の倫理委員会の承認を受け、施設審査委員会に従い、ｉＰＳＣｓの提供者のインフォームドコンセントを得た。ｈｉＰＳＣは、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした細胞培養プレート上に、Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（Ｔａｋａｒａ）を用いたフィーダーフリー培養で維持した。細胞を０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５日毎に継代し、マイコプラズマ汚染の有無を定期的に検査した。マウスネフロン前駆細胞（ｍＮＰＣ）の回収及び維持培養は、既報のように実施した（Z. Li, T. et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.; Z. Li, et al., Kidney Organog Methods Protoc, Hummana Press, New York, 2019: pp. 151-159.）。
　ｍＮＰＣの培養には、表１に示すＮＰＳＲ培地を用いた。ｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣの培養には、表２に示すｈＮＰＳＲ培地を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜ｈｉＰＳＣｓからのＮＰＣの分化誘導＞
　ＮＰＣへの分化誘導は、R. Morizane, et al., Nat Biotechnol. 33 (2015) 1193-1200、又はTsujimoto et al., Cell Report. 31 (2020), 107476に記載の方法（以下、それぞれ「Ｍｏｒｉｚａｎｅの方法」及び「Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏの方法」という）で実施した。
＜免疫染色＞
　腎臓オルガノイドを、４％ＰＦＡ（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）／ＰＢＳ（－）を用いて４℃で一晩固定した。固定したオルガノイドを、ＰＢＳ（－）で２回洗浄し、３０％スクロース（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）／ＰＢＳ（－）を用いて４℃で一晩処理した後、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ）で凍結し、凍結切片を作製した。凍結切片を、２％ロバ血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）／０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）／ＰＢＳ（－）溶液を用いて室温で３０分間インキュベートした。一次抗体を、２％ロバ血清／ＰＢＳ（－）溶液で希釈し、サンプルと４℃で一晩インキュベートした。その後、二次抗体を用いて４℃で２時間インキュベートした。使用した抗体又はレクチンを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３中の略語は、以下の意味を示す。
　Ｂｒｎ１：Ｂｒａｉｎ１；Ｃｄｈ１：　Ｃａｄｈｅｒｉｎ１；ＬＴＬ：Ｌｏｔｕｓ　ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｌｅｃｔｉｎ；Ｅｒｋ１／２：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ　１／２；Ｓｉｘ２：Ｓｉｎｅ　Ｏｃｕｌｉｓ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｈｏｍｏｌｏｇ　２；Ｐｏｄｘｌ：Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ１；Ｓｍａｄ１：Ｍｏｔｈｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ　ｈｏｍｏｌｏｇ１；Ｓｔａｔ３：Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　３；Ｗｔ１：Ｗｉｌｍｓ　ｔｕｍｏｒ　１。
＜ＢＭＰ７代替物のスクリーニング＞
　スクリーニング用の細胞を調製するために、マウスＮＰＣ－３Ｄ培養を確立し、Ｓｉｘ２－ＧＦＰレポーターマウスから取得したｍＮＰＣを既報のように維持した（Z. Li, T. et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.; Z. Li, et al., Kidney Organog Methods Protoc, Hummana Press, New York, 2019: pp. 151-159.）。１０～３０回継代したｍＮＰＣを、スクリーニング試験に用いた。低接着Ｕ底３８４ウェルプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ　Ｂａｋｅｌｉｔｅ）に、２．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ｍＮＰＣを解離して播種した。カスタム調製された低分子ライブラリーを、１ウェルあたり、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１ｍＭのストックをアレイ形式でプレートに供給した。個々の化合物は、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐディスペンサー（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて希釈し、１μＭの最終濃度でＢｉｏｍｅｋ　ＮＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてアッセイプレートに移した。細胞播種から７２時間後、細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、Ａｒｒａｙ　Ｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。定量化パラメータとして、ｍＮＰＣの細胞塊の真円度、大きさ、及び平均ＧＦＰシグナルを用いた。各アッセイプレートは、それぞれ、ＢＭＰ７有り又は無しのＮＰＳＲ培地を含むポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含むように設計された。
＜細胞生存率アッセイ＞
　ＡＴＰの定量を用いた細胞生存率アッセイのために、低接着Ｕ底３８４ウェルプレート（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ　Ｂａｋｅｌｉｔｅ）に、２．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、ｍＮＰＣを解離して播種した。カスタムメイドのＪＡＫ阻害剤ライブラリーを用いた。各化合物を希釈し、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ又は３μＭの最終濃度で、Ｂｉｏｍｅｋ　ＮＸを使用してアッセイプレートに移した。細胞播種から７２時間後、細胞を洗浄し、ＡＴＰ量をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ　２．０　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析した。各アッセイプレートは、それぞれ、ＢＭＰ７有り又は無しのＤＭＳＯ添加ＮＰＳＲ培地を含むポジティブコントロール及びネガティブコントロールを含むように設計された。
＜イメージング＞
　オルガノイドの蛍光画像又は明視野画像を、ＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－Ｘ７００又は共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ７１０）で撮影した。画像解析は、Ｉｍａｇｅ　Ｊ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５１ｊ８　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）を用いて行った（C.A. Schneider, et al., Nat Methods. 9 (2012) 671-675.）。
＜フローサイトメトリー及びセルソーティング＞
　ＮＰＣの分化のために、以前に作製したＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏダブルノックインｈｉＰＳＣ株（T. Toyohara, et al., Stem Cells Transl Med. 4 (2015) 980-992.）を使用した。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）で解離した後、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏ発現について、細胞を分析した。４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＰＩ；０．１ｎｇ／ｍＬ；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色された死細胞は、分析から除外した。データは、ＦＡＣＳ　Ｄｉｖａ（ＢＤ）ソフトウェアプログラムを用いて解析した。
＜ＲＮＡシーケンシング＞
　既報のＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＧＳＥ７８７７２）を使用した（Z. Li, et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.）。ＢＭＰ７有り又は無しで培養したＮＰＣの細胞塊のｍＲＮＡ－ｓｅｑデータを比較した。転写物の定量は、ＧＲＣｍ３８．ｐ６　ｃＤＮＡ遺伝子アノテーション（Ｅｎｓｅｍｂｌ）でＳａｌｍｏｎ（R. Patro, et al., Nat Methods. 14 (2017) 417-419.）を用いて行った。Ｓａｌｍｏｎからの出力をＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　ｐａｃｋａｇｅ　ｔｘｉｍｐｏｒｔを用いて処理し、遺伝子発現値を取得した。遺伝子発現量は、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ＋１）で示した。遺伝子発現量が異なる上位５００の遺伝子について、Ｍｅｔａｓｃａｐｅ（Y. Zhou, et al., Nat Commun. 10 (2019).）を用いて遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析を行った。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ；ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、カットオフ値を±１．５　ｌｏｇ２　ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅとした古典的経路解析を行い、ＢＭＰ７有り培養及びＢＭＰ７無し培養で、それぞれ、２，６４７個及び１，２９３個の上方制御遺伝子を解析した。
＜タンパク質アッセイ＞
　ｍＮＰＣの細胞塊を、氷上で、ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｓｅｔ　ＤＭＳＯ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｋｏ）及びＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｗａｋｏ）を添加したＲＩＰＡ　ｂｕｆｆｅｒ（ＷＡＫＯ）中でピペッティングすることにより解離させ、遠心分離により細胞残渣を除去した。タンパク質濃度を、ＸＬ－Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ａｓｓａｙ　（Ａｐｒｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）により分析し、Ｐｏｗｅｒ　ｓｃａｎ　（ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｉｎｃ．）を用いて測定した。
　Ｓｔａｔ３、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｓｔａｔ３（Ｓｅｒ７２７）、Ｅｒｋ１／２、Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｒｋ１／２、Ｓｍａｄ１及びＰｈｏｓｐｈｏ－Ｓｍａｄ１／５のタンパク質測定は、ＢＭＰ７を含むＮＰＳＲ培地、ＢＭＰ７を含まないＮＰＳＲ培地、及び３μＭ　ＴＣＳ２１３１１を含むＮＰＳＲ培地におけるｍＮＰＣの細胞塊の細胞溶解物を用いて行った。タンパク質発現は、キャピラリーウエスタンブロットアッセイ（J.Q. Chen, et al., Anal Biochem. 442 (2013) 97-103.）（Ｗｅｓ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ　ｆｏｒ　１２－２３０　ｋＤａ，ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）により定量した。タンパク質（０．５μｇ／サンプル）をキャピラリー内のサイズ分解マトリックスを介して分離し、内側のキャピラリー壁に固定化し、抗体希釈バッファー（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）中で１：５０の濃度で一次抗体（表３参照）とインキュベートし、抗ウサギ又は抗マウス二次抗体とインキュベートした後、化学発光を使用して検出した。標的タンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）として反映されたシグナルは、ラン終了時に自動的に生成された。リン酸化タンパク質量は、対応する全標的タンパク質のＡＵＣで標準化された各サンプルからのＡＵＣの比率として定量された。Ｔｏｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して、総タンパク質アッセイを実施した。ＡＵＣ測定に先立ち、各標的タンパク質の線形回帰分析を用いて、試料濃度の直線的な動的範囲を確認した。
＜ＲＴ－ＰＣＲ及びリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）＞
　全ＲＮＡは、製造者の推奨に従い、ＲＮｅａｓｙ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、その後、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）の標準プロトコールを用いてｃＤＮＡ合成を行った。ｑＰＣＲは、Ｓｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。変性を９５℃、３０秒で行い、次いで９５℃で５秒、６０℃で３４秒のサイクルを４０サイクル行った。製造者の推奨に従い、閾値サイクル法を用いて遺伝子発現量のデータ解析を行い、その値をハウスキーピング遺伝子であるβ－Ａｃｔｉｎの発現量で標準化した。ＰＣＲ反応は、各サンプルについて３回行った。プライマー配列を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４中の略語は、以下の意味を示す。
　Ａｃｔｂ：β－Ａｃｔｉｎ；Ｂｍｐ７：Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　７；Ｓｍａｄ７：Ｍｏｔｈｅｒｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ　ｈｏｍｏｌｏｇ　７；Ｓｏｃｓ３：Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　３。
＜統計解析＞
　データは平均値±ＳＥＭで表される。実験が２つの独立群で構成されている場合、平均値を比較するためにスチューデントのｔ検定を行った。多群比較には，Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ　ｐｏｓｔ　ｈｏｃ検定を用いた．
［結果］
＜ＢＭＰ７代替化合物のスクリーニング＞
　ＮＰＳＲ培地におけるＢＭＰ７の役割を調べるために、まず、ＢＭＰ７を添加しないＮＰＳＲ培地でｍＮＰＣを培養した。ＢＭＰ７を添加したＮＰＳＲ培地で培養したｍＮＰＣの細胞塊と比較して、ｍＮＰＣの細胞塊の生育は良好ではなかった（図１）。次に、Ｓｉｘ２－ＧＦＰ発現を測定することにより、ＢＭＰ７の非存在下で細胞増殖を増加させる化合物を同定するためのスクリーニングを行った（図２）。試験した４，３９５個の化合物のうち、細胞塊の真円度及び大きさに基づいて、３４個を１次ヒット化合物とした（データは示さず）。その後、細胞塊の増殖速度及びＧＦＰシグナルに基づいて、各キャプチャ画像を解析した。最終的に、候補化合物として、選択的ＪＡＫ３阻害剤であるＣＰ６９０５５０を同定した（図３、丸で囲ったウェル）。
　次に、ＪＡＫ３阻害がＢＭＰ７シグナル伝達を代替するかどうかを確認するために、０．０１３μＭ、０．０３３μＭ、０．１３μＭ、０．３３μＭ、１３μＭ又は３μＭの最終濃度で複数のＪＡＫ阻害剤でｍＮＰＣを処理し、ＡＴＰ定量アッセイを用いて細胞生存率を解析した（図４）。ＪＡＫ３阻害剤、ＪＡＫ２／３阻害剤、ＪＡＫ１／２阻害剤、又はＪＡＫ２阻害剤で処理した細胞は、ＤＭＳＯで処理した細胞よりも高い生存率を示したが、ＪＡＣ３阻害剤であるＴＣＳ２１３１１の高濃度が、他のＪＡＫ阻害剤よりもはるかに強力な効果を示した（図４）。
　次に、３μＭのＴＣＳ２１３１１を含み、ＢＭＰ７を含まない培地でｍＮＰＣの細胞塊を４日間維持し、この条件で、細胞塊が、糸球体と腎尿細管を含む腎臓オルガノイドに分化する可能性があることを確認した（図５～７）。これらの結果は、ｍＮＰＣ維持培養において、ＴＣＳ２１３１１がＢＭＰ７の代替となることを示している。
＜ＢＭＰ７はＮＰＣ拡大培養でＪＡＫ３関連シグナルを下方制御する＞
　次に、ＮＰＣ拡大培養におけるＢＭＰ７及びＴＣＳ２１３１１のメカニズムの解明を試みた。まず、ＢＭＰ７の非存在下での細胞応答を調べるために、既報のｍＮＰＣのＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（Z. Li, et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.）を入手し、ＢＭＰ７を添加したＮＰＳＲ培地又はＢＭＰ７を添加していないＮＰＳＲ培地で４日間培養し、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）解析を行った（図８）。ＤＥＧのＧＯ解析により、ＢＭＰ７を添加しないで培養したｍＮＰＣでは、ＢＭＰ７を添加して培養したｍＮＰＣに比べて、炎症反応関連シグナルが上方制御されることが明らかになった。ＩＰＡを用いた標準経路解析により、Ｓｔａｔ３又はＪａｋ３関連シグナルの予測された上方制御が確認された（図８）。キャピラリーウエスタンブロットアッセイでは、ＢＭＰ７を添加しないで培養したＮＰＣにおいてＳｔａｔ３のリン酸化（Ｓｅｒ７２７ではなくＴｙｒ７０５）が増加したが、ＢＭＰ７又はＴＣＳ２１３１１を添加することでその効果が逆転した（図９、１０）。マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）では、Ｓｔａｔ３シグナル伝達の標的遺伝子として、ｍｏｔｈｅｒｓ　ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ　ｈｏｍｏｌｏｇ　７（Ｓｍａｄ７）及びｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　３（Ｓｏｃｓ３）が報告されている（Y. Yu, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (2017) 10113-10118.）。ｑＰＣＲ解析により、ＢＭＰ７を添加しないで培養した場合、Ｓｍａｄ７とＳｏｃｓ３の上方制御が明らかになったが、これもＢＭＰ７又はＴＣＳ２１３１１の添加によって逆転した（図１１）。複数のＪＡＫ３阻害剤がＢＭＰ７非存在下でｍＮＰＣの生存率を向上させた結果（図４）と合わせて、これらのデータは、Ｂｍｐ７が、ＮＰＳＲ条件下でｍＮＰＣにおけるＪＡＫ３－ＳＴＡＴ３シグナル伝達を下方制御することを示唆している。
　一方、高濃度のＴＣＳ２１３１１が他のＪＡＫ阻害剤よりもｍＮＰＣの生存率にはるかに高い活性を及ぼすという知見（図４）は、ＴＣＳ２１３１１が、ＪＡＫ３－ＳＴＡＴ３シグナル伝達以外の他の標的分子又は標的経路を有していることを示唆している。ＢＭＰ７を添加しないで細胞を培養した場合、Ｓｍａｄ１／５およびＥｒｋ１／２のリン酸化が減少したのに対し、ＴＣＳ２１３１１の添加によりＳｍａｄ１／５のリン酸化のみが可逆的になったことから、ＴＣＳ２１３１１の潜在的な下流標的がＳｍａｄ１／５経路を含むことが示唆された（図１２～１５）。先行研究では、Ｓｔａｔ３がＳｉｘ２の上流調節因子であることが示されたが（S. Tanigawa, et al., Stem Cell Reports. 5 (2015) 435-447）、ＴＣＳ２１３１１処理は、ＮＰＳＲ条件と比較して、ＮＰＣの未分化状態のマーカーであるＳｉｘ２又はＣｉｔｅｄ１（S. Tanigawa, et al., Cell Rep. (2016) 1-13.）の発現レベルを有意に変化させなかったことから、ＴＣＳ２１３１１は、ＢＭＰ７を含まないＮＰＳＲ培地において、ＮＰＣの未分化状態を維持できることが示唆された（図１６）。
＜ＮＰＳＲ培地へのＴＣＳ２１３１１の添加はｍＮＰＣ増殖を促進する＞
　ＴＣＳ２１３１１の高濃度添加は、他のＪＡＫ阻害剤よりもはるかに高いｍＮＰＣ生存率を発揮するという知見（図４）は、ＮＰＳＲ培地へのＴＣＳ２１３１１の添加がｍＮＰＣの増殖に相加的な効果をもたらす可能性があるという仮説を導く。そこで、ＴＣＳ２１３１１を含むいくつかのＪＡＫ３阻害剤を、０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１、３μＭ又は１０μＭの最終濃度で、ＮＰＳＲ培地に添加して、ｍＮＰＣを培養した（図１７）。０．３μＭのＴＣＳ２１３１１は、試験したＪＡＫ３阻害剤の中で最も高い細胞生存率をもたらした。０．３μＭのＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で４日間培養した各ｍＮＰＣの細胞塊の総細胞数は、ＮＰＳＲ培地のみで培養したｍＮＰＣの細胞塊よりも有意に高かった（図１８）。
　次に、０．３μＭのＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で拡大培養したｍＮＰＣが、２回の継代で１２日間培養した後、腎臓オルガノイドに分化する能力があるかを試験した。その結果、糸球体及び腎尿細管を含む腎臓オルガノイドへの分化を確認できた（図１９）。これらの結果から、ＴＣＳ２１３１１は、維持培養において、ｍＮＰＣに対する増殖効果を有することが示された。
＜ＮＰＳＲ培地へのＴＣＳ２１３１１の添加はｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣの増殖を促進する＞
　ＴＣＳ２１３１１の細胞増殖効果が、ヒトＮＰＣにも適用できるかどうかを調べるために、ＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏノックインｈｉＰＳＣｓ（T. Toyohara, et al., Stem Cells Transl Med. 4 (2015) 980-992.）から、ＮＰＣへの分化誘導を行った。ＮＰＣへの分化誘導は、Ｍｏｒｉｚａｎｅの方法、又はＴｓｕｊｉｍｏｔｏの方法に記載の方法で実施した。ＯＳＲ１（ＧＦＰ）（＋）ＳＩＸ２（ｔｄＴｏｍａｔｏ）（＋）ＮＰＣをフローサイトメトリーによるソーティングにより精製し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ拡大培養実験に用いた。次いで、ｈｉＰＳＣ由来のＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）ＮＰＣを、ＮＰＳＲ培地又は０．３μＭのＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で維持した。その結果、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏの方法で得られたｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣに対するＴＣＳ２１３１１の増殖効果を確認できた（図２０）。さらに、ｈｉＰＳＣ由来ＯＳＲ１（＋）ＳＩＸ２（＋）ＮＰＣを、ＴＣＳ２１３１１を添加したＮＰＳＲ培地で１０日間維持することに成功した。その結果、ｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣの数は約１０倍に増加し（図２１）、１０日の培養後には９０％以上の細胞がＳＩＸ２（＋）であった（図２２、２３）。以上のことから、これらの結果は、ＴＣＳ２１３１１が、ｍＮＰＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣの両方に増殖効果を発揮することを示している。図２１及び２２において、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　１及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　２は、それぞれＭｏｒｉｚａｎｅの方法及びＴｓｕｊｉｍｏｔｏの方法で得られたｈｉＰＳＣ由来ＮＰＣを用いた結果を示す。
（実施例２）
［材料と方法］
＜細胞増殖＞
　ｍＮＰＳＲ培地で拡大培養したｍＮＰＣ（Z. Li, et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 1-14.６）の細胞塊を、１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除いた。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで希釈し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
　低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０Ｘ１０４ｃｅｌｌｓのｍＮＰＣを播種した。５０μＬのｍＮＰＳＲに対して、ＪＡＫ２阻害剤（ＣＥＰ３３７７９，ＴＧ１０１３４８）を、ＩＣ５０を中心に下記の濃度勾配を作製して添加した（ＣＥＰ３３７７９は、０．５，１，２，４，８，１６ｎＭ、ＴＧ１０１３４８は、０．７５，１．５，３，６，１２ｎＭ）。ｍＮＰＳＲ培地単独とｍＮＰＳＲ培地にＪＡＫ２阻害剤を添加した培地で懸濁した細胞を播種した９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始６時間後には細胞塊が形成された。
　静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ濃度のＪＡＫ２阻害剤が添加されたｍＮＰＳＲ培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加添加した。培地を追加添加してから４８時間後に、各ウェルの細胞塊を１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％　ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
　実験に使用したｍＮＰＳＲ培地の組成を表３に示す。ｍＮＰＳＲ培地は、表３に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表５に示す試薬を添加して作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜継代培養＞
　ｍＮＰＳＲ培地にＣＥＰ３３７７９（終濃度２ｎＭ）、ＴＧ１０１３４８（終濃度３ｎＭ）、又はＤＭＳＯを添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞塊を１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除いた。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分間静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％　ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０ｘ１０４　ｃｅｌｌｓのｍＮＰＣを、ｍＮＰＳＲ培地にＣＥＰ３３７７９（終濃度２ｎＭ）、ＴＧ１０１３４８（終濃度３ｎＭ）、又はＤＭＳＯを添加した培地で懸濁して播種した。細胞を播種した低接着９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始から４８時間後に、細胞を播種した際と同じ濃度のＪＡＫ２阻害剤又はＤＭＳＯが添加されたｍＮＰＳＲ培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加添加した。培地を追加添加してから４８時間後に、上記と同様の操作を行い、細胞数の測定と継代を行った。
＜腎オルガノイドの作製＞
　ｍＮＰＳＲ培地にＣＥＰ３３７７９（終濃度２ｎＭ）又はＴＧ１０１３４８（終濃度３ｎＭ）を添加した培地で、継代培養したｍＮＰＣの細胞塊を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にのせ、周囲の培地を除去した。次に、あらかじめ、２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２及び５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たした培養皿に、細胞塊がのったＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした。４８時間後に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲに培地交換した。以後、４８時間毎に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲで培地交換し、分化培養開始１０日目に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのまま４％ＰＦＡを用いて４℃で３時間固定した。固定後、ＰＢＳに置換し、４℃で一晩静置し、免疫染色を行った。
［結果］
＜ＪＡＫ２阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＪＡＫ２阻害剤として、ＣＥＰ３３７７９及びＴＧ１０１３４８を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図２４は、ｍＮＰＳＲ培地にＣＥＰ３３７７９を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報から、ＣＥＰ３３７７８のＩＣ５０は、２ｎＭ付近と予測される。ＣＥＰ３３７７９は、ＩＣ５０付近の濃度で有意な細胞増殖促進効果が確認された。図２５は、ｍＮＰＳＲ培地にＴＧ１０１３４８を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報から、ＴＧ１０１３４８のＩＣ５０は、３～６ｎＭ付近と予測される。ＴＧ１０１３４８は、ＩＣ５０付近の濃度で有意な細胞増殖促進効果が確認された。なお、ＴＧ１０１３４８では、２つの濃度で増殖促進効果が確認された。３ｎＭにおける増殖促進は、ＪＡＫ２阻害のＩＣ５０付近の濃度であり、ＪＡＫ２阻害による増殖促進と考えられた。
＜ｍＮＰＣの継代培養におけるＪＡＫ２阻害剤の増殖促進効果＞
　ＪＡＫ２阻害剤として、ＣＥＰ３３７７９及びＴＧ１０１３４８を用いて、ｍＮＰＣの継代培養を行い、継代毎に細胞数を測定した。
　図２６は、ｍＮＰＳＲ培地に２ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｍＮＰＳＲ培地に２ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣは、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したｍＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｍＮＰＳＲ培地に２ｎＭのＣＥＰ３３７７９を添加した培地で継代培養することにより、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図２７）。Ｐ１（継代数１）における累積細胞数は、Ｐ０（継代数０）で増殖させた細胞数をａ、Ｐ０の培養液の容量をｂ、継代に用いたＰ０の培養液の容量をｃ、Ｐ１で増殖させて得た細胞数をｄとした場合、Ｐ１の累積細胞数＝ａ×［ｄ／（ａ×ｃ／ｂ）］×ｂ／ｃで算出することができる、以降の継代培養における累積細胞数も同様に算出される。
　図２８は、ｍＮＰＳＲ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｍＮＰＳＲ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣは、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したｍＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｍＮＰＳＲ培地に３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養することにより、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図２９）。
＜ＪＡＫ２阻害剤が腎オルガノイド形成に及ぼす影響＞
　ｍＮＰＳＲ培地に２ｎＭのＣＥＰ３３７７９又は３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で、４継代したｍＮＰＣから、腎オルガノイドを分化誘導した。その結果、いずれのＪＡＫ２阻害剤も腎オルガノイドの形成に影響しないことが確認された（図３０）。
＜ＡＤＰＫＤモデルマウス由来ｍＮＰＣを用いた増殖アッセイ＞
　ｍＮＰＣとして、ＡＤＰＫＤ（常染色体優性多発性嚢胞腎）モデルマウスの胎仔腎から抽出したｍＮＰＣを用いたこと以外は、上記と同様に細胞増殖アッセイを行った。ＪＡＫ２阻害剤としては、３ｎＭのＴＧ１０１３４８を用いた。ＡＤＰＫＤモデルマウス由来ｍＮＰＣでも、ＴＧ１０１３４８の添加により増殖が促進されることが確認された（図３１）。
　本発明によれば、ＢＭＰ７を用いることなく、ネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたＮＰＣの拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法が提供される。本発明の方法で得られたネフロン前駆細胞及び腎臓オルガノイドは、腎疾患の治療又は予防に適用することができる。

Claims (19)

  1. 　ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、
    　ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＪＡＫ阻害剤を含む、
    　培地。
  2. 　前記ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、及びＪＡＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項１に記載の培地。
  3. 　前記ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＰＦ－０６６５１６００、ＦＭ－３８１、ＣＰ６９０５５０、及び７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項２に記載の培地。
  4. 　前記ＪＡＫ２阻害剤は、ＣＥＰ３３７７９、及びＴＧ１０１３４８からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項２に記載の培地。
  5. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、請求項１～４のいずれか１項に記載の培地。
  6. 　前記ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１～５のいずれか１項に記載の培地。
  7. 　前記ＡＬＫ阻害剤は、Ａ８３－０１である、請求項１～６のいずれか１項に記載の培地。
  8. 　前記ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項１～７のいずれか１項に記載の培地。
  9. 　ＢＭＰ７をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の培地。
  10. 　ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、
    　ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＴＣＳ２１３１１を含む、
    　培地。
  11. 　ＢＭＰ７をさらに含む、請求項１０に記載の培地。
  12. 　ＪＡＫ阻害剤を含む、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地。
  13. 　前記ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１阻害剤、ＪＡＫ２阻害剤、及びＪＡＫ３阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項１２に記載の培地。
  14. 　前記ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１、ＷＨＩ－Ｐ１５４、ＰＦ－０６６５１６００、ＦＭ－３８１、ＣＰ６９０５５０、及び７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステルからなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項１３に記載の培地。
  15. 　前記ＪＡＫ２阻害剤は、ＣＥＰ３３７７９、及びＴＧ１０１３４８からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項１３に記載の培地。
  16. 　ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、及びＢＭＰ阻害剤からなる群より選択される、少なくとも１種をさらに含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の培地。
  17. 　ＢＭＰ７をさらに含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の培地。
  18. 　請求項１～１７のいずれか１項に記載の培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  19. 　請求項１８に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆培養を拡大培養する工程と、
    　前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、
    　を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
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