WO2022210968A1 - 嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド - Google Patents

嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド Download PDF

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WO2022210968A1
WO2022210968A1 PCT/JP2022/016274 JP2022016274W WO2022210968A1 WO 2022210968 A1 WO2022210968 A1 WO 2022210968A1 JP 2022016274 W JP2022016274 W JP 2022016274W WO 2022210968 A1 WO2022210968 A1 WO 2022210968A1
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collecting duct
cyst
adpkd
medium
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PCT/JP2022/016274
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健二 長船
伸一 前
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国立大学法人京都大学
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • This application relates to an artificial collecting duct organoid with a cystic structure.
  • ADPKD Autosomal dominant polycystic kidney disease
  • cysts mainly develop from the renal collecting duct, not from the renal tubules. It has been reported that renal tubular tissue is induced to differentiate from ADPKD-specific pluripotent stem cells or ADPKD patient-derived pluripotent stem cells to reproduce renal cysts (Non-Patent Documents 1 to 3), but renal collecting duct differentiation There are no reports of a renal cyst model using this system.
  • the purpose of the present application is to provide an artificial collecting duct organoid having a cyst structure formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct master cells.
  • Artificial collecting duct organoids with cystic structures provided by the present application can be used as collecting duct cyst models.
  • the present application provides an artificial collecting duct organoid having a cyst structure formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct master cells.
  • the present application also provides a collecting duct cyst model, which is an organoid having a cystic structure formed by a cell population containing cells that express markers specific to collecting duct chief cells.
  • the present application also provides a method of manufacturing a collecting duct cyst model, comprising the steps of: (1) autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)-specific ureteroblast tip cells were treated with glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated (2) the culture obtained in step (1), Wnt signaling activator, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid Culturing in a medium containing a receptor agonist and a glial cell line-derived neurotrophic factor to obtain an artificial collecting duct organoid having a cystic structure.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • the present application also provides a method of subculturing a collecting duct cyst model, comprising the steps of: (a) dissociating artificial collecting duct organoids with cystic structures into single cells; (b) culturing the cells in a medium containing a Wnt signaling activator; and (c) culturing the culture obtained in step (b) in a medium containing a Wnt signaling activator. , the process of obtaining cystic organoids.
  • the present application also provides a method of screening for a substance that treats ADPKD, comprising the steps of: (i) contacting a candidate substance with a collecting duct cyst model; (ii) confirming whether the cyst structure of the collecting duct cyst model is reduced or disappeared;
  • the present application also provides a method of screening for substances that prevent ADPKD, comprising the steps of: (i') performing a method for producing a collecting duct cyst model of the present application to produce a collecting duct cyst model, wherein the medium in at least one step of each step further comprises a candidate substance; (ii') confirming whether or not a cyst structure is formed in the collecting duct cyst model;
  • the present application provides an artificial collecting duct organoid having a cyst structure formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct master cells. Artificial collecting duct organoids with cystic structures can be subcultured to regenerate cystic organoids. An artificial collecting duct organoid having a cyst structure obtained by the method of the present application and a cystic organoid obtained by subculturing the same can be used as a collecting duct cyst model.
  • the present application also provides methods of screening for agents that treat ADPKD and methods of screening for agents that prevent ADPKD.
  • Organoids derived from early-stage ureteral bud tip cells do not have cystic structures, whereas organoids derived from late-stage ureteral bud tip cells have cystic structures.
  • Target sites of gRNAs at the PKD1 locus PKD1 mutant DNA in PKD1 knockout cell lines.
  • PKD1 mutant mRNA in PKD1 knockout cell lines Amino acid sequence predicted from PKD1 mutant mRNA.
  • An asterisk indicates a premature stop codon.
  • Ureteroblast organoids derived from PKD1 knockout iPS cells Morphology of ureteric bud tip cells derived from PKD1 knockout iPS cells maintained in culture for 6 weeks.
  • SALL4, KIT, and AVPR1A were highly expressed at 2 weeks, and LCN2 expression was elevated at 6 weeks.
  • Organoids with cystic structures were induced from ureteric sprout tip cells subcultured for more than 6 weeks.
  • the CiRA00007 strain has a genetic mutation in exon 41 and a missense mutation in which the 3818th amino acid of the polycystin1 protein is changed from glycine (G) to arginine (R).
  • AQP2 green immunostaining image of an artificial collecting duct organoid with a cystic structure prepared from iPS cells derived from ADPKD patients.
  • Expression patterns of genes included in the gene list (cilium_GO_0005929) in ureteric bud tip cells differentiated from iPS cells without PKD1 gene mutation (PKD1 +/+ ) and PKD1 knockout (PKD1 -/- ) iPS cells were analyzed. Heatmap to show.
  • Heat map showing the expression patterns of genes included in the gene list (cilium movement_GO_0003341) in ureteric bud tip cells differentiated from PKD1 +/+ iPS cells and PKD1 -/- iPS cells.
  • Gene set enrichment analysis GSEA
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • E2F target, G2M checkpoint Gene set enrichment analysis
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • GSEA Gene set enrichment analysis of gene sets related to energy metabolism (Oxidative phosphorylation) in ureteric bud tip cells differentiated from PKD1 +/+ iPS cells and PKD1 ⁇ / ⁇ iPS cells.
  • GSEA Gene set enrichment analysis of gene sets related to cholesterol metabolism (Cholesterol homeostasis, Bile acid metabolism) in ureteric bud tip cells differentiated from PKD1 +/+ iPS cells and PKD1 -/- iPS cells. Intracellular cholesterol levels in ureteric bud tip cells differentiated from PKD1 +/+ iPS cells and PKD1 ⁇ / ⁇ iPS cells. Comparison of the morphology of collecting duct cyst models created with and without the addition of 1 ⁇ M Fluvastatin to the culture process of ureteric sprout tip cells. A chi-square test was used to test for significant differences. Morphology of cysts generated from single cyst cells using medium with or without 2.5 ⁇ M AVP.
  • the area of all cysts in the images of cysts produced with medium containing 2.5 ⁇ M AVP or medium without 2.5 ⁇ M AVP was graphed.
  • the Mann-Whitney U test was used to test for significant differences. Comparison of the average area of cysts made by adding 0.1% DMSO or 5 ⁇ M Tolvaptan. Student's t-test was used to test for significant difference. Comparison of the average area of cysts made with the addition of 0.1% DMSO, 1 ⁇ M Venglustat, 0.1 ⁇ M Bardoxolone methyl, or 1 ⁇ M Tesevatinib.
  • One-way ANOVA and Tukey's t-test were used to test for significant differences.
  • a certain type of cell means a cell group containing cells of that type unless otherwise specified. Cells of types other than cells may be included.
  • a culture of a certain type of cell means a culture of a cell group containing cells of that type, and may contain cells other than the specified type of cells.
  • a cell population of a certain type means a cell population containing cells of the type unless otherwise specified, and the cell population contains cells other than the specified type of cells. may be included.
  • the medium can be prepared by appropriately adding necessary factors to the basal medium used for culturing animal cells.
  • basal media include MEM Zinc Option medium, IMEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM/F12 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, mixed medium of these and the like are included.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferrin, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum replacement during ES cell culture) (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), fatty acids, It may also contain one or more serum replacements such as insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), non One or more substances such as essential amino acids (NEAA), vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and their equivalents, or other substances commonly added to animal culture media. may contain one or more substances that
  • the basal medium used in the present application is, for example, DMEM/F12 medium, or Essential serum-free medium in which L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium, sodium selenium, insulin, NaHCO 3 and transferrin are added to DMEM/F12 medium. 6 TM medium (Thermo Fisher Scientific).
  • Artificial collecting duct organoid with cyst structure provides an artificial collecting duct organoid with a cyst structure formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct master cells, such as AQP2 and/or AVPR2. do.
  • the artificial collecting duct organoid having the cyst structure 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more of the cells constituting the cyst (hereinafter referred to as "cyst-constituting cells”) , ⁇ 70%, ⁇ 80%, ⁇ 85%, ⁇ 90%, ⁇ 95%, or ⁇ 99% express markers specific for collecting duct chief cells, such as AQP2 and AVPR2.
  • cyst-composing cells express markers specific for collecting duct chief cells.
  • "Cyst” means a spherical sac covered by cells that contains fluid.
  • the size of artificial collecting duct organoids with cystic structures is, for example, about 100 to about 5000 ⁇ m.
  • An artificial collecting duct organoid having a cystic structure may contain multiple cysts.
  • Artificial collecting duct organoids with cystic structures contain, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 cysts.
  • the size of one cyst is, for example, about 10 to about 200 ⁇ m. Artificial collecting duct organoids can be confirmed by the expression of known collecting duct markers.
  • the expression of early developing collecting duct markers such as ARL13B (cilia marker), FOXA1, E-CADHERIN (epithelial marker), and CYTOKERATIN19.
  • ARL13B cilia marker
  • FOXA1 epidermal marker
  • E-CADHERIN epidermal marker
  • CYTOKERATIN19 a cyst structure of the present invention
  • the cystic structure of artificial collecting duct organoids can be confirmed, for example, under a microscope.
  • the fact that the cyst structure of the artificial collecting duct organoid is formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct master cells can be visually confirmed under a microscope by immunostaining, or by flow cytometry. may be confirmed using, for example, fluorescence-activated cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • cystic organoids This application also provides cystic organoids.
  • a "cyst organoid" is formed by a cell population containing cells that express markers specific to collecting duct chief cells (e.g., AQP2 and AVPR2), and individual cysts are present independently.
  • markers specific to collecting duct chief cells e.g., AQP2 and AVPR2
  • individual cysts are present independently.
  • cyst-composing cells express markers specific for collecting duct chief cells.
  • the size of one cyst is, for example, about 10 to about 300 ⁇ m.
  • expression of the above-described early collecting duct markers can be observed in cyst-constituting cells and other cells.
  • the present application also provides a method for producing a collecting duct cyst model, comprising the steps of: (1) autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)-specific ureteroblast tip cells were treated with glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated (2) the culture obtained in step (1) is treated with Wnt signaling activator, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor; Culturing in a medium containing a somatic agonist and a glial cell line-derived neurotrophic factor to obtain an artificial collecting duct organoid having a cystic structure.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • a collecting duct cyst model is a cell population, tissue, or organoid that has a cystic structure formed by a cell population containing cells that express markers specific to collecting duct master cells, such as AQP2 and/or AVPR2.
  • 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more of the cyst-constituting cells in the collecting duct cyst model , >95%, or >99% express markers specific for collecting duct chief cells, such as AQP2 and AVPR2.
  • substantially all cyst-composing cells express markers specific for collecting duct chief cells.
  • the size of the collecting duct cyst model is, for example, about 10 to about 5000 ⁇ m.
  • Collecting duct cyst models include both cases in which multiple cysts form a three-dimensional structure together with non-cyst-forming cells, and cases in which individual cysts exist independently.
  • the size of one cyst is, for example, about 10 to about 300 ⁇ m.
  • Collecting duct cyst models include, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 cysts.
  • expression of the above-described early collecting duct marker can be observed in cyst-constituting cells and other cells.
  • the cyst structure of the collecting duct cyst model can be confirmed under a microscope, for example.
  • cyst structure of the collecting duct cyst model is formed by a cell population containing cells expressing markers specific to collecting duct main cells may be confirmed visually under a microscope by immunostaining, or by flow cytometry. Alternatively, it may be confirmed using FACS (fluorescence-activated cell sorting).
  • an artificial collecting duct organoid in which a plurality of cysts form a three-dimensional structure together with cells that do not form cysts is referred to as an "artificial collecting duct organoid having a cyst structure", and individual cysts Organoids in which are present independently are called “cystic organoids”.
  • ADPKD-specific cells refer to cells that are derived from patients with ADPKD or that have genetic mutations associated with ADPKD.
  • a gene mutation associated with ADPKD means a mutation that can directly or indirectly cause ADPKD by impairing normal functioning of an ADPKD-related gene due to the mutation.
  • ADPKD-related genes include the PKD1 gene and PKD2 gene, which are causative genes of ADPKD, and genes related thereto, such as the PKD1 gene.
  • cells with ADPKD-associated gene mutations are cells in which ADPKD-associated genes have been knocked out or knocked down.
  • Methods for knocking out or knocking down genes are known and are not particularly limited. Methods for knocking out genes include homologous recombination technology and genome editing technology using the CRISPR system, TALENs, ZFNs, and the like. Methods for knocking down genes include the antisense method of introducing RNA corresponding to the antisense strand of mRNA into cells, and the RNAi method using siRNA, shRNA, microRNA, and the like.
  • ureterobud tip cell is meant a cell that has the properties of the tip of a sprouted or branched region of a ureteroblast tissue or ureteroblast organoid.
  • Ureteroblast tip cells are associated with expression of markers such as GATA3, RET, WNT11, LHX1, SOX9 and very low density lipoprotein receptor (VLDL-R), or very low density lipoprotein (VLDL) uptake It can be confirmed by, for example,
  • the ureteral sprout tip cells can be of mammalian origin, such as primate origin, and are preferably of human origin.
  • ADPKD-specific ureteral bud tip cells are ureteral bud tip cells derived from patients with ADPKD or ureteral bud tip cells with genetic mutations associated with ADPKD.
  • the ADPKD-specific ureteral bud tip cells are ureteral bud tip cells in which the PKD1 gene has been knocked out.
  • a ureteric bud tip cell with a genetic mutation associated with ADPKD may be generated by genetically modifying a ureteric bud tip cell or may be derived from a cell with a genetic mutation associated with ADPKD.
  • ADPKD-specific ureteral sprout tip cells may be produced from pluripotent stem cells.
  • Methods for producing ureteral bud tip cells from pluripotent stem cells are known, and any known method may be used. For example, the method described in WO2019/098349 or Non-Patent Document 4 can be used.
  • ureteric bud organoids are generated from pluripotent stem cells via anterior intermediate mesoderm cells and mesonephric duct cells, and ureteric bud tips are formed by dissociating the ureteric bud organoids into single cells. All that is required is to manufacture a partial cell.
  • ADPKD-specific ureteral bud tip cells can be cryopreserved. By cryopreserving the ADPKD-specific ureterobud tip cells, each experiment can be performed using the same lot of cells.
  • a known method can be used for freezing and sleeping cells. For example, as a method of freezing cells, ADPKD-specific ureteroblast tip cells are dissociated into single cells with a cell separation solution (e.g., Accutase), the supernatant is removed by centrifugation, and a cryopreservation solution (e.g., stem cell banker), slowly frozen overnight at -80°C, and then stored at -196°C (in liquid nitrogen).
  • a cell separation solution e.g., Accutase
  • stem cell banker e.g., stem cell banker
  • cryopreservation solution a freezing solution containing DMSO or the like can be used.
  • cell bankers such as STEM-CELLBANKER (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), van bankers (NIPPON Genetics), TC protectors (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), CP-1 (KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO ., LTD.) and other commercially available cryopreservation solutions are exemplified.
  • An example of a method for activating frozen cells is to quickly thaw frozen ADPKD-specific ureteral sprout tip cells in a water bath at 37°C or the like, wash the cryopreserved solution by centrifugation, and suspend it in a medium.
  • Cryopreserved and resuscitated ADPKD-specific ureterobud tip cells can be used as ADPKD-specific ureterobud tip cells in the following embodiments.
  • pluripotent stem cells refers to stem cells that have both pluripotency and proliferative ability that are capable of differentiating into all cells existing in the body.
  • GS cells spermatogonial stem cells
  • GS cells spermatogonial stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • pluripotent stem cells can be of mammalian origin, such as primate origin, and are preferably of human origin.
  • pluripotent stem cells can be, for example, ES cells or iPS cells.
  • Pluripotent stem cells can be ADPKD-specific pluripotent stem cells.
  • iPS cells can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al, Nat. Biotechnol. 26:101-106 ( 2008); WO2007/069666).
  • the iPS cells may be produced from somatic cells by a method known per se, or iPS cells that have already been established and stocked may be used.
  • the somatic cells from which the iPS cells used in the present invention are derived are not limited, and for example, peripheral blood-derived cells or umbilical cord blood-derived cells can be used.
  • Animals from which iPS cells are derived are not limited, and examples thereof include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, cows, horses, pigs, sheep, monkeys, orangutans, chimpanzees, dogs, cats, birds, and humans. , preferably primates, more preferably humans.
  • iPS cells and iPS cell-derived somatic cells can be ADPKD-specific cells.
  • step (1) autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)-specific ureteroblast tip cells are treated with glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Culture in a medium containing a Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • YAP Yes-associated protein
  • the concentration of glial cell line-derived neurotrophic factor can be 100 pg/ml to 10 ⁇ g/ml, 1 ng/ml to 10 ⁇ g/ml, or 10 ng/ml to 1 ⁇ g/ml, such as about 100 ng/ml. is.
  • Fibroblast growth factors are known from FGF1 to FGF23, and can be selected from these known ones as appropriate.
  • the concentration of fibroblast growth factor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the fibroblast growth factor to be used.
  • the fibroblast growth factor is FGF1
  • its concentration can be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng/ml. .
  • a "retinoic acid receptor (RAR) agonist” is a naturally occurring retinoid, a chemically synthesized retinoid, a retinoic acid receptor agonist compound without a retinoid backbone, or a natural product with retinoic acid receptor agonist activity.
  • RAR retinoic acid receptor
  • you can Examples of natural retinoids with RAR agonist activity include retinoic acid (the stereoisomers all-trans-retinoic acid (all-trans-RA) and 9-cis-retinoic acid (9-cis-RA) are known). is mentioned.
  • Chemically synthesized retinoids are known in the art (US Pat. No. 5,234,926, US Pat. No. 4,326,055, etc.).
  • retinoic acid receptor agonist compounds without a retinoid backbone examples include Am80, AM580 (4-[[5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl]carboxy amido]benzoic acid), TTNPB (4-[[E]-2-[5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl]-1-propenyl]bene zoic acid) and AC55649 (4'-octyl-[1,1'-biphenyl]-4-carboxylic acid).
  • a RAR agonist for use in the present application may be retinoic acid, AM580, TTNPB, AC55649, eg TTNPB.
  • the concentration of the retinoic acid receptor agonist can be appropriately selected by those skilled in the art according to the retinoic acid receptor agonist to be used.
  • the retinoic acid receptor agonist is TTNPB, its concentration can be 0.1 nM to 10 ⁇ M, 1 nM to 10 ⁇ M, or 10 nM to 1 ⁇ M, eg about 0.1 ⁇ M.
  • GSK3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK3 ⁇ protein (for example, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin), and many substances are already known.
  • GSK3 ⁇ inhibitor IX 6-bromoindirubin 3′-oxime
  • maleimide derivative SB216763 (3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H -pyrrole-2,5-dione
  • SB415286 (3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione
  • phenyl ⁇ GSK3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a bromomethylketone compound, L803-mts (a.k.a.
  • GSK3 ⁇ peptide inhibitor Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2
  • a cell-permeable phosphorylated peptide and high selectivity CHIR99021
  • These compounds are commercially available from, for example, Calbiochem and Biomol, and can be easily used.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor for use in the present application can be, for example, CHIR99021.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the GSK3 ⁇ inhibitor to be used.
  • the concentration can be 3 nM-300 ⁇ M, 30 nM-300 ⁇ M, or 300 nM-30 ⁇ M, eg about 3 ⁇ M.
  • the concentration of the YAP activity inhibitor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the YAP activity inhibitor to be used.
  • the YAP activity inhibitor a known one may be appropriately used, and Thiazovivin having both YAP inhibitory activity and ROCK inhibitory activity is exemplified.
  • the YAP activity inhibitor is Thiazovivin, its concentration can be 10 nM to 1 mM, 100 nM to 1 mM, or 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, eg about 10 ⁇ M.
  • the medium may further contain a TGF ⁇ signal inhibitor.
  • TGF ⁇ signal inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to a receptor to SMAD, and is a substance that inhibits binding to the ALK family receptor, or phosphorylation of SMAD by the ALK family. is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits, for example, Lefty-1 (NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997 are exemplified), SB431542, SB202190 (above, RK Lindemann et al., Mol.
  • a TGF ⁇ signal inhibitor used in the present application can be, for example, A83-01.
  • the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the TGF ⁇ signal inhibitor to be used.
  • the TGF ⁇ signal inhibitor is A83-01, its concentration may be 1 nM-100 ⁇ M, 10 nM-100 ⁇ M, or 100 nM-10 ⁇ M, eg about 1 ⁇ M.
  • the culture period can be 1-5 days, or 1-3 days, for example about 2 days.
  • step (1) autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)-specific ureteral bud tip cells can be cultured in suspension.
  • sustained culture means culturing cells in a non-adherent state on a culture dish.
  • those that have not been artificially treated for the purpose of improving adhesion to cells e.g., coating treatment with extracellular matrix, etc.
  • treatments that artificially suppress adhesion e.g., polyhydroxy It can be carried out using a material coated with ethyl methacrylic acid (poly-HEMA) or a polymer of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (Lipidure).
  • poly-HEMA ethyl methacrylic acid
  • Lipidure 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine
  • commercially available products such as 96-well low attachment plates (Sumitomo Bakelite) and 35 mm low attachment dishes (Sumitomo Bakelite) may be used.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to about 40° C., for example about 37° C., and the culture is performed in an atmosphere of air containing CO 2 with a CO 2 concentration of, for example, about 2 to about 5%.
  • the method of the present application further comprises a step of maintaining and culturing autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD)-specific ureteric bud tip cells prior to step (1). Substances added to the medium during maintenance culture and their concentrations are as described above.
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney disease
  • glial cell line-derived neurotrophic factor e.g., about 100 ng/ml GDNF
  • fibroblast growth factor e.g., about 200 ng/ml FGF1
  • retinoic acid receptor agonist e.g., about 0.1 ⁇ M TTNPB
  • GSK3 ⁇ An inhibitor eg, about 3 ⁇ M CHIR99021
  • a YAP activity inhibitor e.g, about 10 ⁇ M Thiazovivin
  • a TGF ⁇ signaling inhibitor eg, about 1 ⁇ M A83-01
  • the period of maintenance culture can be, for example, 6 weeks or longer, 7 weeks or longer, 8 weeks or longer, 9 weeks or longer, or 10 weeks or longer.
  • Ureterobud tip cells can be maintained by subculturing every 1-12 days, every 5-10 days, every 6-8 days, or about every 7 days. Alternatively, subculturing can also be performed when the colony of ureteric sprout tip cells grows to a size of about 10 to about 1000 ⁇ m, about 15 to about 500 ⁇ m, about 20 to about 150 ⁇ m, or about 80 to about 100 ⁇ m. can be maintained.
  • the number of passages is not particularly limited, and a desired number of passages can be performed.
  • ureteral sprout tip cells can be three-dimensionally cultured by seeding on a hydrogel obtained by diluting a three-dimensional scaffold material with a medium.
  • the three-dimensional scaffold material various materials for constructing a three-dimensional structure of cultured cells are known and are commercially available, and are not particularly limited.
  • collagen-based materials polymer-based materials such as polycaprolactone and polyglycolic acid, or composites thereof can be used.
  • the form thereof is not particularly limited, and examples thereof include a sponge-like structure.
  • the three-dimensional scaffold material may be made from a biological sample (eg, extracellular matrix, basement membrane, etc.). Specific examples include Matrigel (trademark) (Becton Dickinson), type I collagen gel, type IV collagen gel, and the like.
  • Matrigel TM basement membrane matrix is a soluble basement membrane preparation extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murine sarcoma rich in extracellular matrix proteins, primarily laminin, collagen IV, entactin and heparan sulfate proteoglycans. consists of Additionally, other growth factors such as TGF- ⁇ , fibroblast growth factor, tissue plasminogen activator, EHS may be included.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • the concentration of Matrigel in the hydrogel can be 20%-80%, 30%-70%, or 40-60%, for example, about 50%. be.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to about 40° C., for example about 37° C., and the culture is performed in an atmosphere of air containing CO 2 with a CO 2 concentration of, for example, about 2 to about 5%.
  • step (2) the culture obtained in step (1) is treated with a Wnt signaling activator, a BMP inhibitor, a fibroblast growth factor, a retinoic acid receptor agonist, and a glial cell line-derived neurotrophic factor. It is cultured in a medium to obtain an artificial collecting duct organoid having a cyst structure. In one embodiment, the culture obtained in step (1) is suspension cultured.
  • the concentration of the Wnt signaling activator can be appropriately selected by those skilled in the art according to the Wnt signaling activator used.
  • a Wnt signaling activator as used herein can be LiCl, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a, R-spondin 1 or a combination thereof, such as Wnt3a and/or R-spondin 1.
  • Wnt signaling activator is Wnt3a
  • its concentration can be from about 5% to about 20%.
  • Commercially available products such as Afamin/Wnt3a conditioned medium may also be used.
  • the Wnt signaling activator is R-spondin 1
  • its concentration may be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng /ml.
  • BMP inhibitors include proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin 6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1 ,5-a]pyrimidine, its derivatives (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al.
  • proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin 6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1 ,5-a]pyrimidine, its derivatives (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al
  • a BMP inhibitor for use in the present application may be, for example, LDN193189.
  • the concentration of the BMP inhibitor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the BMP inhibitor to be used.
  • the BMP inhibitor is LDN193189, its concentration can be 0.1 nM to 10 ⁇ M, 1 nM to 10 ⁇ M, or 10 nM to 1 ⁇ M, eg about 0.1 ⁇ M.
  • the concentration of fibroblast growth factor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the fibroblast growth factor to be used.
  • the fibroblast growth factor is FGF8
  • its concentration can be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng/ml. .
  • the concentration of the retinoic acid receptor agonist can be appropriately selected by those skilled in the art according to the retinoic acid receptor agonist to be used.
  • the retinoic acid receptor agonist is TTNPB
  • its concentration can be 0.1 nM to 10 ⁇ M, 1 nM to 10 ⁇ M, or 10 nM to 1 ⁇ M, eg about 0.1 ⁇ M.
  • the concentration of glial cell line-derived neurotrophic factor can be 100 pg/ml to 10 ⁇ g/ml, 1 ng/ml to 10 ⁇ g/ml, or 10 ng/ml to 1 ⁇ g/ml, such as about 100 ng/ml. is.
  • the medium may further contain a TGF ⁇ signal inhibitor.
  • a TGF ⁇ signal inhibitor A person skilled in the art can appropriately select the concentration of the TGF ⁇ signal inhibitor depending on the TGF ⁇ signal inhibitor to be used. Where the TGF ⁇ signal inhibitor is A83-01, its concentration may be 1 nM-100 ⁇ M, 10 nM-100 ⁇ M, or 100 nM-10 ⁇ M, eg about 1 ⁇ M.
  • the medium may further contain EGF and/or FGF1.
  • EGF is a protein called epidermal growth factor or Epidermal Growth Factor. EGF commercially available from R&D systems, etc. can be used.
  • the concentration of EGF can be 50 pg/ml to 5 ⁇ g/ml, 500 pg/ml to 5 ⁇ g/ml, or 5 ng/ml to 500 ng/ml, eg about 50 ng/ml.
  • the concentration of FGF1 can be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, eg about 200 ng/ml.
  • the medium may further contain forskolin.
  • concentration of forskolin can be 10 nM to 1 mM, 100 nM to 1 mM, or 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, eg about 10 ⁇ M.
  • forskolin is added to the medium during step (2).
  • forskolin is added to the medium at day 0-15, day 5-10, or about day 8 of culture in step (2).
  • the medium may further contain Matrigel.
  • concentration of Matrigel can be 1-40%, 2-30%, or 5-20%, eg, about 10%.
  • the culture period can be 5-40 days, 7-30 days, or 10-25 days, for example about 14-21 days.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to about 40° C., for example about 37° C., and the culture is performed in an atmosphere of air containing CO 2 with a CO 2 concentration of, for example, about 2 to about 5%.
  • the present application also provides a method of subculturing a collecting duct cyst model, comprising the steps of: (a) dissociating artificial collecting duct organoids with cystic structures into single cells; (b) culturing the cells in a medium containing a Wnt signaling activator; and (c) culturing the culture obtained in step (b) in a medium containing a Wnt signaling activator. , the process of obtaining cystic organoids.
  • step (a) an artificial collecting duct organoid with a cyst structure is dissociated into single cells.
  • artificial collecting duct organoids having cystic structures were produced by the methods of the present application.
  • a conventionally known dissociation method for cell aggregates may be appropriately employed. , Accutase and Accumax) or using a dissociation solution that has only collagenase activity.
  • a method of dissociating cell aggregates using a dissociation solution having protease activity and collagenase activity eg, Accutase
  • mechanically finely dispersing them into single cells may be used.
  • cystic cell refers to an artificial collecting duct organoid having a cystic structure or a single cell from a cystic organoid.
  • step (b) the cyst cells dissociated in step (a) are cultured in a medium containing a Wnt signaling activator.
  • the concentration of the Wnt signaling activator can be appropriately selected by those skilled in the art according to the Wnt signaling activator used.
  • the Wnt signaling activator is Wnt3a
  • its concentration can be from about 5% to about 20%.
  • Commercially available products such as Afamin/Wnt3a conditioned medium may also be used.
  • the Wnt signaling activator is R-spondin 1
  • its concentration may be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng /ml.
  • the medium may further contain a ROCK inhibitor.
  • ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK). et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)), Fasudil/HA1077 (Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)), SR3677 (Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642 -6645 (2008)), GSK269962 (Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007); WO2005/037197), H-1152 (Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • ROCK inhibitors when referring to ROCK inhibitors in this application, one or more ROCK inhibitors may be used.
  • a ROCK inhibitor for use in the present application may preferably be Y-27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the ROCK inhibitor to be used.
  • the ROCK inhibitor is Y-27632
  • its concentration can be 10 nM to 1 mM, 100 nM to 1 mM, or 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, eg about 10 ⁇ M.
  • the medium may further contain fibroblast growth factor.
  • concentration of fibroblast growth factor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the fibroblast growth factor to be used.
  • the fibroblast growth factor is FGF1
  • its concentration can be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng/ml. .
  • the culture period can be 1-10 days, 2-7 days, or 3-5 days, for example about 4 days.
  • the cells dissociated in step (a) can be three-dimensionally cultured.
  • the concentration of Matrigel in the hydrogel can be 20%-80%, 30%-70%, or 40-60%, eg, about 50%.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to about 40° C., for example about 37° C., and the culture is performed in an atmosphere of air containing CO 2 with a CO 2 concentration of, for example, about 2 to about 5%.
  • step (c) the culture obtained in step (b) is cultured in a medium containing a Wnt signaling activator.
  • the culture obtained in step (b) is suspension cultured.
  • the concentration of the Wnt signaling activator can be appropriately selected by those skilled in the art according to the Wnt signaling activator used.
  • the Wnt signaling activator is Wnt3a
  • its concentration can be from about 5% to about 20%.
  • Commercially available products such as Afamin/Wnt3a conditioned medium may also be used.
  • the Wnt signaling activator is R-spondin 1
  • its concentration may be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng /ml.
  • the medium may further contain fibroblast growth factor.
  • concentration of fibroblast growth factor can be appropriately selected by those skilled in the art according to the fibroblast growth factor to be used.
  • the fibroblast growth factor is FGF1
  • its concentration can be 200 pg/ml to 20 ⁇ g/ml, 2 ng/ml to 20 ⁇ g/ml, or 20 ng/ml to 2 ⁇ g/ml, such as about 200 ng/ml. .
  • the medium may further contain forskolin.
  • concentration of forskolin can be 10 nM to 1 mM, 100 nM to 1 mM, or 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, eg about 10 ⁇ M.
  • the medium may further contain Matrigel.
  • concentration of Matrigel can be 1-40%, 2-30%, or 5-20%, eg, about 10%.
  • the culture period can be 1-20 days, 2-15 days, or 5-10 days, for example about 7 days.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to about 40° C., for example about 37° C., and the culture is performed in an atmosphere of air containing CO 2 with a CO 2 concentration of, for example, about 2 to about 5%.
  • Methods of Screening for Agents to Treat ADPKD comprising the steps of: (i) contacting a candidate substance with a collecting duct cyst model; (ii) confirming whether the cyst structure of the collecting duct cyst model is reduced or disappeared;
  • candidate substance is not particularly limited as long as it can be a candidate substance for treating ADPKD.
  • a candidate substance may be a natural substance such as a substance derived from a living body, or a chemically synthesized synthetic substance.
  • candidate substances include proteins, amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates, low-molecular-weight compounds, inorganic compounds, and the like.
  • step (i) the candidate substance is brought into contact with the collecting duct cyst model.
  • the collecting duct cyst model is produced by the method for producing a collecting duct cyst model of the present application.
  • Candidate substances can be added to the culture medium containing, for example, the collecting duct cyst model.
  • step (ii) it is confirmed whether the cyst structure of the collecting duct cyst model has shrunk or disappeared.
  • the cyst structure of the collecting duct cyst model is compared to the cyst structure of a control collecting duct cyst model.
  • a control collecting duct cyst model is, for example, a collecting duct cyst model not contacted with a candidate substance or a collecting duct cyst model before contact with a candidate substance.
  • a candidate substance can be selected as a substance for treating ADPKD if the cyst structure of the collecting duct cyst model is reduced or eliminated compared to the cyst structure of the control collecting duct cyst model.
  • the size of cystic structures can be confirmed under a microscope.
  • treatment refers to reducing or eliminating the cause of a disease, slowing or halting progression of a disease, reducing, alleviating, ameliorating or eliminating symptoms thereof, and/or exacerbating symptoms thereof. means to suppress
  • the present application also provides methods of screening for agents that prevent ADPKD, comprising the steps of: (i') performing a method for producing a collecting duct cyst model of the present application to produce a collecting duct cyst model, wherein the medium in at least one step of each step further comprises a candidate substance; (ii') confirming whether or not a cyst structure is formed in the collecting duct cyst model;
  • the “candidate substance” is not particularly limited as long as it can be a candidate for a substance that prevents ADPKD.
  • a candidate substance may be a natural substance such as a substance derived from a living body, or a chemically synthesized synthetic substance.
  • candidate substances include proteins, amino acids, nucleic acids, lipids, carbohydrates, low-molecular-weight compounds, inorganic compounds, and the like.
  • step (i′) the method for producing a collecting duct cyst model of the present application is performed to produce a collecting duct cyst model (artificial collecting duct organoid or cyst organoid), wherein the medium in at least one step of each step is It further includes a candidate substance.
  • the medium further comprises a candidate substance.
  • the candidate substance may be included in the medium during the entire culture period of each step, or may be included in the medium during a portion of the culture period.
  • step (ii') confirm whether or not the cyst structure of the collecting duct cyst model has been formed. If the cyst structure of the collecting duct cyst model is not formed, the candidate substance can be selected as a substance that prevents ADPKD. In certain embodiments, the cyst structure of the collecting duct cyst model is compared to the cyst structure of a control collecting duct cyst model.
  • the control collecting duct cyst model is, for example, a collecting duct cyst model produced without the candidate substance in the culture medium. If the cyst structure of the collecting duct cyst model is reduced or disappeared compared to the cyst structure of the control collecting duct cyst model, the candidate substance can be selected as a substance that prevents ADPKD. The size of cystic structures can be confirmed under a microscope.
  • Fig. 1 shows a schematic diagram summarizing the method established in this example. Bright-field images of cells and organoids induced in this example were obtained with a CKX41 inverted microscope (Olympus).
  • PKD1 Knockout Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells Experiments using human induced pluripotent stem cells were approved by the Ethics Committee of Kyoto University School of Medicine and graduate School of Medicine. Three human iPS cell lines 585A1, 1231A3 and 1383D2 were used. PKD1 knockout iPS cells were generated using a previously reported DNA transposon-based CRISPR-Cas9 regulated transcription and nuclear shuttling (CRONUS) system (Ishida K. et al., Sci Rep. 8:310 (2018); Shimizu T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 529, 1186-1194 (2020)).
  • CRONUS DNA transposon-based CRISPR-Cas9 regulated transcription and nuclear shuttling
  • CRONUS-Puro vector pPV-TetO-SphcCas9-GR-iC-A-EF1 ⁇ -rtTA-iP, Addgene ID 100596
  • piggyBac vector for cloning sgRNAs pPV-H1-ccdB-mEF1 ⁇ -RiH, Addgene ID 100598
  • pHL-EF1 ⁇ -hcPBase-A Addgene ID 100599 were serially transfected into cells by lipofection using FuGENE6 (Promega).
  • the CRONUS-Puro vector and the piggyBac vector for cloning the sgRNA were compatible with puromycin and hygromycin selection, respectively.
  • the following sequence was used to clone the gRNA sequence targeting the PKD1 exon 34 splicing acceptor site into the pPV-H1-ccdB-mEF1 ⁇ -RiH vector: 5′-GAGACCACTTGGATCC GGGATCAGGTCTTCATCTAG GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3′ (SEQ ID NO: 1, Target sites are underlined).
  • the gRNA target sites at the PKD1 locus are shown in FIG.
  • RFP + colonies were manually picked by drug selection of transfected cells and treated with doxycycline and dexamethasone to induce genome editing. Individual colonies were screened for genome editing efficiency by Sanger sequencing of bulk genomic DNA. Single cells were then isolated by flow cytometry, clonally expanded in iMatrix-511 (Nippi)-coated 24-well culture plates (Corning), and genotyped by Sanger sequencing. Genome editing resulted in frameshifts and premature stop codons (FIGS. 3-5). Two bases (AG) at different sites within exon 34 functioned as splicing acceptor sequences, resulting in the generation of two types of PKD1 mutant mRNAs.
  • PKD1 knockout iPS cells were induced into ureteroblast organoids as previously described (Mae, SI. & Ryosaka, M. et al. Cell Reports 32, 4). , 107943).
  • Ureteroblast organoids derived from PKD1 knockout iPS cells were treated with Accutase (Innovative Cell Technologies) for 5 minutes at 37°C and then dissociated into single cells by pipetting.
  • Cells were treated with B27 supplement (without vitamin A) (Gibco), 3 ⁇ M CHIR99021 (StemRD), 0.1 ⁇ M TTNPB (Santa cruz), 200 ng/ml FGF1 (R&D systems), 100 ng/ml GDNF (R&D systems), 10 ⁇ M Thiazovivin (Santa Cruz). Cruz Biotechnology) and 1 ⁇ M A83-01 (Wako) in DMEM/F12 medium (Gibco).
  • Single cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells/well on one well of a 48-well plate coated with 150 ⁇ L hydrogel.
  • Hydrogels were composed of DMEM/F12 medium with 50% Matrigel (BD Biosciences) and allowed to solidify at 37°C for 1 hour before use. Single cells established ureteric bud tip cell colonies after 7 days. Medium was changed every 2-3 days.
  • a subcultured hydrogel of ureteric bud tip cells was lysed at 4°C for 30 minutes using Cell Recovery Solution (Corning) to isolate ureteric bud tip cell colonies. After further washing with Cell Recovery Solution, ureteral bud tip cell colonies were centrifuged at 500 g for 5 minutes at room temperature. Ureterobud tip cell colonies were treated with Accutase for 5 min at 37° C. and then dissociated into single cells by pipetting. Cells were suspended in DMEM/F12 medium containing B27 supplement (without vitamin A), 3 ⁇ M CHIR99021, 0.1 ⁇ M TTNPB, 200 ng/ml FGF1, 100 ng/ml GDNF, 10 ⁇ M Thiazovivin and 1 ⁇ M A83-01.
  • Hydrogels were composed of DMEM/F12 medium containing 50% Matrigel and allowed to solidify at 37°C for 1 hour prior to use. Ureteric bud tip cell colonies were generated by culturing single cells at 37°C, 5% CO 2 for 7 days. Medium was changed every 2-3 days. The apical cell colonies thus produced were similarly subcultured every 7 days.
  • Cryopreservation of ureteral bud tip cells Single cells dissociated as described above were suspended in STEM-CELLBANKER® GMP grade (#CB045, Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.). The cell suspension was dispensed into each cryopreservation tube. Tubes were frozen overnight at ⁇ 80° C. and transferred to liquid nitrogen cell storage tanks for long-term cryopreservation.
  • cells were thawed at 37°C using a water bath. Cells were then added in STO medium and centrifuged at 200 g for 3 minutes at room temperature. After removing the supernatant, cells were suspended in DMEM/F12 medium containing B27 supplement (without vitamin A), 3 ⁇ M CHIR99021, 0.1 ⁇ M TTNPB, 200 ng/ml FGF1, 100 ng/ml GDNF, 10 ⁇ M Thiazovivin and 1 ⁇ M A83-01. muddy. Cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells/well on one well of a 48-well plate coated with 150 ⁇ L hydrogel.
  • Hydrogels were composed of DMEM/F12 medium containing 50% Matrigel and allowed to solidify at 37°C for 1 hour prior to use. Ureteric bud tip cell colonies were generated by culturing single cells at 37°C, 5% CO 2 for 7 days. Medium was changed every 2-3 days.
  • Reconstituted hydrogels of collecting duct organoids from ureteric bud tip cells were lysed with Cell Recovery Solution at 4°C for 30 minutes to isolate ureteric bud tip cell colonies. After further washing with Cell Recovery Solution, ureteral bud tip cell colonies were centrifuged at 500 g for 5 minutes at room temperature. Ureterobud tip cell colonies were treated with Accutase for 5 min at 37° C. and then dissociated into single cells by pipetting. Cells were suspended in Essential 6 medium (Gibco) containing 3 ⁇ M CHIR99021, 0.1 ⁇ M TTNPB, 200 ng/ml FGF1, 100 ng/ml GDNF, 10 ⁇ M Thiazovivin and 1 ⁇ M A83-01. Cells were seeded at 5.0 ⁇ 10 3 cells/well in 96-well low attachment plates (Sumitomo Bakelite). Spheroids were produced by culturing single cells for 2 days at 37°C and 5% CO 2 .
  • Spheroids were cultured in 10% Afamin/Wnt3a conditioned medium (MBL), 200ng/ml R-spondin 1 (R&D systems), 0.1 ⁇ M LDN193189 (Axon medchem), 200ng/ml FGF1, 200ng/ml FGF8 (Peprotech), 100ng/ml GDNF. , 0.1 ⁇ M TTNPB, 50 ng/ml EGF (R&D systems), 1 ⁇ M A83-01 and Essential 6 medium containing 10% Matrigel, and distributed to 35 mm low-adhesion dishes (Sumitomo Bakelite) at 2.5-3 mL/dish. Medium was changed every 3-4 days. Artificial collecting duct organoids were produced by culturing spheroids at 37°C and 5% CO 2 for 14-21 days.
  • Spheroids were prepared by the above method from ureteric bud tip cells that had been subcultured for 5 or more times. After the spheroids were cultured for about 7 days by the method described above, 10 ⁇ M forskolin (Wako) was added to the medium and cultured for another 7 days.
  • the subcultured hydrogel of cyst cells was lysed with Cell Recovery Solution at 4°C for 30 minutes to isolate organoids with cyst structures. After further washing with Cell Recovery Solution, organoids with cystic structures were centrifuged at 500 g for 5 minutes at room temperature. Organoids with cystic structures were treated with Accutase for 5 min at 37° C. and then dissociated into single cells by pipetting.
  • Cells were cultured in DMEM with B27 supplement (without vitamin A), 10% Afamin/Wnt3a conditioned medium, 200 ng/ml R-spondin 1 and 10 ⁇ M Y-27632 (Wako) in the absence or presence of 200 ng/ml FGF1. Suspended in /F12 medium.
  • Hydrogels were composed of DMEM/F12 medium containing 50% Matrigel and allowed to solidify at 37°C for 1 hour prior to use. Cyst cell spheroids were produced by culturing single cells at 37°C and 5% CO 2 for 4 days.
  • the hydrogel was dissolved with Cell Recovery Solution at 4°C for 30 minutes to isolate cyst cell spheroids. After further washing with Cell Recovery Solution, the cyst cell spheroids were centrifuged at 500 g for 5 minutes at room temperature. Cyst cell spheroids were suspended in Essential 6 medium containing 10% Afamin/Wnt3a conditioned medium, 200ng/ml R-spondin 1 and 10% Matrigel in the absence or presence of 200ng/ml FGF1 and plated in 35mm low attachment dishes. Dispensed at 2.5-3 mL/dish. Cyst organoids were produced by culturing cyst cell spheroids at 37°C and 5% CO 2 for 7 days.
  • PKD1 knockout iPS cells were generated by a previously reported method (Shimizu T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2020). 585A1, 1231A3 and 1383D2 strains were used as parent strains.
  • the induced ureteral bud organoids were dissociated into single cells by Accutase treatment, and the single cells were cultured on hydrogel for 7 days to create ureteral bud tip cell colonies.
  • Ureteric bud tip cell colonies were dissociated into single cells by Accutase treatment, and the single cells were cultured again on hydrogel for 7 days to prepare ureteric bud tip cell colonies.
  • Ureteric bud tip cell colonies were similarly subcultured every 7 days.
  • FIG. 7 shows ureteric bud tip cells subcultured for 6 weeks.
  • ureteric bud tip cells subcultured for 2 weeks and ureteric bud tip cells subcultured for 6 weeks revealed that ureteric bud tip cells subcultured for 6 weeks did not show ureteric bud tip cells.
  • the expression of late-stage tissue marker genes was increased and the expression of early-stage marker genes was decreased (Fig. 8). Therefore, it was suggested that the maintenance culture of ureteric bud tip cells advances the developmental differentiation stage of ureteric bud tip cells.
  • cystic structures occur in the late stage of ureteric bud tissue development, so it was expected that collecting duct organoids with cystic structures would be induced from ureteric bud tip cells maintained and cultured for a long period of time. Therefore, artificial collecting duct organoids were derived from ureteric sprout tip cells subcultured for 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 weeks. Specifically, spheroids were prepared by floating culture of each ureterobud tip cell on a low-adhesion plate for 2 days. Artificial collecting duct organoids were produced by floating culture of the spheroids on a 35 mm low-adhesion dish for an additional 14-21 days.
  • the ureteric bud tip cells used were induced from 585A1 strain PKD1 knockout iPS cells.
  • PKD1 knockout iPS cells As a result, it was found that artificial collecting duct organoids with cystic structures were induced from ureteric sprout tip cells subcultured for 6 weeks or more (Fig. 9). Immunostaining showed that the cysts expressed collecting duct chief cell markers AQP2 and AVPR2 in the plasma membrane and cytoplasm of the cyst lumen (Fig. 10).
  • artificial collecting duct organoids were induced by the method described above.
  • artificial collecting duct organoids having a cyst structure were also induced from ureteric sprout tip cells maintained in culture for 6 weeks or more (Fig. 11).
  • various cells were induced from 585A1 strain PKD1 knockout iPS cells.
  • cyst cell spheroids were produced by floating culture of cyst cell spheroids on a low-adhesion dish for 7 days (Fig. 14).
  • cystic organoids were prepared from the single cells in the same manner as above (Fig. 15). As a result, it was found that the addition of 200ng/ml FGF1 promoted the proliferation of cyst cells.
  • ADPKD patient-derived iPS cells (CiRA00007) were transformed into ureteric bud organoids, ureteric bud tip cells, and cystic structures.
  • An artificial collecting duct organoid was produced (Fig. 16).
  • the CiRA00007 strain has a genetic mutation in exon 41 and a missense mutation in which the 3818th amino acid of the polycystin1 protein is changed from glycine (G) to arginine (R) (Fig. 17).
  • G glycine
  • R arginine
  • the prepared cyst structure was AQP2 positive (Fig. 18).
  • PKD1 -/- ureteric bud tip cells Gene expression comparison between PKD1 -/- ureteric bud tip cells and PKD1 +/+ ureteric bud tip cells Differentiation-induced ureteric bud tip cells from iPS cells without PKD1 gene mutation (PKD1 +/+ ) and ureteric bud tip cells induced to differentiate from PKD1 knockout (PKD1 -/- ) iPS cells by RNA-seq analysis. Ureteric sprout tip cells were used after being cultured for 6 weeks.
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • statins are known to be effective for ADPKD (Xue C. et al., Kidney Dis. 6: 407-413 (2020))
  • the effect of Fluvastatin was selected from among various statins. investigated.
  • the addition of 1 ⁇ M Fluvastatin to the ureteric sprout tip cell culture process significantly reduced the percentage of organoids undergoing cyst formation (FIG. 25).
  • a chi-square test was used to test for significant differences.
  • Cyst organoids were produced according to the following protocol. 1. The cyst structure was dissected from the artificial collecting duct organoid with the cyst structure using an injection needle. 2. The excised cyst structure was treated with a 1:1 mixture of Accutase and TrypLE at 37°C for 3 minutes. 3. Dissociated to single cyst cells by pipetting. 4. Single cyst cells were suspended in medium containing 10% Afamin/Wnt3a conditioned medium, 200 ng/ml R-spondin1, 200 ng/ml FGF1, 10 ⁇ M Y-27632, 10 ⁇ M Forskolin, 2.5 ⁇ M AVP and plated on 50% matrigel. sown in 5. After culturing for 2 days, the medium was replaced with a medium containing 200 ng/ml FGF1 and 2.5 ⁇ M AVP, and cultured for an additional 3 days.
  • Fig. 26 shows morphological photographs of cysts prepared using medium containing 2.5 ⁇ M AVP or medium containing no 2.5 ⁇ M AVP in steps 4 and 5.

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Abstract

以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルの製造方法を提供する：（１）常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤を含む培地で培養する工程、および（２）工程（１）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、およびグリア細胞株由来神経栄養因子を含む培地で培養して、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを得る工程。

Description

嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド
　本願は、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドに関する。
　難治遺伝性疾患である常染色体優性多発性嚢胞腎(autosomal dominant polycystic kidney disease; ADPKD)は、腎臓に進行性に多数の嚢胞を形成し、中年期以降に末期腎不全に進行する。ADPKDの原因遺伝子は、85%の症例がPKD1、15%の症例がPKD2であり、これらの遺伝子を改変した疾患モデルマウスやラットなどの実験動物を用いた研究が行われてきたが、完全な病態解明には至らず、根治的な治療法も開発されていない。
　近年、難治性疾患の患者体細胞から樹立したiPS細胞または健常者由来のiPS細胞に原因遺伝子変異を導入した疾患特異的iPS細胞を樹立し、in vitroにおいて罹患細胞種に分化誘導することによって、病態を再現する疾患モデルを作製し、詳しい病態解析や治療薬探索を行う研究が盛んに行われている。しかし、ADPKDの腎嚢胞については、未だ病態解析や治療薬探索に使用可能なiPS細胞を用いた疾患モデルは十分に確立されていない課題が存在する。
　ADPKDでは腎尿細管ではなく、主に腎集合管から嚢胞が発生する。ADPKD特異的多能性幹細胞またはADPKD患者由来多能性幹細胞から腎尿細管組織を分化誘導し、腎嚢胞を再現することは報告されているが（非特許文献１～３）、腎集合管分化系を用いた腎嚢胞モデルの報告はない。
Freedman BS. et al., Nat Commun 6, 8715 (2015); Czerniecki SM. et al., Cell Stem Cell 22 929-940 (2018); Shimizu T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 529, 1186-1194 (2020); Mae, SI. & Ryosaka, M. et al. Cell Reports 32, 4, 107943
　本願は、集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを提供することを目的とする。本願により提供される嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドは、集合管嚢胞モデルとして用いることができる。
　本願は、集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを提供する。本願はまた、集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有するオルガノイドである、集合管嚢胞モデルを提供する。
　本願はまた、以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルの製造方法を提供する：
　（１）常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤を含む培地で培養する工程、および
　（２）工程（１）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、およびグリア細胞株由来神経栄養因子を含む培地で培養して、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを得る工程。
　本願はまた、以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルを継代培養する方法を提供する：
　（a）嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを単一の細胞に解離させる工程、
　（b）該細胞を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養する工程、および
　（c）工程（b）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養して、嚢胞オルガノイドを得る工程。
　本願はまた、以下の工程を含む、ADPKDを治療する物質をスクリーニングする方法を提供する：
　（ｉ）候補物質を、集合管嚢胞モデルに接触させる工程；
　（ｉｉ）該集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が縮小または消失しているか否かを確認する工程。
　本願はまた、以下の工程を含む、ADPKDを予防する物質をスクリーニングする方法を提供する：
　（ｉ’）本願の集合管嚢胞モデルの製造方法を実施して、集合管嚢胞モデルを製造する工程、ここで各工程の少なくとも１つの工程における培地は候補物質をさらに含む；
　（ｉｉ’）該集合管嚢胞モデルにおいて嚢胞構造が形成されているか否かを確認する工程。
　本願により、集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドが提供される。嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを継代培養して、嚢胞オルガノイドを再生することができる。また本願の方法により得られる嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドおよびこれを継代して得られる嚢胞オルガノイドは、集合管嚢胞モデルとして用いることができる。本願はまた、ADPKDを治療する物質をスクリーニングする方法およびADPKDを予防する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本実施例の内容を示す模式図。早期段階の尿管芽先端部細胞から誘導されたオルガノイドは嚢胞構造を有しないが、後期段階の尿管芽先端部細胞から誘導されたオルガノイドは嚢胞構造を有する。 PKD1遺伝子座におけるgRNAの標的部位。 PKD1ノックアウト細胞株におけるPKD1変異DNA。 PKD1ノックアウト細胞株におけるPKD1変異mRNA。 PKD1変異mRNAから予測されるアミノ酸配列。アスタリスクは未成熟終止コドンを示す。 PKD1ノックアウトiPS細胞から誘導された尿管芽オルガノイド。 6週間維持培養したPKD1ノックアウトiPS細胞由来の尿管芽先端部細胞の形態。 2週間および6週間維持培養した尿管芽先端部細胞における遺伝子発現量を可視化したMAプロット。2週間ではSALL4, KIT, およびAVPR1Aが高発現しており、6週目ではLCN2発現が亢進していた。 4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間および10週間継代培養した尿管芽先端部細胞から誘導したオルガノイドの形態。6週間以上継代培養した尿管芽先端部細胞から嚢胞構造を有するオルガノイドが誘導された。 嚢胞のAQP2（緑色）およびAVPR2（紫色）での免疫染色像。 585A1株、1231A3株および1383D2株のPKD1ノックアウトiPS細胞から誘導されたオルガノイドの形態。 Forskolinで処理された（右図）、またはForskolinで処理されていない（左図）嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドの形態。 嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドから作製された嚢胞細胞スフェロイドの形態。 図１３のスフェロイドから誘導された嚢胞オルガノイドの形態。 Wnt3a, R-spondin 1, FGF1の組み合わせで作製された嚢胞オルガノイドの形態。 ADPKD患者由来iPS細胞から作製した尿管芽オルガノイド、尿管芽先端部細胞、および嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドの形態。 CiRA00007株のPKD1遺伝子座。CiRA00007株は、エクソン41に遺伝子変異があり、polycystin1タンパク質の3818番目のアミノ酸がグリシン（G）からアルギニン（R）に変化するミスセンス変異を有している。 ADPKD患者由来iPS細胞から作製した嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドのAQP2（緑色）での免疫染色像。 PKD1遺伝子変異を有さない（PKD1+/+）iPS細胞およびPKD1ノックアウト（PKD1-/-）iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞における遺伝子リスト（cilium_GO_0005929）に含まれる遺伝子の発現パターンを示すヒートマップ。 PKD1+/+ iPS細胞およびPKD1-/- iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞における遺伝子リスト（cilium movement_GO_0003341）に含まれる遺伝子の発現パターンを示すヒートマップ。 PKD1+/+ iPS細胞およびPKD1-/- iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞における細胞周期に関連する遺伝子セット（E2F target, G2M checkpoint）のgene set enrichment解析（GSEA）。 PKD1+/+ iPS細胞およびPKD1-/- iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞におけるエネルギー代謝に関連する遺伝子セット（Oxidative phosphorylation）のgene set enrichment解析（GSEA）。 PKD1+/+ iPS細胞およびPKD1-/- iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞におけるコレステロール代謝に関連する遺伝子セット（Cholesterol homeostasis, Bile acid metabolism）のgene set enrichment解析（GSEA）。 PKD1+/+ iPS細胞およびPKD1-/- iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞における細胞内コレステロール量。 尿管芽先端部細胞の培養工程に1μM Fluvastatinを追加して、または追加せずに作製した集合管嚢胞モデルの形態の比較。有意差の検定にはカイ二乗検定を用いた。 2.5μM AVPを含む培地または2.5μM AVPを含まない培地を用いて単一の嚢胞細胞から作製した嚢胞の形態。 2.5μM AVPを含む培地または2.5μM AVPを含まない培地を用いて作製した嚢胞の撮影画像におけるすべての嚢胞の面積をグラフ化した。有意差の検定にはMann-Whitney U検定を用いた。 0.1% DMSOまたは5μM Tolvaptanを添加して作製した嚢胞の面積の平均の比較。有意差の検定にはStudent’s t検定を用いた。 0.1% DMSO、1μM Venglustat、0.1μM Bardoxolone methyl、または1μM Tesevatinibを添加して作製した嚢胞の面積の平均の比較。有意差の検定にはOne-way ANOVAおよびTukey’s t検定を用いた。
　本開示では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±10％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約20」は「18～22」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば「約20～30」は「18～33」を含むものとする。
　本願明細書および請求の範囲において、「ある特定種類の細胞」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞群を意味し、当該細胞群には特定された種類の細胞以外の種類の細胞が含まれていてもよい。例えば「ある特定種類の細胞の培養物」は、当該種類の細胞が含まれる細胞群の培養物を意味し、特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていてもよい。同様に、「ある特定種類の細胞集団」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞集団を意味し、当該細胞集団には特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていてもよい。
　本願において、培地は動物細胞の培養に用いられる基礎培地に必要な因子を適宜添加して調製され得る。基礎培地としては、例えばMEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、DMEM/F12培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えばアルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo Fisher Scientific）、N2サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、B27サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類およびこれらの同等物などの１つ以上の物質、あるいはその他の通常動物培養用培地に添加される１つ以上の物質を含有し得る。
　本願で使用される基礎培地は、例えばDMEM/F12培地、またはDMEM/F12培地にL-ascorbic acid-2-phosphate magnesium、sodium selenium、insulin、NaHCO3およびトランスフェリンが添加された無血清培地であるEssential 6(商標)培地（Thermo Fisher Scientific）であり得る。
嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド
　本願は、集合管主細胞に特異的なマーカー、例えばAQP2および／またはAVPR2などを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを提供する。ある態様では、該嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドにおいて、嚢胞を構成する細胞（以下、「嚢胞構成細胞」という）の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、または99％以上が、集合管主細胞に特異的なマーカー（例えばAQP2およびAVPR2など）を発現している。好ましくは、実質的にすべての嚢胞構成細胞が集合管主細胞に特異的なマーカーを発現している。「嚢胞」とは、液体を内包する、細胞によって覆われた球状の嚢状物を意味する。嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドのサイズは、例えば約100～約5000μmである。嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドは、複数の嚢胞を含んでいてもよい。嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の嚢胞を含む。1つの嚢胞のサイズは、例えば約10～約200μmである。人工集合管オルガノイドであることは、公知の集合管マーカーの発現によって確認できる。例えば、ARL13B（繊毛マーカー）、FOXA1、E-CADHERIN（上皮マーカー）、およびCYTOKERATIN19などの発生早期集合管マーカーの発現によって確認してもよい。本発明の嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドでは、嚢胞構成細胞およびそれ以外の細胞において、このような発生早期集合管マーカーの発現が観察され得る。人工集合管オルガノイドの嚢胞構造は例えば顕微鏡下で確認できる。人工集合管オルガノイドの嚢胞構造が集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成されていることは、免疫染色により顕微鏡下において目視で確認してもよく、フローサイトメトリー、例えばFACS(fluorescence-activated cell sorting)を用いて確認してもよい。
嚢胞オルガノイド
　本願はまた、嚢胞オルガノイドを提供する。本願明細書および請求の範囲において「嚢胞オルガノイド」は、集合管主細胞に特異的なマーカー（例えばAQP2およびAVPR2など）を発現する細胞を含む細胞集団により形成され、個別の嚢胞がそれぞれ単独に存在しているオルガノイドを意味する。ある態様では、該嚢胞オルガノイドにおいて、嚢胞構成細胞の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、または99％以上が、集合管主細胞に特異的なマーカー（例えばAQP2およびAVPR2など）を発現している。好ましくは、実質的にすべての嚢胞構成細胞が集合管主細胞に特異的なマーカーを発現している。1つの嚢胞のサイズは、例えば約10～約300μmである。本発明の嚢胞オルガノイドでは、嚢胞構成細胞およびそれ以外の細胞において、上述した発生早期集合管マーカーの発現が観察され得る。
集合管嚢胞モデルの製造方法
　本願はまた、以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルの製造方法を提供する：
　（１）常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤を含む培地で培養する工程、および
　（２）工程（１）で得られた培養物をWntシグナル伝達活性化因子、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、およびグリア細胞株由来神経栄養因子を含む培地で培養して、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを得る工程。
　集合管嚢胞モデルは、集合管主細胞に特異的なマーカー、例えばAQP2および／またはAVPR2などを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する細胞集団、組織またはオルガノイドである。ある態様では、該集合管嚢胞モデルにおいて、嚢胞構成細胞の20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、または99％以上が、集合管主細胞に特異的なマーカー（例えばAQP2およびAVPR2など）を発現している。好ましくは、実質的にすべての嚢胞構成細胞が集合管主細胞に特異的なマーカーを発現している。集合管嚢胞モデルのサイズは、例えば約10～約5000μmである。集合管嚢胞モデルは、複数の嚢胞が嚢胞を形成していない細胞と共に三次元立体構造を形成している場合、個別の嚢胞がそれぞれ単独に存在している場合のいずれも含む。1つの嚢胞のサイズは、例えば約10～約300μmである。集合管嚢胞モデルは、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の嚢胞を含む。本発明の集合管嚢胞モデルでは、嚢胞構成細胞およびそれ以外の細胞において、上述した発生早期集合管マーカーの発現が観察され得る。集合管嚢胞モデルの嚢胞構造は例えば顕微鏡下で確認できる。集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成されていることは、免疫染色により顕微鏡下において目視で確認してもよく、フローサイトメトリーまたはFACS（fluorescence-activated cell sorting）を用いて確認してもよい。
　本明細書および請求の範囲において、複数の嚢胞が嚢胞を形成していない細胞と共に三次元立体構造を形成している人工集合管オルガノイドを「嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド」とし、個別の嚢胞がそれぞれ単独に存在しているオルガノイドを「嚢胞オルガノイド」とする。
　常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的細胞とは、ADPKDの患者由来の細胞であるか、またはADPKDに関連する遺伝子変異を有する細胞を意味する。ADPKDに関連する遺伝子変異とは、当該変異によってADPKD関連遺伝子が正常に機能しなくなることで、ADPKDを直接的又は間接的に引き起こし得る変異を意味する。ADPKD関連遺伝子としては、ADPKDの原因遺伝子であるPKD1遺伝子およびPKD2遺伝子ならびにそれらに関連する遺伝子が挙げられ、例えばPKD1遺伝子である。
　ある実施態様において、ADPKDに関連する遺伝子変異を有する細胞は、ADPKD関連遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされた細胞である。遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法は公知であり、特に限定されない。遺伝子をノックアウトする方法としては、相同組換え技術、ならびにCRISPRシステム、TALENおよびZFNなどを用いたゲノム編集技術などが挙げられる。遺伝子をノックダウンする方法としては、mRNAのアンチセンス鎖に相当するRNAを細胞に導入するアンチセンス法、siRNA、shRNA、microRNAなどを用いるRNAi法などが挙げられる。
　「尿管芽先端部細胞」とは、尿管芽組織または尿管芽オルガノイドの発芽または枝分かれした領域の先端部の性質を有する細胞を意味する。尿管芽先端部細胞であることは、GATA3、RET、WNT11、LHX1、SOX9および超低密度リポタンパク質受容体（VLDL-R）などのマーカーの発現、または超低密度リポタンパク質（VLDL）の取り込みなどにより確認できる。尿管芽先端部細胞は、哺乳動物由来、例えば霊長類由来であり得、好ましくはヒト由来である。
　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞は、ADPKDの患者由来の尿管芽先端部細胞であるか、またはADPKDに関連する遺伝子変異を有する尿管芽先端部細胞である。ある実施態様において、ADPKD特異的尿管芽先端部細胞は、PKD1遺伝子がノックアウトされた尿管芽先端部細胞である。ADPKDに関連する遺伝子変異を有する尿管芽先端部細胞は、尿管芽先端部細胞を遺伝子改変することによって作製されてもよく、ADPKDに関連する遺伝子変異を有する細胞から誘導されてもよい。
　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞は、多能性幹細胞から製造されたものであってもよい。多能性幹細胞から尿管芽先端部細胞を製造する方法は知られており、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えばWO2019/098349または非特許文献４に記載の方法が使用できる。具体的には、多能性幹細胞から前方中間中胚葉細胞および中腎管細胞を経由して尿管芽オルガノイドを作製し、尿管芽オルガノイドを単一の細胞に解離することによって尿管芽先端部細胞を製造すればよい。
　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞は凍結保存することができる。ADPKD特異的尿管芽先端部細胞を凍結保存することにより、同一ロットの細胞を用いて各実験を実施できる。細胞の凍結および起眠方法は公知の方法を使用できる。例えば細胞を凍結する方法として、ADPKD特異的尿管芽先端部細胞を細胞分離溶液（例えばAccutase）により単一細胞に解離させ、遠心分離により上清を除去した後、凍結保存液（例えばstem cell banker）に懸濁し、-80℃で一晩緩慢凍結後、-196℃（液体窒素中）で保存すればよい。凍結保存液としてはDMSOを含む凍結液などを利用できる。具体的にはSTEM-CELLBANKERなどのセルバンカー（Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.）、バンバンカー（NIPPON Genetics）、TCプロテクター（DS Pharma Biomedical Co.,Ltd.）、CP-1（KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.）などの市販の凍結保存液が例示される。凍結細胞を起眠する方法として、凍結したADPKD特異的尿管芽先端部細胞を37℃の水浴などで迅速に融解し、凍結保存液を遠心洗浄後、培地に懸濁させる方法が例示される。凍結保存し、起眠させたADPKD特異的尿管芽先端部細胞は、以下の態様におけるADPKD特異的尿管芽先端部細胞として使用され得る。
　本願において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性と増殖能を併せもつ幹細胞であり、例えば胚性幹（ES）細胞（J.A. Thomson et al. （1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. （1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. （1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall （1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞（T. Wakayama et al. （2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. （2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. （2007）, Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）（M. Kanatsu-Shinohara et al. （2003） Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. （2004）, Cell, 119:1001-1012）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）（Y. Matsui et al. （1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. （1992）, Nature, 359:550-551）、人工多能性幹（iPS）細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka （2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. （2007）, Cell, 131:861-872; J. Yu et al. （2007）, Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al, Nat. Biotechnol. 26:101-106 （2008）；WO2007/069666）、および培養線維芽細胞または骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。本願において、多能性幹細胞は、哺乳動物由来、例えば霊長類由来であり得、好ましくはヒト由来である。また、多能性幹細胞は、例えばES細胞またはiPS細胞であり得る。多能性幹細胞はADPKD特異的多能性幹細胞であり得る。
　iPS細胞は、特定の初期化因子をDNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる（K. Takahashi and S. Yamanaka （2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. （2007）, Cell, 131:861-872; J. Yu et al. （2007）, Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M. et al, Nat. Biotechnol. 26:101-106 （2008）；WO2007/069666）。iPS細胞を用いる場合、該iPS細胞は、自体公知の方法により体細胞から作製してもよいし、既に樹立され、ストックされているiPS細胞を用いてもよい。本発明に用いるiPS細胞の由来となる体細胞に制限はなく、例えば末梢血由来の細胞または臍帯血由来の細胞が用いられ得る。iPS細胞の由来となる動物に制限はなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、オランウータン、チンパンジー、イヌ、ネコ、トリ、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。iPS細胞およびiPS細胞の由来となる体細胞はADPKD特異的細胞であり得る。
　工程（１）において、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤を含む培地で培養する。
　工程（１）において、グリア細胞株由来神経栄養因子の濃度は、100pg/ml～10μg/ml、1ng/ml～10μg/ml、または10ng/ml～1μg/mlであり得、例えば約100ng/mlである。
　「線維芽細胞増殖因子」はFGF1からFGF23までが知られており、これら公知のものから適宜選択すればよい。工程（１）において、線維芽細胞増殖因子の濃度は、使用する線維芽細胞増殖因子に応じて当業者が適宜選択可能である。線維芽細胞増殖因子がFGF1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　「レチノイン酸受容体（RAR）アゴニスト」は天然に存在するレチノイド、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物、またはレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってよい。RARアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス－レチノイン酸（全トランスRA）と9-シス-レチノイン酸（9-シスRA）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第5,234,926号、米国特許第4,326,055号など）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Am80、AM580（4-[[5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル]カルボキシアミド]ベンゾイックアシッド）、TTNPB（4-[[E]-2-[5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル]-1-プロペニル]ベンゾイックアシッド）、AC55649（4’-オクチル-[1,1’-ビフェニル]-4-カルボキシリックアシッド）が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要9:55-61、2009年）。本願で使用されるRARアゴニストは、レチノイン酸、AM580、TTNPB、AC55649であり得、例えばTTNPBであり得る。工程（１）において、レチノイン酸受容体アゴニストの濃度は、使用するレチノイン酸受容体アゴニストに応じて当業者が適宜選択可能である。レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである場合、その濃度は、0.1nM～10μM、1nM～10μM、または10nM～1μMであり得、例えば約0.1μMである。
　「GSK3β阻害剤」とは、GSK3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えばインジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-（2,4-ジクロロフェニル）-4-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021（6-[2-[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イルアミノ]エチルアミノ]ピリジン-3-カルボニトリル）が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。本願で使用されるGSK3β阻害剤は、例えばCHIR99021であり得る。工程（１）において、GSK3β阻害剤の濃度は、使用するGSK3β阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。GSK3β阻害剤がCHIR99021である場合、その濃度は、3nM～300μM、30nM～300μM、または300nM～30μMであり得、例えば約3μMである。
　工程（１）において、YAP活性阻害剤の濃度は、使用するYAP活性阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。YAP活性阻害剤としては、公知のものを適宜用いればよいが、例えばYAP阻害活性とROCK阻害活性の両方の活性を有するThiazovivinが例示される。YAP活性阻害剤がThiazovivinである場合、その濃度は、10nM～1mM、100nM～1mM、または1μM～100μMであり得、例えば約10μMである。
　工程（１）において、培地にはさらにTGFβシグナル阻害剤を含んでいてもよい。「TGFβシグナル阻害剤」はTGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えばLefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A83-01（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド、WO2009146408)、ALK5阻害剤II（2-[3-[6-メチルピリジン-2-イル]-1H-ピラゾル-4-イル]-1,5-ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（6-[2-tert-ブチル-5-[6-メチル-ピリジン-2-イル]-1H-イミダゾル-4-イル]-キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。本願で使用されるTGFβシグナル阻害剤は、例えばA83-01であり得る。工程（１）において、TGFβシグナル阻害剤の濃度は、使用するTGFβシグナル阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。TGFβシグナル阻害剤がA83-01である場合、その濃度は、1nM～100μM、10nM～100μM、または100nM～10μMであり得、例えば約1μMである。
　工程（１）において、培養期間は、1～5日、または1～3日であり得、例えば約2日である。
　工程（１）において、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞は、浮遊培養され得る。本願において、「浮遊培養」とは細胞を培養皿に非接着の状態で培養することである。特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックスなどによるコーティング処理）されていないもの、または人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）がされているものを使用して行うことができる。例えば、96ウェル低接着プレート（Sumitomo Bakelite）および35ｍｍ低接着ディッシュ（Sumitomo Bakelite）などの市販品を使用してもよい。
　培養温度は以下に限定されないが、約30～約40℃、例えば約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は例えば約2～約5％である。
　ある態様において、本願の方法は、工程（１）の前に常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を維持培養する工程をさらに含む。維持培養の際に培地に添加される物質およびその濃度は、上述したとおりである。一例として、グリア細胞株由来神経栄養因子（例えば、約100ng/ml GDNF）、線維芽細胞増殖因子（例えば、約200ng/ml FGF1）、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、約0.1μM TTNPB）、GSK3β阻害剤（例えば、約3μM CHIR99021）、YAP活性阻害剤（例えば、約10μM Thiazovivin）、およびTGFβシグナル阻害剤（例えば、約1μM A83-01）を培地に添加する。
　維持培養の期間は、例えば、6週間以上、7週間以上、8週間以上、9週間以上、または10週間以上であり得る。尿管芽先端部細胞は、1～12日毎、5～10日毎、6～8日毎、または約7日ごとに継代培養することによって維持され得る。また、尿管芽先端部細胞のコロニーが、約10～約1000μm、約15～約500μm、約20～約150μm、または約80～約100μmの大きさまで増殖した時点で継代培養することによっても維持できる。継代の回数は特に限定されず、所望の回数継代培養することができる。
　維持培養において、尿管芽先端部細胞は、三次元スキャホールド材を培地で希釈することにより得られたハイドロゲル上に播種して三次元培養され得る。
　三次元スキャホールド材としては、培養細胞の三次元立体構造構築用のものが種々知られており、また販売されており、特に限定されない。例えばコラーゲンベースの材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の材料、またはそれらの複合体を使用できる。また、その形態も特に限定されず、例えばスポンジ状構造物などが挙げられる。また、三次元スキャホールド材は生体由来の試料を材料（例えば細胞外マトリックスや基底膜など）とするものであってもよい。具体的には、マトリゲル（商標）（ベクトン・ディッキンソン社）、typeIコラーゲンゲル、typeIVコラーゲンゲルなどが例示される。マトリゲル（商標）基底膜マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主にラミニン、コラーゲンIV、エンタクチンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成される。さらに、TGF-β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、EHSなどの他の増殖因子を含んでもよい。
　維持培養において、三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、ハイドロゲル中のマトリゲルの濃度は、20％～80％、30％～70％、または40～60％であり得、例えば約50％である。
　培養温度は以下に限定されないが、約30～約40℃、例えば約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は例えば約2～約5％である。
　工程（２）において、工程（１）で得られた培養物をWntシグナル伝達活性化因子、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、およびグリア細胞株由来神経栄養因子を含む培地で培養して、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを得る。ある態様において、工程（１）で得られた培養物は浮遊培養される。
　工程（２）において、Wntシグナル伝達活性化因子の濃度は、使用するWntシグナル伝達活性化因子に応じて当業者が適宜選択可能である。本願で使用されるWntシグナル伝達活性化因子は、LiCl、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a、R-spondin 1またはそれらの組合せなどであり得、例えばWnt3aおよび／またはR-spondin 1である。Wntシグナル伝達活性化因子がWnt3aである場合、その濃度は約5～約20％であり得る。Afamin/Wnt3a条件培地などの市販品を使用してもよい。Wntシグナル伝達活性化因子がR-spondin 1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　「BMP阻害剤」は、Chordin、Noggin、Follistatinなどのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin 6-[4-（2-piperidin-1-yl-ethoxy）phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine、その誘導体（P. B. Yu et al. （2007）, Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. （2008）, Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. （2008）, PLoS ONE, 3（8）:e2904）およびLDN193189（4-（6-（4-（piperazin-1-yl）phenyl）pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）が例示される。本願で使用されるBMP阻害剤は、例えばLDN193189であり得る。工程（２）において、BMP阻害剤の濃度は、使用するBMP阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。BMP阻害剤がLDN193189である場合、その濃度は、0.1nM～10μM、1nM～10μM、または10nM～1μMであり得、例えば約0.1μMである。
　工程（２）において、線維芽細胞増殖因子の濃度は、使用する線維芽細胞増殖因子に応じて当業者が適宜選択可能である。線維芽細胞増殖因子がFGF8である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（２）において、レチノイン酸受容体アゴニストの濃度は、使用するレチノイン酸受容体アゴニストに応じて当業者が適宜選択可能である。レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである場合、その濃度は、0.1nM～10μM、1nM～10μM、または10nM～1μMであり得、例えば約0.1μMである。
　工程（２）において、グリア細胞株由来神経栄養因子の濃度は、100pg/ml～10μg/ml、1ng/ml～10μg/ml、または10ng/ml～1μg/mlであり得、例えば約100ng/mlである。
　工程（２）において、培地にはさらにTGFβシグナル阻害剤を含んでいてもよい。TGFβシグナル阻害剤の濃度は、使用するTGFβシグナル阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。TGFβシグナル阻害剤がA83-01である場合、その濃度は、1nM～100μM、10nM～100μM、または100nM～10μMであり得、例えば約1μMである。
　工程（２）において、培地はさらにEGFおよび／またはFGF1を含んでいてもよい。EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。EGFはR&D systems社などから市販されているものを使用することができる。EGFの濃度は、50pg/ml～5μg/ml、500pg/ml～5μg/ml、または5ng/ml～500ng/mlであり得、例えば約50ng/mlである。FGF1の濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（２）において、培地はさらにフォルスコリンを含んでいてもよい。フォルスコリンの濃度は、10nM～1mM、100nM～1mM、または1μM～100μMであり得、例えば約10μMである。ある実施態様において、フォルスコリンは工程（２）の途中で培地に添加される。例えば、フォルスコリンは工程（２）の培養0～15日目、5～10日目、または約8日目において培地に添加される。
　工程（２）において、培地はさらにマトリゲルを含んでいてもよい。マトリゲルの濃度は、1～40％、2～30％、または5～20％であり得、例えば約10％である。
　工程（２）において、培養期間は、5～40日、7～30日、または10～25日であり得、例えば約14～21日である。
　培養温度は以下に限定されないが、約30～約40℃、例えば約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は例えば約2～約5％である。
集合管嚢胞モデルを継代培養する方法
　本願はまた、以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルを継代培養する方法を提供する：
　（a）嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを単一の細胞に解離させる工程、
　（b）該細胞を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養する工程、および
　（c）工程（b）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養して、嚢胞オルガノイドを得る工程。
　工程（a）において、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを単一の細胞に解離させる。ある態様において、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドは本願の方法によって製造されたものである。
　嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを解離する方法としては、従来公知の細胞凝集塊の解離方法を適宜採用すればよく、例えば力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、AccutaseおよびAccumaxなど）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。例えば、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えばAccutase）を用いて細胞凝集塊を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法を使用してもよい。
　なお、本明細書および請求の範囲において、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドもしくは嚢胞オルガノイドから単一細胞とした細胞を「嚢胞細胞」という。
　工程（b）において、工程（a）で解離させた嚢胞細胞を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養する。
　工程（b）において、Wntシグナル伝達活性化因子の濃度は、使用するWntシグナル伝達活性化因子に応じて当業者が適宜選択可能である。Wntシグナル伝達活性化因子がWnt3aである場合、その濃度は約5～約20％であり得る。Afamin/Wnt3a条件培地などの市販品を使用してもよい。Wntシグナル伝達活性化因子がR-spondin 1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（b）において、培地はさらにROCK阻害剤を含んでいてもよい。「ROCK阻害剤」はRho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えばY-27632（Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)）、Fasudil/HA1077（Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)）、SR3677（Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)）、GSK269962（Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007); WO2005/037197）、H-1152（Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)）、Wf-536（Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例えばsiRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、および国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号）。本願でROCK阻害剤という場合、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本願で使用されるROCK阻害剤は、好ましくはY-27632であり得る。
　工程（b）において、ROCK阻害剤の濃度は、使用するROCK阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能である。ROCK阻害剤がY-27632である場合、その濃度は、10nM～1mM、100nM～1mM、または1μM～100μMであり得、例えば約10μMである。
　工程（b）において、培地はさらに線維芽細胞増殖因子を含んでいてもよい。線維芽細胞増殖因子の濃度は、使用する線維芽細胞増殖因子に応じて当業者が適宜選択可能である。線維芽細胞増殖因子がFGF1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（b）において、培養期間は、1～10日、2～7日、または3～5日であり得、例えば約4日である。
　工程（b）において、工程（a）で解離させた細胞は三次元培養され得る。三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、ハイドロゲル中のマトリゲルの濃度は、20％～80％、30％～70％、または40～60％であり得、例えば約50％である。
　培養温度は以下に限定されないが、約30～約40℃、例えば約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は例えば約2～約5％である。
　工程（c）において、工程（b）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養する。ある態様において、工程（b）で得られた培養物は浮遊培養される。
　工程（c）において、Wntシグナル伝達活性化因子の濃度は、使用するWntシグナル伝達活性化因子に応じて当業者が適宜選択可能である。Wntシグナル伝達活性化因子がWnt3aである場合、その濃度は約5～約20％であり得る。Afamin/Wnt3a条件培地などの市販品を使用してもよい。Wntシグナル伝達活性化因子がR-spondin 1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（c）において、培地はさらに線維芽細胞増殖因子を含んでいてもよい。線維芽細胞増殖因子の濃度は、使用する線維芽細胞増殖因子に応じて当業者が適宜選択可能である。線維芽細胞増殖因子がFGF1である場合、その濃度は、200pg/ml～20μg/ml、2ng/ml～20μg/ml、または20ng/ml～2μg/mlであり得、例えば約200ng/mlである。
　工程（c）において、培地はさらにフォルスコリンを含んでいてもよい。フォルスコリンの濃度は、10nM～1mM、100nM～1mM、または1μM～100μMであり得、例えば約10μMである。
　工程（c）において、培地はさらにマトリゲルを含んでいてもよい。マトリゲルの濃度は、1～40％、2～30％、または5～20％であり得、例えば約10％である。
　工程（c）において、培養期間は、1～20日、2～15日、または5～10日であり得、例えば約7日である。
　培養温度は以下に限定されないが、約30～約40℃、例えば約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は例えば約2～約5％である。
ADPKD治療物質をスクリーニングする方法
本願はまた、以下の工程を含む、ADPKDを治療する物質をスクリーニングする方法を提供する：
　（ｉ）候補物質を、集合管嚢胞モデルに接触させる工程；
　（ｉｉ）該集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が縮小または消失しているか否かを確認する工程。
　「候補物質」は、ADPKDを治療する物質の候補となり得るものであればよく、その種類については特に限定されない。候補物質は生体由来物質などの天然物質であってもよく、化学的に合成された合成物質であってもよい。具体的には、候補物質としてタンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物、無機化合物などが挙げられる。
　工程（ｉ）において、候補物質を、集合管嚢胞モデルに接触させる。ある態様において、集合管嚢胞モデルは本願の集合管嚢胞モデルの製造方法によって製造されたものである。候補物質は、例えば集合管嚢胞モデルを含む培養培地に添加され得る。
　工程（ｉｉ）において、該集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が縮小または消失しているか否かを確認する。ある態様において、集合管嚢胞モデルの嚢胞構造を、対照の集合管嚢胞モデルの嚢胞構造と比較する。対照の集合管嚢胞モデルは、例えば候補物質を接触させていない集合管嚢胞モデルまたは候補物質を接触させる前の集合管嚢胞モデルである。集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が対照の集合管嚢胞モデルの嚢胞構造と比較して縮小または消失していた場合、候補物質をADPKDを治療する物質として選択できる。嚢胞構造のサイズは顕微鏡下で確認することができる。
　本明細書において、「治療」は、疾患の原因を軽減または除去すること、疾患の進行を遅延または停止させること、その症状を軽減、緩和、改善または除去すること、および／またはその症状の悪化を抑制することを意味する。
ADPKD予防物質をスクリーニングする方法
　本願はまた、以下の工程を含む、ADPKDを予防する物質をスクリーニングする方法を提供する：
　（ｉ’）本願の集合管嚢胞モデルの製造方法を実施して、集合管嚢胞モデルを製造する工程、ここで各工程の少なくとも１つの工程における培地は候補物質をさらに含む；
　（ｉｉ’）該集合管嚢胞モデルにおいて嚢胞構造が形成されているか否かを確認する工程。
　「候補物質」は、ADPKDを予防する物質の候補となり得るものであればよく、その種類については特に限定されない。候補物質は生体由来物質などの天然物質であってもよく、化学的に合成された合成物質であってもよい。具体的には、候補物質としてタンパク質、アミノ酸、核酸、脂質、糖質、低分子化合物、無機化合物などが挙げられる。
　工程（ｉ’）において、本願の集合管嚢胞モデルの製造方法を実施して、集合管嚢胞モデル（人工集合管オルガノイドまたは嚢胞オルガノイド）を製造する、ここで各工程の少なくとも１つの工程における培地は候補物質をさらに含む。例えば、工程（１）および工程（２）、ならびに存在する場合には工程（１）の前にADPKD特異的尿管芽先端部細胞を維持培養する工程において、培地は候補物質をさらに含む。候補物質は、各工程の全培養期間において培地に含めてもよく、あるいは培養期間の一部分において培地に含めてもよい。
　工程（ｉｉ’）において、該集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が形成されているか否かを確認する。集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が形成されていない場合、候補物質をADPKDを予防する物質として選択できる。ある態様において、集合管嚢胞モデルの嚢胞構造を、対照の集合管嚢胞モデルの嚢胞構造と比較する。対照の集合管嚢胞モデルは、例えば候補物質を培地に含めずに製造した集合管嚢胞モデルである。集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が対照の集合管嚢胞モデルの嚢胞構造と比較して縮小または消失していた場合、候補物質をADPKDを予防する物質として選択できる。嚢胞構造のサイズは顕微鏡下で確認することができる。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
　本実施例で確立した方法をまとめた模式図を図１に示す。本実施例で誘導した細胞およびオルガノイドの明視野画像をCKX41倒立顕微鏡（Olympus）により取得した。
［材料と方法］
PKD1ノックアウト人工多能性幹（iPS）細胞の作製
　ヒト人工多能性幹細胞を用いた実験は、京都大学医学部および医学研究科の倫理委員会によって承認された。3種のヒトiPS細胞株585A1、1231A3および1383D2を用いた。PKD1ノックアウトiPS細胞を以前に報告されたDNAトランスポゾンに基づくCRISPR-Cas9 regulated transcription and nuclear shuttling (CRONUS)システムを用いて作製した（Ishida K. et al., Sci Rep. 8:310 (2018); Shimizu T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 529, 1186-1194 (2020)）。CRONUS-Puroベクター（pPV-TetO-SphcCas9-GR-iC-A-EF1α-rtTA-iP、Addgene ID 100596）およびsgRNAをクローニングするためのpiggyBacベクター（pPV-H1-ccdB-mEF1α-RiH、Addgene ID 100598）をpiggyBacトランスポザーゼ発現プラスミド（pHL-EF1α-hcPBase-A、Addgene ID 100599）とともにFuGENE6(Promega)を用いたリポフェクションによって細胞中に連続的にトランスフェクトした。CRONUS-PuroベクターおよびsgRNAをクローニングするためのpiggyBacベクターは、それぞれピューロマイシン選択およびハイグロマイシン選択に適合していた。PKD1エクソン34スプライシングアクセプター部位を標的とするgRNA配列をpPV-H1-ccdB-mEF1α-RiHベクターにクローニングするために以下の配列を用いた：5’-GAGACCACTTGGATCCGGGATCAGGTCTTCATCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’（配列番号１、標的部位を下線で示す）。PKD1遺伝子座におけるgRNA標的部位を図２に示す。トランスフェクトした細胞の薬剤選択によりRFP＋コロニーを手動で採取し、ドキシサイクリンおよびデキサメタゾンで処理してゲノム編集を誘導した。個々のコロニーをバルクゲノムDNAのサンガーシーケンシングによりゲノム編集効率についてスクリーニングした。次いで、単一の細胞をフローサイトメトリーによって単離し、iMatrix-511（Nippi）でコーティングした24ウェル培養プレート（Corning）でクローン的に増殖させ、サンガーシーケンシングにより遺伝子型を決定した。ゲノム編集によりフレームシフトおよび未成熟終止コドンが生じていた（図３～５）。エクソン34内の異なる部位の2塩基（AG）がスプライシングアクセプター配列として機能したため、2種類のPKD1変異mRNAが生成された。
PKD1ノックアウトiPS細胞から尿管芽オルガノイドへの分化誘導
　PKD1ノックアウトiPS細胞を以前に記述されるように尿管芽オルガノイドに誘導した（Mae, SI. & Ryosaka, M. et al. Cell Reports 32, 4, 107943）。
尿管芽先端部細胞の作製
　PKD1ノックアウトiPS細胞から誘導した尿管芽オルガノイドを37℃においてAccutase（Innovative Cell Technologies）で5分間処理し、その後ピペット操作によって単一細胞に解離させた。細胞をB27サプリメント（ビタミンA不含）（Gibco）、3μM CHIR99021（StemRD）、0.1μM TTNPB（Santa cruz）、200ng/ml FGF1（R&D systems）、100ng/ml GDNF（R&D systems）、10μM Thiazovivin（Santa Cruz Biotechnology）および1μM A83-01（Wako）を含むDMEM/F12培地（Gibco）で懸濁した。単一細胞を150μLハイドロゲルでコートした48ウェルプレートの1つのウェル上に1.0x105細胞/ウェルで播種した。ハイドロゲルは50％マトリゲル（BD Biosciences）を含むDMEM/F12培地で構成され、使用する前に37℃で1時間凝固させた。単一細胞は7日後に尿管芽先端部細胞コロニーを構築した。培地を2～3日毎に交換した。
尿管芽先端部細胞の継代培養
　ハイドロゲルをCell Recovery Solution（Corning）を用いて4℃で30分間溶解し、尿管芽先端部細胞コロニーを分離した。Cell Recovery Solutionでさらに洗浄した後、尿管芽先端部細胞コロニーを室温において500gで5分間遠心した。尿管芽先端部細胞コロニーを37℃においてAccutaseで5分間処理し、その後ピペット操作によって単一細胞に解離させた。細胞をB27サプリメント（ビタミンA不含）、3μM CHIR99021、0.1μM TTNPB、200ng/ml FGF1、100ng/ml GDNF、10μM Thiazovivinおよび1μM A83-01を含むDMEM/F12培地で懸濁した。細胞を150μLハイドロゲルでコートした48ウェルプレートの1つのウェル上に1.0x105細胞/ウェルで播種した。ハイドロゲルは50％マトリゲルを含むDMEM/F12培地で構成され、使用する前に37℃で1時間凝固させた。単一細胞を37℃、5%CO2で7日間培養することで、尿管芽先端部細胞コロニーを作製した。培地を2～3日毎に交換した。作製した先端部細胞コロニーを同様に7日毎に継代培養した。
尿管芽先端部細胞の凍結保存
　上述のように解離させた単一細胞を、STEM-CELLBANKER（登録商標） GMP grade（#CB045、Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.）で懸濁した。細胞懸濁液を各凍結保存チューブに分配した。チューブを－80℃で一晩凍結させ、長期間の凍結保存のために液体窒素細胞貯蔵タンクに移動させた。
　培養を開始するため、細胞を水浴を用いて37℃で解凍した。次に、細胞をSTO培地中に添加し、室温において200gで3分間遠心した。上清を除去した後、細胞をB27サプリメント（ビタミンA不含）、3μM CHIR99021、0.1μM TTNPB、200ng/ml FGF1、100ng/ml GDNF、10μM Thiazovivinおよび1μM A83-01を含むDMEM/F12培地で懸濁した。細胞を150μLハイドロゲルでコートした48ウェルプレートの1つのウェル上に1.0x105細胞/ウェルで播種した。ハイドロゲルは50％マトリゲルを含むDMEM/F12培地で構成され、使用する前に37℃で1時間凝固させた。単一細胞を37℃、5%CO2で7日間培養することで、尿管芽先端部細胞コロニーを作製した。培地を2～3日毎に交換した。
尿管芽先端部細胞からの集合管オルガノイドの再構成
　ハイドロゲルをCell Recovery Solutionを用いて4℃で30分間溶解し、尿管芽先端部細胞コロニーを分離した。Cell Recovery Solutionでさらに洗浄した後、尿管芽先端部細胞コロニーを室温において500gで5分間遠心した。尿管芽先端部細胞コロニーを37℃においてAccutaseで5分間処理し、その後ピペット操作によって単一細胞に解離させた。細胞を3μM CHIR99021、0.1μM TTNPB、200ng/ml FGF1、100ng/ml GDNF、10μM Thiazovivinおよび1μM A83-01を含むEssential 6培地（Gibco）で懸濁した。細胞を96ウェル低接着プレート（Sumitomo Bakelite）に5.0x103細胞/ウェルで播種した。単一細胞を37℃、5%CO2で2日間培養することで、スフェロイドを作製した。
　スフェロイドを10％ Afamin/Wnt3a条件培地（MBL）、200ng/ml R-spondin 1（R&D systems）、0.1μM LDN193189（Axon medchem）、200ng/ml FGF1、200ng/ml FGF8（Peprotech）、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPB、50ng/ml EGF（R&D systems）、1μM A83-01および10％マトリゲルを含むEssential 6培地で懸濁し、35mm低接着ディッシュ（Sumitomo Bakelite）に2.5～3mL/ディッシュで分配した。培地を3～4日毎に交換した。スフェロイドを37℃、5%CO2で14～21日間培養することで、人工集合管オルガノイドを作製した。
Forskolin処理による嚢胞の増大
　5回以上継代培養を行った尿管芽先端部細胞から上記の方法によりスフェロイドを作製した。スフェロイドを上記との方法により約7日間培養した後、培地に10μMフォルスコリン（Wako）を添加し、さらに7日間培養した。
嚢胞細胞の継代培養
　ハイドロゲルをCell Recovery Solutionを用いて4℃で30分間溶解し、嚢胞構造を有するオルガノイドを分離した。Cell Recovery Solutionでさらに洗浄した後、嚢胞構造を有するオルガノイドを室温において500gで5分間遠心した。嚢胞構造を有するオルガノイドを37℃においてAccutaseで5分間処理し、その後ピペット操作によって単一細胞に解離させた。細胞を200ng/ml FGF1の非存在下または存在下において、B27サプリメント（ビタミンA不含）、10％ Afamin/Wnt3a条件培地、200ng/ml R-spondin 1および10μM Y-27632（Wako）を含むDMEM/F12培地で懸濁した。細胞を150μLハイドロゲルでコートした48ウェルプレートの1つのウェル上に1.0x105細胞/ウェルで播種した。ハイドロゲルは50％マトリゲルを含むDMEM/F12培地で構成され、使用する前に37℃で1時間凝固させた。単一細胞を37℃、5%CO2で4日間培養することで、嚢胞細胞スフェロイドを作製した。
　ハイドロゲルをCell Recovery Solutionを用いて4℃で30分間溶解し、嚢胞細胞スフェロイドを分離した。Cell Recovery Solutionでさらに洗浄した後、嚢胞細胞スフェロイドを室温において500gで5分間遠心した。嚢胞細胞スフェロイドを200ng/ml FGF1の非存在下または存在下において、10％ Afamin/Wnt3a条件培地、200ng/ml R-spondin 1および10％マトリゲルを含むEssential 6培地で懸濁し、35mm低接着ディッシュに2.5～3mL/ディッシュで分配した。嚢胞細胞スフェロイドを37℃、5%CO2で7日間培養することで、嚢胞オルガノイドを作製した。
免疫染色
　免疫染色をいくつかの改変を伴って以前に記述されるように行った（Mae, SI. & Ryosaka, M. et al. Biochem Biophys Res Commun. 495, 954-61 (2018)）。凍結切片の免疫染色のために、試料を4％ PFA/PBSを用いて4℃で1～2時間固定した。固定した試料を30％ショ糖/PBSで処理し、O.C.T化合物（Sakura Finetek Japan）で凍結し、凍結切片法によって凍結切片を作製した。凍結切片を蒸留水で洗浄し、ブロッキング溶液と共に室温で1時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液で希釈し、試料と共に4℃で一晩インキュベートした。PBSで3回洗浄した後、細胞をブロッキング溶液で1:500に希釈した二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。蛍光画像をBZ-X700オールインワン蛍光顕微鏡（Keyence）により取得した。
　本実施例で使用した一次抗体および二次抗体（Thermo Fisher Scientific）の詳細をそれぞれ表１および表２に示す。本実施例では表２に記載の二次抗体を適宜組み合わせて使用した。また、核染色剤としてHoechst33342（Thermo Fisher Scientific, Catalog Number: H1399）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［結果］
PKD1ノックアウトiPS細胞の作製
　PKD1ノックアウトiPS細胞を以前に報告された方法により作製した（Shimizu T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2020）。親株には585A1株、1231A3株および1383D2株を用いた。
嚢胞構造を有する集合管オルガノイドの作製
　1231A3株のPKD1ノックアウトiPS細胞から、以前に報告された方法により尿管芽オルガノイドを誘導した（Mae, SI. & Ryosaka, M. et al. Cell Reports 32, 4, 107943）。誘導した尿管芽オルガノイドは嚢胞構造を有していなかった（図６）。
　誘導した尿管芽オルガノイドをAccutase処理によって単一細胞に解離させ、単一細胞をハイドロゲル上で7日間培養して尿管芽先端部細胞コロニーを作製した。尿管芽先端部細胞コロニーをAccutase処理によって単一細胞に解離させ、単一細胞をハイドロゲル上で再度7日間培養することにより、尿管芽先端部細胞コロニーを作製した。尿管芽先端部細胞コロニーを同様に7日毎に継代培養した。6週間継代培養した尿管芽先端部細胞を図７に示す。2週間継代培養した尿管芽先端部細胞と6週間継代培養した尿管芽先端部細胞の遺伝子発現を比較したところ、6週間継代培養した尿管芽先端部細胞では、尿管芽組織の発生後期段階のマーカー遺伝子の発現が増加し、発生早期段階のマーカー遺伝子の発現が減少していた（図８）。したがって、尿管芽先端部細胞の維持培養は、尿管芽先端部細胞の発生分化段階を進行させることが示唆された。
　ADPKDにおいて、嚢胞構造は尿管芽組織の発生の後期段階において生じるため、長期間維持培養した尿管芽先端部細胞から嚢胞構造を有する集合管オルガノイドが誘導されることが予想された。そこで、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間および10週間継代培養した尿管芽先端部細胞から人工集合管オルガノイドを誘導した。具体的には、各尿管芽先端部細胞を低接着プレート上で2日間浮遊培養することによりスフェロイドを作製した。スフェロイドを35mm低接着ディッシュ上でさらに14～21日間浮遊培養することで人工集合管オルガノイドを作製した。ここで、尿管芽先端部細胞は585A1株のPKD1ノックアウトiPS細胞から誘導したものを用いた。その結果、6週間以上継代培養した尿管芽先端部細胞から嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドが誘導されることがわかった（図９）。免疫染色により、この嚢胞は嚢胞内腔の細胞膜および細胞質内において集合管主細胞マーカーであるAQP2およびAVPR2を発現していたことが示された（図１０）。
　1231A3株および1383D2株のPKD1ノックアウトiPS細胞を用いて、上述の方法により人工集合管オルガノイドを誘導した。1231A3株および1383D2株においても、6週間以上維持培養した尿管芽先端部細胞から嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドが誘導された（図１１）。以下の実施例では585A1株のPKD1ノックアウトiPS細胞から各種細胞を誘導した。
　次に、フォルスコリン処理による嚢胞構造への影響を調べた。6週間継代培養した尿管芽先端部細胞からスフェロイドを作製し、スフェロイドを7日間浮遊培養した後、培地にフォルスコリンを添加し、さらに7日間浮遊培養した。その結果、フォルスコリンで処理していない場合と比較して嚢胞が増大した人工集合管オルガノイドが作製された（図１２）。
嚢胞細胞の維持培養
　嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドをAccutase処理によって単一細胞に解離させ、単一細胞をハイドロゲル上で4日間三次元培養することにより、嚢胞細胞スフェロイドを作製した（図１３）。嚢胞細胞スフェロイドを低接着ディッシュ上で7日間浮遊培養することにより、嚢胞オルガノイドが作製された（図１４）。
　次に、200ng/ml FGF1の存在下において、該単一細胞から上記と同様に嚢胞オルガノイドを作製した（図１５）。その結果、200ng/ml FGF1の添加により嚢胞細胞の増殖が促進されることが分かった。
ADPKD患者由来iPS細胞からの嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドの作製
　上述の方法を用いて、ADPKD患者由来iPS細胞（CiRA00007）から尿管芽オルガノイド、尿管芽先端部細胞を経て、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを作製した（図１６）。CiRA00007株は、エクソン41に遺伝子変異があり、polycystin1タンパク質の3818番目のアミノ酸がグリシン（G）からアルギニン（R）に変化するミスセンス変異を有している（図１７）。免疫染色の結果、作製した嚢胞構造はAQP2陽性であった（図１８）。
PKD1 -/- 尿管芽先端部細胞とPKD1 +/+ 尿管芽先端部細胞の遺伝子発現比較
　PKD1遺伝子変異を有さない（PKD1+/+）iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞と、PKD1ノックアウト（PKD1-/-）iPS細胞から分化誘導した尿管芽先端部細胞をRNAシークエンス解析で比較した。尿管芽先端部細胞は6週間培養したものを用いた。
　遺伝子リスト（cilium_GO_0005929、cilium movement_GO_0003341）に含まれる遺伝子の発現パターンをヒートマップで示したところ、PKD1遺伝子変異により繊毛関連遺伝子の発現パターンが変化することが分かった（図１９および２０）。
　PKD1+/+およびPKD1-/-iPS細胞由来の尿管芽先端部細胞におけるRNAシークエンス解析結果からgene set enrichment解析（GSEA）を行った。PKD1遺伝子変異を有する尿管芽先端部細胞で発現が亢進する遺伝子は、細胞周期に関連する遺伝子セット（E2F target, G2M checkpoint）、エネルギー代謝に関連する遺伝子セット（Oxidative phosphorylation）、およびコレステロール代謝に関連する遺伝子セット（Cholesterol homeostasis, Bile acid metabolism）に関するものが多いことが分かった（図２１～２３）。また、PKD1遺伝子変異を有する尿管芽先端部細胞では細胞内コレステロール量が増加する傾向があった（図２４）。
Fluvastatinによる嚢胞形成の抑制
　ADPKDにはスタチンが有効であること知られているため（Xue C. et al., Kidney Dis. 6: 407-413 (2020)）、各種スタチンの中からFluvastatinの効果を検討した。集合管嚢胞モデルの製造において、尿管芽先端部細胞の培養工程に1μM Fluvastatinを追加した場合、嚢胞形成が起こるオルガノイドの割合が有意に低下した（図２５）。有意差の検定にはカイ二乗検定を用いた。
本願の集合管嚢胞モデルに対する種々のADPKDの嚢胞増大抑制に有効な化合物の効果
　下記のプロトコールにより、嚢胞オルガノイドを作製した。
　1. 嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドから注射針などを使って嚢胞構造を切離した。
　2. 切離した嚢胞構造をAccutaseとTrypLEを1:1で混合した剥離液で37℃、3分処理した。
　3. ピペッティングにより単一の嚢胞細胞にまで解離させた。
　4. 単一の嚢胞細胞を10% Afamin/Wnt3a条件培地、200ng/ml R-spondin1、200ng/ml FGF1、10μM Y-27632、10μM Forskolin、2.5μM AVPを含む培地に懸濁し、50%マトリゲル上に播いた。
　5. 2日間培養した後、200ng/ml FGF1、2.5μM AVPを含む培地に交換し、さらに3日間培養した。
　ステップ4および5において、2.5μM AVPを含む培地または2.5μM AVPを含まない培地を用いて作製した嚢胞の形態写真を図２６に示す。2.5μM AVPを含む培地または2.5μM AVPを含まない培地を用いて作製した嚢胞の撮影画像におけるすべての嚢胞の面積をグラフ化した（図２７）。Mann-Whitney U検定により、AVP添加によって嚢胞サイズが有意に増大することが示された。
　ADPKDの既存薬であるTolvaptanの効果を確認した。具体的には、ステップ5に0.1% DMSOまたは5μM Tolvaptanを添加した場合の嚢胞面積の平均を比較した（図２８）。Student’s t検定により、Tolvaptanを加えたことで嚢胞サイズが有意に減少したことが示された（n=3）。
　次に、ADPKDに対して有効であることが知られているVenglustat、Bardoxolone methylおよびTesevatinibの効果を確認した（Cornec-Le Gall E. et al., Lancet. 393: 919-35 (2019)）。具体的には、ステップ5に0.1% DMSO、1μM Venglustat、0.1μM Bardoxolone methyl、または1μM Tesevatinibを添加した場合の嚢胞面積の平均を比較した（図２９）。One-way ANOVAおよびTukey’s t検定により、Bardoxolone methylまたはTesevatinibを加えたことで嚢胞サイズが有意に減少したことが示された。以上から、ADPKDに対して有効であることが知られている化合物の添加により、本願の集合管嚢胞モデルの嚢胞サイズが減少したことが示された。

Claims (22)

  1. 　集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイド。
  2. 　集合管主細胞に特異的なマーカーが、AQP2および／またはAVPR2である、請求項１に記載の人工集合管オルガノイド。
  3. 　集合管主細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を含む細胞集団により形成された嚢胞構造を有するオルガノイドである、集合管嚢胞モデル。
  4. 　集合管主細胞に特異的なマーカーが、AQP2および／またはAVPR2である、請求項３に記載の集合管嚢胞モデル。
  5. 　以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルの製造方法：
    　（１）常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）特異的尿管芽先端部細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK3β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤を含む培地で培養する工程、および
    　（２）工程（１）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、およびグリア細胞株由来神経栄養因子を含む培地で培養して、嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを得る工程。
  6. 　工程（１）において、線維芽細胞増殖因子がFGF1であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤がThiazovivinである、請求項５に記載の方法。
  7. 　工程（２）において、Wntシグナル伝達活性化因子がWnt3aおよび／またはR-spondin 1であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項５または６に記載の方法。
  8. 　工程（２）において、培地がフォルスコリンをさらに含む、請求項５～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　工程（１）の前に、ADPKD特異的尿管芽先端部細胞を維持培養する工程をさらに含む、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞がADPKD患者由来の細胞であるか、またはADPKDの関連する遺伝子変異を有する細胞である、請求項５～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞が多能性幹細胞から誘導されたものである、請求項５～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞が霊長類由来である、請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　ADPKD特異的尿管芽先端部細胞がヒト由来である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　以下の工程を含む、集合管嚢胞モデルを継代培養する方法：
    　（a）嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドを単一の細胞に解離させる工程、
    　（b）該細胞を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養する工程、および
    　（c）工程（b）で得られた培養物を、Wntシグナル伝達活性化因子を含む培地で培養することにより、嚢胞オルガノイドを得る工程。
  16. 　嚢胞構造を有する人工集合管オルガノイドが請求項５～１４のいずれかに記載の方法によって製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
  17. 　工程（b）および（c）において、Wntシグナル伝達活性化因子がWnt3aおよび／またはR-spondin 1である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 　工程（b）および（c）において、培地が線維芽細胞増殖因子をさらに含む、請求項１５～１７のいずれかに記載の方法。
  19. 　工程（b）および（c）において、線維芽細胞増殖因子がFGF1である、請求項１８に記載の方法。
  20. 　以下の工程を含む、ADPKDを治療する物質をスクリーニングする方法：
    　（ｉ）候補物質を、集合管嚢胞モデルに接触させる工程；
    　（ｉｉ）該集合管嚢胞モデルの嚢胞構造が縮小または消失しているか否かを確認する工程。
  21. 　集合管嚢胞モデルが請求項５～１４のいずれかに記載の方法によって製造されたものである、請求項２０に記載の方法。
  22. 　以下の工程を含む、ADPKDを予防する物質をスクリーニングする方法：
    　（ｉ’）請求項５～１４のいずれかに記載の方法を実施して、集合管嚢胞モデルを製造する工程、ここで各工程の少なくとも１つの工程における培地は候補物質をさらに含む；
    　（ｉｉ’）該集合管嚢胞モデルにおいて嚢胞構造が形成されているか否かを確認する工程。
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