WO2022149615A1 - ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 - Google Patents

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法 Download PDF

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inhibitor
medium
cells
tbk1
nephron progenitor
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健二 長船
利和 荒岡
達之 井上
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国立大学法人京都大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells, a method for expanding and culturing nephron progenitor cells, and a method for producing renal organoids.
  • kidney transplantation is one of the radical treatments for chronic kidney disease including end-stage chronic renal failure, but the supply has not caught up with the demand due to a serious shortage of donor organs.
  • the kidney is derived from the intermediate mesoderm, which is a tissue in the early embryonic period. In vertebrates, the intermediate mesoderm forms three kidneys, the anterior kidney, the middle kidney, and the posterior kidney, and in mammals, the posterior kidney becomes the adult kidney.
  • the posterior kidney is a tissue that will differentiate into the nephron of the adult kidney called the mesenchymal and the interstitial space, and a tissue that will differentiate into the lower renal pelvis, ureter, and part of the bladder from the collecting duct of the adult kidney called the ureteral bud. It occurs through the interaction of two tissues.
  • NPCs nephron progenitor cells
  • Non-Patent Document 3 includes BMP7, fibroblast growth factor (FGF) 2, heparin, Y-27632, CHIR99021, leukemia inhibitory factor (LIF), A83-01, LDN193189. It has been reported that mNPC was grown over a year using the containing medium (NPSR medium).
  • FGF fibroblast growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • the present invention is obtained by a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells capable of efficiently expanding and culturing Neflon progenitor cells, a method for expanding and culturing Neflon progenitor cells using the medium, and the above-mentioned expansion culture method. It is an object of the present invention to provide a method for producing a kidney organoid from the obtained Neflon progenitor cells.
  • the present invention includes the following aspects.
  • the medium according to the embodiment of the present invention is a medium for expanding and culturing Neflon progenitor cells, and comprises a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor. Includes at least one selected from the group.
  • the medium according to ⁇ 1> above is at least selected from the group consisting of FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and BMP7. One may be further included.
  • the medium according to the embodiment of the present invention is a medium for expanding and culturing Neflon precursor cells, and comprises a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor. It comprises at least one selected from the group and FGF2, heparin, ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and BMP7.
  • the ALK inhibitor may be A83-01.
  • the BMP inhibitor may be at least one selected from the group consisting of LDN193189, Dorsomorphin, Noggin, and DMH1. good.
  • the medium described in ⁇ 1> above may further contain a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and FGF9.
  • the ROCK inhibitor may be Y-27632.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor may be CHIR99021.
  • the TBK1 inhibitor may be MRT67307 or BX795.
  • the CSF1R inhibitor may be GW2580.
  • the FLT3 inhibitor may be ASP2215.
  • the DYRK1 inhibitor may be ID-8.
  • the STAT6 inhibitor may be AS1517499.
  • the method for producing a kidney organoid according to an embodiment of the present invention includes a step of expanding and culturing Neflon progenitor cells by the method of expanding and culturing Neflon progenitor cells according to ⁇ 14> above, and the expanded culture of Neflon. It comprises the steps of differentiating progenitor cells into renal organoids.
  • the present invention was obtained by a medium for expanding and culturing Neflon precursor cells capable of efficiently expanding and culturing Neflon precursor cells, a method for expanding and culturing Neflon precursor cells using the medium, and the above-mentioned expansion culture method. It has the effect of providing a method for producing renal organoids from Neflon precursor cells.
  • the number of cells of mNPC cultured in mNPSR medium (medium containing CHIR99021, Y-27632, FGF-2, LIF, BMP7, heparin, LDN193189, A83-01) with a final concentration of 0 to 1000 nM MRT67307 is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which BX795 having a final concentration of 0 to 16 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which GW2580 with a final concentration of 0 to 1000 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which ASP2215 having a final concentration of 0 to 3.2 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which ID-8 having a final concentration of 0 to 30,000 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells of mNPC cultured in the medium in which AS1517499 with a final concentration of 0 to 200 nM was added to the mNPSR medium is shown.
  • the number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO (0.1%) or MRT67307 having a final concentration of 30 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • MRT67307 was dissolved in DMSO and added to mNPSR medium.
  • the cumulative number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO (0.1%) or MRT67307 with a final concentration of 30 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • MRT67307 was dissolved in DMSO and added to mNPSR medium.
  • the number of cells in each passage number of mNPC subcultured in a medium in which DMSO (0.1%) or BX795 having a final concentration of 4 nM was added to mNPSR medium is shown.
  • BX795 was dissolved in DMSO and added to mNPSR medium.
  • FIG. 3 is a fluorescence microscope image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis of CDH1 (CADHERIN1; distal tubule).
  • PODXL PODOCALLYXIN; glomerulus
  • LTL Litus Tetragonolobus Lectin; near
  • FIG. 3 is a fluorescence microscope image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis of CDH1 (CADHERIN1; distal tubule).
  • FIG. 3 is a fluorescence microscopic image showing the results of immunostaining analysis of SIX2 in embryos taken out from mouse embryos in an FBS medium supplemented with DMSO (0.1%) or MRT67307 at a final concentration of 100 nM.
  • the number of cells in each passage number of the 4A6 strain-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%) or MRT67307 at a final concentration of 30 nM to hNPSR medium is shown.
  • MRT67307 was dissolved in DMSO and added to hNPSR medium.
  • MRT67307 The cumulative number of cells in each passage number of the 4A6 strain-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%) or MRT67307 having a final concentration of 30 nM in hNPSR medium is shown. MRT67307 was dissolved in DMSO and added to hNPSR medium. Number of cells in each passage number of ASe16 strain (disease-specific iPS cell line derived from Allport syndrome patient) -derived hiPSC-NPC subcultured in hNPSR medium supplemented with DMSO (0.1%) or MRT67307 with a final concentration of 30 nM. Is shown. MRT67307 was dissolved in DMSO and added to hNPSR medium.
  • the cumulative number of cells in each passage number of the ASe16-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%) or MRT67307 at a final concentration of 30 nM in hNPSR medium is shown. MRT67307 was dissolved in DMSO and added to hNPSR medium.
  • PODXL PODOCALLYXIN; glomerulus
  • LTL Litus Tetragonolobus Lectin; proximal tubule
  • CADHERIN1; distal tubule is a fluorescent microscopic image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis (Scale bar; 100 ⁇ m).
  • the number of cells in each passage number of c-MET (+)-hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%) or AS1517499 having a final concentration of 100 nM in CFY medium is shown.
  • AS1517499 was dissolved in DMSO and added to CFY medium.
  • the cumulative number of cells in each passage of c-MET (+)-hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%) or AS1517499 with a final concentration of 100 nM in CFY medium is shown.
  • AS1517499 was dissolved in DMSO and added to CFY medium.
  • PODXL PODOCALLYXIN; glomerulus
  • LTD Litus Tetragonolobus Lectin; It is a fluorescence microscope image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis of CDH1 (CADHERIN1; distal tubule) (Square bar; 100 ⁇ m).
  • CADHERIN1 distal tubule
  • Square bar 100 ⁇ m.
  • the number of cells in each passage number of hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO (0.1%), MRT67307 with a final concentration of 30 nM, or TG101348 with a final concentration of 3 nM in CFY medium is shown.
  • MRT67307 and TG101348 were dissolved in DMSO and added to CFY medium.
  • PODXL PODOCALLYXIN; glomerulus
  • LTL Litus Tetragonolobus Lectin; proximal tubule
  • CADHERIN1; distal tubule is a fluorescent microscopic image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis (Scale bar; 100 ⁇ m).
  • PODXL PODOCALLYXIN; glomerulus
  • LTL Litus Terragonolobus Lectin; proximal tubule
  • CADHERIN1; distal tubule is a fluorescent microscopic image showing the results of lectin staining and immunostaining analysis (Scale bar; 100 ⁇ m).
  • the first aspect of the present invention is a medium for expanding and culturing nephron progenitor cells.
  • the medium of this embodiment comprises at least one selected from the group consisting of a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor.
  • the medium of this embodiment is FGF2, heparin, in addition to at least one selected from the group consisting of a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor.
  • ROCK inhibitor ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor and at least one selected from the group consisting of BMP7.
  • the medium of this embodiment is FGF2, heparin, in addition to at least one selected from the group consisting of a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor.
  • ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor and BMP7 ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor and BMP7.
  • NPCs are cells that can differentiate into organ structures such as glomerular and tubular structures of the kidney in vitro. The ability of nephron progenitor cells to differentiate into organ structures is described, for example, in Osafune K, et al. (2006), it can be evaluated by the method described in Development 133: 151-61. SIX2 is known as a characteristic factor for maintaining the state as a nephron progenitor cell (Cell Stem Cell 3: 169-181 (2008)), and as an example of a nephron progenitor cell cultured by the method of this embodiment. , SIX2-positive nephron progenitor cells.
  • pluripotent stem cells having a reporter gene for example, tdTomato
  • a reporter gene for example, tdTomato
  • SIX2 promoter for example, OSR1-GFP / SIX2-tdTomato reporter human iPS cells described in Examples below
  • SIX2-positive Neflon precursor cells can be isolated by a method known in the art (for example, a method using a cell sorter) using the expression of SIX2-positive as an index. It is also possible to confirm the expression of SIX2 in nephron progenitor cells by a method for analyzing gene expression such as quantitative RT-PCR (NatCommun 4,1367, (2013)).
  • SIX2-positive nephron progenitor cells include cells expressing the SIX2 protein and cells expressing the protein encoded by the gene under the control of the SIX2 promoter.
  • the human SIX2 gene (NCBI Gene ID: 10736) is a gene having a nucleotide sequence registered at NCBI accession number: NM_016932.5
  • the mouse SIX2 gene (NCBI Gene ID: 20472) is the NCBI accession number. : Examples include, but are not limited to, genes having a nucleotide sequence registered in NM_011380.2.
  • the nephron progenitor cells cultured in the medium of this embodiment are preferably OSR1 positive and HOX11, WT1, SIX2 and SALL1 positive.
  • Neflon progenitor cells may be those isolated from the posterior renal mesenchyme of a living body or those induced to differentiate from pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.).
  • Induction of differentiation of nephron progenitor cells from pluripotent stem cells can be performed by a known method.
  • Examples of the method for inducing nephron progenitor cells from pluripotent stem cells include the methods described in International Publication No. 2014/200115, International Publication No. 2017/0436666, International Publication No. 2018/216743 and the like.
  • Neflon progenitor cells Isolation of Neflon progenitor cells from a cell population collected from the posterior mesenchyme or a cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells is described, for example, in OSR1, HOX11, WT1, SIX2, which are markers of the Neflon progenitor cells described above.
  • OSR1, HOX11, WT1, SIX2 markers of the Neflon progenitor cells described above.
  • the expression of SALL1 can be used as an index.
  • MET or AGTR2 can be used as an index (International Publication No. 2020/022261).
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured in the medium of this embodiment may be provided as a cell population containing other cell types, or may be provided as a cell population of purified nephron progenitor cells.
  • the ratio of the number of nephron progenitor cells is 30%, 40% or more, 50% or more, 60% or more with respect to the total number of cells (100%). , 70% or more, 80% or more, or 90% or more is preferable.
  • “Expanded culture” means a culture in which nephron progenitor cells are proliferated while maintaining the properties of the nephron progenitor cells. That is, the expanded-cultured nephron progenitor cells can be differentiated into organ structures such as glomerular-like structure and tubular structure of the kidney in vitro. In the medium of this embodiment, the nephron progenitor cells can be expanded and cultured while maintaining the properties of the nephron progenitor cells even after repeated passages.
  • the medium of this embodiment is a medium obtained by adding at least one selected from the group consisting of a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor to a basal medium used for animal culture. There may be. In addition, at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor, and FGF2, heparin, and ROCK inhibitor are added to the basal medium used for animal culture. , GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor and at least one selected from the group consisting of BMP7 may be added.
  • LIF leukemia inhibitor
  • BMP inhibitor at least one selected from the group consisting of BMP7
  • At least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor, and FGF2, heparin, and ROCK inhibitor are added to the basal medium used for animal culture.
  • GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor and BMP7 may be added.
  • the basal medium is not particularly limited, and those usually used for animal culture can be used without particular limitation.
  • Examples of the basal medium include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Medium Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulvecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12), and Ham's F12 (F12).
  • Examples include, but are not limited to, a medium, Fisher's medium, and a mixed medium thereof.
  • the medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferase, KnockOut Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, for example.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acids insulin, collagen precursors
  • Trace elements 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol and the like may contain one or more serum substitutes.
  • the basal medium may be, for example, a mixed medium of DMEM / F12 medium (for example, a mixed medium in which DMEM: F12 is mixed at a ratio of 1: 1) to which amino acids, non-essential amino acids, serum substitutes and the like are added. ..
  • the medium of this embodiment contains at least one selected from the group consisting of a TBK1 inhibitor, a CSF1R inhibitor, a FLT3 inhibitor, a DYRK1 inhibitor, and a STAT6 inhibitor.
  • the TBK1 inhibitor contained in the medium of this embodiment is a substance that inhibits the activity of TANK binding kinase 1 (TBK1).
  • the TBK1 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of TANK binding kinase 1.
  • Examples of the TBK1 inhibitor include MRT67307 (CAS No. 1190378-57-4), BX795 (CAS No. 702675-74-9), TBK1 / IKK ⁇ -IN-1 (CAS No. 2058264-32-5), and TBK1 / IKK ⁇ .
  • -IN-2 CAS No. 1292310-49-6
  • TBK1 / IKK ⁇ -IN-5 CAS No.
  • MRT67307 and BX795 are preferable as TBK1 inhibitors.
  • the TBK1 inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • the TBK1 inhibitor is not limited to the small molecule compound as described above, and may be an antisense nucleic acid for TBK1, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof. ..
  • the concentration of the TBK1 inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected depending on the type of the TBK1 inhibitor.
  • the TBK1 inhibitor is preferably used at a concentration near, for example, IC50.
  • the TBK1 inhibitor can be used, for example, at a concentration of 0.5 nM or higher, 1 nM or higher, 2 nM or higher, 3 nM or higher, 4 nM or higher, 5 nM or higher, 6 nM or higher, 7 nM or higher, 8 nM or higher, 9 nM or higher, or 10 nM or higher.
  • Examples of the upper limit of the concentration of the TBK1 inhibitor include 1000 nM or less, 500 nM or less, 200 nM or less, 100 nM or less, 50 nM or less, 35 nM or less, and the like.
  • the concentration of MRT67307 in the medium may be, for example, 0.5 to 1000 nM, 5 to 500 nM, 5 to 200 nM, 5 to 100 nM, 5 to 50 nM, 10 to 35 nM, or 20 to 35 nM.
  • the concentration of BX795 in the medium may be 0.5 to 16 nM, 0.5 to 8 nM, 1 to 8 nM, or 2 to 8 nM.
  • the CSF1R inhibitor included in this embodiment is a substance that inhibits the activity of the colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R).
  • the CSF1R inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the colony stimulating factor 1 receptor.
  • Examples of the CSF1R inhibitor include GW2580 (CAS No. 870843-87-7), CSF1R-IN-1 (CAS No. 2095884-04-8), AZD7507 (CAS No. 1041852-85-0), and PRN1371 (CAS No. 1802929). 433-6), cFMS Receiver Inhibitor II (CAS No. 959860-85-6), PLX-3397 hydride (CAS No. 2040295-03-0), Ki20227 (CAS No.
  • GW2580 is preferable as the CSF1R inhibitor.
  • the CSF1R inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the CSF1R inhibitor is not limited to the small molecule compound as described above, and may be an antisense nucleic acid for CSF1R, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof. ..
  • the concentration of the CSF1R inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected depending on the type of the CSF1R inhibitor.
  • the CSF1R inhibitor is preferably used at a concentration near, for example, IC50.
  • the CSF1R inhibitor is, for example, 0.5 nM or more, 1 nM or more, 2 nM or more, 3 nM or more, 4 nM or more, 5 nM or more, 6 nM or more, 7 nM or more, 7.5 nM or more, 8 nM or more, 9 nM or more, 10 nM or more, 50 nM or more, Alternatively, it can be used at a concentration of 100 nM or more.
  • Examples of the upper limit of the concentration of the CSF1R inhibitor include 5000 nM or less, 3000 nM or less, 2000 nM or less, 1000 nM or less, and the like.
  • the concentrations of GW2580 in the medium are, for example, 0.5-5000 nM, 7.5-3000 nM, 15-2000 nM, 30-1000 nM, 60-1000 nM, 120-1000 nM, 240-1000 nM, Alternatively, 250 to 1000 nM and the like can be mentioned.
  • the FLT3 inhibitor included in this embodiment is a substance that inhibits the activity of FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3).
  • the FLT3 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of FMS-like tyrosine kinase 3.
  • Examples of FLT3 inhibitors include ASP2215 (CAS No. 1254053-43-4), SKLB4771 (CAS No. 1370256-78-2), CCT241736 (CAS No. 1402709-93-6), and BPR1K871 (CAS No. 2443767-35-7). ), But not limited to this. Among them, ASP2215 (Gilteritinib) is preferable as the FLT3 inhibitor.
  • the FLT3 inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • the FLT3 inhibitor is not limited to the small molecule compound as described above, and may be an antisense nucleic acid for FLT3, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof. ..
  • the concentration of the FLT3 inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected depending on the type of the FLT3 inhibitor.
  • the FLT3 inhibitor is preferably used at a concentration near, for example, IC50.
  • the FLT3 inhibitor is, for example, 0.1 nM or more, 0.2 nM or more, 0.3 nM or more, 0.4 nM or more, 0.5 nM or more, 0.6 nM or more, 0.7 nM or more, 0.8 nM or more, 0.9M. As mentioned above, it can be used at a concentration of 1.0 nM or more, or 1.5 nM or more.
  • Examples of the upper limit of the concentration of the FLT3 inhibitor include 1000 nM or less, 500 nM or less, 200 nM or less, 100 nM or less, 50 nM or less, 35 nM or less, 20 nM or less, 10 nM or less, or 5 nM or less.
  • the concentrations of ASP2215 in the medium are, for example, 0.1-10 nM, 0.2-10 nM, 0.4-10 nM, 0.8-10 nM, 0.8-5.0 nM. Alternatively, 0.8 to 3.2 nM and the like can be mentioned.
  • the DYRK1 inhibitor contained in the medium of this embodiment is a substance that inhibits the activity of bispecific tyrosine phosphorylation-regulating kinase 1 (DYRK1).
  • the DYRK1 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of bispecific tyrosine phosphorylation-regulating kinase 1.
  • the DYRK1 inhibitor is preferably a substance (DYRK1A inhibitor) that inhibits the activity of the bispecific tyrosine phosphorylation-regulating kinase 1A (DYRK1A).
  • Examples of the DYRK1 inhibitor include ID-8 (CAS No. 147591-46-6), INDY (CAS No.
  • ID-8 is preferable as the DYRK1 inhibitor.
  • One type of DYRK1 inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • DYRK1 inhibitors are not limited to small molecule compounds such as those described above, but are antisense nucleic acids against DYRK1 (DYRK1A, DYRK1B, etc.), RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, and expression vectors thereof. And so on.
  • the concentration of the DYRK1 inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected depending on the type of the DYRK1 inhibitor.
  • the DYRK1 inhibitor is preferably used at a concentration near, for example, IC50.
  • the DYRK1 inhibitor can be used at a concentration of, for example, 0.5 nM or more, 1 nM or more, 2 nM or more, 3 nM or more, 4 nM or more, 5 nM or more, 6 nM or more, 7 nM or more, 8 nM or more, 9 nM or more, or 10 nM or more. ..
  • Examples of the upper limit of the concentration of the DYRK1 inhibitor include 30,000 nM or less, 10,000 nM or less, 1000 nM or less, 500 nM or less, and the like.
  • the concentrations of ID-8 in the medium are, for example, 0.5-30000 nM, 0.5-10000 nM, 0.5-3000 nM, 0.5-1000 nM, 100-1000 nM, Alternatively, 250 to 1000 nM and the like can be mentioned.
  • the STAT6 inhibitor contained in the medium of this embodiment is a substance that inhibits the activity of the signal transduction transcription factor 6 (STAT6).
  • STAT6 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of the signal transduction transcription factor 6.
  • Examples of the STAT6 inhibitor include, but are not limited to, AS151499 (CAS No. 919486-40-1).
  • the STAT6 inhibitor is preferably AS1517499.
  • One type of STAT6 inhibitor may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the STAT6 inhibitor is not limited to the small molecule compound as described above, and may be an antisense nucleic acid for STAT6, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof. ..
  • the concentration of the STAT6 inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected depending on the type of the STAT6 inhibitor.
  • the STAT6 inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the STAT6 inhibitor is, for example, at a concentration of 1 nM or higher, 2 nM or higher, 3 nM or higher, 4 nM or higher, 5 nM or higher, 6.25 nM or higher, 7 nM or higher, 8 nM or higher, 9 nM or higher, 10 nM or higher, 12.5 nM or higher, or 25 nM or higher. Can be used.
  • the concentration of AS1517499 in the medium may be, for example, 1 to 1000 nM, 6.25 to 1000 nM, 12.5 to 1000 nM, 25 to 1000 nM, 25 to 500 nM, or 25 to 200 nM. ..
  • the medium of this embodiment preferably contains FGF2.
  • FGF2 Fibroblast Growth Factor 2
  • bFGF basic FGF
  • the organism from which FGF2 is derived is not particularly limited.
  • FGF2 for example, human FGF2 can be used.
  • human FGF2 NCBI Gene ID: 2247) include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001348594.1.
  • FGF2 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • Commercially available FGF2 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of FGF2 in the medium is, for example, 1 to 1000 ng / mL, preferably 10 to 500 ng / mL, more preferably 20 to 400 ng / mL, still more preferably 50 to 350 ng / mL.
  • Heparin is preferably in the form of a salt.
  • heparin salts include salts with alkali metals such as lithium, sodium and potassium; salts with alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium; salts with metals such as aluminum, zinc, copper and iron; Examples include ammonium salts; salts with organic bases; and salts with amino acids.
  • heparin is preferably an alkali metal salt, more preferably a sodium salt.
  • the concentration of heparin in the medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ g / mL, preferably 0.05 to 50 ⁇ g / mL, and more preferably 0.1 to 10 ⁇ g / mL.
  • the medium of this embodiment preferably contains a ROCK inhibitor.
  • a ROCK inhibitor is a substance that inhibits the function of Rho-kinase (ROCK).
  • Examples of the ROCK inhibitor include Y-27632 (see, eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000)).
  • Fasudil / HA1077 eg, Uenta et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • H-1152 eg, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)
  • Wf-536 see, eg, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52 (4): 319-324 (2003)
  • antisense nucleic acids for ROCK RNA interference-inducing nucleic acids
  • RNA interference-inducing nucleic acids eg, siRNA
  • Dominant negative variants and their expression vectors.
  • other known low molecular weight compounds can also be used as the ROCK inhibitor (for example, US Patent Application Publication No.
  • the ROCK inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • Preferred ROCK inhibitors include Y-27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of Y-27632 in the medium is, for example, 0.1-100 ⁇ M, preferably 1-75 ⁇ M, more preferably 5-50 ⁇ M.
  • the medium of this embodiment preferably contains a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the function of GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 ⁇ , for example, kinase activity (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitor examples include BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoinsylbin 3'-oxym), which is an indylbin derivative, and SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl)-), which is a maleimide derivative.
  • GSK3 ⁇ Peptide Inhibitor Myr-N-GKEAPAPPQSpP-NH2
  • CHIR99021 (6- [2- [2- [4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin) -2-Ilamino] ethylamino] pyridine-3-carbonitrile), and derivatives thereof and the like.
  • These compounds can be obtained from, for example, Stemgent, Calbiochem, Biomol, etc., or may be prepared by themselves.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor may be an antisense nucleic acid against GSK3 ⁇ , an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, and an expression vector thereof.
  • GSK3 ⁇ inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the GSK3 ⁇ inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of CHIR99021 in the medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 3 ⁇ M, and particularly preferably 0.5 to 3 ⁇ M. It is 0.5 to 1.5 ⁇ M.
  • the medium of this embodiment preferably contains a leukemia inhibitor (LIF).
  • LIF leukemia inhibitor
  • the inclusion of LIF in addition to at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor results in better proliferation of nephron progenitor cells. ..
  • the organism from which LIF is derived is not particularly limited. Examples of the LIF include humans (Japanese Patent Publication No. 1-502985), mice (Japanese Patent Publication No. 1-502985), sheep (Japanese Patent Publication No. 4-502554), and pigs (Japanese Patent Publication No. 4-502554). No.), cows (Japanese Patent Publication No.
  • human or mouse LIF is preferred.
  • human LIF (NCBI Gene ID: 3976) include proteins having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_00124464.1 or NP_002300.1.
  • mouse LIF (NCBI Gene ID: 16878) include proteins having the amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001034626.1 or NP_032527.1.
  • the LIF can be appropriately selected depending on the organism from which the nephron progenitor cells are derived. For example, when the nephron progenitor cells are derived from mice, it is preferable to use mouse LIF.
  • LIF may be a fragment and a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • LIF a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of LIF in the medium is, for example, 1 to 1000 ng / mL, preferably 10 to 500 ng / mL, and more preferably 50 to 250 ng / mL.
  • the concentration of LIF in the medium is, for example, 10 to 5000 units / mL, preferably 100 to 3000 units / mL, and more preferably 500 to 2000 units / mL.
  • the medium of this embodiment preferably contains an ALK inhibitor.
  • An ALK inhibitor in addition to at least one selected from the group consisting of at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitors, CSF1R inhibitors, FLT3 inhibitors, DYRK1 inhibitors, and STAT6 inhibitors. Therefore, the proliferation of Neflon progenitor cells becomes better.
  • ALK inhibitors are substances that inhibit the function of the ALK (Activin receptor-Like Kinase) family. Examples of the ALK inhibitor include a substance that inhibits the binding of TGF ⁇ to the ALK family, a substance that inhibits the phosphorylation of SMAD by the ALK family, and the like.
  • Examples of the ALK inhibitor include inhibitors of ALK4, ALK5 or ALK7.
  • Examples of the ALK inhibitor include Lefty-1 (as NCBI accession numbers, mouse: NP_034224.1 and human: NP_066277.1 are exemplified), SB431542, SB202190 (hereinafter, RK Lindemann et al., Mol.
  • ALK inhibitor may be an antisense nucleic acid for the ALK family, an RNA interference-in
  • the ALK inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • Preferred ALK inhibitors include A83-01.
  • the concentration of the ALK inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ALK inhibitor.
  • the ALK inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of A83-01 in the medium is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 500 nM, more preferably 1 to 100 nM, and particularly preferably. Is 10 to 80 nM.
  • the medium of this embodiment contains a BMP inhibitor.
  • BMP inhibitor proliferation is better with BMP inhibitor in addition to at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor.
  • a BMP inhibitor is a substance that inhibits BMP (Bone morphogenetic Protein) signal transduction.
  • the BMP inhibitor may be, for example, a substance that inhibits the kinase activity of ALK2 or ALK3, which is a receptor for BMP.
  • BMP inhibitor examples include proteinin inhibitors such as Chordin, Noggin, and Follistatin; Dorsomorphin (6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo. [1,5-a] pyrimidine) (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P. B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33. -41; J. Hao et al.
  • proteinin inhibitors such as Chordin, Noggin, and Follistatin
  • Dorsomorphin 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo. [1,5-a] pyrimidine
  • the BMP inhibitor may be an antisense nucleic acid for BMP, an RNA interference-inducing nucleic acid (eg, siRNA), a dominant negative mutant, an expression vector thereof, or the like.
  • the BMP inhibitor one type may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Preferred BMP inhibitors include LDN193189, Dorsomorphin, Noggin, and DMH1, with LDN193189 being more preferred.
  • the concentration of the BMP inhibitor in the medium can be appropriately selected depending on the type of the ALK inhibitor.
  • the BMP inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the concentration of LDN193189 in the medium is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 500 nM, more preferably 0.5 to 100 nM, and particularly preferably 0.5 to 100 nM. It is 1 to 50 nM.
  • the medium of this embodiment preferably contains BMP7.
  • BMP7 in addition to at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitors, CSF1R inhibitors, FLT3 inhibitors, DYRK1 inhibitors, and STAT6 inhibitors results in better proliferation of nephron progenitor cells. ..
  • the organism from which BMP7 is derived is not particularly limited.
  • a human BMP7 can be used as the BMP7.
  • Examples of human BMP7 include proteins having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_001710.1.
  • BMP7 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • BMP7 a commercially available product may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of BMP7 in the medium is, for example, 0.1 to 500 ng / mL, preferably 1 to 300 ng / mL, and more preferably 10 to 100 ng / mL.
  • the medium of this embodiment may contain Fibroblast Growth Factor (FGF) 9.
  • FGF Fibroblast Growth Factor
  • the organism from which FGF9 is derived is not particularly limited.
  • FGF9 for example, human FGF9 can be used.
  • human FGF9 NCBI Gene ID: 22544
  • FGF9 may be a fragment or a functional variant thereof as long as it has an activity of promoting the proliferation of nephron progenitor cells.
  • Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of FGF9 in the medium is, for example, 1 to 800 ng / ml, preferably 5 to 500 ng / ml, more preferably 10 to 400 ng / ml, still more preferably 100 to 300 ng / ml.
  • the medium of this embodiment can contain components other than the above as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • components other than the above include JAK inhibitors.
  • the medium of this embodiment may contain a JAK inhibitor.
  • a JAK inhibitor is a substance that inhibits the activity of one or more enzymes of the Janus kinase family (eg, JAK1, JAK2, JAK3, TYK2). JAK inhibitors inhibit signal transduction of the JAK-STAT system by inhibiting the enzymatic activity of the Janus kinase family.
  • the medium contains a JAK inhibitor in addition to the GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF9, the proliferation of nephron progenitor cells is further promoted.
  • the JAK inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of enzymes of the Janus kinase family.
  • the JAK inhibitor is preferably one that inhibits the enzyme activity of at least one selected from the group consisting of JAK1, JAK2, and JAK3, and more preferably one that inhibits the enzyme activity of JAK2 (JAK2 inhibitor).
  • the JAK3 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK3.
  • Examples of the JAK3 inhibitor include TCS21311 (CAS number 1260181-14-3), WHI-P154 (CAS 211555-04-3), PF-06651600 (CAS number 1792180-81-4), FM-381 (CAS number). 2226521-65-7), CP690550 (CAS No.
  • JAK3 INHIBITOR IV (CAS number 58753-54-1), ZM449829 (CAS number 4452-06-6), AZD1480 (CAS number 935666-88-9) ), Selective JAK3 inhibitor 1 (CAS No. 14432235-95-7), and derivatives thereof, but are not limited thereto.
  • TCS21311 is preferable as the JAK3 inhibitor.
  • the JAK2 inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit the activity of JAK2.
  • Examples of the JAK2 inhibitor include NVP-BSK805 2HCl (CAS No. 1949219-79-0), TG101209 (CAS No. 936091-14-4), TG101348 (CAS No. 936091-26-8), 1, 2, 3, and so on. 4,5,6-hexabromocyclohexane (CAS No. 1837-91-8), CEP-337779 (CAS No. 1257704-57-6), NSC33994 (CAS No. 82058-16-0), and derivatives thereof.
  • TG101348 is preferable as the JAK2 inhibitor.
  • the JAK inhibitor may be a JAK2 / 3 inhibitor.
  • a JAK2 / 3 inhibitor is an inhibitor that inhibits JAK2 and JAK3.
  • Examples of the JAK2 / 3 inhibitor include AG490 (CAS No. 133550-30-8), AT9283 (CAS No. 896466-04-9), LY3009104 (CAS No. 1187594-09-7), and derivatives thereof. However, but not limited to these.
  • the JAK inhibitor may be a JAK1 / 2 inhibitor.
  • JAK1 / 2 inhibitors are inhibitors that inhibit JAK1 and JAK2.
  • Examples of JAK1 / 2 inhibitors include CYT387 (CAS No. 1056634-68-4), S-Ruxolitinib (INCB018424) (CAS No. 941685-37-6), and LY2784544 (CAS No. 1229236-86-5), and Examples thereof include, but are not limited to, these derivatives.
  • JAK inhibitors are not limited to low molecular weight compounds as described above, but are antisense nucleic acids for the Janus kinase family (JAK1, JAK2, JAK3, TYK2), RNA interference-inducing nucleic acids (eg, siRNA), dominant negative variants, etc. And their expression vectors and the like.
  • the JAK inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • a JAK2 inhibitor is preferable, and TG101348 is more preferable.
  • the concentration of the JAK inhibitor in the medium of this embodiment can be appropriately selected according to the type of the JAK inhibitor.
  • the JAK inhibitor is preferably used, for example, at a concentration near the IC50.
  • the JAK inhibitor can be used, for example, at a concentration of 0.01 nM or more, 0.05 nM or more, 0.1 nM or more, 0.5 nM or more, or 1 nM or more.
  • Examples of the upper limit of the concentration of the JAK inhibitor include 100 nM or less, 50 nM or less, 30 nM or less, 20 nM or less, 10 nM or less, 5 nM or less, and the like.
  • the concentration of TG101348 in the medium may be, for example, 0.5 to 50 nM, 1 to 30 nM, 1 to 20 nM, 1 to 10 nM, or 1 to 5 nM.
  • the medium of this embodiment comprises at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor, and JAK inhibitor, FGF2, heparin. , ROCK inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor, leukemia inhibitor (LIF), ALK inhibitor, BMP inhibitor, and BMP7.
  • examples include TBK1 inhibitors, FGF2, heparin, ROCK inhibitors, GSK3 ⁇ inhibitors, leukemia inhibitors (LIFs), ALK inhibitors, BMP inhibitors, and BMP7.
  • the medium of this embodiment can contain MRT67307, FGF2, heparin, Y-27632, LIF, CHIR99021, LDN193189, and A83-01.
  • the medium of this embodiment is a GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK, in addition to at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor. Includes inhibitors and FGF9.
  • the medium of this embodiment may further contain a JAK inhibitor.
  • the medium of this embodiment can contain CHIR99021, Y-27632, and FGF9.
  • the medium of this embodiment maintained the differentiation potential of Neflon progenitor cells by containing at least one selected from the group consisting of TBK1 inhibitor, CSF1R inhibitor, FLT3 inhibitor, DYRK1 inhibitor, and STAT6 inhibitor. As it is, Neflon progenitor cells can be satisfactorily proliferated.
  • a second aspect of the present invention is a method for expanding and culturing nephron progenitor cells using the medium of the first aspect.
  • Nephron progenitor cells can be cultured under the culture conditions normally used for culturing animal cells.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as the nephron progenitor cells can proliferate, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • Nephron progenitor cells can usually be cultured in an atmosphere of CO 2 -containing air.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. Specific examples of the CO 2 concentration include about 5%.
  • the culture period is not particularly limited and can be any period.
  • by using the medium of the first aspect it is possible to culture for a long period of time while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • the culture of the nephron progenitor cells can be continued while maintaining the properties of the nephron progenitor cells.
  • Subculture can be performed by collecting a cell mass of nephron progenitor cells from the culture medium and seeding the cells in a new medium.
  • a cell dispersion containing an enzyme such as protease, collagenase, and DNase may be used to disperse the cell mass and then seeded in a new medium.
  • the interval between passages is not particularly limited, but may be, for example, about 2 to 10 days, or about 3 to 7 days.
  • the nephron progenitor cells are cultured using the medium of the first aspect, so that the nephron progenitor cells can be efficiently proliferated.
  • the nephron progenitor cells expanded and cultured by the method of this embodiment can be administered to a subject having renal disease and used for treating renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases. It can also be used for the production of renal organoids described below.
  • a third aspect of the present invention is a method for producing a renal organoid.
  • the method for producing a renal organoid of this embodiment includes a step of expanding and culturing nephron progenitor cells (expansion culture step) and a step of differentiating the expanded and cultured nephron precursor cells into renal organoids by the method of the second aspect (differentiation). Step) and.
  • the expansion culture step is performed by the method of the second aspect. By this step, nephron progenitor cells can be efficiently grown to a desired number.
  • nephron progenitor cells into renal organoids can be performed by known methods. For example, the methods reported in Nature, 526, 564-568 (2015) can be used.
  • the cell mass of the nephron progenitor cells obtained in the expansion culture step may be co-cultured with feeder cells such as 3T3-Wnt4 cells, mouse fetal spinal cells, or mouse fetal kidney cells.
  • the cell mass of Neflon progenitor cells is cultured in semi-gastric culture (preferably gas-liquid phase culture; see Nature, 526,564-568 (2015)) using a basal medium containing a GSK3 ⁇ inhibitor. You may.
  • the medium used in the semi-gastric culture may contain FGF9, FGF2, etc. in addition to the GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the basal medium, GSK3 ⁇ inhibitor, and FGF2 include the same as above.
  • a preferred basal medium is KSR.
  • Preferred GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR99021.
  • Preferred FGF2 includes human FGF2.
  • Preferred FGF9 includes human FGF9.
  • human FGF9 include a protein having an amino acid sequence of NCBI accession number: NP_002001.1.
  • FGF9 includes fragments and functional variants thereof as long as it has the activity of inducing differentiation into renal organoids. Commercially available FGF9 may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the culture conditions in the differentiation step the culture conditions usually used for culturing animal cells can be used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it can induce differentiation into renal organoids, but is usually 25 to 40 ° C, preferably 30 to 40 ° C. Specific examples of the culture temperature include about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can usually be about 0.3-5%, preferably about 2-5%. Specific examples of the CO 2 concentration include about 5%.
  • the renal organoid obtained by the production method of this embodiment can be administered to a subject having a renal disease and used for treating the renal disease. It can also be used as a pharmaceutical composition for treating or preventing renal diseases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition comprising nephron progenitor cells obtained by the method of the second aspect or renal organoids obtained by the production method of the third aspect.
  • the present invention also provides a renal disease therapeutic agent comprising said nephron progenitor cells or said renal organoids.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing renal disease, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the nephron precursor cells or the renal organoid to a subject having renal disease or a subject at risk of renal disease. ..
  • a method of administering the Neflon precursor cell to a subject requiring treatment or prevention of renal disease for example, a method of sheeting the Neflon precursor cell and attaching it to the target kidney; the Neflon precursor cell in physiological saline.
  • the transplantation site is not particularly limited as long as it is within the kidney, but is preferably under the renal capsule.
  • Examples of the method for administering the renal organoid to a subject in need of treatment or prevention of renal disease include a method of transplanting into the body of the subject (for example, intraperitoneally).
  • the renal disease to be treated or prevented is not particularly limited, and examples thereof include acute renal disorder, chronic renal failure, and chronic kidney disease that does not lead to chronic renal failure.
  • the number of cells of the nephron progenitor cell to be transplanted or the size of the renal organoid is not particularly limited as long as it can be engrafted after transplantation, and is appropriately adjusted according to the size of the diseased site, the body, age, sex, etc. of the administration target. be able to.
  • Example 1 [Materials and methods] ⁇ Animal experiment> All animal experiments were conducted with the approval of the Animal Experiment Committee of Kyoto University. B6; 129-Six2 tm3 (EGFP / cr / ERT2) Amc / J mice are available from Jackson Laboratory Inc. Purchased from (A. Kobayashi, et al., Cell Stem Cell. 3 (2008) 169-181.). B6. Alport syndrome model mouse. Col4a5 tm1Yseg / J mice are available from Jackson Laboratory Inc. Purchased from (MN Rheaut, et al., JAm Soc Nephrol. 15 (2004) 1466-1474.).
  • the Pkd1 ⁇ / ⁇ (del2-6) mouse which is an ADPKD model mouse, was provided by Fujita Medical University (S Muto, et al., Hum Mol Genet. 11 (2002) 1731-1742.). The animals were bred under specific pathogen-free (SPF) conditions at the experimental animal facility of the Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University. Mice were free-fed with food and water.
  • SPF pathogen-free
  • ⁇ Cell culture> Experiments using human iPS cells (hiPSC) were approved by the Institutional Review Board of the graduate School of Medicine, Kyoto University, and informed consent was obtained from the provider of hiPSC according to the Institutional Review Board.
  • the hiPSC was maintained in a feeder-free culture using Stem Fit AK02N medium (Takara Bio Inc.) on a cell culture plate coated with Synthemax (Corning). Cells were passaged every 5 days using 0.5 mM EDTA / PBS (Thermo Fisher Scientific) and routinely tested for mycoplasma contamination.
  • ⁇ Cell proliferation> The cell mass of mNPC (Z. Li, et al., Cell Stem Cell. 19 (2016) 516-529) expanded and cultured in mNPSR medium was transferred to a 1.5 mL tube, and the supernatant was completely removed. 30 ⁇ L of Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.) was added, and the mixture was allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 5 % CO for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were diluted with 470 ⁇ L of 10% FBS and the number of cells was measured with TC20 (Bio-Rad).
  • TBK1 inhibitor MRT67307, BX795
  • CSF1R inhibitor GW2580
  • FLT3 inhibitor ASP2215
  • DYRK1 inhibitor ID-8
  • STAT6 inhibitor AS1517499
  • concentration gradients were prepared and added to the center (MRT67307: 5 nM, 10 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM, BX795: 0.5 nM, 1 nM, 2 nM, 4 nM. , 8nM, 16nM, GW2580 are 7.5nM, 15nM, 30nM, 60nM, 120nM, 240nM, 250nM, 500nM, 1000nM, ASP2215 are 0.1nM, 0.2nM, 0.4nM, 0.8nM, 1.6nM.
  • ID-8 is 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 3000 nM, 10000 nM, 30000 nM, AS1517499 is 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM).
  • a 96-well plate inoculated with cells suspended in 1 was centrifuged at 300 g for 3 minutes and statically cultured in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO. A cell mass was formed 6 hours after the start of static culture.
  • TBK1 inhibitor MRT67307, BX795
  • CSF1R inhibitor GW2580
  • FLT3 inhibitor ASP2215
  • DYRK1 inhibitor ID-8
  • An additional 100 ⁇ L of mNPSR medium supplemented with a STAT6 inhibitor AS1517499 was added to each well.
  • the cell mass of each well was transferred to a 1.5 mL tube, the supernatant was completely removed, 30 ⁇ L of Accumax (Incubative Cell Technologies, Inc.) was added, and 37 ° C., CO 2
  • the cells were allowed to stand in a 5% incubator for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were suspended in 470 ⁇ L of 10% FBS and the number of cells was measured by TC20 (Bio-Rad).
  • Table 1 shows the composition of the mNPSR medium used in the experiment.
  • the mNPSR medium was prepared by adding the reagents shown in Table 1 to the Basic medium shown in Table 1.
  • ⁇ Preparation of renal organoids> The cell mass of the subcultured mNPC was placed on Transwell (Corning) in a medium in which 30 nM MRT67307 or 4 nM BX795 was added to the mNPSR medium, and the surrounding medium was removed. Next, a Transwell with a cell mass was set in a culture dish previously filled with 5% KSR (Knock-out serum reaction) (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 200 ng / mL FGF2 and 5 ⁇ M CHIR99021. After 48 hours, the medium was replaced with 5% KSR without the addition of growth factors and small molecule compounds.
  • KSR Kerat-out serum reaction
  • the medium was exchanged with 5% KSR to which growth factors and small molecule compounds were not added, and on the 10th day after the start of differentiation culture, the cells were fixed at 4 ° C. for 3 hours using 4% PFA as Transwell. .. After fixation, the cells were replaced with PBS and allowed to stand at 4 ° C. overnight for immunostaining.
  • the FBS medium used in the ex vivo experiment was prepared by adding 10% fetal bovine serum (FBS) and PS (Penicillin Strepromycin) to DMEM / F12 Glutamax medium at 500 U / ml.
  • Kidneys were collected from mouse embryos (E12.5), placed on Transwell (Corning), and the surrounding medium was removed. Next, the Transwell on which the kidney was placed was set in a culture dish previously filled with an FBS medium supplemented with 100 nM MRT67307. After 24 to 72 hours from the start of culturing, the cells were fixed at 4 ° C. for 3 hours using 4% PFA in Transwell. After fixation, the cells were replaced with PBS and allowed to stand at 4 ° C. overnight for immunostaining.
  • FIG. 1 shows the results of a cell proliferation assay in a medium in which MRT67307 was added to mNPSR medium. From the literature information, the IC50 of MRT67307 is predicted to be around 19nM. MRT67307 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at a concentration near IC50.
  • FIG. 2 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which BX795 was added to mNPSR medium. From the literature information, the IC50 of BX795 is predicted to be around 2nM. BX795 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at a concentration near IC50.
  • FIG. 3 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which GW2580 was added to the mNPSR medium. GW2580 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at 240 nM to 1000 nM.
  • FIG. 4 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which ASP2215 was added to the mNPSR medium. From the literature information, the IC50 of ASP2215 is predicted to be around 0.29 nM. It was confirmed that ASP2215 had a significant cell proliferation promoting effect near 3.2 nM. This was presumed to be a growth promoting effect due to FLT3 inhibition.
  • FIG. 5 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which ID-8 was added to the mNPSR medium. ID-8 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at around 500 nM.
  • FIG. 6 shows the results of the cell proliferation assay in a medium in which AS151479 was added to the mNPSR medium. From the literature information, the IC50 of AS151499 is predicted to be around 21 nM. The AS1517499 was confirmed to have a significant cell proliferation promoting effect at around 25 to 200 nM.
  • FIG. 7 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 30 nM MRT67307 was added to the mNPSR medium.
  • Cell proliferation was promoted in mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with 30 nM MRT67307 as compared with mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with DMSO.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in the medium in which DMSO was added to the mNPSR medium (FIG. 8).
  • the cumulative number of cells in P1 is the number of cells grown in P0 a, the volume of the culture medium of P0 b, the volume of the culture medium of P0 used for passage c, and the number of cells obtained by growing in P1.
  • the cumulative number of cells in the subsequent subcultures is calculated in the same manner.
  • FIG. 9 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 4 nM BX795 was added to the mNPSR medium.
  • Cell proliferation was promoted in mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with 4 nM BX795 as compared with mNPC subcultured in mNPSR medium supplemented with DMSO.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in a medium in which DMSO was added to the mNPSR medium (FIG. 10).
  • Renal organoids were induced to differentiate from 4-passaged mNPC in mNPSR medium supplemented with 30 nM MRT67307 or 4 nM BX795. As a result, it was confirmed that none of the TBK1 inhibitors affected the formation of renal organoids (FIGS. 11 and 12).
  • ⁇ Proliferation assay using mNPC derived from ADPKD model mouse> A cell proliferation assay was performed in the same manner as above, except that mNPC extracted from the fetal kidney of an ADPKD (autosomal dominant polycystic kidney disease) model mouse was used as the mNPC. As the TBK1 inhibitor, 30 nM MRT67307 was used. It was confirmed that the addition of MRT67307 promoted the growth of mNPCs derived from ADPKD model mice (FIG. 13).
  • ⁇ Proliferation assay using mNPC derived from Alport syndrome model mouse> A cell proliferation assay was performed in the same manner as above, except that mNPC extracted from the fetal kidney of Alport syndrome model mouse was used as mNPC. 100 nM AS1517489 was used as the STAT6 inhibitor and 500 nM ID-8 was used as the DYRK1 inhibitor. It was confirmed that the addition of AS1517489 or ID-8 promotes the proliferation of mNPCs derived from Alport syndrome model mice (Fig. 14).
  • Kidneys were removed from embryonic mice, and the kidneys were placed on Transwell and cultured. As a TBK1 inhibitor, 100 nM MRT67307 was used. It was confirmed that the addition of MRT67307 promoted the growth of ex vivo as well (FIG. 15).
  • Example 2 [Materials and methods] ⁇ Cell proliferation> 4A6 strain (derived from 201B7), which is a healthy human-derived hiPS cell line, or ASe16 strain, which is an Alport syndrome disease-specific iPS cell line, is used as a human iPS cell on a 24-well plate using the method described in International Publication No. 2018/216743. After inducing differentiation into the derived NPCs, 100 ⁇ L of Accumax was added and the cells were allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 5 % CO for 30 minutes. After 30 minutes, it was suspended in 900 ⁇ L of 10% FBS.
  • 4A6 strain derived from 201B7
  • ASe16 strain which is an Alport syndrome disease-specific iPS cell line
  • the suspended cells were counted by TC20, and the cells required for flow cytometry were transferred to a 1.5 ml tube and centrifuged at 200 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and suspended at a ratio of 100 ⁇ L of 2% FBS to 1.0x10 6 cells. To 100 ⁇ L of 2% FBS in which cells were suspended, 10 ⁇ L of human-HGFR / cMET antibody (R & D systems, FAB 3582A) to which the fluorescent substance APC was conjugated was added, and the cells were allowed to stand on ice for 30 minutes.
  • human-HGFR / cMET antibody R & D systems, FAB 3582A
  • the supernatant was removed by centrifugation at 200 g for 5 minutes, washed with 1 mL of PBS, and again centrifuged at 200 g for 5 minutes. This operation was performed twice.
  • the cells from which the supernatant had been removed were suspended in 2% FBS diluted with DAPI 1,000 times, passed through a 40 ⁇ m filter, and then cMET-positive cells were extracted using flow cytometry.
  • the extracted cells were suspended in 50 ⁇ L of hNPSR medium alone or hNPSR medium supplemented with 30 nM MRT67307 so as to be 2.0x10 4 cells per well, and seeded in a low-adhesion 96-well plate (Nunc) to 300 g.
  • the cells were centrifuged at 37 ° C. for 3 minutes and statically cultured in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO. A cell mass was formed 6 hours after the start of static culture.
  • Table 2 shows the composition of the hNPSR medium used in the experiment.
  • the hNPSR medium was prepared by adding the reagents shown in Table 2 to the Basic medium shown in Table 2.
  • hNPSR-NPC human iPS cell-derived NPCs
  • hNPSR medium hNPSR medium supplemented with 30 nM MRT67307
  • Accumax Incubative Cell Technologies, Incubative Cell Technologies, Inc. 30 ⁇ L was added, and the cells were allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were suspended in 470 ⁇ L of 10% FBS and the number of cells was measured by TC20 (Bio-Rad).
  • a low-adhesion 96-well plate (Nunc) 2.0x10 4 cells of human iPS cell-derived NPCs per well were suspended and seeded in hNPSR medium alone and hNPSR medium supplemented with 30 nM MRT67307.
  • Low-attainment 96-well plates seeded with cells were centrifuged at 300 g for 3 minutes and statically cultured in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO. Forty-eight hours after the start of static culture, 100 ⁇ L of hNPSR medium supplemented with the same concentration of inhibitor as when the cells were seeded was additionally administered to each well. Forty-eight hours after the additional administration of the medium, the same operation as above was performed to measure the cell number and subculture.
  • FIG. 16 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 30 nM MRT67307 was added to the hNPSR medium.
  • the 4A6 strain-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with 30 nM MRT67307 in the hNPSR medium showed cell proliferation compared with the 4A6 strain-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO in the hNPSR medium. It was promoted.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in the medium in which DMSO was added to the hNPSR medium (FIG. 17).
  • FIG. 18 shows the change in the number of cells when subcultured in a medium in which 30 nM MRT67307 was added to the hNPSR medium.
  • the ASe16-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with 30 nM MRT67307 in the hNPSR medium had cell proliferation higher than that in the ASe16 strain-derived hiPSC-NPC subcultured in a medium supplemented with DMSO in the hNPSR medium. It was promoted.
  • the cumulative number of cells increased as compared with the case of subculturing in the medium in which DMSO was added to the hNPSR medium (FIG. 19).
  • Example 3 ⁇ Induction of nephron progenitor cells (hiPSC-NPC) from human iPS cells> After inducing differentiation of 4A6 strain (derived from 201B7), which is a healthy human-derived hiPS cell line, into human iPS cell-derived NPCs on a 24-well plate using the method described in International Publication No. 2018/216743, 100 ⁇ L of Accumax was added 30 The cells were allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO for a minute. After 30 minutes, it was suspended in 900 ⁇ L of 10% FBS.
  • 4A6 strain derived from 201B7
  • the suspended cells were counted by TC20, the cells required for flow cytometry were transferred to a 1.5 ml tube, and the cells were centrifuged at 200 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and suspended at a ratio of 100 ⁇ L of 2% FBS to 1.0x10 6 cells.
  • ⁇ Purification of c-MET positive cells To 100 ⁇ L of 2% FBS in which the hiPSC-NPC induced as described above was suspended, 10 ⁇ L of human-HGFR / c-MET antibody (R & D systems, FAB 3582A) to which the fluorescent substance APC was conjugated was added. It was allowed to stand on ice for 30 minutes. After 30 minutes, the supernatant was removed by centrifugation at 200 g for 5 minutes, washed with 1 mL of PBS, and again centrifuged at 200 g for 5 minutes. This operation was performed twice. The cells from which the supernatant had been removed were suspended in 2% FBS diluted with DAPI 1,000 times, passed through a 40 ⁇ m filter, and then c-MET-positive cells were extracted using flow cytometry.
  • human-HGFR / c-MET antibody R & D systems, FAB 3582A
  • the hiPSC-NPC obtained by purifying c-MET-positive cells may be referred to as "c-MET (+)-hiPSC-NPC”.
  • DMSO dissolved in CFY medium STAT6 inhibitor dissolved in DMSO (STAT6 inhibitor: AS1517499 (final concentration 100 nM)), TBK1 inhibitor dissolved in DMSO (TBK1 inhibitor: MRT67307 (final concentration 30 nM)).
  • STAT6 inhibitor AS1517499 (final concentration 100 nM)
  • TBK1 inhibitor TBK1 inhibitor dissolved in DMSO
  • MRT67307 final concentration 30 nM
  • a medium supplemented with a JAK2 inhibitor dissolved in DMSO JAK2 inhibitor: TG101348 (final concentration 3 nM) was used.
  • the composition of the CFY medium is shown in Table 3.
  • the CFY medium was prepared by adding the reagents shown in Table 3 to the Basic medium shown in Table 3.
  • HiPSC-NPCs were suspended in 50 ⁇ L of test medium to 2.0x10 4 cells per well, seeded on a low-adhesion 96-well plate (Nunc), centrifuged at 300 g for 3 minutes, 37 ° C., CO2 5 The cells were statically cultured in a% incubator. A cell mass was formed 6 hours after the start of static culture.
  • hiPSC-NPC human iPS cell-derived NPC
  • the cell mass of human iPS cell-derived NPC (hiPSC-NPC) cultured in the test medium was transferred to a 1.5 ml tube, the supernatant was completely removed, and 30 ⁇ L of Accumax (Incubative Cell Technologies, Inc.) was added at 37 ° C.
  • the cells were allowed to stand in an incubator with a CO of 25 % for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were suspended in 470 ⁇ L of 10% FBS and the number of cells was measured by TC20 (Bio-Rad).
  • TC20 Bio-Rad
  • Low-attainment 96-well plates seeded with cells were centrifuged at 300 g for 3 minutes and statically cultured in an incubator at 37 ° C. and 25 % CO. Forty-eight hours after the start of static culture, 100 ⁇ L of the test medium was additionally administered to each well. Forty-eight hours after the additional administration of the medium, the same operation as above was performed to measure the cell number and subculture.
  • the cell mass of the subcultured hiPSC-NPC was placed on Transwell (Corning), and the surrounding medium was removed.
  • a Transwell with a cell mass was set in a culture dish previously filled with 5% KSR (Knock-out serum reaction) (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 200 ng / mL FGF2 and 5 ⁇ M CHIR99021.
  • KSR Knock-out serum reaction
  • the medium was replaced with 5% KSR without the addition of growth factors and small molecule compounds.
  • the medium was exchanged with 5% KSR to which growth factors and small molecule compounds were not added, and on the 10th day after the start of differentiation culture, the cells were fixed at 4 ° C. for 3 hours using 4% PFA as Transwell. .. After fixation, the cells were replaced with PBS and allowed to stand at 4 ° C. overnight for immunostaining.
  • OSR1 and SIX2 A hiPS cell having an OSR1-GFP reporter gene in which a GFP coding region was introduced at the OSR1 locus and a SIX2-tdTomato reporter gene in which the tdTomato coding region was linked to the SIX2 gene was established.
  • the expression of OSR1 and SIX2 was confirmed by conducting a culture test using the hiPS cells and detecting each fluorescence of GFP and tdTomato with a fluorescence microscope.
  • FIG. 20 shows the number of cells in each subculture.
  • the CPHY medium supplemented with the STAT6 inhibitor promoted the growth of hiPSC-NPCs. It was
  • HiPSC-NPC was subcultured using a CFY medium supplemented with a STAT6 inhibitor (AS151499, final concentration 100 nM), and an attempt was made to prepare renal organoids from the cells of the first passage.
  • Kidney organoids were formed from the cells of the first passage in a medium supplemented with 100 nM AS1517499 to CFY medium. From this result, it was confirmed that hiPSC-NPC can be subcultured by using a medium in which a STAT6 inhibitor is added to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • ⁇ C-MET (+)-hiPSC-NPC growth promoting effect of STAT6 inhibitor> A STAT6 inhibitor (AS151499, final concentration 100 nM) was added to CFY medium, c-MET (+)-hiPSC-NPC was expanded and cultured, the number of cells was measured, and the cumulative number of cells was calculated. The number of cells and the cumulative number of cells for each 1, 2 and 3 passages were compared with the case where only DMSO was added to CFY medium.
  • FIGS. 22 and 23 show the results.
  • STAT6 inhibitor improved the growth promoting effect of c-MET (+)-hiPSC-NPC in the CFY medium.
  • C-MET (+)-hiPSC-NPC was subcultured using a CFY medium supplemented with a STAT6 inhibitor (AS151499, final concentration 100 nM), and an attempt was made to produce renal organoids from the cells of the first passage. ..
  • Kidney organoids were formed from the cells of the first passage in a medium supplemented with 100 nM AS1517499 to CFY medium. From this result, it was confirmed that c-MET (+)-hiPSC-NPC can be subcultured using a medium obtained by adding a STAT6 inhibitor to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • FIG. 25 shows the number of cells in each subculture. As shown in FIG. 25, the growth of hiPSC-NPC was promoted by the CFY medium supplemented with the TBK1 inhibitor or the JAK2 inhibitor.
  • HiPSC-NPC was subcultured using a medium supplemented with a TBK1 inhibitor (MRT67307, final concentration 30 nM) or JAK2 inhibitor (TG101348, final concentration 3 nM) in CFY medium, and kidney organoids were transferred from the cells of the first passage. I tried to make it.
  • FIGS. 26 and 27 show the results of the TBK1 inhibitor.
  • FIG. 27 shows the results of JAK2 inhibitors. Kidney organoids were formed from the cells of the first passage in a medium obtained by adding MRT67307 with a final concentration of 30 nM or TG101348 with a final concentration of 3 nM to CFY medium. From this result, it was confirmed that hiPSC-NPC can be subcultured by using a medium in which a TBK1 inhibitor or a JAK2 inhibitor is added to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • ⁇ C-MET (+)-hiPSC-NPC growth promoting effect of TBK1 inhibitor or JAK2 inhibitor> A TBK1 inhibitor (MRT67307, final concentration 30 nM) or JAK2 inhibitor (TG101348, final concentration 3 nM) was added to CFY medium, c-MET (+)-hiPSC-NPC was expanded and cultured, the number of cells was measured, and cumulative. The number of cells was calculated. The number of cells and the cumulative number of cells for each 1, 2 and 3 passages were compared with the case where only DMSO was added to CFY medium.
  • FIGS. 28 and 29 show the results.
  • CFY medium supplemented with TBK1 inhibitor or JAK2 inhibitor cell proliferation was promoted in all passages as compared with culture in CFY medium supplemented with DMSO. From this result, it was confirmed that the growth promoting effect of c-MET (+)-hiPSC-NPC in the CFY medium was improved by adding the TBK1 inhibitor or the JAK2 inhibitor.
  • ⁇ Preparation of renal organoids from c-MET (+)-hiPSC-NPC subcultured in CFY medium supplemented with TBK1 inhibitor> A subculture of c-MET (+)-hiPSC-NPC was performed using a medium in which a TBK1 inhibitor (MRT67307, final concentration 30 nM) was added to a CFY medium, and an attempt was made to prepare renal organoids from the cells of the second passage. ..
  • Kidney organoids were formed from the cells of the second passage in the medium in which MRT67307 with a final concentration of 30 nM was added to the CFY medium. From this result, it was confirmed that c-MET (+)-hiPSC-NPC can be subcultured using a medium obtained by adding a TBK1 inhibitor to a CFY medium while maintaining the ability to form renal organoids.
  • a medium for expanding and culturing Neflon precursor cells capable of efficiently expanding and culturing Neflon precursor cells, a method for expanding and culturing Neflon precursor cells using the medium, and the above-mentioned expansion culture method can be used.
  • a method for producing a renal organoid from the obtained Neflon precursor cells is provided.
  • the nephron progenitor cells and renal organoids obtained by the method of the present invention can be applied to the treatment or prevention of renal diseases.

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Abstract

この培地は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む。

Description

ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法
　本発明は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法、腎臓オルガノイドの製造方法に関する。
　本願は、２０２１年１月８日に、日本に出願された特願２０２１－０２２０２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　現在、本邦において慢性腎臓病（ＣＫＤ）の患者数は、約１，３００万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は３４万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。
　腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の３つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の２つの組織の相互作用で発生する。さらに、後腎間葉の中にネフロンを構成する糸球体と数種類の尿細管上皮細胞に分化する多分化能を有するネフロン前駆細胞（Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ＮＰＣ）の存在が示されている（非特許文献１，２）。
　マウスネフロン前駆細胞（ｍｏｕｓｅ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ：ｍＮＰＣ）の拡大培養法としては、骨形成因子（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）７を用いた方法が報告されている。例えば、非特許文献３には、ＢＭＰ７、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＣＨＩＲ９９０２１、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、Ａ８３－０１、ＬＤＮ１９３１８９を含む培地（ＮＰＳＲ培地）を用いて、１年以上にわたってｍＮＰＣを増殖させたことが報告されている。
Ｏｓａｆｕｎｅ　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｍｏｕｓｅ　ｋｉｄｎｅｙ　ｂｙ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ａｓｓａｙ．　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２００６；　１３３：　１５１－６１． Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｉｘ２　ｄｅｆｉｎｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ａ　ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗｉｎｇ　ｎｅｐｈｒｏｎ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２００８；　３：　１６９－８１． Ｚ．　Ｌｉ，　Ｔ．　Ａｒａｏｋａ，　Ｊ．Ｃ．Ｉ．　Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，　Ｇｅｎｅ　Ｅｄｉｔｉｎｇ　ｉｎ　３Ｄ　Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　Ｎｅｐｈｒｏｎ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ，　ｉｎ：　Ｓ．　Ｖａｉｎｉｏ　（Ｅｄ．），　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｏｒｇａｎｏｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｒｏｔｏｃ，　Ｈｕｍｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　２０１９：　ｐｐ．　１５１－１５９．
　培養コスト、培養時間の低減のためには、より効率よくネフロン前駆細胞を増殖させることができる拡大培養法の開発が望まれる。
　そこで、本発明は、効率よくネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
＜１＞　本発明の一実施形態に係る培地は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む。
＜２＞　上記＜１＞に記載の培地は、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＢＭＰ７からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含んでもよい。
＜３＞　本発明の一実施形態に係る培地は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種と、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＢＭＰ７と、を含む。
＜４＞　上記＜２＞または＜３＞に記載の培地において、前記ＡＬＫ阻害剤は、Ａ８３－０１であってもよい。
＜５＞　上記＜２＞～＜４＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１からなる群より選択される少なくとも１種であってもよい。
＜６＞　上記＜１＞に記載の培地において、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＦＧＦ９をさらに含んでもよい。
＜７＞　上記＜２＞～＜６＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であってもよい。
＜８＞　上記＜２＞～＜７＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であってもよい。
＜９＞　上記＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＴＢＫ１阻害剤がＭＲＴ６７３０７またはＢＸ７９５であってもよい。
＜１０＞　上記＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＣＳＦ１Ｒ阻害剤が、ＧＷ２５８０であってもよい。
＜１１＞　上記＜１＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＦＬＴ３阻害剤が、ＡＳＰ２２１５であってもよい。
＜１２＞　上記＜１＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＤＹＲＫ１阻害剤が、ＩＤ－８であってもよい。
＜１３＞　上記＜１＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の培地において、前記ＳＴＡＴ６阻害剤が、ＡＳ１５１７４９９であってもよい。
＜１４＞　本発明の一実施形態に係るネフロン前駆細胞を拡大培養する方法は、上記＜１＞～＜１３＞のいずれか１つに記載の培地を用いる。
＜１５＞　本発明の一実施形態に係る腎臓オルガノイドの製造方法は、上記＜１４＞に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、を含む。
　本発明は、効率よくネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法を提供できるという効果を奏する。
ｍＮＰＳＲ培地（ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ－２７６３２、ＦＧＦ－２、ＬＩＦ、ＢＭＰ７、ヘパリン、ＬＤＮ１９３１８９、Ａ８３－０１を含む培地）に終濃度０～１０００ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～１６ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～１０００ｎＭのＧＷ２５８０を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～３．２ｎＭのＡＳＰ２２１５を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～３００００ｎＭのＩＤ－８を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地に終濃度０～２００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞数を示す。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＢＸ７９５はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＢＸ７９５はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で４回継代した後のｍＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で４回継代した後のｍＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で、ＡＤＰＫＤ（常染色体優性多発性嚢胞腎）モデルマウス由来のｍＮＰＣを培養したときの細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）、終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９、または終濃度５００ｎＭのＩＤ－８を添加した培地で、Ａｌｐｏｒｔ症候群モデルマウス由来のｍＮＰＣを培養したときの細胞数を示す。ＡＳ１５１７４９９およびＩＤ－８はＤＭＳＯに溶解してｍＮＰＳＲ培地に添加した。 ＦＢＳ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度１００ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地でマウスの胎仔から取り出し、培養した腎臓におけるＳＩＸ２の免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養した４Ａ６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｈＮＰＳＲ培地に添加した。 ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養した４Ａ６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｈＮＰＳＲ培地に添加した。 ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したＡＳｅ１６株（Ａｌｐｏｒｔ症候群患者由来疾患特異的ｉＰＳ細胞株）由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｈＮＰＳＲ培地に添加した。 ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したＡＳｅ１６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７はＤＭＳＯに溶解してｈＮＰＳＲ培地に添加した。 ＣＦＹ培地（ＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ－９、Ｙ－２７６３２を含む培地）にＤＭＳＯ（０．１％）または終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で継代培養したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＡＳ１５１７４９９は、ＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地に終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で１回継代した後のｈｉＰＳＣ－ＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ）。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＡＳ１５１７４９９はＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ（０．１％）又は終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＡＳ１５１７４９９はＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地に終濃度１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地で１回継代した後のｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ）。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ（０．１％）、終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７、又は終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７、ＴＧ１０１３４８はＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地に終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で１回継代した後のｈｉＰＳＣ－ＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ）。 ＣＦＹ培地に終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で１回継代した後のｈｉＰＳＣ－ＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ）。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ（０．１％）、終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７、または終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における細胞数を示す。ＭＲＴ６７３０７、ＴＧ１０１３４８はＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ（０．１％）、終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７、または終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの各継代数における累積細胞数を示す。ＡＳ１５１７４９９はＤＭＳＯに溶解してＣＦＹ培地に添加した。 ＣＦＹ培地に終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で２回継代した後のｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣから形成した腎臓オルガノイドにおけるＰＯＤＸＬ（ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管）、ＣＤＨ１（ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）のレクチン染色および免疫染色分析の結果を示す蛍光顕微鏡画像である（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ）。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地＞
　本発明の第１の態様は、ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地である。一実施形態において、本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む。また、一実施形態において、本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤およびＢＭＰ７からなる群より選択される少なくとも１種と、を含む。また、一実施形態において、本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤およびＢＭＰ７を含む。
（ネフロン前駆細胞：ＮＰＣ）
　ＮＰＣは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化し得る細胞である。ネフロン前駆細胞の器官構造への分化能は、例えば、Ｏｓａｆｕｎｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１３３：１５１－６１に記載の方法によって評価し得る。ネフロン前駆細胞としての状態を維持するための特徴的な因子としてＳＩＸ２が知られており（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　３：１６９－１８１　（２００８））、本態様の方法で培養されるネフロン前駆細胞の例として、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞が挙げられる。例えば、ＳＩＸ２プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１－ＧＦＰ／ＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ＮａｔＣｏｍｍｕｎ　４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、ネフロン前駆細胞におけるＳＩＸ２の発現を確認することもできる。本明細書において、ＳＩＸ２陽性のネフロン前駆細胞には、ＳＩＸ２タンパク質を発現している細胞、およびＳＩＸ２プロモーター制御下にある遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。ヒトのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１０７３６）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１６９３２．５で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子、マウスのＳＩＸ２遺伝子（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２０４７２）としては、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１１３８０．２で登録されたヌクレオチド配列を有する遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。本態様の培地で培養されるネフロン前駆細胞は、好ましくは、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２及びＳＡＬＬ１が陽性である。
　ネフロン前駆細胞は、生体の後腎間葉から単離されたものであってもよく、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）から分化誘導したものであってもよい。
　多能性幹細胞からのネフロン前駆細胞の分化誘導は、公知の方法により行うことができる。多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導する方法としては、例えば、国際公開第２０１４／２００１１５号、国際公開第２０１７／０４３６６６号、国際公開第２０１８／２１６７４３号等に記載の方法が挙げられる。
　後腎間葉から採取された細胞集団又は多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団からのネフロン前駆細胞の単離は、例えば、上記ネフロン前駆細胞のマーカーであるＯＳＲ１、ＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２、又はＳＡＬＬ１の発現を指標として行うことができる。あるいは、ＭＥＴ、又はＡＧＴＲ２の発現を指標として行うことができる（国際公開第２０２０／０２２２６１号）。
　本態様の培地で拡大培養されるネフロン前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化されたネフロン前駆細胞の細胞集団として提供されてもよい。ネフロン前駆細胞と他の細胞腫とを含む細胞集団である場合、ネフロン前駆細胞数の割合は、全細胞数（１００％）に対して、３０％、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることが好ましい。
（拡大培養）
　「拡大培養」とは、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を増殖させる培養を意味する。すなわち、拡大培養したネフロン前駆細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化することができる。本態様の培地は、継代を繰り返しても、ネフロン前駆細胞の性質を維持させたままネフロン前駆細胞を拡大培養することができる。
（培地）
　本態様の培地は、動物培養に用いられる基礎培地に、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を添加した培地であってもよい。また、動物培養に用いられる基礎培地に、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種と、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤およびＢＭＰ７からなる群より選択される少なくとも１種と、を添加したものであってもよい。また、動物培養に用いられる基礎培地に、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種と、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤およびＢＭＰ７と、を添加したものであってもよい。
≪基礎培地≫
　基礎培地は、特に限定されず、動物培養に通常用いられるものを特に制限なく使用することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。また、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、及びこれらの同等物などの１つ以上の物質を含んでいてもよい。
　基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の混合培地（例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ１２を１：１で混合した混合培地）に、アミノ酸、非必須アミノ酸、血清代替物等を添加したものであってもよい。
　本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む。
≪ＴＢＫ１阻害剤≫
　本態様の培地に含まれるＴＢＫ１阻害剤は、ＴＡＮＫバインディングキナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する物質である。ＴＢＫ１阻害剤はＴＡＮＫバインディングキナーゼ１の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＴＢＫ１阻害剤としては、例えば、ＭＲＴ６７３０７（ＣＡＳ番号１１９０３７８－５７－４）、ＢＸ７９５（ＣＡＳ番号７０２６７５－７４－９）、ＴＢＫ１／ＩＫＫε－ＩＮ－１（ＣＡＳ番号２０５８２６４－３２－５）、ＴＢＫ１／ＩＫＫε－ＩＮ－２（ＣＡＳ番号１２９２３１０－４９－６）、ＴＢＫ１／ＩＫＫε－ＩＮ－５（ＣＡＳ番号１８９３３９７－６５－３）、ＧＳＫ８６１２（ＣＡＳ番号２３６１６５９－６２－１）、Ａｍｌｅｘａｎｏｘ（ＣＡＳ番号６８３０２－５７－８）、ＢＡＹ－９８５（ＣＡＳ番号２４０９４７９－２９－２）、ＧＳＫ３１９３４７Ａ（ＣＡＳ番号８６２８１２－９８－４）などが挙げられるが、これに限定されない。中でも、ＴＢＫ１阻害剤は、ＭＲＴ６７３０７およびＢＸ７９５が好ましい。ＴＢＫ１阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＴＢＫ１阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ＴＢＫ１に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　本態様の培地におけるＴＢＫ１阻害剤の濃度は、ＴＢＫ１阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＴＢＫ１阻害剤は、例えばＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤は、例えば、０．５ｎＭ以上、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、３ｎＭ以上、４ｎＭ以上、５ｎＭ以上、６ｎＭ以上、７ｎＭ以上、８ｎＭ以上、９ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＴＢＫ１阻害剤の濃度の上限値としては、例えば１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または３５ｎＭ以下等が挙げられる。ＴＢＫ１阻害剤がＭＲＴ６７３０７である場合、ＭＲＴ６７３０７の培地における濃度は、例えば、０．５～１０００ｎＭ、５～５００ｎＭ、５～２００ｎＭ、５～１００ｎＭ、５～５０ｎＭ、１０～３５ｎＭ、または２０～３５ｎＭなどが挙げられる。ＴＢＫ１阻害剤がＢＸ７９５である場合、ＢＸ７９５の培地における濃度は、０．５～１６ｎＭ、０．５～８ｎＭ、１～８ｎＭ、または２～８ｎＭなどが挙げられる。
≪ＣＳＦ１Ｒ阻害剤≫
　本態様に含まれるＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の活性を阻害する物質である。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、コロニー刺激因子１受容体の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤としては、例えば、ＧＷ２５８０（ＣＡＳ番号８７０４８３－８７－７）、ＣＳＦ１Ｒ－ＩＮ－１（ＣＡＳ番号２０９５８４９－０４－８）、ＡＺＤ７５０７（ＣＡＳ番号１０４１８５２－８５－０）、ＰＲＮ１３７１（ＣＡＳ番号１８０２９２９－４３－６）、ｃＦＭＳ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＩＩ（ＣＡＳ番号９５９８６０－８５－６）、ＰＬＸ－３３９７　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ番号２０４０２９５－０３－０）、Ｋｉ２０２２７（ＣＡＳ番号６２３１４２－９６－１）、ＢＬＺ９４５（ＣＡＳ番号　９５３７６９－４６－５）、ＰＬＸ５６２２（ＣＡＳ番号１３０３４２０－６７－８）などが挙げられるが、これに限定されない。中でもＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、ＧＷ２５８０が好ましい。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ＣＳＦ１Ｒに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　本態様の培地におけるＣＳＦ１Ｒ阻害剤の濃度は、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、例えばＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤は、例えば、０．５ｎＭ以上、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、３ｎＭ以上、４ｎＭ以上、５ｎＭ以上、６ｎＭ以上、７ｎＭ以上、７．５ｎＭ以上、８ｎＭ以上、９ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、５０ｎＭ以上、または１００ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤の濃度の上限値としては、例えば５０００ｎＭ以下、３０００ｎＭ以下、２０００ｎＭ以下、または１０００ｎＭ以下等が挙げられる。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤がＧＷ２５８０である場合、ＧＷ２５８０の培地における濃度は、例えば、０．５～５０００ｎＭ、７．５～３０００ｎＭ、１５～２０００ｎＭ、３０～１０００ｎＭ、６０～１０００ｎＭ、１２０～１０００ｎＭ、２４０～１０００ｎＭ、または２５０～１０００ｎＭなどが挙げられる。
≪ＦＬＴ３阻害剤≫
　本態様に含まれるＦＬＴ３阻害剤は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）の活性を阻害する物質である。ＦＬＴ３阻害剤は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＦＬＴ３阻害剤としては、例えば、ＡＳＰ２２１５（ＣＡＳ番号１２５４０５３－４３－４）、ＳＫＬＢ４７７１（ＣＡＳ番号１３７０２５６－７８－２）、ＣＣＴ２４１７３６（ＣＡＳ番号１４０２７０９－９３－６）、ＢＰＲ１Ｋ８７１（ＣＡＳ番号２４４３７６７－３５－７）などが挙げられるが、これに限定されない。中でもＦＬＴ３阻害剤は、ＡＳＰ２２１５（Ｇｉｌｔｅｒｉｔｉｎｉｂ）が好ましい。ＦＬＴ３阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＦＬＴ３阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ＦＬＴ３に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　本態様の培地におけるＦＬＴ３阻害剤の濃度は、ＦＬＴ３阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＦＬＴ３阻害剤は、例えばＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＦＬＴ３阻害剤は、例えば、０．１ｎＭ以上、０．２ｎＭ以上、０．３ｎＭ以上、０．４ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上、０．６ｎＭ以上、０．７ｎＭ以上、０．８ｎＭ以上、０．９Ｍ以上、１．０ｎＭ以上、または１．５ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＦＬＴ３阻害剤の濃度の上限値としては、例えば１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下等が挙げられる。ＦＬＴ３阻害剤がＡＳＰ２２１５である場合、ＡＳＰ２２１５の培地における濃度は、例えば、０．１～１０ｎＭ、０．２～１０ｎＭ、０．４～１０ｎＭ、０．８～１０ｎＭ、０．８～５．０ｎＭ、または０．８～３．２ｎＭなどが挙げられる。
≪ＤＹＲＫ１阻害剤≫
　本態様の培地に含まれるＤＹＲＫ１阻害剤は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１（ＤＹＲＫ１）の活性を阻害する物質である。ＤＹＲＫ１阻害剤は二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＤＹＲＫ１阻害剤は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ１Ａ（ＤＹＲＫ１Ａ）の活性を阻害する物質（ＤＹＲＫ１Ａ阻害剤）であることが好ましい。ＤＹＲＫ１阻害剤としては、例えば、ＩＤ－８（ＣＡＳ番号１４７５９１－４６－６）、ＩＮＤＹ（ＣＡＳ番号１１６９７５５－４５－６）、Ｍｉｒｋ－ＩＮ－１（ＣＡＳ番号１３８６９７９－５５－０）、ＥＨＴ５３７２（ＣＡＳ番号１４２５９４５－６０－３）などが挙げられるが、これに限定されない。中でも、ＤＹＲＫ１阻害剤は、ＩＤ－８が好ましい。ＤＹＲＫ１阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＤＹＲＫ１阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ＤＹＲＫ１（ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＲＫ１Ｂなど）に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　本態様の培地におけるＤＹＲＫ１阻害剤の濃度は、ＤＹＲＫ１阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＤＹＲＫ１阻害剤は、例えばＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＤＹＲＫ１阻害剤は、例えば、０．５ｎＭ以上、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、３ｎＭ以上、４ｎＭ以上、５ｎＭ以上、６ｎＭ以上、７ｎＭ以上、８ｎＭ以上、９ｎＭ以上、または１０ｎＭ以上、の濃度で用いることができる。ＤＹＲＫ１阻害剤の濃度の上限値としては、例えば３００００ｎＭ以下、１００００ｎＭ以下、１０００ｎＭ以下、または５００ｎＭ以下等が挙げられる。ＤＹＲＫ１阻害剤がＩＤ－８である場合、ＩＤ－８の培地における濃度は、例えば、０．５～３００００ｎＭ、０．５～１００００ｎＭ、０．５～３０００ｎＭ、０．５～１０００ｎＭ、１００～１０００ｎＭ、または２５０～１０００ｎＭなどが挙げられる。
≪ＳＴＡＴ６阻害剤≫
　本態様の培地に含まれるＳＴＡＴ６阻害剤は、シグナル伝達性転写因子６（ＳＴＡＴ６）の活性を阻害する物質である。ＳＴＡＴ６阻害剤はシグナル伝達性転写因子６の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＳＴＡＴ６阻害剤としては、例えば、ＡＳ１５１７４９９（ＣＡＳ番号９１９４８６－４０－１）などが挙げられるが、これに限定されない。ＳＴＡＴ６阻害剤は、ＡＳ１５１７４９９が好ましい。ＳＴＡＴ６阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　ＳＴＡＴ６阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ＳＴＡＴ６に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　本態様の培地におけるＳＴＡＴ６阻害剤の濃度は、ＳＴＡＴ６阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＳＴＡＴ６阻害剤は、例えばＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＳＴＡＴ６阻害剤は、例えば、１ｎＭ以上、２ｎＭ以上、３ｎＭ以上、４ｎＭ以上、５ｎＭ以上、６．２５ｎＭ以上、７ｎＭ以上、８ｎＭ以上、９ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、１２．５ｎＭ以上、または２５ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＳＴＡＴ６阻害剤の濃度の上限値としては、例えば１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、または２００ｎＭ以下等が挙げられる。ＳＴＡＴ６阻害剤がＡＳ１５１７４９９である場合、ＡＳ１５１７４９９の培地における濃度は、例えば、１～１０００ｎＭ、６．２５～１０００ｎＭ、１２．５～１０００ｎＭ、２５～１０００ｎＭ、２５～５００ｎＭ、または２５～２００ｎＭなどが挙げられる。
≪ＦＧＦ２≫
　本態様の培地は、ＦＧＦ２を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＦＧＦ２を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）２は、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）とも呼ばれる。ＦＧＦ２が由来する生物は特に限定されない。ＦＧＦ２としては、例えば、ヒトＦＧＦ２を用いることができる。ヒトＦＧＦ２（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２２４７）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１３４８５９４．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ２はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＦＧＦ２は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＦＧＦ２の濃度は、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、２０～４００ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは５０～３５０ｎｇ／ｍＬである。
≪ヘパリン≫
　本態様の培地は、ヘパリンを含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ヘパリンを含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ヘパリンは、塩の形態であることが好ましい。ヘパリンの塩としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄などの金属との塩；アンモニウム塩；有機塩基との塩；及びアミノ酸との塩等が挙げられる。中でも、ヘパリンは、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩がより好ましい。
　培地におけるヘパリンの濃度は、例えば、０．０１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは、０．０５～５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは、０．１～１０μｇ／ｍＬである。
≪ＲＯＣＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ－キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を阻害する物質である。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６－９８３（２０００）；　Ｎａｒｕｍｉｙａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，　２７３－２８４　（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３８９：９９０－９９４（１９９７）参照）、Ｈ－１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．　９３：　２２５－２３２（２００２）参照）、Ｗｆ－５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　５２（４）：３１９－３２４（２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ－２７６３２が挙げられる。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である場合、培地におけるＹ－２７６３２の濃度は、例えば、０．１～１００μＭ、好ましくは、１～７５μＭ、さらに好ましくは、５～５０μＭである。
≪ＧＳＫ３β阻害剤≫
　本態様の培地は、ＧＳＫ３β阻害剤を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＧＳＫ３β阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２）、及びＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン－３－カルボニトリル）、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。培地におけるＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、ＧＳＫ３β阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＧＳＫ３β阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である場合、培地におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度としては、例えば、０．０１～１００μＭ、好ましくは、０．１～１０μＭ、さらに好ましくは、０．５～３μＭであり、特に好ましくは、０．５～１．５μＭである。
≪ＬＩＦ≫
　本態様の培地は、白血病阻害因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＬＩＦを含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＬＩＦが由来する生物は、特に限定されない。ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特表平１－５０２９８５号公報）、マウス（特表平１－５０２９８５号公報）、ヒツジ（特表平４－５０２５５４号公報）、ブタ（特表平４－５０２５５４号公報）、ウシ（特表平８－１５４６８１号公報）等のＬＩＦを用いることができる。中でも、ヒト又はマウスのＬＩＦが好ましい。ヒトＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：３９７６）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１２４４０６４．１又はＮＰ＿００２３００．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。マウスＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１６８７８）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３４６２６．１又はＮＰ＿０３２５２７．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＬＩＦは、ネフロン前駆細胞が由来する生物に応じて適宜選択することができる。例えば、ネフロン前駆細胞がマウス由来である場合、マウスＬＩＦを用いることが好ましい。ネフロン前駆細胞がヒト由来である場合、ヒトＬＩＦを用いることが好ましい。ＬＩＦはネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片及び機能的改変体であってもよい。ＬＩＦは市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＬＩＦの濃度は、例えば、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１０～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、５０～２５０ｎｇ／ｍＬである。また、培地におけるＬＩＦの濃度は、例えば、１０～５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、好ましくは、１００～３０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、より好ましくは、５００～２０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬである。
≪ＡＬＫ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＡＬＫ阻害剤を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＡＬＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ）ファミリーの機能を阻害する物質である。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＴＧＦβのＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質等が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５又はＡＬＫ７の阻害剤が挙げられる。ＡＬＫ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ　アクセッション番号として、マウス：ＮＰ＿０３４２２４．１、ヒト：ＮＰ＿０６６２７７．１が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃａｎｃｅｒ，　２００３，　２：２０）、ＳＢ５０５１２４　（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８　（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６　（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、ＷＯ２００９１４６４０８）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＬＫ阻害剤は、ＡＬＫファミリーに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＡＬＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＡＬＫ阻害剤としては、Ａ８３－０１が挙げられる。培地におけるＡＬＫ阻害剤の濃度は、ＡＬＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＬＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＡＬＫ阻害剤がＡ８３－０１である場合、培地におけるＡ８３－０１の濃度としては、例えば、０．０１～１０００ｎＭ、好ましくは、０．１～５００ｎＭ、さらに好ましくは、１～１００ｎＭであり、特に好ましくは、１０～８０ｎＭである。
≪ＢＭＰ阻害剤≫
　本態様の培地は、ＢＭＰ阻害剤を含む。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＢＭＰ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナル伝達を阻害する物質である。ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＢＭＰの受容体であるＡＬＫ２又はＡＬＫ３のキナーゼ活性を阻害する物質であってもよい。ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤；Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）（Ｐ．　Ｂ．　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　（２００７），　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　１１６：ＩＩ＿６０；　Ｐ．Ｂ．　Ｙｕ　ｅｔ　ａｌ．　（２００８），　Ｎａｔ．　Ｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｌ．，　４：３３－４１；　Ｊ．　Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．　（２００８），　ＰＬｏＳ　ＯＮＥ，　３（８）：ｅ２９０４)、及びＬＤＮ１９３１８９（４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ１(ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１；４－［６－（４－ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＭＰ阻害剤は、ＢＭＰに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＢＭＰ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。好ましいＢＭＰ阻害剤としては、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１が挙げられ、ＬＤＮ１９３１８９がより好ましい。培地におけるＢＭＰ阻害剤の濃度は、ＡＬＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＢＭＰ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＢＭＰ阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である場合、培地におけるＬＤＮ１９３１８９の濃度としては、例えば、０．０１～１０００ｎＭ、好ましくは、０．１～５００ｎＭ、さらに好ましくは、０．５～１００ｎＭであり、特に好ましくは、１～５０ｎＭである。
≪ＢＭＰ７≫
　本態様の培地は、ＢＭＰ７を含むことが好ましい。ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＢＭＰ７を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより良好となる。ＢＭＰ７が由来する生物は特に限定されない。ＢＭＰ７としては、例えば、ヒトＢＭＰ７を用いることができる。ヒトＢＭＰ７（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：６５５）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１７１０．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ７はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＢＭＰ７は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＢＭＰ７の濃度は、例えば、０．１～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、１～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは、１０～１００ｎｇ／ｍＬである。
≪ＦＧＦ９≫
　本態様の培地は、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）９を含んでもよい。ＦＧＦ９が由来する生物は特に限定されない。ＦＧＦ９としては、例えば、ヒトＦＧＦ９を用いることができる。ヒトＦＧＦ９（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：２２５４）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２００１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９はネフロン前駆細胞の増殖を促進する活性を有する限りその断片又は機能的改変体であってもよい。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよく、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　培地におけるＦＧＦ９の濃度は、例えば、１～８００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５～５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～４００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１００～３００ｎｇ／ｍｌである。
　本態様の培地は、本発明の効果を損なわない範囲で、上記以外の成分を含むことができる。上記以外の成分としては、例えば、ＪＡＫ阻害剤が挙げられる。
　ＪＡＫ阻害剤
　本態様の培地は、ＪＡＫ阻害剤を含んでいてもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ　ｋｉｎａｓｅ）ファミリー（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）の１種類以上の酵素の活性を阻害する物質である。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素活性を阻害することにより、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ系のシグナル伝達を阻害する。培地が、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＦＧＦ９に加えて、ＪＡＫ阻害剤を含むことで、ネフロン前駆細胞の増殖がより促進される。ＪＡＫ阻害剤は、ヤヌスキナーゼファミリーの酵素の活性を阻害できるものである限り、特に限定されない。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、及びＪＡＫ３からなる群より選択される少なくとも１種の酵素活性を阻害するものが好ましく、ＪＡＫ２の酵素活性を阻害するもの（ＪＡＫ２阻害剤）がより好ましい。
　ＪＡＫ３阻害剤は、ＪＡＫ３の活性を阻害できるものであれば特に限定されない。ＪＡＫ３阻害剤としては、例えば、ＴＣＳ２１３１１（ＣＡＳ番号　１２６０１８１－１４－３）、ＷＨＩ－Ｐ１５４（ＣＡＳ　２１１５５５－０４－３）、ＰＦ－０６６５１６００（ＣＡＳ番号　１７９２１８０－８１－４）、ＦＭ－３８１（ＣＡＳ番号　２２２６５２１－６５－７）、ＣＰ６９０５５０（ＣＡＳ番号　５４０７３７－２９－９）、７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－カルボン酸，４－［３－[（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）アミノ］フェニル］－，エチルエステル、ＪＡＫ３　ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ　ＩＶ（ＣＡＳ番号５８７５３－５４－１）、ＺＭ４４９８２９（ＣＡＳ番号４４５２－０６－６）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ番号９３５６６６－８８－９）、及びＳｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＪＡＫ３　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１（ＣＡＳ番号１４４３２３５－９５－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＪＡＫ３阻害剤は、ＴＣＳ２１３１１が好ましい。
　ＪＡＫ２阻害剤は、ＪＡＫ２の活性を阻害できるものであれば、特に限定されない。ＪＡＫ２阻害剤としては、例えば、ＮＶＰ－ＢＳＫ８０５　２ＨＣｌ（ＣＡＳ番号１９４２９１９－７９－０）、ＴＧ１０１２０９（ＣＡＳ番号９３６０９１－１４－４）、ＴＧ１０１３４８（ＣＡＳ番号９３６０９１－２６－８）、１，２，３，４，５，６－ヘキサブロモシクロヘキサン（ＣＡＳ番号１８３７－９１－８）、ＣＥＰ－３３７７９（ＣＡＳ番号１２５７７０４－５７－６）、及びＮＳＣ３３９９４（ＣＡＳ番号８２０５８－１６－０）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＪＡＫ２阻害剤は、ＴＧ１０１３４８が好ましい。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ２／３阻害剤であってもよい。ＪＡＫ２／３阻害剤は、ＪＡＫ２及びＪＡＫ３を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ２／３阻害剤としては、例えば、ＡＧ４９０（ＣＡＳ番号１３３５５０－３０－８）、ＡＴ９２８３（ＣＡＳ番号８９６４６６－０４－９）、及びＬＹ３００９１０４（ＣＡＳ番号１１８７５９４－０９－７）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ１／２阻害剤であってもよい。ＪＡＫ１／２阻害剤は、ＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する阻害剤である。ＪＡＫ１／２阻害剤としては、例えば、ＣＹＴ３８７（ＣＡＳ番号１０５６６３４－６８－４）、Ｓ－Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＩＮＣＢ０１８４２４）（ＣＡＳ番号９４１６８５－３７－６）、及びＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ番号１２２９２３６－８６－５）、並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＪＡＫ阻害剤は、上記のような低分子化合物に限定されず、ヤヌスキナーゼファミリー（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２）に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ＪＡＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ２阻害剤が好ましく、ＴＧ１０１３４８がより好ましい。
　本態様の培地におけるＪＡＫ阻害剤の濃度は、ＪＡＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択可能である。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、ＩＣ５０付近の濃度で用いることが好ましい。ＪＡＫ阻害剤は、例えば、０．０１ｎＭ以上、０．０５ｎＭ以上、０．１ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上、又は１ｎＭ以上の濃度で用いることができる。ＪＡＫ阻害剤の濃度の上限値としては、例えば、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、又は５ｎＭ以下等が挙げられる。ＪＡＫ阻害剤が、ＴＧ１０１３４８である場合、ＴＧ１０１３４８の培地における濃度は、例えば、０．５～５０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、１～１０ｎＭ、又は１～５ｎＭ等が挙げられる。
　一実施態様において、本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種と、ＪＡＫ阻害剤、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、およびＢＭＰ７と、を含む。一例として、ＴＢＫ１阻害剤、ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、およびＢＭＰ７を含む。一例としては、本態様の培地は、ＭＲＴ６７３０７、ＦＧＦ２、ヘパリン、Ｙ－２７６３２、ＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、及びＡ８３－０１を含むことができる。
　一実施態様において、本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種に加えて、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＦＧＦ９を含む。本態様の培地は、さらにＪＡＫ阻害剤を含んでもよい。一例としては、本態様の培地は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｙ－２７６３２、及びＦＧＦ９を含むことができる。
　本態様の培地は、ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、およびＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含むことで、ネフロン前駆細胞の分化能を維持したまま、良好にネフロン前駆細胞を増殖させることができる。
＜ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法＞
　本発明の第２の態様は、前記第１の態様の培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法である。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いる限り、培養方法は特に限定されない。ネフロン前駆細胞は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件で培養することができる。培養温度は、ネフロン前駆細胞が増殖できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ネフロン前駆細胞は、通常ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養することができる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　培養期間は、特に限定されず、任意の期間をすることができる。本態様の方法では、第１の態様の培地を用いることにより、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、長期間培養することができる。長期間培養する場合、適宜、継代することが好ましい。前記第１の態様の培地を用いて継代を繰り返すことで、ネフロン前駆細胞の性質を維持したまま、ネフロン前駆細胞の培養を続けることができる。継代は、培養液からネフロン前駆細胞の細胞塊を採取し、新たな培地に播種することにより、行うことができる。継代の際には、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、及びＤＮａｓｅ等の酵素を含む細胞分散液を用いて、細胞塊を分散した後、新たな培地に播種してもよい。継代の間隔は、特に限定されないが、例えば、２～１０日程度、又は３～７日程度とすることができる。
　本態様の方法は、前記第１の態様の培地を用いてネフロン前駆細胞を培養するため、効率よくネフロン前駆細胞を増殖させることができる。本態様の方法で拡大培養されたネフロン前駆細胞は、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。また、後述の腎臓オルガノイドの製造のために用いることができる。
＜腎臓オルガノイドの製造方法＞
　本発明の第３の態様は、腎臓オルガノイドの製造方法である。本態様の腎臓オルガノイドの製造方法は、前記第２の態様の方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程（拡大培養工程）と、前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程（分化工程）と、を含む。
（拡大培養工程）
　拡大培養工程は、前記第２の態様の方法により行う。本工程により、ネフロン前駆細胞を所望の数まで効率よく増殖させることができる。
（分化工程）
　ネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドへの分化は、公知の方法により行うことができる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）で報告されている方法等を用いることができる。例えば、前記拡大培養工程で得られたネフロン前駆細胞の細胞塊を、３Ｔ３－Ｗｎｔ４細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、又はマウス胎仔腎細胞と共培養してもよい。あるいは、ネフロン前駆細胞の細胞塊を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む基礎培地を使用した半気相培養（好ましくは、気相－液相培養；Ｎａｔｕｒｅ，５２６，５６４－５６８（２０１５）参照）で培養してもよい。前記半気相培養で使用する培地は、ＧＳＫ３β阻害剤に加えて、ＦＧＦ９及びＦＧＦ２等を含んでいてもよい。基礎培地、ＧＳＫ３β阻害剤、ＦＧＦ２としては、上記と同様のものが挙げられる。好ましい基礎培地としてはＫＳＲが挙げられる。例えば、Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，１９，５１６－５１９（２０１６）で報告されている培地等を用いることができる。好ましいＧＳＫ３β阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。好ましいＦＧＦ２としてはヒトＦＧＦ２が挙げられる。好ましいＦＧＦ９としては、ヒトＦＧＦ９が挙げられる。ヒトＦＧＦ９としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２００１．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９は腎臓オルガノイドへの分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含される。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　分化工程における培養条件は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件を用いることができる。培養温度は、腎オルガノイドに分化誘導できる限り特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　本態様の製造方法により得られた腎臓オルガノイドは、腎疾患を有する対象に投与して、腎疾患を治療するために使用することができる。また、腎疾患を治療又は予防するための医薬組成物として使用することができる。
＜他の態様＞
　本発明は、前記第２の態様の方法で得られたネフロン前駆細胞又は前記第３の態様の製造方法で得られた腎臓オルガノイドを含む医薬組成物もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドを含む腎疾患治療剤もまた提供する。本発明は、前記ネフロン前駆細胞又は前記腎臓オルガノイドの治療有効量を、腎疾患を有する対象又は腎疾患のリスクを有する対象に投与する工程を含む、腎疾患を治療又は予防する方法もまた提供する。
　腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記ネフロン前駆細胞の投与方法としては、例えば、前記ネフロン前駆細胞をシート化して、対象の腎臓に貼付する方法；前記ネフロン前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液を対象の腎臓に移植する方法；前記ネフロン前駆細胞を三次元培養（例えば、Ｄｅｖ　Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ　１１，２０１２；２３（３）：６３７－６５１）し、得られた細胞塊を対象の腎臓に直接移植する方法；前記ネフロン前駆細胞をマトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた細胞塊を対象の腎臓に移植する方法等が挙げられる。移植部位は、腎臓内であれば特に限定されないが、好ましくは、腎被膜下である。腎疾患の治療又は予防を必要とする対象への前記腎臓オルガノイドの投与方法としては、対象の体内（例えば、腹腔内）に移植する方法等が挙げられる。
　治療又は予防対象となる腎疾患は、特に限定されないが、例えば、急性腎障害、慢性腎不全、慢性腎不全にまで至らない慢性腎臓病等が挙げられる。移植する前記ネフロン前駆細胞の細胞数又は前記腎臓オルガノイドの大きさは、移植後に生着できれば特に限定されず、疾患部位の大きさ、投与対象の体躯、年齢、性別等に合わせて、適宜調整することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
［材料と方法］
＜動物実験＞
　全ての動物実験は、京都大学動物実験委員会の承認を得て行った。Ｂ６；１２９－Ｓｉｘ２ｔｍ３（ＥＧＦＰ／ｃｒｅ／ＥＲＴ２）Ａｍｃ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｃ．から購入した（Ａ．　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　３　（２００８）　１６９－１８１．）。Ａｌｐｏｒｔ症候群モデルマウスであるＢ６．Ｃｏｌ４ａ５ｔｍ１Ｙｓｅｇ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｃ．から購入した（ＭＮ　Ｒｈｅａｕｌｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ａｍ　Ｓｏｃ　Ｎｅｐｈｒｏｌ．　１５　（２００４）　１４６６－１４７４．）。ＡＤＰＫＤモデルマウスであるＰｋｄ１－／－　（ｄｅｌ２－６）マウスは、藤田医科大学より提供いただいた（Ｓ　Ｍｕｔｏ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ．１１　（２００２）　１７３１－１７４２．）。京都大学ｉＰＳ細胞研究所の実験動物施設で、特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件で飼育した。マウスには、餌及び水を自由給餌した。
＜細胞培養＞
　ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）を用いた実験は、京都大学医学部大学院医学研究科の倫理委員会の承認を受け、施設審査委員会に従い、ｈｉＰＳＣの提供者のインフォームドコンセントを得た。ｈｉＰＳＣは、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした細胞培養プレート上に、Ｓｔｅｍ　Ｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（タカラバイオ株式会社）を用いたフィーダーフリー培養で維持した。細胞を０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５日毎に継代し、マイコプラズマ汚染の有無を定期的に検査した。マウスネフロン前駆細胞（ｍＮＰＣ）の回収及び維持培養は、既報のように実施した（Ｚ．　Ｌｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　１９　（２０１６）　５１６－５２９．；　Ｚ．　Ｌｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｋｉｄｎｅｙ　Ｏｒｇａｎｏｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｒｏｔｏｃ，　Ｈｕｍｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　２０１９：　ｐｐ．　１５１－１５９．）。
＜細胞増殖＞
　ｍＮＰＳＲ培地で拡大培養したｍＮＰＣ（Ｚ．　Ｌｉ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．　１９　（２０１６）　５１６－５２９）の細胞塊を、１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除いた。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで希釈し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
　低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０Ｘ１０４ｃｅｌｌｓのｍＮＰＣを播種した。５０μＬのｍＮＰＳＲに対して、ＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、ＢＸ７９５）、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（ＧＷ２５８０）、ＦＬＴ３阻害剤（ＡＳＰ２２１５）、ＤＹＲＫ１阻害剤（ＩＤ－８）、またはＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９）を、ＩＣ５０を中心に下記の濃度勾配を作製して添加した（ＭＲＴ６７３０７は、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、ＢＸ７９５は、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、ＧＷ２５８０は、７．５ｎＭ、１５ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ、１２０ｎＭ、２４０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、ＡＳＰ２２１５は、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．８ｎＭ、１．６ｎＭ、３．２ｎＭ、ＩＤ－８は、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、３０００ｎＭ、１００００ｎＭ、３００００ｎＭ、ＡＳ１５１７４９９は、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ）。ｍＮＰＳＲ培地単独とｍＮＰＳＲ培地にＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、ＢＸ７９５）、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（ＧＷ２５８０）、ＦＬＴ３阻害剤（ＡＳＰ２２１５）、ＤＹＲＫ１阻害剤（ＩＤ－８）、またはＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９）を添加した培地で懸濁した細胞を播種した９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始６時間後には細胞塊が形成された。
　静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ濃度のＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、ＢＸ７９５）、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（ＧＷ２５８０）、ＦＬＴ３阻害剤（ＡＳＰ２２１５）、ＤＹＲＫ１阻害剤（ＩＤ－８）、またはＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９）が添加されたｍＮＰＳＲ培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加添加した。培地を追加添加してから４８時間後に、各ウェルの細胞塊を１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％　ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
　実験に使用したｍＮＰＳＲ培地の組成を表１に示す。ｍＮＰＳＲ培地は、表１に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表１に示す試薬を添加して作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜継代培養＞
　ｍＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、図７および８）又はＤＭＳＯを添加した培地で培養したｍＮＰＣの細胞塊を１．５ｍＬチューブに移し、上清を完全に取り除いた。Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分間静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％　ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０ｘ１０４　ｃｅｌｌｓのｍＮＰＣを、ｍＮＰＳＲ培地に３０ｍＭのＴＢＫ１阻害剤又はＤＭＳＯを添加した培地で懸濁して播種した。細胞を播種した低接着９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始から４８時間後に、細胞を播種した際と同じ濃度のＴＢＫ１阻害剤又はＤＭＳＯが添加されたｍＮＰＳＲ培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加添加した。培地を追加添加してから４８時間後に、上記と同様の操作を行い、細胞数の測定と継代を行った。同様の方法で、４ｎＭのＢＸ７９５（図９および図１０）についても細胞数の測定と継代を行った。
＜腎オルガノイドの作製＞
　ｍＮＰＳＲ培地に３０nＭのＭＲＴ６７３０７または４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で、継代培養したｍＮＰＣの細胞塊を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にのせ、周囲の培地を除去した。次に、あらかじめ、２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２及び５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たした培養皿に、細胞塊がのったＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした。４８時間後に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲに培地交換した。以後、４８時間毎に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲで培地交換し、分化培養開始１０日目に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのまま４％ＰＦＡを用いて４℃で３時間固定した。固定後、ＰＢＳに置換し、４℃で一晩静置し、免疫染色を行った。
＜ｅｘ　ｖｉｖｏにおける細胞培養＞
　ｅｘ　ｖｉｖｏの実験に使用したＦＢＳ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２　Ｇｌｕｔａｍａｘ　ｍｅｄｉｕｍに、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％、ＰＳ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｉｎ）を５００Ｕ／ｍｌで添加して作製した。
　マウス胚仔（Ｅ１２．５）から腎臓を採取し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にのせ、周囲の培地を除去した。次に、あらかじめ、１００ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加したＦＢＳ培地で満たした培養皿に、前記腎臓がのったＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした。培養開始から２４～７２時間後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのまま４％ＰＦＡを用いて４℃で３時間固定した。固定後、ＰＢＳに置換し、４℃で一晩静置し、免疫染色を行った。
［結果］
＜ＴＢＫ１阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＴＢＫ１阻害剤として、ＭＲＴ６７３０７、ＢＸ７９５を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図１は、ｍＮＰＳＲ培地にＭＲＴ６７３０７を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報から、ＭＲＴ６７３０７のＩＣ５０は、１９ｎＭ付近と予測される。ＭＲＴ６７３０７は、ＩＣ５０付近の濃度で有意な細胞増殖促進効果が確認された。図２は、ｍＮＰＳＲ培地にＢＸ７９５を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報からＢＸ７９５のＩＣ５０は、２ｎＭ付近と予測される。ＢＸ７９５は、ＩＣ５０付近の濃度で有意な細胞増殖促進効果が確認された。
＜ＣＳＦ１Ｒ阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＣＳＦ１Ｒ阻害剤として、ＧＷ２５８０を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図３は、ｍＮＰＳＲ培地にＧＷ２５８０を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。ＧＷ２５８０は、２４０ｎＭ～１０００ｎＭで有意な細胞増殖促進効果が確認された。
＜ＦＬＴ３阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＦＬＴ３阻害剤として、ＡＳＰ２２１５を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図４は、ｍＮＰＳＲ培地にＡＳＰ２２１５を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報から、ＡＳＰ２２１５のＩＣ５０は、０．２９ｎＭ付近と予測される。ＡＳＰ２２１５は、３．２ｎＭ付近で有意な細胞増殖促進効果が確認された。これは、ＦＬＴ３阻害による増殖促進効果と推測された。
＜ＤＹＲＫ１阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＤＹＲＫ１阻害剤として、ＩＤ－８を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図５は、ｍＮＰＳＲ培地にＩＤ－８を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。ＩＤ－８は、５００ｎＭ付近で有意な細胞増殖促進効果が確認された。
＜ＳＴＡＴ６阻害剤のｍＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＳＴＡＴ６阻害剤として、ＡＳ１５１７４９９を用いて、ｍＮＰＣの細胞増殖アッセイを行った。図６は、ｍＮＰＳＲ培地にＡＳ１５１７４９９を添加した培地における細胞増殖アッセイの結果を示す。文献情報から、ＡＳ１５１７４９９のＩＣ５０は、２１ｎＭ付近と予測される。ＡＳ１５１７４９９は、２５～２００ｎＭ付近で有意な細胞増殖促進効果が確認された。
＜ｍＮＰＣの継代培養におけるＴＢＫ１阻害剤の増殖促進効果＞
　ＴＢＫ１阻害剤として、ＭＲＴ６７３０７及びＢＸ７９５を用いて、ｍＮＰＣの継代培養を行い、継代毎に細胞数を測定した。
　図７は、ｍＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｍＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣは、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したｍＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｍＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養することにより、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図８）。Ｐ１における累積細胞数は、Ｐ０で増殖させた細胞数をａ、Ｐ０の培養液の容量をｂ、継代に用いたＰ０の培養液の容量をｃ、Ｐ１で増殖させて得た細胞数をｄとした場合、Ｐ１の累積細胞数＝ａ×［ｄ／（ａ×ｃ／ｂ）］×ｂ／ｃで算出することができる。以降の継代培養における累積細胞数も同様に算出される。
　図９は、ｍＮＰＳＲ培地に４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｍＮＰＳＲ培地に４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で継代培養したｍＮＰＣは、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したｍＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｍＮＰＳＲ培地に４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で継代培養することにより、ｍＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図１０）。
＜ＴＢＫ１阻害剤が腎オルガノイド形成に及ぼす影響＞
　ｍＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７又は４ｎＭのＢＸ７９５を添加した培地で、４継代したｍＮＰＣから、腎オルガノイドを分化誘導した。その結果、いずれのＴＢＫ１阻害剤も腎オルガノイドの形成に影響しないことが確認された（図１１および１２）。
＜ＡＤＰＫＤモデルマウス由来ｍＮＰＣを用いた増殖アッセイ＞
　ｍＮＰＣとして、ＡＤＰＫＤ（常染色体優性多発性嚢胞腎）モデルマウスの胎仔腎から抽出したｍＮＰＣを用いたこと以外は、上記と同様に細胞増殖アッセイを行った。ＴＢＫ１阻害剤としては、３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を用いた。ＡＤＰＫＤモデルマウス由来ｍＮＰＣでも、ＭＲＴ６７３０７の添加により増殖が促進されることが確認された（図１３）。
＜Ａｌｐｏｒｔ症候群モデルマウス由来ｍＮＰＣを用いた増殖アッセイ＞
　ｍＮＰＣとして、Ａｌｐｏｒｔ症候群モデルマウスの胎仔腎から抽出したｍＮＰＣを用いたこと以外は、上記と同様に細胞増殖アッセイを行った。ＳＴＡＴ６阻害剤として１００ｎＭのＡＳ１５１７４８９を用い、ＤＹＲＫ１阻害剤として５００ｎＭのＩＤ－８を用いた。Ａｌｐｏｒｔ症候群モデルマウス由来ｍＮＰＣでも、ＡＳ１５１７４８９またはＩＤ－８の添加により増殖が促進されることが確認された（図１４）。
＜ｅｘ　ｖｉｖｏにおけるＴＢＫ１阻害剤の増殖促進効果＞
　胎生期のマウスから腎臓を取り出し、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌに腎臓を乗せ培養した。ＴＢＫ１阻害剤として、１００ｎＭのＭＲＴ６７３０７を用いた。ｅｘ　ｖｉｖｏにおいても、ＭＲＴ６７３０７の添加により増殖が促進されたことが確認された（図１５）。
（実施例２）
［材料と方法］
＜細胞増殖＞
　健常人由来ｈｉＰＳ細胞株である４Ａ６株（２０１Ｂ７由来）またはＡｌｐｏｒｔ症候群疾患特異的ｉＰＳ細胞株であるＡＳｅ１６株を国際公開第２０１８／２１６７４３号に記載の方法を用いて２４ウェルプレート上でヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣｓに分化誘導後、Ａｃｃｕｍａｘ　１００μＬを添加し３０分間、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターに静置した。３０分後、１０％ＦＢＳ　９００μＬで懸濁した。懸濁した細胞をＴＣ２０で細胞数を測定し、フローサイトメトリーに必要な細胞を１．５ｍｌチューブに移し、２００ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を除去して、１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓに対して、２％ＦＢＳ　１００μＬの比率となるように懸濁した。細胞を懸濁した２％ＦＢＳ　１００μＬに対して、蛍光物質であるＡＰＣが接合されたｈｕｍａｎ－ＨＧＦＲ／ｃＭＥＴ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ　３５８２Ａ）１０μＬを添加し、氷上で３０分静置した。３０分後、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再び、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した。この操作を２回行った。上清を除いた細胞を、ＤＡＰＩを１，０００倍で希釈した２％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍのＦｉｌｔｅｒに通した後、フロ－サイトメトリーを用いて、ｃＭＥＴ陽性の細胞を抽出した。抽出した細胞を、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓとなるように、ｈＮＰＳＲ培地単独およびｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地５０μＬで懸濁し、低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始６時間後には細胞塊が形成された。
　静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ培地を１００μＬずつ追加投与した。培地を追加投与してから４８時間後に、各ウェルから１００μＬの上清を除去し、新しい培地１００μＬを添加した。以後、同様の操作を４８時間毎に行った。浮遊培養開始後７日に、各ウェルの細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
　実験に使用したｈＮＰＳＲ培地の組成を表２に示す。ｈＮＰＳＲ培地は、表２に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表２に示す試薬を添加して作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜継代培養＞
　ｈＮＰＳＲ培地およびｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で培養したヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣｓ（ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ）の細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓのヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣｓを、ｈＮＰＳＲ培地単独とｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で懸濁し播種した。細胞を播種したＬｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ濃度の阻害剤が添加されたｈＮＰＳＲ培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加投与した。培地の追加投与後４８時間で、上記と同様の操作を行い、細胞数の測定と継代を行った。
［結果］
＜ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養におけるＴＢＫ１阻害剤の増殖促進効果＞
　ＴＢＫ１阻害剤として、ＭＲＴ６７３０７を用いて、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養を行い、継代毎に細胞数を測定した。
　図１６は、ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養した４Ａ６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣは、ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養した４Ａ６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養することにより、ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図１７）。
　図１８は、ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したときの細胞数の変化を示す。ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養したＡＳｅ１６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣは、ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したＡＳｅ１６株由来ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣと比較して、細胞増殖が促進された。また、ｈＮＰＳＲ培地に３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地で継代培養することにより、ｈＮＰＳＲ培地にＤＭＳＯを添加した培地で継代培養したときと比較して、累積細胞数が増加した（図１９）。
（実施例３）
　＜ヒトｉＰＳ細胞からのネフロン前駆細胞（ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ）の誘導＞
　健常人由来ｈｉＰＳ細胞株である４Ａ６株（２０１Ｂ７由来）を国際公開第２０１８／２１６７４３号に記載の方法を用いて２４ウェルプレート上でヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣｓに分化誘導後、Ａｃｃｕｍａｘ　１００μＬを添加し３０分間、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターに静置した。３０分後、１０％ＦＢＳ　９００μＬで懸濁した。懸濁した細胞をＴＣ２０で細胞数を測定し、フローサイトメトリーに必要な細胞を１．５ｍｌチューブに移し、２００ｇで５分間遠心した。遠心後、上清を除去して、１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓに対して、２％ＦＢＳ　１００μＬの比率となるように懸濁した。
＜ｃ－ＭＥＴ陽性細胞の純化＞
　上記のように誘導したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを懸濁した２％ＦＢＳ　１００μＬに対して、蛍光物質であるＡＰＣが接合されたｈｕｍａｎ－ＨＧＦＲ／ｃ－ＭＥＴ抗体（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ＦＡＢ　３５８２Ａ）１０μＬを添加し、氷上で３０分静置した。３０分後、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した後、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、再び、２００ｇで５分間遠心し、上清を除去した。この操作を２回行った。上清を除いた細胞を、ＤＡＰＩを１，０００倍で希釈した２％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍのＦｉｌｔｅｒに通した後、フロ－サイトメトリーを用いて、ｃ－ＭＥＴ陽性の細胞を抽出した。
　本明細書では、ｃ－ＭＥＴ陽性細胞の純化を行ったｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを「ｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ」という場合がある。
＜拡大培養用培地＞
　拡大培養用の試験培地として、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯ、ＤＭＳＯに溶解したＳＴＡＴ６阻害剤（ＳＴＡＴ６阻害剤：ＡＳ１５１７４９９（終濃度１００ｎＭ））、ＤＭＳＯに溶解したＴＢＫ１阻害剤（ＴＢＫ１阻害剤：ＭＲＴ６７３０７（終濃度３０ｎＭ））、ＤＭＳＯに溶解したＪＡＫ２阻害剤（ＪＡＫ２阻害剤：ＴＧ１０１３４８（最終濃度３ｎＭ））を添加した培地を用いた。
　ＣＦＹ培地の組成を表３に示す。ＣＦＹ培地は、表３に示すＢａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍに、表３に示す試薬を添加して作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜細胞増殖＞
　ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓとなるように、５０μＬの試験培地で懸濁し、低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に播種し、３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始６時間後には細胞塊が形成された。
　静置培養開始４８時間後に、細胞を播種した際と同じ培地を１００μＬずつ追加投与した。培地を追加投与してから４８時間後に、各ウェルから１００μＬの上清を除去し、新しい培地１００μＬを添加した。以後、同様の操作を４８時間毎に行った。浮遊培養開始後７日に、各ウェルの細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。
＜継代培養＞
　試験培地で培養したヒトｉＰＳ細胞由来ＮＰＣ（ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ）の細胞塊を１．５ｍｌチューブに移し、上清を完全に取り除き、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）３０μＬを添加し、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで１０分静置した。１０分後に、４７０μＬの１０％ＦＢＳで懸濁し、ＴＣ２０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で細胞数を測定した。低接着９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に、各ウェルあたり２．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓのｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを、試験培地で懸濁し播種した。細胞を播種したＬｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　９６ウェルプレートを３００ｇで３分間遠心して、３７℃、ＣＯ２　５％のインキュベーターで静置培養した。静置培養開始４８時間後に、試験培地を１００μＬずつそれぞれのウェルに追加投与した。培地の追加投与後４８時間で、上記と同様の操作を行い、細胞数の測定と継代を行った。
＜腎臓オルガノイドの作製＞
　試験培地で、継代培養したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの細胞塊を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にのせ、周囲の培地を除去した。次に、あらかじめ、２００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２及び５μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した５％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で満たした培養皿に、細胞塊がのったＴｒａｎｓｗｅｌｌをセットした。４８時間後に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲに培地交換した。以後、４８時間毎に、成長因子及び低分子化合物の添加されていない５％ＫＳＲで培地交換し、分化培養開始１０日目に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌのまま４％ＰＦＡを用いて４℃で３時間固定した。固定後、ＰＢＳに置換し、４℃で一晩静置し、免疫染色を行った。
＜ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現確認＞
　ＯＳＲ１遺伝子座にＧＦＰコード領域を導入したＯＳＲ１－ＧＦＰレポーター遺伝子を有し、且つＳＩＸ２遺伝子にｔｄＴｏｍａｔｏコード領域を連結したＳＩＸ２－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子が導入されたｈｉＰＳ細胞を樹立した。ＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現は、前記ｈｉＰＳ細胞を用いて培養試験を行い、ＧＦＰ及びｔｄＴｏｍａｔｏの各蛍光を蛍光顕微鏡で検出することで確認した。
＜腎臓オルガノイドのイメージング＞
　腎臓オルガノイドの明視野画像を、ＫＥＹＥＮＣＥ　ＢＺ－Ｘ７００又は共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ７１０）で撮影した。画像解析は、Ｉｍａｇｅ　Ｊ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５１ｊ８（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）を用いて行った（Ｃ．Ａ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．９（２０１２）６７１－６７５．）。
［結果］
＜ＳＴＡＴ６阻害剤のｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９、終濃度１００ｎＭ）を添加し、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを拡大培養し、細胞数を測定した（ｎ＝３，　ｔ－ｔｅｓｔ　＊＊ｐ＜０．０１）。１，２，３継代毎の細胞数を、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯのみを添加した場合と比較した。
　結果を図２０に示す。図２０は、各継代培養における細胞数を示す。図２０に示すように、ＳＴＡＴ６阻害剤を添加したＣＦＹ培地によって、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの増殖が促進された。　
＜ＳＴＡＴ６阻害剤添加ＣＦＹ培地で継代培養したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣからの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９、終濃度１００ｎＭ）を添加した培地を用いてｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養を行い、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図２１に示す（（ＰＯＤＸＬ；ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体、ＬＴＬ；Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管、ＣＤＨ１；　ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ））。ＣＦＹ培地に１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地において、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを継代培養できることが確認された。
＜ＳＴＡＴ６阻害剤のｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９、終濃度１００ｎＭ）を添加し、ｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを拡大培養し、細胞数を測定し、累積細胞数を算出した。１，２，３継代毎の細胞数および累積細胞数を、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯのみを添加した場合と比較した。
　結果を図２２および図２３に示す。図２２は、各継代培養における細胞数を示す（ｎ＝３，　ｔ－ｔｅｓｔ　＊ｐ＜０．０５）。図２３は、各継代培養における累積細胞数を示す（ｎ＝３，　ｔ－ｔｅｓｔ　＊ｐ＜０．０５，　＊＊ｐ＜０．０１）。ＣＦＹ培地にＡＳ１５１７４９９を添加した培地で培養した場合、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地での培養と比較して、いずれの継代においても細胞増殖が促進された。この結果から、ＳＴＡＴ６阻害剤を添加することにより、ＣＦＹ培地におけるｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの増殖促進効果が向上することが確認された。
＜ＳＴＡＴ６阻害剤添加ＣＦＹ培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣからの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤（ＡＳ１５１７４９９、終濃度１００ｎＭ）を添加した培地を用いてｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養を行い、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図２４に示す（（ＰＯＤＸＬ；ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体、ＬＴＬ；　Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管、ＣＤＨ１；　ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ））。ＣＦＹ培地に１００ｎＭのＡＳ１５１７４９９を添加した培地において、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地にＳＴＡＴ６阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを継代培養できることが確認された。
＜ＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤のｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、終濃度３０ｎＭ）またはＪＡＫ２阻害剤（ＴＧ１０１３４８、終濃度３ｎＭ）を添加し、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを拡大培養し、細胞数を測定した（ｎ＝３，　Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　Ｔｕｋｅｙ　ｔｅｓｔ　＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。１，２継代毎の細胞数を、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯのみを添加した場合と比較した。
　結果を図２５に示す。図２５は、各継代培養における細胞数を示す。図２５に示すように、ＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤を添加したＣＦＹ培地によって、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの増殖が促進された。
＜ＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤を添加したＣＦＹ培地で継代培養したｈｉＰＳＣ－ＮＰＣからの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、終濃度３０ｎＭ）またはＪＡＫ２阻害剤（ＴＧ１０１３４８、終濃度３ｎＭ）を添加した培地を用いてｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養を行い、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図２６および図２７に示す（（ＰＯＤＸＬ；ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体、ＬＴＬ；　Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管、ＣＤＨ１；　ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ））。図２６は、ＴＢＫ１阻害剤の結果を示す。図２７は、ＪＡＫ２阻害剤の結果を示す。ＣＦＹ培地に終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７または終濃度３ｎＭのＴＧ１０１３４８を添加した培地において、１継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを継代培養できることが確認された。
＜ＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤のｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣ増殖促進効果＞
　ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、終濃度３０ｎＭ）またはＪＡＫ２阻害剤（ＴＧ１０１３４８、終濃度３ｎＭ）を添加し、ｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを拡大培養し、細胞数を測定し、累積細胞数を算出した。１，２，３継代毎の細胞数および累積細胞数を、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯのみを添加した場合と比較した。
　結果を図２８および図２９に示す。図２８は、各継代培養における細胞数を示す（ｎ＝３，Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　Ｔｕｋｅｙ　ｔｅｓｔ,＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。図２９は、各継代培養における累積細胞数を示す（ｎ＝３，Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　Ｔｕｋｅｙ　ｔｅｓｔ,＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤を添加した培地で培養した場合、ＣＦＹ培地にＤＭＳＯを添加した培地での培養と比較して、いずれの継代においても細胞増殖が促進された。この結果から、ＴＢＫ１阻害剤またはＪＡＫ２阻害剤を添加することにより、ＣＦＹ培地におけるｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの増殖促進効果が向上することが確認された。
＜ＴＢＫ１阻害剤添加ＣＦＹ培地で継代培養したｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣからの腎臓オルガノイドの作製＞
　ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤（ＭＲＴ６７３０７、終濃度３０ｎＭ）を添加した培地を用いてｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣの継代培養を行い、２継代目の細胞から腎臓オルガノイドの作製を試みた。
　結果を図３０に示す（（ＰＯＤＸＬ；ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ；糸球体、ＬＴＬ；　Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎ；　近位尿細管、ＣＤＨ１；　ＣＡＤＨＥＲＩＮ１；遠位尿細管）（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ；　１００μｍ））。ＣＦＹ培地に終濃度３０ｎＭのＭＲＴ６７３０７を添加した培地において、２継代目の細胞から腎臓オルガノイドが形成された。この結果から、ＣＦＹ培地にＴＢＫ１阻害剤を添加した培地を用いて、腎臓オルガノイドの形成能を維持したまま、ｃ－ＭＥＴ（＋）－ｈｉＰＳＣ－ＮＰＣを継代培養できることが確認された。
　本発明によれば、効率よくネフロン前駆細胞を拡大培養することが可能なネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地、前記培地を用いたネフロン前駆細胞の拡大培養方法、及び前記拡大培養方法で得られたネフロン前駆細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法が提供される。本発明の方法で得られたネフロン前駆細胞及び腎臓オルガノイドは、腎疾患の治療又は予防に適用することができる。

Claims (15)

  1. 　ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、
    　ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種
    　を含む培地。
  2. 　ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＢＭＰ７からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、
    　請求項１に記載の培地。
  3. 　ネフロン前駆細胞を拡大培養するための培地であって、
    　ＴＢＫ１阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＤＹＲＫ１阻害剤、及びＳＴＡＴ６阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種と、
    　ＦＧＦ２、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、及びＢＭＰ７と、
    　を含む培地。
  4. 　前記ＡＬＫ阻害剤は、Ａ８３－０１である、請求項２または３に記載の培地。
  5. 　前記ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、及びＤＭＨ１からなる群より選択される少なくとも１種である、
    　請求項２～４のいずれか１項に記載の培地。
  6. 　ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＦＧＦ９をさらに含む、
    　請求項１に記載の培地。
  7. 　前記ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である、請求項２～６のいずれか１項に記載の培地。
  8. 　前記ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項２～７のいずれか１項に記載の培地。
  9. 　前記ＴＢＫ１阻害剤がＭＲＴ６７３０７またはＢＸ７９５である、請求項１～８のいずれか１項に記載の培地。
  10. 　前記ＣＳＦ１Ｒ阻害剤が、ＧＷ２５８０である、請求項１～９のいずれか１項に記載の培地。
  11. 　前記ＦＬＴ３阻害剤が、ＡＳＰ２２１５である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の培地。
  12. 　前記ＤＹＲＫ１阻害剤が、ＩＤ－８である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の培地。
  13. 　前記ＳＴＡＴ６阻害剤が、ＡＳ１５１７４９９である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の培地。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の培地を用いて、ネフロン前駆細胞を拡大培養する方法。
  15. 　請求項１４に記載のネフロン前駆細胞を拡大培養する方法により、ネフロン前駆細胞を拡大培養する工程と、
    　前記拡大培養したネフロン前駆細胞を腎臓オルガノイドに分化させる工程と、
    　を含む、腎臓オルガノイドの製造方法。
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