KR102594102B1 - 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 - Google Patents

중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 다음의 공정 (i) ~ (vi)을 포함하는 방법이다.
(i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP4, GSK-3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK(Rho-kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
(vi) 공정 (v)에서 얻어진 세포를 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하고, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 유도하는 공정.

Description

중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법 및 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도 방법
본 발명은 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도하는 방법에 관한 것이다.
현재, 일본에 있어서 만성 신장병(CKD)의 환자 수는 약 1,300만 명으로 추계되고 있으며, 새로운 국민병이라고 불리고 있다. 만성 신장병에 대한 근치(根治)적 치료법은 적으며, 그 진행에 따라 투석 요법이 필요한 말기 만성 신부전 환자는 30만 명 이상이며, 의학적뿐만 아니라 의료 경제적으로도 큰 문제가 되고 있다. 말기 만성 신부전을 포함한 만성 신장병의 근치 요법으로서 신장 이식을 들 수 있지만, 심각한 도너 장기 부족 때문에 수요에 대하여 공급이 전혀 따라잡지 못하고 있는 상태이다.
신장은 태생 초기의 조직인 중간 중배엽에서 유래하며, 척추동물에서는 중간 중배엽으로부터 전신(前腎), 중신(中腎), 후신(後腎)의 3개의 신장이 형성되고, 포유류에서는 후신이 성체의 신장이 된다. 후신은 간엽(間葉)이라고 불리는 성체 신장의 네프론과 간질로 장래 분화되는 조직과 요관아(尿管芽)라고 불리는 성체 신장의 집합관으로부터 하부의 신우, 요관, 방광의 일부로 장래 분화되는 조직의 2개의 조직의 상호 작용으로 발생한다. 게다가, 후신 간엽 중에 네프론을 구성하는 사구체와 여러 종류의 요세관 상피세포로 분화되는 다분화능을 갖는 네프론 전구 세포의 존재가 개시되어 있다(비특허문헌 1, 2).
인간 인공 다능성 줄기(iPS) 세포나 인간 배성 줄기(ES) 세포로부터 네프론 전구 세포를 고효율로 분화 유도하는 방법이 확립되면, 향후 삼차원의 신장의 재구축에 의한 신장 이식의 도너 부족의 해결이나 사구체와 요세관 세포의 공급원으로서 세포 요법에 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 사구체와 요세관 세포나 이들을 포함하는 신장 조직을 이용한 약제 신독성 평가계나 질환 특이적 iPS 세포로부터 제작되는 신장 세포와 신장 조직을 이용한 질환 모델 제작이나 치료약 개발 등의 연구로의 발전이 기대된다.
인간 iPS 세포나 인간 ES 세포로부터 네프론 전구 세포를 분화 유도하는 방법이 다수 보고되어 있으나(비특허문헌 3~6), 배상체(embryoid body; EB)를 이용하고 있기 때문에 분화 유도 효율이 낮은 점(비특허문헌 3)과 발생의 각 단계를 정확하게 재현하고 있는지 여부가 불분명하다는 점이 문제였다(비특허문헌 4~6).
또한, 본 발명자들의 그룹은 중간 중배엽 세포를 TGFβ 신호 자극제 및 BMP 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포의 제조 방법에 대하여 개시하고 있으나(특허문헌 1), 보다 효율적으로 신장 전구 세포를 분화 유도할 수 있는 방법이 요구되고 있었다.
특허문헌 1: WO2014/200115
비특허문헌 1: Osafune K., et al., Development 2006; 133: 151-61. 비특허문헌 2: Kobayashi A., et al., Cell Stem Cell 2008; 3: 169-81. 비특허문헌 3: Taguchi A., et al., Cell Stem Cell. 2014; 14: 53-67. 비특허문헌 4: Takasato M., et al., Nat Cell Biol.2014; 16: 118-26. 비특허문헌 5: Takasato M., et al., Nature. 2015; 526: 564-568. 비특허문헌 6: Morizane R., et al., Nat. Biotechnol. 2015; 33: 1193-1200.
본 발명의 과제는 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 효율적으로 분화 유도하는 방법을 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 다능성 줄기세포로부터 유도한 중간 중배엽 세포를 다시 신장 전구 세포로 분화 유도하는 공정을 포함하는, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 접착 배양을 행함으로써, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉 본 발명은 다음의 특징을 갖는다 :
[1] 중간 중배엽 세포를 GSK(글리코겐 합성 효소 키나아제)-3β 억제제 및 FGF(섬유아세포 증식 인자)9를 포함하는 배지에서 접착 배양하고, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 유도하는 공정을 포함하는, 신장 전구 세포의 제조 방법.
[2] 상기 신장 전구 세포가 SIX2 양성 세포인, [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 중간 중배엽 세포가 OSR1 양성 세포인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] GSK-3β 억제제가 CHIR99021인, [1] ~ [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[5] 상기 배지는 ROCK 억제제를 더 포함하는, [1] ~ [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[6] 상기 접착 배양은 세포 외 기질로 코팅된 배양 용기를 이용하여 수행되는, [1] ~ [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[7] 상기 세포 외 기질은 라미닌 511의 E8 단편인, [6]에 기재된 방법.
[8] 상기 중간 중배엽 세포는 다능성 줄기세포로부터 유도되는 중간 중배엽 세포인, [1] ~ [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9] 상기 중간 중배엽 세포는 다음의 공정 (i) ~(v)를 포함하는 방법으로 제조되는 중간 중배엽 세포인, [8]에 기재된 방법:
(i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP(골형성 단백질)4, GSK-3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정.
[10] 공정 (v)의 배지는 BMP 억제제를 더 포함하는, [9]에 기재된 방법.
[11] 상기 다능성 줄기세포는 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, [8] 또는 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[12] 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인, [11]에 기재된 방법.
[13] 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 다음의 공정 (i) ~ (vi)을 포함하는 방법:
(i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP4, GSK-3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK(Rho-kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
(vi) 공정 (v)에서 얻어진 세포를 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하고, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 유도하는 공정.
[14] 공정 (v)의 배지는 BMP 억제제를 더 포함하는, [13]에 기재된 방법.
[15] 상기 신장 전구 세포는 SIX2 양성 세포인, [13] 또는 [14]에 기재된 방법.
[16] 상기 공정 (v)에서 얻어진 세포는 OSR1 양성 세포인, [13] ~ [15] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[17] 상기 GSK-3β 억제제는 CHIR99021인, [13] ~ [16] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[18] 상기 공정 (vi)의 배지는 ROCK 억제제를 더 포함하는, [13] ~ [17] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[19] 상기 배양은 세포 외 기질로 코팅된 배양 용기를 이용하여 수행되는, [13] ~ [18] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[20] 상기 세포 외 기질은 라미닌 511의 E8 단편인, [19]에 기재된 방법.
[21] 상기 다능성 줄기세포는 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인, [13] ~ [20] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[22] 상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인, [21]에 기재된 방법.
[23] [1] ~ [22] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조되는 신장 전구 세포.
[24] [1] ~ [22] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조되는 신장 전구 세포를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드.
[25] [1] ~ [22] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조되는 신장 전구 세포 또는 이를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 약학 조성물.
[26] [1] ~ [22] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조되는 신장 전구 세포 또는 이를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 신질환 치료제.
본 발명의 방법에 의하면, 접착 배양으로 배양을 수행할 수 있기 때문에, 80% 이상의 고효율로 인간 iPS 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도가 가능하다. 게다가, 후신 간엽 네프론 전구 세포를 파생시키는 후방 배반엽(胚盤葉) 상층, 후기 체절(體節) 중배엽 세포, 후방 중간 중배엽 세포의 각 발생 분화 단계를 정확하게 재현한 방법이기 때문에, 각 단계에서의 세포의 해석도 가능하다.
후신은 성체 신장을 형성하는 태아 신장 조직의 하나이며, 신장 재생에 있어서 필수적인 성분이다. 또한, 후신 네프론 전구 세포나 여기에서 파생하는 사구체, 요세관에 발생하는 신질환은 많기 때문에, 신질환 모델 제작에 있어서도 본 발명의 방법은 유용하다. 따라서, 본 발명의 방법은 신질환에 대한 치료 방법이나 치료약 탐색의 관점에서도 유용하다.
도 1은 인간 iPS 세포로부터 분화 유도된 후기 후방 배반엽 상층, 중배엽 계보 후기 원시 선조(線條), 후신 계보(系譜) 후기 원시 선조, 후기 후방 중간 중배엽 및 네프론 전구 세포(신장 전구 세포)를 나타내는 면역 세포 염색의 결과를 나타낸 도면(사진)이다. 후기 후방 중간 중배엽 및 네프론 전구 세포에 대해서는 마커 양성 세포의 비율도 FACS로 나타내었다.
도 2는 인간 iPS 세포 유래 신장 전구 세포를 마우스 태자(胎仔) 신장과 공배양하여 얻어진 신장 오가노이드의 염색 결과를 나타낸 사진이다. 도면에서, 포도칼릭신(Podocalyxin)은 사구체의 마커를, LTL은 근위 요세관의 마커를, CDH1은 원위 요세관의 마커를, CDH6은 근위 요세관의 마커를, 네프린(Nephrin)은 사구체의 마커를 나타내고, 또한 스케일 바는 50 μm을 나타낸다.
도 3은 인간 iPS 세포 유래 신장 전구 세포를 배양하여 얻어진 신장 오가노이드의 명시야 상(像) 및 면역 염색 상(像)을 나타낸 사진이다. 도면에서, 포도칼릭신은 사구체의 마커를, LTL은 근위 요세관의 마커를, CDH1 및 BRN1은 원위 요세관과 헨레 고리(Loop of Henle)의 마커를 나타낸다. 도리코스 비플로루스 아글루티닌(Dolicos biflorus agglutinin, DBA)은 원위 요세관 마커이다.
본 발명을 아래에 상세하게 설명한다.
<중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도>
본 발명은 중간 중배엽 세포를 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정(신장 전구 세포 분화 유도 공정이라고도 함)을 포함하는, 신장 전구 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 중간 중배엽 세포란 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양함으로써 신장 전구 세포로 유도되는 임의의 세포를 의미한다. 중간 중배엽 세포를 취득하는 방법으로는, 예를 들어 마우스 및 인간의 다능성 줄기세포로부터 중간 중배엽 세포로의 분화 유도 방법이 공지되어 있다(Biochem Biophys Res Commun. 393: 877-82(2010), Nat Commun. 4: 1367(2013), WO2012/011610 및 특허문헌 1). 중간 중배엽 세포를 특징짓는 마커로서 OSR1이 알려져 있으며, 본 발명의 방법에서 사용되는 중간 중배엽 세포의 예로 OSR1 양성의 중간 중배엽 세포를 들 수 있다. 예를 들면, OSR1 프로모터 제어하에 도입된 리포터 유전자(예를 들어, GFP)를 갖는 다능성 줄기세포(예를 들어, 하기 실시예에 기재된 OSR1-GFP 리포터 인간 iPS 세포)를 배양하고, 해당 리포터 유전자의 발현을 지표로 해당 분야에서의 공지의 방법(예를 들어, 세포 분리기(sorter)를 이용하는 방법)에 의해 OSR1 양성의 중간 중배엽 세포를 단리(單離)할 수 있다. 또한, 정량적 RT-PCR(Nat Commun 4, 1367,(2013)) 등의 유전자 발현을 분석하는 방법에 의해, 중간 중배엽 세포에 있어서의 OSR1의 발현을 확인할 수도 있다. 본 발명에 있어서, OSR1 양성의 중간 중배엽 세포에는 OSR1 단백질을 발현하고 있는 세포 및 OSR1 프로모터 제어하에 있는 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 세포가 포함된다. 본 발명에 있어서, OSR1에는 NCBI의 등록 번호(accession No.)로서, 인간의 경우 NM_145260.2, 마우스의 경우 NM_011859.3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 및 해당 유전자에 암호화되는 단백질 및 이들의 기능을 갖는 천연에 존재하는 돌연변이체가 포함된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 중간 중배엽 세포는 SIX2가 음성이고, OSR1, HOX11, WT1이 양성인 세포이다.
본 발명에 있어서, 신장 전구 세포는 네프론 전구 세포와 동등한 세포로서 취급되며, 시험관 내(in vitro)에서 신장의 사구체모양 구조나 요세관모양 구조 등의 기관 구조로 분화할 수 있는 세포이며, 기관 구조로의 분화능은 예를 들어, 문헌[Osafune K, et al.(2006), Development 133: 151-61]에 기재된 방법에 의해 평가할 수 있다. 신장 전구 세포로서의 상태를 유지하기 위한 특징적인 인자로서 SIX2가 알려져 있으며(Cell Stem Cell 3: 169-181(2008)), 본 발명의 방법으로 유도되는 신장 전구 세포의 예로서, SIX2 양성의 신장 전구 세포를 들 수 있다. 예를 들어, SIX2 프로모터 제어하에 도입된 리포터 유전자(예를 들어, tdTomato)를 갖는 다능성 줄기세포(예를 들어, 하기 실시예에 기재된 OSR1-GFP/SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포)를 배양하고, 해당 리포터 유전자의 발현을 지표로 해당 분야에서 공지의 방법(예를 들어, 세포 분리기(sorter)를 이용하는 방법)에 의해, SIX2 양성의 신장 전구 세포를 단리할 수 있다. 또, 정량적 RT-PCR(NatCommun 4, 1367,(2013)) 등의 유전자 발현을 분석하는 방법에 의해, 신장 전구 세포에 있어서의 SIX2의 발현을 확인할 수도 있다. 본 발명에 있어서, SIX2 양성의 신장 전구 세포에는 SIX2 단백질을 발현하고 있는 세포, 및 SIX2 프로모터 제어하에 있는 유전자로 암호화되는 단백질을 발현하는 세포가 포함된다. 본 발명에 있어서, SIX2에는 NCBI의 등록 번호로서, 인간의 경우 NM_016932.4, 마우스의 경우 NM_011380.2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 및 해당 유전자로 암호화되는 단백질 및 이들 기능을 갖는 천연에 존재하는 돌연변이체가 포함된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로 유도되는 신장 전구 세포는 OSR1이 양성이며, 아울러 HOX11, WT1, SIX2 및 SALL1이 양성인 세포이다.
본 발명에 있어서, 중간 중배엽 세포 또는 신장 전구 세포는 다른 세포종이 포함되는 세포 집단으로 제공될 수 있으며, 순화된 집단일 수도 있다. 바람직하게는, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 10%, 20%, 28% 또는 30% 이상 해당 세포가 포함된 세포 집단이다. 순화는 상기 마커를 지표로 FACS 등의 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 접착 배양이란 세포가 배양 기재에 접착된 상태로 배양되는 것을 의미하며, 예를 들어 코팅 처리된 배양 접시에서 배양하는 것을 의미한다. 코팅제로는 세포 외 기질이 바람직하며, 예를 들어 콜라겐, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알루론산, 테나신, 엔탁틴, 엘라스틴, 피브린 및 라미닌과 같은 물질 또는 이들의 단편을 들 수 있다. 이들 세포 외 기질은 조합하여 이용할 수 있고, 예를 들어 BD Matrigel(상표) 등의 세포로부터의 조제물일 수도 있다. 세포 외 기질은 바람직하게는 라미닌 또는 그 단편이다. 본 발명에 있어서 라미닌이란 α 사슬, β 사슬, γ 사슬을 각각 1개씩 가지는 헤테로 삼량체 구조를 갖는 단백질이며, 서브유닛 사슬의 조성이 상이한 동형이 존재하는 세포 외 매트릭스 단백질이다. 라미닌은 5종의 α 사슬, 4종의 β 사슬 및 3종의 γ 사슬의 헤테로 삼량체의 조합으로 약 15종류의 동형을 갖는다. 특히 한정되지 않지만, 예를 들어, α 사슬은 α1, α2, α3, α4 또는 α5이며, β 사슬은 β1, β2, β3 또는 β4이며, 그리고 γ 사슬은 γ1, γ2 또는 γ3이 예시된다. 라미닌은 더욱 바람직하게는 α5, β1 및 γ1로 이루어지는 라미닌 511이다(Nat Biotechnol 28, 611-615(2010)). 라미닌은 단편일 수 있으며, 인테그린 결합 활성을 갖고 있는 단편이라면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 엘라스타아제에 의해 소화되어 얻어지는 단편인 E8 단편(라미닌 511E8)(EMBO J., 3: 1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987, WO2011/043405)일 수 있다. 라미닌 511E8은 시판되고 있으며, 예를 들어 닛피 주식회사 등으로부터 구입 가능하다.
신장 전구 세포 분화 유도 공정에 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 예를 들어, IMDM 배지, Medium 199 배지, 이글의 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지( Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) 배지, 함(Ham's) F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔의(Fischer's) 배지 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 배지에는 혈청(예를 들어, 소 태아 혈청(FBS))이 함유될 수 있거나, 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 예를 들어 알부민, 트랜스페린, 녹아웃 혈청 대체물(KnockOut Serum Replacement, KSR)(ES 세포 배양시의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 1개 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 및 이들의 동등물 등의 1개 이상의 물질도 함유할 수 있다. ReproFF2(리프로 셀) 등 미리 줄기세포 배양용으로 최적화된 배지를 사용할 수도 있다. 또한, 신장 전구 세포 분화 유도 공정에 사용되는 배지에는 후술하는 Y-27632 등의 ROCK 억제제가 포함될 수 있다.
신장 전구 세포 분화 유도 공정에서 사용되는 GSK-3β 억제제는 GSK-3β의 기능, 예를 들어 키나아제 활성을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 인디루빈 유도체인 BIO(별명, GSK-3β 억제제 IX; 6-브로모인디루빈-3'-옥심), 말레이미드 유도체인 SB216763(3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), 페닐-α-브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 억제제 VII(α,4-디브로모아세토페논), 세포막 투과형의 인산화 펩티드인 L803-mts(별명, GSK-3β 펩티드 억제제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 높은 선택성을 갖는 CHIR99021(Nature(2008) 453: 519-523)을 들 수 있다. 이들 화합물은 예를 들어, Stemgent사, Calbiochem사, Biomol사 등으로부터 입수 가능하며, 또한 자체 제작할 수도 있다. 본 공정에서 이용하는 바람직한 GSK-3β 억제제로는 CHIR99021을 들 수 있다. 본 공정에서 이용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라서 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 10 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 μM 내지 3 μM이며, 특히 바람직하게는 0.5 μM 내지 1.5 μM이다.
신장 전구 세포 분화 유도 공정에서 사용되는 FGF9는 인간 FGF9가 바람직하며, 인간 FGF9로는 예를 들어, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 등록 번호: NP_002001.1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. FGF9는 분화 유도 활성을 갖는 한, 그 단편 및 기능적 개변체가 포함된다. FGF9는 시판되고 있는 것을 사용할 수 있으며, 세포로부터 정제된 단백질이나 유전자 재조합으로 생산된 단백질을 사용할 수도 있다. 이 공정에서 이용되는 FGF9의 농도는 예를 들어, 1 ng/ml 내지 500 ng/ml, 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 또는 5 ng/ml 내지 25 ng/ml이다.
신장 전구 세포 분화 유도 공정의 배양 일수는 장기간 배양하는 것에 의해 신장 전구 세포의 제조 효율에 특히 영향이 없기 때문에 상한은 없지만, 예를 들어 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상을 들 수 있다. 신장 전구 세포 분화 유도 공정에 있어서, 배양 온도는 다음으로 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행되며, CO2 농도는 바람직하게는 약 2 ~ 5%이다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 중간 중배엽 세포는 다능성 줄기세포로부터 유도되는 중간 중배엽 세포이다. 이 경우, 유도되는 중간 중배엽 세포를 일단 단리하고, 단리된 중간 중배엽 세포를 본 발명의 배양 공정에 의해 신장 전구 세포로 유도할 수도 있다. 또는, 다능성 줄기세포로부터 중간 중배엽 세포를 유도하고, 중간 중배엽 세포를 단리하지 않고 그대로 본 발명의 배양 공정에 제공함으로써 신장 전구 세포로 유도할 수도 있다.
중간 중배엽 세포를 단리할 경우, 내재성의 OSR1 프로모터에 의해 발현이 제어되는 리포터 유전자를 갖는 다능성 줄기세포를 사용할 수도 있다. 다능성 줄기세포의 OSR1 프로모터 제어하에 리포터 유전자를 도입하는 방법으로는 예를 들어, BAC 벡터 등을 이용한 상동 재조합을 들 수 있고, WO2012/011610 등에 기재되어 있다. 또한, 유도된 신장 전구 세포를 단리하기 위하여, SIX2 프로모터에 의해 발현이 제어되는 리포터 유전자를 갖는 다능성 줄기세포를 사용할 수 있으며, 상기와 마찬가지의 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 사용되는 리포터 유전자로는 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), tdTomato, 세포 표면 단백질 등의 공지의 리포터 단백질을 암호화하는 유전자를 들 수 있다. 이들 다능성 줄기세포로부터 유도되는 중간 중배엽 세포 또는 신장 전구 세포는 해당 리포터 단백질의 발현을 지표로 하여 세포 분리기(sorter)를 이용하는 방법, 해당 세포 표면 단백질에 대한 항체를 사용하여 자기 비즈를 이용하여 자성에 의해 세포를 선별하는 방법(예를 들어, MACS), 해당 항체 등이 고정화된 담체(예를 들어, 세포 농축 컬럼)을 이용하는 방법 등 해당 분야에 공지된 방법을 이용하여 단리될 수 있다.
본 발명에 있어서 다능성 줄기세포란 생체에 존재하는 많은 세포로 분화 가능한 다능성을 가지는 한편 증식능도 겸비한 줄기세포이며, 본 발명에서 사용되는 중간 중배엽 세포로 유도되는 임의의 세포가 포함된다. 다능성 줄기세포에는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 배성 줄기(ES) 세포, 핵 이식에 의해 얻어지는 클론 배(胚) 유래의 배성 줄기(ntES) 세포, 정자 줄기세포("GS 세포"), 배성 생식 세포("EG 세포"), 인공 다능성 줄기(iPS) 세포, 배양 섬유아세포나 골수 줄기세포 유래의 다능성 세포(Muse 세포) 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기세포는 제조 공정에 있어서 배(胚), 난자 등을 파괴하지 않고 입수 가능하다는 관점에서 iPS 세포이며, 더욱 바람직하게는 인간 iPS 세포이다.
iPS 세포의 제조 방법은 해당 분야에 공지되어 있으며, 임의의 체세포로 초기화 인자를 도입함으로써 제조될 수 있다. 여기서, 초기화 인자란 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 베타 카테닌(beta-catenin), Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a 2, Tbx3 또는 Glis1 등의 유전자 또는 유전자 산물이 예시되며, 이들 초기화 인자는 단독일 수 있고, 조합하여 이용할 수도 있다. 초기화 인자의 조합으로는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al.(2008), Nat.Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al.(2008), Stem Cells. 26: 2467-2474, Huangfu D, et al.(2008), Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275, Shi Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al.(2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479, Marson A,(2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al.(2009), Nat. Cell Biol. 11: 197-203, R.L.Judson et al.,(2009), Nat. Biotechnol., 27: 459-461, Lyssiotis CA, et al.(2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 8912-8917, Kim JB, et al.(2009), Nature. 461: 649-643, Ichida JK, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503, Heng JC, et al.(2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74, Han J, et al.(2010), Nature. 463: 1096-100, Mali P, et al.(2010), Stem Cells. 28: 713-720, Maekawa M, et al.(2011), Nature. 474: 225-9.에 기재된 조합이 예시된다.
체세포에는 비한정적으로, 태아(태자)의 체세포, 신생아(신생자)의 체세포 및 성숙하고 건전한 또는 질환성의 체세포가 모두 포함되며, 또한 초대 배양 세포, 계대 세포 및 주화(株化) 세포가 모두 포함된다. 구체적으로는, 체세포는 예를 들어, (1) 신경 줄기세포, 조혈 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 치수(齒髓) 줄기세포 등의 조직 줄기세포(체성 줄기세포), (2) 조직 전구 세포,(3) 혈액 세포(말초혈 세포, 제대혈 세포 등), 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유아세포(피부 세포 등), 모(毛)세포, 간세포, 위점막 세포, 장(腸)세포, 비장 세포, 췌장 세포(췌장 외분비 세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신장 세포 및 지방 세포 등의 분화된 세포 등이 예시된다.
또한, iPS 세포를 이식용 세포의 재료로서 이용하는 경우, 거절 반응이 일어나지 않는다는 관점에서, 이식처의 개체의 HLA 유전자형이 동일 또는 실질적으로 동일한 체세포를 이용하는 것이 바람직하다. 여기서, "실질적으로 동일"이란 이식한 세포에 대하여 면역 억제제에 의해 면역 반응을 억제할 수 있는 정도로 HLA 유전자형이 일치하고 있는 것이며, 예를 들어 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개의 유전자 좌 또는 HLA-C를 더한 4개의 유전자 좌가 일치하는 HLA형을 갖는 체세포이다.
< 다능성 줄기세포로부터 중간 중배엽 세포로의 분화 유도>
본 발명에 있어서, 다능성 줄기세포로부터 중간 중배엽 세포로의 분화 유도시에 있어서, 다음의 공정을 포함하는 방법을 이용할 수 있다.
(i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP(골형성 단백질) 4, GSK-3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
(iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정.
아래에 각 공정에 대하여 다시 설명한다.
(i) 다능성 줄기세포를 FGF2 , BMP4 , GSK - 3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정
이 공정에서는, 다능성 줄기세포로부터 후기 후방 배반엽 상층이 유도된다. 후기 후방 배반엽 상층은 CDX1, OCT4, NANOG, E-CDH(CDH1) 중 적어도 1개 이상의 마커가 양성인 세포로서 특징지어지며, 바람직하게는 이들 모든 마커가 양성인 세포로서 특징지어진다. 후기 후방 배반엽 상층은 또한 EOMES 및 BRACHYURY가 음성인 것이 바람직하다.
공정 (i)에서는, 다능성 줄기세포를 해당 분야에 공지된 임의의 방법으로 분리하고, 바람직하게는 접착 배양에 의해 배양한다.
다능성 줄기세포의 분리 방법으로는 예를 들어, 역학적 분리나 프로테아제 활성과 콜라게나아제 활성을 갖는 분리 용액(예를 들어, Accutase(TM) 및 Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)을 들 수 있음) 또는 콜라게나아제 활성만을 갖는 분리 용액을 이용한 분리를 들 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 활성과 콜라게나아제 활성을 갖는 분리 용액을 이용하여 해리(解離)하고, 역학적으로 작게 단일 세포로 분산하는 방법이다. 공정 (i)에서 이용하는 인간 다능성 줄기세포로는 사용되는 디쉬(dish)에 대하여 70% ~ 80% 컨플루언트될 때까지 배양된 콜로니를 이용하는 것이 바람직하다.
공정 (i)에 있어서 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 FGF2, BMP4, GSK-3β 억제제 및 레티노산 또는 그 유도체를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 상술한 바와 같은 기초 배지를 사용할 수 있고, 혈청이 함유될 수 있거나, 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 혈청 대체물, 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수도 있다.
공정 (i)에 있어서 사용되는 GSK-3β 억제제는 상술한 신장 전구 세포 분화 유도 공정에서 예시한 GSK-3β 억제제를 사용할 수 있으며, 바람직한 GSK-3β 억제제로는 CHIR99021을 들 수 있다. 공정 (i)에서 이용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라서 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 10 μM, 더욱 바람직하게는 0.5 μM 내지 3 μM이며, 특히 바람직하게는 0.5 μM 내지 1.5 μM이다.
공정 (i)에서 사용되는 FGF2(염기성 FGF: bFGF)는 인간 FGF2가 바람직하고, 인간 FGF2로는 예를 들어, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 등록 번호: ABO43041.1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. FGF2는 분화 유도 활성을 갖는 한, 그 단편 및 기능적 개변체가 포함되는 FGF2는 시판되고 있는 것을 사용할 수 있으며, 세포로부터 정제된 단백질이나 유전자 재조합으로 생산된 단백질을 사용할 수도 있다. 이 공정에서 이용되는 FGF2의 농도는 1 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 바람직하게는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml, 더욱 바람직하게는 50 ng/ml 내지 250 ng/ml이다.
공정 (i)에서 사용되는 BMP4는 인간 BMP4가 바람직하고, 인간 BMP4로는 예를 들어, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 등록 번호: AAH20546.1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. BMP4는 분화 유도 활성을 갖는 한, 그 단편 및 기능적 개변체가 포함되는 BMP4는 시판되고 있는 것을 사용할 수 있으며, 세포로부터 정제된 단백질이나 유전자 재조합으로 생산된 단백질을 사용할 수도 있다. 이 공정에서 이용되는 BMP4의 농도는 0.1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 ng/ml 내지 5 ng/ml이다.
공정 (i)에 있어서 사용되는 레티노산은 레티노산 그 자체일 수 있으며, 천연의 레티노산이 갖는 분화 유도 기능을 보유하는 레티노산 유도체일 수 있다. 레티노산 유도체로서 예를 들어, 3-디하이드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카보닐]아미노]-벤조산(AM580)(Tamura K, et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26(1990)), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB)(Strickland S, et al., Cancer Res. 43: 5268-5272(1983)) 및 Tanenaga, K.et al., Cancer Res. 40: 914-919(1980)에 기재되어 있는 화합물, 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로레티놀, 3-디하이드로레티날 등을 들 수 있다.
공정 (i)에서 이용하는 레티노산 또는 그 유도체의 농도는 예를 들어, 1 nM 내지 100 nM, 바람직하게는 5 nM 내지 50 nM, 더욱 바람직하게는 5 nM 내지 25 nM이다.
공정 (i)에 있어서, 배양 온도는 다음에 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행된다. CO2 농도는 약 2 ~ 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 공정 (i)의 배양 시간은 후기 후방 배반엽 상층이 분화 유도되는데 충분한 기간일 수 있으나, 예를 들어 1 ~ 2일의 배양이며, 바람직하게는 1일이다.
(ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2 , GSK - 3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정
이 공정에서는 후기 후방 배반엽 상층으로부터 중배엽 계보 원시 선조가 유도된다. 중배엽 계보 원시 선조는 CDX1 및 BRACHYURY가 양성인 세포로서 특징지어진다. 또한, 중배엽 계보 원시 선조는 OCT4, NANOG 및 E-CDH가 음성인 것이 바람직하다.
공정 (ii)에서는, 상술한 공정 (i)에서 얻어지는 세포 집단을 단리하고, 별도로 준비한 코팅 처리된 배양 접시에서 접착 배양할 수 있으며, 공정 (i)에서 접착 배양에 의해 얻어진 세포를 그대로 배지의 교환에 의해 배양을 계속할 수도 있다.
공정 (ii)에서 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 상술한 바와 같은 기초 배지를 사용할 수 있으며, 혈청이 함유될 수 있거나 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 혈청 대체물, 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수도 있다.
공정 (ii)에서 사용되는 FGF2는 공정 (i)에서 설명한 것과 마찬가지이고, 그 바람직한 농도 범위도 마찬가지이다.
공정 (ii)에서 사용되는 GSK-3β 억제제는 상술한 공정 (i)에 있어서 예시한 GSK-3β 억제제를 사용할 수 있고, 바람직한 GSK-3β 억제제로는 CHIR99021을 들 수 있다. 공정 (ii)에서 이용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라서 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 7.5 μM이며, 특히 바람직하게는 2 내지 5 μM이다. 공정 (ii)에서 이용하는 GSK-3β 억제제의 농도는 공정 (i)에 있어서의 농도보다 증가시키는 것이 바람직하다.
공정 (ii)에서 사용되는 BMP7은 인간 BMP7이 바람직하고, 인간 BMP7로는 예를 들어, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 등록 번호: NM_001719.2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. BMP7은 분화 유도 활성을 갖는 한, 그 단편 및 기능적 개변체가 포함되는 BMP7은 시판되고 있는 것을 사용할 수 있으며, 세포로부터 정제된 단백질이나 유전자 재조합으로 생산된 단백질을 사용할 수도 있다. 이 공정에서 이용되는 BMP7의 농도는 0.1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 0.5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 ng/ml 내지 5 ng/ml이다.
공정 (ii)에 있어서, 배양 온도는 다음으로 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행된다. CO2 농도는 약 2 ~ 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 공정 (ii)의 배양 시간은 중배엽 계보 원시 선조가 분화 유도되는데 충분한 기간일 수 있으나, 예를 들어 10시간 ~ 2일, 또는 1 ~ 2일의 배양이며, 바람직하게는 0.5 ~ 1일이다.
(iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2 , GSK - 3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정
이 공정에서는 중배엽 계보 원시 선조로부터 중배엽 계보 후기 원시 선조가 유도된다. 중배엽 계보 후기 원시 선조는 CDX2 및 BRACHYURY가 양성인 세포로서 특징지어진다.
공정 (iii)에서는 상술한 공정 (ii)에서 얻어진 세포 집단을 단리하고, 별도 준비한 코팅 처리된 배양 접시에서 접착 배양할 수 있으며, 공정 (ii)에서 접착 배양에 의해 얻어진 세포를 그대로 배지의 교환에 의해 배양을 계속할 수도 있다.
공정 (iii)에서 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 상술한 바와 같은 기초 배지를 사용할 수 있고, 혈청이 함유될 수 있거나 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 혈청 대체물, 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수도 있다.
공정 (iii)에서 사용되는 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7은 공정 (ii)와 마찬가지이고, 그 바람직한 농도 범위도 마찬가지이지만, GSK-3β 억제제의 농도 범위는 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 10 μM, 더욱 바람직하게는 1 μM 내지 7.5 μM이며, 특히 바람직하게는 2 내지 5 μM이다.
공정 (iii)에서 사용되는 TGFβ 억제제는 TGFβ의 수용체로의 결합으로부터 SMAD로 이어지는 신호 전달을 저해하는 물질이며, 수용체인 ALK 패밀리로의 결합을 저해하는 물질 또는 ALK 패밀리에 의한 SMAD의 인산화를 저해하는 물질을 들 수 있고, 예를 들어 Lefty-1(NCBI 등록 번호로서, 마우스: NM_010094, 인간: NM_020997이 예시됨), SB431542, SB202190(이상, R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20), SB505124(GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208(Scios), LY2109761, LY364947, LY580276(Lilly Research Laboratories), A83-01(WO2009146408) 및 이들의 유도체 등이 예시된다. TGFβ 억제제는 바람직하게는 A83-01일 수 있다.
배양액 중에 있어서의 TGFβ 억제제의 농도는 ALK를 저해하는 농도라면 특별히 한정되지 않지만, 0.5 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 1 μM 내지 50 μM, 더욱 바람직하게는 5 μM 내지 25 μM이다.
공정 (iii)에 있어서, 배양 온도는 다음으로 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행된다. CO2 농도는 약 2 ~ 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 공정 (iii)의 배양 시간은 중배엽 계보 후기 원시 선조가 분화 유도되는데 충분한 기간일 수 있으나, 예를 들어 1 ~ 3일의 배양이며, 바람직하게는 1.5 ~ 2일이다.
(iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2 , GSK - 3β 억제제, BMP7 , 액티빈 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정
이 공정에서는 중배엽 계보 후기 원시 선조로부터 후신 계보 후기 원시 선조가 유도된다. 후신 계보 후기 원시 선조는 HOX11 및 BRACHYURY가 양성인 세포로서 특징지어진다.
공정 (iv)에서는 상술한 공정 (iii)에서 얻어진 세포 집단을 단리하고, 별도 준비한 코팅 처리된 배양 접시에서 접착 배양할 수 있으며, 공정 (iii)에서 접착 배양에 의해 얻어진 세포를 그대로 배지의 교환에 의해 배양을 계속할 수도 있다.
공정 (iv)에서 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK 억제제를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 상술한 바와 같은 기초 배지를 사용할 수 있고, 혈청이 함유될 수 있거나 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 혈청 대체물, 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수도 있다.
공정 (iv)에서 사용되는 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7은 공정 (ii)와 마찬가지이고, 그 바람직한 농도 범위도 마찬가지이지만, GSK-3β 억제제의 농도 범위는 0.01 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 0.1 μM 내지 10 μM, 보다 바람직하게는 1 μM 내지 7.5 μM이며, 특히 바람직하게는 2 내지 5 μM이다.
공정 (iv)에서 사용되는 액티빈에는 인간 및 다른 동물 유래의 액티빈 및 이들의 기능적 개변체가 포함되며, 예를 들어 R&D systems 사 등의 시판중인 것을 사용할 수 있다. 공정 (iv)에서 이용하는 액티빈의 농도는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 더욱 바람직하게는 5 ng/ml 내지 25 ng/ml이다.
공정 (iv)에 있어서 사용되는 ROCK 억제제는 Rho-키나아제(ROCK)의 기능을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 Y-27632(예, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983(2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284(2000) 참조), Fasudil/HA1077(예, Uenata et al., Nature 389: 990-994(1997) 참조), H-1152(예, Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232(2002)참조), Wf-536(예, Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324(2003) 참조) 및 이들의 유도체, 및 ROCK에 대한 안티 센스 핵산, RNA 간섭 유도성 핵산(예, siRNA), 우성 음성 변이체 및 이들의 발현 벡터를 들 수 있다. 또한, ROCK 억제제로는 다른 공지의 저분자 화합물도 사용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허출원 공개 제2005/0209261호, 미국 특허출원 공개 제2005/0192304호, 미국 특허출원 공개 제2004/0014755호, 미국 특허출원 공개 제2004/0002508호, 미국 특허출원 공개 제2004/0002507호, 미국 특허출원 공개 제2003/0125344호, 미국 특허출원 공개 제2003/0087919호, 및 국제공개 제2003/062227호, 국제공개 제2003/059913호, 국제공개 제2003/062225호, 국제공개 제2002/076976호, 국제공개 제2004/039796호 참조). 본 발명에서는 1종 또는 2종 이상의 ROCK 억제제가 사용될 수 있다. 바람직한 ROCK 억제제로는 Y-27632를 들 수 있다. 공정 (iv)에서 사용되는 ROCK 억제제의 농도는 사용하는 ROCK 억제제에 따라서 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들어 0.1 μM 내지 100 μM, 바람직하게는 1 μM 내지 75 μM, 보다 바람직하게는 5 μM 내지 50 μM이다.
공정 (iv)에 있어서, 배양 온도는 다음으로 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행된다. CO2 농도는 약 2 ~ 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 공정 (iv)의 배양 시간은 후신 계보 후기 원시 선조가 분화 유도되는데 충분한 기간일 수 있으나, 예를 들어 1 ~ 5일의 배양이며, 바람직하게는 3일이다.
(v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정
이 공정에서는 후신 계보 후기 원시 선조로부터 후기 후방 중간 중배엽이 유도된다. 중간 중배엽은 OSR1, HOX11 및 WT1이 양성인 세포로서 특징지어진다.
공정 (v)에서는, 상술한 공정 (iv)에서 얻어진 세포 집단을 단리하고, 별도 준비한 코팅 처리된 배양 접시에서 접착 배양할 수 있으며, 공정 (iv)에서 접착 배양에 의해 얻어진 세포를 그대로 배지의 교환에 의해 배양을 계속할 수도 있다.
공정 (v)에서 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 이용되는 기초 배지에 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로는 상술한 바와 같은 기초 배지를 사용할 수 있고, 혈청이 함유될 수 있거나 또는 무혈청일 수 있다. 필요에 따라서, 혈청 대체물, 지질, 아미노산, 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염류 등을 함유할 수도 있다.
공정 (v)에서 사용되는 레티노산 또는 그 유도체 및 FGF9는 각각 공정 (i) 및 신장 전구 세포 유도 공정에서 설명한 바와 같고, 그 바람직한 농도 범위도 마찬가지이다.
공정 (v)에 있어서 사용되는 배지는 BMP 억제제를 더 포함할 수도 있다.
BMP 억제제로는 코르딘(Chordin), 노긴(Noggin), 폴리스타틴(Follistatin) 등의 단백질성 억제제, 돌소몰핀(Dorsomorphin)(즉, 6-[4-(2-피페리딘-1-일-에톡시)페닐]-3-피리딘-4-일-피라졸로[1,5-a]피리미딘), 그 유도체(P. B. Yu et al.(2007), Circulation, 116: II_60; P.B. Yu et al.(2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al.(2008), PLoS ONE, 3(8): e2904) 및 LDN193189(즉, 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린)이 예시된다.
BMP 억제제로서 보다 바람직하게는 노긴이며, 그 농도는 예를 들어, 1 ~ 100 ng/ml로 할 수 있다.
공정 (v)에 있어서, 배양 온도는 다음으로 한정되지 않지만, 약 30 ~ 40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기하에서 배양이 수행된다. CO2 농도는 약 2 ~ 5%, 바람직하게는 약 5%이다. 공정 (v) 배양 시간은 후기 후방 중간 중배엽이 분화 유도되는데 충분한 기간일 수 있으나, 예를 들어 1 ~ 3일의 배양이며, 바람직하게는 2일이다.
공정 (v)에서 얻어진 중간 중배엽 세포를 신장 전구 세포 유도 공정에서 설명한 바와 같이, GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양함으로써 신장 전구 세포를 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 상술한 방법에 의해 얻어지는 신장 전구 세포를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 제공한다. iPS 세포로부터의 신장 오가노이드는 예를 들어, Nature, 526, 564-568(2015)에 보고되어 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들어, 상기 방법으로 얻어진 신장 전구 세포를 배양하여 세포 덩어리를 제작하고, 이것을 3T3-Wnt4 세포 등의 피더 세포, 마우스 태자 척수 세포, 또는 마우스 태자 신장 세포와 공배양하는 것, 또는 CHIR99021 등의 GSK-3β 억제제를 포함하는 기초 배지를 사용하는 반기상(半氣相) 배양(참고 문헌 Nature, 526, 564-568(2015))에 의해 얻을 수 있다. 배지는 GSK-3β 억제제에 더하여, FGF9나 FGF2를 포함할 수 있다.
본 발명은 상술한 방법에 의해 얻어진 신장 전구 세포 또는 이것을 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 약학 조성물, 상기 신장 전구 세포 또는 이것을 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 신질환 치료제, 상기 신장 전구 세포 또는 이것을 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 신질환을 치료하는 방법을 각각 제공한다. 치료를 필요로 하는 환자로의 치료제의 투여 방법으로는 예를 들어, 얻어진 신장 전구 세포를 시트화하여 환자의 신장에 첩부하는 방법, 얻어진 신장 전구 세포를 생리 식염수 등에 현탁시킨 세포 현탁액, 또는 삼차원 배양(예를 들어, Dev Cell. Sep 11, 2012; 23(3): 637-651)하고, 얻어진 세포 덩어리를 환자의 신장에 직접 이식하는 방법, 매트리겔 등으로 구성된 스캐폴드 상에서 삼차원 배양하고, 얻어진 신장 전구 세포 덩어리를 이식하는 방법 등을 들 수 있다. 이식 부위는 신장 내라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 신장 피막 아래이다. 신질환으로는 급성 신장 장애, 만성 신부전, 만성 신부전에까지 이르지 않는 만성 신장병이 예시된다.
본 발명에 있어서, 신질환 치료제에 포함되는 신장 전구 세포의 세포수는 이식편이 투여 후에 생착될 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 환부의 크기나 체구의 크기에 맞추어 적절히 증감하여 조제하여도 무방하다.
실시예
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 아래의 양태에는 한정되지 않는다.
<1> iPS 세포로부터 신장 전구 세포로의 분화 유도
이하의 프로토콜에 의해 iPS 세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도하였다. 한편, iPS 세포는 201B7 유래의 OSR1-GFP/SIX2-tdTomato 리포터 인간 iPS 세포를 사용하였다.
1. 미분화 iPS 세포를 아쿠타아제(accutase) 처리로 단세포화 한 후에 10 μM의 Y27632를 첨가한 ReproFF2 배지(리프로 셀)에 현탁하고, 매트리겔(BD Biosciences)로 코팅한 웰에 1.0 × 104/웰 ~ 5.0 × 104/웰의 밀도로 파종하고 24 시간, 37℃에서 인큐베이트.
2. 24시간 후(1일째(Day 1))에 비타민 A를 함유하지 않는 B27 서플리먼트(vitamin A free supplement, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 첨가한 DMEM/F12 Glutamax(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 기초 배지로 하고, 1 μM CHIR99021, 10 nM 레티노산, 1 ng/ml BMP4, 100 ng/ml FGF2를 첨가한 배지로 배지 교환(후기 후방 배반엽 상층의 제작 … 1)
3. 2일째에 상기 기초 배지에 3 μM CHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2를 첨가한 배지로 배지 교환(중배엽 계보 원시 선조의 제작 … 2)
4. 3일째, 4일째에 상기 기초 배지에 3 μM CHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10 μM A83-01을 첨가한 배지로 배지 교환(중배엽 계보 후기 원시 선조의 제작 … 3)
5. 5일째, 6일째, 7일째에 상기 기초 배지에 3 μM CHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10 ng/ml ACTIVIN, 30 μM Y27632를 첨가한 배지로 배지 교환(후신 계보 후기 원시 선조의 제작 … 4)
6. 8일째, 9일째에 상기 기초 배지에 100 ng/ml FGF9, 100 nM 레티노산을 첨가한 배지로 배지 교환(후기 후방중간 중배엽의 제작 … 5)
7. 10일째, 11일째, 12일째에 상기 기초 배지에 10 ng/ml FGF9, 1 μM CHIR99021을 첨가한 배지로 배지 교환(신장 전구 세포의 제작 … 6)
각 단계에서 분화 유도가 진행되고 있는 것은 표 1에 기재된 마커의 발현에 의해 확인하였다.
음성 마커는 발현되지 않고 있다는 것을 확인하였다. 도 1에 각 단계의 세포 마커 염색 결과를 나타내었다. 후기 후방 중간 중배엽 및 신장 전구 세포에 대해서는 80% 이상의 마커 양성 세포를 얻을 수 있었다. 한편, 상기 5의 공정에서의 배지를 200 ng/ml FGF9, 100 nM 레티노산, 25 ng/ml NOGGIN으로 하였을 때에도 마찬가지의 결과를 얻을 수 있었다.
각 단계의 마커 유전자
양성 마커 음성 마커
① CDX1, OCT4, NANOG, E-CDH EOMES, BRACHYURY
② BRACHYURY, CDX1 OCT4, NANOG, E-CDH
③ BRACHYURY, CDX2
④ BRACHYURY, HOX11
⑤ OSR1, HOX11, WT1
⑥ OSR1, HOX11, WT1, SIX2, SALL1
이상의 결과로부터, iPS 세포로부터 신장 전구 세포를 분화 유도할 수 있었다. 분화 유도 효율은 80% 이상으로 현저하게 고효율로 신장 전구 세포를 얻을 수 있었다.
<2> 마우스 태자 신장 세포와의 공배양에 의한 신장 전구 세포로부터의 신장 오가노이드의 제작
<1>에서 얻어진 신장 전구 세포를 1.0 × 105의 크기의 세포 덩어리로 하고, 1 μM CHIR99021 및 10 ng/ml FGF9를 첨가한 기초 배지에서 1 일간 배양하였다. 거기에 E11.5의 마우스 태자 척수와 반기상(半氣相) 배양으로 공배양 하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 사구체나 요세관을 확인할 수 있고, 신장 오가노이드의 제작에 성공하였다.
<3> 신장 전구 세포 단독 배양에 의한 신장 오가노이드의 제작
<1>에서 얻어진 신장 전구 세포를 1.0 × 105 크기의 세포 덩어리로 하고, 1 μM CHIR99021 및 200 ng/ml FGF9를 첨가한 기초 배지에서 1 ~ 2 일간 배양하였다. 그 세포 덩어리를 5 μM CHIR99021 및 200 ng/ml FGF2을 첨가한 기초 배지에서 2 일간 반기상(半氣相) 배양하고, 게다가, 기초 배지에서만 8 일간 반기상(半氣相) 배양을 하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 사구체나 요세관을 확인할 수 있고, 신장 오가노이드의 제작에 성공하였다. 또, BRN1(+)CDH1(+)DBA(-) 헨레 고리를 관찰할 수 있었다.

Claims (26)

  1. 중간 중배엽 세포를 GSK(글리코겐 합성 효소 키나아제)-3β 억제제 및 FGF(섬유아세포 증식 인자)9를 포함하는 배지에서 접착 배양하여, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 유도하는 공정을 포함하는, 신장 전구 세포의 제조 방법으로서,
    상기 중간 중배엽 세포는 다능성 줄기세포로부터 유도되며, 다음의 공정(i) ~ (v)을 포함하는 방법으로 제조되는 방법:
    (i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP(골형성 단백질)4, GSK-3β 억제제, 및 레티노산 또는 3-디하이드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카보닐]아미노]-벤조산(AM580), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB), 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로레티놀 및 3-디하이드로레티날로 이루어진 군에서 선택된 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK(Rho-kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
    (v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 3-디하이드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카보닐]아미노]-벤조산(AM580), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB), 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로레티놀 및 3-디하이드로레티날로 이루어진 군에서 선택된 레티노산 유도체, 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신장 전구 세포는 SIX2 양성 세포인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 중간 중배엽 세포는 OSR1 양성 세포인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    GSK-3β 억제제는 CHIR99021인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 GSK(글리코겐 합성 효소 키나아제)-3β 억제제 및 FGF(섬유아세포 증식 인자)9를 포함하는 배지는 ROCK 억제제를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 접착 배양은 세포 외 기질로 코팅된 배양 용기를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포 외 기질은 라미닌 511의 E8 단편인 것인 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    공정 (v)의 배지는 BMP 억제제를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 다능성 줄기세포는 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 것인 방법.
  13. 다능성 줄기세포로부터 신장 전구 세포를 제조하는 방법으로서,
    다음의 공정 (i) ~ (vi)를 포함하는 방법:
    (i) 다능성 줄기세포를 FGF2, BMP4, GSK-3β 억제제, 및 레티노산 또는 3-디하이드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카보닐]아미노]-벤조산(AM580), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB), 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로레티놀 및 3-디하이드로레티날로 이루어진 군에서 선택된 레티노산 유도체를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (ii) 공정 (i)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제 및 BMP7을 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (iii) 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7 및 TGFβ 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (iv) 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 FGF2, GSK-3β 억제제, BMP7, 액티빈 및 ROCK(Rho-kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하는 공정;
    (v) 공정 (iv)에서 얻어진 세포를 레티노산 또는 3-디하이드로레티노산, 4-[[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카보닐]아미노]-벤조산(AM580), 4-[(1E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로펜-1-일]-벤조산(TTNPB), 팔미트산 레티놀, 레티놀, 레티날, 3-디하이드로레티놀 및 3-디하이드로레티날로 이루어진 군에서 선택된 레티노산 유도체, 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하는 공정; 및
    (vi) 공정 (v)에서 얻어진 세포를 GSK-3β 억제제 및 FGF9를 포함하는 배지에서 배양하여, 중간 중배엽 세포로부터 신장 전구 세포를 유도하는 공정.
  14. 제13항에 있어서,
    공정 (v)의 배지는 BMP 억제제를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 신장 전구 세포는 SIX2 양성 세포인 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 공정 (v)에서 얻어진 세포는 OSR1 양성 세포인 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 GSK-3β 억제제는 CHIR99021인 것인 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 공정 (vi)의 배지는 ROCK 억제제를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    상기 배양은 세포 외 기질로 코팅된 배양 용기를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 세포 외 기질은 라미닌 511의 E8 단편인 것인 방법.
  21. 제13항에 있어서,
    상기 다능성 줄기세포는 인공 다능성 줄기(iPS) 세포인 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 iPS 세포는 인간 iPS 세포인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 신장 전구 세포.
  24. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 신장 전구 세포를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드.
  25. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 신장 전구 세포 또는 이를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 약학 조성물.
  26. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 신장 전구 세포 또는 이를 이용하여 얻어지는 신장 오가노이드를 포함하는 신질환 치료제.
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