KR20230067232A - 신장 오가노이드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신장 오가노이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 줄기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신장 오가노이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 투과성 다공성 웰 및 새로운 프로토콜을 적용하여 보다 향상된 네프론 구조를 갖는 신장 오가노이드를 형성하는 방법을 제공하는 것이다.
배아 줄기 세포(ES: embryonic stem cell) 및 유도 만능 줄기 세포(iPS: induced pluripotent stem cell)를 포함한 만능성 줄기 세포(PSC: pluripotent stem cell)의 분화는 신장을 포함한 다양한 조직의 오가노이드 모델의 생성을 가능하게 하였다.
신장 오가노이드는 신장 발달 과정을 모사하며 형성된 3차원 세포 응집체로, 다양한 신장 세포로 구성되어 있으며 신장과 유사한 구조를 구현함으로써 약물의 신독성 평가 및 신장 질환 치료제 연구 등을 위한 체외 신장 모델로의 잠재성을 보여주고 있다. 이에, 신장 오가노이드 형성을 위해 많은 연구들이 수행되고 있으며, 다양한 신장 오가노이드 형성 방법이 제시되었다.
일반적으로 3차원 신장 오가노이드를 형성하기 위해서는 세포를 3차원 응집체로 만들어줄 수 있는 웰 플레이트, 마이크로웰 어레이 (microwell array) 등과 같은 웰(well) 타입의 플랫폼을 사용한다. 그러나, 종래의 비투과성 웰의 경우 영양분 및 성장인자(growth factor)의 공급과 대사산물(metabolites)의 제거가 원활하지 않아 신장 오가노이드의 생존력이 낮아지고, 미성숙의 원인이 될 수 있다.
한편, 최근 줄기세포 분야의 진보에 따라, 인간 만능성줄기세포(human pluripotent stem cell; hPSC)로부터 신장 오가노이드를 생성하기 위한 몇 가지 다른 프로토콜이 확립되었다. hPSC-유래 신장 오가노이드는 네프론-유사 배열(arrangement)로서 족세포(podocyte), 근위세뇨관 상피세포(proximal tubule epithelial cell) 및 원위세뇨관 상피세포(distal tubule epithelial cell)을 포함하는 분절 구조를 가지고 있다. hPSC-신장 오가노이드의 생체 외(in vitro) 및 신장 조직의 생체 내(in vivo)에서의 비교 분석은 신장 오가노이드가 사람의 신장 발달을 되풀이한다는 사실을 보여주었다. 그러나, 네프론-유사 구조의 제한된 혈관화(vascularization) 및 미성숙 문제는 여전히 극복해야 할 과제로 남아있다.
이에 본 발명의 한 측면은 투과성 다공성 웰 및 새로운 프로토콜을 적용하여 보다 향상된 네프론 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면 줄기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 의하면 새로운 프로토콜의 적용에 의해 분화 성공률이 향상되고, 보다 선명한 세뇨관의 구조 형성이 가능하며, 나아가 투과성 웰을 활용하여 더욱 향상된 네프론 기능을 발현하는 신장 오가노이드를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 획득되는 신장 오가노이드를 이용하는 경우 신장 관련 질병 연구 및 신독성 약물 평가 등과 같은 체외 신장 모델이 사용되는 분야에 있어서 실제 체내 신장의 질병 및 약물의 흡수와 같은 현상을 체외에서 모사할 수 있어 제약 분야, 조직공학 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 예시적인 제조 공정 및 제조된 웰을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의해 획득되는 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드를 나타낸 것이다.
도 4는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 면역형광염색 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드 성숙도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 의해 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드의 약물 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이를 나타낸 것이다.
도 8(a)는 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이의 확인을 위해 후기 원시선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이고, 도 8(b)는 분화 21일째에 형성된 신장 오가노이드를 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰한 결과는 나타낸다.
도 9는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
도 10은 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 적용될 수 있는 투과성 웰의 단면을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의해 획득되는 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드를 나타낸 것이다.
도 4는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드의 면역형광염색 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드 성숙도 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 의해 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드의 약물 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이를 나타낸 것이다.
도 8(a)는 제1 단계에서의 산소 조건에 따른 차이의 확인을 위해 후기 원시선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이고, 도 8(b)는 분화 21일째에 형성된 신장 오가노이드를 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰한 결과는 나타낸다.
도 9는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
도 10은 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 신장 오가노이드의 제조방법은 줄기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계; 후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및 후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는 것이다.
본 발명에 사용될 수 있는 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC) 및 배아줄기세포(ES) 중 적어도 하나인 것일 수 있으며, 예를 들어 유도만능줄기세포(iPSC)일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 기본 배지는 동물세포의 배양에 이용되는 기초 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham'sF12(F12) 배지, RPMI 1640 배지, Advanced RPMI 1640 배지, Fischer's배지, McCoy's 5A medium, Basal medium Eagle's(BME), MCDB media 및 이들의 혼합 배지 등이 포함된다. 예를 들어, Advanced RPMI 1640은 RPMI 1640에 비해 FBS가 적게 함유되어 있어 세포 성장률이나 세포의 형태 및 기능의 변화없이 보다 재현성 높은 실험이 가능하도록 하므로, 바람직하다.
필요에 따라 예를 들어 알부민, 트랜스페린, KSR(KnockOut Serum Replacement)(ES세포 배양 시의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2보충제(Invitrogen), B27 보충제(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올 글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함할 수 있고 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 성장 인자, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 및 이들의 동등물 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. ReproFF2(리프로 셀), StemFit Basic medium(Ajinomoto) 등 미리 줄기세포 배양용으로 최적화된 배지를 사용하여도 좋다.
한편, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 산소 농도 10% 미만의 저산소 분위기에서 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 5% 이하의 산소 분압인 것이 바람직하다. 상기 1 단계에서 산소 농도 10% 이상인 경우 분화 초기 단계인 1단계에서 바람직하게는 약 4일째에 나타나야 하는 돔 유사 형태의 안정적인 유도에 문제가 있다.
실제 인간 배아의 발달 과정 초기에는 혈관화가 되어 있지 않아 저산소 환경에서 발달이 진행되며, 이와 같은 저산소 조건에서의 신장 발달은 저산소 유도인자인 HIF의 활성화를 통해 세뇨관 형성을 향상시키는 점에 기초하여 본 발명은 신장 오가노이드 분화 시 초기 단계인 제1 단계에서의 분위기를 배아발달 환경인 저산소 조건으로 형성하였다. 한편, 제2 단계 및 제3 단계에서는 정상 산소 분압에서 분화를 진행하였다. 이와 같은 상기 제1 단계에서 저산소 조건이 도입된 새로운 프로토콜에서 분화된 신장 오가노이드는 제3 단계 완료 후, 예를 들어 21일째에서 저산소 조건이 도입되지 않은 조건에서 분화된 신장 오가노이드에 비해 높은 재현율로 선명한 세뇨관 구조를 나타낼 수 있다.
한편, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, iii) FGF9을 포함하는 배지 및 이 중 적어도 2 이상을 혼합한 배지 중 적어도 하나의 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 8일 내지 10일 동안 수행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, 및 iii) FGF9을 포함하는 배지에서 순차적으로 각 배지 당 1일 내지 4일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 예를 들어 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지에서 약 4일, ii) Activin A를 포함하는 배지에서 약 3일, 및 iii) FGF9을 포함하는 배지에서 약 2일 동안 배양할 수 있다.
상기 BMP4 억제제로는 Chordin, NOGGIN, Follistatin 등의 단백질성 억제제, Dorsomorphin(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine), LDN193189(4-(6-(4-(piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl) quinoline), Gremlin(Grem1), Sclerostin, Twisted gastrulation(Tsg) protein 등일 수 있다. BMP4 억제제로서 보다 바람직하게는 NOGGIN이며 그 농도는 예를 들면 1~100 ng/ml일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 20 ng/ml일 수 있다.
상기 GSK-3β억제제는 예를 들어, CHIR, CHIR99021 등을 들 수 있다. GSK-3β억제제의 농도는 사용하는 GSK-3β 억제제에 따라 당업자에게 적절히 선택 가능하나, 예를 들면 0.01μM에서 100μM, 바람직하게는, 0.1μM에서 10μM이다.
상기 세포 응집체를 형성하는 제2 단계는 GSK-3β 억제제 및 FGF9을 포함하는 배지에서 2일 내지 3일 동안 수행되는 것이 바람직하다.
한편, 상기 제1 단계 및 제2 단계에서 사용되는 배지의 FGF9 농도는 5 ng/ml 이상 25 ng/ml 미만의 농도로 포함되는 것으로, FGF9 농도가 5 ng/ml 미만인 경우 네프론 줄기세포의 발달과 유지에 문제가 있으며, 25 ng/ml 이상인 경우 신장 오가노이드로의 분화 효율이 불안정하다는 문제가 있다.
상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안, 예를 들어 10일 내지 50일 동안, 또는 15일 내지 30일 동안, 예를 들어 16일 내지 21일 동안 수행되는 것이 바람직하며, 예를 들어 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 사용되는 배지는 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 0.5 내지 5 부피%의 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안 수행되는 것이다. FBS 농도가 0.5 부피% 미만인 경우 형성된 신장 오가노이드의 네프론 구조 관찰에 문제가 있으며, 5 부피% 초과의 경우 세포의 성장률이나 유전자 및 단백질 발현에 영향을 주어 세포의 표현형이 달라질 수 있기 때문에 신장 오가노이드로 분화시키는데 문제가 있다.
상기와 같이 FBS 성분을 포함하는 경우 3차원 구조의 신장 오가노이드에 FBS 내 포함된 성장인자, ECM 분자, 호르몬 등을 공급함으로써, 분화 완료 시까지의 세포의 생존율을 유지하면서 성공적으로 분화를 진행시킬 수 있다.
한편, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 25 ng/ml 내지 50 ng/ml, 예를 들어 25 ng/ml 내지 40 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내지 5일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것으로, 상기 1 단계 및 2 단계에서 저농도의 FGF9를 포함한 것과 달리 고농도의 FGF9를 포함하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 제3 단계에서 FGF9 농도가 25 ng/ml 미만인 경우 신장 오가노이드가 발달된 세뇨관 구조를 가지게 하는데 문제가 있으며, 50 ng/ml 초과의 경우 세포 증식률에 영향을 주어 신장 오가노이드를 안정적으로 분화시키는데 문제가 있다.
한편, 상기 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내지 5일 동안 배양하는 단계는 상기 제3 단계의 시작 시점 또는 초반부에 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 3 단계의 시작으로부터 2일 내지 5일 동안 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하는 배지를 이용하여 배양을 수행한다.
제2 단계에서 세포 응집체로 분화되는 경우 성장인자들이 세포 응집체에 충분히 전달되지 못하기 때문에, 제3 단계에서 네프론 줄기세포의 성장과 유지에 필요한 FGF9의 농도를 25 ng/ml 내지 50 ng/ml로 향상시켜 보다 성공적으로 세뇨관 구조로 분화를 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 제2 단계 및 제3 단계는 마이크로웰에서 수행되는 것이 바람직하며, 이때 상기 마이크로웰은 1개 이상의 오목부를 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 1개 이상의 오목부는 마이크로웰의 하단부에 형성되는 것이다. 한편, 상기 마이크로웰은 다공성 마이크로웰인 것이 바람직하며, 다공성 마이크로웰은 다공성 멤브레인으로 형성된 것일 수 있다. 예를 들어, 한국 등록특허 제KR 10-2224065 B1호에 기재된 다공성 마이크로웰에 관한 기술을 채용할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 프로토콜을 사용하여 신장 오가노이드를 분화시킬 경우 분화 성공률이 균일하여 안정적이고 재현성 있는 신장 오가노이드 형성이 가능하다.
본 발명의 신장 오가노이드의 제조방법에 의해 제공되는 프로토콜에 따르면 분화 성공률이 향상되고, 나아가 세뇨관의 원활한 구조 형성이 가능하다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 신장 오가노이드의 제조
실시예 1
Geltrex 1%가 코팅된 24 웰 플레이트에 25,000~30,000 cells/well 농도의 유도만능 줄기세포(iPSC) (IMR90-4, WiCell 또는 WTC-11, CORIELL INSTITUTE) 를 시딩하였으며, 이때 배지는 mTeSRTM1 을 사용하였다. 하루 뒤 새로운 mTeSRTM1 배지로 교체하였으며, 이때부터 상기 줄기세포(iPSC)가 콜로니(colony, 세포 군집)를 형성하는 것을 확인하였다.
상기 줄기세포(iPSC) 콜로니가 웰을 35% 내지 40% 정도 채운 시점부터 졌을 때 분화 배지에서 분화시키는 단계를 수행하기 시작하였다(D0). 이때 분화 배지는 CHIR 10 μM, Glutamax 100 X(즉, 전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%) 및 Noggin 10 ng/ml을 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지(RPMI 1640보다 FBS 함유량이 낮은 배지)를 사용하였으며, 저산소 환경 (5% O2)에서 수행하였다. 2일차(D2)에 새 분화 배지로 교체를 수행하였고, 4일차(D4)에 세포 형태(morphology)가 돔 유사 형태(dome like morphology)가 되었을 때 Activin A 배지로 처리하였다. 이때 Activin A 배지는 Activin A 10 ng/ml 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)을 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지를 사용하였다. 7일차(D7)에 저농도 FGF9 배지 처리하였고, 이때 저농도 FGF9 배지는 FGF9 10ng/ml 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)를 포함하는 Advanced RPMI 1640의 혼합배지를 사용하였다.
이때 사용한 투과성 웰은 도 1과 같이 제작될 수 있으며, 먼저 도 1의(a)와 같이 투과성 멤브레인을 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoro-2-propanol) 용액에 폴리카프로락톤(Polycarprolactone)과 플루로닉 108(Pluronic F108)을 5:5로 혼합한 5% 내지 25% 농도의 용액을 사용하여 전기방사 공정을 통해 제작하고, 그 후에 도 1의(b)와 같이 음각 몰드 및 양각 몰드를 이용하여 열성형 공정을 거쳐 투과성 웰이 제조될 수 있다. 이와 같이 제조된 투과성 웰은 다공성 구조임을 알 수 있다(도 1의(c)). 본 발명에 사용된 투과성 웰의 단면을 도 2에 나타내었다.
9일차(D9)에 웰 플레이트에서 분화된 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포에 Accutase 처리를 하여 떼어낸 후 투과성 웰에 800 uM 웰 기준 10,000 cells/well로 시딩하였다. 이때 사용 배지는 CHIR 3 uM 및 FGF9 10ng/ml을 포함하는 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하였으며, 9일째부터 21% 산소 분압에서 배양하여 세포 응집체를 형성하였다.
11일차(D11)에 고농도 FGF9 배지로 교체하였으며, 이때 고농도 FGF9 배지는 FGF9 30ng/ml 및 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하였으며, 21% 산소 분압 에서 배양하여 신장 소포(Renal Vesicle) 단계로 분화시켰다.
14일차(D14)에 기본 분화 배지로 전체 배지의 부피를 기준으로 FBS 1.5 부피%를 포함하는 Advanced RPMI 1640 및 Glutamax 100X(전체 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 1 부피%)의 혼합배지를 사용하여 21일까지 배양하였다. 그 결과 투과성 웰 상에서 형성된 신장 오가노이드를 도 3과 같이 확인할 수 있었다.
비교예 1
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 투과성 웰이 아닌 비투과성 웰로 AggrewellTM을 사용하여 신장 오가노이드를 제조하였다.
2. 웰 타입에 의한 신장 오가노이드의 차이 확인
(1) 분화의 균일도 확인
분화된 신장 오가노이드를 분화 21일째(D21)에 DPBS로 5분간 워싱(washing)한 후, 2시간 동안 전체 용액 부피를 기준으로 4 부피% PFA를 상온에서 처리하여 신장 오가노이드를 고정시켰다. 두 시간 후에 DPBS로 10분간 3번씩 워싱하고 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피% 의 Triton X-100과 5 부피% 당나귀 혈청(donkey serum)을 처리하여 상온에서 블로킹(blocking)하였다. 2시간 동안 처리한 후, 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100과 부피%의 소혈청 알부민(BSA, Bovine Serum Albumin)을 함유한 완충용액에 1차 항체를 희석하여 4℃에서 5일간 처리하였다. 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피% 의 Triton X-100의 PBST로 상온에서 10분 동안 3번씩 워싱하고, 전체 버퍼 부피를 기준으로 0.3 부피%의 Triton X-100과 부피%의 소혈청 알부민(BSA)이 포함된 완충용액에 2차 항체를 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 다음날 전체 완충용액 부피를 기준으로 0.3 부피% 의 Triton X-100의 PBST로 상온에서 20분 동안 3번씩 워싱하고 DPBS에 1 μg/ml 농도로 DAPI를 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 처리한 후, DPBS로 10분간 3번 워싱하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 신장 오가노이드에 대하여 면역형광염색 실험을 수행하였다.
비투과성 웰 어레이와 투과성 웰 어레이에서 형성된 신장 오가노이드 면역형광염색 비교 결과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장의 네프론에 존재하고 있는 PODXL(podocyte), LTL(proximal tubule epithelial cell), ECAD(distal tubule epithelial cell) 마커를 비교하는 경우 본 발명에 따라 실시예 1와 같이 투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드는 균일하게 잘 분화된 반면, 비교예 1의 비투과성 웰 어레이에서는 균일도가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 신장 오가노이드 성숙도 확인
역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-qPCR, Reverse Transcription quantitative Polymer Chain Reaction) 방법에 따라 유도 만능 줄기세포(iPSCs)를 대조군으로 신장 오가노이드에서 발현되는 마커를 정량하여 분화된 신장 오가노이드의 성숙도를 분석하였다. 실험 조건은 95 ℃에서 1분간 처리한 후, 95 ℃에서 15초, 56 ℃ 또는 62.7 ℃에서 15초, 72 ℃에서 45초를 1 사이클로 하여 40회 반복하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 신장 오가노이드에 대하여 성숙도를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장의 네프론에 존재하고 있는 PODXL(podocyte), LTL(proximal tubule epithelial cell), ECAD(distal tubule epithelial cell) 마커를 비교하는 경우 본 발명에 따라 실시예 1와 같이 투과성 웰에서 형성된 신장 오가노이드는 모든 마커에서 비교예 1의 비투과성 웰 어레이보다 향상된 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
3. 프로토콜에 따른 신장 오가노이드의 차이 확인
(1) 세포로 분화시키는 제1 단계에서 산소 농도에 따른 차이
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 제1 단계에서 저산소분위기가 아닌 21% 산소 농도에서 분화를 진행시킬 경우, 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 분화 4일째가 되어도 세포 형태(morphology)가 돔 유사 형태(dome like morphology)로 밀집해지지 않았으나(우측 사진), 5% 저산소 조건에서 분화를 진행한 경우 3일 만에 돔 유사 형태가 나타났고 4일째까지 그 형태를 유지하여 분화 4일째에 배치 마다 안정적으로 돔 유사 형태(dome like morphology)가 나타나는 것을 확인하였다(좌측 사진).
보다 명확한 확인을 위해 후기 원시선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과 도 8(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 21% 산소 환경에서 보다 저산소 환경(5%)에서 분화된 신장 오가노이드가 후기 원시선(late primitive streak) 마커인 Brachyury(T)의 발현량이 보다 향상된 것을 확인하였다.
나아가 분화 21일째에 면역형광염색으로 분석한 결과에서도 저산소 조건(5%)에서 네프론 구조를 보다 선명하게 나타내는 것을 관찰하였다 도 8(b).
(2) 오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 차이
실시예 1과 동일한 과정에 의해 신장 오가노이드를 제조하되, 제3 단계에서 FGF9을 1O μg/ml, 및 20 μg/ml 농도로 각각 함유한 배지를 처리한 경우에는 모든 배지마다 안정적으로 네프론 구조를 가지지 않는다는 문제가 있었다.
한편, 실시예 1과 같이 30 ng/ml 농도로 혼합한 배지로 신장 오가노이드를 분화시키는 경우에 세포가 보다 안정적으로 네프론 구조로 발달하고, 특히 세뇨관 구조로 선명하게 분화되는 것을 관찰하여 분화 제 3단계에서는 보다 고농도인 30 ng/ml의 농도로 FGF9를 처리하는 것이 바람직함을 확인하였다. 도 9는 제3 단계에서 FGF9 농도에 따른 네프론 구조로 발달을 나타낸 것이다.
(3)오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 차이
오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 FBS 포함 여부에 따른 분화 정도를 면역형광염색법으로 분석하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이 FBS를 포함하지 않은 배지 조성으로 분화가 진행된 신장 오가노이드는 내부에 네프론 구조를 관찰할 수 없었으나, 전체 배지 조성의 1.5 부피% 로 FBS를 추가한 배지 조성에서 분화된 신장 오가노이드는 내부에 네프론과 유사한 구조를 가지는 것을 확인하였다.
4. 신장 오가노이드의 약물 독성 평가
Advanced RPMI 1640에 0, 30 60 uM으로 타크로리무스를 농도 별로 37℃에서 24시간 동안 처리하였으며, 24시간 후 DPBS로 3번 워싱한 후 calcein-AM과 ethidium homodimer-1으로 각각 생세포와 사세포를 염색하였다. 이러한 과정에 의해 상기 실시예 1에서 획득된 신장 오가노이드의 약물 독성을 평가하였다.
그 결과 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 신장에 독성이 있다고 알려진 타크로리무스(FK506)를 농도 별로 처리하는 경우 농도가 높을수록 세포가 많이 죽는 것을 관찰하였으며, 이에 따라 본 발명에 의해 신장 오가노이드가 제조된 것을 확인할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
Claims (14)
- 줄기세포를 후신간엽(metanephric mesenchyme) 세포로 분화시키는 제1 단계;
후신간엽 세포를 배양하여 세포 응집체를 형성하는 제2 단계; 및
후신간엽 세포 응집체를 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 배아줄기세포(ES)인 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 산소 농도 10% 미만의 저산소 환경에서 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, iii) FGF9을 포함하는 배지 및 이 중 적어도 2 이상을 혼합한 배지 중 적어도 하나의 배지에서 배양하는 단계를 포함하여, 8일 내지 9일 동안 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 후신간엽 세포로 분화시키는 제1 단계는 i) GSK-3β억제제 및 BMP4 억제제를 포함하는 배지, ii) Activin A를 포함하는 배지, 및 iii) FGF9을 포함하는 배지에서 순차적으로 각 배지 당 1일 내지 4일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 응집체를 형성하는 제2 단계는 GSK-3β 억제제 및 FGF9을 포함하는 배지에서 2일 내지 3일 동안 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 단계 및 제2 단계의 FGF9는 5 ng/ml 이상 25 ng/ml 미만의 농도로 포함되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계에서 사용되는 배지는 배지 조성물 전체 부피를 기준으로 0.5 내지 5 부피%의 FBS를 포함하는 배지에서 7일 내지 100일 동안 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 제3 단계는 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내지 5일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제10항에 있어서, 25 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF9를 추가로 포함하여 2일 내지 5일 동안 배양하는 단계는 상기 제3 단계의 시작 시점 또는 초반부에 포함되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 단계 및 제3 단계는 마이크로웰에서 수행되는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 마이크로웰은 1개 이상의 오목부를 포함하는, 신장 오가노이드의 제조방법.
- 제13항에 있어서, 상기 마이크로웰은 다공성 마이크로웰인, 신장 오가노이드의 제조방법.
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