一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域,具体涉及一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物,尤其是利用该组合物快速直接定向的诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法,以及进一步将神经上皮细胞定向诱导分化成神经元细胞或神经胶质细胞的方法。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell,NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞,存在于成体脑组织中的一种干细胞。主要分布在脑室管膜,室下区,纹状体,海马齿状回等区域,是成年神经系统中可以自我更新和分化为多种神经类细胞的一种多能细胞,其可分化为多种神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞的发现,给中枢神经系统损伤和其他大脑退行性疾病的治疗带来了希望。NSCs作为一种全新的生物学治疗方法,随着分离培养、体外扩增等技术的日臻完善,NSCs在中枢神经损伤修复中具有潜在的应用价值,其应用主要集中以下几方面:一是直接细胞移植进行替代治疗,神经干细胞作为细胞移植的来源,可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活,分化为神经元和胶质细胞,与已经存在的细胞结构整合到一起;二是以NSCs作为基因载体,携带治疗作用的报告基因进行移植,从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用;三是通过对生长因子和细胞因子的研究,诱导自身的NSCs分化进行神经自我修复。由于神经干细胞是从大脑组织中提取出来的成体干细胞,来源非常有限,目前在临床应用的可能几乎为零。因此,急需一个替代物来取代其治疗价值。
小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman成功分离建系,它们来源于胚泡的内细胞团(inner cell mass,ICM),这些细胞具有稳定的二倍体核型,在体外可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)。撤去这种自我更新的刺激信号后,ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统。
神经上皮细胞是一种干细胞,可细胞分裂产生两个完全相同的细胞。而后,子细胞会经由不对称的细胞分裂,产生一个与亲代相同的细胞及另一个非干细胞的先驱细胞或神经元。文献(Billon N,Jolicoeur C,Ying QL,et al.,Journal of Cell Science,2002,115)公开了一种诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法,然而这种利用EB自然分化产生的神经上皮细胞,分化比例非常低,而且是瞬时产生的不具有较长期的自我增殖与更新的能力,无法做为细胞产物长期体外培养,冻存与利用。
文献(Falk A,Koch P,Kesavan J,et al.PLOS One,2012,7)公开了一种诱导人胚胎干细胞分化为可以较长时间进行自我增殖与自我更新的神经上皮细胞的方法,但是其是通过自然分化的方法同时加入生长因子EGF和bFGF,诱导时长达30天以上,其利用价值大大降低。也有研究者通过加入SMAD信号通路的两种抑制剂Noggin与SB431542,诱导人胚胎干细胞分化为神经干细胞,但其诱导效率较低,且耗时较久(Chambers,S.M.,et al.,NatBiotechnol,2009.27,3)。
小鼠和人的ES细胞有较大差异:
1.二者的形态不同:小鼠ES细胞形成多层鸟巢状的集落,难以分清单个细胞,人ES细胞形成相对扁平的单层细胞集落,单个细胞密集排列,可见清晰的核仁(Buecker C,GeijsenN,Cell Stem Cell,2010,7);
2.二者维持未分化的机制不同(Hanna J,Markoulaki S,Mitalipova M,et al,Cell Stem Cell,2009,4);
3.二者表达的分子标志有所不同(Takahashi and Yamanaka,Cell,2006,126;Takahashi K,Yamanaka S,Cell,2007,131)。因此在实际中,小鼠和人的ES细胞研究工作是各自相对独立的研究体系。
目前尚无一种方法可以快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为具有自我更新与增殖能力的神经上皮细胞。
发明内容
目前还没有关于从小鼠胚胎干细胞越过EB阶段直接分化生成为具有较长期自我复制与更新能力的神经上皮细胞(Neuroepithelial cells,NE)的报导。本发明首次报导了利用几种小分子直接诱导分化小鼠胚胎干细胞生成神经上皮细胞的快速有效方法,利用本发明的方法生成的神经上皮细胞(NE)具有较长期的自我更新能力与自我复制的能力,并类似神经干细胞,表达神经干细胞的标记物Nestin和Sox1,可进一步诱导NE定向分化为多种神经细胞如神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞等,为临床应用提供了可能。
本发明具体技术方案如下:
一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法,包括如下步骤:
(1)第一阶段:向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基,连续培养若干天,一般为3-5天,细胞每天换液,诱导鼠胚胎干细胞形成玫瑰花状神经球;
(2)第二阶段:消化并挑出第一阶段的神经球,加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬浮培养形成悬浮的神经球;
(3)第三阶段:将神经球消化成单细胞,然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。
上述方法中的鼠胚胎干细胞团状克隆可以用常规方法制备得到,例如:首先,用基质胶(BD)包被24孔板(Corning)。细胞计数后,将小鼠胚胎干细胞(mESCs,购买于上海斯丹赛生物技术有限公司,品系M1)以1x103/孔的数量种在细胞培养板上。每个孔加入400μl的培养基,并隔天换液。3-5天后细胞即长成团状克隆。
上述方法中的第一阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、NEAA和β-Mercaptoethanol,优选配方为:DMEM F12(Invitrogen),1xN2(Invitrogen),1xB27(Invitrogen),1x NEAA(Invitrogen),0.1mMβ-Mercaptoethanol(Invitrogen),100ng/ml noggin(R&D Systems),20μM SB431542(Sigma),2μMdorsomophin(Sigma),3μM CHIR99021(Stemgent)。
上述方法中的第二阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、bFGF和葡萄糖,优选配方为:DMEM F12,1x N2,20ng/ml bFGF(Peprotech),1.6g/Lglucose(Sigma)。
上述方法中的第三阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、胰岛素、葡萄糖、bFGF和EGF,优选配方为DMEM F12,1xN2,1μl/mlB27,20ug/ml insulin(Wako Pure Chemical Industries),1.6g/L glucose(Sigma),20ng/mlbFGF,20ng/ml EGF(R&D Systems)。
上述方法中,第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入各个因子的含量优选0.1~5μM的dorsomorphin、100~500ng/ml(4.35~21.75nM)的noggin、5~30μM的SB431542和1~5μM的CHIR99021,更优选的组合为:2μM的dorsomorphin、100ng/ml(4.35nM)的noggin、20μM的SB431542和3μM的CHIR99021。
本发明还提供了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物,包括dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021,优选dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021的摩尔比为(100~5000):(4.35~21.75):(5000~30000):(1000~5000),(100ng/ml noggin(R&D Systems),换成摩尔浓度是4.35nM),更优选摩尔比为460:1:4598:690(对应的浓度比为2μM:4.35nM:20μM:3μM)。
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是从囊胚期内细胞团(inner cell mass,ICM)分离得到的,在体外具有无限或较长期的自我更新能力,并能在特定的诱导条件下分化成外中内三胚层,并进一步分化为各种组织特异性细胞。大量研究表明,OCT4、SOX2和NANOG这三个转录因子对ES细胞基因转录具有关键性的调控作用,它们通过结合靶基因调控区,选择性地抑制分化基因表达或促进多能性基因表达。它们通常只在多能干细胞中表达,在分化细胞中不表达。在不同的发育阶段,它们的表达量受到特异调控,并且分别与Sox-2、FoxD3等其他转录因子以及LIF、BMP、wnt、Tgf-β等胞外信号通路互相作用,形成一个复杂的转录调节crosstalk网络,对保持ES细胞多潜能性和自我更新发挥作用。目前,通过对LIF、BMP、wnt、Tgf-β等胞外信号通路的调控来诱导胚胎干细胞分化的研究很多,有研究报导指出同时使用noggin,SB431542和dorsomorphin三种小分子可以将小鼠外胚层胚胎干细胞(mouse embryonic epiblast stem cell)直接分化为增殖2-3代的NE细胞(MJ Nejm,Nature Method,2011)。由于外胚层胚胎干细胞与胚胎干细胞的诱导分化存在差异,在本发明的研究中,实验结果表明使用noggin,SB431542和dorsomorphin并不能直接将鼠ES细胞分化为神经上皮细胞,实验是失败的(图3)。
本发明首次发现在ES形成神经球的阶段通过同时加入dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021,可快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞,实验结果表明,上述因子不仅抑制ES细胞的多条保持ES细胞的多能性信号通路,并且抑制ES细胞向中胚层和内胚层的分化,从而高效率的将ES向外胚层进行定向分化从而生成神经上皮细胞,使ES细胞向神经上皮细胞的分化效率几乎达到100%。
SB431542(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-Benzamidehydrate)是TGF-β1Ⅰ型受体阻断剂,主要是通过抑制TGF-β1激活素受体样激酶activin receptor-like kinases(ALKs)中的ALK4、ALK5、ALK7来抑制TGF-beta/Activin信号通路。
Dorsomrphine(6-[4-(2-Piperidin-1-ylethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidine,Compound C,AMPK Inhibitor)是一种选择性的骨形态发生蛋白(BMP)信号通路抑制剂。它已被发现能抑制胚胎发生的BMP信号发育和促进人多能干细胞(HPSC)向神经分化。通过抑制ALK2,3,6来抑制BMP信号通路。
Noggin:1992年,California大学的Harland,R.M和Smith,W.C.从非洲爪蟾的胚胎中分离出noggin基因,在人的体内定位于染色体17q22,在大鼠与小鼠体内定位于11号染色体。Noggin cDNA编码产物为26kD的蛋白,具有疏水氨基末端,是一种分泌蛋白。研究表明,noggin是内源性的BMPs特异性拮抗剂,对胚胎和个体的发育有着重要的作用,如神经管的形成和关节软骨的形成。氨基酸序列如下:
MQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYD
PGFMATSPPEDRPGGGGGPAGGAEDLAELDQLLRQRPSGAMPSEIKG
LEFSEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDLGSRF
WPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCQRRGQR
CGWIPIQYPIISECKCSC。
CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)
-2pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile),最有效和特定的肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂。GSK3是Wnt信号通路中的一个重要的激酶,它能够抑制整个wnt通路的功能。在CHIR99021的作用下,GSK3β与β-catenin解离导致β-catenin不能再被降解而在细胞质中累积,并进入细胞核内,激活wnt信号通路,激活下游靶基因的转录,起到促进向神经外胚层的分化的作用。
在SB431542、Dorsomrphine、noggin和CHIR99021的作用下,ES迅速下调干性marker,上调神经外胚层基因,并导致细胞从形态上变为玫瑰花状神经球。同时CHIR99021使NE定向分化更直接和稳定。CHIR99021是参与Wnt路径中的肝糖原合成激酶3β(GSK3β)受体的选择性抑制剂。GSK-3β受抑制,即可抑制胚胎干细胞进行自我更新又可促进干细胞向神经外胚层细胞分化。
本发明研究结果表明经过免疫荧光染色的方法比较NE和NSC细胞发现他们的标志性蛋白一致,均表达Nestin和Sox1(图4);这说明NE和NSC性能和功能非常相似,而且它们都可以进一步分化为神经元(图9),少突胶质细胞和星型胶质细胞(图10)。
在上述研究的基础上,本发明还提供了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化成神经元的方法,采用上述方法制备得到神经上皮细胞,进行贴壁培养,加入向神经元分化的普通诱导培养基或向中脑神经元分化的培养基,连续培养若干天,一般为14-20天,即得到普通神经元细胞或者中脑神经元。
上述方法中普通诱导培养基或向中脑神经元分化的培养基为本领域熟知的培养基,培养基配方如下:
向神经元分化的普通诱导培养基是:DMEM/F12培养基(GIBCO C11330)添加B27supplement(1:50;Invitrogen17504-044),N2supplement(1:100;Invitrogen1752048)与cAMP(300ng/ml,Sigma)。
向中脑神经元分化的培养基成分是DMEM/F12培养基(GIBCO C11330)添加B27supplement(1:50),N2supplement(1:100),cAMP(300ng/ml),SHH(100~500ng/ml,R&DSystems),FGF8(200~500ng/ml,ProSpec Cyt-070)。
具体的神经元的诱导方法如下:
首先24孔细胞培养板用基质胶提前包被。将NE细胞以1x104/孔的细胞数种下,加向普通神经元诱导培养基诱导14天,隔天换液。14天后就可以得到普通神经元细胞。
或者按以上方法种下细胞后用向中脑神经元分化的诱导培养基诱导14天以上,每隔天换液。14天后就可以得到中脑神经元。
本发明还提供了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质前体细胞的方法,采用如权利上述方法制备得到神经上皮细胞,进行贴壁培养,加入OPC诱导培养基,连续培养若干天,一般为3-5天,即得到少突胶质前体细胞,所述OPC诱导培养基包含有:DMEM/F12神经基础培养基,N2培养基,不含维生素A的B27培养基、Glutamax、bFGF、PDGF-AA和SHH,优选配方DMEM/F12神经基础培养基,N2培养基,不含维生素A的B27培养基、2mM Glutamax、20ng/ml bFGF、20ng/ml PDGF-AA和200ng/ml SHH。
本发明还提供了一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质细胞或星形胶质细胞的方法,采用上述方法制备得到少突胶质前体细胞(OPC)可以进行较长期的自我更新与增殖的能力,进行贴壁培养,加入少突胶质细胞诱导培养基或者星形胶质细胞诱导培养基,连续培养若干天,一般为3-7天,即得到少突胶质细胞或星形胶质细胞。
上述方法中少突胶质细胞诱导培养基或者星形胶质细胞诱导培养基配方与已发表的从鼠外胚层胚胎干细胞分化来的NE细胞进一步分化为OPC的培养基相同(MJ Nejm,Nature Method,2011),培养基配方如下:
少突胶质细胞诱导培养基配方:DMEM/F12神经基础培养基添加0.4ng/ml T3(Sigma),200ng/ml SHH,100ng/ml noggin,10μM dibutyryl cyclic-AMP sodium salt(Sigma),100ng/mlIGF-1(PROSPEC)和10ng/ml NT3(R&D Systems)。
星形胶质细胞诱导培养基配方:DMEM/F12神经基础培养基加上FBS(Gibco)或者加入BMP-4(20ng/ml,R&D)。
具体的细胞诱导方法如下:
a)OPC的诱导:首先24孔细胞培养板用基质胶提前包被,然后将NE细胞以1x104/孔的细胞数种下,加入OPC诱导培养基,每隔一天换一次液,连续培养五天。
b)少突胶质细胞的诱导:首先培养板用多聚鸟氨酸(Sigma)和laminin(Sigma)包被。OPC细胞要以每平方厘米2.2×104/孔细胞数的密度把细胞种在24孔培养板上,加入少突胶质细胞诱导培养基,诱导3-5天,隔天换液。
c)星形胶质细胞的诱导:首先培养板用鸟氨酸(plo,Sigma)和laminin(Sigma)包被。OPC细胞要以每平方厘米2.2×104/孔细胞数的密度把细胞种在24孔培养板上,加入星形胶质细胞诱导培养基,诱导7天,隔天换液。
本发明的优点:
1.本发明创造了一套新颖快速的从鼠ES向神经上皮细胞直接定向分化的方法;
2.利用该发明的分化方法得到的神经上皮细胞具有较长期的自我更新与增殖能力;
3.分化方法摒弃了传统的形成EB方法,缩短了分化时间,而且分化的效率达到了95%以上;
4.同时本发明又可将NE进一步定向分化为具有较长期自我更新能力与增殖能力的少突胶质前体细胞(OPC),分化效率在90%以上。该前体细胞可以再进一步分化为少突胶质细胞和星型胶质细胞;
5.本方明产生的NE也可进一步分化为各类神经元细胞;
6.本发明可快速诱导NE细胞替代NSC细胞功能治疗中枢系统损伤,具有很高的临床应用性。
附图说明
图1.小鼠胚胎干细胞(mES)向神经上皮细胞(NE)快速阶梯式分化示意图。
图2.利用4种小分子成功诱导分化小鼠胚胎干细胞生成神经上皮细胞(A.小鼠胚胎干细胞(mES)在无滋养层培养条件培养.B.mES经过第一阶段分化为花瓣状的神经球(Rossette).C.mES经过第二阶段分化为悬浮状的神经球.D.mES经过第三阶段分化为神经上皮细胞,图示显示P0代,.E.放大倍数20X神经上皮细胞P0代F.神经上皮细胞P1代(标尺显示为200μM))。
图3.利用3种小分子抑制剂无法成功诱导分化小鼠胚胎干细胞为神经上皮细胞(A.小鼠胚胎干细胞(mES)在无滋养层培养条件培养.B.mES经过第一阶段无法贴壁培养,直接变为悬浮的神经球.C.mES经过胰酶处理变为单个细胞无法贴壁与生长)。
图4.神经上皮细胞第一阶段神经球可表达神经前体标记物Pax6,Sox1和Nestin(bar=50μm)。(A.NE诱导三天后形成松散的玫瑰花状神经球表达Pax6,Nestin。B.NE诱导三天后形成松散的玫瑰花状神经球表达Sox1,Nestin)。
图5.神经上皮细胞的诱导效率和生长曲线(通过统计NE特异性转录因子和核表达数目比统计出NE诱导率高达99%以上。通过传代技术统计NE每代的细胞数经过GraphPad处理软件得到NE的生长曲线)。
图6.神经上皮细胞特异性标志物染色结果(bar=50μm,A.NE特异性转录因子DACH1,也表达神经前体标记物Nestin。B.NE也可以被神经前体转录因子Sox2染色。C.NE可表达极性标记物ZO-1,说明神经上皮细胞的极性特点,也可表达神经前体标记物Pax6。D.NE表达其特异性转录因子PLZF)。
图7.NE,NSC皆可表达神经前体转录因子Pax6,Sox1;NE也可表达NSC特异性标记物Sox9,CD133(bar=50μm,A.NE细胞表达Pax6,Nestin。B.小鼠神经干细胞表达Pax6,Nestin。C.小鼠神经干细胞表达Sox1,Nestin.D.NE可表达神经干细胞膜蛋白CD133。E.NE可表达NSC特异标记物Sox9。F.NSC特异性标记物CD133.G.NSC特异性标记物Sox9)。
图8.Real-time PCR比值结果比较诱导三天为神经球第二阶段的NE,第三阶段成熟的NE与NSC比值法神经前体干细胞的各种基因的表达。
图9.NE来源的神经元染色(A,C,D bar=250μm;B bar=500μm,A.经诱导,可表达中脑神经元5TH。B.表达神经元标记物NeuN。C.同时也可以表达中脑神经元TH。D.诱导的细胞可表达神经元特异性标记物β-tubulinⅢ)。
图10.NE诱导的少突胶质前体细胞,少突胶质细胞,星形胶质细胞(A,E,F bar=200μm;B,C,D bar=100μm,A.NE诱导的OPC细胞明视场。B.NE来源的OPC可表达Oligo2.C.NE诱导的OPC继续诱导成少突胶质细胞明视场。D.诱导的少突胶质细胞可表达其特异性标记物MBP。E.NE诱导的OPC继续诱导成星形胶质细胞。F.诱导的星形胶质细胞可表达其标记物GFAP)。
图11.少突胶质细胞前体细胞(OPC)和少突胶质细胞(oligo)与神经干细胞(NSC)Real-time PCR基因表达的比较。
图12.少突胶质细胞前体细胞的转化率及生长曲线。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞
实验目的:小鼠胚胎干细胞向神经上皮细胞进行高效率分化且生成的神经上皮细胞能够进行自我复制及较长期的增殖。小鼠胚胎干细胞(mESCs)购买于上海斯丹赛生物技术有限公司,品系M1。
首先,用基质胶(BD)包被24孔板(Corning)。细胞计数后,将小鼠胚胎干细胞(mESCs)以1x103/孔的数量种在细胞培养板上。每个孔加入400μl的培养基,并隔天换液。3-5天后细胞长成团状克隆,然后开始诱导,分为3个阶段。
1)第一阶段:将贴壁培养的小鼠胚胎干细胞团状克隆的培养基换成含有因子的第一阶段诱导培养基,根据加入因子及组合的不同,共分为两组,这一阶段连续培养四天,细胞每天换液,直到出现玫瑰花状(Rossette)的神经团结构。
组1:第一阶段诱导培养基:DMEM F12(Invitrogen),1xN2(Invitrogen),1xB27(Invitrogen),1x NEAA(Invitrogen),0.1mMβ-Mercaptoethanol(Invitrogen),100ng/mlnoggin(R&D Systems),20μM SB431542(Sigma),2μM dorsomophin(Sigma),3μMCHIR99021(Stemgent)。
组2:第一阶段诱导培养基:DMEM F12(Invitrogen),1xN2(Invitrogen),1xB27(Invitrogen),1x NEAA(Invitrogen),0.1mMβ-Mercaptoethanol(Invitrogen),100ng/mlnoggin(R&D Systems),20μM SB431542(Sigma),2μM dorsomophin(Sigma)
2)第二阶段:对第一阶段的两组细胞均采用如下相同的操作:吸掉培养基,PBS洗一遍,加胶原酶IV(BD)消化5min后,吸掉胶原酶,PBS洗一遍,加培养基终止消化,用枪头挑出神经球,800r/min离心5min,用第二阶段培养基重悬,花状结构的神经球转到没有包被的培养板上用第二阶段诱导培养基进行培养,这一阶段培养4天。第二阶段诱导培养基:DMEM F12,1x N2,20ng/ml bFGF(Peprotech),1.6g/L glucose(Sigma)。
3)第三阶段:对第二阶段的两组细胞均采用如下相同的操作:诱导前首先基质胶包被培养板,37℃,1小时。然后把悬浮的神经球转移到基质胶提前包被的培养板上用第三阶段的诱导培养基进行培养,一天方可形成成熟的NE细胞。第三阶段诱导培养基:DMEMF12,1xN2,1μl/ml B27,20ug/ml insulin(Wako Pure Chemical Industries),1.6g/L glucose(Sigma),20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF(R&D Systems)
实验结果表明:组1利用4种小分子抑制剂SB431542、Dorsomorphine、noggin和CHIR99021,通过快速阶梯式的诱导分化,可成功地诱导小鼠胚胎干细胞分化为可大量增殖的神经上皮细胞(图2所示,A.小鼠胚胎干细胞(mES)在无滋养层培养条件培养.B.mES经过第一阶段分化为花瓣状的神经球(Rossette).C.mES经过第二阶段分化为悬浮状的神经球.D.mES经过第三阶段分化为神经上皮细胞,图示显示P0代,放大倍数为5X.E.放大倍数20X神经上皮细胞P0代F.神经上皮细胞P1代(标尺显示为200μM))。
虽然文献记载了采用三种小分子抑制剂SB431542、Dorsomorphine和noggin可以成功地把小鼠胚胎外胚层干细胞(EpiSC)直接分化为神经上皮细胞,但是组2的实验表明上述三种因子不能把小鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞,结果如图3所示。A.小鼠胚胎干细胞(mES)在无滋养层培养条件培养.B.mES经过第一阶段无法贴壁培养,直接变为悬浮的神经球.C.mES经过胰酶处理变为单个细胞无法贴壁与生长。
实施例2小鼠神经上皮细胞的免疫鉴定
将实施例1得到的第一到第三代的神经上皮细胞进行免疫荧光检测,具体步骤包括固定,破膜,再加封闭液封闭1小时,然后加一抗分别为Nestin(Beyotime)1:10,Sox2(CST)1:200,Sox1(R&D)1:10,Pax6(Abcam)1:20,CD133(Bioss)1:100或Sox9(Millipore)1:5004℃过夜,PBS清洗后,加与一抗适合的荧光二抗FITC(ImmunoResearch),CY3(ImmunoResearch)室温孵育2小时。最后经PBS清洗后用Hoechst或DAPI染色细胞核加封片剂封片。在荧光显微镜(Zeiss)和扫描激光共焦成像系统(Leica)下检测。NE免疫荧光染色显示表达神经前体细胞标记物巢蛋白Nestin和Sox2,同时也可表达关键的神经前体细胞转录因子Sox1和Pax6(如图5所示),也可表达NSC特异标记物Sox9和膜蛋白CD133(如图4所示,NE第一阶段神经球可表达神经前体标记物Pax6,Sox1和Nestin(bar=50μm),A.NE诱导三天后形成松散的玫瑰花状神经球表达Pax6,Nestin。B.NE诱导三天后形成松散的玫瑰花状神经球表达Sox1,Nestin)。
实施例3神经上皮细胞的极性结构和神经玫瑰花瓣状特异性标志物的鉴定对实施例1得到的神经上皮细胞进行细胞免疫荧光染色,操作方法与实施例2相同,所用一抗分别为PLZF(Santa Cruz)1:50,ZO-1(Santa Cruz)1:50,SOX2(CST)1:200,PAX6(Abcam)1:200,结果表明,实施例1得到的神经上皮细胞显示核表达转录因子PLZF和DACH1,同时发现神经上皮极性标志物ZO-1也有表达(如图6所示,A.NE特异性转录因子DACH1,也表达神经前体标记物Nestin。B.NE也可以被神经前体转录因子Sox2染色。C.NE可表达极性标记物ZO-1,说明神经上皮细胞的极性特点,也可表达神经前体标记物Pax6。D.NE表达其特异性转录因子PLZF)。同时,对神经上皮细胞进行特异性标记物PLZF统计,结果表明本发明方法诱导的神经上皮细胞成功转化为NE细胞的转化率达98%以上,而且到目前为止可连续传代冻存至少10代以上(如图5所示,通过统计NE特异性转录因子和核表达数目比统计出NE诱导率高达99%以上。通过传代技术统计NE每代的细胞数经过GraphPad处理软件得到NE的生长曲线。),这样大量增加细胞来源,而且我们在传代的过程中,细胞形态和状态十分稳定,各代之间并没有明显差异。同时我们还对NE细胞特异性蛋白进行免疫组化染色,操作方法与实施例2相同,所用抗体分别为Nestin(Beyotime)1:10,Sox1(R&D)1:10,CD133(Bioss)1:100和Sox9(Millipore)1:500。实验显示根据本发明方法产生的NE细胞具有NE特有的标记蛋白(如图6所示)。而且NE除了表达NSC的表达蛋白Nestin和Sox1,也表达NSC的标记蛋白如CD133和Sox9,结果如图7所示,A.NE细胞表达Pax6,Nestin。B.小鼠神经干细胞表达Pax6,Nestin。C.小鼠神经干细胞表达Sox1,Nestin.D.NE可表达神经干细胞膜蛋白CD133。E.NE可表达NSC特异标记物Sox9。F.NSC特异性标记物CD133.G.NSC特异性标记物Sox9)。通过real-time PCR,对从mES分化来的NE第一阶段与第三阶段分化的NE细胞与神经干细胞NSC,从RNA水平分析对比它们的代表性基因表达,real-time PCR扩展方法按照程序为95℃2min,然后95℃15s,58℃60s,72℃60s的参数进行扩增44个循环。引物序列如表1:
表1:实时定量PCR比较NSC与NE基因表达的寡核苷酸引物
比较了NE与NSC在NSC特异性基因表达的相似度,图8显示两者基因表达基本相同。
实施例4神经上皮细胞定向分化为神经元(neuron).
首先24孔细胞培养板用基质胶提前包被。将NE细胞以1x104/孔的细胞数种下,加向普通神经元诱导培养基诱导,隔天换液,诱导两天后,发现NE细胞开始变形,逐渐伸出轴突,培养至14天后可明显观察到各类神经元样细胞,经过免疫荧光染色,所用一抗抗体包括βⅢ-tubulin,5TH,TH,NeuN发现其免疫阳性神经元特异性marker:βⅢ-tubulin,NeuN等(如图9所示,A.经诱导,可表达中脑神经元5TH。B.表达神经元标记物NeuN。C.同时也可以表达中脑神经元TH。D.诱导的细胞可表达神经元特异性标记物β-tubulinⅢ)。
或者按以上方法种下细胞后用向中脑神经元分化的诱导培养基诱导14天以上,每隔天换液。14天后,得到中脑神经元,可明显看到神经元形态呈比较类似几种,经染色发现能大量表达TH,5TH(如图9所示)。
向神经元分化的普通诱导培养基是:DMEM/F12培养基(GIBCO C11330)添加B27supplement(1:50;Invitrogen17504-044),N2supplement(1:100;Invitrogen1752048)与cAMP(300ng/ml,Sigma)。
向中脑神经元分化的培养基成分是DMEM/F12培养基(GIBCO C11330)添加B27supplement(1:50),N2supplement(1:100),cAMP(300ng/ml),SHH(100~500ng/ml,R&DSystems),FGF8(200~500ng/ml,ProSpec Cyt-070)。
实施例5神经上皮细胞定向分化为少突胶质前体细胞、少突胶质细胞(Oligodendrocytes)和星形胶质细胞(Astrocytes)少突胶质前体细胞诱导培养基配方:DMEM/F12神经基础培养基,N2培养基,不含维生素A的B27培养基、2mM Glutamax、20ng/ml bFGF、20ng/ml PDGF-AA和200ng/ml SHH。
少突胶质细胞诱导培养基配方:DMEM/F12神经基础培养基添加0.4ng/ml T3(Sigma),200ng/ml SHH,100ng/ml noggin,10μM dibutyryl cyclic-AMP sodium salt(Sigma),100ng/ml IGF-1(PROSPEC)和10ng/ml NT3(R&D Systems)。
星形胶质细胞诱导培养基配方:DMEM/F12神经基础培养基加上FBS(Gibco)或者加入BMP-4(20ng/ml,R&D)。
具体的细胞诱导方法如下:
a)少突胶质前体细胞诱导:首先24孔细胞培养板用基质胶提前包被,然后将NE细胞以1x104/孔的细胞数种下,加入OPC诱导培养基,每隔一天换一次液,连续培养五天,方可形成增殖能力较NE更强的OPC细胞(如图10所示,A.NE诱导的OPC细胞明视场。B.NE来源的OPC可表达Oligo2.C.NE诱导的OPC继续诱导成少突胶质细胞明视场。D.诱导的少突胶质细胞可表达其特异性标记物MBP。E.NE诱导的OPC继续诱导成星形胶质细胞。F.诱导的星形胶质细胞可表达其标记物GFAP)。
b)少突胶质细胞的诱导:首先培养板用多聚鸟氨酸(Sigma)和laminin(Sigma)包被。OPC细胞要以每平方厘米2.2×104/孔细胞数的密度把细胞种在24孔培养板上,加入少突胶质细胞诱导培养基,隔天换液,诱导3-5天方可形成少突胶质细胞(图10)。
c)星形胶质细胞的诱导:首先培养板用多聚鸟氨酸(Sigma)和laminin(Sigma)包被。OPC细胞要以每平方厘米2.2×104/孔细胞数的密度把细胞种在24孔培养板上,加入星形胶质细胞诱导培养基,隔天换液,诱导7天,方可形成星形胶质细胞。
通过Real-time PCR,,扩展方法按照程序为95℃2min,然后95℃15s,58℃60s,72℃60s的参数进行扩增44个循环。引物序列如表二:
表2:实时定量PCR比较OPC与NSC,Oligo与OPC基因表达的寡核苷酸引物
对NE分化来的OPC及进一步得到的oligodendrocyte进行基因表达的比较,从RNA水平分析对比它们的代表性基因表达发现在OPC阶段,与OPC有关的基因上调,与NSC有关的基因下调;在oligodendrocyte阶段,与Oligodendrocyte有关的基因上调,与NSC有关的基因下调,结果如图11所示。定量计算从NE向OPC分化的转化率,是根据免疫组化实验,把Olig2(Millipore)1:50和Hoeschst免疫组化染色,在显微镜下,随机选取5个相同倍数下的视野,进行统计计算,分别计数Olig2阳性染色细胞和Hoeschst阳性染色细胞。阳性率=目的蛋白阳性细胞数/DAPI阳性细胞数里的Olig2与Hoeschst细胞核染色的对比,NE转化为OPC的诱导转化率为80%以上,同时生长曲线显示而且到目前为止可连续传代冻存至少6代以上,结果如图12所示。