CN116981768A - 将人类体细胞化学重编程为多能细胞 - Google Patents
将人类体细胞化学重编程为多能细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116981768A CN116981768A CN202280018680.2A CN202280018680A CN116981768A CN 116981768 A CN116981768 A CN 116981768A CN 202280018680 A CN202280018680 A CN 202280018680A CN 116981768 A CN116981768 A CN 116981768A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- stage
- cell
- inhibitor
- inhibitors
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 title claims abstract description 101
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 title abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 425
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 99
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 136
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical group CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 70
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 36
- -1 doxofmorphine Chemical compound 0.000 claims description 33
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical group CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 27
- FOIVPCKZDPCJJY-JQIJEIRASA-N arotinoid acid Chemical group C=1C=C(C(CCC2(C)C)(C)C)C2=CC=1C(/C)=C/C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 FOIVPCKZDPCJJY-JQIJEIRASA-N 0.000 claims description 25
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 25
- IGLYMJRIWWIQQE-QUOODJBBSA-N (1S,2R)-2-phenylcyclopropan-1-amine (1R,2S)-2-phenylcyclopropan-1-amine Chemical compound N[C@H]1C[C@@H]1C1=CC=CC=C1.N[C@@H]1C[C@H]1C1=CC=CC=C1 IGLYMJRIWWIQQE-QUOODJBBSA-N 0.000 claims description 23
- 229960003741 tranylcypromine Drugs 0.000 claims description 23
- RWEVIPRMPFNTLO-UHFFFAOYSA-N 2-(2-fluoro-4-iodoanilino)-N-(2-hydroxyethoxy)-1,5-dimethyl-6-oxo-3-pyridinecarboxamide Chemical compound CN1C(=O)C(C)=CC(C(=O)NOCCO)=C1NC1=CC=C(I)C=C1F RWEVIPRMPFNTLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 22
- WXRGFPHDRFQODR-ICLZECGLSA-N 1-[3-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-amino-7-pyrrolo[2,3-d]pyrimidinyl)-3,4-dihydroxy-2-oxolanyl]methyl-propan-2-ylamino]propyl]-3-(4-tert-butylphenyl)urea Chemical group C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2C=C1)O)N(C(C)C)CCCNC(=O)NC1=CC=C(C(C)(C)C)C=C1 WXRGFPHDRFQODR-ICLZECGLSA-N 0.000 claims description 21
- RCLQNICOARASSR-SECBINFHSA-N 3-[(2r)-2,3-dihydroxypropyl]-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-iodoanilino)-8-methylpyrido[2,3-d]pyrimidine-4,7-dione Chemical compound FC=1C(=O)N(C)C=2N=CN(C[C@@H](O)CO)C(=O)C=2C=1NC1=CC=C(I)C=C1F RCLQNICOARASSR-SECBINFHSA-N 0.000 claims description 21
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 21
- MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N CHIR-98014 Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(N)=NC(NCCNC=2N=C(C(=CN=2)N2C=NC=C2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=C1 MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 claims description 20
- MLSAQOINCGAULQ-QFMPWRQOSA-N (E)-SB-590885 Chemical group C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C1=NC(C=2C=CN=CC=2)=C(C=2C=C3CCC(/C3=CC=2)=N\O)N1 MLSAQOINCGAULQ-QFMPWRQOSA-N 0.000 claims description 19
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical group Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 claims description 19
- 101000740178 Homo sapiens Sal-like protein 4 Proteins 0.000 claims description 19
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 claims description 19
- INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N entinostat Chemical compound NC1=CC=CC=C1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1CNC(=O)OCC1=CC=CN=C1 INVTYAOGFAGBOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 18
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 18
- 102100037192 Sal-like protein 4 Human genes 0.000 claims description 17
- MPVGZUGXCQEXTM-UHFFFAOYSA-N linifanib Chemical group CC1=CC=C(F)C(NC(=O)NC=2C=CC(=CC=2)C=2C=3C(N)=NNC=3C=CC=2)=C1 MPVGZUGXCQEXTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 claims description 15
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 claims description 15
- 108090000064 retinoic acid receptors Proteins 0.000 claims description 15
- 102000003702 retinoic acid receptors Human genes 0.000 claims description 15
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims description 14
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims description 14
- 108020002202 Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 claims description 13
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 13
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 13
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000004093 hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 13
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 13
- WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N N-(6-methyl-1,3-benzothiazol-2-yl)-2-[(4-oxo-3-phenyl-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide Chemical compound S1C2=CC(C)=CC=C2N=C1NC(=O)CSC1=NC=2CCSC=2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 102000005234 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 claims description 11
- 229940124639 Selective inhibitor Drugs 0.000 claims description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 11
- KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 1-n-(4-chlorophenyl)-6-methyl-5-n-[3-(7h-purin-6-yl)pyridin-2-yl]isoquinoline-1,5-diamine Chemical compound N=1C=CC2=C(NC=3C(=CC=CN=3)C=3C=4N=CNC=4N=CN=3)C(C)=CC=C2C=1NC1=CC=C(Cl)C=C1 KKVYYGGCHJGEFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N BAY-43-9006 Chemical compound C1=NC(C(=O)NC)=CC(OC=2C=CC(NC(=O)NC=3C=C(C(Cl)=CC=3)C(F)(F)F)=CC=2)=C1 MLDQJTXFUGDVEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- DEZZLWQELQORIU-RELWKKBWSA-N GDC-0879 Chemical compound N=1N(CCO)C=C(C=2C=C3CCC(/C3=CC=2)=N\O)C=1C1=CC=NC=C1 DEZZLWQELQORIU-RELWKKBWSA-N 0.000 claims description 10
- 239000005511 L01XE05 - Sorafenib Substances 0.000 claims description 10
- 101100381978 Mus musculus Braf gene Proteins 0.000 claims description 10
- 229960003787 sorafenib Drugs 0.000 claims description 10
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical group O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 9
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 claims description 9
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 claims description 9
- 102100023550 Zinc finger protein 42 homolog Human genes 0.000 claims description 9
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 claims description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 9
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims description 9
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims description 9
- LXFOLMYKSYSZQS-XKHGBIBOSA-N (2R,3R,4S,5R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-[[[3-[2-(6-tert-butyl-1H-benzimidazol-2-yl)ethyl]cyclobutyl]-propan-2-ylamino]methyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C2NC(CCC3CC(C3)N(C[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)C(C)C)=NC2=C1 LXFOLMYKSYSZQS-XKHGBIBOSA-N 0.000 claims description 8
- 102100023495 Zinc finger protein ZIC 3 Human genes 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 102100036279 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 102100024810 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B Human genes 0.000 claims description 7
- 101000931098 Homo sapiens DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 101000976645 Homo sapiens Zinc finger protein ZIC 3 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100033421 Keratin, type I cytoskeletal 18 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 claims description 6
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 claims description 6
- 229940127361 Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors Drugs 0.000 claims description 6
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N fasudil Chemical compound C=1C=CC2=CN=CC=C2C=1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 NGOGFTYYXHNFQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960002435 fasudil Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 6
- 101710123222 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B Proteins 0.000 claims description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 101000998020 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 18 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001008816 Homo sapiens N-lysine methyltransferase KMT5A Proteins 0.000 claims description 5
- 229940116839 Janus kinase 1 inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 229940121730 Janus kinase 2 inhibitor Drugs 0.000 claims description 5
- 102100027771 N-lysine methyltransferase KMT5A Human genes 0.000 claims description 5
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 5
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 102100024811 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3-like Human genes 0.000 claims description 4
- 229940122964 Deacetylase inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 101000909250 Homo sapiens DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3-like Proteins 0.000 claims description 4
- 101001046589 Homo sapiens Krueppel-like factor 17 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 claims description 4
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 claims description 4
- 229940124036 Hydrolase inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 102100022249 Krueppel-like factor 17 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 claims description 4
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 claims description 4
- 102100026457 Zinc finger E-box-binding homeobox 1 Human genes 0.000 claims description 4
- SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N [azido(phenoxy)phosphoryl]oxybenzene Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(=O)(N=[N+]=[N-])OC1=CC=CC=C1 SORGEQQSQGNZFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012345 acetylating agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 4
- VRYZCEONIWEUAV-UHFFFAOYSA-N n-[6-(hydroxyamino)-6-oxohexoxy]-3,5-dimethylbenzamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C(=O)NOCCCCCC(=O)NO)=C1 VRYZCEONIWEUAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HPTXLHAHLXOAKV-INIZCTEOSA-N (2S)-2-(1,3-dioxo-2-isoindolyl)-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1[C@H](C(=O)O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 HPTXLHAHLXOAKV-INIZCTEOSA-N 0.000 claims description 3
- IQCKJUKAQJINMK-HUBRGWSESA-N 1-[3-[[(2r,3s,4r,5r)-5-(4-amino-5-bromopyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl-propan-2-ylamino]propyl]-3-(4-tert-butylphenyl)urea Chemical compound C([C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2C(Br)=C1)O)N(C(C)C)CCCNC(=O)NC1=CC=C(C(C)(C)C)C=C1 IQCKJUKAQJINMK-HUBRGWSESA-N 0.000 claims description 3
- JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-3-indolyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C(C(NC1=O)=O)=C1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl JCSGFHVFHSKIJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 3
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- DKPQHFZUICCZHF-UHFFFAOYSA-N 6-[2-tert-butyl-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-imidazol-4-yl]quinoxaline Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(N=C(N2)C(C)(C)C)C=2C=C3N=CC=NC3=CC=2)=N1 DKPQHFZUICCZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000001893 Bone Morphogenetic Protein Receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010040422 Bone Morphogenetic Protein Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 claims description 3
- 102100031518 Collagen alpha-2(VI) chain Human genes 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022123 Hepatocyte nuclear factor 1-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000941585 Homo sapiens Collagen alpha-2(VI) chain Proteins 0.000 claims description 3
- 101001069727 Homo sapiens Paired mesoderm homeobox protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 102100033786 Paired mesoderm homeobox protein 1 Human genes 0.000 claims description 3
- WGZOTBUYUFBEPZ-UHFFFAOYSA-N SB 505124 Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(N=C(N2)C(C)(C)C)C=2C=C3OCOC3=CC=2)=N1 WGZOTBUYUFBEPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229960003603 decitabine Drugs 0.000 claims description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 229940124617 receptor tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 claims description 3
- VAZAPHZUAVEOMC-UHFFFAOYSA-N tacedinaline Chemical compound C1=CC(NC(=O)C)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1N VAZAPHZUAVEOMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 3-[[6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol Chemical compound NC1=CC=CC(C=2NC3=NC=NC(OC=4C=C(O)C=CC=4)=C3C=2)=C1 VPVLEBIVXZSOMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BVQCFCYPFJOOAV-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-n'-butylbenzohydrazide Chemical compound CCCCNNC(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 BVQCFCYPFJOOAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100030942 Apolipoprotein A-II Human genes 0.000 claims description 2
- 102100031457 Collagen alpha-1(V) chain Human genes 0.000 claims description 2
- 230000035131 DNA demethylation Effects 0.000 claims description 2
- 108010002156 Depsipeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029284 Hepatocyte nuclear factor 3-beta Human genes 0.000 claims description 2
- 101000793406 Homo sapiens Apolipoprotein A-II Proteins 0.000 claims description 2
- 101000941708 Homo sapiens Collagen alpha-1(V) chain Proteins 0.000 claims description 2
- 101001045758 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-beta Proteins 0.000 claims description 2
- 101001062347 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 3-beta Proteins 0.000 claims description 2
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000616465 Homo sapiens Sonic hedgehog protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000819088 Homo sapiens Transcription factor GATA-6 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000633054 Homo sapiens Zinc finger protein SNAI2 Proteins 0.000 claims description 2
- ZGSXEXBYLJIOGF-ALFLXDJESA-N IWR-1-endo Chemical compound C=1C=CC2=CC=CN=C2C=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1N1C(=O)[C@@H]2[C@H](C=C3)C[C@H]3[C@@H]2C1=O ZGSXEXBYLJIOGF-ALFLXDJESA-N 0.000 claims description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 101150008417 LIN gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100021382 Transcription factor GATA-6 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010083162 Twist-Related Protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010083176 Twist-Related Protein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100030398 Twist-related protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100031720 Twist-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029570 Zinc finger protein SNAI2 Human genes 0.000 claims description 2
- HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N [(E)-[2-(6-bromo-2-hydroxy-1H-indol-3-yl)indol-3-ylidene]amino] acetate Chemical compound CC(=O)O\N=C1\C(=Nc2ccccc12)c1c(O)[nH]c2cc(Br)ccc12 HUDSYNWJCPDHLL-CJLVFECKSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 claims description 2
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 claims description 2
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 claims description 2
- 102000044728 human SHH Human genes 0.000 claims description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N n-benzyl-2-(pyrimidin-4-ylamino)-1,3-thiazole-4-carboxamide Chemical compound C=1SC(NC=2N=CN=CC=2)=NC=1C(=O)NCC1=CC=CC=C1 DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000008262 pumice Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 229940126190 DNA methyltransferase inhibitor Drugs 0.000 claims 2
- 229940126560 MAPK inhibitor Drugs 0.000 claims 2
- OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 3-deazaneplanocin a Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=CC=2N1[C@@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H]1O OMKHWTRUYNAGFG-IEBDPFPHSA-N 0.000 claims 1
- DSFVSCNMMZRCIA-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1h-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl]amino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.N1C(C)=CN=C1C(C(=N1)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=CN=C1NCCNC1=CC=C(C#N)C=N1 DSFVSCNMMZRCIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101100055841 Danio rerio apoa1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100037126 Developmental pluripotency-associated protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 101000881868 Homo sapiens Developmental pluripotency-associated protein 4 Proteins 0.000 claims 1
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000803403 Homo sapiens Vimentin Proteins 0.000 claims 1
- 101000785626 Homo sapiens Zinc finger E-box-binding homeobox 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000976622 Homo sapiens Zinc finger protein 42 homolog Proteins 0.000 claims 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 claims 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 claims 1
- OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N romidepsin Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H]2CSSCC\C=C\[C@@H]1CC(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N2 OHRURASPPZQGQM-GCCNXGTGSA-N 0.000 claims 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 67
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 63
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 52
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 47
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 37
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 28
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 25
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 20
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 20
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 18
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 239000002144 L01XE18 - Ruxolitinib Substances 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 229960000215 ruxolitinib Drugs 0.000 description 14
- HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N ruxolitinib Chemical compound C1([C@@H](CC#N)N2N=CC(=C2)C=2C=3C=CNC=3N=CN=2)CCCC1 HFNKQEVNSGCOJV-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 14
- VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 3-chloro-N-[trans-4-(methylamino)cyclohexyl]-N-[3-(pyridin-4-yl)benzyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1C[C@@H](NC)CC[C@@H]1N(C(=O)C1=C(C2=CC=CC=C2S1)Cl)CC1=CC=CC(C=2C=CN=CC=2)=C1 VFSUUTYAEQOIMW-YHBQERECSA-N 0.000 description 13
- 102100031262 Deleted in malignant brain tumors 1 protein Human genes 0.000 description 13
- 101000844721 Homo sapiens Deleted in malignant brain tumors 1 protein Proteins 0.000 description 13
- 101001000628 Rattus norvegicus Peripheral myelin protein 22 Proteins 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 12
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 238000011160 research Methods 0.000 description 11
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 11
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 10
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 10
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 102000038624 GSKs Human genes 0.000 description 8
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 description 8
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 8
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 8
- 101710160552 Zinc finger protein 42 Proteins 0.000 description 8
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 8
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- XIVUGRBSBIXXJE-UHFFFAOYSA-N 7-[3-(dimethylamino)propoxy]-6-methoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)-n-(1-methylpiperidin-4-yl)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCN(C)CCC2)N=C2C=C(OCCCN(C)C)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C)CC1 XIVUGRBSBIXXJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N Benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 7
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 238000012552 review Methods 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- GEPYBHCJBORHCE-SFHVURJKSA-N 4-[(2s)-1-[2-[2-(3-chloro-4-methoxyphenyl)ethyl]-5-(3,5-dimethyl-1,2-oxazol-4-yl)benzimidazol-1-yl]propan-2-yl]morpholine Chemical compound C1=C(Cl)C(OC)=CC=C1CCC1=NC2=CC(C3=C(ON=C3C)C)=CC=C2N1C[C@H](C)N1CCOCC1 GEPYBHCJBORHCE-SFHVURJKSA-N 0.000 description 6
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 6
- 101000963360 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-79 specific Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 101710174353 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 6
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- MVCOAUNKQVWQHZ-UHFFFAOYSA-N doramapimod Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1N1C(NC(=O)NC=2C3=CC=CC=C3C(OCCN3CCOCC3)=CC=2)=CC(C(C)(C)C)=N1 MVCOAUNKQVWQHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 6
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 5
- 102100039489 Histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-79 specific Human genes 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 5
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 5
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 5
- 102100028974 PR domain zinc finger protein 14 Human genes 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 5
- 108010084091 heregulin beta1 Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 5
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 5
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- YKNAKDFZAWQEEO-IBGZPJMESA-N 1-[7-(3,4-dimethoxyphenyl)-9-[[(3s)-1-methylpiperidin-3-yl]methoxy]-3,5-dihydro-2h-1,4-benzoxazepin-4-yl]propan-1-one Chemical compound C1N(C(=O)CC)CCOC2=C1C=C(C=1C=C(OC)C(OC)=CC=1)C=C2OC[C@H]1CCCN(C)C1 YKNAKDFZAWQEEO-IBGZPJMESA-N 0.000 description 4
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012824 ERK inhibitor Substances 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 4
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 4
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 4
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 4
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 108010048992 Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 4
- 102100023489 Transcription factor 4 Human genes 0.000 description 4
- 102100033438 Tyrosine-protein kinase JAK1 Human genes 0.000 description 4
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 4
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N n-[2-chloro-5-(trifluoromethyl)phenyl]-2-[3-(4-ethyl-5-ethylsulfanyl-1,2,4-triazol-3-yl)piperidin-1-yl]acetamide Chemical compound CCN1C(SCC)=NN=C1C1CN(CC(=O)NC=2C(=CC=C(C=2)C(F)(F)F)Cl)CCC1 NFVJNJQRWPQVOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- DBZQFUNLCALWDY-PNHWDRBUSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(4-aminoimidazo[4,5-c]pyridin-1-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=CC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O DBZQFUNLCALWDY-PNHWDRBUSA-N 0.000 description 3
- ZPVQIJIWGMKMQN-UHFFFAOYSA-N ClC=1C=C(CNC(C2=CC(=CC(=C2)CN2C(N(C=C2)C)=N)C=2C(=NC(=CC=2)F)C)=O)C=CC=1Cl Chemical compound ClC=1C=C(CNC(C2=CC(=CC(=C2)CN2C(N(C=C2)C)=N)C=2C(=NC(=CC=2)F)C)=O)C=CC=1Cl ZPVQIJIWGMKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710169453 Hemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 101001128090 Homo sapiens Homeobox protein NANOG Proteins 0.000 description 3
- 101001123298 Homo sapiens PR domain zinc finger protein 14 Proteins 0.000 description 3
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 3
- 229940123685 Monoamine oxidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000055601 Nanog Homeobox Human genes 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 3
- 108010023606 Zinc Finger E-box-Binding Homeobox 1 Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229940125763 bromodomain inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002899 monoamine oxidase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetamide Chemical compound NC(=O)CC1=CC=CC=C1 LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100020925 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034744 Cell division cycle 7-related protein kinase Human genes 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010000063 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100031615 Ciliary neurotrophic factor receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 102000006312 Cyclin D2 Human genes 0.000 description 2
- 108010058544 Cyclin D2 Proteins 0.000 description 2
- 108010017222 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p57 Proteins 0.000 description 2
- 102000004480 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p57 Human genes 0.000 description 2
- 108010024491 DNA Methyltransferase 3A Proteins 0.000 description 2
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102100029109 Endothelin-3 Human genes 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 2
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 2
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 102100028999 High mobility group protein HMGI-C Human genes 0.000 description 2
- 101710091505 High mobility group protein HMGI-C Proteins 0.000 description 2
- 101000693913 Homo sapiens Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101000945740 Homo sapiens Cell division cycle 7-related protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 101000909249 Homo sapiens DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3B Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 2
- 101000804764 Homo sapiens Lymphotactin Proteins 0.000 description 2
- 101000990915 Homo sapiens Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000665381 Homo sapiens T-box transcription factor TBX2 Proteins 0.000 description 2
- 101000666775 Homo sapiens T-box transcription factor TBX3 Proteins 0.000 description 2
- 101000819074 Homo sapiens Transcription factor GATA-4 Proteins 0.000 description 2
- 101000652332 Homo sapiens Transcription factor SOX-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 description 2
- 101000976643 Homo sapiens Zinc finger protein ZIC 2 Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 2
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 239000012825 JNK inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021747 Leukemia inhibitory factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 2
- 102100032514 MARCKS-related protein Human genes 0.000 description 2
- 101710136868 MARCKS-related protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108010064527 OSM-LIF Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101710167114 PR domain zinc finger protein 14 Proteins 0.000 description 2
- 102000012850 Patched-1 Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010065129 Patched-1 Receptor Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010082093 Placenta Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100038721 T-box transcription factor TBX2 Human genes 0.000 description 2
- 102100038409 T-box transcription factor TBX3 Human genes 0.000 description 2
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710185710 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100021380 Transcription factor GATA-4 Human genes 0.000 description 2
- 102100030248 Transcription factor SOX-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- KLGQSVMIPOVQAX-UHFFFAOYSA-N XAV939 Chemical compound N=1C=2CCSCC=2C(O)=NC=1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 KLGQSVMIPOVQAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023492 Zinc finger protein ZIC 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710131563 Zinc finger protein ZIC 3 Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007348 cell dedifferentiation Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- SAQUSDSPQYQNBG-UHFFFAOYSA-N chembl355496 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C(N=O)=C1C1=C(O)NC2=CC(Br)=CC=C21 SAQUSDSPQYQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001335 demethylating effect Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004039 endoderm cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 101150090422 gsk-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 2
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940068935 insulin-like growth factor 2 Drugs 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 101150079478 jak1 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000021317 sensory perception Effects 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001779 taste bud Anatomy 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 210000002438 upper gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 229940121396 wnt pathway inhibitor Drugs 0.000 description 2
- XUGWUUDOWNZAGW-CNUIFLNQSA-N (1r,2s,5s)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-(hydroxymethyl)cyclopent-3-ene-1,2-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C=C(CO)[C@H](O)[C@@H]1O XUGWUUDOWNZAGW-CNUIFLNQSA-N 0.000 description 1
- PAXGPAVOMLKKDQ-IIZJFRANSA-N (1s,2r)-n-[1-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)ethyl]-2-phenylcyclopropan-1-amine Chemical compound C1([C@H]2C[C@@H]2NC(C)C=2C=C3OCCOC3=CC=2)=CC=CC=C1 PAXGPAVOMLKKDQ-IIZJFRANSA-N 0.000 description 1
- LNNHUAXCDFXQNM-BBBLOLIVSA-N (1s,2r,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3-(hydroxymethyl)cyclopent-3-ene-1,2-diol Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H]1O LNNHUAXCDFXQNM-BBBLOLIVSA-N 0.000 description 1
- XUGWUUDOWNZAGW-VDAHYXPESA-N (1s,2r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-(hydroxymethyl)cyclopent-3-ene-1,2-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1C=C(CO)[C@@H](O)[C@H]1O XUGWUUDOWNZAGW-VDAHYXPESA-N 0.000 description 1
- XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N (3S)-3-amino-4-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3S)-1-[[(1R,6R,12R,17R,20S,23S,26R,31R,34R,39R,42S,45S,48S,51S,59S)-51-(4-aminobutyl)-31-[[(2S)-6-amino-1-[[(1S,2R)-1-carboxy-2-hydroxypropyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]carbamoyl]-20-benzyl-23-[(2S)-butan-2-yl]-45-(3-carbamimidamidopropyl)-48-(hydroxymethyl)-42-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-59-(2-methylsulfanylethyl)-7,10,19,22,25,33,40,43,46,49,52,54,57,60,63,64-hexadecaoxo-3,4,14,15,28,29,36,37-octathia-8,11,18,21,24,32,41,44,47,50,53,55,58,61,62,65-hexadecazatetracyclo[32.19.8.26,17.212,39]pentahexacontan-26-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@@H]4CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc5ccccc5)NC(=O)[C@@H](NC1=O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](Cc1cnc[nH]1)NC3=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N2)C(=O)NCC(=O)N4)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XJOTXKZIRSHZQV-RXHOOSIZSA-N 0.000 description 1
- JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N (3S,6S,9S,12R)-3-[(2S)-Butan-2-yl]-6-[(1-methoxyindol-3-yl)methyl]-9-(6-oxooctyl)-1,4,7,10-tetrazabicyclo[10.4.0]hexadecane-2,5,8,11-tetrone Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCCCC(=O)CC)NC(=O)[C@H]2CCCCN2C(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-GMFLJSBRSA-N 0.000 description 1
- ZZUVBKWGQQCRMJ-BCNYZFJLSA-N (7s,9s)-6,9,11-trihydroxy-9-(2-hydroxyacetyl)-4-methoxy-7-[[4-methyl-1-[[4-methyl-6-[[(1s,3s)-3,5,12-trihydroxy-3-(2-hydroxyacetyl)-10-methoxy-6,11-dioxo-2,4-dihydro-1h-tetracen-1-yl]oxy]-2,3a,4,6,7,7a-hexahydropyrano[4,3-d][1,3]oxazol-1-yl]methyl]-2,3a,4 Chemical compound O=C1C2=CC=CC(OC)=C2C(=O)C(C(O)=C23)=C1C(O)=C3C[C@@](O)(C(=O)CO)C[C@@H]2OC(OC1C)CC2C1OCN2CN1COC(C(C)O2)C1CC2O[C@H]1C[C@](O)(C(=O)CO)CC2=C1C(O)=C(C(=O)C=1C(OC)=CC=CC=1C1=O)C1=C2O ZZUVBKWGQQCRMJ-BCNYZFJLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 1,5-naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1h-pyrazol-4-yl]- Chemical compound CC1=CC=CC(C2=C(C=NN2)C=2N=C3C=CC=NC3=CC=2)=N1 LBPKYPYHDKKRFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethyl Chemical group C[CH]N LLAPDLPYIYKTGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-5-[[2-[5-(trifluoromethyl)-1H-imidazol-2-yl]-4-pyridinyl]oxy]-N-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-benzimidazolamine Chemical compound N=1C2=CC(OC=3C=C(N=CC=3)C=3NC(=CN=3)C(F)(F)F)=CC=C2N(C)C=1NC1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 YABJJWZLRMPFSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical group NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004201 2,4-dichlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(*)=C(Cl)C([H])=C1Cl 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOECJCJVIMVJGX-UHFFFAOYSA-N 2-cyclohexyl-6-methoxy-N-(1-propan-2-yl-4-piperidinyl)-7-[3-(1-pyrrolidinyl)propoxy]-4-quinazolinamine Chemical compound N1=C(C2CCCCC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 QOECJCJVIMVJGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-aminophenyl)sulfonylaniline Chemical group NC1=CC=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(N)C=CC=2)=C1 LJGHYPLBDBRCRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- SQTLUXJWUCHKMT-UHFFFAOYSA-N 4-bromo-n,n-diphenylaniline Chemical compound C1=CC(Br)=CC=C1N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 SQTLUXJWUCHKMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDOQBOJDRPLBQU-QMMMGPOBSA-N 5-chloro-2-n-[(1s)-1-(5-fluoropyrimidin-2-yl)ethyl]-4-n-(5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound N([C@@H](C)C=1N=CC(F)=CN=1)C(N=1)=NC=C(Cl)C=1NC=1C=C(C)NN=1 PDOQBOJDRPLBQU-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QNOXYUNHIGOWNY-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethoxy-2-phenylquinoxaline Chemical compound N1=C2C=C(OC)C(OC)=CC2=NC=C1C1=CC=CC=C1 QNOXYUNHIGOWNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEXCGGWTIDNVNT-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethoxy-2-pyrrolidin-1-yl-n-(5-pyrrolidin-1-ylpentyl)quinazolin-4-amine Chemical compound C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCCC2)=NC=1NCCCCCN1CCCC1 WEXCGGWTIDNVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOMHEMQQCHEWDS-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-yl]amino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cc1cnc([nH]1)-c1cnc(NCCNc2ccc(cn2)C#N)nc1-c1ccc(Cl)cc1Cl OOMHEMQQCHEWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 6-bromoindirubin-3'-oxime Chemical compound O=C/1NC2=CC(Br)=CC=C2C\1=C\1/C(=N/O)/C2=CC=CC=C2N/1 DDLZLOKCJHBUHD-WAVHTBQISA-N 0.000 description 1
- AULLUGALUBVBDD-UHFFFAOYSA-N 7-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]ethoxy]-6-methoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)-N-(1-methyl-4-piperidinyl)-4-quinazolinamine Chemical compound N1=C(N2CCN(C)CCC2)N=C2C=C(OCCOCCN(C)C)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C)CC1 AULLUGALUBVBDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100034134 Activin receptor type-1B Human genes 0.000 description 1
- 102100030379 Acyl-coenzyme A synthetase ACSM2A, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100026024 Acyl-coenzyme A synthetase ACSM3, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000011403 Alexander disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000269332 Ambystoma mexicanum Species 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102100033715 Apolipoprotein A-I Human genes 0.000 description 1
- 101000931104 Arabidopsis thaliana DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3 Proteins 0.000 description 1
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 1
- 206010003594 Ataxia telangiectasia Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 229940125431 BRAF inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 240000005220 Bischofia javanica Species 0.000 description 1
- 235000010893 Bischofia javanica Nutrition 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241001457926 Brachys Species 0.000 description 1
- 206010068597 Bulbospinal muscular atrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102100025805 Cadherin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000220451 Canavalia Species 0.000 description 1
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 1
- 241000819038 Chichester Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 description 1
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 1
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100031785 Endothelial transcription factor GATA-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010072844 Endothelin-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000006397 Ephrin-B1 Human genes 0.000 description 1
- 108010044099 Ephrin-B1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N Ethyl hydrogen sulfate Chemical compound CCOS(O)(=O)=O KIWBPDUYBMNFTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 1
- 108010075641 GATA2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000011852 GATA2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039990 Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010061414 Hepatocyte Nuclear Factor 1-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100022373 Homeobox protein DLX-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100021090 Homeobox protein Hox-A9 Human genes 0.000 description 1
- 102100029433 Homeobox protein Hox-B9 Human genes 0.000 description 1
- 102100028707 Homeobox protein MSX-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100054737 Homo sapiens ACSM2A gene Proteins 0.000 description 1
- 101000799189 Homo sapiens Activin receptor type-1B Proteins 0.000 description 1
- 101000799193 Homo sapiens Activin receptor type-1C Proteins 0.000 description 1
- 101000733802 Homo sapiens Apolipoprotein A-I Proteins 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 101001066265 Homo sapiens Endothelial transcription factor GATA-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000841213 Homo sapiens Endothelin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001035089 Homo sapiens Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000901627 Homo sapiens Homeobox protein DLX-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000989000 Homo sapiens Homeobox protein Hox-B9 Proteins 0.000 description 1
- 101000985653 Homo sapiens Homeobox protein MSX-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000972291 Homo sapiens Lymphoid enhancer-binding factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001069723 Homo sapiens Paired mesoderm homeobox protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001109800 Homo sapiens Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform Proteins 0.000 description 1
- 101000685824 Homo sapiens Probable RNA polymerase II nuclear localization protein SLC7A6OS Proteins 0.000 description 1
- 101000610537 Homo sapiens Prokineticin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000932478 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 101000642514 Homo sapiens Transcription factor SOX-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000750283 Homo sapiens Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 201000008450 Intracranial aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 229940118135 JNK inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000027747 Kennedy disease Diseases 0.000 description 1
- 108010066327 Keratin-18 Proteins 0.000 description 1
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 1
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 1
- 102100022699 Lymphoid enhancer-binding factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000002569 Machado-Joseph Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000002740 Muscle Rigidity Diseases 0.000 description 1
- 208000008238 Muscle Spasticity Diseases 0.000 description 1
- 206010028570 Myelopathy Diseases 0.000 description 1
- JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N OT-Key 11219 Natural products N1C(=O)C(CCCCCC(=O)CC)NC(=O)C2CCCCN2C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CN(OC)C2=CC=CC=C12 JWOGUUIOCYMBPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002584 Octamer Transcription Factor-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010068425 Octamer Transcription Factor-3 Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZDJQTHVDDOVHR-UHFFFAOYSA-N PLX-4720 Chemical compound CCCS(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C(C(=O)C=2C3=CC(Cl)=CN=C3NC=2)=C1F YZDJQTHVDDOVHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033829 Paired mesoderm homeobox protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 208000032319 Primary lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100023136 Probable RNA polymerase II nuclear localization protein SLC7A6OS Human genes 0.000 description 1
- 102100040126 Prokineticin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 101710132455 Protein A2 Proteins 0.000 description 1
- 101710106115 Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- 101000713578 Rattus norvegicus Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 102100020718 Receptor-type tyrosine-protein kinase FLT3 Human genes 0.000 description 1
- 229940096885 Retinoic acid receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000608282 Sagiyama virus Species 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 1
- 239000004012 Tofacitinib Substances 0.000 description 1
- 102100036693 Transcription factor SOX-4 Human genes 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102100021162 Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010046298 Upper motor neurone lesion Diseases 0.000 description 1
- 238000008083 Urea Assay Methods 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000006269 X-Linked Bulbo-Spinal Atrophy Diseases 0.000 description 1
- KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CN=C1 Chemical group [C]1=CC=CN=C1 KPCZJLGGXRGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZPWXAOBLNYOHY-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=NC2=CC=CC=C12 Chemical group [C]1=CC=NC2=CC=CC=C12 SZPWXAOBLNYOHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000005005 aminopyrimidines Chemical group 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 108010082820 apicidin Proteins 0.000 description 1
- 229930186608 apicidin Natural products 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000005518 carboxamido group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N chembl1790180 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]2CSSC[C@@H](C(N[C@H](CC=3C=CC=CC=3)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](CCC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2)[C@H](C)O)=O)NC(=O)[C@@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](N)CSSC1)C1=CNC=N1 ZGOVYTPSWMLYOF-QEADGSHQSA-N 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 125000004188 dichlorophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- HWXIGFIVGWUZAO-UHFFFAOYSA-N doxofylline Chemical compound C1=2C(=O)N(C)C(=O)N(C)C=2N=CN1CC1OCCO1 HWXIGFIVGWUZAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004483 doxofylline Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003999 epithelial cell of bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018511 hepcidin Human genes 0.000 description 1
- 108060003558 hepcidin Proteins 0.000 description 1
- 229940066919 hepcidin Drugs 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 108010027263 homeobox protein HOXA9 Proteins 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000055650 human NRG1 Human genes 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002962 imidazol-1-yl group Chemical group [*]N1C([H])=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- ZGSXEXBYLJIOGF-BOPNQXPFSA-N iwr-1 Chemical compound C=1C=CC2=CC=CN=C2C=1NC(=O)C(C=C1)=CC=C1N1C(=O)[C@@H]2C(C=C3)CC3[C@@H]2C1=O ZGSXEXBYLJIOGF-BOPNQXPFSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000022013 kidney Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229950002216 linifanib Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000005949 negative regulation of histone deacetylation Effects 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- XUGWUUDOWNZAGW-UHFFFAOYSA-N neplanocin A Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1C=C(CO)C(O)C1O XUGWUUDOWNZAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000002902 organometallic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001811 primitive streak Anatomy 0.000 description 1
- 125000002572 propoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000004527 pyrimidin-4-yl group Chemical group N1=CN=C(C=C1)* 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000018198 spasticity Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 208000003001 spinal tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 229960001350 tofacitinib Drugs 0.000 description 1
- UJLAWZDWDVHWOW-YPMHNXCESA-N tofacitinib Chemical compound C[C@@H]1CCN(C(=O)CC#N)C[C@@H]1N(C)C1=NC=NC2=C1C=CN2 UJLAWZDWDVHWOW-YPMHNXCESA-N 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003862 vemurafenib Drugs 0.000 description 1
- GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N vemurafenib Chemical compound CCCS(=O)(=O)NC1=CC=C(F)C(C(=O)C=2C3=CC(=CN=C3NC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1F GPXBXXGIAQBQNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
公开了用于改进人类体细胞重编程为人化学诱导的多能细胞的培养条件的组合物和逐步方法。使用具有必要生物学活性的小分子组合的第一阶段,旨在下调体细胞基因程序。第二阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子来上调一个或多个多能性相关转录因子。第三阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子因子来建立初始多能性网络,通过OCT4的表达来测量。第四个即最后一个阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子来完全建立多能性网络,通过检测重编程细胞中的转录因子的共表达(例如OCT4、SOX2和NANOG)来进行测量。由此产生的重编程细胞被称为人化学诱导的多能干细胞,hCiPSC。
Description
技术领域
本发明一般涉及将体细胞化学重编程为具有多能干细胞特征的细胞的领域。
背景技术
在发育、稳态和疾病状态期间,细胞身份响应于来自微环境的外部信号而建立、维持和改变(1,2)。在植物和一些无脊椎动物中,外部刺激足以触发细胞去分化和再生(3,4)。然而,仅使用外部扰动来重新启动哺乳动物细胞(尤其是人类体细胞)的可塑性潜力是项艰巨的挑战,这是因为具有保护定型(committed)的细胞具有稳定的表观遗传景观(5,6)。使用小分子作为外部化学扰动来将小鼠体细胞诱导为多能干细胞的先前研究,证明了化学物质可促进细胞命运重编程(7-10)。作为控制细胞命运的高度可调的方法,小分子组合可以通过调节多个细胞信号通路和染色质状态来操纵细胞命运(11-12)。然而,人类体细胞的高效和稳健的重编程仍然需要改进,因为随着进化的发展,人类表观基因组更加稳定,并且可塑性降低(5-6,13-14)。
本发明的目的是提供可用于将人类体细胞重编程为多能细胞的小分子的组合。
本发明的另一个目的是提供以改进的效率将人类体细胞重编程为多能细胞的改进方法。
发明概述
公开了用于将人类体细胞改进成多能细胞的组合物和方法。所公开的方法通过采用四阶段重编程方法克服了现有技术方法的不足,该方法选择性地抑制/激活体细胞中的生物学活性的组合,从而允许改进的人类体细胞的重编程。第一阶段使用具有所需生物学活性的小分子组合(第I阶段因子),旨在下调体细胞基因程序。第二阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子(第II阶段因子)来上调一种或多种多能性相关转录因子。第三阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子因子(第III阶段因子)来建立初始多能性网络,其通过OCT4的表达来测量。第四阶段即最后阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子(第IV阶段因子)来完全建立多能网络,其通过重编程细胞(本文称为人化学诱导的多能干细胞,hCiPSC)中的共表达因子,例如OCT4、SOX2和NANOG进行测量。
选自具有以下生物学活性的小分子的第I阶段因子的优选组合:糖原激酶抑制剂,例如CHIR99021,TGFβ抑制剂,例如616452,和视黄酸受体(RAR)激动剂,例如TTNPB,用于通过将细胞在补充有第I阶段因子的细胞培养基中培养将细胞转化为单层上皮样细胞(第I阶段条件)的有效时间量,以在第I阶段将人类体细胞(例如,人成纤维细胞)转化为单层上皮样细胞。在一些优选的实施方案中,具有一种或多种以下生物学活性的小分子可以包括在第I阶段条件中:Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,例如Y27632;受体酪氨酸激酶抑制剂,例如ABT869;G蛋白偶联受体Smoothened的激动剂,例如SAG;Dot1L抑制剂,例如EPZ004777或EPZ5676;Jak1/Jak2抑制剂,例如鲁索利替尼(Ruxolitinib),SAH水解酶抑制剂,例如DZNep,和Menin-MLL相互作用抑制剂,例如VTP50469、MI3454或WDR5-IN-4(第I阶段补充因子)。
选自具有以下生物学活性的小分子的第II阶段因子的优选组合:糖原激酶抑制剂,例如CHIR99021,TGFβ抑制剂,例如616452,视黄酸受体(RAR)激动剂,例如TTNPB,G蛋白偶联受体Smoothened的激动剂(例如SAG)和c-Jun激酶抑制剂,例如JNKIN8用于通过将细胞在补充有第II阶段因子的培养基中培养上调一种或多种多能性相关转录因子(第II阶段条件)的有效时间量,以在第II阶段上调一种或多种多能性相关转录因子。在一些优选的实施方案中,具有一种或多种以下生物学活性的小分子可以包括在第II阶段条件中:DNA甲基转移酶抑制剂,例如5-氮杂胞苷,组蛋白去甲基化抑制剂,例如反苯环丙胺,Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,例如Y27632,受体酪氨酸激酶抑制剂,例如ABT869,G9a抑制剂,例如,UNC0224,BMP受体/AMPK抑制剂,例如Dorsomorphin,Jak1/Jak2抑制剂,例如鲁索利替尼,p38 MAPK抑制剂,例如BIRB796,CBP/p300溴结构域抑制剂,例如SGC-CBP30,I-CBP112、GNE272或GNE409,以及Menin-MLL相互作用抑制剂,例如VTP50469、MI3454或WDR5-IN-4(第II阶段补充因子)。
选自具有以下生物学活性的小分子的第III阶段因子的优选组合:组蛋白脱乙酰酶抑制剂,例如丙戊酸,MAPK抑制剂,例如PD0325901,TGFβ抑制剂,例如616452,和SAH水解酶抑制剂例如,DZNep用于通过将细胞在补充有第III阶段因子的细胞培养基中培养建立初始多能性网络(第III阶段条件)的有效时间量,以在第三阶段建立初始多能性网络,例如通过OCT4的表达进行测量。在一些优选的实施方案中,具有一种或多种以下生物学活性的小分子可以包括在第III阶段条件中:糖原激酶抑制剂,例如CHIR99021,Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,例如Y27632,SETD8抑制剂,例如Unc0379,组蛋白去甲基化的抑制剂,例如反苯环丙胺,以及Dot1L抑制剂,例如EPZ004777(第III阶段补充因子)。
选自具有以下生物学活性的小分子的第IV阶段因子的优选组合:B-Raf抑制剂,例如SB590885,和MAPK抑制剂,例如PD0325901用于通过将细胞在补充有第IV阶段因子的细胞培养基中培养完全建立多能网络(第IV阶段条件)的有效时间量,以在第四阶段完全建立多能网络,例如通过OCT4、SOX2和NANOG的表达进行测量。在一些优选的实施方案中,具有一种或多种以下生物学活性的小分子可以包括在第IV阶段条件中:Wnt抑制剂,例如IWP2,糖原激酶抑制剂,例如CHIR99021或CHIR98014,Rho相关的、含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,例如Y27632,和组蛋白脱乙酰酶抑制剂,例如丙戊酸(第IV阶段补充因子)。
所公开的方法可用于重编程从胎儿或成人供体组织分离的人类体细胞,例如人胚胎成纤维细胞、成人皮肤真皮成纤维细胞和成人脂肪来源的间充质基质细胞。
还提供了根据所公开的方法获得的细胞(例如,hCiPSC)。根据所公开的方法获得的细胞包括,例如,通过第I阶段的培养获得的上皮样细胞,其特征在于MMP1、ZEB1、VIM、COL1A1、COL5A1、COL6A2、PRRX1、SNAI2、TWIST1和TWIST2中的至少一种基因在早期阶段的下调,以及与LIN28A和KRT有关的至少一种基因,例如KRT8、KRT18、KRT19和LIN28A的上调;(ii)通过第I阶段和第II阶段的培养获得的具有再生程序的可塑性状态细胞,其特征在于它们表达SALL4和LIN28A中的至少一种,并且具有开放染色质位点数量增加和DNA去甲基化增加的解锁表观基因组状态;(iii)通过第I阶段、第II阶段和第III阶段的培养获得的XEN样细胞,其特征在于LIN28A、SALL4和OCT4中的至少一种基因上调,并且表达至少一种XEN(胚外内胚层)相关的标记物,例如GATA6、SOX17、FOXA2、HNF1B、APOA1和APOA2;和/或(iv)人化学诱导的多能干细胞,其特征在于它们表达至少一种表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4,以及核心多能性转录因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3和NANOG。hCiPSC的特征在于它们可以扩增超过20代,例如高达25、30、35、40、41、42代,以与hESC相似的倍增时间增殖。hCiPSC的特征还在于它们表达至少一种表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4,以及核心多能性转录因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3和NANOG。在优选的实施方案中,它们表达TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4。在第IV阶段结束时诱导的原代hCiPSC表达几种独特的标记物,例如发育多能性相关3(DPPA3)、Kruppel样因子17(KLF17)和DNA甲基转移酶3样(DNMT3L)。这些标记物在传统的人多能干细胞(hESC和hiPSC)中不表达。从功能上讲,当将hCiPSC注射到免疫缺陷小鼠体内时,产生的畸胎瘤含有所有3个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)的组织;hCiPSC在体外形成胚状体并表达三个胚层的标记基因,并且可以进行定向分化成为另一种定型的细胞类型,例如肝细胞,或定向分化为祖细胞,例如造血祖细胞。最重要的是,hCiPSC优选地不经过遗传改造,即不是通过包括通过向细胞中引入或从细胞中去除遗传元件来改变人类体细胞的过程获得的,例如改造体细胞以表达一种或多种多能性标记物,例如OCT4、SOX2、KLF4、NANOG和/或c-Myc,因此按照所公开的方法获得的hCiPSC优选不含有外源引入的OCT4、SOX2、KLF4、NANOG和/或c-Myc。
还提供了用于将人类体细胞重编程为人化学诱导的多能细胞(例如,用于所公开的方法中)的细胞培养基组合物或试剂盒。组合物或试剂盒可以包括本文公开的第I-IV阶段的一个或多个,优选全部的分子的组合的混合物。这些可以是具有限定浓度的形式,以促进添加到细胞培养基中来产生所需的浓度。该组合物或试剂盒可用于制备本文公开的第I-IV阶段中的一个或多个阶段的细胞。
因此,公开了用于改进人类体细胞重编程为人化学诱导多能细胞的培养条件的组合物和逐步方法。第一阶段,其使用具有必要生物学活性的小分子组合(第I阶段),旨在下调体细胞基因程序。第二阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子(第II阶段)来上调一个或多个与多能性相关转录因子。第三阶段使用具有选定生物学活性的一系列小分子因子(第III阶段)来建立初始多能性网络,通过OCT4的表达进行测量。第四阶段即最后阶段,使用具有选定生物学活性的一系列小分子(第IV阶段)来完全建立多能性网络,通过重编程细胞中的共表达因子(例如OCT4、SOX2和NANOG)进行测量。所得的重编程细胞被称为人化学诱导的多能干细胞,hCiPSC。
此外,本文公开的培养条件的组合物和逐步方法可以产生干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的来源,其具有产生所需细胞类型的能力,并且对于治疗性治疗、组织改造和研究很重要。通过该文件中描述的方法获得的细胞,包括hCiPSC、XEN样细胞、可塑性状态细胞和上皮样细胞,是干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的容易获得的来源,其表达至少一种干细胞或祖细胞相关标记物,例如LIN28A、SALL4、OCT4或NANOG。尽管在本文件中,为了简洁起见,干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的来源被指定为hCiPSC,但是本领域技术人员将理解,通过本文件描述的方法获得的XEN样细胞、可塑性状态细胞和上皮样细胞也可以类似地用作干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的来源。
此外,本申请中的小分子组合物可用于体外和体内的组织再生、修复和更新。例如,可以配制用于重编程过程第I阶段和第I阶段I的小分子用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触,以促进体内或体外/离体的去分化、再生、修复和更新。
附图说明
图1A-D和1J显示小分子化合物产生hCiPSC。图1A为从成纤维细胞到hCiPSC的化学重编程过程的示意图。图1B显示了小鼠化学重编程条件处理后人胚胎成纤维细胞的形态学变化。比例尺,100μm。代表至少三个独立实验。图1C显示未处理的HEF的形态。图1D显示源自HEF的hCiPSC的形态(hCiPSC-1117-1#-p21)。图1E显示了hCiPSC诱导过程中每个阶段结束时的细胞代表性图像。比例尺,100μm。代表至少三个独立实验。图1F-I显示hCiPSC诱导期间基因表达的定量PCR验证。图1F和1G显示了在第I阶段结束时成纤维细胞相关基因、上皮细胞相关基因和LIN28A的相对表达。图1H显示了第II阶段结束时LIN28A和SALL4的相对表达。图1I显示了在第III阶段结束时LIN28A、SALL4和OCT4的相对表达。误差线,均值(SD)。代表三个独立实验。图1J为hCiPSC和hESC中的多能性标记物的RT-qPCR分析。比例尺,100μm。误差线,均值(SD);n=3。
图2A-2E显示了从成体体细胞产生hCiPSC。图2A为成人hADSC和hADSC衍生的hCiPSC的代表性图像。图2B为所示hCiPSC和hESC中的多能性标记物的RT-qPCR分析。图2C为hCiPSC、hESC和成体体细胞的全局转录组谱的层次聚类。图2D为hADSC和hADSC衍生的hCiPSC(hCiPSC-0809-3#)OCT4和NANOG启动子基因座中DNA CpG甲基化状态的亚硫酸氢盐测序分析。图2E为hCiPSC来源的畸胎瘤切片(hCiPSC-0809-3#和hCiPSC-1003#)的苏木精和曙红染色。对于每个hCiPSC克隆,所有图像均从单个畸胎瘤获得,该畸胎瘤含有外胚层、中胚层和内胚层的代表性组织特征。
图3A显示了在第I阶段下调和在第II阶段上调的基因的基因本体论分析。使用HEF和hADSC的四批独立实验用于分析重叠的差异表达基因。图3B为显示了在成纤维细胞和第II阶段中通过sc-ATAC-seq检测到的开放基因的热图。图3C为在成纤维细胞、第I阶段和第II阶段中不同DNA CpG甲基化状态的分布。代表三个独立实验。图3D为显示了成纤维细胞、第I阶段和第II阶段中甲基化基因启动子的数量的维恩图。图3E为所示GO术语中基因的基因表达富集、染色质可及性和DNA甲基化状态。
图4A-F显示了早期阶段调节可塑性特征的关键小分子的数据。图4A和4B为第I阶段结束时LIN28A和成纤维细胞标记物基因的表达,以及从第I阶段撤回个别化学物质后重编程结束时hCiPSC集落的数量。代表三个独立实验。图4C和4D为从第II阶段撤回个别化学物质后,第II阶段的SALL4阳性集落和重编程结束时hCiPSC集落的数量。代表三个独立实验。图4E为显示所示样品的所示基因表达的热图。图4F为撤回个别化学物质后第II阶段中开放基因座的信号密度。图4G为从第II阶段撤回个别化学物质后的DNA甲基化水平。图4H.从第II阶段撤回个别化学物质后,所示GO术语中基因的基因表达富集、染色质可及性和DNA甲基化状态。图4I.早期阶段重编程过程中关键分子事件的示意图。误差线,均值(SD);n=3。
图5A显示了hCiPSC的表征,示例为hCiPSC和hESC的计算的倍增时间。误差线,均值(SD)。图5B和C显示了hCiPSC中的全局基因表达分析。图5B.比较hCiPSC、hESC和HEF中的全局基因表达的散点图。代表三个独立实验。图5C.hCiPSC、hESC和HEF全局转录组谱的层次聚类。通过I-spearman相关系数计算距离。图5D显示了成纤维细胞、原代hCiPSC和人胚胎干细胞(hESC)中Kruppel样因子17(KLF17)、发育多能性相关3(DPPA3)和DNA甲基转移酶3样(DNMT3L)的表达。
图6A-6C显示了hCiPSC体外定向分化为造血谱系细胞。图6A和6B.通过FACS分析计数CD34/CD144双阳性和CD34/CD31双阳性细胞的百分比。误差线,均值(SD);n=3。图6C.通过FACS分析计数hCiPSC来源的T祖细胞的百分比。
图7A-D显示了hCiPSC体外定向分化为肝细胞。图7A.对AFP和ALB双阳性hCiPSC来源的肝祖细胞(HPC)的FACS分析。图7B.hCiPSC来源的肝细胞(hdHeps)形态。比例尺,100/lm。图7C.hdHeps和原代人肝细胞(PHH)的尿素和ALB分泌的定量分析。图7D.对hiPSC、HPC、hdHeps和PHH中的功能性肝细胞标记物基因的RT-qPCR分析。将相对表达归一化为PHH。误差线,均值(SD);n=3。
图8显示核型分析,其显示具有正常二倍体染色体含量的REF来源的hCiPSC。
图9A-D显示了促进hADSC重编程效率的小分子的结果。图9A.从hADSC诱导hCiPSC期间每个阶段结束时的细胞代表性图像。比例尺,100flm。图9B和9C为促进在第I阶段和第II阶段从hADSC产生hCiPSC的小分子及其组合的鉴定。EPZ,EPZ004777;Ruxo,鲁索利替尼;BIRB,BIRB796;U2,UNC0224;DM,多索吗啡(Dorsomorphin)。误差线,均值(SD);n=3。图9D.不同时间过程下从hADSC产生的hCiPSC集落的数量。“8+8+8+7”分别表示每个阶段的连续持续时间。误差线,均值(SD);n=4。上述所有结果代表至少三个独立实验。
图10A-B显示源自hADSC的hCiPSC的表征。图10A.hCiPSC、hESC和hADSC中OCT4和NANOG启动子区域的亚硫酸氢盐基因组测序。图10B.显示hADSC来源的hCiPSC的正常二倍体染色体含量的核型分析。
图11A-C显示了源自人成人皮肤成纤维细胞(hASF)的hCiPSC的表征。图11A.代表性成人hASF和hASF来源的hCiPSC的图像。图11B.对所示hCiPSC和hESC中多能性标记物的实时qPCR分析;每组6个条中的条从左到右标记如下:1=hCiPSCs-0408-1#;2=hCiPSCs-0408-2#;3=hCiPSCs-1230-4#;4=hCiPSCs-1230-11#;5=H1;6=H9)。图11C.显示hASF来源的hCiPSC的正常二倍体染色体含量的核型分析。
图12A-B显示了在第III阶段诱导XEN样状态。图12A.如RT-qPCR显示,化学重编程过程中XEN相关标记物的动态表达变化。误差线,均值(SD);n=3。代表三个独立实验。图12B.在5批独立实验中,XEN样集落内部(黑色)和外部(红色)产生的OCT4阳性细胞的百分比。每个实验批次计数超过3个孔。
图13A-C显示了第III阶段结束时的细胞的单细胞RNA测序分析。图13A.第III阶段原始内胚层(也称为XEN)相关标记物的表达。图13B.在人植入前胚胎及第Ⅲ阶段细胞簇中原始内胚层相关基因的表达。图13C.XEN样细胞(簇2)中原始内胚层相关特征的富集评分的GSEA分析。
图14是重编程过程中关键分子事件的示意图。
图15A-C显示了从第I阶段条件中撤回个别化学物质的影响。(A)在第I阶段所示处理后细胞的全局转录谱的层次聚类。(B)和(C)去除CHIR、616452和TTNPB后不同表达基因的基因本体论分析。
图16A-C显示了从第II阶段条件中撤回个别化学物质的影响。(A和B)在第II阶段结束时撤回所示化学物质后SALL4的表达和细胞数量。误差线,均值SD(n=3)。****p<0.0001。代表三个独立实验。(C)去除JNKIN8后差异表达基因的基因本体论分析。
图17显示了从第I阶段、第II阶段、第III阶段和第IV阶段去除单个小分子后的重编程效率,并且可以通过这些数据来鉴定核心小分子。
图18显示了第I阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(GSK3β抑制剂;RA途径激动剂;Rock抑制剂;TGFβ抑制剂)替换后的重编程效率。
图19显示了第II阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(GSK3β抑制剂;RA途径激动剂;Rock抑制剂;TGFβ抑制剂)替换后的重编程效率。
图20显示了第II阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(Smoothened激动剂;组蛋白去甲基化抑制剂;DNMT抑制剂;JNK抑制剂)替换后的重编程效率。
图21显示了第III阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(GSK3β抑制剂;TGFβ抑制剂;Rock抑制剂;组蛋白去甲基化抑制剂和Rock抑制剂)替换后的重编程效率。
图22显示了第III阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(HDAC抑制剂;Dot1L抑制剂;S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶抑制剂;ERK抑制剂)替换后的重编程效率。
图23显示了第IV阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(GSK3β抑制剂;ERK抑制剂;Rock抑制剂;WNT途径抑制剂)替换后的重编程效率。
图24显示了第IV阶段的小分子被靶向相同途径或靶标的其他小分子(BRAF抑制剂和HDAC抑制剂)替换后的重编程效率。
图25示出了小分子化合物对hCiPSC的诱导过程。
图26显示包括SGC-CBP30、I-CBP112、GNE272和GNE409的CBP/p300抑制剂可以改进重编程效率。
图27显示Menin-MLL相互作用抑制剂可以改进重编程效率。
图28显示SETD8抑制剂可以改进重编程效率。
图29显示了改进第I阶段重编程效率的最小化学组合和小分子。
图30显示了改进第II阶段重编程效率的最小化学组合和小分子。
图31显示了改进第III阶段重编程效率的最小化学组合和小分子。
图32显示了改进第IV阶段重编程效率的最小化学组合和小分子。
发明详述
外部刺激足以引发植物和一些无脊椎动物的细胞去分化和再生。然而,由于其定型的细胞身份和稳定的表观基因组,人类体细胞可以抵抗外部扰动,来将其可塑性调节为不受限制的效力。在这里,具有选定生物学活性的小分子组合作为外部化学扰动,通过类似于自然再生的去分化过程,允许有效地重新编程分化的人类体细胞的表观遗传景观。这种体细胞的化学重编程导致人化学诱导的多能干细胞(hCiPSC)在转录组谱、表观遗传状态和发育潜力方面表现出多能干细胞的关键特征。所公开的方法提供了产生用于应用的人多能干细胞的平台。此外,本文公开的研究还揭示了治疗性重编程,其中人类体细胞的可塑性潜力可以通过体外和体内两者的外部刺激来调节。
I.定义
本文使用的术语“化学诱导的多能干细胞”(CiPSC)是指通过将非多能细胞与化学化合物接触而不是通过表达一种或多种转染基因获得的来源于非多能细胞(即多能或分化的细胞)的多能细胞。
如本文所用,“培养物”是指在培养基中生长并任选传代的细胞群。细胞培养物可以是原代培养物(例如,尚未传代的培养物)或者可以是二次或后续培养物(例如,已经传代培养或传代一次或多次的细胞群)。
如本文所用,“增强”或“增加”重编程的效率是指减少总的重编程时间、增加从培养相同时间长度的相同起始细胞密度获得的重编程细胞的数量和/或改进重编程细胞的质量,当与不使用增强因子(小分子)的化学重编程方法相比时,其在从细胞表达多能性因子(例如OCT4、SOX2和NANOG)的能力以及培养物中的传代次数选择的特征方面测量。
当提及CiPSC时,术语“分离的”或“纯化的”是指化学诱导的多能干细胞至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%不含污染细胞类型,例如非多能细胞。分离的干细胞还可以基本上不含可溶的天然存在的分子。
本文所用的术语“多能性”(或多能的)是指细胞分化成三个胚层中的任一个的潜力:内胚层(例如,胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如,肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖系统)或外胚层(例如,表皮组织和神经系统)。术语“非多能的”是指细胞不具有分化成所有三个胚层的潜力。多能干细胞的可塑性较差,分化程度更高,并且可以成为给定器官内几种类型的细胞之一。例如,多能血液干细胞可以发育成红细胞祖细胞、白细胞或血小板生成细胞。成体干细胞是多能干细胞。脂肪来源的干细胞具有多能性。
本文所用的“重编程”是指一种特定细胞类型向另一种细胞类型的转化。例如,非多能的人类体细胞可以被重编程为多能细胞。当使用化学化合物将非多能细胞重编程为多能细胞时,所得细胞是化学诱导的多能干细胞。
术语“小分子”是指分子量小于2,000道尔顿,更优选小于1,500道尔顿,并最优选小于1,000道尔顿的分子,例如有机或有机金属化合物。
术语“去分化的”是指从分化程度较高的状态反向发育成分化程度较低的状态的细胞或组织。细胞或组织获得了不太成熟的外观、基因表达、表观遗传状态或代谢谱。
术语“可塑性”是指细胞或组织具有其他细胞或组织的特征的能力。细胞可塑性表明细胞具有克服跨谱系限制边界并产生其他细胞类型的巨大潜力。
II.组合物
A.用于在人类体细胞中改进多能性的诱导的小分子
可用于改善人类体细胞重编程为人化学诱导多能细胞的化学化合物包括具有小于2,000道尔顿,更优选小于1,500道尔顿,最优选小于1,000道尔顿分子量的单独小分子,或其与蛋白质的组合。小分子可以具有小于或等于900道尔顿或者,小于或等于500道尔顿的分子量。
因此,已鉴定出小分子混合物,其抑制/激活选定细胞活性的组合,改进化学重编程的四阶段过程中人类体细胞重编程为人化学诱导的多能细胞(无需对细胞进行遗传改造以表达一种或多种多能性标记物,例如Oct4)的重编程。通过选择性抑制/激活所公开的生物学活性来改进人类体细胞的重编程例如可以被确定为例如重编程细胞的改进质量,当与不使用本文公开的生物学活性的抑制/激活的组合的化学重编程方法相比,其在选自细胞单独表达多能性因子例如OCT4、SOX2和NANOG或与至少一种表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4的组合的能力的特征,和/或培养物中的(重编程细胞的)传代次数方面测量。
用于重编程过程的第I阶段的小分子包括具有生物学活性的小分子的组合(本文为第I阶段条件),其选自:糖原激酶抑制剂,在优选实施方案中使用CHIR99021,TGFβ抑制剂,在优选实施方案中使用616452,和视黄酸受体(RAR)激动剂,在优选实施方案中使用TTNPB。在一些实施方案中,具有选定生物学活性的额外小分子包含在第I阶段条件中,例如Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的抑制剂,在优选实施方案中使用Y27632或Tzv,受体酪氨酸激酶抑制剂,在优选实施方案中使用ABT869,以及受体Smoothened的激动剂,在优选实施方案中使用SAG。
第I阶段条件用于将人类体细胞例如人成纤维细胞、脂肪来源的基质细胞等转化为单层上皮样细胞,并且可以任选地补充第I阶段补充生物学活性,例如SAH水解酶抑制剂,在优选实施方案中使用DZNep,DOT1L甲基转移酶抑制剂,在优选实施方案中使用EPZ004777,以及JAK1/JAK2抑制剂,在优选实施方案中使用鲁索利替尼。
用于重编程过程的第II阶段的小分子包括具有选定生物学活性的小分子的组合(本文中,第II阶段条件)(i)第I阶段因子:糖原激酶抑制剂,在优选实施方案中使用CHIR99021,TGFβ抑制剂,在优选实施方案中使用616452,Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,在优选实施方案中使用Y27632,以及受体Smoothened的激动剂,在优选实施方案中使用SAG(尽管嘌吗啡胺(Purmorphamine);Hh-Ag1.5;SAG 21K或人SHH可用作受体Smoothened的激动剂)和受体酪氨酸激酶抑制剂,在优选实施方案中使用ABT869;(ii)第I阶段补充因子:JAK1/2抑制剂,在优选实施方案中使用鲁索利替尼;(iii)第II阶段因子:组蛋白去甲基化抑制剂,在优选实施方案中使用反苯环丙胺(Tranylcypromine),DNA甲基转移酶抑制剂,在优选实施方案中使用5-氮杂胞苷(尽管地西他滨和RG108也可以用作表观遗传调节剂),和c-Jun激酶抑制剂,在优选实施方案中使用JNKIN8(尽管Sp600125;JNK-in-5;或JNK-in-7;JNK-in-12也可以用作c-Jun激酶抑制剂)。
将第II阶段条件添加到用第I阶段条件处理的细胞中,以上调一种或多种多能性相关的转录因子,并且可以任选地补充第II阶段补充因子例如G9a抑制剂,在优选实施方案中使用UNC0224(尽管Unc0638和Unc0321可以用作G9a抑制剂),JAK1/2抑制剂,在优选实施方案中使用鲁索利替尼(尽管托法替尼;和AZD1480可以用作JAK1/2抑制剂),p38 MAPK抑制剂,在优选实施方案中使用BIRB796,BMP受体/AMPK抑制剂,在优选实施方案中使用Dorsomorphin,和在优选实施方案中使用的CBP/p300溴结构域抑制剂SGC-CBP30。
用于重编程过程的第III阶段的小分子包括具有选定生物学活性(本文中,第III阶段条件)的小分子的组合,其选自:(i)第I阶段因子:糖原激酶抑制剂,在优选实施方案中使用CHIR99021,TGFβ抑制剂,在优选实施方案中使用616452;(ii)第I阶段补充因子:SAH水解酶抑制剂,在优选实施方案中使用DZNep,DOT1L甲基转移酶抑制剂,在优选实施方案中使用EPZ004777酸;(iii)第II阶段因子:组蛋白去甲基化抑制剂,在优选实施方案中使用反苯环丙胺;和(iv)第III阶段因子:组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂,在优选实施方案中使用丙戊酸,Rho相关、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,在优选实施方案中使用Y27632,和MAPK抑制剂,在优选实施方案中使用PD0325901(尽管也可以使用AZD8330、TAK-733和曲米替尼(Tramitinib)代替PD0325901),以及SETD8抑制剂,在优选实施方案中使用Unc0379。
将第III阶段条件添加到用第II阶段条件处理的细胞中,以建立初始多能性网络,其通过OCT4的表达进行测量。
用于重编程过程的第IV阶段的小分子包括具有选定生物学活性的小分子的组合(本文中,第IV阶段条件),其选自:(i)第I阶段因子:糖原激酶抑制剂,在优选实施方案中使用CHIR99021,和Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,在优选实施方案中使用Y27632;(ii)第I阶段补充因子:SAH水解酶抑制剂,在优选实施方案中使用DZNep,DOT1L甲基转移酶抑制剂,在优选实施方案中使用EPZ004777酸;(iii)第II阶段因子:组蛋白去甲基化的抑制剂,在优选实施方案中使用反苯环丙胺;(iv)第III阶段因子:MAPK抑制剂,在优选实施方案中使用PD0325901,组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂,在优选实施方案中使用丙戊酸,和(v)第IV阶段因子:B-Raf抑制剂,在优选实施方案中使用SB590885,和Wnt抑制剂,在优选实施方案中使用IWP2。
在一些优选的实施方案中,第I阶段的小分子选自以下组合:CHIR99021+616452+TTNPB、CHIR99021+616452+CH55、CHIR99021+616452+AM580、CHIR99021+A8301+TTNPB、CHIR99021+A8301+CH55、CHIR99021+A8301+AM580、CHIR99021+SB431542+TTNPB、CHIR99021+SB431542+CH55、CHIR99021+SB431542+AM580、CHIR99021+LY2109761+TTNPB、CHIR99021+LY2109761+CH55、CHIR99021+LY2109761+AM580、TD114-2+616452+TTNPB、TD114-2+616452+CH55、TD114-2+616452+AM580、TD114-2+A8301+TTNPB、TD114-2+A8301+CH55、TD114-2+A8301+AM580、TD114-2+SB431542+TTNPB、TD114-2+SB431542+CH55、TD114-2+SB431542+AM580、TD114-2+LY2109761+TTNPB、TD114-2+LY2109761+CH55、TD114-2+LY2109761+AM580、CHIR98014+616452+TTNPB、CHIR98014+616452+CH55、CHIR98014+616452+AM580、CHIR98014+A8301+TTNPB、CHIR98014+A8301+CH55、CHIR98014+A8301+AM580、CHIR98014+SB431542+TTNPB、CHIR98014+SB431542+CH55、CHIR98014+SB431542+AM580、CHIR98014+LY2109761+TTNPB、CHIR98014+LY2109761+CH55、CHIR98014+LY2109761+AM580、GSK3bi XV+616452+TTNPB、GSK3bi XV+616452+CH55、GSK3bi XV+616452+AM580、GSK3bi XV+A8301+TTNPB、GSK3bi XV+A8301+CH55、GSK3bi XV+A8301+AM580、GSK3bi XV+SB431542+TTNPB、GSK3bi XV+SB431542+CH55、GSK3bi XV+SB431542+AM580、GSK3bi XV+LY2109761+TTNPB、GSK3bi XV+LY2109761+CH55、GSK3bi XV+LY2109761+AM580。
在一些优选的实施方案中,第II阶段的小分子选自以下组合:CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-7、CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-12、CHIR99021+616452+TTNPB+嘌吗啡胺(Purmorphamine)+JNK-in-8、CHIR99021+616452+TTNPB+Hh-ag-1.5+JNK-in-8、CHIR99021+616452+CH55+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+616452+AM580+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+A8301+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+SB431542+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+LY2109761+TTNPB+SAG+JNK-in-8、TD114-2+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR98014+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、GSK3biXV+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8。
在一些优选的实施方案中,第III阶段小分子选自以下组合:VPA+Dznep+PD0325901+616452、VPA+Dznep+AZD8330+616452、VPA+Dznep+TAK733+616452、VPA+Dznep+曲米替尼+616452、VPA+Adox+PD0325901+616452、VPA+Adox+AZD8330+616452、VPA+Adox+TAK733+616452、VPA+Adox+曲米替尼+616452、VPA+Nepa+PD0325901+616452、VPA+Nepa+AZD8330+616452、VPA+Nepa+TAK733+616452、VPA+Nepa+曲米替尼+616452、MS275+Dznep+PD0325901+616452、MS275+Dznep+AZD8330+616452、MS275+Dznep+TAK733+616452、MS275+Dznep+曲米替尼+616452、MS275+Adox+PD0325901+616452、MS275+Adox+AZD8330+616452、MS275+Adox+TAK733+616452、MS275+Adox+曲米替尼+616452、MS275+Nepa+PD0325901+616452、MS275+Nepa+AZD8330+616452、MS275+Nepa+TAK733+616452、MS275+Nepa+曲米替尼+616452、LMK235+Dznep+PD0325901+616452、LMK235+Dznep+AZD8330+616452、LMK235+Dznep+TAK733+616452、LMK235+Dznep+曲米替尼+616452、LMK235+Adox+PD0325901+616452、LMK235+Adox+AZD8330+616452、LMK235+Adox+TAK733+616452、LMK235+Adox+曲米替尼+616452、LMK235+Nepa+PD0325901+616452、LMK235+Nepa+AZD8330+616452、LMK235+Nepa+TAK733+616452、LMK235+Nepa+曲米替尼+616452、丁酸盐+Dznep+PD0325901+616452、丁酸盐+Dznep+AZD8330+616452、丁酸盐+Dznep+TAK733+616452、丁酸盐+Dznep+曲米替尼+616452、丁酸盐+Adox+PD0325901+616452、丁酸盐+Adox+AZD8330+616452、丁酸盐+Adox+TAK733+616452、丁酸盐+Adox+曲米替尼+616452、丁酸盐+Nepa+PD0325901+616452、丁酸盐+Nepa+AZD8330+616452、丁酸盐+Nepa+TAK733+616452、丁酸盐+Nepa+曲米替尼+616452。
在一些优选的实施方案中,第IV阶段的小分子选自以下组合:PD0325901+SB590885、PD0325901+索拉非尼、PD0325901+GDC0879、AZD8330+SB590885、AZD8330+索拉非尼、AZD8330+GDC0879、TAK733+SB590885、TAK733+索拉非尼、TAK733+GDC0879、曲米替尼+SB590885、曲米替尼+索拉非尼、曲米替尼+GDC0879。
GSK(糖原合成激酶)抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中GSK的抑制。优选的GSK抑制剂是氨基嘧啶,CHIR99021,其化学名称为[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈]。其他GSK抑制剂也可以用于本文公开的方法中,它们包括但不限于BIO-丙酮肟;GSK 3I抑制剂XV;SB-216763[3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮];CHIR 99021三盐酸盐,其是CHIR99021的盐酸盐;GSK-3抑制剂IX[((2Z,3E)-6'-溴-3-(羟基亚氨基)-[2,3'-二吲哚满叉]-2'-酮]([((2Z,3E)-6’-bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3’-biindolinylidene]-2’-one]);GSK 3 IX[6-溴靛玉红-3'-肟];GSK-3β抑制剂XII[3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚];GSK-3抑制剂XVI[6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙基-氨基)-烟腈];SB-415286[3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮];Bio[(2'Z,3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟];TD114-2[6,7,9,10,12,13,15,16,18,19-十氢-5,29:20,25-二亚甲基-26H-二苯并[n,t]吡咯[3,4-q][1,4,7,10,13,22]tetraoxadiazacyclotetracosine-26,28(27H)-二酮];和CHIR98014[N6-[2-[[4-(2,4-]二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺],其以等于3-12μM CHIR99021的浓度使用。
TGFβ受体抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中的TGFβ的抑制。在一些实施方案中,TGFβ抑制剂优选抑制TGFβ1型受体激活受体样激酶(ALK)5,并且在其他实施方案中还可以抑制ALK4和结节型受体1受体ALK7。
优选的TGFβ受体抑制剂是616452[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶]。其他TGFβ抑制剂是本领域已知的并且是可商购的。实例包括A 83-01[3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺];SB 505124[2-[4-(1,3-苯并间二氧杂环戊烷-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶];GW 788388[4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺];和SB 525334[6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉]和多索吗啡(dorsomorphine)。
组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重新编程的细胞中组蛋白脱乙酰化的抑制。优选的组蛋白脱乙酰酶抑制剂是丙戊酸。然而,其他组蛋白脱乙酰酶抑制剂是可商购的并且可以使用。非限制性实例包括阿哌丁(apicidin)[环(N-O-甲基-L-色氨酸基-L-异亮氨酸基-D-哌啶基-L-2-氨基-8-氧代癸酰基)];LMK235[N-[[6-(羟基氨基)-6-氧代己基]氧基]-3,5-二甲基苯甲酰胺];MS275[(吡啶-3-基)甲基4-(2-氨基苯基氨基甲酰基)苄基氨基甲酸酯];CI994[N-乙酰地那林4-(乙酰氨基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺];缩酚肽;KD 5170[S-[2-[6-[[[4-[3-(二甲基氨基)丙氧基]苯基]磺酰基]氨基]-3-吡啶基]-2-氧代乙基]乙硫酸酯];4-pehynl丁酸钠;丁酸钠[丁酸钠盐];UF 010[4-溴-N'-丁基苯甲酰肼]和HDACi IV等
组蛋白去甲基化的抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中组蛋白去甲基化的抑制。优选的组蛋白去甲基化抑制剂是反苯环丙胺。反苯环丙胺是非选择性且不可逆的单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。另一种有用的MAOI(其也是组蛋白去甲基化的抑制剂)包括RN-1[2-((1R,2S)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮二盐酸盐];GSK2879[4-{[4-({[(1R,2S)-2-苯基环丙基]氨基}甲基)哌啶-1-基]甲基}苯甲酸];S2101[(1R,2S)-2-[2-(苄氧基)-3,5-二氟苯基]环丙-1-胺盐酸盐];LSD1-C76[(1R,2S)-N-(1-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二恶英-6-基)乙基)-2-苯基环丙胺]等。
视黄酸受体(RAR)激动剂
所公开的重编程方案涉及被重新编程的细胞中视黄酸受体的激活。优选的RAR激动剂是TTNPB[4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸]。其他可以使用的包括Ch 55[4-[(1E)-3-[3,5-双(1,1-二甲基乙基)苯基]-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸],其是对RAR-α和RAR-β受体具有高亲和力并对细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)具有低亲和力的高效能合成类视黄醇];AM580([4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰氨基]苯甲酸];视黄酸类似物,其充当选择性RARα激动剂);
SAH水解酶抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中SAH的抑制。优选的SAH水解酶抑制剂是3-去氮腺嘌呤A(deazaneplanocin A)(DZNep)[(1S,2R,5R)-5-(4-氨基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1,2-二醇]。可以包含在本文公开的CIP组合组合物中的其他有用的SAH水解酶抑制剂包括但不限于(-)腺苷类似物A(Neplanocin A)(NepA)[5R-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-(羟甲基)-3-环戊烯-1S,2R-二醇];Adenozine高碘酸盐氧化(Adox)[(2S)-2-[(1R)-1-(6-氨基嘌呤-9-基)-2-氧代乙氧基]-3-羟基丙醛]和3-脱氮腺苷(DZA)[1-β-D-呋喃核糖基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4-胺]及其组合。
DOT1L甲基转移酶抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中DOT1L甲基转移酶的抑制。优选的DOT1L甲基转移酶抑制剂包括SGC 0946[1-[3-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基](异丙基)氨基]丙基]-3-[4-(2,2-二甲基乙基)苯基]脲];EPZ004777[7-[5-脱氧-5-[[3-[[[[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]氨基]羰基]氨基]丙基](1-甲基乙基)氨基]-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺];EPZ5676[(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((((1r,3S)-3-(2-(5-(叔-丁基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇]
受体酪氨酸激酶抑制剂
优选的受体酪氨酸激酶抑制剂是ABT 869(利尼伐尼)(Linifanib)[N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)-脲],其是ATP竞争性受体酪氨酸激酶抑制剂,是血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)受体家族成员的有效抑制剂。其他酪氨酸激酶抑制剂,例如AG1296[6,7-二甲氧基-3-苯基喹喔啉]和Valatanib能够替代ABT 869,并可代替ABT 869使用。
B-Raf抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中B-Raf的抑制。优选的B-Raf抑制剂是SB590885[5-[2-[4-[2-(二甲氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1H-茚-1-酮肟]。SB590885是有效的B-Raf抑制剂,其在无细胞测定中Ki为0.16nM,对B-Raf的选择性比c-Raf高11倍,对其他人类激酶没有抑制作用。其他有效的B-Raf抑制剂是已知的,并且可以以与SB590885相同的活性使用。实例包括维莫非尼(Vemurafenib)、RAF265(CHIR-265)(Selleckhchem目录号S2161)和PLX4720(Selleckhchem目录号S11525)。
Wnt抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中Wnt的抑制。优选的Wnt抑制剂是IWP-2[N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺]。然而,Wnt抑制剂例如WNT-C59[4-(2-甲基-4-吡啶基)-N-[4-(3-吡啶基)苯基]苯乙酰胺]、XAV-939[3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮]和IWR-1(Selleckchem目录号S7086)能够替代IWP-2,并且因此可以代替IWP-2使用。
Rho相关的,含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中ROCK的抑制。优选的ROCK抑制剂是Y27632([(+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺+++二盐酸盐)])或Tzv(thiazovivin)。
CBP/p300溴结构域抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中CBP/p300溴结构域的抑制。优选的CBP/p300溴结构域抑制剂是SGC-CBP30[2-[2-(3-氯-4-甲氧基苯基)乙基]-5-(3,5-二甲基-4-异恶唑基)-1-[(2S)-2-(4-吗啉基)丙基]-1H-苯并咪唑]、I-CBP112、GNE272或GNE409。
Menin-MLL相互作用抑制剂
所公开的重编程方案涉及被重编程的细胞中Menin-MLL相互作用的抑制。优选的Menin-MLL相互作用是VTP50469、MI3454或WDR5-IN-4。
B.待诱导的细胞
hCiPSC从人类体细胞中获得。本领域普通技术人员会理解,体细胞是除配子(精子或卵子)、生殖细胞(继续变成配子的细胞)、配子体或未分化干细胞之外的任何细胞。
体细胞可以从组织例如骨髓、胎儿组织(例如胎儿肝脏组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织获得。在优选的实施方案中,hCiPSC获自成纤维细胞、脂肪来源的细胞、神经细胞或来自肠上皮的细胞。在更优选的实施方案中,hCiPSC获自新生儿(例如包皮)或成体成纤维细胞。然而,hCiPSC可获自其他细胞类型,包括但不限于:血液来源的体细胞、皮肤来源的细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间质来源的细胞、实质细胞(例如,肝细胞)、神经细胞和结缔组织细胞。
在优选的实施方案中,hCiPSC获自成纤维细胞和脂肪来源的体细胞(例如,脂肪细胞)。在更优选的实施方案中,hCiPSC获自成纤维细胞,其可以是新生儿(例如包皮成纤维细胞)或成体成纤维细胞。
可以通过使用本领域技术人员已知的技术解聚用作细胞来源的合适器官或组织来分离细胞。例如,组织或器官可以机械解聚和/或用削弱相邻细胞之间连接的消化酶和/或螯合剂处理,使得组织可以分散以形成单个细胞的悬浮液而没有明显的细胞破损。酶促解离可以通过切碎组织并用一种或多种酶处理切碎的组织来实现,所述酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等。机械破坏也可以通过多种方法来实现,所述方法包括但不限于使用研磨机、搅拌机、筛子、均化器、压力传感器或超声波发生器。
C.hCiPSC
还提供了根据所公开的方法获得的hCiPSC。这些细胞的特征在于它们可以扩增超过20代,例如高达25、30、35、40、41、42代,以与hESC相似的倍增时间增殖。hCiPSC的特征还在于它们表达至少一种表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4,以及核心多能性转录因子OCT4、SOX2(SRY-Box转录因子2)、NANOG(DNMT3B(DNA甲基转移酶3β)、DPPA4(发育多能性相关4)、UTF1(未分化胚胎细胞转录因子1)、ZFP42(锌指蛋白42)、PRDM14(含PR结构域的蛋白14)和ZIC3(Zic)家族成员3))和NANOG(Nanog同源框)。这些标记物在传统的多能干细胞(hESC和hiPSC)中不表达。从功能上讲,当将hCiPSC注射到免疫缺陷小鼠体内时,产生的畸胎瘤含有所有3个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)的组织;hCiPSC在体外形成胚状体并表达三个胚层的标记物基因,并且可以进行定向分化成为另一种定型的细胞类型,例如肝细胞,或定向分化为祖细胞,例如造血祖细胞。最重要的是,hCiPSC优选不经过遗传改造,即不是通过这样的方法获得的,所述方法包括通过向细胞中引入或从细胞中去除遗传元件来改变人类体细胞,例如改造体细胞以表达一种或多种多能性标记物,例如Oct3/4(八聚体-结合转录因子3/4)、KLF4、nanog和/或cMyc,因此根据所公开的方法获得的hCiPSC优选不含外源引入的Oct3/4、KLF4、NANOG和/或cMyc。
III.制备方法
所公开的将人类体细胞重编程为多能细胞的方法是四阶段细胞培养过程。使用本领域公知的方法和在本文下面的实施例中举例说明的方法,用成人真皮组织、成人脂肪来源的间充质基质细胞和人胚胎成纤维细胞,从期望的组织中收获待重编程的人类体细胞。收获的细胞维持培养并传代,直到重新编程。
在第I阶段,将体细胞接种在细胞培养基中,例如DMEM、KnockOutTMDMEM、DMEM/F12、高级DMEM/F12,并在适当的细胞培养基,例如DMEM中暴露于第I阶段条件,即细胞培养基补充有效量的第I阶段因子,优选地在第二天,然后在一些实施方案中,在第I阶段条件中在具有5%O2(例如,当体细胞是获自成人组织的体细胞时,例如,具有hADSC和hASF)或在其他实施方案中,在37℃,具有21% O2和5% CO2(例如,当体细胞是获自成人组织的体细胞时,例如HEF)的缺氧条件下培养有效量时间来将体细胞转化为单层上皮样细胞。该初始诱导阶段可以在细胞初始接种后4小时至48小时开始。将细胞以适当的密度接种,例如,ADSC和hASF可以以每孔1×104个细胞的密度接种在12孔板的15%FBSDMEM培养基中。补充培养基每3-4天更换一次。将体细胞有效转化为单层上皮样细胞的培养时间长度将根据体细胞类型而变化。例如,由hADSC诱导的单层上皮样细胞可以在第4-6天出现,并在第8-12天接近80%-100%汇合度。对于ASF,上皮样细胞在第12-20天接近80%-100%汇合度。当与在未补充第I阶段因子的细胞培养基中培养/在第I阶段条件下培养的相应体细胞相比时,转化成上皮样细胞可以通过上皮细胞相关基因,例如KRT8(例如,高达60倍上调)、KRT18(例如,高达22倍上调)和KRT19(例如,高达2.5倍上调)的上调来测量。此外,第I阶段结束时的细胞表现出LIN28A的表达增加,例如与培养它们的体细胞相比,上调高达21倍。
用于第I阶段条件的因子的优选组合选自:CHIR99021(3-12μM,优选10-12μM,例如8、9、10、11或12μM)、616452(2-50μM,优选5-20μM,例如5、8、10、11、12、13、14、15或20μM),TTNPB(0.5-10μM,优选1-5μM,例如0.9、1、1.5、2、2.5或3μM)、Y27632或TZV(1-10μM,优选1-5μM,例如0.9、1、1.5、2、2.5或3μM)、ABT869(0.5-5μM,优选1-2μM,例如0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2或1.5μM)和SAG(0.2-2μM,优选0.5-1μM,例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μM)。通过将细胞在补充有第I阶段因子(第I阶段条件)的细胞培养基中培养有效量的时间来将细胞转化为单层上皮样细胞,将体细胞,例如成纤维细胞转化为单层上皮样细胞。在一些实施方案中,第I阶段条件可以包括补充选自由以下组成的组的小分子:Dot1L抑制剂(EPZ004777或EPZ5676(0.2-10μM,优选1-5μM,例如0.9、1、1.5、2、2.5、或3μM)、鲁索利替尼(0.1-5μM,优选0.5-1μM,例如0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2或1.5μM))和DZNep(0.005-0.1μM,优选0.01-0.05,例如,0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μM)。
在第II阶段,当与在未补充第II阶段因子的细胞培养基中培养的/在第II阶段条件下培养的相应体细胞相比时,将用第I阶段条件处理的细胞的细胞培养基更改为第II阶段条件持续有效量的时间(例如,培养中8-20天)以上调培养细胞中的一种或多种多能性相关转录因子表达,例如通过与LIN28A(例如,高达38倍上调)共表达的多能性相关转录因子SALL4的激活(例如,高达24倍上调)来测量。用于第II阶段条件的因子的优选组合包括(i)第II阶段因子5-氮杂胞苷(2-10μM,优选5-10μM,例如5、6、7、8、9、10μM)、反苯环丙胺(2-50μM,优选2-10μM,例如2、2.5、3、5、8或10),和JNKIN8(0.2-2μM,优选0.5-1μM,例如0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2或1.5μM);(ii)第I阶段因子:CHIR99021、616452、TTNPB、ABT-869和SAG,其使用浓度与上文针对第I阶段条件所公开的浓度相同。第II阶段条件可包括向培养基额外补充小分子,所述小分子选自由以下项组成的组:第I阶段补充因子鲁索利替尼(以与上文针对第I阶段条件公开的相同浓度使用)和第II阶段补充因子:UNC0224(0.1-5μM,优选0.5-2μM,例如0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2或1.5μM)、BIRB796(0.2-5μM,优选2-5μM,例如2、2.5、3、3.5、4或5μM)和多索吗啡(Dorsormorphin)(0.2-2μM,优选0.5-1μM,例如0.2、0.5、0.6、0.8或1)。在第II阶段条件下有效培养的培养时间长度将略有不同,这取决于细胞类型。在第II阶段条件下培养hADSC和hASF后,经过约8-12天的处理后会出现多层集落,并且这些细胞集落继续生长得更大。在第II阶段条件总共约16-20天后,可以将细胞培养基更改为第III阶段条件。
在第III阶段,将用第II阶段条件处理的细胞的细胞培养基更改为第III阶段条件并在第III阶段条件下培养有效量的时间来建立初始多能性网络,通过OCT4的表达来测量。用第II阶段条件处理的细胞,通过在补充有第III阶段因子的细胞培养基中培养细胞有效量的时间来建立初始多能性网络,通过OCT4(第III阶段条件)的表达来测量。用于第III阶段条件的因子的优选组合包括:(i)第III阶段因子:PD0325901(0.02-5μM,优选0.5-1μM,例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2或1.5μM)和VPA(200-1500μM,优选200-500μM,例如200、300、400或500μM);(ii)第I阶段因子CHIR99021(1-10μM,优选1-3μM,例如1、1.5、2、2.5或3μM);以与针对第I阶段条件公开的相同浓度使用的616452,和Y-27632(2-50μM,优选2-10μM,例如2、3、4、5、6、7、8、9或10μM);(iii)第I阶段补充因子DZNep(0.05-0.5μM,优选0.1-0.3μM,例如0.1、0.15、0.2、0.25或0.3μM)和EPZ004777(0.25-20μM,优选1-10μM,例如1、2、3、4、5、8或10μM);(iv)第II阶段因子反苯环丙胺(5-50μM,优选5-20μM,例如5、8、10、15或20μM)。在第II阶段条件下有效培养的培养时间长度将略有不同,这取决于细胞类型。然而,优选在第III阶段条件下8-12天的处理,在一些实施方案中,可以使用8-10天。
在第IV阶段,将用第III阶段条件处理的细胞的细胞培养基更改为第IV阶段条件并在第IV阶段条件下培养有效量的时间来完全建立多能性网络,通过共表达OCT4、SOX2和NANOG来测量。用于第IV阶段条件的因子的优选组合选自:(i)第I阶段因子CHIR99021(0.2-3μM,优选0.2-1μM,例如0.2、0.3、0.5、0.8或1μM);和Y-27632(2-20μM,优选2-10μM,例如2、3、4、5、7、8或10μM);(ii)第I阶段补充因子DZNep(0.02-0.2μM,优选0.02-0.05μM,例如0.02、0.03、0.04、0.05或0.1μM)和EPZ004777(0.25-20μM,优选1-10μM,例如,1、2、3、4、5、8或10μM);(iii)第II阶段因子反苯环丙胺(2-50μM,优选2-10μM,例如2、2.5、3、5、8或10μM);(iv)第III阶段因子PD0325901(0.02-5μM,优选0.1-1μM,例如0.1、0.2、0.5、0.7、0.8或1μM)和VPA(200-1500μM,优选200-500μM,例如,200、300、400或500μM);和(v)第IV阶段因子IWP2(0.5-4μM,优选1-2μM,例如0.9、1、1.5、2、2.5或3μM),和SB590885(0.1-5μM,优选0.2-1μM,例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μM)。对于第IV阶段诱导,VPA、反苯环丙胺、DZnep和EPZ004777应优选包括在第IV阶段条件的前4天。约6-8天处理后将出现原代hCiPSC集落。对于HEF,VPA优选包括在前4天。6-8天处理后将出现原代hCiPSC集落。
尽管在优选实施方案中公开了具体因素,但是它们可以容易地与提供相同生物学活性的已知小分子互换,如组合物中所公开的。因此,具有相似生物学活性的替代化合物可以以与本文针对具体化合物提供的具体浓度所提供的生物学活性相对应的量使用。因此,例如,CHIR99021是优选的GSK抑制剂,在本文中提供了其浓度范围。然而,它可以用具有相同生物学活性(即抑制GSK的能力)的小分子替代,至少达到为CHIR99021公开的浓度所见的水平。基于本文示例的浓度,对于属内的物种(列出的具体化合物)(公开的生物学活性)确定替代因子的等量在本领域普通技术人员的能力范围内。
B.hCiPSC的分离
能够维持ES细胞的未分化状态和多能性或诱导分化的培养基是本领域已知的。本领域技术人员可以通过使用广泛应用于ES细胞的确认手段来容易地确认分离的诱导多能干细胞的分化和增殖能力。
基本上纯化的hCiPSC群体可以例如通过从培养物来源提取(例如,通过密度梯度离心和/或流式细胞术)来获得。纯度可以通过任何适当的方法测量。多能细胞可以通过例如流式细胞术(例如FACS分析)纯化至99%-100%。人诱导多能干细胞可以通过利用与例如在诱导多能干细胞上的标记物(例如TRA-1-81、TRA-1-60或标记物的组合)结合的分子(例如抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子),从而正选择结合该分子的细胞(即,正选择)来分离。正选择方法的其他实例包括优先促进所需细胞类型和不需要细胞类型的混合群体中所需细胞类型的生长的方法。或者,通过使用与不存在于所需细胞类型上但存在于不需要的细胞类型上的标记物结合的分子,可以从所需细胞中除去含有此类标记物的不需要的细胞(即负选择)。其他负选择方法包括优先杀死或抑制所需细胞类型和不需要的细胞类型的混合群体中不需要的细胞类型的生长。因此,通过使用负选择、正选择或其组合,可以制备富集的干细胞群体。
分离程序可包括磁力分离、使用抗体包被的磁珠、亲和层析、连接至单克隆抗体的细胞毒性剂或与单克隆抗体联合使用的此类试剂,例如补体和细胞毒素,以及用附着到固体基质(例如,板)的抗体“淘选”,或其他方便的技术。提供精确分离的技术包括荧光激活细胞分选器,其可以具有不同程度的复杂性,例如多个颜色通道、小角度和钝角光散射检测通道以及阻抗通道。抗体可以与标记物,例如磁珠(允许直接分离)、生物素(可以用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉亲和素蛋白去除)或荧光染料(可以与荧光激活细胞分选仪一起使用)缀合,以允许易于分离特定细胞类型。可以采用不会过度损害所诱导的多能干细胞的活力的任何技术。在一个实施方案中,将细胞与针对标记物的抗体一起孵育,并且手动选择标记物染色呈阳性的细胞并传代培养。
富集方法的组合可用于改进纯化或富集的时间或效率。例如,在富集步骤去除具有不指示目的细胞类型的标记物的细胞之后,可以通过荧光激活细胞分选仪(FACS)或具有高特异性的其他方法进一步分离或富集细胞。多色分析可以与FACS一起使用。可以在特定抗原的染色水平或缺乏特定抗原的染色水平基础上来分离细胞。荧光染料可用于标记对特定抗原具有特异性的抗体。此类荧光染料包括藻胆蛋白,例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红。
C.hCiPSC的培养和保存
hCiPSC可以在培养物中扩增并储存以供以后检索和使用。一旦建立了细胞培养物或干细胞的混合培养物,根据细胞密度,在有利于细胞增殖的条件下(有或没有组织形成)传代至新鲜培养基,细胞群在体外进行有丝分裂扩增。此类培养方法可包括例如在缺乏诱导分化的特定生长因子(例如IGF、EGF、FGF、VEGF和/或其他生长因子)的培养基中传代细胞。当达到足够的细胞密度时,可以将培养的细胞转移到新鲜培养基中。一些干细胞类型不表现出典型的接触抑制凋亡,或者当密度最大时它们变得静止。因此,适当的传代技术可用于减少接触抑制和静止。
可以根据已知方法冷冻保存细胞以供储存,例如Doyle等人,(编辑),1995,Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons,Chichester中描述的那些。例如,细胞可以悬浮在“冷冻培养基”中,例如含有15-20%胎牛血清(FBS)和10%二甲亚砜(DMSO)、含有或不含5-10%甘油的培养基,其密度为例如,约4-10x 106个细胞/ml。将细胞分配到玻璃或塑料小瓶中,然后将其密封并转移到可编程或被动式冷冻机的冷冻室中。最佳冷冻速率可以凭经验确定。例如,可以使用通过熔化热产生-1℃/分钟的温度变化的冷冻程序。一旦含有细胞的小瓶达到-80℃,它们就会被转移到液氮储存区域。冷冻保存的细胞可以保存数年。
IV.使用方法
鉴定可产生所需细胞类型或形态的干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的容易获得的来源对于治疗性处理、组织改造和研究是重要的。通过本申请的方法获得的细胞,包括hCiPSC、XEN样细胞、具有再生程序的可塑性状态细胞和上皮样细胞,是干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的容易获得的来源,其表达至少一种干细胞相关标记物,例如LIN28A、SALL4、OCT4或NANOG。就此而言,虽然使用术语hCiPSC作为示例,但是本领域技术人员应当理解,通过本申请的方法获得的XEN样细胞、具有再生程序的可塑性状态细胞、以及上皮样细胞也可以类似地用作干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性潜力的细胞的来源。干细胞、祖细胞、去分化细胞或具有可塑性和再生潜力的细胞的可用性将在移植、组织改造、血管生成的调节、血管发生和细胞替换或细胞治疗以及某些疾病的预防中极其重要。此类干细胞或祖细胞也可用于将基因导入受试者体内,作为基因治疗方案的一部分。另外,通过本申请的方法获得的包含第I、II、III、IV阶段中的一个或多个的细胞,例如上皮样细胞、具有再生程序的可塑性状态细胞和/或XEN样细胞,可以被直接诱导为所需的细胞类型并植入和递送至受试者,也就是说,并非在所有情况下都需要首先获得hCiPSC来获得分化的细胞。
A.提供分化的体细胞(再分化的细胞)
一旦建立,干细胞的培养物可用于产生后代细胞,例如能够产生新组织的成纤维细胞。hCiPSC可被诱导以分化成来自三个胚层中任何一个的细胞,例如,皮肤和毛细胞,包括上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞,形成骨、肌肉和结缔组织的细胞,例如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞、实质细胞,例如肝细胞、肾细胞、肾上腺细胞和胰岛细胞、血细胞、视网膜细胞(以及参与感觉知觉的其他细胞,例如在耳朵中形成毛细胞或在舌头上形成味蕾的那些细胞),以及包括神经的神经组织。
在一个实施方案中,通过将细胞暴露于“外胚层分化”培养基来诱导hCiPSC分化成外胚层来源的细胞。在另一个实施方案中,通过将细胞暴露于“中胚层分化培养基”来诱导hCiPSC分化成中胚层来源的细胞。在又一个实施方案中,通过将细胞暴露于“内胚层培养基”来诱导hCiPSC分化成内胚层来源的细胞。“内胚层”、“中胚层”和“外胚层”培养基的组分是本领域技术人员已知的。已知的细胞表面标记物可用于验证细胞确实分化成相应细胞培养基谱系的细胞。确认三个胚层分化的最普遍接受的标记物是内胚层细胞的α胎儿蛋白、中胚层的α平滑肌肌动蛋白和外胚层的Beta-III微管蛋白的表达,所有这些标记物通常在这些组织的发育较早期表达。
干细胞向成纤维细胞或其他细胞类型的分化,随后由其产生组织,可以通过具体的外源生长因子或通过改变干细胞培养的培养条件(例如,密度)来触发。用于诱导细胞分化成所需细胞类型的细胞的方法是本领域已知的。例如,可以通过向细胞环境中添加物质(例如,生长因子、酶、激素或其他信号分子)来诱导hCiPSC分化。可用于诱导分化的因子的实例包括促红细胞生成素、集落刺激因子,例如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、白细胞介素,例如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、白血病抑制工厂(LIF)或Steel因子(Stl),其与组织定型细胞或其他谱系定型细胞类型共培养,以诱导干细胞定型为特定谱系。
分化的细胞可以在培养基中扩增并储存以供以后检索和使用。
XEN样细胞、可塑性状态细胞和上皮样细胞是容易获得的来源,可用于生成其他细胞类型,这些细胞类型可由具体的外源生长因子、小分子、过表达基因或通过改变干细胞培养的培养条件(例如,密度)来触发。从XEN样细胞、可塑性状态细胞和上皮样细胞诱导的细胞可以是不同的细胞类型,包括但不限于:血液来源的体细胞、皮肤来源的细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间质来源的细胞、实质细胞(例如肝细胞、β细胞)、神经细胞和结缔组织细胞。
B.细胞疗法
诱导的多能干细胞的治疗用途包括将诱导的多能干细胞、干细胞群或其后代移植到个体中以治疗多种病理状态,包括由癌症、伤口、肿瘤、损伤、病毒感染、糖尿病等引起的疾病和病症。治疗可能需要根据本领域目前已知的或将来待开发的任何方法而涉及使用细胞来产生新的组织,以及使用由此产生的组织。可以将细胞植入、注射或以其他方式直接施用到组织损伤部位,以便它们在体内产生新组织。在一个实施方案中,施用包括施用遗传修饰的hCiPSC或其后代。
在优选的实施方案中,hCiPSC获自自体细胞,即供体细胞是自体的。然而,细胞可以从异源细胞获得。在一个实施方案中,供体细胞获自与受体遗传相关的供体。在另一个实施方案中,供体细胞获自与受体遗传无关的供体。
如果hCiPSC与受体受试者相比源自异源(非自体/同种异体)来源,则通常施用伴随的免疫抑制疗法,例如施用免疫抑制剂环孢菌素或FK506。然而,由于人诱导的多能干细胞的不成熟状态,可能不需要这种免疫抑制疗法。因此,在一个实施方案中,可以在不存在免疫调节(例如,免疫抑制)疗法的情况下将人诱导的多能干细胞施用于接受者。或者,可以将细胞封装在膜中,这允许液体交换但防止细胞与细胞接触。微囊化细胞的移植是本领域已知的,例如,Balladur等人,Surgery,117:189-94,1995;和Dixit等人,CellTransplantation 1:275-79(1992)。
(i)糖尿病
糖尿病(DM)是一组代谢性疾病,其中受试者血糖升高,要么是因为胰腺不能产生足够的胰岛素,要么是因为细胞对产生的胰岛素没有反应。胰岛素疗法的有前景的替代方案是向需要胰岛素的患者提供胰岛细胞。Shapiro等人,N Engl J Med.,343(4):230-8(2000)已经证明β细胞/胰岛的移植为糖尿病患者提供了治疗。尽管多种胰岛素类型是可商购的,但这些制剂均以注射剂形式提供。人诱导的多能干细胞提供了胰岛细胞的替代来源来预防或治疗糖尿病。例如,可以分离诱导的多能干细胞并将其分化为胰腺细胞类型并递送至受试者。或者,可将诱导的多能干细胞递送至受试者的胰腺并在体内分化为胰岛细胞。因此,这些细胞可用于移植以预防或治疗糖尿病的发生。用于减少细胞因子暴露后炎症而不影响胰岛细胞的活力和效力的方法公开于例如Naziruddin等人的美国专利号8,637,494中。
(ii)神经退行性病症
神经退行性病症的特征在于涉及因疾病、遗传病况或损伤(例如创伤性或缺血性脊髓或脑损伤)而导致的神经元退化的病况。神经退行性病况包括涉及神经元损伤或退化的任何疾病或病症或症状或其原因或影响。神经退行性病况可包括但不限于亚历山大病、阿尔珀氏病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、共济失调性毛细血管扩张症、卡纳万病、科凯恩综合征、皮质基底节变性、克雅氏病、亨廷顿病、肯尼迪病、克拉伯病、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病、多发性硬化症、帕金森病、佩梅病、尼曼-皮克病、原发性侧索硬化症、雷夫叙姆病、桑霍夫病、希尔德病、斯蒂尔-理查森-奥尔谢夫斯基病、脊髓痨或与损伤的神经元相关的任何其他病况。其他神经退行性病况可包括创伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、中风、创伤性脑损伤和遗传性疾病,或由其引起。
具体地,所公开的方法包括将已在体外扩增的NSC、神经祖细胞或神经前体移植到有需要的受试者中,使得细胞可以改善神经退行性病况。扩增的神经干细胞的移植可用于改善患有多种形式的脊髓病的受试者中的行走功能,所述脊髓病具有痉挛、强直、发作、麻痹或任何其他肌肉过度活跃的症状。例如,Johe等人的美国专利No.8,236,299中公开了用于扩增和移植神经细胞和神经祖细胞以治疗不同神经变性病况的方法。
(iii)癌症疗法
hCiPSC及其后代的治疗用途包括将诱导多能干细胞、干细胞群或其后代移植到个体中以治疗和/或改善与癌症相关的症状。例如,在一个实施方案中,hCiPSC可以施用于已经经历了杀死、减少或损伤受试者细胞的化学疗法的癌症患者。在典型的癌症干细胞移植中,使用非常高剂量的化学疗法,通常与放射疗法一起使用,以尝试消灭所有癌细胞。这种治疗还会杀死骨髓中的干细胞。治疗后不久,干细胞就会被用来替代那些被破坏的细胞。
在另一个实施方案中,hCiPSC可以用至少一种另外的治疗因子转染或转化(除了去分化因子之外)。例如,一旦分离了hCiPSC,可以用编码治疗性多肽的多核苷酸转化细胞,然后植入或施用于受试者,或者可以分化成所需的细胞类型,然后植入并递送至受试者。在这样的条件下,多核苷酸在受试者体内表达以递送多肽产物。
(iii)组织改造
hCiPSC及其后代可用于使用本领域已知的方法制备组织改造的构建体。组织改造的构建体可用于多种目的,包括作为修复或替换受损器官或组织的假体装置。它们还可以用作由构建体的细胞分泌的蛋白质或其他分子的体内递送系统,或者用作一般药物递送系统。组织改造的构建体还可用作组织功能的体外模型或测试多种治疗或药物效果的模型。最常用的干细胞移植生物材料支架概述于Willerth,S.M.和Sakiyama-Elbert,S.E.,Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues andcell delivery(2008年7月9日),StemBook,编辑The Stem Cell Research Community,StemBook。组织改造技术经常涉及选择合适的培养基质以维持和促进组织生长。一般来说,这些基质应该是三维的并且应该可加工以形成目的组织所需形状的支架。
美国专利号6,962,814总体公开了用于产生组织改造的构建体和改造的天然组织的方法。关于具体实例,授予Vacanti等人的美国专利No.7,914,579公开了组织改造的韧带和肌腱。美国专利号5,716,404公开了使用与聚合物基质组合植入的分离的肌细胞来重建或增强乳房组织的方法和组合物。美国专利号8,728,495公开了使用自体真皮成纤维细胞修复软骨。Duailibi等人的美国公开申请号20090029322公开了使用干细胞形成牙组织以用于制造牙齿替代品。美国公开申请号2006/0019326公开了用于治疗颅内动脉瘤的细胞种子组织改造的聚合物。Atala的美国公开申请号2007/0059293公开了可用于替代受损器官的组织改造的构建体(以及制备此类构建体的方法),所述受损器官例如肾、心脏、肝脏、脾脏、胰腺、膀胱、输尿管和尿道。
(iv)由hCiPSC产生的细胞(后代)
hCiPSC可被诱导分化成来自三个胚层中任何一个的细胞,例如,皮肤和毛细胞,包括上皮细胞、角质形成细胞、黑素细胞、脂肪细胞,形成骨、肌肉和结缔组织的细胞,例如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞、实质细胞,例如肝细胞、肾细胞、肾上腺细胞和胰岛细胞(例如α细胞、δ细胞、PP细胞和β细胞)、血细胞(例如白细胞、红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞),视网膜细胞(以及参与感觉知觉的其他细胞,例如在耳朵中形成毛细胞或在舌头上形成味蕾的那些细胞),以及包括神经的神经组织。
(v)治疗性组合物
可配制hCiPSC用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以促进体内或体外/离体去分化。可以掺入另外的因子,例如生长因子、诱导分化或去分化的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎剂、消退因子、促进神经支配、血管形成或增强淋巴网络的生物学活性化合物和药物。
诱导的多能细胞可以通过这样的组合物施用于患者,所述组合物包括单独的hCiPSC或hCiPSC后代群体或者在载体或支持结构上或之中的hCiPSC或hCiPSC后代群体。在许多实施方案中,将不需要载体。可以通过注射到需要细胞的位点上或注射到需要细胞的位点中来施用细胞。在这些情况下,细胞通常会已经被洗涤以除去细胞培养基,并将其悬浮在生理缓冲液中。
在其他实施方案中,细胞设有支持结构或整合到支持结构之上或之中。支持结构可以是网状物、固体支持物、支架、管、多孔结构和/或水凝胶。此类固体支持物和在其上培养细胞的方法是本领域已知的。
参考以下非限制性实施例将进一步理解本发明,这些实施例作为优选实施方案呈现。
C.小分子组合物的用途
小分子组合物可用于体外和体内组织再生、组织重塑和修复、更新或逆转衰老、抑制或逆转纤维化,以及诱导人类体细胞中的可塑性。
例如,用于重编程过程的第I阶段和第II阶段的小分子可以被配制用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触,以促进体内或体外/离体的去分化、再生、修复和更新。可以掺入另外的因子,例如生长因子、诱导去分化或再生的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎剂、消退因子、促进神经支配、血管形成或增强淋巴网络的生物学活性化合物和药物。
在一个实施方案中,小分子可以通过包含用于重编程过程的第I阶段或第II阶段的全部或部分小分子的组合物的方式施用于患者。小分子组合物可以全身施用或通过注射到其中细胞丢失或组织受损的位点上或注射到其中以促进内源性修复能力。在一些实施方案中,将不需要载体。在其他实施方案中,组合物可以包含药学上可接受的载体。还可以配制小分子用于持续释放,例如使用微囊化。小分子组合物可以单剂量、多剂量、连续或间歇方式施用于患者以获得期望的生理学效果,这取决于接受者的生理状况。
在一些实施方案中,用于重编程过程的第I阶段和第II阶段的小分子可以被配制用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以促进更新。可以配制这些小分子来预防与年龄相关的组织学变化并维持组织中的细胞处于年轻状态。更新的效果可以通过表观遗传时钟的逆转、或代谢变化、或转录组变化(例如衰老、应激或炎症途径的变化)来检测。小分子组合物可以以单剂量、多剂量、连续或间歇方式施用于患者以获得期望的生理学效果,这取决于接受者的生理状况。
在一些实施方案中,用于重编程过程的第I阶段和第II阶段的小分子可以被配制用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以抑制或修正纤维样变性。纤维样变性可以通过疾病、应激或炎症引起的形态学变化、表观基因组或代谢变化或转录组变化来检测。小分子组合物可以以单剂量、多剂量、连续或间歇方式施用于患者,以抑制或修正纤维样变性,这取决于接受者的生理状况。
在一些实施方案中,用于重编程过程的第I阶段和第II阶段的小分子可以被配制用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以诱导人类体细胞中的细胞可塑性。细胞可塑性可以通过表观基因组的变化、代谢的变化或转录组的变化来检测。小分子组合物可以在体外或体内以单剂量、多剂量、连续或间歇方式使用以诱导细胞可塑性。
实施例
材料和方法
HEF的分离和培养
人胚胎成纤维细胞(HEF)从胚胎真皮组织中分离得到,所述胚胎真皮组织获得了中日友好医院临床研究伦理委员会(Clinical Research Ethics Committee of China-Japan Friendship Hospital)的知情书面同意和批准(伦理批准号:2009-50)。这项研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。简而言之,将组织(0.5-1cm2)用含有2%青霉素-链霉素(Gibco,15140-122)的PBS(CORNING,05418005)洗涤两次,用剪刀切碎至1-2mm2并用5-10ml2mg/ml胶原酶IV溶液(Gibco,1963347)在100-mm培养皿中,37℃解离1小时。接下来,加入10-20ml 15%FBS-DMEM培养基,并将细胞上下吹打数次以进行解离。将悬浮液收集至50ml管中并摇动1-2分钟以释放细胞。然后将悬浮液在400g离心5分钟,并在去除上清液后将细胞重悬于15%FBS-DMEM培养基中。通常,可从0.5-1cm2真皮获得1-3x106个细胞,并将其铺板于100-mm培养皿(P0)中,然后在37℃、5% CO2中孵育。第二天,更换新鲜的15% FBS-DMEM培养基以去除非贴壁细胞。原代HEF通常在3-4天内汇合,并准备传代用于重编程。0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200-056)用于解离原代HEF。对于CiPSC诱导,将HEF以每孔1.5x104个细胞的密度接种于具有15% FBS-DMEM培养基的12孔板中。为了培养和扩增,HEF以每100-mm培养皿1.5x106个细胞的密度接种。建议使用原代HEF在7次传代内诱导CiPS细胞。15%FBS-DMEM培养基:高葡萄糖DMEM(Gibco,C11965500BT),其补充有15%胎牛血清(FBS)(Vistech,VIS93526487)、1% GlutaMAXTM(Gibco,35050-061)、1% MEM非必需氨基酸溶液(NEAA)(Gibco,11140050)、1%青霉素-链霉素和0.055mM 2-巯基乙醇(Gibco,21985-023)。
hADSC的分离和培养
成人脂肪来源的间充质基质细胞(hADSC)是从成人脂肪组织中分离得到的,其获得了北京大学伦理委员会审查委员会(Institute of Ethics Committee Review Boardin Peking University)的知情书面同意和批准(IRB 00001052-19070)。这项研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。简而言之,将组织(2-4cm2)用含有2%青霉素-链霉素的PBS洗涤两次,用剪刀切碎至1-2mm2并用5-10ml 2mg/ml胶原酶IV溶液在100-mm培养皿中,37℃解离1小时。接下来,加入10-20ml 15%FBS-DMEM培养基,并将细胞上下吹打数次以进行解离。将悬浮液收集至2个50ml管中,每个管用15%FBS-DMEM培养基稀释至30-40ml,随后摇动1-2分钟以释放细胞。然后将悬浮液在400g离心5分钟,并在去除上清液后将细胞重悬于间充质干细胞生长培养基2(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2)(Promo Cell,C-28009)中。通常,可从2-4cm2脂肪组织获得1-3x106个细胞,并将其铺板于100-mm培养皿(P0)中,然后在37℃、5% CO2中孵育。第二天,更换新鲜的间充质干细胞生长培养基2以去除非贴壁细胞。原代hADSC通常在3-5天内汇合,并准备传代用于重编程。0.25%胰蛋白酶-EDTA用于解离原代HEF。对于CiPSC诱导,将hADSC以每孔1x104个细胞的密度接种于具有15% FBS-DMEM培养基的12孔板中。为了培养和扩增,hADSC以具有间充质干细胞生长培养基2的每100-mm培养皿1.5x106个细胞的密度接种。建议使用原代hADSC在4次传代内诱导CiPS细胞。
hASF的分离和培养
人成人皮肤成纤维细胞(hASF)是从成人真皮组织中分离出来的,并获得北京大学伦理委员会审查委员会的知情书面同意和批准(IRB 00001052-19070)。这项研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。简而言之,将组织(0.5-1cm2)用含有2%青霉素-链霉素的PBS洗涤两次,用剪刀切成0.5-1mm2碎片。然后将碎片放入100-mm细胞培养皿中,并将1滴15%FBS-DMEM培养基滴到每片组织上。接下来,将碎片在37℃、5% CO2中孵育4-12小时(不要让碎片变干)。然后将3-5ml间充质干细胞生长培养基2轻轻添加到培养皿中(不要让碎片从培养皿中脱落)。每2-3天更换一次新鲜间充质干细胞生长培养基2。4-7天内,就会产生成纤维细胞生长。原代hASF通常在10-14天内汇合并准备好传代用于重编程。以与上述hADSC相同的方式传代hASF用于重编程和扩增。
从HEF产生hCiPSC
用于hCiPSC诱导的培养基制备
第I阶段诱导培养基:
KnockOutTM DMEM(Gibco,10829018),其补充有10% Knockout血清替代品(KSR)(Gibco,10828028)、10% FBS、1% GlutaMAXTM、1%NEAA、1%青霉素-链霉素、0.055mM 2-巯基乙醇,50μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸(Vc2P)(Sigma,A8960)、5mM LiCl(Sigma,L4408)、1mM烟酰胺(NAM)(Sigma,72340)、2mg/mL AlbuMAXTM-II(Gibco,11021045)和小分子CHIR999021(10μM)、616452(10μM)、TTNPB(2μM)、SAG(0.5μM)、ABT-869(1μM)、Rock抑制剂(Y-27632(2μM)或Tzv(2μM))
为了提高重编程效率,在第I阶段诱导培养基中引入Dot1L抑制剂(EPZ004777(0.2μM)或EPZ5676(0.2μM))、鲁索利替尼(1μM)和DZNep(0.01μM)。
第II阶段诱导培养基:
KnockOutTM DMEM,其补充有10% KSR、10% FBS、1% GlutaMAXTM、1%NEAA、1%青霉素-链霉素、0.055mM 2-巯基乙醇、50μg/ml Vc2p、5mM LiCl、1mM NAM、40ng/ml bFGF(Origene,TP750002)和小分子CHIR99021(10μM)、616452(10μM)、TTNPB(2μM)、SAG(0.5μM)、ABT-869(1μM)、Y27632(10μM)、JNKIN8(1μM)、反苯环丙胺(10μM)、5-氮杂胞苷(5μM)。
为了提高重编程效率,可以在第II阶段诱导培养基中引入小分子UNC0224(1μM)、鲁索利替尼(1μM)(Selleckchem目录号S7256)和CBP/p300溴结构域抑制剂SGC-CBP30(2μM)。
第III阶段诱导培养基:
KnockoutTM DMEM,其补充有1% N2补充剂(Gibco,17502-048)、2%B27补充剂(Gibco,17504-044)、1%GlutaMAXTM、1%NEAA、1%青霉素-链霉素、0.055mM 2-巯基乙醇、5mg/mL AlbuMAXTM-II、20ng/mL重组人Heregulinβ-1(HRG)(PEPROTECH,100-03)和小分子CHIR99021(1μM)、616452(10μM)、Y-27632(10μM))、PD0325901(1μM)、反苯环丙胺(10μM)、VPA(500μM)、DZNep(0.2μM)、EPZ004777(5μM)
第IV阶段诱导培养基:
KnockoutTM DMEM,其补充有1% N2补充剂、2% B27补充剂、1%GlutaMAXTM、1%NEAA、1%青霉素-链霉素、0.055mM 2-巯基乙醇、20ng/mL HRG和小分子CHIR99021(1μM)、Y-27632(10μM)、PD0325901(1μM)、IWP-2(2μM)、SB590885(0.5μM)。VPA(500μM)包括在前4天中。
从HEF诱导hCiPSC的过程
将细胞维持在37℃、21%O2和5%CO2的条件下。每3-4天更换一次诱导培养基。HEF以每孔1-1.5x104个细胞的密度接种于具有15%FBS-DMEM培养基的12孔板中。第二天将培养基更换为第I阶段诱导培养基。对于第I阶段诱导,单层上皮样细胞将在第4-6天出现,并在第8-12天接近80%-100%汇合度,然后将培养基更换为第II阶段诱导培养基。对于第II阶段诱导,处理8-12天后出现多层集落,并且这些细胞集落会持续长大。经过总共16-20天的第II阶段处理后,将培养基改为第III阶段条件。对于第III阶段诱导,需要第III阶段培养基进行8-12天的处理,然后将培养基改为第IV阶段条件。对于第IV阶段诱导,前4天包括VPA(500μM)。处理6-8天后将出现原代hCiPSC集落。在第IV阶段结束时,使用OCT4和NANOG共表达的免疫荧光染色来确认原代hCiPSC集落的产生。原代hCiPSC集落数计算为紧密的OCT4阳性集落数。重编程效率计算为原代hCiPSC集落的数量除以输入HEF的数量。
从hADSC和hASF产生hCiPSC
用于hCiPSC诱导的培养基制备
第I阶段诱导培养基:
KnockOutTM DMEM,其补充有10% KSR、10% FBS、1% GlutaMAXTM、1% NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素、50μg/ml Vc2p、5mM LiCl、1mM NAM、2mg/mLAlbuMAXTM-II和小分子CHIR999021(10μM)、616452(10μM)、TTNPB(2μM)、SAG(0.5μM)、ABT-869(1μM)、Rock抑制剂(Y-27632(2μM))或Tzv(2μM))、Dot1L抑制剂(EPZ004777(2μM)或EPZ5676(2μM))、DZNep(0.02μM)、鲁索利替尼(1μM)。为了提高重编程效率,在第I阶段诱导培养基中引入Menin-MLL相互作用抑制剂VTP50469。
在几个实验中,为了测试去除每个小分子后的重编程效率,从混合物中去除了所示的小分子。用于调节相同途径或靶标的小分子浓度如下所示:GSK3抑制剂(CHIR99021:3-15μM;TD114-2:0.5-2μM;CHIR98014:1-3μM;GSK3βi XV:0.05-0.2μM);RA途径激动剂(TTNPB:0.5-10μM;Ch55:1-5μM;AM580:0.1-1μM);Rock抑制剂(TZV:2-10μM;Y27632:2-15μM;法舒地尔(Fasudil):2-10μM;HA1100:2-10μM);TGFβ抑制剂(A8301:0.1-5μM;SB431542:2-50μM;LY364947:0.5μM;LY21:0.5μM;616452:10μM)。
第II阶段诱导培养基:
KnockOutTM DMEM,其补充有10% KSR、10% FBS、1% GlutaMAXTM、1%NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素、50μg/ml Vc2p、5mM LiCl、1mM NAM、100ng/mlbFGF(Origene)和小分子CHIR99021(10-12μM)、616452(10μM)、TTNPB(2μM)、SAG(0.5μM)、ABT-869(1μM)、Y-27632(10μM)、JNKIN8(1μM)、反苯环丙胺(2μM)、5-氮杂胞苷(5μM)、UNC0224(1μM)、鲁索利替尼(1μM)、BIRB796(2μM)、多索吗啡(0.5-1μM)。为了提高重编程效率,在第II阶段诱导培养基中引入CBP/p300溴结构域抑制剂SGC-CBP30(2μM)和Menin-MLL相互作用抑制剂VTP50469。
在几个实验中,为了测试调节每个小分子后的重编程效率,从混合物中去除了所示的小分子。用于靶向相同途径或靶标的小分子浓度如下所示:GSK3抑制剂(CHIR99021:3-15μM;TD114-2:0.5-2μM;CHIR98014:1-3μM;GSK3βi XV:0.05-0.2μM);TGFβ抑制剂(A8301:0.2-5μM;SB431542:2-50μM;616452:10μM);RA途径激动剂(TTNPB:0.2-10μM;Ch55:1-10μM;AM580:0.1-1μM);Rock抑制剂(Y27632:2-15μM;法舒地尔:2-10μM;HA1100:2-10μM;TZV:2-10μM);Smoothened激动剂(SAG:0.2-2μM;嘌吗啡胺:0.5-2μM;Hg-Ag1.5:0.5-1μM;人shh:20-200μM);组蛋白去甲基化抑制剂(反苯环丙胺:2-50μM;GSK2879:0.02-2μM;LSD-C76:0.2-5μM;S2101:0.5-5μM;LSD-2D:0.2-5μM;RN-1:0.2-5μM);DNMT抑制剂(5-azaC:2-15μM;地西他滨:0.5-10μM;RG108:0.5-10μM);JNK抑制剂(JNK-in-8:0.2-2μM;JNK-in-5:0.5-1μM;JNK-in-7:0.2-2μM;JNK-in-12:0.2-0.5μM);CBP/p300溴结构域抑制剂(SGC-CBP30:0.5-2μM;I-CBP112:0.5-5μM;GNE272:0.5-5μM;GNE409:0.5-5μM);Menin-MLL相互作用抑制剂(VTP50469:0.5-2μM;MI3454:0.5-2μM;WDR5-IN-4:0.5-2μM)。
第III阶段诱导培养基:
KnockoutTM DMEM,其补充有1% N2补充剂、2% B27补充剂、1%GlutaMAXTM、1%NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素、5mg/mL AlbuMAXTM-II、20ng/mL HRG和小分子CHIR99021(1μM)、616452(10μM)、Y-27632(10μM)、PD0325901(1μM)、反苯环丙胺(10μM)、VPA(500μM)、Dznep(0.2μM)、EPZ004777(5μM)。在几个实验中,为了测试去除每个小分子后的重编程效率,从混合物中去除了所示的小分子。用于靶向相同途径或靶标的小分子浓度如下所示:GSK3抑制剂(CHIR99021:1-10μM;TD114-2:0.05-0.5μM;TD114-3:0.2-1μM;IM12:0.5 -2μM;CHIR98014:0.2-1μM);TGFβ抑制剂(616452:2-15μM;A8301:0.5-5μM;SB431542:2-50μM);Rock抑制剂(Y27632:2-100μM;TZV:2-10μM;法舒地尔:5-10μM;布雷他汀(Blebbistatin):2-10μM);组蛋白去甲基化抑制剂(反苯环丙胺:10-50μM;RN-1:1-2μM;GSK2879:0.5-1μM;S2101:0.5-2μM;LSD-C76:0.5-2μM);HDAC抑制剂(VPA:200-1500μM;MS275:0.2-2μM;LMK235:0.05-0.5μM;丁酸钠:200-1000μM);Dolt1L抑制剂(EPZ004777:5μM;EPZ5676:1-5μM;SGC0946:1-5μM);S-腺苷-L同型半胱氨酸水解酶抑制剂(DZNep:0.1-0.5μM;Adox:10-70μM);ERK抑制剂(PD0325901:0.02-5μM);SETD8抑制剂(UNC0379:0.1-2uM)。
第IV阶段诱导培养基:
KnockoutTM DMEM,其补充有1% N2补充剂、2% B27补充剂、1% GlutaMAXTM、1%NEAA、0.055mM 2-巯基乙醇、1%青霉素-链霉素、20ng/mL HRG和小分子CHIR99021(1μM)、Y-27632(10μM)、PD0325901(1μM)、IWP-2(2μM)、SB590885(0.5μM)。前4天包括VPA(500μM)、反苯环丙胺(10μM)、DZNep(0.05μM)和EPZ004777(5μM)。在几个实验中,为了测试去除每个小分子后的重编程效率,从混合物中去除了所示的小分子。用于靶向相同途径或靶标的小分子的浓度如下所示:GSK3抑制剂(CHIR99021:0-10μM);ERK抑制剂(PD0325901:0.02-5μM;AZD8330:0.2-5μM;TAK733:0.2-5μM;曲米替尼:0.2-5μM;U0126:0.2-5μM);Rock抑制剂(Y27632:2-12μM;TZV:0.2-0.5μM;法舒地尔:2-10μM;HA-1100:4-20μM;布雷他汀:2-10μM);WNT途径抑制剂(IWP2:0.5-4μM;IWR1:1-10μM;XAV939:1-10μM);BRAF抑制剂(SB590885:0.1-5μM;索拉非尼:0.1-0.5μM;GDC0879:0.1-5μM);HDAC抑制剂(VPA:200-1000μM;MS275:0.2-1μM;丁酸钠:100-500μM)。
从hADSC和hASF诱导hCiPSC的过程
在第I阶段诱导中应用5% O2缺氧。在第I阶段诱导后,将细胞更换到21%O2中。每3-4天更换一次诱导培养基。(1)ADSC和hASF以每孔1x104个细胞的密度接种在具有15%FBSDMEM培养基的12孔板中。第二天将培养基更换为第I阶段诱导培养基。(2)对于第I阶段诱导,从hADSC诱导的单层上皮样细胞将在第4-6天出现,并在第8-12天接近80%-100%汇合度。对于ASF,上皮样细胞将在第12-20天接近80%-100%汇合度。然后将培养基更换为第II阶段诱导培养基。(3)对于第II阶段诱导,处理8-12天后出现多层细胞集落,并且这些细胞集落持续长大。第II阶段培养基处理总共16-20天后,将培养基更换为第III阶段诱导培养基。(4)对于第III阶段诱导,需要第III阶段诱导培养基处理10-12天。然后将培养基改为第IV阶段条件。(5)对于第IV阶段诱导,在第IV阶段诱导培养基的前4天中加入VPA(500μM)、反苯环丙胺(10μM)、DZNep(0.05μM)和EPZ004777(5μM)。处理6-8天后将出现原代hCiPSC集落。
人CiPS细胞系的衍生和培养
8-12天的第IV阶段条件处理后,通过Accutase(Millipore,SCR005)解离细胞,并在改良的第IV阶段条件下以1:3至1:12的比例重新接种到丝裂霉素C(Sigma-Aldrich,M4287)处理的MEF饲养层上(2-3x104/cm2):Knockout DMEM,补充有1% N2补充剂、2% B27补充剂、1%GlutaMAXTM、1% NEAA、1%青霉素-链霉素、0.055mM 2-巯基乙醇、2mg/mLAlbuMAXTM-II和小分子CHIR99021(1μM)、PD0325901(0.5μM)、IWP-2(2μM)、Y-27632(10μM)、HRG(20ng/mL)、和bFGF(100ng/mL,Origene)。细胞在21% O2、5% CO2、37℃下培养,每天更换培养基。3-7天后,出现紧密的CiPS细胞集落。10-12天后,手动挑取这些菌落,机械解离到小夹子中,并转移到补充有Y-27632(10μM)的mTeSRTM Plus培养基(STEMCELL,05826)中的Matrigel(Corning,354248)包被的平板上。让集落附着在培养板上24小时,然后用不含Y-27632的新鲜mTeSRTMPlus培养基更换用过的培养基。
人CiPS细胞和hES细胞(H1和H9)在37℃,21% O2、5% CO2条件下维持在Matrigel包被的平板上的mTeSRTMPlus培养基中。每天更换培养基。当细胞达到~85%汇合度时进行传代。这通常发生在传代后第3-7天,分离比约为1:10至1:20。为了传代,通过ReLeSRTM(STEMCELL,05872)解离人CiPS细胞,并将分离的细胞聚集体转移到具有补充Y-27632(10μM)的mTeSRTMPlus培养基的Matrigel包被的平板上。让集落附着在培养板上24小时,然后用不含Y-27632的新鲜mTeSRTMPlus培养基更换用过的培养基。
免疫荧光
如前所述进行免疫荧光(Hou等人,2013)。用4%多聚甲醛(DingGuo,AR-0211)在室温下固定30分钟后,将细胞透化并用含有0.1% TritonTM X-100(Sigma-Aldrich,T8787)和2%驴血清(Jackson Immuno Research,017-000-121)的PBS在37℃封闭1小时。适当稀释的一抗孵育在相同缓冲液中于4℃过夜进行。第二天,用PBS洗涤细胞3次,并用含2%驴血清的PBS中的二抗在4℃下过夜探测。然后用PBS洗涤细胞3次,并用DAPI溶液(Roche LifeScience,10236276001)对DNA进行染色。表1提供了抗体详细信息。
表1.抗体信息
/>
群体倍增时间
通过使用血细胞计数器计算细胞数量作为时间的函数来确定生长速率。使用来自指数生长期的数据。倍增时间按照以下公式计算:DT=t*[lg2/(lgNt-lgNo)]。
畸胎瘤形成
对于畸胎瘤形成,通过ReLeSRTM收获hCiPS细胞。将大约2x106个细胞重悬于Matrigel中,然后皮下注射到免疫缺陷的NPG小鼠中。畸胎瘤通常在6-7周内获得,然后包埋在石蜡中。石蜡切片用苏木精和曙红染色。所有动物实验均按照中国北京大学的动物保护指南进行。
EB形成
hCiPSC以小团块形式收获,并以球体形式接种在mTESRTM Plus培养基中的超低附着平板上1天,以形成胚状体,并在补充有20% FBS的高葡萄糖DMEM中分化16天。然后,收集EB并在相同培养基中铺在Matrigel包被的平板上6天,固定并用免疫染色检测。
定向分化
hCiPSC的造血和T细胞分化
如前所述,通过优化条件诱导多能干细胞分化为中胚层和造血内皮(HE)细胞(Wang等人,2012)。简而言之,在分化前第1天,将多能干细胞在6孔板中以每孔1×104~5×104的低密度培养在Matrigel包被的平板中。在分化第0天,施用RPMI 1640(Gibco,61870036)2天,其补充不含维生素A的B27、20ng/mL激活素A(Activin A)、20ng/mL BMP4(StemImmune LLC,HST-B4-0100)、50μg/ml Vc2p、3-5μM CHIR99021、1%GlutaMAXTM、1%NEAA、1%青霉素-链霉素和0.1mM 1-硫代甘油(Sigma,M6145)。中胚层诱导2天后,培养分化的EB用RPMI 1640进行培养,所述RPMI 1640补充有不含维生素A的B27、50μg/ml Vc2p、5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF(StemImmune LLC,HVG-VF5-1000)、50ng/ml bFGF(Origene,TP750002)、1% GlutaMAXTM、1% NEAA、1%青霉素-链霉素和10μM SB-431542(Selleck,S1067)。接下来,为了造血诱导,在第6天将培养基更换为IMDM(Gibco,12440053),其补充有不含维生素A的B27、50μg/ml Vc2p、5ng/ml BMP4、10ng/ml VEGF、20ng/ml SCF(StemImmuneLLC,HHM-SF-1000)、1% GlutaMAXTM、1% NEAA、1%青霉素-链霉素。第8天,收集造血祖细胞并转移至MS5-DL4细胞上,并在T细胞分化培养基(IMDM,补充不含维生素A的B27,50μg/mlVc2p、1%GlutaMAXTM、1%NEAA,1%青霉素-链霉素、0.1mM 1-硫代甘油、5ng/ml SCF、5ng/mlFLT3(StemImmune LLC,HHM-FT-1000)、5ng/ml IL7(StemImmune LLC,HCT-I7-1000))中共培养。每2天更换一次培养基。对于表面标记物检测,收集培养的细胞并添加所示的抗体。使用FACSVerse(BD)进行流式细胞术分析。使用FlowJo-V10(BD)分析数据。
hCiPSC的肝细胞分化
如前所述诱导多能干细胞分化为肝细胞(Chen等人,2020)。简而言之,利用100ng/ml激活素A、0.5ng/ml BMP4、10ng/ml bFGF(PEPROTECH,100-18B)和20ng/ml Wnt3a的组合,在含有B27补充剂和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中1天,将hCiPSC1诱导成原条,并利用100ng/ml激活素A、0.5ng/ml BMP4和10ng/ml bFGF的组合诱导3天而成为定型的内胚层细胞。在含有B27补充剂和1%青霉素-链霉素的RPM I1640培养基中,利用20ng/ml KGF(StemImmune,EST-KF-1000)和5μM SB-431542的组合培养2天,将hCiPSC来源的内胚层细胞进一步分化为前肠内胚层细胞。然后在含有B27补充剂和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中,利用20ng/ml KGF、20ng/ml BMP4、10ng/ml BMP2(Stemimmune,HST-B2-1000)和10ng/ml bFGF的组合再培养3天,将hCiPSC来源的前肠内胚层细胞诱导分化为成肝细胞。利用hHPC成熟培养基(含有B27补充剂、25μM毛喉素(Forskolin)和10μM SB-431542的Williams'E培养基)诱导hCiPSC来源的hHPC分化为成熟肝细胞。根据制造商的说明,利用脂质(油红O)染色试剂盒(Sigma,MAK194)进行脂质检测。根据制造商的说明,使用人白蛋白ELISA定量试剂盒(Beth Laboratory,E80-129)测量人白蛋白。根据制造商的说明,使用QuantiChrom尿素测定试剂盒(生物测定系统,BA_DIUR-500)测量尿素合成。
核型分析
核型(染色体G带)分析由北京家恩医院外包,使用高分辨率G分带(400G-500G)的标准方案并通过CytoVision(Leica)进行。对于每次分析,检查至少20个中期。检查染色体的数量以及染色体结构异常的存在。
短串联重复(STR)分析
短串联重复分析由Beijing Microread Genetics Co.,Ltd.外包。简而言之,使用STR多重扩增试剂盒(MicroreaderTM 21 ID System)将基因组DNA进行PCR,并通过ABI3730xl DNA分析仪(Applied )和GeneMapperID-X软件进行分析。
逆转录(RT)-定量PCR(qPCR)
使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research,R2053)分离总RNA。使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech,AT311-03)从0.5-1μg总RNA合成cDNA。使用KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix(KAPA Biosystems,KM4101)在CFX ConnectTM Real-Time System(Bio-Rad)上进行qPCR。使用δ-δCt方法分析数据。GAPDH用作对照以归一化靶基因的表达。本研究中用于qPCR的引物序列列于表2。
表2.用于qRT-PCR的引物
/>
/>
/>
RNA测序
使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒分离总RNA。使用NEBNext Ultra RNALibrary Prep Kit for Illumina(NEB England BioLabs,E7775)构建RNA测序文库。使用Illumina HiSeq X Ten对片段化和随机引物的2x150 bp双末端文库进行测序
单细胞RNA测序(scRNA-seq)
使用单细胞3'文库和Gel Bead Kit V3.1(10x Genomics,1000075)和ChromiumSingle Cell B Chip Kit(10x Genomics,1000074),将细胞悬浮液(通过Count Star测定的每微升300-600个活细胞)加载到Chromium单细胞控制器(10x Genomics)上,根据制造商的方案在乳液中产生单细胞凝胶珠。简而言之,收集整个化学重编程过程不同时间点上的细胞并以每毫升1x106个细胞重悬于具有0.04% BSA的1 x PBS中。大约1x104个细胞被添加到每个通道,并且将回收的靶细胞估计为大约5x103个细胞。捕获的细胞被裂解,释放的RNA在单个GEM中通过逆转录进行条形码标记。反转录在S1000TM Touch Thermal Cycler(BioRad)上进行,53℃,45min,随后85℃,5min,并维持在4℃。产生cDNA,然后进行扩增,并使用Agilent 4200评估质量。据制造商的说明,使用单细胞3'文库和Gel Bead Kit V3.1构建了单细胞RNA-seq文库。最后使用IlluminaNovaseq6000测序仪,采用双端150bp(PE150)读取策略对文库进行测序,测序深度为至少每个细胞1x105个读数(由CapitalBio Technology,Beijing进行)。
使用测序(ATAC-seq)对转座酶可及的染色质的测定
收集每个样品的大约5x104个细胞,用冷PBS洗涤一次,并重悬于50μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl PH7.4、10mM NaCl、3mM MgCl2、0.5% NP-40)中。随后的DNA文库构建通过用于Illumina的TurePrep DNA Library Prep Kit V2(Vazyme,TD501-02)制备,并使用用于Illumina的TruePrep Index Kit V2(Vazyme,TD202 96rxn)通过PCR进行扩增。所有ATAC文库均在Illumina Novaseq 6000平台上进行测序,并生成150bp配对末端读数。生物学独立实验n=3。
全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)
从HEF、hADSC、hCiPSC和hESC中分离出基因组DNA。按照之前的报道(2018,Zhao等人)对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化。将回收的亚硫酸氢盐转化的DNA构建成测序文库,每个文库通过Illumina HiSeq X Ten测序90G原始数据。
亚硫酸氢盐基因组测序
使用Quick-DNA Miniprep试剂盒(Zymo Research,D3024)提取DNA。分离的DNA通过亚硫酸氢盐处理进行修饰,并使用EZ DNA Methylation-Direct Kit(Zymo Research,D5020)进行纯化。然后使用ZymoTaq PreMix试剂盒(Zymo Research,E2003)通过PCR扩增亚硫酸氢盐修饰的DNA。引物列于表2中。将扩增的片段克隆到pEASY-T1 Simple Cloningvector(Transgen,CT111-02)中。对每个样本中十个随机挑选的克隆进行测序。
RNA-seq分析
使用FastQC对所有样品进行质量控制。使用具有参数‘ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:7:1:true LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36’的Trimmomatic修剪原始RNA-seq读数,以去除检测到的接头。使用具有附加参数‘--outSAMtype BAM Unsorted--outSAMstrandField intronMotif--outFilterIntronMotifsRemoveNoncanonical’的STAR将干净读数映射到人类参考基因组hg19上。使用Subread包的featureCounts程序对映射到每个基因上的读数数量进行计数。
使用R包DESeq2进行差异表达基因分析。具体来说,去除了平均表达最低40%分位数的基因,并使用具有默认参数的函数DESeq进行预处理。使用lfcShrink和自适应t先验收缩估计器apeglm计算组之间的基因表达差异。差异表达基因(DEG)定义为组间log2倍数变化>2且调整后的p值<0.05的基因。使用R包clusterProfiler的函数enrichGO对DEG进行GO分析。归一化的计数也经过方差稳定转化并缩放以绘制热图。使用带有参数‘scale.=T,n=3’的R包irlba进行主成分分析(PCA)。
WGBS分析
为了正确进行经亚硫酸氢盐处理的读数的比对,遵循Bismark BismarkBisulfite Mapper流程。首先,使用脚本bismark_genome_preparation将人类参考基因组hg19和λ基因组转化为完全亚硫酸氢盐转变的正向(C>T)和反向(正向链的G>A转换)版本。使用具有Bismark设置的参数的Bowtie2,对序列读数进行类似的转化并映射到准备好的基因组上。然后使用脚本deduplicate_bismark去除与来自Bismark作图输出的基因组中相同位置的比对。使用具有参数‘-p--no_overlap--ignore 5--ignore_r2 5--zero_based--CX--buffer_size 50%’的脚本bismark_methylation_extractor提取每个单个C的甲基化信息。这样就获得了支持甲基化的读数数量以及覆盖每个CpG位点的读取数量,非CpG位点在后面的分析中不考虑。
为了鉴定显示甲基化证据的位点,对这些计数每个位点进行二项测试,以测试甲基化计数是否超出亚硫酸氢盐非转化事件。亚硫酸氢盐非转化率定义为在文库构建过程中掺入的λ基因组的总甲基化水平。使用Benjamini-Hochberg方法计算错误发现率(FDR)。其FDR高于0.01的位点被视为非转化位点,并且其甲基化水平设置为0。通过测试的每个CpG位点的甲基化水平定义为覆盖该位点的读数中支持甲基化的读数的分数(mCpG/CpG)。对于具有多个CpG位点的区域,甲基化水平定义为加权甲基化(总mCpG/总CpG)。每个样本的平均CpG甲基化水平计算为覆盖CpG位点的读数中支持CpG甲基化的所有读数的分数(所有mCpG/所有CpG)。
为了比较不同样本的全局相似性,将基因组切割成长度为50000bp的bin,并计算每个bin的CpG甲基化水平。这些甲基化水平被用作全局CpG甲基化特征的估计。使用函数hclust进行层次聚类,并以1-Pearson相关系数作为距离参数。
ATAC-seq分析
使用FastQC对所有样本进行质量控制。使用具有参数‘ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:7:1:true LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15MINLEN:36’的Trimmomatic修剪原始ATAC-seq读数,以去除检测到的接头。然后使用具有参数‘--very-sensitive’的Bowtie2将干净的读数映射到人类参考基因组hg19上。输出的SAM文件被转换为BAM文件,并使用Samtools按名称排序。使用Picard工具的MarkDuplicates功能去除重复读数。使用Samtools过滤低质量的映射的读数和映射到线粒体的读数。将片段向前调整5bp以考虑到Tn5转座酶占用峰后,使用具有参数‘-g hs--nomodel--shift-100--extsize200--keep-dup all’的MACS2对每个样本进行峰调用。为了仅保留同一样本重复中的一致峰,在每对重复之间进行不可重现发现率(IDR)分析,仅保留至少一次测试中得分>540的峰。
使用R包ChIPpeakAnno合并不同样本中的重叠峰并定义样本特异的峰集。然后使用R软件包ChIPseeker将每个峰注释到最接近的基因。使用Deeptools量化峰区域或基因启动子区域周围的ATAC信号强度。
单细胞RNA-seq数据预处理
使用Cellranger v3.1.0将干净的单细胞RNA-seq读取映射到人类参考基因组hg19上。去除总基因数少于500或总UMI计数少于1000的细胞。然后检查每个细胞线粒体基因的UMI计数比例(M%),并去除对数量度后其M>中位数+2MAD(中位数绝对偏差)或M<中位数-2MAD的细胞。使用具有参数‘use.ranks=T’的R包scran的函数QuickCluster,根据其Spearman等级相关性对通过质量控制的细胞进行粗略聚类。接下来的scaling归一化是通过使用具有‘downsample=T,down_prop=0.1’的函数computeSumFactors和logNormCounts对细胞池中的大小因子进行反卷积来进行的。归一化数据用于使用R包Seurat v3创建Seurat对象。使用2000个可变特征和scaled归一化数据进行PCA降维。然后使用前20个PC进行Uniform Manifold Approximation and Projection(UMAP)降维。使用前20个PC构建Shared Nearest Neighbor(SNN)图,并使用分辨率为0.6的函数FindClusters基于SNN图识别细胞簇。通过函数RunALRA计算的Adaptively-thresholdedLow Rank Approximation(ALRA)插补归一化数据用于可视化基因表达值。
使用报告的数据集对XEN样细胞进行转录组分析
通过一些规范标记物在样本中识别出XEN样簇。为了将这些XEN样细胞与已知的XEN细胞进行比较,使用公共数据集作为参考:人类植入前胚胎数据(E-MTAB-3929,Petropoulos等人,2016)。以类似的方式对该数据集进行预处理,将UMI计数矩阵归一化化为TPM并进行ALRA imputation。所有细胞类型的Pearson相关系数是使用之前论文(Petropoulos等人,2016)定义的300个谱系标记物来计算的。使用R包clusterProfiler进行基因集富集分析(GSEA)。
统计分析
为了进行统计分析,p值是使用GraphPad Prism 8通过不配对的双尾斯氏t检验计算的。p值如下:*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001;****p<0.0001。结果以均值±SD表示,如图例所示。
结果与讨论
为了通过小分子诱导人成纤维细胞成为多能干细胞,首先在人胚胎成纤维细胞(HEF)上测试了成功诱导小鼠多能性(7-10)的先前公开的化学混合物。然而,这些HEF在处理后增殖不良并表现出凋亡表型(图1B),这与之前的发现一致,即与小鼠细胞相比,人类细胞对外源信号更抵抗(15)。为了应对利用外源信号改变人类体细胞命运的挑战,采用了这样的策略,其包括具有选定生物学活性的小分子,所述小分子的组合用于消除体细胞基因程序,激活多能性基因,并建立整合的多能性网络。最后,建立了逐步方法以将人类体细胞重编程为多能干细胞(图1A)。
为了通过小分子将人成纤维细胞诱导成为多能干细胞,首先在人胚胎成纤维细胞(HEF)上测试了多种小分子混合物。然而,在初始阶段,遇到了几个主要障碍:1)HEF维持其成纤维细胞形态并且没有经历间质到上皮的转变;2)或处理后HEF增殖不良并表现出凋亡表型;3)激活多能相关基因的表达也具有挑战性。这些现象与之前的发现一致,即具有稳定表观基因组(5-6)的人类细胞对外源信号具有抵抗力(15)。为了应对利用外源信号改变人类体细胞命运的挑战,采用了将化学文库筛选和小分子组合相结合来消除体细胞基因程序,激活多能性基因,并建立整合的多能性网络的策略。最后,建立了将人类体细胞重编程为多能干细胞的逐步方法。
(图1A)。
为了破坏原始细胞身份并下调体细胞基因程序,进行了化学筛选,以鉴定可以将人成纤维细胞(图1C)转化为单层上皮样细胞(图1E)的小分子组合(CHIR99021、616452和TTNPB)。额外的筛选揭示,将Y27632、ABT869和SAG添加到组合中可以促进上皮样细胞的产生(第I阶段条件)。处理后,一组成纤维细胞标记基因下调(图1F),而上皮细胞相关基因,例如KRT8、KRT18和KRT19则上调(图1G)。此外,多能性相关基因LIN28A在处理的细胞中高表达(图1B和图1G)。然而,在这个阶段,其他关键的多能性基因并未被显著激活。这些第I阶段上皮样细胞上的后续筛选显示,在第I阶段条件中添加表观遗传调节剂5-氮杂胞苷和反苯环丙胺组合JNKIN8(第II阶段条件)后,多能性相关转录因子SALL4被激活并与LIN28A(图1B和图1H)共表达。然而,建立多能性网络的关键,主多能性转录因子OCT4在这些细胞中并未被激活。
OCT4被小分子的组合激活,所述小分子包括表观遗传调节剂(反苯环丙胺、丙戊酸、DZNep和EPZ004777)和信号转导抑制剂(CHIR99021、616452、Y27632和PD0325901)(第III阶段条件)(图1B和图1I)。为了进一步建立完全的多能性基因网络,添加了额外的小分子,以促进人多能干细胞的维持。用CHIR99021、PD0325901、SB590885、IWP2和Y27632(第IV阶段条件)处理后,产生了共表达OCT4、SOX2和NANOG(OSN)的紧密集落(图1B)。重要的是,在转移到人胚胎干细胞(hESC)培养基中后,这些集落表现出典型的hESC形态,其具有紧密排列且核质比高的细胞(图1D)。
然后,对这些建立的OSN细胞系的基因表达和表观遗传状态进行了表征。首先,这些细胞(其可以扩增超过20代)增殖倍增时间与hESC相似(图5A)。它们还表达表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4,以及核心多能性转录因子OCT4、SOX2和NANOG(图1E,数据未显示)。
此外,RT-qPCR分析显示这些细胞中多能性基因(OCT4(八聚体结合转录因子4)、SOX2(SRY-盒转录因子2)、NANOG(Nanog同源框)、DNMT3B(DNA 甲基转移酶3β)、DPPA4(发育多能性相关4)、UTF1(未分化胚胎细胞转录因子1)、ZFP42(锌指蛋白42)、PRDM14(含有PR结构域的蛋白14)和ZIC3(Zic家族成员3))的表达水平与hESC中的结果相当(图1J)并且RNA测序分析显示,这些细胞的转录组与hESC的转录组高度相似(图5B-C,数据未显示)。在hCiPSC中高表达的基因包括:NANOG(Nanog同源框)、PRDM14(含有PR结构域的蛋白14)、LIN28A(蛋白lin-28同源物A)、OCT4(八聚体结合转录因子4)、DPPA4(发育多能性-相关4)、EPCAM(上皮细胞粘附分子)、DNMT3B(DNA甲基转移酶3β)、ZFP42(锌指蛋白42)、SALL4(Spalt样转录因子4)、ZIC3(Zic家族成员3)、SOX2(SRY-盒转录因子2)、TDGF1(畸胎癌衍生生长因子1)、DNMT3A(DNA甲基转移酶3α)、CDH1(钙粘蛋白1)、OTX2(Orthodenticle同源盒2)、ZIC2(Zic家族成员2)。同样,OCT4和NANOG启动子像hESC的那些一样具有去甲基化模式,和开放的染色质可及性状态(数据未显示)。此外,早期传代的hCiPSC具有几个独特的标记物,例如发育多能性相关3(DPPA3)、Kruppel样因子17(KLF17)和DNA甲基转移酶3样(DNMT3L)。这些标记物在传统的多能干细胞(hESC和hiPSC)中不表达。最后,DNA甲基化测定揭示的全局修饰显示那些细胞与hESC共有相似的表观基因组状态(数据未显示)。总而言之,这些结果证明OSN阳性细胞系的转录组和表观遗传谱与人多能干细胞的那些相似。此后,建立的OSN阳性细胞系被称为人化学诱导的多能干细胞(hCiPSC)。
接下来,对hCiPSC的体内和体外发育潜力进行了表征。首先,将hCiPSC注射到免疫缺陷小鼠体内,所得畸胎瘤含有所有3个胚层(内胚层、外胚层和中胚层)的组织(数据未显示)。与此结果一致,hCiPSC在体外形成胚状体并表达三个胚层的标记基因(FOXA2(叉头盒蛋白A2)、SOX17(SRY-盒转录因子17)、GATA4(GATA结合蛋白4)、SOX1(SRY-盒转录因子1)、T-(brachyury)和TUJ1(神经元特异性III类β-微管蛋白))(数据未显示)。定向分化证明hCiPSC系可以分化为造血祖细胞(图6,A和B),并进一步向T细胞祖细胞分化(图6C)。此外,还通过hCiPSC的定向分化产生肝细胞(图7A-D)。总而言之,这些结果显示hCiPSC的稳定分化能力使它们能够产生所有3个胚层的谱系定向细胞。为了测定hCiPSC的基因组完整性,使用高分辨率G带分析对hCiPSC系进行核型分析;数据显示它们都具有正常的二倍体核型(图8和表3)。
表3.hCiPS细胞系的核型分析
此外,短串联重复分析证实hCiPSC源自其亲代成纤维细胞,与其他已建立的hESC系不同。
然后进行研究,将成年体细胞化学重编程为hCiPSC。经过额外的筛选,我们鉴定了促进重编程过程的促进剂(图9A至C),并从成人脂肪源性间充质基质细胞(hADSC)产生hCiPSC(图2,A和现在显示的数据,以及图9D)。此外,来自不同供体的人成人皮肤真皮成纤维细胞(hASF)被重编程为hCiPSC(图11A)。成年体细胞来源的hCiPSC的转录组和表观遗传谱与人多能干细胞的转录组和表观遗传谱相似(图2B至D,图10A-B中未显示的数据,以及图11A-C和未显示的数据)。重要的是,这些成年体细胞来源的hCiPSC还可以在体内和体外分化成所有3个胚层的细胞类型(图2E和数据未显示)。此外,研究在从超过8个独立供体的体细胞中再生hCiPSC是100%成功的(表4)
表4:来自不同供体的hADSC和hASF的重编程效率总结。
hADSCs:人成体脂肪源性间充质基质细胞
hASFs:人成体皮肤成纤维细胞
功效计算为初始hCiPSC集落的数量处理输入细胞的数量
值报导为均值±SD
这些结果证明,我们的小分子方法可以将不同类型的成年体细胞重编程为多能干细胞。
为了进一步了解人类细胞的化学重编程,在每个重编程阶段结束时对基因表达进行了分析。首先,在重编程过程中确定了3个连续的关键阶段,开始于在早期阶段(第I阶段和第II阶段)获得可塑性特征,然后激活胚胎外内胚层(XEN)程序(第III阶段),最后,建立整合的多能性网络(图14)。免疫荧光和单细胞RNA测序显示在第III阶段有一组高度表达的XEN相关标记物(图12A-B,数据未显示和图13A-C)。研究还显示,OCT4阳性细胞从XEN样集落中出现(图12A,数据未显示),表明XEN程序在晚期阶段中桥接了多能性获得,就像对小鼠细胞进行化学重编程一样(8-10)。在早期阶段,观察到体细胞基因程序的下调(早期阶段下调的基因:PRRX2、COL6A2(VI型胶原蛋白α2链)、VIM(波形蛋白)、COL1A1(I型胶原蛋白α1链)、COL1A2(胶原蛋白I型α2链)、RUNX1(Runt相关转录因子1)、ZEB1(锌指E-盒结合同源框1)、PRRX1(配对相关同源框1)、MMP3(基质金属肽酶3),然后是观察到的参与胚胎发育和再生的一系列基因的上调(早期阶段上调基因:FOXC1(叉头盒C1)、KRT19(角蛋白19)、KRT8(角蛋白8)、KRT18(角蛋白18)、CDC7(细胞分裂周期7)、KDR(激酶插入结构域受体)、VASH2(血管抑制素2)、MARCKSl1(MARCKS相关蛋白)、SOX4(MARCKS相关蛋白)、FGF9(成纤维细胞生长因子9)、CDKN1C(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C)、FGFR3(成纤维细胞生长因子受体3)、LIN28A(lin-28同源物A)、BMP4(骨形态发生蛋白4)、LIFR(白血病抑制因子受体)、CCND2(细胞周期蛋白D2)、EFNB1(肝配蛋白B1)、LEF1(淋巴增强子结合因子1)、WT1(肾母细胞瘤1)、NOTCH1(神经源性位点同源蛋白1)、SALL4(Spalt样转录因子4)、IGFBP3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、HMGA2(高迁移率组AT-钩蛋白2)、GATA2(GATA结合蛋白2)、MSX1(msh同源盒1)、EDN3(内皮素3)、TBX3(T盒转录因子3)、TBX2(T盒转录因子2)、HOXA1(同源盒A1)、ZAP70(T细胞受体相关蛋白激酶70的ζ链)、HOXA5(同源盒A5)、HOXB9(同源盒B)、HOXA9(同源盒A)、IGF2(胰岛素样生长因子2)、PGF(胎盘生长因子)、PTCH1(patched 1)、PROK1(前动力蛋白1)、CNTFR(睫状神经营养因子受体)、HEY2(具有YRPW基序的hes相关家族bHLH转录因子2)、CDX2(尾侧型同源框2)、DLX5(远端少同源框5)、IGFL4(IGF样家族成员4)、PRAME(PRAME核受体转录调节因子)、GLI1(GLI家族锌指1;另请参见图3A和图3E),所有这些都类似于自然再生中发生的去分化(17-19)。此外,增加的细胞增殖(图3A和E)代表了重要的细胞去分化和再生特征(17-19)。值得注意的是,早期阶段激活的SALL4和LIN28A是几种生物体中组织修复和再生启动的关键启动子(20-23)。出乎意料的是,t染色质可及性分析显示,包括调节发育和多能性的基因的基因座在第II阶段打开(图3B和未显示的数据,以及图3G)。此外,细胞还在第II阶段获得了低甲基化的表观遗传状态(图3C和D),并且与胚胎发育、细胞周期和干细胞增殖相关的基因的启动子区域被去甲基化(图3E)。总而言之,这些结果表明分化程度较低且可塑性状态较高的早期阶段诱导提供了细胞被重新编程为多能状态的许可(图14)。
在化学重编程中,与小鼠细胞相比,在早期阶段释放人类体细胞可塑性更具挑战性,这与具有降低可塑性潜力的人类体细胞(13-14)对外部信号刺激特别抵抗的报道一致(15)。使用逐步化学重编程策略,本文的研究能够有效地调控人类体细胞的可塑性特征。使用逐步化学重编程策略来有效调控人类体细胞可塑性特征。第I阶段的研究显示,去除CHIR99021、6161452或TTNPB严重降低LIN28A激活并抑制体细胞程序的下调(图4A和图15A-C)。在第II阶段中,JNKIN8对于激活SALL4(图4C和图16A-C)和获取可塑性特征(数据未显示和图4F、图4H以及图19B和C)是必需的,而细胞需要5-氮杂胞苷来形成低甲基化状态(图4G和H)。此外,染色质可及性分析还证实JNKIN8对于在第II阶段激活的基因的开放染色质状态至关重要(图4F和H)。此外,当这些因子(CHIR99021、616452、TTNPB、JNKIN8和5-氮杂胞苷)中的任何一个被去除时,hCiPSC的产生都会受到极大损害(图4B和D),这提示它们对于为多能性网络建立细胞可塑性都是不可或缺的。这些研究证明,小分子可以协同操纵内源性途径和表观遗传靶标,足以将人类体细胞从紧密锁定的分化状态释放到允许细胞命运转换的可塑状态(图4I)。这些发现提供了治疗性重编程的新可能性,其中人类体细胞可塑性潜力可以通过相对简单的程序的外部刺激在体外和体内重新启动,并且无需基因操作。
总之,这些研究报告了人类体细胞向多能干细胞的化学重编程的改进,这在疾病建模、药物发现和再生医学中具有广泛的应用(24-25)。此外,目前的结果显示,通过使用抑制/激活关键生物学活性的一组选定的小分子进行外部化学操作,可以解锁人类体细胞的受限表观遗传景观并将其转化为多能状态。重要的是,这些结果揭示了通过外部化学扰动进行细胞命运重编程的新概念,这与需要卵母细胞细胞质成分的核移植过程有根本的不同(26),并且也不同于依赖于过表达细胞内部转录因子的方法(27-29)。因此,这些研究为转变人类细胞命运和探索细胞重编程提供了新的平台。此外,人类体细胞的化学重编程提供了产生接近临床级细胞制造(30)的患者特异性干细胞的新方法,并且提供了允许在再生医学中轻松调整不同应用的具有灵活的小分子组合的优势。
参考文献
1.Jaenisch,Nat Genet 33,245-254(2003).
2.Liu,等人Nat Rev Cancer 16,359-372(2016).
3.Ikeuchi,等人Development 143,1442-1451(2016).
4.Bosch,Dev Biol 303,421-433(2007).
5.Nicetto,等人Current Opinion in Genetics&Development 55,1-10(2019).
6.Hawkins,等人Cell Stem Cell 6,479-491(2010).
7.Hou,等人Science 341,651-654(2013).
8.Zhao,等人Cell 163,1678-1691(2015).
9.Ye,等人..Cell Research 26,34-45(2015).
10.Zhao,等人Cell Stem Cell 23,31-45.e37(2018).
11.Xu,等人Cell Stem Cell 16,119-134(2015).
12.Li,等人Cell Stem Cell 13,270-283(2013).
13.Alvarado,Nature Reviews Genetics 7,873-884(2006).
14.Wang,C.K.Hu,A.Zeng,D.Alegre,D.Hu,K.Gotting,A.Ortega Granillo,Y.Wang,S.Robb,R.Schnittker,S.Zhang,D.Alegre,H.Li,E.Ross,N.Zhang,A.Brunet,A.Sanchez Alvarado,Changes in regeneration-responsive enhancers shaperegenerative capacities in vertebrates.Science 369,(2020).
15.Akagi,Trends in Molecular Medicine 10,542-548(2004).
16.Kellner,等人Histol Histopathol 25,405-412(2010).
17.Jopling,等人Nature Reviews Molecular Cell Biology 12,79-89(2011).
18.Tanaka,Cell 165,1598-1608(2016).
19.Goldman,Nature Reviews Genetics 21,511-525(2020).
20.Neff,等人Developmental Dynamics 240,979-989(2011).
21.Erickson,M.D.Gearhart,D.D.Honson,T.A.Reid,M.K.Gardner,B.S.Moriarity,K.Echeverri,A novel role for SALL4 during scar-free woundhealing in axolotl.npj Regenerative Medicine 1,(2016).
22.Shyh-Chang,等人Cell 155,778-792(2013).
23.Ye,Z.Su,S.Xie,Y.Liu,Y.Wang,X.Xu,Y.Zheng,M.Zhao,L.Jiang,Yap-lin28aaxis targets let7-Wnt pathway to restore progenitors for initiatingregeneration.eLife 9,(2020).
24.Soldner,等人Cell 175,615-632(2018).
25.Rowe,等人Nature Reviews Genetics 20,377-388(2019).
26.Tachibana,等人Cell 153,1228-1238(2013).
27.Takahashi,等人Cell 131,861-872(2007).
28.Yu,等人Science 318,1917-1920(2007).
29.Park,等人Nature 451,141-146(2007).
30.Li,等人Curr Opin Genet Dev 52,29-35(2018).
Claims (25)
1.将人类体细胞重编程为人化学诱导多能细胞(hCiPSC)的方法,其包括:
在四阶段细胞培养过程中培养人类体细胞,其中:
(a)第I阶段包括在补充有具有以下生物学活性的小分子的细胞培养基中将体细胞培养有效时间量以将细胞转化为单层上皮样细胞;:
(i)糖原激酶抑制剂,
(ii)TGFβ抑制剂,和
(iii)视黄酸受体(RAR)激动剂(第I阶段条件);
(b)第II阶段包括在补充有具有以下生物学活性的小分子的细胞培养基中将来自第I阶段的细胞培养有效时间量以上调一种或多种多能性相关转录因子:
(i)糖原激酶抑制剂,
(ii)TGFβ抑制剂,
(iii)视黄酸受体(RAR)激动剂,
(iv)G蛋白偶联受体Smoothened的激动剂,以及
(v)c-Jun激酶抑制剂(第II阶段条件);
(c)第III阶段包括在补充有具有以下生物学活性的小分子的细胞培养基中将来自第II阶段的细胞培养有效时间量以建立初始多能性网络,通过OCT4的表达来测量:
(i)组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂,
(ii)TGFβ抑制剂,
(iii)MAPK抑制剂,以及
(iv)SAH水解酶抑制剂(第III阶段条件);和
(d)第IV阶段包括在补充有具有以下生物学活性的小分子的细胞培养基中将来自第III阶段的细胞培养有效时间量以完全建立多能性网络,通过共表达OCT4、SOX2和NANOG来测量:
(i)B-Raf抑制剂,和
(ii)MAPK抑制剂(第IV阶段条件)。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述第I阶段条件还包括向所述细胞培养基补充具有以下生物学活性的一种或多种小分子:
(i)Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,
(ii)受体酪氨酸激酶抑制剂,
(iii)G蛋白偶联受体Smoothened的激动剂,
(iv)Dot1L抑制剂,
(v)Jak1/Jak2抑制剂,
(vi)SAH水解酶抑制剂,以及
(vii)Menin-MLL相互作用抑制剂,
任选地,第II阶段条件还包括向细胞培养基补充具有以下生物学活性的一种或多种小分子:
(i)DNA甲基转移酶抑制剂,
(ii)组蛋白去甲基化抑制剂,
(iii)Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,(iv)受体酪氨酸激酶抑制剂,
(v)G9a抑制剂,
(vi)BMP受体/AMPK抑制剂,
(vii)Jak1/Jak2抑制剂,
(viii)p38 MAPK抑制剂,
(ix)CBP/p300溴结构域抑制剂,以及
(x)Menin-MLL相互作用抑制剂,
任选地,第III阶段条件还包括向细胞培养基补充具有以下生物学活性的一种或多种小分子:
(i)糖原激酶抑制剂,
(ii)Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,
(iii)组蛋白去甲基化抑制剂,以及
(iv)Dot1L抑制剂;
(v)SETD8抑制剂
任选地,第IV阶段条件还包括向细胞培养基补充具有以下生物学活性的一种或多种小分子:
(i)Wnt抑制剂,
(ii)糖原激酶抑制剂,
(iii)Rho相关的、含有卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的选择性抑制剂,以及
(iv)组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中将所述细胞维持在第I阶段条件下4-12天的时间段。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中将所述细胞维持在第II阶段条件下8-20天的时间段。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中将所述细胞维持在第III阶段条件下8-12天时间段。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的方法,其中将所述细胞维持在第IV阶段条件下6-8天的时间段。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述体细胞是成年体细胞,并且所述第I阶段条件在以5%O2为特征的缺氧下进行。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述糖原激酶抑制剂选自CHIR99021、SB-216763;CHIR 99021三盐酸盐、BIO-丙酮肟、GSK-3β抑制剂XII、GSK-3抑制剂XV、TD114-2、TD114-3、IM12、CHIR98014和SB-415286。
9.权利要求1-8中任一项的方法,其中所述TGFβ抑制剂选自616452、A83-01、SB431542、SB 505124、GW 788388、多索吗啡和SB 525334。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述视黄酸受体(RAR)激动剂选自TTNPB、Ch55和AM580。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述Rho相关的、含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)抑制剂是Y27632、法舒地尔或thiazovivin。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述受体酪氨酸激酶抑制剂选自ABT869、AG1296和Valatanib。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述G蛋白偶联受体Smoothened的激动剂是SAG、嘌吗啡胺、Hh-Ag1.5或人SHH。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法,其中当存在时,(a)所述DNA甲基转移酶抑制剂选自5-氮胞苷、地西他滨和RG108,(b)组蛋白去甲基化的抑制剂选自:反苯环丙胺、GSK2879、LSD-C76、S2101、RN1和(c)c-Jun激酶抑制剂选自JNKIN8、Sp600125;JNK-in-5;JNK-in-7;和JNK-in-12。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法,其中当存在时,(a)Dot1L抑制剂选自EPZ004777、EPZ5676和SGC0946,(b)SAH水解酶抑制剂选自DZNep、Adox和NepA。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法,其中当存在时,(a)所述组蛋白乙酰化剂/脱乙酰酶抑制剂选自丙戊酸、MS275、LMK235、丁酸盐、阿哌丁、CI 994、缩酚肽、钠、4-pehynl丁酸盐、丁酸钠和UF 010,(b)MAPK抑制剂选自PD0325901、AZD8330;和TAK-733。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述人类体细胞选自血液来源的细胞、皮肤来源的细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间质来源的细胞、实质细胞(例如,肝细胞)、神经细胞和结缔组织细胞。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述体细胞选自成纤维细胞和脂肪来源的体细胞(例如,脂肪细胞)。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法,其中当存在时,(a)所述B-Raf抑制剂选自SB590885、索拉非尼和GDC0879,并且(b)所述Wnt抑制剂选自:IWP-2、WNT-C59、XAV-939和IWR-1,任选地,
(i)第I阶段的小分子选自以下组合:CHIR99021+616452+TTNPB、CHIR99021+616452+CH55、CHIR99021+616452+AM580、CHIR99021+A8301+TTNPB、CHIR99021+SB431542+TTNPB、TD114-2+616452+TTNPB、CHIR98014+616452+TTNPB、GSK3bi XV+616452+TTNPB,
(ii)第II阶段的小分子选自以下组合:CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-7、CHIR99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-12、CHIR99021+616452+TTNPB+嘌吗啡胺+JNK-in-8、CHIR99021+616452+TTNPB+Hh-ag-1.5+JNK-in-8、CHIR99021+616452+CH55+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+616452+AM580+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+A8301+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+SB431542+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR99021+LY2109761+TTNPB+SAG+JNK-in-8、TD114-2++616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR98014+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、GSK3bi XV+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8,
(iii)第III阶段的小分子选自以下组合:VPA+Dznep+PD0325901+616452、VPA+Dznep+AZD8330+616452、VPA+Dznep+TAK733+616452、VPA+Dznep+曲米替尼+616452、VPA+Adox+PD0325901+616452、VPA+Nepa+PD0325901+616452、MS275+Dznep+PD0325901+616452、LMK235+Dznep+PD0325901+616452、丁酸盐+Dznep+PD0325901+616452,和/或
(iv)第IV阶段的小分子选自以下组合:PD0325901+SB590885、PD0325901+索拉非尼、PD0325901+GDC0879、AZD8330+SB590885、AZD8330+索拉非尼、AZD8330+GDC0879、TAK733+SB590885、TAK733+索拉非尼、TAK7 33+GDC0879、曲米替尼+SB590885、曲米替尼+索拉非尼、曲米替尼+GDC0879。
20.通过包括权利要求1-19中任一项所定义的一个或多个阶段的方法获得的细胞,例如,(i)通过第I阶段的培养获得的上皮样细胞,其特征在于至少一种基因MMP1、ZEB1、VIM、COL1A1、COL5A1、COL6A2、PRRX1、SNAI2、TWIST1和TWIST2在早期阶段的下调,以及与LIN28A和KRT有关的至少一种基因例如KRT8、KRT18、KRT19和LIN28A的上调;
(ii)通过第I阶段和第II阶段的培养获得的具有再生程序的可塑性状态细胞,其特征在于它们表达SALL4和LIN28A中的至少一种,并且具有解锁的表观基因组状态,其中开放染色质基因座的数量增加,并且DNA去甲基化增加;
(iii)通过第I阶段、第II阶段和第III阶段培养获得的XEN样细胞,其特征在于至少一种基因LIN28A、SALL4和OCT4上调,并且表达至少一种XEN(胚外内胚层)相关标记物,例如,GATA6、SOX17、FOXA2、HNF1B、APOA1和APOA2;和/或
(iv)人化学诱导多能干细胞,其特征在于它们表达至少一种表面标记物TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA-4,以及核心多能性转录因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3和NANOG。
21.根据权利要求20所述的细胞,其中所述人化学诱导的多能干细胞还表达TRA-1-60、TRA-1-81和/或SSEA-4。
22.根据权利要求20或21中任一项所述的细胞,其特征在于所述人化学诱导的多能干细胞能够在细胞培养中扩增超过20代,例如高达25、30、35、40、41、42代。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的细胞,其中在阶段SIV结束时诱导的原代人化学诱导的多能干细胞表达选自发育多能性相关3(DPPA3)、Kruppel样因子17(KLF17)和DNA甲基转移酶3样(DNMT3L)的因子的至少一种因子。
24.用于将人类体细胞重编程为人化学诱导的多能细胞的细胞培养基组合物或试剂盒,所述组合物或试剂盒包含权利要求1-19中任一项所定义的第I-IV阶段的一个或多个的分子的组合。
25.根据权利要求24所述的组合物或试剂盒,其用于制备权利要求20-23中任一项所定义的细胞。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNPCT/CN2021/085936 | 2021-04-08 | ||
CN2021085936 | 2021-04-08 | ||
PCT/CN2022/077048 WO2022213731A1 (en) | 2021-04-08 | 2022-02-21 | Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116981768A true CN116981768A (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=83545145
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280018680.2A Pending CN116981768A (zh) | 2021-04-08 | 2022-02-21 | 将人类体细胞化学重编程为多能细胞 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4320223A1 (zh) |
JP (1) | JP2024513094A (zh) |
KR (1) | KR20230165858A (zh) |
CN (1) | CN116981768A (zh) |
AU (1) | AU2022255867A1 (zh) |
CA (1) | CA3213219A1 (zh) |
WO (1) | WO2022213731A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN118048296A (zh) * | 2024-04-16 | 2024-05-17 | 成都赛济元生物医药有限公司 | 一种用于细胞重编程的培养体系、试剂盒及方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102448428B1 (ko) * | 2017-01-27 | 2022-09-30 | 가부시키가이샤 가네카 | 내배엽계 세포 집단, 및 다능성 세포로부터 3배엽 중 어느 하나의 세포 집단을 제조하는 방법 |
WO2024078119A1 (en) * | 2022-10-12 | 2024-04-18 | Peking University | Methods for chemical reprogramming and pluripotent stem cells |
CN115772505B (zh) * | 2023-02-13 | 2023-05-19 | 淇嘉科技(天津)有限公司 | 促进体细胞重编程为诱导多能干细胞的培养基及方法 |
CN116536251B (zh) * | 2023-07-06 | 2023-09-19 | 北京北启生物医药有限公司 | 一种无饲养层的化学诱导多能干细胞单克隆建株方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104278008B (zh) * | 2013-07-12 | 2020-08-21 | 北京宏冠再生医学科技有限公司 | 一种通过小分子化合物处理来制备多潜能干细胞的方法、试剂盒和用途 |
CN108884436B (zh) * | 2015-08-13 | 2021-11-05 | 北昊干细胞与再生医学研究院有限公司 | 诱导的扩展的多潜能干细胞、制备及使用方法 |
WO2017091943A1 (en) * | 2015-11-30 | 2017-06-08 | Hong Guan Ltd. | Improved methods for reprograming non-pluripotent cells into pluripotent stem cells |
-
2022
- 2022-02-21 EP EP22783801.8A patent/EP4320223A1/en active Pending
- 2022-02-21 KR KR1020237038453A patent/KR20230165858A/ko unknown
- 2022-02-21 CN CN202280018680.2A patent/CN116981768A/zh active Pending
- 2022-02-21 AU AU2022255867A patent/AU2022255867A1/en active Pending
- 2022-02-21 CA CA3213219A patent/CA3213219A1/en active Pending
- 2022-02-21 WO PCT/CN2022/077048 patent/WO2022213731A1/en active Application Filing
- 2022-02-21 JP JP2023561261A patent/JP2024513094A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN118048296A (zh) * | 2024-04-16 | 2024-05-17 | 成都赛济元生物医药有限公司 | 一种用于细胞重编程的培养体系、试剂盒及方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2022255867A1 (en) | 2023-10-05 |
CA3213219A1 (en) | 2022-10-13 |
EP4320223A1 (en) | 2024-02-14 |
JP2024513094A (ja) | 2024-03-21 |
WO2022213731A1 (en) | 2022-10-13 |
KR20230165858A (ko) | 2023-12-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220025321A1 (en) | Methods for reprograming non-pluripotent cells into pluripotent stem cells | |
CN108884436B (zh) | 诱导的扩展的多潜能干细胞、制备及使用方法 | |
EP3019596B1 (en) | Compositions and methods for reprograming non- pluripotent cells into pluripotent stem cells | |
CN110662832B (zh) | 由间介中胚层细胞分化诱导肾祖细胞的方法和由多能干细胞分化诱导肾祖细胞的方法 | |
WO2022213731A1 (en) | Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells | |
EP3064577B1 (en) | Novel chondrocyte induction method | |
Hu et al. | GSK 3 inhibitor‐BIO regulates proliferation of female germline stem cells from the postnatal mouse ovary | |
US20200277567A1 (en) | Methods for chemically induced lineage reprogramming | |
EP4177335A1 (en) | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same | |
WO2018193949A1 (ja) | ドパミン神経細胞の調製方法 | |
Kumar et al. | Generation of an expandable intermediate mesoderm restricted progenitor cell line from human pluripotent stem cells | |
WO2023149407A1 (ja) | 肺間葉細胞の製造方法および肺間葉細胞 | |
Noort et al. | Pannexin 1 influences lineage specification of human iPSCs | |
Park et al. | Homogeneous generation of iDA neurons with high similarity to bona fide DA neurons using a drug inducible system | |
US20240182867A1 (en) | Chemical reprogramming of human somatic cells into pluripotent cells | |
Pathak et al. | Stem Cells and Aging | |
Patni et al. | Progress in human embryonic stem cell research and aging | |
WO2023017848A1 (ja) | 腎間質前駆細胞の製造方法並びにエリスロポエチン産生細胞、およびレニン産生細胞の製造方法 | |
Nayak | Elucidation of Mechanisms of in vitro Myogenesis of Human Induced Pluripotent Stem Cells with Functional Validation in vitro and in vivo | |
CN117836404A (zh) | 肾间质前体细胞的制造方法及促红细胞生成素产生细胞和肾素产生细胞的制造方法 | |
AU2022376962A1 (en) | Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof | |
Laronde | DIFFERENTIAL PLURIPOTENT REGULATION DEPENDENT UPON DEFINED FACTORS IN HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40096211 Country of ref document: HK |