JP2024513094A

JP2024513094A - ヒト体細胞の多能性細胞への化学的リプログラミング

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Publication number: JP2024513094A
Application number: JP2023561261A
Authority: JP
Inventors: デン，ホンクイ; グアン，ジンヤン; ワン，ジンリン; ワン，グアン; チャン，ジャンユエン; フゥー，ヤオ; チェン，リン; メン，ガオファン
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2024-03-21
Also published as: CA3213219A1; CN116981768A; AU2022255867A1; KR20230165858A; US20240182867A1; EP4320223A1; WO2022213731A1

Abstract

ヒト体細胞の化学的誘導ヒト多能性細胞へのリプログラミングを改良するための培養条件の組成と段階的方法を開示する。必要な生物活性を有する低分子の組合せを用いる第一段階は、体細胞遺伝子プログラムのダウンレギュレーションを目的とする。第二段階は、選択した生物活性を有する低分子の選択を用いて、 1つ以上の多能性関連転写因子をアップレギュレートする。第三段階は、選択した生物活性を有する低分子の選択を用いて、 OCT4の発現によって測定した初期多能性ネットワークを確立する。第四段階と最終段階は、選択した生物活性を有する低分子の選択を用いて、再プログラム細胞におけるOCT4, SOX2, NANOGなどの共発現因子によって測定した多能性ネットワークを完全に確立する。得られた再プログラム細胞は、化学的誘導ヒト多能性幹細胞、 hCiPSCと呼ばれる。

Description

本発明は、一般に、多能性幹細胞の特徴を有する細胞への体細胞の化学的リプログラミングの分野に属する。

細胞の同一性は、発生、恒常性及び疾患の状態において、微小環境からの外部シグナルに応答して確立され、維持され、変化する(1、2)。植物及び一部の無脊椎動物において、外部刺激は細胞の脱分化及び再生を十分に誘発する(3、4)。しかしながら、哺乳類細胞、特にヒト体細胞の可塑性ポテンシャルを再起動するために外部摂動のみを使用することは、コミットされた細胞同一性を保護する安定したエピジェネティックな観点から困難な挑戦である(5、6)。マウス体細胞を多能性幹細胞に誘導するための外部化学的摂動として低分子を使用する以前の研究は、細胞の運命のリプログラミングに向けた化学物質を実証した(7-10)。細胞の運命を制御する高度に調整可能な方法として、低分子の組み合わせは、複数の細胞シグナル伝達経路とクロマチン状態を調節することによって細胞運命を操作することができる (11-12) 。しかし、ヒト体細胞の効率的で堅牢なリプログラミングには、進化に沿って発達したより安定なヒトエピゲノムと可塑性の低下(5-6、13-14)のため、まだ改善が必要である。

本発明の目的は、ヒト体細胞を多能性細胞に再プログラムするために用いることができる低分子の組合せを提供することである。

また、本発明の目的は、ヒト体細胞を改良された効率で多能性細胞に再プログラムする改良された方法を提供することである。

ヒト体細胞を多能性細胞に改良するための組成物及び方法が開示されている。開示された方法は、ヒト体細胞の改良されたリプログラミングを可能にする、体細胞における生物活性の組み合わせを選択的に阻害/活性化する4段階リプログラミングアプローチを採用することにより、従来技術の方法の不十分さを克服する。第1段階は、体細胞遺伝子プログラムの下方制御を目的とした、必要な生物活性 (ステージI因子) を有する低分子の組み合わせを使用する。第2段階は、選択的な生物活性 (ステージII因子) を有する低分子の選択を使用して、1つ以上の多能性関連転写因子を上方制御する。第3段階は、選択的な生物活性 (ステージIII因子) を有する低分子の選択を使用して、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立する。第4及び最終段階は、選択的な生物活性 (ステージIV因子) を有する低分子の選択を使用して、再プログラム細胞(ここでは、化学的に誘導されたヒト多能性幹細胞、hCiPSCと呼ばれる)におけるOCT4、SOX2、及びNANOGなどの共発現因子によって測定される多能性ネットワークを完全に確立する。

以下の生物活性を有する低分子から選択されるステージI因子の好ましい組み合わせ:グリコーゲンキナーゼ阻害剤、例えばCHIR99021、TGFβ阻害剤、例えば616452、及びレチノイン酸受容体 (RAR) アゴニスト、例えばTTNPBは、ステージI因子を補充した細胞培養液中で細胞を単層上皮様細胞に変換するために有効な時間培養することにより、ヒト体細胞、例えばヒト線維芽細胞を単層上皮様細胞に変換するためにステージIで使用される (ステージI条件) 。いくつかの好ましい実施態様において、以下の生物活性の1つ以上を有する低分子をステージI条件に含めることができる:Rho関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、例えばY27632;受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばABT869;Gタンパク質共役受容体Smoothenedに対するアゴニスト、例えばSAG;ドット1L阻害剤、例えばEPZ004777又はEPZ5676; Jak1/Jak2阻害剤、例えばRuxolitinib;SAH加水分解酵素阻害剤、例えばDZNep、及びメニン-MLL相互作用阻害剤、例えばVTP50469、MI3454、又はWDR5-IN-4 (ステージI補足因子) 。

以下の生物活性を有する低分子から選択されるステージII因子の好ましい組み合わせ:グリコーゲンキナーゼ阻害剤、例えばCHIR99021； TGFβ阻害剤、例えば616452；レチノイン酸受容体 (RAR) アゴニスト、例えばTTNPB； Gタンパク質共役受容体Smoothenedに対するアゴニスト、例えばSAG；及びc-Junキナーゼ阻害剤、例えばJNKIN8は、1つ以上の多能性関連転写因子を上方制御するためにステージII因子を補足した細胞培養液中で1つ以上の多能性関連転写因子を上方制御するために有効な時間培養することにより、ステージIIで使用される (ステージII条件) 。いくつかの好ましい実施態様において、以下の生物活性の1つ以上を有する低分子をステージII条件に含めることができる:DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば5-アザシチジン；ヒストン脱メチル化阻害剤、例えばトラニルシプロミン；Rho関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、例えばY27632；受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばABT869； G9a阻害剤、例えばUNC0224；BMP受容体/AMPK阻害剤、例えばDorsomorphin； Jak1/Jak2阻害剤、例えばRuxolitinib；p38 MAPK阻害剤、例えばBIRB796；CBP/p300ブロモドメイン阻害剤、例えばSGC-CBP30、I-CBP112、GNE272、又はGNE409；メニン-MLL相互作用阻害薬、例えばVTP50469、MI3454、又はWDR5-IN-4 (ステージII補足因子) 。

以下の生物活性を有する低分子から選択されるステージIII因子の好ましい組み合わせ:ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、例えばバルプロ酸；MAPK阻害剤、例えばPD0325901； TGFβ阻害剤、例えば616452；及びSAHヒドロラーゼ阻害剤、例えばDZNepをステージ3で使用して、初期多能性ネットワークを確立するために、ステージIII因子を補充した細胞培養液中で細胞を有効な時間培養することにより、例えばOCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立する (ステージIII条件) 。いくつかの好ましい実施態様において、以下の生物活性の1つ以上を有する低分子をステージIII条件に含めることができる:グリコーゲンキナーゼ阻害剤、例えばCHIR99021；Rho関連コイル状含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、例えばY27632；SETD8阻害剤、例えばUnc0379；ヒストン脱メチル化阻害剤、例えばトラニルシプロミン；及びDot1L阻害剤、例えばEPZ004777 (ステージIII補充因子) 。

以下の生物活性を有する低分子から選択されたステージIV因子の好ましい組み合わせ:B-Raf阻害剤、例えばSB590885；及びMAPK阻害剤、例えばPD0325901は、ステージ4において、多能性ネットワークを完全に確立するために、例えば、ステージIV因子を補充した細胞培養液中で、多能性ネットワークを完全に確立するために有効な時間、細胞を培養することにより、OCT4、SOX2、及びNANOGの共発現によって測定される多能性ネットワークを完全に確立するために使用される (ステージIV条件) 。いくつかの好ましい実施態様において、以下の生物活性の1つ以上を有する低分子は、ステージIV条件に含めることができる:例えば、Wnt阻害剤、例えば、IWP2；グリコーゲンキナーゼ阻害剤、例えば、CHIR99021又はCHIR98014；Rho関連コイル状含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、例えば、Y27632；及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤、例えば、バルプロ酸 (ステージIV補充因子) 。

開示された方法は、ヒト胚性線維芽細胞、成体ヒト皮膚線維芽細胞及び成体脂肪由来間葉系間質細胞のような胎児又は成体ドナー組織から単離されたヒト体細胞を再プログラムするために使用することができる。

開示された方法に従って得られた細胞(例えば、hCiPSC)も提供される。開示された方法に従って得られた細胞としては、例えば、 (i) ステージIの培養によって得られ、初期ステージMMP1、ZEB1、VIM、COL1A1、COL5A1、COL6A2、PRRX1、SNAI2、TWIST1及びTWIST2の少なくとも1つの遺伝子のダウンレギュレーション、並びにLIN28A及びKRTに関連する少なくとも1つの遺伝子、例えば、KRT8、KRT18、KRT19及びLIN28Aのアップレギュレーションを特徴とする上皮様細胞、(ii) ステージI及びステージIIの培養によって得られ、SALL4及びLIN28Aの少なくとも1つを発現し、さらに開いたクロマチン座の数が増加し、DNA脱メチル化が増加したアンロックされたエピゲノム状態であることを特徴とする、再生プログラムを有する可塑性状態の細胞、(iii) ステージI、ステージII及びステージIIIの培養によって得られ、LIN28A、SALL4及びOCT4の少なくとも1つの遺伝子のアップレギュレーション及びXEN (胚外内胚葉) 関連マーカー、例えばGATA6、SOX17、FOXA2、HNF1B、APOA1及びAPOA2の少なくとも1つの発現を特徴とするXEN様細胞、及び/又は (iv) TRA-1-60、TRA-1-81及びSSEA-4の少なくとも1つの表面マーカーを、コア多能性転写因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3及びNANOGとともに発現することを特徴とする化学的誘導ヒト多能性幹細胞を含む。hCiPSCは、20以上の継代、例えば25、30、35、40、41、42までの継代で拡張し、hESCと同様の倍加時間で増殖することを特徴とする。hCiPSCはまた、コア多能性転写因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3、及びNANOGとともに、TRA-1-60、TRA-1-81、及びSSEA-4の少なくとも1つの表面マーカーを発現することを特徴とする。好ましい実施形態では、それらはTRA-1-60、TRA-1-81、及びSSEA-4を発現する。ステージIVの終わりに誘導される一次hCiPSCは、発生多能性関連3 (DPPA3) 、Kruppel様因子17 (KLF17) 及びDNAメチルトランスフェラーゼ3様 (DNMT3L) のようないくつかのユニークなマーカーを発現する。これらのマーカーは、従来のヒト多能性幹細胞 (hESC及びhiPSC) では発現しなかった。機能的には、免疫不全マウスにhCiPSCを注入し、その結果生じた奇形腫は、3つのすべての生殖層(内胚葉、外胚葉、中胚葉)の組織を含む。hCiPSCは、in vitroで胚様体を形成し、3つの生殖層のマーカー遺伝子を発現し、他のコミットされた細胞型、例えば肝細胞への指向性分化、又は造血前駆細胞などの前駆細胞への指向性分化を受けることができる。最も重要なことに、hCiPSCは、好ましくは遺伝子操作されず、すなわち、例えばOCT4、SOX2、KLF4、NANOG及び/又はc-Mycのような多能性の1つ以上のマーカーを発現するように体細胞を操作するなど、細胞から遺伝要素を導入又は除去することによってヒト体細胞を改変することを含むプロセスによって得られるのではなく、したがって、開示された方法に従って得られたhCiPSCは、好ましくは外因的に導入されたOCT4、SOX2、KLF4、NANOG及び/又はc-Mycを含まない。

ヒト体細胞を化学的に誘導されたヒト多能性細胞(例えば、開示された方法で使用する場合)にリプログラミングするための細胞培養培地組成物又はキットも提供される。上記組成物又はキットは、本明細書に開示されるステージI～IVの1つ以上の、好ましくはすべての分子の組み合わせのカクテルを含み得る。これらは、所望の濃度を生成するために細胞培養培地への添加を容易にするために、定義された濃度を有する形態であり得る。組成物又はキットは、本明細書に開示されるステージI～IVの1つ以上の細胞を調製する際に使用され得る。

従って、培養条件の組成物及び化学的に誘導されたヒト多能性細胞へのヒト体細胞のリプログラミングを改善する段階的方法が開示される。第1段階は、必要な生物活性を有する低分子の組み合わせを用い、体細胞遺伝子プログラムのダウンレギュレーションを目的とする(第I段階)。第2段階は、選択的な生物活性を有する低分子の選択を用い(第II段階)、1つ以上の多能性関連転写因子を上方制御する。第3段階は、選択的な生物活性を有する低分子の選択を用い(第III段階)、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立する。第4及び最終段階は、選択的な生物活性を有する低分子の選択を用い(第IV段階)、再プログラムされた細胞におけるOCT4、SOX2及びNANOGのような共発現因子によって測定される多能性ネットワークを完全に確立する。得られた再プログラムされた細胞は、化学的に誘導されたヒト多能性幹細胞、hCiPSCと呼ばれる。

加えて、ここに開示された培養条件の組成物及び段階的方法は、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又は所望の細胞型を生じさせる能力を有する可塑性ポテンシャルを有する細胞の源を生成することができ、治療、組織工学及び研究にとって重要である。hCiPSC、XEN様細胞、可塑性状態細胞及び上皮様細胞を含む本文書に記載された方法を通じて得られた細胞は、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又はLIN28A、SALL4、OCT4又はNANOGのような少なくとも1つの幹細胞又は前駆細胞関連マーカーを発現する可塑性ポテンシャルを有する細胞の容易に利用可能な源である。本明細書では、簡潔さのために、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又は可塑性ポテンシャルを有する細胞の源をhCiPSCと称したが、当業者は、本明細書に記載された方法によって得られたXEN様細胞、可塑性状態細胞及び上皮様細胞も、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又は可塑性ポテンシャルを有する細胞の源として同様に使用することができることを理解するであろう。

さらに、本出願における低分子組成物は、in vitro及びin vivoで組織再生、修復及び若返りに使用することができる。例えば、リプログラミング過程のステージI及びステージIIの低分子は、in vivo又はin vitro/ex vivoで脱分化、再生、修復及び若返りを促進するために、投与、送達又は被験体、組織又は細胞との接触のために配合することができる。

図1A～D及び1Jは、低分子化合物によるhCiPSCの生成を示す。図1A線維芽細胞からhCiPSCへの化学的リプログラミング過程の模式図。図1Bはマウスの化学的リプログラミング条件での処理後のヒト胚線維芽細胞の形態学的変化を示す。スケールバーは100μm。少なくとも3つの独立した実験の代表例。図1Cは未処理HEFの形態を示す。図1DはHEFに由来するhCiPSC (hCiPSC‐1117‐1#‐p21) の形態を示す。図1EはhCiPSC誘導の間の、各段階の終わりにおける細胞の代表的画像を示す。スケールバーは100μm。少なくとも3つの独立した実験の代表例。図1F-IはhCiPSC誘導の間の遺伝子発現の定量的PCR検証を示す。図1F及び1GはステージIの終わりにおける線維芽細胞関連遺伝子、上皮関連遺伝子及びLIN28Aの相対的発現を示す。図1HはステージIIの終わりにおけるLIN28A及びSALL4の相対的発現を示す。図1IはステージIIIの終わりにおけるLIN28A、SALL4及びOCT4の相対的発現を示す。エラーバー、平均 (SD) 。3つの独立した実験の代表例。図1J表示されたhCiPSC及びhESCにおける多能性マーカーのRT-qPCR分析。スケールバーは100μm。エラーバー、平均 (SD);n=3。図2A～2Eは成体体細胞からのhCiPSCの生成を示す。図2A：成人hADSC及びhADSC由来hCiPSCの代表的な画像。図2B：表示されたhCiPSC及びhESCにおける多能性マーカーのRT-qPCR分析。図2C：hCiPSC, hESC及び成体体細胞の全体的トランスクリプトームプロファイルの階層的クラスタリング。図2D：hADSC及びhADSC由来hCiPSC (hCiPSC-0809-3#) OCT4及びNANOGプロモーター遺伝子座におけるDNA CpGメチル化状態の亜硫酸水素塩配列解析。図2E：hCiPSC由来奇形腫切片 (hCiPSC-0809-3#及びhCiPSC-1003#) のヘマトキシリン・エオジン染色。各hCiPSCクローンについて、すべての画像は外胚葉、中胚葉及び内胚葉の代表的な組織特徴を含む単一奇形腫から得た。図3AはステージIで下方制御され、ステージIIで上方制御された遺伝子の遺伝子オントロジー解析を示す。HEFsとhADSCを用いた独立実験の4バッチを用いて、重複する差次的発現遺伝子を解析した。図3B：線維芽細胞及びステージIIにおいてsc‐ATAC‐seqにより検出された開口遺伝子を示すヒートマップ。図3C：線維芽細胞、ステージI及びステージIIにおける異なるDNA CpGメチル化状態の分布。3つの独立した実験の代表例。図3D：線維芽細胞、ステージI及びステージIIにおけるメチル化遺伝子プロモーターの数を示すベン図。図3E：示されたGO項における遺伝子の遺伝子発現濃縮、クロマチンアクセシビリティ及びDNAメチル化状態。図4A～Fは、初期段階で可塑性シグネチャを調節する重要な低分子のデータを示す。図4 (a) 及び (b) ：ステージIから個々の化学物質を取り出した後のリプログラミング終了時におけるLIN28A及び線維芽細胞マーカー遺伝子の発現及びhCiPSCコロニー数。3つの独立した実験の代表例。図4C及び4D：ステージIIにおけるSALL4陽性コロニー及びステージIIから個々の化学物質を除去した後の再プログラム終了時のhCiPSCコロニーの数。3つの独立した実験の代表例。図4E：指示されたサンプルの指示された遺伝子発現を示すヒートマップ。図4F：個々の化学物質を取り出した後のステージIIでの開いた遺伝子座のシグナル密度。図4G：ステージIIから個々の化学物質を取り出した後のDNAメチル化レベル。図4H：ステージIIから個々の化学物質を回収した後の、示されたGO期における遺伝子の遺伝子発現濃縮、クロマチンアクセシビリティ及びDNAメチル化状態。図4I：初期段階におけるリプログラミング過程における主要な分子事象の模式図。エラーバー、平均 (SD);n=3。図5Aは、hCiPSC及びhESCの計算された倍加時間として例示されたhCiPSCの特性化を示す。エラーバー、平均 (SD) 。図5B及びCは、hCiPSCにおけるグローバル遺伝子発現解析を示す。図5B：hCiPSC、hESC及びHEFsにおけるグローバル遺伝子発現を比較する散布図。3つの独立した実験の代表例。図5 (c)：hCiPSC, hESC及びHEFsのグローバル転写プロファイルの階層的クラスタリング。距離はI‐スピアマン相関係数により計算した。図5Dは、線維芽細胞、初代hCiPSC及びヒト胚性幹細胞 (hESC) におけるKruppel様因子17 (KLF17)、発生多能性関連3 (DPPA3) 及びDNAメチルトランスフェラーゼ3様(DNMT3L) の発現を示す。図6A～6CはhCiPSCの造血系細胞へのin vitro指向性分化を示す。図、6A及び6B：FACS分析によってカウントされたCD34/CD144二重陽性細胞及びCD34/CD31二重陽性細胞の割合。エラーバー、平均値 (SD);n=3。図6 (c)：FACS分析によってカウントされたhCiPSC由来T前駆細胞の割合。図7A‐DはhCiPSCの肝細胞へのin vitro指向性分化を示す。図7A：AFP及びALB二重陽性hCiPSC由来肝前駆細胞 (HPC) のFACS解析。図7 B：hCiPSC由来肝細胞 (hdHeps) 形態。スケールバーは100/lm。図7 (c) ：hdHeps及び初代ヒト肝細胞 (PHH) による尿素及びALB分泌の定量分析。図7D：hiPSC, HPC, hdHeps, PHHにおける機能性肝細胞マーカー遺伝子のRT‐qPCR解析。相対発現はPHHに標準化した。エラーバー、平均 (SD);n=3。図8は正常な二倍体染色体含有量を有するREF由来hCiPSCを示す核型分析を示す。図9A～DはhADSCのリプログラミング効率を促進する低分子の結果を示す。図9 (a)：hADSCからのhCiPSC誘導中の各段階の終わりにおける細胞の代表画像。スケールバー、100 flm。図9B及び9C：ステージI及びステージIIでhADSCからhCiPSCの生成を促進する低分子及びその組み合わせの同定。EPZ, EPZ004777;ルキソ、ルキソリチニブ;BIRB, BIRB796;U2, UNC0224;DM,ドルソモルヒネ。エラーバー、平均 (SD);n=3。図9D：異なる時間経過下でhADSCから生成されたhCiPSCコロニー数。「8+8+8+7」はそれぞれ各段階の連続した期間を表す。エラーバー、平均(SD);n=4。上記のすべての結果は、少なくとも3つの独立した実験を代表するものである。図10A～Bは、hADSCから誘導されたhCiPSCの特性化を示す。図10A：hCiPSC, hESC及びhADSCにおけるOCT4及びNANOGプロモーター領域の亜硫酸水素塩ゲノム配列決定。図10 (b)：hADSC由来hCiPSCの正常な二倍体染色体含量を示す核型分析。図11A～Cはヒト成人皮膚線維芽細胞 (hASFs) 由来hCiPSCの特性化を示す。図11A：代表的な成人hASF及びhASF由来hCiPSCの画像。図11B：示されたhCiPSC及びhESCにおける多能性マーカーのリアルタイムqPCR分析;6本の棒の各グループの棒は左から右に次のようにラベル付けされる:1=hCiPSCs-0408-1#;2=hCiPSCs-0408-2#;3=hCiPSCs-1230-4#;4=hCiPSCs-1230-11#;5=H1;6=H9) 。図11 (c)：hASF由来hCiPSCの正常な二倍体染色体含量を示す核型分析。図12A～BはXEN様状態がステージIIIで誘導されたことを示す。図12A：RT-qPCRによって示されるように、化学リプログラミング過程中のXEN関連マーカーの動的発現変化。エラーバー、平均 (SD);n=3。3つの独立した実験の代表例。図12B：5バッチの独立した実験でXEN様コロニーの内側 (黒) と外側 (赤) から発生したOCT4陽性細胞の割合。各実験バッチに対して3以上のウェルをカウントした。図13A～CはステージIIIの終わりの細胞の単一細胞RNA配列解析を示す。図13A：ステージIIIにおける原始内胚葉 (XENとしても知られる) 関連マーカーの発現。図13B：ヒト着床前胚及びステージIIIの細胞クラスターにおける原始内胚葉関連遺伝子の発現。図13C：XEN様細胞 (クラスタ2) における原始内胚葉関連特徴の濃縮スコアのGSEA解析。図14は、リプログラミング処理中の主要な分子事象の概略図である。図15A～Cは、ステージI条件から個々の化学物質を回収する効果を示す。(A) ステージIでの指示された処理後の細胞のグローバル転写プロファイルの階層的クラスタリング (B) 及び (C) CHIR, 616452及びTTNPBの除去後の異なる発現遺伝子の遺伝子オントロジー解析。図16A～CはステージII条件から個々の化学物質を除去する効果を示す。(A及びB) ステージIIの終了時に指示された化学物質を除去した後のSALL4及び細胞数の発現。エラーバー、SDによる平均値 (n=3) 。**** p<0.0001。三つの独立した実験の代表例。(C) JNKIN8除去後の異なる発現遺伝子の遺伝子オントロジー解析。図17は、ステージI、ステージII、ステージIII及びステージIVから個々の低分子を除去した後のリプログラミング効率を示しており、コア低分子はこれらのデータによって識別できる。図18は、ステージIの低分子を同じ経路又は標的を標的とする他の低分子(GSK3β阻害薬;RA経路作動薬;ロック阻害剤;TGFβ阻害剤)に置き換えた後のリプログラミング効率を示している。図19は、ステージIIの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す(GSK3β阻害薬;RA経路作動薬;ロック阻害剤;TGFβ阻害剤)。図20は、ステージIIの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す(Smoothenedアゴニスト;ヒストン脱メチル阻害剤;DNMT阻害剤;JNK阻害剤)。図21は、ステージIIIの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す(GSK3β阻害薬;TGFβ阻害剤;ロック阻害剤;ヒストン脱メチル阻害剤及びロック阻害剤)。図22は、ステージIIIの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す(HDAC阻害薬;Dot1L阻害薬;S-アデノシル-L-ホモシステインヒドロラーゼ阻害剤;ERK阻害薬)。図23は、ステージIVの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す(GSK3β阻害薬;ERK阻害薬;ロック阻害剤;WNT経路阻害薬)。図24は、ステージIVの低分子が同じ経路又は標的を標的とする他の低分子 (BRAF阻害剤及びHDAC阻害剤) に置き換えられた後のリプログラミング効率を示す。図25は、低分子化合物によるhCiPSCの誘導過程を示す。図26は、SGC-CBP30、I-CBP112、GNE272及びGNE409を含むCBP/p300阻害剤がリプログラミング効率を改善できることを示す。図27は、Menin-MLL相互作用阻害剤がリプログラミング効率を改善できることを示す。図28は、SETD8阻害剤がリプログラミング効率を改善できることを示す。図29は、ステージIにおけるリプログラミング効率を改善する最小の化学的組み合わせ及び低分子を示す。図30は、ステージIIにおけるリプログラミング効率を改善する最小の化学的組み合わせ及び低分子を示す。図31は、ステージIIIにおけるリプログラミング効率を改善する最小の化学的組み合わせ及び低分子を示す。図32は、ステージIVにおけるリプログラミング効率を改善する最小の化学的組み合わせ及び低分子を示す。

［本発明の詳細な説明］
外部刺激は、植物及び一部の無脊椎動物において細胞の脱分化及び再生を十分に誘発する。しかしながら、ヒト体細胞は、それらの確定された細胞同一性と安定したエピゲノムのために、その可塑性を制限されない効力に調節するために、外部の摂動に抵抗する。ここでは、外部の化学的摂動としての選択された生物活性との低分子の組み合わせは、自然再生に似た脱分化プロセスを介して、分化したヒト体細胞のエピジェネティックな景観の効果的なリプログラミングを可能にした。体細胞のこの化学的リプログラミングは、トランスクリプトームプロファイル、エピジェネティックな状態及び発生能において多能性幹細胞の重要な特徴を示す、ヒト化学的に誘導された多能性幹細胞 (hCiPSC) をもたらした。開示されたアプローチは、応用のためのヒト多能性幹細胞を生成するためのプラットフォームを提供する。さらに、本明細書に開示された研究は、ヒト体細胞の可塑性ポテンシャルがin vitro及びin vivoの両方の外部刺激によって調節され得る治療的リプログラミングにも光を当てる。

I. 定義
本明細書において使用される用語「化学的に誘導された多能性幹細胞」 (CiPSC) は、1つ以上のトランスフェクトされた遺伝子の発現によってではなく、非多能性細胞を化学化合物と接触させることによって、多能性でない細胞、すなわち、多能性又は分化した細胞から誘導された多能性細胞を指す。

本明細書において使用される場合、「培養」とは、培地中で増殖し、必要に応じて継代される細胞の集団を意味する。細胞培養は、一次培養(例えば、通過していない文化)であってもよく、二次培養又は後続培養(例えば、1回以上継代又は継代された細胞の集団)であってもよい。

本明細書で使用されるように、リプログラミングの「強化」又は「効率の向上」とは、強化因子 (低分子) を使用しない化学的リプログラミング方法と比較したときに、OCT4、SOX2及びNANOGのような多能性因子を発現する細胞の能力及び培養中の継代数から選択された特性に関して測定される、総リプログラミング時間の短縮、同じ時間培養された同じ開始細胞密度から得られるリプログラミング細胞の数の増加及び/又はリプログラミング細胞の品質の向上を意味する。

CiPSCに言及するときの用語「単離された」又は「精製された」とは、少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%の化学的に誘導された多能性幹細胞であって、非多能性細胞のような細胞タイプを汚染していないものを意味する。単離された幹細胞は、可溶性の天然に存在する分子を実質的に含まないこともある。

本明細書で使用される用語「多能性」 (又は多能性) は、細胞が3つの胚層のいずれかに分化する可能性を指す:内胚葉(例えば、胃の内側粘膜、消化管、肺)、中胚葉(例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器)、又は外胚葉(例えば、表皮組織や神経系)。「多能性ではない」という用語は、細胞が3つの生殖層のすべてに分化する可能性を持たないことを意味する。多能性幹細胞は、可塑性が低く、より分化しており、特定の臓器内のいくつかの種類の細胞の1つになることができる。例えば、多能性幹細胞は、赤血球前駆細胞、白血球細胞、血小板産生細胞に成長することができる。成体幹細胞は多能性幹細胞である。脂肪由来幹細胞は多能性である。

本明細書で使用される「リプログラミング」とは、ある特定の細胞型を別の細胞型に変換することを意味する。例えば、多能性ではないヒト体細胞を多能性細胞にリプログラミングすることができる。非多能性細胞を化合物を用いて多能性細胞にリプログラミングする場合、得られる細胞は化学的に誘導された多能性幹細胞である。

用語「低分子」は、分子量が2,000ダルトン未満、より好ましくは1,500ダルトン未満、最も好ましくは1,000ダルトン未満の有機化合物又は有機金属化合物のような分子を指す。

用語「脱分化」は、より分化した状態からより低分化した状態へと逆に発達した細胞又は組織を指す。細胞又は組織は、より成熟していない外観、遺伝子発現、エピジェネティック状態又は代謝プロファイルを獲得した。

用語「可塑性」は、細胞又は組織が他の細胞又は組織の特徴を取る能力を指す。細胞の可塑性は、細胞が系統間制限境界を克服し、他の細胞型を発生させる可能性がかなりあることを示している。

II 組成物
A. ヒト体細胞における多能性の誘導を改善するための低分子
ヒト体細胞のヒト化学的に誘導された多能性細胞へのリプログラミングを改善するために有用な化学化合物は、単独又はタンパク質との組み合わせで、2,000ダルトン未満、より好ましくは1,500ダルトン未満、最も好ましくは1,000ダルトン未満の分子量を有する低分子を含む。低分子は、900ダルトン以下又は500ダルトン以下の分子量を有することができる。

したがって、選択した細胞活性の組み合わせを阻害/活性化し、化学的リプログラミングの四段階プロセスにおいて、ヒト体細胞の化学的誘導ヒト多能性細胞へのリプログラミングを改善する低分子カクテルが同定されている (Oct4のような多能性の一つ以上のマーカーを発現するように細胞を遺伝子工学する必要なしに) 。選択的阻害によるヒト体細胞のリプログラミングの改善。開示された生物活性の/活性化は、例えば、本明細書に開示された生物活性の阻害/活性化の組み合わせを使用しない化学的リプログラミング方法と比較して、OCT4、SOX2及びNANOGのような多能性因子を発現する細胞の能力から選択された特性、単独、又は少なくとも1つの表面マーカーTRA-1-60、TRA-1-81及びSSEA-4との組み合わせ、及び/又は培養中の (リプログラミングされた細胞の) 継代数によって測定される、リプログラミングされた細胞の品質の改善として決定することができる。

リプログラミング工程のステージIのための低分子は、以下から選択される生物活性を有する低分子(ここでは、ステージI条件)の組み合わせを含む:好ましい実施形態で使用されるCHIR99021を有するグリコーゲンキナーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用される616452を有するTGFβ阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるTTNPBを有するレチノイン酸受容体 (RAR) アゴニスト。いくつかの実施形態では、選択された生物活性を有する追加の低分子がステージI条件に含まれ、例えば、好ましい実施形態で使用されるY27632又はTzvを有するRho関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の阻害剤、好ましい実施形態で使用されるABT869を有する受容体チロシンキナーゼ阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるSAGを有するSmoothened受容体のためのアゴニスト。

ステージI条件は、ヒト体細胞、例えば、ヒト線維芽細胞、脂肪由来間質細胞などを単層上皮様細胞に変換するために使用され、好ましい実施形態で使用されるDZNepを有するSAHヒドロラーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用されるEPZ004777を有するDOT1Lメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるルキソリチニブを有するJAK1/JAK2阻害剤などのステージI補足生物活性を任意に補充することができる。

リプログラミング過程のステージIIのための低分子は、選択的生物活性を有する低分子の組み合わせを含む(ここではII期の状態) (i) ステージI因子:好ましい実施形態で使用されるCHIR99021を有するグリコーゲンキナーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用される616452を有するTGFβ阻害剤、好ましい実施形態で使用されるY27632を有するRho関連コイル状含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるSAGを有するSmoothened受容体 (プルモルファミン;Hh-Ag1.5;SAG 21K又はヒトSHHは、Smoothened受容体のアゴニストとして使用することができる)のためのアゴニスト、及び好ましい実施形態で使用されるABT869を有する受容体チロシンキナーゼ阻害剤、の組み合わせを含む。(ii) ステージI補足因子:好ましい実施形態で使用されるルキソリチニブを有するJAK1/2阻害剤;(iii) ステージII因子:好ましい実施形態で使用されるトラニルシプロミンを有するヒストンデメチル化阻害剤、好ましい実施形態で使用される5-アザシチジンを有するDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤 (ただし、デシタビン及びRG108はエピジェネティック調節剤としても使用され得る) 、及び好ましい実施形態で使用されるJNKIN8を有するc-Junキナーゼ阻害剤(ただし、SP 600125;JNK-in-5;又はJNK-in-7;JNK-in-12はc-Junキナーゼ阻害剤としても使用できる)。

ステージII条件は、1つ又は複数の多能性関連転写因子を上方制御するためにステージI条件で処理された細胞に加えられ、好ましい実施形態で使用されるUNC0224 (ただし、G9a阻害剤としてUnc0638及びUnc0321を使用することができる) 、好ましい実施形態で使用されるルクソリチニブを有するJAK1/2阻害剤(トファシチニブであっても;AZD1480はJAK1/2阻害剤として使用することができる。)、好ましい実施形態で使用されるBIRB796を有するp38 MAPK阻害剤、好ましい実施形態で使用されるDorsomorphinを有するBMP受容体/AMPK阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるCBP/p300ブロモドメイン阻害剤SGC-CBP30などのステージII補足因子で任意に補足することができる。

リプログラミング過程のステージIIIのための低分子は、以下から選択される選択的生物活性(ここでは、III期の状態)を有する低分子の組み合わせを含む。 (i) ステージI因子:好ましい実施形態で使用されるCHIR99021を有するグリコーゲンキナーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用されるTGFβ阻害剤、及び好ましい実施形態で使用される616452を有する;(ii) ステージI補足因子:好ましい実施形態で使用されるDZNepを有するSAHヒドロラーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用されるEPZ004777酸を有するDOT1Lメチルトランスフェラーゼ阻害剤;(iii) ステージII因子:好ましい実施形態で使用されるトラニルシプロミンを有するヒストン脱メチル化阻害剤;及び (iv) ステージIII因子:好ましい実施形態で使用されるバルプロ酸を有するヒストンアセチル化酵素/脱アセチル化酵素阻害剤、好ましい実施形態で使用されるY27632を有するRho結合コイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されるPD0325901を有するMAPK阻害剤(ただし、PD0325901の代わりにAZD8330、TAK-733及びトラミチニブを使用することもできる)、ならびに好ましい実施形態で使用されるUnc0379を有するSETD8阻害剤。

ステージII条件で処理された細胞にステージIII条件を加え、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立する。

リプログラミング過程のステージIVのための低分子は、選択的生物活性(ここではIV期の状態)を有する低分子の組み合わせを含み、以下から選択される: (i) ステージI因子:好ましい実施形態で使用されているCHIR99021を有するグリコーゲンキナーゼ阻害剤及び好ましい実施形態で使用されているY27632を有するRho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤;(ii) ステージI補足因子:好ましい実施形態で使用されているDZNepを有するSAHヒドロラーゼ阻害剤、好ましい実施形態で使用されているEPZ004777酸を有するDOT1Lメチルトランスフェラーゼ阻害剤;(iii) ステージII因子:好ましい実施形態で使用されているトラニルシプロミンを有するヒストン脱メチル化阻害剤;(iv) ステージIII因子:好ましい実施形態で使用されているPD0325901を有するMAPK阻害剤、好ましい実施形態で使用されているバルプロ酸を有するヒストンアセチル化/脱アセチル化酵素阻害剤、及び (v) ステージIV因子:好ましい実施形態で使用されているSB590885を有するB-Raf阻害剤、及び好ましい実施形態で使用されているIWP2を有するWnt阻害剤。

いくつかの好ましい実施態様において、ステージIの低分子は、以下の組み合わせから選択される:CHIR 99021+616452+TTNPB、CHIR 99021+616452+CH 55、CHIR 99021+616452+AM 580、CHIR 99021+A 8301+TTNPB、CHIR 99021+A 8301+CH 55、CHIR 99021+A 8301+AM 580、CHIR 99021+SB 431542+TTNPB、CHIR 99021+SB 431542+CH 55、CHIR 99021+SB 431542+AM 580、CHIR 99021+LY 2109761+TTNPB、CHIR 99021+LY 2109761+CH 55、CHIR 99021+LY 2109761+AM 580、TD 114-2+616452+TTNPB、TD 114-2+616452+CH 55, TD 114-2+616452+AM 580, TD 114-2+A 8301+TTNPB, TD 114-2+A 8301+CH 55, TD 114-2+A 8301+AM 580, TD 114-2+SB 431542+TTNPB, TD 114-2+SB 431542+CH 55, TD 114-2+SB 431542+AM 580, TD 114-2+LY 2109761+TTNPB, TD 114-2+LY 2109761+CH 55, TD 114-2+LY 2109761+AM 580, CHIR 98014+616452+TTNPB, CHIR 98014+616452+CH 55, CHIR 98014+616452+AM 580, CHIR 98014+A 8301+TTNPB,、CHIR 98014+A 8301+CH 55, CHIR 98014+A 8301+AM 580, CHIR 98014+SB 431542+TTNPB, CHIR 98014+SB 431542+CH 55, CHIR 98014+SB 431542+AM 580, CHIR 98014+LY 2109761+TTNPB, CHIR 98014+LY 2109761+CH 55, CHIR 98014+LY 2109761+AM 580, GSK3bi XV+616452+TTNPB, GSK3bi XV+616452+CH 55, GSK3bi XV+616452 A 8301+TTNPB, GSK3bi XV+A 8301+CH 55,、GSK3bi XV+A 8301+AM 580、GSK3bi XV+SB 431542+TTNPB、GSK3bi XV+SB 431542+CH 55、GSK3bi XV+SB 431542+AM 580、GSK3bi XV+LY 2109761+TTNPB、GSK3bi XV+LY 2109761+CH 55、GSK3bi XV+LY 2109761+AM 580。

いくつかの好ましい実施態様において、ステージIIの低分子は、以下の組み合わせから選択される:CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-7、CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-12、CHIR 99021+616452+TTNPB+プルモルファミン+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+TTNPB+Hh-ag-1.5+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+CH 55+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+AM 580+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+A 8301+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+SB 431542+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+LY 2109761+TTNPB+SAG+JNK-in-8、TD 114-2+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 98014+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、GSK3bi XV+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8。

いくつかの好ましい実施態様において、ステージIIIの低分子は、以下の組み合わせから選択される:VPA+Dznep+PD 0325901+616452、VPA+Dznep+AZD 8330+616452、VPA+Dznep+TAK 733+616452、VPA+Dznep+トラミチニブ+616452、VPA+Adox+PD 0325901+616452、VPA+Adox+AZD 8330+616452、VPA+Adox+TAK 733+616452、VPA+Adox+トラミチニブ+616452、VPA+Nepa+PD 0325901+616452、VPA+Nepa+AZD 8330+616452、VPA+Nepa+TAK 733+616452、VPA+Nepa+トラミチニブ+616452、MS 275+Dznep+PD 0325901+616452、MS 275+Dznep+AZD 8330+616452, MS 275+Dznep+TAK 733+616452, MS 275+Dznep+トラミチニブ+616452, MS 275+Adox+PD 0325901+616452, MS 275+Adox+AZD 8330+616452, MS 275+Adox+TAK 733+616452, MS 275+Adox+トラミチニブ+616452, MS 275+Nepa+PD 0325901+616452, MS 275+Nepa+AZD 8330+616452, MS 275+Nepa+TAK 733+616452, MS 275+Nepa+トラミチニブ+616452, LMK 235+Dznep+PD 0325901+616452, LMK 235+Dznep+AZD 8330+616452,、LMK 235+Dznep+TAK 733+616452, LMK 235+Dznep+トラミチニブ+616452, LMK 235+Adox+PD 0325901+616452, LMK 235+Adox+AZD 8330+616452, LMK 235+Adox+TAK 733+616452, LMK 235+Adox+トラミチニブ+616452, LMK 235+Nepa+PD 0325901+616452, LMK 235+Nepa+AZD 8330+616452, LMK 235+Nepa+TAK 733+616452, LMK 235+Nepa+トラミチニブ+616452,酪酸+Dznep+PD 0325901+616452,酪酸+Dznep+AZD 8330+616452,、酪酸+Dznep+TAK 733+616452,酪酸+Dznep+トラミチニブ+616452,酪酸+Adox+PD 0325901+616452,酪酸+Adox+AZD 8330+616452,酪酸+Adox+TAK 733+616452,酪酸+Adox+トラミチニブ+616452,酪酸+Nepa+PD 0325901+616452,酪酸+Nepa+AZD 8330+616452,酪酸+Nepa+TAK 733+616452,酪酸+Nepa+トラミチニブ+616452。

いくつかの好ましい実施態様において、ステージIVの低分子は、以下の組み合わせから選択される:PD 0325901+SB 590885、PD 0325901+ソラチニブ、PD 0325901+GDC 0879、AZD 8330+SB 590885、AZD 8330+ソラチニブ、AZD 8330+GDC 0879、TAK 733+SB 590885、TAK 733+ソラチニブ、TAK 733+GDC 0879、トラミチニブ+SB 590885、トラミチニブ+ソラチニブ、トラミチニブ+GDC 0879。

GSK (グリコーゲン合成キナーゼ) 阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるGSKの阻害を含む。好ましいGSK阻害剤は、化学名[6-[[2-[[4- (2, 4-ジクロロフェニル) -5- (5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル) -2-ピリミジニル] アミノ]エチル]アミノ]-3-ピリジンカルボニトリル]を有するアミノピリミジン、CHIR99021である。他のGSK阻害剤も、本明細書に開示される方法において使用することができ、それらは、BIO-アセトキシムを含むが、これらに限定されない。GSK 3I阻害剤XV;SB-216763 [3-(2, 4-ジクロロフェニル)-4- (1-メチル-1H-インドール-3-イル) -1H-ピロール-2, 5-ジオン];CHIR99021の塩酸塩であるCHIR99021三塩酸塩;GSK-3阻害剤IX [((2Z、3E) -6’-ブロモ-3- (ヒドロキシイミノ) -[2, 3’-ビインドリニリデン] -2’-オン];GSK-3 IX [6-ブロモインジルビン-3'-オキシム];GSK-3β阻害薬XII [3-[[6- (3-アミノフェニル) -7H-ピロロ[2、3-d]ピリミジン-4-イル]オキシ]フェノール];GSK-3阻害薬XVI [6-(2-(4-(2, 4-ジクロロフェニル)-5- (4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル) -ピリミジン-2-イルアミノ)エチルアミノ)-ニコチノニトリル];SB-415286 [3- [ (3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル) アミノ] -4- (2-ニトロフェニル) -1 H-ピロール-2, 5-ジオン];ビオ [ (2'Z, 3'E) -6-ブロモインジルビン-3'-オキシム];TD114-2 [6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19-デカヒドロ-5, 29:20, 25ジメテノ-26H-ジベンゾ[n, t]ピロロロ[3、4-q] [1、4、7、10、13、22]テトラオキサジアザシクロトレコシン-26, 28 (27H) -ジオン];及びCHIR98014 [N6-[2-[[4- (2, 4-ジクロロフェニル) -5- (1H-イミダゾール-1-イル) -2-ピリミジニル]アミノ]エチル]-3-ニトロ-2, 6-ピリジンジアミン]を3～12μMのCHIR99021に相当する濃度で使用する。

TGFβ受容体阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるTGFβの阻害を含む。TGFβ阻害剤は、いくつかの実施形態においてTGFβ1型受容体活性化受容体様キナーゼ (ALK) 5を阻害することが好ましく、さらに他の実施形態においてALK 4及び結節型受容体1受容体ALK7を阻害することができる。

好ましいTGFβ受容体阻害剤は、616452 [2- (3- (6-メチルピリジン-2-イル) -H-ピラゾール-4-イル) -1,5-ナフチリジン]である。他のTGFβ阻害剤は当技術分野で公知であり、市販されている。例としては、A 83-01 [3- (6-メチル-2-ピリジニル) -N-フェニル-4- (4-キノリニル) -1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド] が挙げられる。SB 505124 [2-[4-(1, 3-ベンゾジオキソール-5-イル)-2-(1, 1-ジメチルエチル)-1H-イミダゾール-5-イル]-6-メチル-ピリジン];GW 788388 [4- [4- [3- (2-ピリジニル) -1H-ピラゾール-4-イル] -2-ピリジニル] -N- (テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル) -ベンズアミド];及びSB 525334 [6-[2-(1, 1-ジメチルエチル)-5- (6-メチル-2-ピリジニル) -1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン]、ドルソモルヒネ。

ヒストンアセチル化/脱アセチル化酵素阻害薬
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるヒストンデアセチル化の阻害を含む。好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、バルプロ酸である。しかしながら、他のヒストンデアセチラーゼ阻害剤も市販されており、使用できる。非限定的な例としては、アピシジン [シクロ (N-O-メチル-L-トリプトファン-L-イソロイシニル-D-ピペコリニル-L-2-アミノ-8-オキソデカノイル) ] が挙げられる。LMK235 [N- [ [六- (ヒドロキシアミノ) -六-オキソヘキシル] オキシ] -3, 5-ジメチルベンズアミド];MS275 [ (ピリジン-3-イル) メチル4- (2-アミノフェニルカルバモイル) ベンジルカルバメート];CI 994 [N-アセチルジナリン4- (アセチルアミノ) -N- (2-アミノフェニル) ベンズアミド];デプシペプチド;KD 5170 [S- [2- [6- [ [ [4- [3- (ジメチルアミノ) プロポキシ] フェニル] スルホニル] アミノ] -3-ピリジニル] -2-オキソエチル] エタンチオ酸エステル];酪酸ナトリウム、 4-フェニル;酪酸ナトリウム [ブタン酸ナトリウム塩];UF 010 [4-ブロモ-N'-ブチルベンゾヒドラジド]、HDACi IV等。

ヒストン脱メチル化阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるヒストン脱メチル化の阻害を含む。ヒストン脱メチル化の好ましい阻害剤は、トラニルシプロミンである。トラニルシプロミンは非選択的で不可逆的なモノアミン酸化酵素阻害剤 (MAOI) である。ヒストン脱メチル化の阻害剤でもある他の有用なMAOIはRN‐1 [2-((1R、2S)-2- (4- (ベンジルオキシ) フェニル) シクロプロピルアミノ)-1- (4-メチルピペラジン-1-イル) エタノン二塩酸塩]を含む。GSK2879 [4-{[4-({ [ (1R, 2S) -2-フェニルシクロプロピル] アミノ}メチル)ピペリジン-1-イル]メチル}安息香酸];S2101 [(1R, 2S) -2-[二- (ベンジルオキシ) -3, 5-ジフルオロフェニル]シクロプロパン-1-アミン塩酸塩];LSD1-C76 [(1R, 2S) -N-(1-(2, 3-ジヒドロベンゾ [b] [1、4]ダイオキシン-6-イル)エチル)-2-フェニルシクロプロパナミン]等。

レチノイン酸受容体 (RAR) 作動薬
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるレチノイン酸受容体の活性化を含む。好ましいRARアゴニストはTTNPB [4-[(E) -2-(5、6、7、8-テトラヒドロ-5、5、8、8-テトラメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]安息香酸]である。その他には、 RAR‐α及びRAR‐β受容体に対する親和性が高く、細胞内レチノイン酸結合蛋白質 (CRABP) に対する親和性が低い、非常に強力な合成レチノイドであるCh 55 [4-[(1) -3-[3, 5‐ビス(1, 1-ジメチルエチル)フェニル]-3-オキソ-1-プロペニル]安息香酸]が使用されることがある。];AM580 ([4-[(5、6、7、8-テトラヒドロ-5、5、8、8-テトラメチル-2-ナフタレニル)カルボキサミド]安息香酸];選択的RARα作動薬として作用するレチノイン酸の類似体);

SAHヒドロラーゼ阻害薬
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるSAHの阻害を含む。好ましいSAHヒドロラーゼ阻害剤は、3-デアザネプラノシンA [(1S, 2R, 5R) -5-(4-アミノ-1H-イミダゾ[4、5-c]ピリジン-1-イル)-3- (ヒドロキシメチル) -3-シクロペンテン-1, 2-ジオール]である。本明細書に開示するCIP配合組成物に含まれ得る他の有用なSAHヒドロラーゼ阻害剤には、限定されないが、 (-) ネプラノシンA (NepA) [5R- (6-アミノ-9H-プリン-9-イル) -3- (ヒドロキシメチル) -3-シクロペンテン-1S、2R-ジオール] が含まれる。過ヨウ素酸アデノシン酸化 (Adox) [ (2S) -2- [ (1R) -1- (6-アミノプリン-9-イル) -2-オキソエトキシ] -3-ヒドロキシプロパナール] 及び3-デアザアデノシン (DZA) [1-β-D-リボフラノシル-1H-イミダゾ[4、5-c]ピリジン-4-アミン]及びそれらの組み合わせ。

DOT1Lメチルトランスフェラーゼ阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるDOT1Lメチルトランスフェラーゼの阻害を含む。好ましいDOT1Lメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、SGC 0946 [1-[3-[[[ (2R, 3S, 4R, 5R) ‐5‐ (4‐アミノ‐5‐ブロモ‐7H‐ピロロ [2, 3‐d] ピリミジン‐7‐イル) -3, 4‐ジヒドロキシテトラヒドロフラン‐2‐イル] メチル] (イソプロピル) アミノ]プロピル]-3-[4-(2, 2-ジメチルエチル)フェニル]尿素]を含む。EPZ004777 [7-[5-デオキシ-5-[[3- [ [ [ [ [4- (1, 1-ジメチルエチル) フェニル] アミノ] カルボニル] アミノ] プロピル]] (1-メチルエチル) アミノ]-β-D-リボフラノシル]-7H-ピロロロ[2、3-d]ピリミジン-4-アミン];EPZ5676 [(2R, 3R, 4S, 5R) -2- (6-アミノ-9H-プリン-9-イル) -5-((((1r, 3S) -3- (2- (5- (tert-ブチル) -1H-ベンゾ [d] イミダゾール-2-イル) エチル) シクロブチル) (イソプロピル) アミノ)メチル)テトラヒドロフラン-3, 4-ジオール]。

受容体チロシンキナーゼ阻害薬
好ましい受容体チロシンキナーゼ阻害薬はABT 869 (リニファニブ) [N‐[4‐ (3‐アミノ‐1H‐インダゾール‐4‐イル) フェニル] ‐N’‐ (2‐フルオロ‐5‐メチルフェニル) ‐尿素] であり、血管内皮成長因子(VEGF) 及び血小板由来成長因子 (PDGF) 受容体ファミリーのメンバーの強力な阻害薬であるATP競合受容体チロシンキナーゼ阻害薬である。 AG1296 [6・7-ジメトキシ-3-フェニルキノキサリン]及びバラタニブのような他のチロシンキナーゼ阻害薬はABT 869を置き換えることができ、 ABT 869の代わりに使用できる。

B-Raf阻害薬
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるB-Raf阻害を含む。好ましいB-Raf阻害剤はSB590885 [5- [2- [4- [2- (ジメチルアミノ) エトキシ] フェニル] -5- (4-ピリジニル) -1H-イミダゾール-4-イル] -2, 3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オンオキシム]である。SB590885は、無細胞アッセイで_Kiが0.16 nMの強力なB-Raf阻害剤であり、 c-RafよりもB-Rafの選択性が11倍高く、他のヒトキナーゼに対する阻害はない。他の強力なB-Raf阻害剤が知られており、SB590885と同じ活性のために使用することができる。例としては、ベムラフェニブ、RAF265 (CHIR-265) (SeleckhchemカタログNo.S 2161)、PLX4720 (SeleckhchemカタログNo.S 11525)などがある。

Wnt阻害薬
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるWnt阻害を含む。好ましいWnt阻害剤は、IWP-2 [N- (6-メチル-2-ベンゾチアゾリル) -2-[(3, 4, 6, 7-テトラヒドロ-4-オキソ-3-フェニルチエノ[3、2-d]ピリミジン-2-イル)チオ]-アセトアミド]である。しかしながら、WNT-C59 [4- (2-メチル-4-ピリジニル) -N- [4- (3-ピリジニル) フェニル] ベンゼンアセトアミド] 、XAV-939 [3, 5, 7, 8-テトラヒドロ-2- [4- (トリフルオロメチル) フェニル] -4H-チオピラノ[4、3-d]ピリミジン-4-オン]及びIWR-1 (セレックケムカタログNo.S 7086)のようなWnt阻害剤は、IWP-2を置き換えることができ、したがって、IWP-2の代わりに使用することができる。

Rho関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼ(ROCK) 阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞における阻害ROCKを含む。好ましいROCK阻害剤は、Y27632 ( [ (+) - (R) -trans-4- (1-アミノエチル) -N- (4-ピリジル) シクロヘキサンカルボキサミド+++二塩酸塩] ) 又はTzv (チアゾビビン) である。

CBP/p300ブロモドメイン阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるCBP/p300ブロモドメインの阻害を含む。好ましいCBP/p300ブロモドメイン阻害剤は、SGC-CBP30 [2-(3, 5-ジメチル-4-イソオキサゾリル)-1- [ (2S) -2- (4-モルホリニル) プロピル] -1H-ベンズイミダゾール]、I-CBP112、GNE272、又はGNE409である。

メニン-MLL相互作用阻害剤
開示されたリプログラミングプロトコルは、リプログラミングされる細胞におけるメニン-MLL相互作用の阻害を含む。好ましいメニン-MLL相互作用は、VTP50469、MI3454、又はWDR5-IN-4である。

B. 誘導される細胞
hCiPSCはヒト体細胞から得られる。当業者によって理解される体細胞は、配偶子 (精子又は卵子) 、生殖細胞 (配偶子になる細胞) 、配偶子細胞又は未分化幹細胞以外の任意の細胞である。

体細胞は、骨髄、胎児組織(例、胎児肝組織)、末梢血、臍帯血、膵臓、皮膚又は任意の器官又は組織のような組織から得ることができる。好ましい態様において、hCiPSCは、線維芽細胞、脂肪由来細胞、神経細胞又は腸上皮由来細胞から得られる。より好ましい態様において、hCiPSCは、新生児 (例えば包皮) 又は成人の線維芽細胞から得られる。しかしながら、hCiPSCは、以下を含むがこれらに限定されない他の細胞型から得ることができる:血液起源の体細胞、皮膚由来細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉起源の細胞、実質細胞(例えば肝細胞)、神経細胞及び結合組織細胞。

好ましい態様において、hCiPSCは、線維芽細胞及び脂肪由来体細胞(例えば、脂肪細胞)から得る。より好ましい態様において、hCiPSCは、新生児 (例えば、包皮線維芽細胞) 又は成人線維芽細胞であり得る線維芽細胞から得る。

細胞は、当業者に公知の技術を用いて、細胞源として機能する適切な器官又は組織を分解することによって単離することができる。例えば、組織又は器官は、機械的に分解することができ、及び/又は隣接細胞間の結合を弱める消化酵素及び/又はキレート剤で処理することができ、したがって、組織は、顕著な細胞破壊なしに個々の細胞の懸濁液を形成するように分散させることができる。酵素的解離は、組織をみじん切りにし、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ及び/又はヒアルロニダーゼ、DNアーゼ、プロナーゼ、ディスペンスなどの1つ又は複数の酵素でみじん切り組織を処理することによって達成することができる。機械的破壊はまた、グラインダー、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、圧力セル又はインソネーターの使用を含むが、これらに限定されない多くの方法によって達成することができる。

C. hCIpSCs
開示された方法に従って得られたhCIpSCsも提供される。これらの細胞は、20以上の継代、例えば25、30、35、40、41、42までの継代で増殖することができ、hESCと同様の倍加時間で増殖することが特徴である。hCiPSCは、コア多能性転写因子OCT4、SOX2 (SRY-Box転写因子2) 、NANOG (、DNMT3B (DNAメチルトランスフェラーゼ3β) 、DPPA4 (発生的多能性関連4) 、UTF1 (未分化胚細胞転写因子1) 、ZFP42 (ジンクフィンガープロテイン42) 、PRDM14 (PRドメイン含有タンパク質14) 及びZIC3 (ジックファミリーメンバー3))及びNANOG (Nanog Homeobox) とともに、少なくとも1つの表面マーカーTRA-1-60、TRA-1-81及びSSEA-4を発現することも特徴である。これらのマーカーは、従来の多能性幹細胞(hESC及びhiPSC) では発現しなかった。機能的には、免疫不全マウスにhCiPSCを注入し、その結果生じた奇形腫が3つのすべての生殖層(内胚葉、外胚葉、中胚葉)の組織を含む場合;hCiPSCはin vitroで胚様体を形成し、3つの生殖層のマーカー遺伝子を発現し、他のコミットされた細胞型、例えば肝細胞への指向性分化、又は造血前駆細胞などの前駆細胞への指向性分化を受けることができる。最も重要なことは、hCiPSCは好ましくは遺伝子操作されず、すなわち、細胞から遺伝的要素を導入又は除去することによってヒト体細胞を改変することを含むプロセスによって得られず、例えば、Oct3/4 (八量体結合転写因子3/4) 、KLF4、nanog及び/又はcMycなどの多能性の1つ以上のマーカーを発現するように体細胞を操作し、従って、開示された方法に従って得られたhCiPSCは好ましくは外因的に導入されたOct3/4、KLF4、NANOG及び/又はcMycを含まない。

III 製造方法
ヒト体細胞を多能性細胞に再プログラムする開示された方法は、4段階の細胞培養プロセスである。再プログラムされるヒト体細胞は、成人真皮組織、成人ヒト脂肪由来間葉系間質細胞及びヒト胚性線維芽細胞を用いて、当技術分野でよく知られ、本明細書において下記の実施例で例示される方法を用いて、所望の組織から採取される。採取された細胞は、再プログラムされるまで、培養中に維持され、継代される。

ステージIにおいて、体細胞は、細胞培養培地、例えばDMEM、KnockOutTM DMEM、DMEM/F12、Advanced DMEM/F12に播種され、ステージI条件に曝露され、例えばDMEMのような適切な細胞培養培地、すなわち、細胞培養培地にステージI因子を有効量、好ましくは翌日に補充され、その後、いくつかの実施形態ではステージI条件で5% O2 (例えば、体細胞が、例えば、hADSC及びhASFを有する成人組織から得られた体細胞である場合)、又は他の実施形態では21% O2及び5% CO2 (例えば、体細胞が非成体組織から得られた体細胞である場合、例えば、HEF)で37°Cの低酸素条件下で、体細胞を単層上皮様細胞に変換するために有効な時間培養される。この初期誘導ステージは、細胞の初期播種後4時間から48時間まで開始することができる。細胞は適切な密度で播種され、例えば、ADSC及びhASFは、15% FBS DMEM培地中の12ウェルプレートのウェル当たり1×10⁴細胞の密度で播種することができる。補充培地は、3～4日ごとに交換することができる。体細胞の単層上皮様細胞への変換に有効な培養期間は、体細胞の種類によって異なる。例えば、hADSCから誘導された単層上皮様細胞は、4～6日目に出現し、8～12日目に80% -100%の合流に近づくことができる。ASFについては、上皮様細胞は12～20日目に80% -100%の合流に近づく。上皮様細胞への転換は、細胞培養液で培養された対応する体細胞と比較した場合、ステージI因子の補充なしに/ステージI条件で培養された場合、2.5 KRT8 (例えば、最大60倍のアップレギュレーション)、KRT18 (例えば、最大22倍のアップレギュレーション)、及びKRT19などの上皮細胞関連遺伝子の上方調節によって測定することができる) 。さらに、ステージIの終わりの細胞は、例えばLIN28Aの発現増加を示し、培養された体細胞と比較した場合、21倍の上方調節を示す。

ステージI条件のための好ましい因子の組み合わせは、CHIR99021 (3～12μM、好ましくは10～12μM、例えば、8、9、10、11、又は12μM)、616452 (2～50μM、好ましくは5～20μM、例えば、5、8、10、11、12、13、14、15又は20μM)、TTNPB (0.5～10μM、好ましくは1～5μM、例えば、0.9、1、1.5、2、2.5、又は3μM)、Y27632又はTZV (1～10μM、好ましくは1～5μM、例えば、0.9、1、1.5、2、2.5、又は3μM)、ABT869 (0.5～5μM、好ましくは1～2μM、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2又は1.5μM)及びSAG (0.2～2μM、好ましくは0.5～1μM、例えば、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μM)から選択される。体細胞、例えば線維芽細胞は、単層上皮様細胞に変換するために有効な時間、ステージI因子 (ステージI条件) を補充した細胞培養培地で細胞を培養することによって単層上皮様細胞に変換される。いくつかの実施態様において、ステージI条件は、Dot1L阻害剤(EPZ004777又はEPZ5676 (0.2～10μM、好ましくは1～5μM、例えば、0.9、1、1.5、2、2.5、又は3μM)、本剤(0.1～5μM、好ましくは0.5～1μM、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2又は1.5μM))及びDZNep (0.005～0.1μM、好ましくは0.01～0.05、例えば0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μM)からなる群から選択された低分子の補充を含むことができる。

ステージIIにおいて、ステージI条件で処理された細胞のための細胞培養培地は、ステージII因子の補充なしに/ステージII条件で培養された対応する体細胞と比較したときに、例えばLIN28A (例えば、最大38倍のアップレギュレーション)と共発現する多能性関連転写因子SALL4 (例えば、最大24倍のアップレギュレーション)の活性化として測定される、培養細胞における1つ又は複数の多能性関連転写因子発現を上方制御するために、有効な時間(例えば、8～20日の培養)の間ステージII条件に変更される。ステージII条件のための好ましい因子の組み合わせには、 (i) ステージII因子5-アザシチジン(2～10μM、好ましくは5～10μM、例えば5、6、7、8、9、10μM)、トラニルシプロミン(2～50μM、好ましくは2～10μM、例えば、2、2.5、3、5、8又は10)、及びJNKIN8 (0.2～2μM、好ましくは0.5～1μM、例えば0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2又は1.5μM)が含まれる。及び (ii) ステージI因子:ステージI条件のために上記で開示されたのと同じ濃度で使用されるCHIR99021、616452、TTNPB、ABT-869及びSAG。ステージII条件は、ステージI条件のために上記で開示されたのと同じ濃度で使用されるステージI補足因子ルキソリチニブ、及びステージII補足因子:UNC0224 (0.1～5μM、好ましくは0.5～2μM、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2又は1.5μM)、BIRB796 (0.2～5μM、好ましくは2～5μM、例えば、2、2.5、3、3.5、4又は5μM)、及びDorsormorphin (0.2～2μM、好ましくは0.5～1μM、例えば、0.2、0.5、0.6、0.8又は1)からなる群から選択された低分子を培地に追加補給することを含むことができる。ステージII条件での培養に有効な培養時間の長さは、細胞の種類によってわずかに異なる。ステージII条件でのhADSCとhASFの培養後、約8～12日の処理後に多層コロニーが出現し、これらの細胞コロニーは大きく成長し続ける。合計約16～20日のステージII条件の後、細胞培養培地をステージIII条件に変更することができる。

ステージIIIでは、ステージII条件で処理された細胞の細胞培養培地をステージIII条件に変更し、ステージIII条件で有効な時間培養して、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立する。ステージII条件で処理された細胞は、ステージIIIを補充した細胞培養培地で細胞を培養することにより、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立するための有効な時間 (ステージIII条件) 。ステージIIIの因子の好ましい組み合わせには、以下のものがある: (i) ステージIIIの因子:PD0325901 (0.02～5μM、好ましくは0.5～1μM、例えば、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2又は1.5μM)及びVPA (200～1500μM、好ましくは200～500μM、例えば200,300,400又は500μM);(ii) ステージIの因子CHIR99021 (1～10μM、好ましくは1～3μM、例えば1、1.5、2、2.5又は3μM);ステージIの条件及びY-27632 (2～50μM、好ましくは2～10μM、例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10μM)について開示されているのと同じ濃度で使用された616452;(iii) ステージI補足因子、DZNep (0.05～0.5μM、好ましくは0.1～0.3μM、例えば、0.1、0.15、0.2、0.25又は0.3μM)及びEPZ004777 (0.25～20μM、好ましくは1～10μM、例えば、1、2、3、4、5、8、又は10μM);(iv) ステージII因子、トラニルシプロミン(5～50μM、好ましくは5～20μM、例えば5、8、10、15又は20μM)。ステージIIの培養に有効な培養期間は、細胞の種類により若干異なる。しかしながら、ステージIIIにおける8～12日の処理が好ましく、いくつかの実施形態では8～10日を用いることができる。

ステージIVにおいて、ステージIII条件で処理された細胞のための細胞培養液をステージIV条件に変更し、OCT4、SOX2及びNANOGの共発現によって測定される多能性ネットワークを完全に確立するために有効な時間の間、ステージIV条件で培養する。以下から選択されるステージIV条件のための好ましい因子の組み合わせ: (i) ステージI因子CHIR99021 (0.2～3μM、好ましくは0.2～1μM、例えば、0.2、0.3、0.5、0.8又は1μM);及びY-27632 (2～20μM、好ましくは2～10μM、例えば2、3、4、5、7、8、又は10μM);2ステージI補足因子DZNep (0.02～0.2μM、好ましくは0.02～0.05μM、例えば、0.02、0.03、0.04、0.05又は0.1μM)及びEPZ004777 (0.25～20μM、好ましくは1～10μM、例えば1、2、3、4、5、8又は10μM);3ステージII因子トラニルシプロミン(2～50μM、好ましくは2～10μM、例えば、2、2.5、3、5、8又は10μM);4ステージIII因子PD0325901 (0.02～5μM、好ましくは0.1～1μM、例えば、0.1、0.2、0.5、0.7、0.8又は1μM)及びVPA (200～1500μM、好ましくは200～500μM、例えば200,300,400又は500μM);5ステージIV因子IWP2 (0.5～4μM、好ましくは1～2μM、例えば、0.9、1、1.5、2、2.5、又は3μM)及びSB590885 (0.1～5μM、好ましくは0.2～1μM、例えば、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8μM)。ステージIV誘導では、 VPA,トラニルシプロミン、 DZnep及びEPZ004777をステージIV条件の最初の4日間に含めることが望ましい。原発性hCiPSCコロニーは約6～8日の治療後に出現する。HEFsではVPAを最初の4日間に含めることが望ましい。1次hCiPSCコロニーは6～8日の処理後に出現する。

特定の因子は好ましい実施形態で開示されているが、組成物に開示されているように、同じ生物活性を提供する既知の低分子と容易に交換することができる。したがって、類似の生物活性を有する代替化合物は、特定の化合物について本明細書に提供される特定の濃度によって提供される生物活性に対応する量で使用することができる。したがって、例えば、CHIR99021は好ましいGSK阻害剤であり、その濃度範囲は本明細書に記載されている。しかしながら、それは、少なくともCHIR99021に関して開示された濃度で見られるレベルまで、同じ生物活性(すなわち、GSKを阻害する能力)を有する低分子で置き換えることができる。本明細書に例示された濃度に基づいて、属 (開示された生物活性) 内の種 (リストされた特定の化合物) について置換因子の等価量を決定することは、当業者の能力の範囲内である。

B. hCiPSCの単離
この分野では、 ES細胞の未分化状態や多能性を維持したり、分化を誘導したりする培地が知られている。単離された誘導多能性幹細胞の分化及び増殖能力は、 ES細胞に広く適用されている確認手段を用いることにより、当業者によって容易に確認することができる。

hCiPSCの実質的に精製された集団は、例えば、培養源からの抽出(例えば、密度勾配遠心及び/又はフローサイトメトリーによる)によって得ることができる。純度は、任意の適切な方法によって測定することができる。多能性細胞は、例えば、フローサイトメトリー(例えば、FACS解析)によって99% -100%精製することができる。ヒト人工多能性幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞上のマーカー(例えば、TRA-1-81、TRA-1-60又はマーカーの組み合わせ)に結合する分子(例えば、抗体、抗体誘導体、リガンド又はFcペプチド融合分子)を利用し、それによって分子(すなわち、正の選択)に結合する細胞を積極的に選択することによって単離することができる。正の選択方法の他の例は、所望の細胞型と望ましくない細胞型の混合集団において所望の細胞型の増殖を優先的に促進する方法を含む。あるいは、所望の細胞型には存在しないが望ましくない細胞型には存在するマーカーに結合する分子を用いることにより、そのようなマーカーを含む望ましくない細胞を所望の細胞から除去することができる(すなわち、負の選択)。他の負の選択方法は、所望の細胞型と望ましくない細胞型の混合集団における望ましくない細胞型の増殖を選択的に殺すか阻害することを含む。したがって、負の選択、正の選択、又はそれらの組み合わせを使用することによって、幹細胞の豊かな集団を作ることができる。

分離のための手順は、抗体被覆磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合された細胞毒性剤、又はモノクローナル抗体と一緒に使用されるそのような薬剤、例えば補体及び細胞毒性剤、及び固体マトリックスに結合された抗体による(例えば、プレート)又は他の便利な技術を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、例えば、複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、及びインピーダンスチャネルなど、様々な程度の精巧さを有することができる蛍光活性化セルソーターを含む。抗体は、直接的な分離を可能にする磁気ビーズ、支持体に結合したアビジン又はストレプトアビジンで除去することができるビオチン、又は蛍光活性化セルソーターと共に使用することができ、特定の細胞型の分離を容易にすることができる蛍光色素などのマーカーと結合され得る。誘導された多能性幹細胞の生存性に過度に有害でない任意の技術が使用され得る。1つの実施形態では、細胞をマーカーに対する抗体とインキュベートし、マーカーに対して陽性に染色される細胞を手動で選択し、継代培養する。

濃縮方法の組み合わせは、精製又は濃縮の時間又は効率を改善するために使用することができる。例えば、関心のある細胞型を示すものではないマーカーを有する細胞を除去するための濃縮工程の後、細胞は、蛍光活性化細胞選別器 (FACS) 又は高い特異性を有する他の方法によって更に分離又は濃縮され得る。多色分析は、FACSと共に採用され得る。細胞は、特定の抗原に対する染色レベル又はその欠如に基づいて分離され得る。蛍光色素は、特定の抗原に特異的な抗体を標識するために使用され得る。そのような蛍光色素には、フィコビリタンパク質、例えばフィコエリトリン及びアロフィコシアニン、フルオレセイン、及びテキサスレッドが含まれる。

C. hCiPSCの培養及び保存
hCiPSCは培養で拡張でき、後の検索及び使用のために保存できる。一旦、細胞の培養又は幹細胞の混合培養が確立されると、細胞の集団は、組織形成の有無にかかわらず、細胞増殖に資する条件下で細胞密度が指示するように新鮮培地への通路によりin vitroで有糸分裂的に拡張される。そのような培養方法は、例えば、分化を誘導する特定の増殖因子(例えば、IGF、EGF、FGF、VEGF及び/又は他の成長因子)を欠く培養培地への細胞の通路を含み得る。培養細胞は、十分な細胞密度に達したときに新鮮な培地に移すことができる。幹細胞の種類によっては、典型的な接触阻害アポトーシスを示さないか、密度が最大になると休止状態になる。したがって、適切な継代技術を用いて、接触阻害と休止状態を減少させることができる。

細胞は、Doyle et al., (eds.)、 1995, Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures, John Wiley&Sons, Chichesterに記載されているような既知の方法に従って、保存のために凍結保存することができる。例えば、細胞は、例えば、約4～10×¹⁰⁶細胞/mlの密度で、15～20%のウシ胎児血清 (FBS) 及び10%のジメチルスルホキシド (DMSO) を含有する培養液のような「凍結培地」中に懸濁され得る。細胞は、ガラス又はプラスチックバイアルに分配され、次いで、密封され、プログラム可能又は受動冷凍庫の凍結室に移される。最適凍結速度は、経験的に決定される。例えば、融解熱によって-1^°C/分の温度変化を与える凍結プログラムを使用することができる。細胞を含むバイアルが-80^°Cに達すると、細胞は液体窒素貯蔵領域に移される。凍結保存された細胞は数年間保存できる。

IV. 使用方法
幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞、又は所望の細胞型又は形態を生じうる可塑性ポテンシャルを有する細胞の容易に入手可能な供給源の同定は、治療、組織工学及び研究にとって重要である。hCiPSC, XEN様細胞、再生プログラムを有する可塑性状態細胞、及び上皮様細胞を含む本出願の方法によって得られた細胞は、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞、又はLIN28A, SALL4, OCT4又はNANOGのような幹細胞関連マーカーの少なくとも1つを発現する可塑性ポテンシャルを有する細胞の容易に入手可能な供給源である。この点に関して、用語hCiPSCは例として使用されるが、当業者は、 XEN様細胞、再生プログラムを有する可塑性状態細胞、及び本出願の方法によって得られた上皮様細胞を、幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又は可塑性ポテンシャルを有する細胞の供給源として同様に使用することができることを理解するであろう。幹細胞、前駆細胞、脱分化細胞又は可塑性及び再生ポテンシャルを有する細胞の利用可能性は、移植、組織工学、及び血管新生、血管新生、及び細胞置換又は細胞療法の調節ならびに特定の疾患の予防において極めて有用であろう。このような幹細胞又は前駆細胞は、遺伝子治療レジメンの一部として、対象に遺伝子を導入するためにも使用できる。さらに、ステージI, II, III, IV,例えば、上皮様細胞、再生プログラムを有する可塑性状態細胞、及び/又はXEN様細胞の1つ又は複数を含む本出願の方法によって得られた細胞は、所望の細胞型に直接誘導され、移植され、対象に送達され得る、すなわち、分化細胞を得るために最初にhCiPSCを得ることは、すべての場合に必要ではない。

A. 分化体細胞 (再分化細胞) の提供
いったん確立された幹細胞の培養は、新しい組織を産生することができる線維芽細胞などの子孫細胞を産生するために使用されることがある。hCiPSCは、上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯槽細胞などの骨、筋肉及び結合組織を形成する細胞、肝細胞、腎細胞、副腎細胞及び膵島細胞などの実質細胞、血液細胞、網膜細胞(と、耳の有毛細胞や舌の味蕾を形成する細胞など、感覚知覚に関与する他の細胞)、及び神経を含む神経組織を含む3つの胚層のいずれかから細胞に分化するように誘導することができる。

一実施形態では、hCiPSCは、細胞を「外胚葉分化」媒体に曝露することによって、外胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。別の実施形態では、hCiPSCは、細胞を「中胚葉分化媒体」に曝露することによって、中胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。さらに別の実施形態では、hCiPSCは、細胞を「中胚葉分化媒体」に曝露することによって、中胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。「中胚葉」、「中胚葉」及び「外胚葉」培地の構成要素は、当業者には既知であり、既知の細胞表面マーカーを使用して、細胞が対応する細胞培養培地の系統の細胞に実際に分化していることを検証することができる。3つの胚層の分化を確認するために最も一般的に受け入れられているマーカーは、内胚葉細胞のα胎児タンパク質、中胚葉のα平滑筋アクチン、及び外胚葉のβ-IIIチューブリンの発現であり、これらのすべては通常、これらの組織の発生の非常に初期に発現される。

幹細胞から線維芽細胞又は他の細胞型への分化とそれに続く組織の産生は、特定の外因性増殖因子又は幹細胞培養の培養条件(例えば、密度)の変更によって引き起こされる。細胞を所望の細胞型の細胞に分化させる方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、hCiPSCは、細胞の環境に物質(例えば、成長因子、酵素、ホルモン、又は他のシグナル伝達分子)を添加することによって分化を誘導することができる。分化を誘導するために使用することができる因子の例としては、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、例えば、GM-CSF、G-CSF又はM-CSF、インターロイキン、例えば、IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、白血病抑制工場 (LIF) 又はスチール因子 (Stl) 、組織コミット細胞との共培養、又は幹細胞を特定の系統にコミットさせるために他の系統コミット細胞型が挙げられる。

分化した細胞は、培養中に拡張することができ、後の検索及び使用のために保存することができる。
XEN様細胞、可塑性状態細胞及び上皮様細胞は、特定の外因性成長因子、低分子、過剰発現遺伝子又は幹細胞培養の培養条件(例えば、密度)を変更することにより誘発され得る他の細胞型に生成するための容易に利用可能な供給源である。XEN様細胞、可塑性状態細胞、及び上皮様細胞から誘導される細胞は、以下を含むがこれらに限定されない異なる細胞型であり得る:血液起源の体細胞、皮膚由来細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉起源の細胞、実質細胞(例えば、肝細胞、β細胞)、神経細胞、及び結合組織細胞。

B. 細胞療法
人工多能性幹細胞の治療用途には、人工多能性幹細胞、幹細胞集団又はその子孫を個体に移植して、癌、創傷、新生物、傷害、ウイルス感染、糖尿病などに起因する様々な病的状態を治療することが含まれる。治療には、当該技術分野で現在知られている、又は将来開発されるいずれかの方法に従って、新しい組織を産生するための細胞の使用、及びこのようにして産生された組織の使用が含まれる。細胞は、生体内で新しい組織を産生するように、組織損傷部位に直接移植、注入、又はその他の方法で投与され得る。一実施形態では、投与は、遺伝子組換えhCiPSC又はその子孫の投与を含む。

好ましい実施形態では、hCiPSCは自己細胞から得られる、すなわち、ドナー細胞は自己である。しかしながら、細胞は異種細胞から得ることができる。一実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントに遺伝的に関連するドナーから得る。別の実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントに遺伝的に関連しないドナーから得る。

hCiPSCがレシピエント被験者と比較して異種 (非自己/同種) 源に由来する場合、併用免疫抑制療法が典型的には、例えば、免疫抑制剤シクロスポリン又はFK506の投与が投与される。しかしながら、ヒト人工多能性幹細胞の未成熟状態のために、そのような免疫抑制療法は必要ないかもしれない。従って、一実施形態では、ヒト人工多能性幹細胞は、免疫調節(例、免疫抑制剤)療法の非存在下でレシピエントに投与することができる。代替的に、細胞は、液体の交換を可能にするが、細胞/細胞の接触を防止する膜にカプセル化することができる。マイクロカプセル化細胞の移植は、例えば、Balladurら、Surgery、117:189-94、1995のように、当該技術分野で知られている。及びDixitら、Cell Transplantation 1:275-79 (1992) 。

(i) 糖尿病
糖尿病 (DM) は、膵臓が十分なインスリンを産生しないか、又は産生されたインスリンに細胞が反応しないために、被験者が高血糖を呈する代謝性疾患群である。
インスリン療法の有望な代替は、インスリンを必要とする患者への膵島細胞の提供である。Shapiroら、 N Engl J Med., 343 (4) :230-8 (2000) は、β細胞/膵島の移植が糖尿病患者に治療を提供することを示した。多数のインスリンタイプが市販されているが、これらの製剤は注射剤として提供されている。ヒト人工多能性幹細胞は、糖尿病を予防又は治療するための島細胞の代替源を提供する。例えば、人工多能性幹細胞を単離し、膵臓細胞型に分化させ、被験者に送達することができる。あるいは、人工多能性幹細胞を被験者の膵臓に送達し、in vivoで膵島細胞に分化させることができる。したがって、細胞は糖尿病の発生を予防又は治療するための移植に有用である。膵島細胞の生存性及び効力に影響を及ぼすことなく、サイトカイン曝露後の炎症を低減する方法は、例えば、米国特許第8,637,494号 (Naziruddinら) に開示されている。

(ii) 神経変性疾患
神経変性疾患は、外傷性又は虚血性脊髄又は脳損傷のような、疾患、遺伝的条件又は損傷の結果としてのニューロンの劣化を伴う状態を特徴とする。神経変性疾患には、ニューロンの損傷又は劣化を伴うあらゆる疾患、疾患、症状又はその原因又は影響が含まれる。神経変性疾患には、アレキサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、カナバン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、マチャド-ジョセフ病、多発性硬化症、パーキンソン病、ペリゼウス-メルツバッハー病、ニーマン-ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、スティール-リチャードソン-オルシェフスキー病、タベス・ドルサリス、又は損傷したニューロンに関連するその他の疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。その他の神経変性疾患には、外傷性脊髄損傷、虚血性脊髄損傷、脳卒中、外傷性脳損傷、及び遺伝性疾患が含まれるか、これらによって引き起こされる。

特に、開示された方法は、細胞が神経変性状態を改善することができるようにin vitroで拡張されたNSC、神経前駆体、又は神経前駆体を必要とする被験者への移植を含む。拡張された神経幹細胞の移植は、痙縮、硬直、痙攣、麻痺又は筋肉の他のあらゆる活動亢進の症状を伴う様々な形態のミエロパシーに苦しむ被験者の歩行機能を改善するために使用することができる。異なる神経変性状態の治療のための神経細胞及び神経前駆細胞の拡張及び移植の方法は、例えば、Joheらに対する米国特許第8,236,299号に開示されている。al。

(iii) がん治療
hCiPSC及びその子孫の治療用途には、がんに関連する症状を治療及び/又は改善するために、人工多能性幹細胞、幹細胞集団、又はその子孫を個体に移植することが含まれる。例えば、一実施形態では、hCiPSCは、対象の細胞を殺傷、減少、又は損傷する化学療法を受けたがん患者に投与することができる。がんに対する典型的な幹細胞移植では、非常に高用量の化学療法が、しばしば放射線療法とともに使用され、すべてのがん細胞を破壊しようとする。この治療法は、骨髄中の幹細胞も殺す。治療後すぐに、破壊された幹細胞を補充するために幹細胞を投与する。

別の実施形態では、hCiPSCは、 (脱分化因子に加えて) 少なくとも1つの追加的な治療因子でトランスフェクト又は形質転換され得る。例えば、一旦hCiPSCが単離されると、細胞は、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換され、次いで、被験体に移植又は投与され得るか、又は所望の細胞型に分化され、移植及び被験体に送達され得る。そのような条件下で、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド産物の送達のために被験体内で発現される。

(iv) 組織工学
hCiPSC及びその子孫は、当該技術分野において公知の方法を用いて、組織工学的構築物を作製するために使用することができる。組織工学的構築物は、損傷した臓器又は組織の修復又は置換のための補綴装置として使用することを含む様々な目的のために使用することができる。それらはまた、構築物の細胞によって分泌されるタンパク質又は他の分子のin vivo送達システムとして、又は一般的に薬物送達システムとしても機能することができる。組織工学的構築物はまた、組織機能のin vitroモデルとして、又は様々な治療又は医薬品の効果を試験するためのモデルとしても使用される。幹細胞移植のための最も一般的に使用される生体材料足場は、幹細胞移植のための最も一般的に使用される生体材料足場でレビューされており、Willerth, S.M.及びSakiyama-Elbert, S.E., Combing stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tisses and cell delivery (2008年07月09日)、 StemBook, ed。幹細胞研究コミュニティ、 StemBook。組織工学技術は、組織成長を維持し促進するための適切な培養基質の選択をしばしば伴う。一般に、これらの基質は三次元であるべきであり、目的の組織に対して所望の形状の足場を形成するために加工可能であるべきである。

米国特許第6,962,814号は、一般に、組織工学的構築物及び工学的天然組織を製造する方法を開示している。具体例に関しては、バカンティらに対する米国特許第7,914,579号は、組織工学的靱帯及び腱を開示している。米国特許第5,716,404号は、高分子マトリックスと組み合わせて移植された解離筋細胞を用いた乳房組織の再建又は増強のための方法及び組成物を開示している。米国特許第8,728,495号は、自己皮膚線維芽細胞を用いた軟骨の修復を開示している。Duailibiらによる米国公開出願第20090029322号は、歯の代替物を作製する際に使用する歯組織を形成するための幹細胞の使用を開示している。米国公開出願第2006/0019326は、頭蓋内動脈瘤の治療のための細胞シード組織工学ポリマーを開示している。アタラによる米国公開出願第2007/0059293は、例えば腎臓、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、尿管及び尿道のような損傷臓器を置換するために使用することができる組織工学構築物 (及びそのような構築物を製造する方法) を開示している。

(v) hCiPSCから産生される細胞 (子孫)
hCiPSCは、例えば、上皮細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨、筋肉及び筋細胞のような結合組織を形成する細胞、軟骨細胞、骨細胞、歯槽細胞、肝細胞のような実質細胞、腎細胞、副腎細胞及び膵島細胞(例えば、アルファ細胞、デルタ細胞、PP細胞及びベータ細胞)、血液細胞(例、白血球、赤血球、マクロファージ、リンパ球)、網膜細胞(と、耳の有毛細胞や舌の味蕾を形成する細胞など、感覚知覚に関与する他の細胞)、及び神経を含む神経組織を含む3つの生殖層のいずれかからの細胞に分化するよう誘導することができる。

(vi) 治療用組成物
hCiPSCは、in vivo又はin vitro/ex vivoでの脱分化を促進するために、投与、送達又は被験体、組織又は細胞との接触のために処方することができる。成長因子、分化又は脱分化を誘導する他の因子、分泌産物、免疫調節剤、抗炎症剤、退行因子、神経支配、血管新生又はリンパネットワークを促進する生物活性化合物、及び薬物などの追加因子を組み込むことができる。

誘導された多能性細胞は、hCiPSC又はhCiPSC子孫の集団を単独で、又はキャリア又は支持構造上又は支持構造中に含む組成物を介して患者に投与することができる。多くの実施形態では、キャリアは必要とされない。細胞は、細胞が必要とされる部位に注射又は注入によって投与することができる。これらの場合、細胞は、典型的には、細胞培養培地を除去するために洗浄され、生理的緩衝液に懸濁されるであろう。

他の実施形態では、細胞は、支持構造と共に提供されるか、支持構造上又は支持構造内に組み込まれる。支持構造は、メッシュ、固体支持体、足場、チューブ、多孔質構造、及び/又はヒドロゲルであり得る。そのような固体支持体及びその上で細胞を培養する方法は、当該技術分野において公知である。

本発明は、好ましい実施形態として提示される以下の非限定的実施例を考慮してさらに理解されるであろう。

C. 低分子組成物の使用
低分子組成物は、in vitro及びin vivoにおいて、ヒト体細胞における組織再生、組織リモデリング及び修復、若返り又は老化の逆転、線維症の阻害又は逆転、及び可塑性の誘導に使用することができる。

例えば、リプログラミング過程のステージI及びステージIIの低分子は、in vivo又はin vitro/ex vivoにおいて脱分化、再生、修復及び若返りを促進するために、投与、送達又は被験体、組織又は細胞との接触のために配合することができる。成長因子、脱分化又は再生を誘導する他の因子、分泌産物、免疫調節剤、抗炎症剤、退行因子、神経支配、血管新生又はリンパネットワークを促進する生物学的に活性な化合物、及び薬物などの追加因子を組み込むことができる。

一実施形態では、低分子は、リプログラミング過程のステージI又はステージIIのために、低分子の全部又は一部を含む組成物を介して患者に投与することができる。低分子組成物は、内因性修復能力を高めるために、細胞が失われたり、組織が損傷されたりする部位に、全身的に、又は注射によって投与することができる。いくつかの実施形態では、担体は必要とされない。他の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。低分子は、例えば、マイクロカプセル化を用いて、持続的放出のために処方することもできる。低分子組成物は、レシピエントの生理学的条件に応じて、所望の生理学的効果を得るために、単回投与、複数回投与、連続的又は間欠的に患者に投与することができる。

いくつかの実施態様において、リプログラミング過程のステージI及びステージIIの低分子は、若返りを促進するために、投与、送達又は被験体、組織又は細胞との接触のために処方することができる。これらの低分子は、加齢に伴う組織学的変化を防止し、組織における細胞をより若い状態に維持するために処方することができる。若返り効果は、エピジェネティック時計の復帰、代謝変化、又は老化、ストレス、炎症経路の変化などのトランスクリプトーム変化によって検出することができる。低分子組成物は、レシピエントの生理学的条件に応じて、所望の生理学的効果を得るために、単回投与、複数回投与、連続又は間欠的方法で患者に投与することができる。
いくつかの実施態様において、リプログラミング過程のステージI及びステージIIの低分子は、投与、送達又は被験者、組織又は細胞との接触のために配合され、線維症を阻害又は修正することができる。線維症は、形態、エピゲノム又は代謝変化の変化、又は疾患、ストレス又は炎症によって誘発されるトランスクリプトーム変化によって検出することができる。低分子組成物は、レシピエントの生理学的条件に応じて、線維症を阻害又は修正するために、単回投与、複数回投与、連続又は間欠的な方法で患者に投与することができる。

いくつかの実施態様において、リプログラミング過程のステージI及びステージIIの低分子は、ヒト体細胞において細胞の可塑性を誘導するために、投与、送達又は被験体、組織又は細胞との接触のために処方することができる。細胞の可塑性は、エピゲノム、代謝変化、又はトランスクリプトーム変化の変化によって検出することができる。低分子組成物は、細胞の可塑性を誘導するために、連続的又は間欠的な方法で、in vitro又はin vivoで単回投与、複数回投与で使用することができる。

材料及び方法
HEFの単離及び培養
ヒト胚性線維芽細胞 (HEF) を、中日友好病院(倫理承認No .2009-50)の臨床研究倫理委員会によるインフォームドコンセント及び承認を得た胚性真皮組織から単離した。本研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施した。簡単に言えば、組織 (0.5～1 cm²) を2%ペニシリン‐ストレプトマイシン(ギブコ15140-122)を含有するPBS (コーニング、 05418005)で2回洗浄し、ハサミで1～2 mm²に刻み、 100 mm皿中で5～10 ml 2 mg/mlコラゲナーゼIV溶液(ギブコ1963347)で37^°Cで1時間解離させた。次に、 10～20 mlの15% FBS‐DMEM培地を加え、細胞を解離のために上下に数回ピペットした。懸濁液を50 mlチューブに集め、細胞を開放するために1～2分間振った。その後、懸濁液を400 gで5分間遠心分離し、上清を除去した後、細胞を15% FBS‐DMEM培地に再懸濁した。一般に、1～3×10⁶個の細胞を0.5～1 cm²の真皮から得ることができ、100 mm皿 (P0) にプレートした後、5% CO₂を含む37°Cでインキュベートする。翌日、新鮮な15% FBS-DMEM培地を交換し、非接着細胞を除去した。一次HEFsは通常3～4日で融合し、再プログラムのために通過する準備ができていた。0.25%トリプシン-EDTA (Gibco, 25200-056)を用いて一次HEFsを解離させた。CiPSC誘導のために、 15% FBS-DMEM培地で12ウェルプレートのウェル当たり1.5×10⁴細胞の密度でHEFsを播種した。培養と拡大のために、 100 mmディッシュ当たり1.5×10⁶細胞の密度でHEFsを播種した。7継代以内のCiPS細胞の誘導のために一次HEFsを使用することが推奨される。15% FBS‐DMEM培地:15%ウシ胎児血清(FBS) (Vistech, VIS93526487)、 1% GlutaMAXTM (ギブコ35050-061)、 1% MEM非必須アミノ酸溶液 (NEAA) (ギブコ11140050)、 1%ペニシリン‐ストレプトマイシン及び0.055 mM 2‐メルカプトエタノール(Gibco, 21985-023)を添加した高グルコースDMEM (ギブコ、C11965500BT)。

hADSCの単離及び培養
成人ヒト脂肪由来間葉系間質細胞 (hADSC) を、北京大学の倫理委員会審査委員会 (IRB 00001052‐19070) によるインフォームドコンセント及び承認を得た成人脂肪組織から単離した。この研究はヘルシンキ宣言の原則に従って行われた。簡単に言えば、組織 (2～4 cm²) を2%ペニシリン‐ストレプトマイシンを含有するPBSで2回洗浄し、ハサミで1～2 mm²に刻み、 100 mm皿中の5～10 ml 2 mg/mlコラゲナーゼIV溶液で3^7°Cで1時間解離させた。次に、 10～20 mlの15% FBS‐DMEM培地を加え、細胞を解離のために数回上下にピペットした。懸濁液を2本の50 mlチューブに集め、 15% FBS‐DMEM培地でそれぞれ30～40 mlに希釈し、続いて細胞を放出するために1～2分間振とうした。次に懸濁液を400 gで5分間遠心分離し、上清を除去した後、細胞を間葉系幹細胞増殖培地2 (プロモーションセルC-28009)に再懸濁した。一般に、 2～4 cm²の脂肪組織から1～3×10⁶細胞を得ることができ、 100 mm皿 (P0) にプレートし、続いて5% CO₂で37°Cでインキュベートする。翌日、新鮮な間葉系幹細胞増殖培地2を、非接着細胞を除去するために交換した。一次hADSCは通常3～5日で融合し、リプログラミングのために通過する準備ができていた。0.25%トリプシン-EDTAを用いて一次HEFsを解離させた。CiPSC誘導のために、 hADSCを15% FBS-DMEM培地で12ウェルプレートのウェル当たり1×10⁴細胞の密度で播種した。培養及び拡張のために、hADSCを、間葉系幹細胞増殖培地2を用いて100 mm皿当たり1.5×10⁶細胞の密度で播種した。4継代内のCiPS細胞の誘導のために一次hADSCを使用することが推奨される。

hASFsの単離と培養
ヒト成人皮膚線維芽細胞 (hASFs) を、北京大学の倫理委員会審査委員会 (IRB 00001052‐19070) によるインフォームドコンセントと承認を得た成人真皮組織から単離した。本研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施した。簡単に言えば、組織 (0.5～1 cm²) を2%ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むPBSで2回洗浄し、ハサミで0.5～1 mm²の断片に刻んだ。その後、断片を100 mm細胞培養皿に置き、 15% FBS‐DMEM培地の1滴を各組織断片に置いた。次に、断片を5% CO₂と共に37^°Cで4～12時間インキュベートした (断片を乾燥させない) 。次いで、 3～5 mlの間葉系幹細胞増殖培地2を皿に穏やかに加えた (断片を皿から分離させない) 。新鮮な間葉系幹細胞増殖培地2を2～3日毎に交換した。4～7日以内に線維芽細胞の伸長が起こる。一次hASFは通常10～14日で融合し、リプログラミングのために通過する準備ができていた。hASFは、上記のhADSCと同じ方法でリプログラミングと拡張の両方のために通過した。

HEFsからのhCiPSCの生成
hCiPSC誘導のための培地調製
ステージI誘導培地:
10%ノックアウト血清置換 (KSR) (ギブコ10828028)、10% FBS、1% GlutaMAX^TM、1% NEAA、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、50μg/ml L-アスコルビン酸2-リン酸 (Vc2P) (シグマ、A8960)、5 mM LiCl (シグマL4408)、1 mMニコチン酸アミド(NAM) (シグマ、72340)、2 mg/mL AlbuMAX^TM-II (ギブコ11021045)及び低分子CHIR999021 (10μM) 、616452 (10μM) 、TTNPB (2μM) 、SAG (0.5μM) 、ABT-869 (1μM) 、ロック阻害剤 (Y-27632 (2μM) 又はTzv (2μM) ) を添加したKnockOut^TM DMEM (ギブコ10829018)。

リプログラミング効率を高めるために、 Dot1L阻害剤 (EPZ004777 (0.2μM) 又はEPZ5676 (0.2μM) )、ルキソリチニブ (1μM) 及びDZNep (0.01μM) をステージI誘導培地に導入した。

ステージII誘導培地:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン‐ストレプトマイシン、 0.055 mM 2‐メルカプトエタノール、 50μg/ml Vc2p, 5 mM LiCl, 1 mM NAM, 40 ng/ml bFGF (オリジンTP750002)及び低分子CHIR99021 (10μM)、 616452 (10μM)、 TTNPB (2μM)、 SAG (0.5μM)、 ABT‐869 (1μM)、 Y27632 (10μM)、 JNKIN8 (1μM)、トラニルシプロミン (10μM)、 5‐アザシチジン (5μM) を添加したKnockOutTM DMEM。

リプログラミング効率を高めるために、低分子のUNC0224 (1μM) 、ルキソリチニブ (1μM) (セレックケムカタログNo.S 7256)及びCBP/p300ブロモドメイン阻害剤SGC-CBP30 (2μM) をステージII誘導培地に導入することができる。

ステージIII誘導培地:
1% N2サプリメント(Gibco, 17502-048)、2% B27サプリメント(Gibco, 17504-044)、1% GlutaMAX^TM、1% NEAA、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、5 mg/mL AlbuMAX^TM-II、20 ng/mL組換えヒトヘレグリンβ-1 (HRG) (PEPROTECH 100-03)及び低分子CHIR99021 (1μM) 、616452 (10μM) 、Y-27632 (10μM) 、PD0325901 (1μM) 、トラニルシプロミン (10μM) 、VPA (500μM) 、DZNep (0.2μM) 、EPZ004777 (5μM) を添加したノックアウトTM DMEM IV期の導入媒体:

1% N2サプリメント、2% B27サプリメント、 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、 20 ng/mL HRG及び低分子CHIR99021 (1μM)、 Y-27632 (10μM)、 PD0325901 (1μM)、 IWP-2 (2μM)、 SB590885 (0.5μM) を添加したノックアウトTM DMEM。VPA (500μM) は最初の4日間に含まれた。

HEFからのhCiPSCの誘導過程
細胞を21% O₂と5% CO₂で37°Cに維持した。誘導培地は3～4日毎に交換した。HEFは15%の12ウェルプレートのウェル当たり1～1.5×¹⁰⁴細胞の密度で播種した。FBS‐DMEM培地。翌日、I期誘導培地に変更する。I期誘導では、単層上皮様細胞が4～6日目に出現し、8～12日目に80% -100%の合流に近づき、培地をII期誘導培地に変更する。II期誘導では、8～12日の処理後に多層コロニーが出現し、これらの細胞コロニーは継続的に大きくなる。完全に16～20日のII期処理後、培地をIII期状態に変える。III期誘導では、III期培地を8～12日間処理した後、培地をIV期状態に変える。IV期誘導では、VPA (500μM) を最初の4日間に含めた。一次hCiPSCコロニーは6～8日の処理後に出現する。ステージIVの最後に、 OCT4とNANOGの共発現の免疫蛍光染色を用いて一次hCiPSCコロニーの発生を確認した。一次hCiPSCコロニー数をコンパクトOCT4陽性コロニー数として計算した。リプログラミング効率を、一次hCiPSCコロニー数を入力HEF数で割って計算した。

hADSCとhASFからのhCiPSCの生成
hCiPSC誘導のための培地調製
ステージI誘導培地:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 0.055mM 2-メルカプトエタノール、 1%ペニシリン-ストレプトマイシン、50μg/ml Vc2p, 5mM LiCl, 1 mM NAM, 2 mg/mL AlbuMAX^TM-II及び低分子CHIR999021 (10μM)、 616452 (10μM)、 TTNPB (2μM)、 SAG (0.5μM)、 ABT-869 (1μM)、ロック阻害剤 (Y-27632 (2μM) 又はTzv (2μM) )、 Dot1L阻害剤 (EPZ004777 (2μM) 又はEPZ5676 (2μM) )、 DZNep (0.02μM)、ルキソリチニブ (1μM) を添加したKnockOutTM DMEM。リプログラミング効率を高めるために、 Menin‐MLL相互作用阻害剤VTP50469をステージI誘導培地に導入した。
いくつかの実験で、各低分子を除去した後のリプログラミング効率を試験するために、指示された低分子をカクテルから除去した。同じ経路又は標的を調節するために使用された低分子の濃度は、以下のように示された:GSK3阻害剤(CHIRE 99021:3～15μM;TD114-2:0.5-2μM;CHIR98014:1～3μM;GSK3βi XV:0.05～0.2μM);RA経路作動薬(TTNPB:0.5～10μM;Ch55:1～5μM;AM580:0.1-1μM);ロック阻害薬(TZV:2～10μM;Y27632:2～15μM;ファスジル:2～10μM;HA1100:2～10μM);TGFβ阻害薬(A8301:0.1-5μM;SB431542:2～50μM;LY364947:0.5μM;LY21:0.5μM;616452:10μM)。

ステージII誘導培地:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-メルカプトエタノール、 1%ペニシリン-ストレプトマイシン、50μg/ml Vc2p, 5 mM LiCl, 1 mM NAM, 100 ng/ml bFGF (Origene)、及び低分子CHIR99021 (10-12μM)、 616452 (10μM)、 TTNPB (2μM)、 SAG (0.5μM)、 ABT-869 (1μM)、 Y-27632 (10μM)、 JNKIN8 (1μM)、トラニルシプロミン (2μM)、 5-アザシチジン (5μM)、 UNC0224 (1μM)、ルキソリチニブ (1μM)、 BIRB796 (2μM)、ドルソルモルヒネ (0.5～1μM) 、。リプログラミング効率を高めるために、 CBP/p300ブロモドメイン阻害剤SGC‐CBP30 (2μM) とメニン‐MLL相互作用阻害剤VTP50469をステージII誘導培地に導入した。

いくつかの実験では、各低分子を調節した後のリプログラミング効率を試験するために、指示された低分子をカクテルから除去した。同じ経路又は標的を標的とするために使用される低分子の濃度は、以下のように示された:GSK3阻害剤(CHIRE 99021:3～15μM;TD114-2:0.5-2μM;CHIR98014:1～3μM;GSK3βi XV:0.05～0.2μM);TGFβ阻害剤(A8301:0.2～5μM;SB431542:2～50μM;616452:10μM);RA経路作動薬(TTNPB:0.2～10μM;Ch55:1～10μM;AM580:0.1-1μM);ロック阻害薬(Y27632:2～15μM;ファスジル:2～10μM;HA1100:2～10μM;TZV:2～10μM); Smoothenedアゴニスト(SAG:0.2～2μM;プルモルファミン:0.5-2μM;Hg-Ag1.5:0.5-1μM;ヒトshh:20～200μM);ヒストン脱メチル化阻害剤(トラニルシプロミン:2～50μM;GSK2879:0.02-2μM;LSD-C76:0.2～5μM;S2101:0.5～5μM;LSD-2D:0.2～5μM;RN-1:0.2～5μM);DNMT阻害剤(5-azaC:2～15μM;デシタビン:0.5～10μM;RG108:0.5～10μM);JNK阻害剤(JNK-in-8:0.2-2μM;JNK-in-5:0.5-1μM;JNK-in-7:0.2-2μM;JNK-in-12:0.2～0.5μM);CBP/p300ブロモドメイン阻害剤(SGC-CBP30:0.5-2μM;I-CBP112:0.5-5μM;GNE272:0.5-5μM;GNE409:0.5～5μM);メニン‐MLL相互作用阻害剤(VTP50469:0.5-2μM;MI3454:0.5-2μM;WDR5-IN-4:0.5-2μM)。

ステージIII誘導培地:
1% N2サプリメント、2% B27サプリメント、1% GlutaMAX^TM、1% NEAA、0.055 mM 2-メルカプトエタノール、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、5 mg/mL AlbuMAX^TM-II、20 ng/mL HRG及び低分子CHIR99021 (1μM) 、616452 (10μM) 、Y-27632 (10μM) 、PD0325901 (1μM) 、トラニルシプロミン (10μM) 、VPA (500μM) 、Dznep (0.2μM) 、EPZ004777 (5μM) を添加したノックアウトTM DMEM。いくつかの実験では、各低分子を除去した後のリプログラミング効率をテストするために、指示された低分子をカクテルから除去した。同じ経路又は標的を標的とするために使用される低分子の濃度は、以下のように示された:GSK3阻害剤(CHIRE 99021:1～10μM;TD114-2:0.05～0.5μM;TD114-3:0.2-1μM;IM12:0.5-2μM;CHIR98014:0.2-1μM);TGFβ阻害剤(616452:2～15μM;A8301:0.5～5μM;SB431542:2～50μM);ロック阻害剤(Y27632:2～100μM;TZV:2～10μM;ファスジル:5～10μM;ブレビスタチン:2～10μM);ヒストン脱メチル化阻害剤(トラニルシプロミン:10～50μM;RN-1:1-2μM;GSK2879:0.5-1μM;S2101:0.5-2μM;LSD-C76:0.5-2μM);HDAC阻害剤(VPA:200～1500μM;MS275:0.2-2μM;LMK235:0.05～0.5μM;酪酸ナトリウム:200～1000μM);Dolt1L阻害剤(EPZ004777:5μM;EPZ5676:1～5μM;SGC0946:1～5μM);S-アデノシル-Lホモシステインヒドロラーゼ阻害剤(DZNep:0.1～0.5μM;Adox:10～70μM);ERK阻害剤(PD0325901:0.02～5μM);SETD8阻害剤(UNC0379:0.1-2uM)。

ステージIV導入培地:
1% N2サプリメント、2% B27サプリメント、 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-メルカプトエタノール、 1%ペニシリン-ストレプトマイシン、 20 ng/mL HRG及び低分子CHIR99021 (1μM)、 Y-27632 (10μM)、 PD0325901 (1μM)、 IWP-2 (2μM)、 SB590885 (0.5μM) を添加したノックアウト^TM DMEM。VPA (500μM)、トラニルシプロミン (10μM)、 DZNep (0.05μM)、 EPZ004777 (5μM) を最初の4日間に含んだ。いくつかの実験では、各低分子を除去した後のリプログラミング効率を試験するために、指示された低分子をカクテルから除去した。同じ経路又は標的を標的とするために使用される低分子の濃度は、以下のように示された:GSK3阻害剤(CHIRE 99021:0～10μM);ERK阻害剤(PD0325901:0.02～5μM;AZD8330:0.2～5μM;TAK733:0.2～5μM;トラミチニブ:0.2～5μM;U0126:0.2～5μM);ロック阻害剤(Y27632:2～12μM;TZV:0.2～0.5μM;ファスジル:2～10μM;HA-1100:4～20μM;ブレビスタチン:2～10μM);WNT経路阻害剤(IWP2:0.5～4μM;IWR1:1～10μM;XAV939:1～10μM);BRAF阻害剤(SB590885:0.1-5μM;ソラチニブ:0.1-0.5μM;GDC0879:0.1-5μM);HDAC阻害剤(VPA:200～1000μM;MS275:0.2-1μM;酪酸ナトリウム:100～500μM)。

hADSC及びhASFからのhCiPSCの誘導過程
5% O₂による低酸素をステージI誘導に適用した。ステージI誘導後、細胞を21% O₂に変化させた。誘導培地を3～4日毎に交換した。(1).ADSCとhASFを15% FBS DMEM培地中で12ウェルプレートのウェル当たり1×¹⁰⁴細胞の密度で播種した。翌日に培地をステージI誘導培地に変更した。(2).ステージI誘導では、 hADSCから誘導された単層上皮様細胞は4日目から6日目に出現し、8日目から12日目に80% -100%の合流に近づいた。ASFでは、上皮様細胞は12日目から20日目に80% -100%の合流に近づいた。その後、培地をステージII誘導培地に変える。(3) ステージII誘導では、 8～12日の処理後に多層細胞コロニーが出現し、これらの細胞コロニーは継続的に大きくなる。ステージII培地を完全に16～20日処理した後、培地をステージIII誘導培地に変更する。(4) ステージIII誘導には、ステージIII誘導培地を10～12日処理する必要があった。その後、培地をステージIV状態に変更する。(5) ステージIV誘導のために、VPA (500μM)、トラニルシプロミン(10μM)、 DZNep (0.05μM) 及びEPZ004777 (5μM) をステージIV誘導培地の最初の4日間に含めた。一次hCiPSCコロニーは6～8日の処理後に出現した。

ヒトCiPS細胞株の誘導及び培養
8～12日ステージIV条件処理後、細胞をアキュターゼ(ミリポア、SCR005)により解離させ、修正104ステージIV条件でマイトマイシンC (シグマ-アルドリッチM4287)処理MEFのフィーダー層上で1:3から1:12の比で再生した:1% N2サプリメント、 2% B27サプリメント、 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン‐ストレプトマイシン、 0.055 mM 2‐メルカプトエタノール、 2 mg/mL AlbuMAX^TM‐II及び低分子CHIR99021 (1μM)、 PD0325901 (0.5μM)、 IWP‐2 (2μM)、 Y‐27632 (10μM)、 HRG (20 ng/mL) 及びbFGF (100 ng/mL、Origine)を添加したノックアウトDMEM。細胞を37°Cで21% O₂, 5% CO₂下でインキュベートし、培地を毎日変えた。3～7日後、コンパクトなCiPS細胞コロニーが出現した。10日～12日後、これらのコロニーを手動でピックアップし、機械的に小さなクランプに解離させ、 Y‐27632 (10μM) を添加したmTeSRTMプラス培地(STEMCELL, 05826)中のマトリゲル(コーニング354248年)被覆プレート上に移した。使用済み培地をY‐27632を含まない新鮮なmTeSRTMプラス培地と交換する前に、コロニーを培養プレートに24時間付着させた。

ヒトCiPS細胞とhES細胞 (H1とH9) を、 37°Cで21% O₂, 5% CO₂の下でマトリゲル被覆プレート上のmTeSRTMプラス培地で維持した。培地は毎日交換した。細胞は約85%のコンフルエンスに達した時点で継代した。これは通常、約1:10から1:20の分割比で継代後3～7日目に生じた。継代のために、ヒトCiPS細胞をReLeSR^TM (STEMCELL, 05872)によって解離させ、分離した細胞凝集体をY‐27632 (10μM) を添加したmTeSRTMプラス培地中のマトリゲルコート板上に移した。コロニーを培養プレートに24時間付着させてから、使用済み培地をY-27632なしの新しいmTeSRTM Plus培地と交換する。
免疫蛍光

免疫蛍光は前述の通り実施した(Hou et al., 2013)。室温で4%パラホルムアルデヒド(DingGuo, AR-0211)で30分間固定した後、細胞を透過化し、 0.1% Triton^TM X‐100 (シグマ-アルドリッチT8787)及び2%ロバ血清(ジャクソン免疫研究所、 017-000-121)を含むPBSで3^7°Cで1時間ブロックした。適切な希釈液による一次抗体インキュベーションを、同じ緩衝液中で^4°Cで一晩行った。翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、 2%ロバ血清を含むPBS中の二次抗体を4°Cで一晩プローブした。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、 DNAをDAPI溶液(ロシュ・ライフ・サイエンス社10236276001)で染色した。抗体の詳細を表1に示す。

細胞数倍加時間
増殖速度は時間の関数として血球計を用いて細胞数を数えることによって決定した。増殖の指数相からのデータを用いた。倍加時間はDT=t* [lg2/ (lgNt-lgNo) ] の式に従って計算した。

奇形腫形成
奇形腫形成のために、 hCiPS細胞をReLeSRTMにより採取した。約2×¹⁰⁶細胞をMatrigelに再懸濁し、免疫不全NPGマウスに皮下注射した。奇形腫は通常6～7週までに得られ、その後パラフィンに包埋した。パラフィン切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。すべての動物実験は、中国、北京大学の動物保護ガイドラインに従って実施した。

EB形成
hCiPSCを小さな塊として収穫し、胚様体を形成するためにmTESR^TM Plus培地中の超低付着プレート上に球として播種し、 20% FBSを添加した高グルコースDMEM中で16日間分化させた。次に、 EBを収集し、同じ培地中で6日間マトリゲル被覆プレート上にプレートし、固定し、免疫染色で検出した。

指向性分化
hCiPSCの造血及びT細胞分化
多能性幹細胞からの中胚葉及び造血内皮 (HE) 細胞分化は、以前に記述したように最適化条件(Wangら、2012年)で誘導した。簡単に言えば、多能性幹細胞は、分化前の6ウェルプレート1日目に、 1×¹⁰⁴～5×104/ウェルからの低密度でマトリゲル被覆プレート中で培養した。分化第0日に、ビタミンAを含まないB27, 20 ng/mLアクチビンA, 20 ng/mL BMP4 (StemImmune LLC, HST-B4-0100)、 50μg/mL Vc2p, 3‐5μM CHIR99021, 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン‐ストレプトマイシン及び0.1 mM 1‐チオグリセロール(シグマ、M6145)を添加したRPMI 1640 (ギブコ61870036)を2日間投与した。中胚葉誘導の2日後に、分化したEBを、ビタミンAを含まないB27, 50μg/mL Vc2p, 5 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF (StemImmune LLC, HVG-VF5-1000)、 50 ng/mL bFGF (オリジンTP750002)、 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン‐ストレプトマイシン及び10μM SB‐431542 (セレックS1067)を添加したRPMI 1640で培養した。次に、造血誘導のために、培養培地を6日目に、ビタミンAを含まないB27, 50μg/mL Vc2p, 5 ng/mL BMP4, 10 ng/mL VEGF, 20 ng/mL SCF (StemImmune LLC, HHM-SF-1000)、 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン‐ストレプトマイシンを添加したIMDM (ギブコ12440053)に変更した。8日目に、造血前駆細胞を採取し、 MS5‐DL4細胞に移植し、 T細胞分化培地(ビタミンAを含まないB27, 50μg/ml Vc2p, 1% GlutaMAX^TM, 1% NEAA, 1%ペニシリン-ストレプトマイシン、 0.1 mM 1-チオグリセロール、 5 ng/ml SCF, 5 ng/ml FLT3 (StemImmune LLC, HHM-FT-1000)、 5 ng/ml IL7 (StemImmune LLC, HCT-I7-1000)を添加したIMDM)で共培養した。培地は2日毎に交換した。表面マーカー検出のため、培養細胞を採取し、指示された抗体を添加した。FACSVerse (BD) を用いてフローサイトメトリー分析を行った。データはFlowJo‐V10 (BD) を用いて分析した。

hCiPSCの肝細胞分化
多能性幹細胞からの肝細胞分化は、以前に述べたように誘導した(Chenら、2020年)。簡単に言うと、 hCiPSCは、 B27サプリメントと1%ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中で1日間、100 ng/mlアクチビンA, 0.5 ng/ml BMP4, 10 ng/ml bFGF (PEPROTECH 100-18B)と20 ng/ml Wnt3aの組み合わせで原始線条に誘導され、 3日間、 100 ng/mlアクチビンA, 0.5 ng/ml BMP4と10 ng/ml bFGFの組み合わせで決定的な内胚葉細胞に誘導された。hCiPSC由来内胚葉細胞は、さらに、 B27サプリメントと1%ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むRPM I1640培地中で2日間、 20 ng/ml KGF (StemImmune, EST-KF-1000)と5μM SB‐431542の組み合わせで前腸内胚葉細胞に同定された。hCiPSC由来前腸内胚葉細胞は、その後、 B27サプリメントと1%ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中でさらに3日間、 20 ng/ml KGF, 20 ng/ml BMP4, 10 ng/ml BMP2 (幹免疫、 HST-B2-1000)と10 ng/ml bFGFの組み合わせで肝芽細胞に分化するよう誘導された。hCiPSC由来hHPCは、 hHPC成熟培地:B27サプリメントを含むWilliams’E培地、 25μMフォルスコリンと10μM SB‐431542で成熟肝細胞に分化するよう誘導された。脂質検出は、製造業者の指示に従って脂質 (オイルレッドO) 染色キット(シグマ、MAK194)で行った。ヒトアルブミンは、製造業者の指示に従ってヒトアルブミンELISA定量キット(ベチル研究所E80-129)を用いて測定した。尿素合成は、製造業者の指示に従ってQuantiChrom尿素アッセイキット(バイオアッセイシステムBA_DIUR-500)を用いて測定した。

核型分析
核型 (染色体Gバンド) 分析は、高分解能Gバンド (400G～500G) のための標準プロトコルを用いて、北京Jiaen病院で委託され、 CytoVision (Leica) によって分析された。各分析に対して、少なくとも20の中期が調べられた。染色体数と構造的染色体異常の存在が調べられた。

ショートタンデムリピート (STR) 分析
ショートタンデムリピート分析はBeijing Microread Genetics Co., Ltd.で委託された。簡単に言うと、ゲノムDNAはSTR Multi-amplification Kit (Microreader^TM21 ID System) でPCRに使用され、ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems(登録商標)) とGeneMapperID-Xソフトウェアで分析された。

逆転写 (RT) 定量PCR (qPCR)
全RNAをDirect‐zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research、R2053)を用いて単離した。cDNAをTransScript一本鎖cDNA合成SuperMix (TransGen Biotech AT311-03)を用いて全RNAの0.5～1μgから合成した。CFX ConnectTMリアルタイムシステム (Bio‐Rad) 上でKAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (KAPAバイオシステムズKM4101)を用いてqPCRを行った。データはデルタ‐デルタCt法を用いて分析した。GAPDHを標的遺伝子の発現を正常化する対照として用いた。本研究におけるqPCRのプライマー配列を表2に示す。

RNAシークエンシング
ダイレクトゾルRNA MiniPrep Kitを用いて全RNAを単離した。イルミナ用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit (NEB England BioLabs, E7775)を用いてRNA配列決定ライブラリーを構築した。断片化及びランダムにプライミングされた2×150 bpペアエンドライブラリーをイルミナHiSeq X 10を用いて配列決定した。

単一細胞RNA配列決定 (scRNA‐seq)
単一細胞3’Library and Gel Bead Kit V3.1(10x Genomics、1000075)及びChromium Single Cell B Chip Kit (10x Genomics、1000074)を用いて、細胞懸濁液 (Count Starにより測定されたマイクロリットル当たり300～600個の生きた細胞) をChromium Single Cell Controller (10x Genomics) にロードし、製造業者のプロトコルに従ってエマルジョン中に単一細胞ゲルビーズを生成した。簡単に言えば、化学的リプログラミング過程を通じて異なる時点の細胞を採取し、0.04% BSAを含む1 x PBS中で1 x ¹⁰⁶細胞/mlで再懸濁した。約1 x ¹⁰⁴細胞を各チャネルに添加し、標的細胞は約5 x ¹⁰³細胞と推定された。捕獲細胞を溶解し、放出されたRNAを個々のGEMの逆転写によりバーコード化し、逆転写をS1000TMタッチサーマルサイクラー (Bio Rad) 上で53°Cで45分間、続いて85°Cで5分間行い、4°Cで保持した。cDNAを生成して増幅し、Agilent 4200を用いて品質を評価した。メーカーの紹介によると、シングルセルRNA-seqライブラリは、Single Cell 3’LibraryとGel Bead Kit V3.1を使用して構築されました。ライブラリは、ペアエンド150 bp (PE150) 読み取り戦略(CapitalBio Technology (北京) が実施)を使用して、少なくとも1×¹⁰⁵読み取りの配列決定深度を持つIlluminaNovaseq6000シーケンサを使用して最終的に配列決定されました。

配列決定 (ATAC-seq) を使用したトランスポザーゼ利用可能なクロマチンのアッセイ
各サンプルの約5×¹⁰⁴細胞を収集し、冷PBSで一度洗浄し、50μL溶解緩衝液(10 mMトリス-HCl PH7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl₂、0.5% NP-40)に再懸濁させた。続いて、イルミナ用TurePrep DNA Library Prep Kit V2 (バザイムTD501-02)によりDNAライブラリー構築を行い、イルミナ用TruePrep Index Kit V2 (Vazyme, TD202 96rxn)を用いてPCRにより増幅した。全てのATACライブラリーをIllumina Novaseq 6000プラットフォーム上で配列決定し、150 bpのペアエンドリードを生成した。生物学的に独立した実験n=3。

全ゲノム重亜硫酸塩基配列決定 (WGBS)
ゲノムDNAをHEFs, hADSC, hCiPSC及びhESCから単離した。抽出したDNAの亜硫酸水素塩変換を以前に報告したように行った(2018年趙ら)。回収した亜硫酸水素塩変換DNAを配列決定ライブラリーに構築し、各ライブラリーをIllumina HiSeq X 10により90G生データを配列決定した。

亜硫酸水素塩ゲノム配列決定
DNAはQuick-DNA Miniprepキット(ザイモリサーチD3024)を用いて抽出した。単離したDNAは亜硫酸水素塩処理によって修飾し、 EZ DNAメチル化‐直接キット(Zymo Research, D5020)を用いて精製した。次に、亜硫酸水素塩修飾DNAをZymoTaq PreMixキット(Zymo Research、E2003)を用いてPCRによって増幅した。プライマーを表2に示す。増幅断片をpEASY-T1シンプルクローニングベクター(トランスジェニック、 CT111-02)にクローニングした。各試料から無作為に選んだ10クローンを配列決定した。

RNA‐seq解析
全ての試料に対してFastQCを用いて品質管理を行った。生RNA‐seq読み取りは、検出されたアダプタを除去するためにパラメータ「ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:7:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36」を用いてTrimmomaticを用いてトリミングした。ヒト参照ゲノムhg19へのクリーンリードは、追加パラメータ‘--outSAMtype BAM Unsorted--outSAMstrandField intronMotif--outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical’を持つSTARを用いてマッピングした。各遺伝子にマッピングされたリード数は、プログラム特徴Counts of Subreadパッケージを用いてカウントした。

RパッケージDESeq2を用いて、差次的に発現した遺伝子解析を行った。詳細には、平均発現の最低40%分位の遺伝子を除去し、デフォルトパラメータを持つDESeq関数を用いて前処理を行った。群間の遺伝子発現差は、適応t事前収縮推定量apeglmを持つlfcShrinkを用いて計算した。差次的に発現した遺伝子 (DEG) は、群間のlog2倍変化>2及び調整p値<0.05の遺伝子として定義した。DEGへのGO分析は、 Rパッケージクラスタプロファイラの関数enrichGOを用いて行った。正規化カウントも分散安定化変換し、プロットヒートマップにスケーリングした。主成分分析 (PCA) はパラメータ'scale'を持つRパッケージirlbaを用いて行った。=T, n=3'。

WGBS解析
亜硫酸水素塩処理読み取りのアラインメントを正しく行うために、 Bismark Bisulfite Mapperパイプラインに従った。最初に、スクリプトbismark_genome_preparationを用いて、ヒト参照ゲノムhg19とラムダゲノムを完全に亜硫酸水素塩変換した順方向 (C>T) と逆方向 (G>A変換) バージョンに変換した。配列読み取りも同様に変換し、 Bowtie2を用いて準備されたゲノムにマップした。次に、 Bismarkマッピング出力からゲノム内の同じ位置へのアラインメントをスクリプトdeduplicate_bismarkを用いて除去した。全ての単一Cのメチル化情報は、パラメータ‘-p--no_overlap--ignore 5--ignore_r2 5--zero_based--CX--buffer_size 50%’を用いてスクリプトbismark_methylation_extractorを用いて抽出した。このようにして、メチル化をサポートする読み取り数と全てのCpG部位をカバーする読み取り数を得たが、非CpG部位は後の解析では考慮しなかった。

メチル化の証拠を示す部位を同定するために、メチル化数が亜硫酸水素塩非変換事象を超えているかどうかを試験するために、これらのカウントで各部位に対して二項検定を行った。亜硫酸水素塩非変換率は、ライブラリー構築中にスパイクインされたラムダゲノムの全メチル化レベルとして定義した。Benjamini‐Hochberg法を用いて偽発見率 (FDR) を計算した。FDRが0.01以上の部位を非変換部位とみなし、メチル化レベルを0に設定した。試験に合格した各CpG部位のメチル化レベルは、その部位をカバーする読み取りのうちメチル化をサポートする読み取りの割合 (mCpG/CpG) として定義した。複数のCpG部位を有する領域のメチル化レベルは、加重メチル化 (総mCpG/総CpG) として定義した。各サンプルの平均CpGメチル化レベルは、 CpG部位をカバーする読み取り (全mCpG/全CpG) からCpGメチル化をサポートする全読み取りの割合として計算した。

異なるサンプルの全体的な類似性を比較するために、ゲノムを長さ5万 bpのビンに切断し、各ビンのCpGメチル化レベルを計算した。これらのメチル化レベルを、全体的なCpGメチル化特徴の推定として用いた。階層的クラスタリングは、遠隔パラメータとして1-ピアソン相関係数を持つ関数hclustを用いて行った。

ATAC‐seq解析
全試料に対してFastQCを用いて品質管理を行った。未加工ATAC‐seq読み取りは、検出されたアダプタを除去するためにパラメータ「ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:7:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36」を用いてTrimmamaticを用いてトリミングした。次に、クリーンリードをパラメータ‘--very-sensitive’でBowtie2を用いてヒト参照ゲノムhg19にマッピングした。出力SAMファイルをBAMファイルに変換し、 Samtoolsを用いて名前でソートした。重複読み取りはPicardツールのMarkDuplicates関数を用いて除去した。低品質マップ読み取りとミトコンドリアにマップされた読み取りはSamtoolsを用いてフィルタリングした。Tn5トランスポザーゼ占有ピークを説明するためにフラグメントを5bp前方に調整した後、パラメータ‘-g hs--nomodel--shift -100--extsize 200--keep-dup all’を用いてMACS2を用いて各サンプルに呼び出しを行った。同じサンプルの複製物間でコンセンサスピークのみを保持するために、複製不能発見率 (IDR) 分析を複製物の各ペア間で行い、少なくとも一つの試験でスコア>540のピークのみを保持した。

異なるサンプルの重複ピークをマージし、 RパッケージChIPpeakAnnoを用いてサンプル特異的ピークセットを定義した。各ピークをRパッケージChIPseekerを用いて最も近い遺伝子にアノテーションした。ピーク領域又は遺伝子プロモーター領域周辺のATACシグナル強度をDeeptoolsを用いて定量した。

単一細胞RNA‐seqデータ前処理
クリーンな単一細胞RNA‐seq読み取りをCellranger v 3.1.0を用いてヒト参照ゲノムhg19にマッピングした。総遺伝子数500未満又は総UMI数1000未満の細胞を除去した。次に、各細胞のミトコンドリア遺伝子のUMI数割合 (M%) をチェックし、ログスケール後にM>中央値+2MADs (中央値絶対偏差) 又はM<中央値-2MADsの細胞を除去した。品質管理を通過した細胞は、パラメーター「use.ranks=T」を持つRパッケージスキャンの関数quickClusterを使用して、それらのスピアマン順位相関に基づいて大まかにクラスター化した。次のスケーリング正規化は、パラメーター「downsample=T, down_prop=0.1」を持つ関数computeSumFactorsとlogNormCountsを使用して、セルプールからサイズ因子をデコンボルビングすることによって実行した。正規化されたデータは、 RパッケージSeurat v3を使用してSeuratオブジェクトを作成するために使用された。PCA次元縮小は、 2000の変数特徴とスケーリングされた正規化データを使用して実行した。次に、最初の20のPCを使用して、均一多様体近似及び投影 (UMAP) 次元縮小を実行した。最初の20のPCを使用して共有最近接(SNN) グラフを構築し、解像度0.6の関数FindClustersを使用してSNNグラフに基づいて細胞のクラスタを識別した。関数RunALRAによって計算された適応閾値低ランク近似 (ALRA) 帰属正規化データを使用して、遺伝子発現値を可視化した。

報告されたデータセットによるXEN様細胞のトランスクリプトーム分析
XEN様クラスターはいくつかの正準マーカーにより試料中で同定された。これらのXEN様細胞を既知のXEN細胞と比較するために、公開データセットを参照として用いた:ヒト着床前胚データ(E-MTAB-3929、Petropoulos et al.、2016)。同様の方法でこのデータセットに前処理を行い、 UMIカウントマトリックスをTPMに正規化し、 ALRA帰属を行った。全細胞型のPearson相関係数を、以前の論文(Petropoulosら、2016年)で定義された300系統マーカーを用いて計算した。遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) を、 Rパッケージクラスタプロファイラを用いて行った。

統計解析
統計解析のため、 p値はGraphPad Prism 8を用いた不対両側Studentのt検定により計算した。p値は以下の通りである:*p<0.05;*p<0.01;*** p<0.001;**** p<0.0001。結果は図の凡例に示すように平均値±標準偏差として示す。

［結果と考察]
低分子によりヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に誘導するために、マウス多能性 (7～10) の誘導に成功した以前に開示された化学カクテルをヒト胚線維芽細胞 (HEFs) で初めて試験した。しかし、これらのHEFは増殖が乏しく、処理後にアポトーシス表現型を示し(図1B)、マウス細胞と比較してヒト細胞は外因性シグナルにより抵抗性であるという以前の知見と一致した (15) 。ヒト体細胞の運命を変えるために外因性シグナルを使用するという課題を満たすために、選択した生物活性を有する低分子を含む戦略を採用し、その組み合わせを用いて体細胞遺伝子プログラムを消去し、多能性遺伝子を活性化し、統合多能性ネットワークを確立した。最後に、ヒト体細胞を多能性幹細胞(図1A)に再プログラムする段階的アプローチを確立した。

低分子によりヒト線維芽細胞を多能性幹細胞に誘導するため、種々の低分子カクテルをヒト胚性線維芽細胞 (HEFs) で最初に試験した。しかし、初期段階でいくつかの主要な障壁に遭遇した:1) HEFsは線維芽細胞形態を維持し、間葉から上皮への移行を受けなかった。2) 又はHEFsは処理後に不十分に増殖し、アポトーシス表現型を示した。3) 多能性関連遺伝子の発現を活性化することも挑戦的である。これらの現象は、安定なエピゲノム (5～6) を有するヒト細胞が外因性シグナル (15) に抵抗性であるという以前の知見と一致した。ヒト体細胞の運命を変えるために外因性シグナルを使用するという課題に対処するために、体細胞遺伝子プログラムを消去し、多能性遺伝子を活性化し、統合多能性を確立するために、化学ライブラリースクリーニングと低分子の組み合わせを組み合わせた戦略を採用した。最後に、ヒト体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする段階的アプローチを確立した。(図1A)。

元の細胞同一性を破壊し、体細胞遺伝子プログラムを下方制御するために、化学スクリーニングを行い、ヒト線維芽細胞(図1C)を単層上皮様細胞(図1E)に変換できる低分子組合せ(CHIR99021、616452及びTTNPB)を同定した。追加スクリーニングにより、 Y27632, ABT869及びSAGを併用に加えると上皮様細胞の生成を促進できることが明らかになった (ステージI条件) 。その処理後、線維芽細胞マーカー遺伝子のパネルはダウンレギュレートされ(図1F)、 KRT8, KRT18及びKRT19のような上皮細胞関連遺伝子はアップレギュレートされた(図1G)。加えて、多能性関連遺伝子LIN28Aは処理細胞で高度に発現した(図1B及び図1G)。しかし、この段階では、他の重要な多能性遺伝子は有意に活性化されなかった。これらのステージI上皮様細胞のその後のスクリーニングは、 JNKIN8と組み合わせたエピジェネティック調節因子5‐アザシチジンとトラニルシプロミンをステージI条件 (ステージII条件) に加えた後、多能性関連転写因子SALL4が活性化され、 LIN28A (図1B及び図1H)と共発現することを示した。しかし、多能性ネットワークを確立する鍵であるマスター多能性転写因子OCT4はこれらの細胞で活性化されなかった。

OCT4はエピジェネティック調節因子(トラニルシプロミン、バルプロ酸、 DZNep,及びEPZ004777)及びシグナル伝達阻害剤(CHIR99021、616452、Y27632、PD0325901) (図1B及び図1I)を含む低分子の組み合わせにより活性化された。完全多能性遺伝子ネットワークをさらに確立するために、ヒト多能性幹細胞の維持を容易にするために、さらなる低分子を加えた。CHIR99021, PD0325901, SB590885, IWP2,及びY27632 (ステージIV条件) で処理した後、 OCT4, SOX2,及びNANOG (OSN) を共発現するコンパクトコロニーが生成した(図1B)。重要なことに、ヒト胚性幹細胞(hESC) 培養培地に移植した後、これらのコロニーは、密に充填された高核細胞質比細胞(図1D)を有する典型的なhESC形態を示した。

次に、確立されたOSN細胞株の遺伝子発現とエピジェネティック状態を特性化した。まず、 20継代以上拡張可能なこれらの細胞は、 hESC (図5A)と同様の倍加時間で増殖した。また、コア多能性転写因子OCT4, SOX2及びNANOG (図1E及び図示しないデータ)とともに、表面マーカーTRA‐1‐60, TRA‐1‐81及びSSEA‐4を発現した。

加えて、 RT‐qPCR分析は、これらの細胞における多能性遺伝子(OCT4 (八量体結合転写因子4) 、SOX2 (SRY-Box転写因子2) 、NANOG (Nanog Homeobox) 、DNMT3B (DNAメチルトランスフェラーゼ3β) 、DPPA4 (発生多能性関連4) 、UTF1 (未分化胚細胞転写因子1) 、ZFP42 (亜鉛フィンガータンパク質42) 、PRDM14 (PRドメイン含有タンパク質14) 、及びZIC3 (Zicファミリーメンバー3))の発現を、 hESC (図1J)と同等のレベルで示し、 RNA配列解析は、これらの細胞のトランスクリプトームがhESC (図5B-C及び図示しないデータ)のトランスクリプトームと非常に類似していることを示した。hCiPSCで高度に発現する遺伝子には、NANOG (ナノグ・ホメオボックス) 、PRDM14 (PRドメイン含有蛋白質14) 、LIN28A (蛋白質lin-28ホモログA) 、OCT4 (八量体結合転写因子4) 、DPPA4 (発生多能性関連4) 、EPCAM (上皮細胞接着分子) 、DNMT3B (DNAメチルトランスフェラーゼ3β) 、ZFP42 (亜鉛フィンガー蛋白質42) 、SALL4 (Spalt Like転写因子4) 、ZIC3 (Zic Family Member 3) 、SOX2 (SRY-Box転写因子2) 、TDGF1 (teratocarcinoma-derived growth factor 1) 、DNMT3A (DNAメチルトランスフェラーゼ3α) 、CDH1 (カドヘリン1) 、OTX2 (Orthodenicle Homeobox 2) 、ZIC2 (Zicファミリーメンバー2) 。また、 OCT4及びNANOGプロモーターは脱メチル化パターンを有し、 hESCのそれら (データは示されていない) のような開いたクロマチンアクセシビリティ状態を有した。加えて、初期継代hCiPSCは、発生多能性関連3 (DPPA3)、 Kruppel様因子17 (KLF17) 及びDNAメチルトランスフェラーゼ3様(DNMT3L) のようないくつかのユニークなマーカーを有した。これらのマーカーは、従来の多能性幹細胞(hESC及びhiPSC) では発現しなかった。最後に、DNAメチル化アッセイによって明らかにされた全体的な修飾は、これらの細胞がhESCと同様のエピゲノム状態を共有することを示した (データは示されていない) 。全体として、これらの結果は、OSN陽性細胞株のトランスクリプトーム及びエピジェネティックなプロファイルが、ヒト多能性幹細胞のプロファイルに類似していることを示している。今後、確立されたOSN陽性細胞株は、ヒト化学的に誘導された多能性幹細胞 (hCiPSC) と呼ばれる。

次に、in vivo及びin vitroにおけるhCiPSCの発生能を特性化した。最初に、hCiPSCを免疫不全マウスに注射し、得られた奇形腫は3つの胚層(内胚葉、外胚葉、中胚葉)の組織を含んでいた (データは示されていない) 。この結果と一致し17て、hCiPSCはin vitroで胚様体を形成し、3つの胚層のマーカー遺伝子(SRY-Box転写因子1、T- (短尿) 及びTUJ1 (ニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリン))を発現した(データは示されていない) 。指向性分化は、hCiPSC系統が造血前駆細胞(図6、A及びB)に分化し、さらにT細胞前駆細胞(図6C)に分化することを示した。加えて、肝細胞もhCiPSCの指向性分化によって生成された(図7A-D)。全体として、これらの結果は、hCiPSCの安定な分化能が、それらが3つの生殖層すべての系統確定細胞を生成することを可能にすることを示す。hCiPSCのゲノム完全性を測定するために、高分解能Gバンド解析を用いて、hCiPSC系統の核型を決定した。データは、それらすべてが正常な二倍体核型(図8及び表3)であることを示した。

さらに、短いタンデム反復分析は、hCiPSCが親の線維芽細胞に由来し、他の確立されたhESC系統とは異なることを確認した。

その後、成人体細胞をhCiPSCに化学的に再プログラムする研究を実施した。追加スクリーニング後、リプログラミング過程を促進する促進因子を同定し(図9 A～C)、成体脂肪由来間葉系間質細胞 (hADSC) からhCiPSCを生成した(図2、A及び現在示されているデータ、及び図9D)。さらに、異なるドナー由来のヒト成体皮膚線維芽細胞 (hASF) をhCiPSCにリプログラミングした(図11A)。成体体細胞由来hCiPSCのトランスクリプトーム及びエピジェネティックなプロファイルは、ヒト多能性幹細胞(図2B～D、図10A～Bに示されていないデータ、及び図11A～Cに示されていないデータ)のものと類似していた。重要なことに、これらの成体体細胞由来hCiPSCは、 in vivo及びin vitroの両方で、全3生殖層の細胞型に分化することもできた(図2E及び図示しないデータ)。さらに、これらの研究は、 8人以上の独立ドナーの体細胞からhCiPSCを再生することに100%成功した (表4) 。

これらの結果は、著者らの低分子アプローチが異なるタイプの成体体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングできることを示す。

ヒト細胞の化学的リプログラミングをさらに理解するために、遺伝子発現を各リプログラミング段階の最後にプロファイリングした。最初に、初期段階 (ステージIとステージII) での可塑性シグネチャの獲得に始まり、続いて胚体外内胚葉 (XEN) プログラムの活性化 (ステージIII)、最後に統合多能性ネットワークの確立 (図14) の3つの連続したキーフェーズがリプログラミング過程で同定された。免疫蛍光と単一細胞RNA配列決定は、ステージIIIで高度に発現したXEN関連マーカーのセットを示した(図12A-B、データは図示せず、図13A-C)。研究はまた、OCT4陽性細胞がXEN様コロニー(図12A及び図示しないデータ)から出現することを示し、XENプログラムがマウス細胞の化学的リプログラミング (8～10) と同様に、後期段階における多能性獲得を橋渡しすることを示した。初期段階では、体細胞遺伝子プログラムのダウンレギュレーションが観察された (初期段階でダウンレギュレーションされた遺伝子:PRRX2, COL6A2 (コラーゲンVI型α2鎖)、 VIM (ビメンチン)、 COL1A1 (コラーゲンI型α1鎖)、 COL1A2 (コラーゲンI型α2鎖)、 RUNX1 (Runt関連転写因子1)、 ZEB1 (亜鉛フィンガーEボックス結合ホメオボックス1)、 PRRX1 (対関連ホメオボックス1)、 MMP3 (マトリックスメタロペプチダーゼ3) )、続いて胚発生と再生に関与する一連の遺伝子のアップレギュレーションが観察された(初期段階でアップレギュレートされた遺伝子:FOXC1 (フォークヘッドボックスC1)、 KRT19 (ケラチン19)、 KRT8 (ケラチン8)、 KRT18 (ケラチン18)、CDC7 (細胞分裂サイクル7) 、KDR (キナーゼインサートドメイン受容体) 、VASH2 (バソヒビン2) 、MARCKSl1 (MARCKS関連蛋白質) 、SOX4 (MARCKS関連蛋白質) 、FGF9 (線維芽細胞増殖因子9) 、CDKN1C (サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1C) 、FGFR3 (線維芽細胞増殖因子受容体3) 、LIN28A (lin-28ホモログA) 、BMP4 (骨形成蛋白質4) 、LIFR (白血病阻害因子受容体) 、CCND2 (サイクリンD2) 、EFNB1 (エフリンB1) 、LEF1 (リンパエンハンサー結合因子1) 、WT1 (ウィルムス腫瘍1) 、NOTCH1 (神経遺伝子座ホモログ蛋白質1) 、SALL4 (スパルト様転写因子4) 、IGFBP3 (インスリン様成長因子結合蛋白質3)、 HMGA2 (高移動度群AT-hook蛋白質2)、 GATA2 (GATA結合蛋白質2)、 MSX1 (mshhomeobox 1)、 EDN3 (エンドセリン3)、 TBX3 (T-box転写因子3)、TBX2 (T-box転写因子2)、 HOXA1 (homeobox A1)、 ZAP70 (T細胞受容体関連プロテインキナーゼ70のゼータ鎖)、 HOXA5 (homeobox A5)、 HOXB9 (homeobox B)、 HOXA9 (homeobox A)、 IGF2 (インスリン様成長因子2)、 PGF (胎盤成長因子)、 PTCH1 (パッチ1)、 PROK1 (プロキネチシン1)、 CNTFR (毛様神経栄養因子受容体)、HEY2 (YRPWモチーフを持つhes関連ファミリーbHLH転写因子2)、 CDX2 (尾型ホメオボックス2)、 DLX5 (遠位レスホメオボックス5)、 IGFL4 (IGF様ファミリーメンバー4)、 PRAME (PRAME核内受容体転写調節因子)、 GLI1 (GLIファミリー亜鉛フィンガー1;図3 A及び図3Eも参照)はいずれも自然再生で起こる脱分化に類似していた (17～19) 。さらに、細胞増殖の増加(図3A及び図E)は重要な細胞脱分化と再生の特徴を示した (17～19) 。特に、初期段階で活性化されたSALL4とLIN28Aは、いくつかの生物における組織修復と再生開始の重要なプロモーターである (20～23) 。注目すべきことに、 tクロマチンアクセシビリティ解析は、発生と多能性を調節する遺伝子を含む遺伝子座がステージII (図3B及びデータは図示せず、図3G)で開かれることを示した。加えて、細胞はステージII (図3C及び図D)で低メチル化エピジェネティック状態も獲得し、胚発生、細胞周期及び幹細胞増殖に関連する遺伝子のプロモーター領域は脱メチル化された(図3E)。全体として、これらの結果は、細胞が多能性状態に再プログラムされることを許可すると、低分化でより可塑的な状態の初期段階の誘導を示唆する (図14) 。

化学的再プログラムでは、マウス細胞と比較して、初期段階でのヒト体細胞可塑性の解放はより困難であり、これは、可塑性電位が低下したヒト体細胞 (13～14) が外部シグナル伝達刺激に特に抵抗性であるという報告 (15) と一致する。段階的化学的再プログラム戦略を用いて、ここでの研究は、ヒト体細胞可塑性シグネチャを効果的に調節することができた。段階的化学的再プログラム戦略を用いて、ヒト体細胞可塑性シグネチャを効果的に調節した。ステージIでは、 CHIR99021, 6161452又はTTNPBの除去はLIN28A活性化を著しく低下させ、体細胞プログラムのダウンレギュレーションを阻害した(図4A及び図15A～C)。ステージIIでは、 JNKIN8はSALL4 (図4C及び図16A-C)の活性化と可塑性シグネチャ(図示しないデータ、図4F、図4H及び図19B及びC)の獲得に必要であり、一方、細胞は低メチル化状態(図4G及びH)の発生に5‐アザシチジンを必要とした。加えて、クロマチンアクセシビリティ解析は、 JNKIN8がステージII (図4F及びH)で活性化した遺伝子の開いたクロマチン状態に必須であることも確認した。さらに、これらの因子(CHIR99021、616452、TTNPB、JNKIN8及び5-アザシチジン)のいずれかを除去すると、 hCiPSCの生成は大きく損なわれ(図4B及びD)、それらがすべて多能性ネットワークのための細胞可塑性の確立に不可欠であることを示唆した。これらの研究は、低分子が密接にロックされた分化状態から細胞運命転換(図4I)を可能にする可塑性状態へヒト体細胞を解放するのに十分な内因性経路とエピジェネティック標的を相乗的に操作できることを示した。これらの知見は、ヒト体細胞可塑性ポテンシャルが比較的単純な手順の外部刺激を介して、遺伝子操作なしでin vitroとin vivoで再起動できる、治療的リプログラミングの新しい可能性を提供する。

要約すると、これらの研究は、ヒト体細胞の多能性幹細胞への改良された化学的リプログラミングを報告しており、それは疾患モデリング、創薬、及び再生医療 (24～25) において広範な応用がある。加えて、本結果は、ヒト体細胞の制限された後成的ランドスケープを、主要な生物活性を阻害/活性化する低分子の選択セットを用いた外部化学的操作によって解放し、多能性状態に変換できることを示した。重要なことに、これらの結果は、卵母細胞の細胞質成分を必要とする核移植プロセス (26) とは根本的に異なり、細胞の内部転写因子の過剰発現に依存するアプローチ (27‐29) とも異なる、外部化学的摂動による細胞運命リプログラミングの新しい概念を明らかにする。したがって、これらの研究は、ヒト細胞運命を変換し、細胞リプログラミングを探索するための新しいプラットフォームを提供する。さらに、ヒト体細胞の化学的リプログラミングは、臨床グレードの細胞製造 (30) に近い患者特異的幹細胞を製造する新しい方法と、再生医療における異なる応用のための容易な調整を可能にする柔軟な低分子組み合わせの利点を提供する。

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Claims

ヒト体細胞を化学的に誘導されたヒト多能性細胞(hCiPSC) にリプログラミングする方法であって、
4段階の細胞培養プロセスにおけるヒト体細胞の培養を含み、
(a) ステージIは、以下の生物活性を有する低分子を補充した細胞培養培地中で、細胞を単層上皮様細胞に変換するために効果的な時間、体細胞を培養することを含み:
(i) グリコーゲンキナーゼ阻害剤、
(ii) TGFβ阻害剤、及び
(iii) レチノイン酸受容体 (RAR) アゴニスト (ステージI状態)；
(b) ステージIIは、以下の生物活性を有する低分子を添加した細胞培養培地で、1つ以上の多能性関連転写因子を上方制御するために効果的な時間、ステージIの細胞を培養することを含み:
(i) グリコーゲンキナーゼ阻害剤、
(ii) TGFβ阻害剤、
(iii) レチノイン酸受容体 (RAR) アゴニスト、
(iv) Gタンパク質共役Smoothened受容体のためのアゴニスト、及び
(v) c-Junキナーゼ阻害剤 (ステージII条件);
(c) ステージIIIは、以下の生物活性を有する低分子を補充した細胞培養培地でステージIIの細胞を、OCT4の発現によって測定される初期多能性ネットワークを確立するために有効な時間、培養することを含み:
(i) ヒストンアセチル化/脱アセチル化酵素阻害剤、
(ii) TGFβ阻害剤、
(iii) MAPK阻害剤、及び
(iv) SAHヒドロラーゼ阻害剤 (ステージIIIの状態) で、;並びに
(d) ステージIVは、以下の生物活性を有する低分子を補充した細胞培養培地で、OCT4、SOX2、及びNANOGの共発現によって測定された、多能性ネットワークを完全に確立するために有効な時間、ステージIIIの細胞を培養することを含む、方法
(i) B-Raf阻害剤、及び
(ii) MAPK阻害剤 (ステージIV条件 )。
ステージI条件が、以下の生物活性を有する1つ以上の低分子を細胞培養培地に補充することをさらに含み、
(i) Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、
(ii) 受容体チロシンキナーゼ阻害剤、
(iii) Gタンパク質共役Smoothened受容体のアゴニスト、
(iv) Dot1L阻害剤、
(v) Jak1/Jak2阻害剤、
(vi) SAH加水分解酵素阻害剤、
(vii) メニン-MLL相互作用阻害剤
そして任意選択的に、ステージII条件はさらに、以下の生物活性を有する1つ以上の低分子を細胞培養培地に補充することを含み、
(i) DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、
(ii) ヒストン脱メチル化阻害剤、
(iii) Rho結合コイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、
(iv) 受容体チロシンキナーゼ阻害剤、
(v) G9a阻害剤、
(vi) BMP受容体/AMPK阻害剤、
(vii) Jak1/Jak2阻害剤、
(viii)p38 MAPK阻害剤
(ix) CBP/p300ブロモドメイン阻害剤、及び
(x) メニン-MLL相互作用阻害剤、
そして任意選択的に、ステージIII条件はさらに、以下の生物活性を有する1つ以上の低分子を細胞培養培地に補充することを含み:
(i) グリコーゲンキナーゼ阻害剤、
(ii) Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、
(iii) ヒストン脱メチル化阻害剤、
(iv) Dot1L阻害剤、及び
(v) SETD8阻害剤
そして任意選択的に、ステージIV条件はさらに、以下の生物活性を有する1つ以上の低分子を細胞培養培地に補充することを含む、請求項1に記載の方法
(i) Wnt阻害剤
(ii) グリコーゲンキナーゼ阻害剤
(iii) Rho関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼ (ROCK) の選択的阻害剤、及び
(iv) ヒストンアセチル化酵素/脱アセチル化酵素阻害剤。
前記細胞がステージIの状態で4～12日の期間維持される、請求項1～2のいずれか1項に記載の方法。
前記細胞がステージIIの状態で8～20日の期間維持される、請求項1～2のいずれか1項に記載の方法。
前記細胞がステージIIIの状態で8～12日の期間維持される、請求項1～2のいずれか1項に記載の方法。
前記細胞がステージIVの状態で6～8日の期間維持される、請求項1～2のいずれか1項に記載の方法。
前記体細胞が成体体細胞であり、ステージIの状態が5% O₂で特徴付けられる低酸素下で実行される、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
前記グリコーゲンキナーゼ阻害剤が、CHIR99021、SB-216763、CHIR 99021三塩酸塩、BIO-アセトキシム、GSK-3β阻害剤XII、GSK-3阻害剤XV、TD114-2、TD114-3、IM12、CHIR98014及びSB-415286からなる群から選択される、請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
TGFβ阻害剤が、616452、A 83-01、SB431542、SB 505124、GW 788388、ドルソモルヒネ及びSB 525334からなる群から選択される、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
レチノイン酸受容体 (RAR) アゴニストが、TTNPB、Ch55及びAM580からなる群から選択される、請求項1～9のいずれか1項に記載の方法。
Rho関連コイルドコイル含有蛋白質キナーゼ (ROCK) の阻害剤が、Y27632、ファスジル又はチアゾビビンである、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法。
受容体チロシンキナーゼ阻害剤が、ABT 869、AG1296及びバラタニブからなる群から選択される、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法。
Gタンパク質共役Smoothened受容体に対するアゴニストが、SAG、プルモルファミン、Hh-Ag1.5又はヒトSHHである、請求項1～12のいずれか1項に記載の方法。
存在する場合、(a) DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤が5-アザシチジン、デシタビン及びRG108からなる群から選択され、 (b) ヒストンデメチル化阻害剤がトラニルシプロミン、GSK2879、LSD-C76、S2101、RN1からなる群から選択され、及び (c) c-Junキナーゼ阻害剤がJNKIN8、Sp600125、JNK-in-5;JNK-in-7及びJNK-in-12からなる群から選択される、請求項1～13のいずれか1項に記載の方法。
存在する場合、 (a) Dot1L阻害剤がEPZ004777、EPZ5676及びSGC0946からなる群から選択され、 (b) SAHヒドロラーゼ阻害剤がDZNep、Adox及びNepAからなる群から選択される、請求項1～14のいずれか1項に記載の方法。
存在する場合、 (a) ヒストンアセチル化酵素/脱アセチル化酵素阻害剤が、バルプロ酸、MS275、LMK235、酪酸、アピシジン、CI 994、デプシペプチド、ナトリウム、4-ペヒニル酪酸、酪酸ナトリウム及びUF 010からなる群から選択され、 (b) MAPK阻害剤がPD0325901、AZD8330及びTAK-733からなる群から選択される、請求項1～15のいずれか1項に記載の方法。
ヒト体細胞が、血液起源細胞、皮膚由来細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉起源細胞、実質細胞(例えば肝細胞)、神経細胞及び結合組織細胞からなる群から選択される、請求項1～16のいずれか1項に記載の方法。
体細胞が、線維芽細胞及び脂肪由来体細胞(例えば、脂肪細胞)からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
存在する場合、 (a) B-Raf阻害剤がSB590885、ソラチニブ及びGDC0879からなる群から選択され、 (b) Wnt阻害剤がIWP-2、WNT-C59、XAV-939及びIWR-1からなる群から選択され、
任意選択的に、
(i) ステージIの低分子は、以下の組み合わせから選択され:CHIR 99021+616452+TTNPB、CHIR 99021+616452+CH 55、CHIR 99021+616452+AM 580、CHIR 99021+A 8301+TTNPB、CHIR 99021+SB 431542+TTNPB、TD 114-2+616452+TTNPB、CHIR 98014+616452+TTNPB、GSK3bi XV+616452+TTNPB、
(ii) ステージIIの低分子は、以下の組み合わせから選択され:CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-7、CHIR 99021+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-12、CHIR 99021+616452+TTNPB+Purmorphamine+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+TTNPB+Hh-ag-1.5+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+CH 55+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+616452+AM 580+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+A 8301+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+SB 431542+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 99021+LY 2109761+TTNPB+SAG+JNK-in-8、TD 114-2+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、CHIR 98014+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、GSK3bi XV+616452+TTNPB+SAG+JNK-in-8、
(iii) ステージIIIの低分子は、以下の組み合わせから選択され:VPA+Dznep+PD 0325901+616452、VPA+Dznep+AZD 8330+616452、VPA+Dznep+TAK 733+616452、VPA+Dznep+トラミチニブ+616452、VPA+Adox+PD 0325901+616452、VPA+Nepa+PD 0325901+616452、MS 275+Dznep+PD 0325901+616452、LMK 235+Dznep+PD 0325901+616452、酪酸塩+Dznep+PD 0325901+616452、及び/又は
(iv) ステージIVの低分子は、PD 0325901+SB 590885、PD 0325901+ソラチニブ、PD 0325901+GDC 0879、AZD 8330+SB 590885、AZD 8330+ソラチニブ、AZD 8330+GDC 0879、TAK 733+SB 590885、TAK 733+ソラチニブ、TAK 733+GDC 0879、トラミチニブ+SB 590885、トラミチニブ+ソラチニブ、トラミチニブ+GDC 0879の組み合わせから選択される、
請求項1～18のいずれか1項に記載の方法、
請求項1～19のいずれか1項に記載の1つ以上のステージを含む方法により得られる細胞であり、例えば、 (i) ステージIの培養により得られる上皮様細胞であって、初期ステージMMP1、ZEB1、VIM、COL1A1、COL5A1、COL6A2、PRRX1、SNAI2、TWIST1及びTWIST2における少なくとも1つの遺伝子のダウンレギュレーション、及びLIN28A及びKRTに関連する少なくとも1つの遺伝子、例えばKRT8、KRT18、KRT19及びLIN28Aのアップレギュレーションを特徴とする細胞;
(ii) SALL4及びLIN28Aの少なくとも1つを発現し、開放されたクロマチン座の数が増加し、DNA脱メチル化が増加したロック解除されたエピゲノム状態を有することを特徴とする、ステージI及びステージIIの培養により得られた再生プログラムを有する可塑性状態細胞;
(iii) 少なくとも1つの遺伝子LIN28A、SALL4及びOCT4のアップレギュレーション及びXEN (胚外内胚葉) 関連マーカー、例えば、GATA6、SOX17、FOXA2、HNF1B、APOA1及びAPOA2の少なくとも1つの発現を特徴とする、ステージI、ステージII及びステージIIIの培養により得られたXEN様細胞;及び/又は
(iv) コア多能性転写因子OCT4、SOX2、DNMT3B、DPPA4、UTF1、ZFP42、ZIC3及びNANOGとともに、少なくとも1つの表面マーカーTRA-1-60、TRA-1-81及びSSEA-4を発現することを特徴とする化学的誘導ヒト多能性幹細胞。
化学的誘導ヒト多能性幹細胞がさらにTRA-1-60、TRA-1-81及び/又はSSEA-4を発現する、請求項20に記載の細胞。
化学的誘導ヒト多能性幹細胞が20継代以上、例えば、細胞培養において最大25、30、35、40、41、42継代まで拡張できることを特徴とする、請求項20又は21に記載の細胞。
ステージSIVの最後に誘導された初代化学的誘導ヒト多能性幹細胞が、発生多能性関連3 (DPPA3) 、Kruppel様因子17 (KLF17) 及びDNAメチルトランスフェラーゼ3様 (DNMT3L) からなる群から選択される少なくとも一つの因子を発現する、請求項20～22のいずれか一項に記載の細胞。
ヒト体細胞を化学的誘導ヒト多能性細胞にリプログラミングするための細胞培養培地組成物又はキットであって、請求項1～19のいずれか一項に記載のステージI～IVの1つ以上の分子の組み合わせを含む、細胞培養培地組成物又はキット。
請求項20～23のいずれか一項に記載の細胞を調製するための、請求項24に記載の組成物又はキット。
ヒト体細胞の多能性細胞への化学的リプログラミング。