CN108934168B

CN108934168B - 用于将非多能细胞重编程为多能干细胞的改进方法

Info

Publication number: CN108934168B
Application number: CN201580084912.4A
Authority: CN
Inventors: 邓宏魁; 赵扬; 赵挺; 关景洋; 张旭; 傅瑶; 叶俊青
Original assignee: Beijing Hongguan Regenerative Medicine Technology Co ltd; Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Hongguan Regenerative Medicine Technology Co ltd; Beibei Stem Cell And Regenerative Medicine Translational Research Institute Co ltd
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2015-11-30
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2035-11-30
Also published as: US20220025321A1; CN108934168A; EP3384007A4; EP3384007C0; WO2017091943A1; EP3384007B1; US20190282624A1; EP3384007A1

Abstract

本文提供多能性化学诱导剂(CIP)，其包括糖原合成酶激酶抑制剂、TGFβ受体抑制剂、环AMP激动剂和S‑腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂或组蛋白乙酰化剂。本文还提供了通过使用这样的多能性化学诱导剂在诱导部分或完全分化的细胞中的多能性的方法。所述方法包括：(i)使细胞与CIP接触足够的时间段以使得将细胞重编程为具有ESC样特征的多能干细胞(CiPSC)。分离的化学诱导的多能干细胞(CiPSC)和通过CiPSC的诱导分化产生的它们的子代可以在多种应用中使用，包括但不限于细胞治疗和组织工程。

Description

用于将非多能细胞重编程为多能干细胞的改进方法

发明领域

本发明总体上涉及用于将真核细胞重编程为多能细胞的小分子组合物和方法。

发明背景

多能干细胞，如胚胎干细胞(ESC)，可以自我更新并且分化为所有体细胞类型。已经通过向卵母细胞中的核移植或通过限定因子的异位表达将体细胞重编程而成为多能性的。(Wilmut等，Nature，385：810-813(1997)；Takahashi等，Cell，126：663-676(2006)；Yamanaka等，Nature，465：704-712 (2010)和Stadtfeld等，Genes Dev.，24：2239-2263(2010))。然而，外源多能性相关因子，尤其是Oct4，在这些用于建立多能性的方法中是不可缺少的 (Zhu，Annu.Rev.Biomed.Eng.，13：73-90(2011)；Li，CellRes.，21：196-204 (2011)和Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，109：20853-20858(2012))。此外，在这些重编程方法中对致肿瘤基因(tumorigenic gene)如c-Myc的要求产生了诱导癌细胞的风险。因此，重编程策略已经引起了对临床应用的担忧。(Saha等，Cell Stem Cell，5：584-595(2009)和Wu等，Cell Biol.， 13：497-505(2011))。

在PCT/CN2014/081961中公开了可以驱动体细胞重编程为多能细胞的小分子。小分子具有优点，因为小分子更容易透过细胞，它们是非免疫原性的、更节省成本、并且更容易合成、保存、和标准化。对于例如通过减少总重编程时间和/或增加在相同时间长度内得到的重编程的细胞的数量来增加重编程效率的将非多能细胞化学重编程为多能细胞的方法，仍然存在需求。

本发明的目的是提供可以用于将部分或完全分化的细胞重编程为多能细胞的小分子的组合。

本发明的另一个目的是提供具有提高的效率的将部分或完全分化的细胞重编程为多能细胞的方法。

发明概述

公开了用于提高将非多能细胞化学诱导为多能细胞的效率的组合物和方法。所述方法基于在重编程阶段期间准备用于向多能性转化的中间细胞群体(XEN样细胞)的发现、优先将部分或完全分化的细胞偏置(bias)为 XEN样状态并且随后将XEN样细胞重编程为多能细胞的小分子组合、以及所需的重新接种浓度/密度。因此，通过选择对部分或完全分化的细胞向 XEN样状态的转化进行偏置/富集的小分子，将XEN样细胞重编程为多能细胞的小分子、和适当的重新接种浓度，在所得到的群落数量和重编程时间方面，使部分或完全分化的细胞重编程的效率提高。

因此，已经鉴别了可以用于使部分或完全分化的细胞(包括未被遗传改造以表达一种或多种多能性标记如Oct4并且不自然表达Oct4的细胞)重编程为XEN样状态并且随后重编程为多能细胞增强的小分子混合物。所需的多能性化学诱导剂(CIP)包括(1)糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂，(2)TGFβ受体抑制剂，(3)环AMP激动剂，(4)S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂，(5)组蛋白乙酰化剂/去乙酰化酶抑制剂如丙戊酸(VPA；“V”)，(6)DOT1L 甲基转移酶抑制剂，(7)视黄酸受体(RAR)激动剂，(8)表观遗传调节剂， (9)组蛋白去甲基化抑制剂以及它们的组合。CIP可以单独提供或者作为 CIP组合物而组合提供。一种或多种表观遗传调节剂和视黄酸受体激动剂，例如视黄酸受体配体也可以与CIP一起施用。在一些优选的实施方案中， CIP包含DZNep作为SAH抑制剂。

在优选的实施方案中，GSK抑制剂是氨基嘧啶，CHIR99021(CHIR；“C”)[6-[[2-[[4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈]；TGFβ受体抑制剂是616452(“6”)[2-(3-(6-甲基吡啶-2- 基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶]；cAMP激动剂是毛喉素(Forskolin)(FSK；“F”) 并且SAH抑制剂是3-脱氮瓶菌素(deazaneplanocin)A(DZNep；“Z”)。优选的甲基转移酶抑制剂包括SGC 0946(“S”)(1-[3-[[[(2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基 -5-溴-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基](异丙基) 氨基]丙基]-3-[4-(2，2-二甲基乙基)苯基]脲)和EPZ004777，“1-(3-((((2R，3S，4R，5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3，4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲(“E”)。优选的 RAR激动剂包括AM580(“A”)(4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)。优选的组蛋白去甲基化抑制剂是反苯环丙胺(“T”)。优选的表观遗传调节剂是5-氮杂胞苷(“D”)。

还提供了使不是多能细胞的第一类细胞如体细胞重编程为多能细胞增强的方法。优选的重编程的细胞包括成纤维细胞、脂肪来源的干细胞 (ADSC)、神经来源的干细胞和肠上皮细胞。在优选的实施方案中，所述方法不包括转染要重编程的细胞以使其表达Oct4、KLF4、SOX2、C-Myc或 NANOG中的任一种。在这个实施方案中，所述方法也不包括使要重编程的细胞与多肽如转录因子接触。在本文中所公开的方法包括以下步骤：(a) 使要重编程的细胞与CIP的第一混合物(在本文中，XEN-混合物)接触足够的时间段以将细胞偏置为XEN样细胞群体；(b)使XEN样细胞群体与CIPS 的第二混合物(在本文中，XEN-CiPSC混合物)接触足够的时间段以将细胞重编程为化学诱导的多能干细胞(CiPSC)和(c)在2i培养基中培养细胞。优选在步骤(a)期间将细胞以约50,000-100,000细胞/孔的密度重新接种在6孔板中。2i培养基优选另外包括N2B27。方法任选包括在步骤(a)之后对 EpCAM(上皮细胞粘附分子)阳性细胞进行选择。基于ESC样性质如形态，倍增时间，ESC标记如碱性磷酸酶(AP)、nanog、Rex1、Sox2、Dax1、Sall4、未分化胚胎细胞转录因子(Utf1)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)的表达，细胞分化为三个胚层的组织的能力，将重编程的细胞鉴别为多能细胞。将 CiPSC分离并且可以进一步培养。

分离的化学诱导的多能干细胞(CiPSC)不是天然存在的多能干细胞。 CiPSC拥有ESC样性质如ESC形态，与ESC相似的倍增时间，ESC标记如碱性磷酸酶(AP)、nanog、Rex1、Sox2、Dax1、Sall4、未分化胚胎细胞转录因子(Utf1)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)的表达，细胞分化为三个胚层的组织的能力。CiPSC与ESC不同之处在于，例如它们不直接来源 /分离自胚泡的内部细胞团块。CiPSC与其他诱导的多能干细胞(iPSC)不同之处在于，它们未被改造以表达转基因如表达Oct4、KLF4、SOX2、c-Myc 或NANOG的基因，或未通过包括将它们所获得自的细胞转染以表达这些转基因中的任一种的过程制备。CiPSC与其他诱导的多能干细胞(iPSC)不同之处还在于，它们未通过包括使非多能细胞与一种或多种多肽如Klf、Oct、Myc或Sox接触的过程制备。在优选的实施方案中，CiPSC未被遗传改造，即未通过引入或移除来自细胞的基因元件来改变CiPSC。在 CiPSC、iPSC和ESC之间不存在明显的差异。然而，至少可以通过产生它们的方法、即通过它们的来源将在本文中所公开的CiPSC与ESC区分。在ESC是天然存在的细胞的情况下，如在本文中所描述的，另一方面， CiPSC不是天然存在的并且是通过用小分子的组合处理非多能细胞而得到的。

可以培养或诱导CiPSC以分化为所需类型的细胞。CiPSC和它们的子代可以在多种应用中使用，包括但不限于细胞治疗和组织工程。

附图简述

图1A和1B示出了由被SKM(图1A)或SK(图1B)加化学物质或Oct4 感染的MEF诱导的iPSC群落的数量。误差条，平均值±SD(n＝3个生物学重复孔)。图1C示出了在MEF、SKM-FSK-iPSC和ESC(R1)中的多能性标记基因的RT-PCR分析。图1D示出了SKM-FSK-iPSC和SK-FSK-iPSC 的基因组PCR分析。图1E和1F示出了利用化学处理通过SKM或SK诱导的iPSC群落的JRT-PCR(图1E)和基因组PCR(图1F)分析。缩写：M (2-Me-5HT)；D(D4476)；V(VPA)。Tg表示外源引入的基因。比例尺，100 μM。

图2示出了在MEF、GFP阴性细胞、GFP阳性簇和ESC(R1)中通过 RNA-seq分析检测的多能性相关基因的mRNA水平。在第24天收集GFP 阴性细胞和GFP阳性簇。Cdh1＝E-钙粘着蛋白。

图3是示出在用指定的小分子处理之后的iPSC群落的相对数量的柱状图。(-)对照，DMSO。误差条表示s.d(n≥2)。缩写：PEG2(前列腺素E12)； 5-aza-C(5-氮杂胞苷)；NaB(丁酸钠)。

图4A示出了在第36天的DZNep处理之后诱导的GFP阳性群落的数量。误差条，平均值±SD(n＝2个生物学重复孔)。图4B是由OG-MEF诱导的GFP阳性细胞的FACS分析。左，在初始MEF中不存在GFP阳性细胞；中和右，在第44天通过VC6TF(中)和VC6TFZ(右)诱导的GFP阳性细胞的比例。图4C是示出CiPSC生成的过程的示意图。比例尺，100mm。对于(图4A)来说，在第12天重新接种用于重编程的细胞。图4D示出了在MEF、GFP阳性群落和ESC(R1)中通过RNA-seq分析检测的多能性相关基因的mRNA水平。不同于小鼠ESC群落，这些上皮状并且致密的GFP 阳性群落不能维持在ESC培养条件下并且在第36天收集。图4E示出了在MEF、CiPSC和ESC(R1)中通过RNA-seq分析检测的多能性相关基因的mRNA水平。

图5A-K示出了在VC6TFZ条件下个体化学物质的浓度和处理持续时间的优化。图5A-G示出了作为如指出的小分子的浓度(在CiPSC诱导期间滴定、)的函数CiPSC细胞的群落的数量。图5H示出了每个小分子的持续时间。图5I-K示出了化学组合的持续时间。在不同的时间点用2i培养基替换化学重编程培养基加VC6TFZ。误差条表示s.d.(n≥2)。

图6A-F示出了提高化学重编程效率或动力学的被验证的小分子。图 6A示出了在MEF中与VC6TFZ组合的提高化学重编程效率或动力学的被验证的小分子。从第0天至第12天加入的化学物质：PGE2、DY131、RG108、 2-Me-5HT和IBMX；在第12天之后加入的化学物质：SF1670、UNC0638 和SRT1720。(-)对照，DMSO。误差条表示s.d.(n≥2)。图6B示出了在 MEF中与C6FZ或VC6TFZ组合的TTNPB对提高化学重编程效率的影响。在第50天和第40天对CiPSC群落进行量化以用于分别通过C6FZ和 VC6TFZ进行化学重编程。在第24天和第16天对iPSC群落进行量化以用于分别进行OSK诱导的和OSKM诱导的重编程。误差条表示s.d.(n＝ 3)。图6C示出了在MEF中与VC6TFZ组合的TTNPB对提高化学重编程动力学的影响。在指定的天数对GFP阳性群落进行量化。(-)对照，VC6TFZ。误差条表示s.d.(n＝3)。图6D-F示出了针对CiPSC的基因组PCR分析。

图7A-D示出了基因组PCR和DNA印迹分析，其显示CiPSC不含转基因污染。图7A和B示出了所使用的两组病毒载体的基因组PCR。图7C 是检测病毒整合事件的DNA印迹分析。基于psi序列设计DNA探针以靶向pLL3.7-AU6和tet-on载体二者。分析CiPSC并且使用Tet-O-iPS、 pLL-O-iPS和MEFS作为对照。图7D示出了用于DNA印迹的溴化乙锭染色的凝胶。

图8A-B示出了通过从VC6TFZ移除个体化学物质诱导的GFP阳性(图 8A)和CiPSC(图8B)群落的数量。三个独立实验的结果以不同颜色(白色、灰色、和黑色)示出。

如通过RT-PCR示出的，图9A示出了在与MEFS相比不同的CiPS细胞克隆中的多能性标记表达。图9B示出了CiPSC的生长曲线。图9B-D 示出了在MAF-CiPS细胞、ADSC-CiPSC和MNF-CiPSC中的多能性标记的RT-PCR分析。

图I0A示出了由CiPSC生成的嵌合体的存活曲线。n，所研究的嵌合体的总数。图10B和10C示出了通过定量实时PCR测量的在NSC-CiPSC (A)和IEC-CiPSC(B)中的多能性基因表达(误差条，平均值±SD，n＝3)。

图11A-B示出了通过实时PCR测量的多能性相关基因(图11A)和 Gata6、Gata4、和Soxl7 (图11B)的表达。图11C-D示出了通过实时PCR 验证的Sall4、Sox2、Gata6、Gata4和Sox17的表达。与在第0天在MEF 中的表达相比，在第4、8、12、16、20和24天(图11C)或在12h时(图11D) 的Sall4、Sox2、Gata6、Gata4和Sox17表达的倍数发生变化。误差条表示s.d.(n＝2)。图11E-I示出了个体和组合化学物质或从VC6TF(或 VC6TFZ)中取出化学物质对基因表达的影响。图11E-F示出了在第12天个体和组合化学物质对Sall4和Sox2的表达的影响。图11G-H示出了在第 12天从VC6TF中移除化学物质对Sall4和Sox2的表达的影响。图11I示出了在第32天从VC6TFZ中取出个体化学物质(CHIR、616452和FSK) 对多能性标记基因的表达的影响。图11J示出了在第32天从VC6TFZ中取出个体化学物质(CHIR、616452和FSK)对Gata6、Gata4和Soxl7的表达的影响。误差条表示s.d.(n＝2)。图11K示出了在第32天在存在和不存在DZNep的情况下的多能性相关基因的表达。图11L示出了在第32天在存在和不存在DZNep的情况下的H3K9甲基化。

图12A-B示出了通过实时PCR验证的在诱导后第4天在MEF中的 Sall4(图12A)和Sox2(图12B)的相对表达水平。误差条表示s.d(n＝2)。图 12C示出了在用Sall4或/和Sox2质粒转染的MEF中检查Oct4启动子驱动的荧光素酶活性。误差条表示s.d.(n＝3)。图12D-E示出了在从VC6TFZ 中移除C6F的情况下通过Sall4和Sox2的过度表达诱导的Oct4活化(图12D) 和GFP阳性和iPSC群落的数量(图12E)。

图13A-D示出了在第24天由Sall4、Gata6、Gata4或Sox17的敲除导致的基因表达变化。图13A示出了由Sall4、Gata6或Gata4敲除导致的Sall4、Gata6和Gata4的相对表达变化。图13B示出了由Sox17敲除导致的Sox17、Sall4、Gata6、Gata4和Oct4的相对表达变化。图13C示出了由Sall4、Gata6或Gata4的敲除导致的Sox17的相对表达变化。图13D示出了由Sall4、Gata6或Gata4的敲除导致的Sox2的相对表达变化。误差条表示s.d.(n＝2)。图13E-F示出了Sall4、Gata6或Gata4敲除对Oct4 的表达和iPSC形成的影响。图13E示出了在第32天由Sall4、Gata6或 Gata4敲除导致的Oct4表达变化。误差条表示s.d.(n＝2)。图13F示出了当在化学重编程期间敲除Sall4、Gata6或Gata4时的GFP阳性和iPSC群落的数量。误差条表示s.d.(n＝3)。图13G是示出在化学重编程期间多能性回路的分步建立的示意图。

图14A-B示出了在化学重编程期间DZNep的生物活性。图14A示出了通过HPLC分析测量的与在MEF中相比的SAH与SAM的细胞内水平的相对比例。误差条表示s.d.(n＝2)。图14B示出了与VC6TF处理组合使用SAH水解酶抑制剂(Nep A、Adox和DZA)代替DZNep诱导CiPSC生成。误差条表示s.d.(n＝3)。缩写：HPLC(高效液相色谱法)。图14C示出了通过蛋白印迹分析而分析的EZH2的蛋白质水平。图14D示出了通过VC6TF 加shRNA或DZNep诱导的iPSC群落的数量。误差条表示s.d.(n＝3)。图 14E示出了实时PCR，其显示在对Ezh2进行shRNA介导的敲除之后Ezh2 被阻遏。误差条表示s.d.(n＝2)。图14F示出了与在MEF中的那些相比的相对细胞内cAMP水平。图14G示出了由2’5’ddAdo导致的腺苷酸环化酶的抑制对通过VC6TFZ生成的CiPSC群落的数量的影响。(-)对照，DMSO。图14H-J示出了在CiPSC诱导期间用cAMP类似物(DBcAMP，使用/不使用IBMX)代替FSK并且伴随VC6T加DZNep(VC6TZ)处理、或用磷酸二酯酶抑制剂(咯利普兰(Rolipram)和IBMX)代替FSK与VC6TZ组合对化学重编程的影响。图14K是在使用指定化学物质的MEF处理之后的细胞内 cAMP水平的量化。误差条表示s.d.(n≥2)。图14L示出了在NSC和IEC 细胞中在化学重编程的前20天期间616452浓度的影响(误差条，平均值±SD，n＝3)。图14M示出了CiPSC的生长曲线。来自第6代的 NSC-CiPSC-2；来自第7代的NSC-CiPSC-5；来自第10代的IEC-CiPSC-4；和来自第7代的IEC-CiPSC-10。图14N示出了用于OG MEF的化学重编程的获得自不同RAR激动剂的CiPSC群落。13-顺式-RA，2μM；9-顺式 -RA，2μM；ATRA，全反式视黄酸，2μM；AM 580，0.01μM；TTNPB， 2μM；Ch 55，1μM。

图15A是在化学重编程系统的开发中的主要步骤的示意图。蓝色六边形表示重编程转录因子，并且红色正方形表示在每个步骤鉴别的主要小分子。重编程增强剂在右侧显示，对应于不同的重编程条件。备选的Oct4 替代物D4476和2-Me-5HT在FSK下方显示。缩写：O(Oct4)、S(Sox2)、 K(Klf4)、M(c-Myc)、Tranyl(反苯环丙胺)。图15B和15C示出了通过定量实时PCR测量的分别来自在第0天(D0)、第4天(D4)和第16天(D16) 的NSC(图15B)和IEC(图15C)的在化学重编程早期的Sall4、Gata4和 Soxl7基因的表达。图15D和15F通过具有不同浓度的616452的化学混合物示出了在第16天(图15F)和第20天(图15D)的Sall4、Gata4和Sox17 基因的表达(误差条，平均值±SD，n＝3)。图15E示出了通过定量实时PCR 测量的来自NSC(分别为第0天(D0)、第4天(D4)、第12天(D12)、第16 天(D16)和第20天(D20))的在化学重编程期间的多能性基因Sall4、Lin28、 Esrrb、Dppa2和Oct4的表达。图15G示出了通过在MEF、IEC和NSC 中的RNA-seq分析检测的Sall4、Gata4、Gata6和Sox17基因的mRNA水平。

图16A示出了在8个实验批次中从上皮群落的内部(蓝色)和外部(红色) 生成的CiPSC群落的数量。对于实验#5和#7来说，上皮群落的细胞汇合 (confluence)小于20％。图16B示出了在MEF、阶段1(第16天)和阶段2(第 28天)末期的细胞和eXEN(胚胎来源的XEN细胞)中的XEN细胞标记 (Gata4、Gata6、Sox17、Sox7、Sall4)和多能性标记Oct4的qRT-PCR分析。图16C示出了来自在第20天(在化学重编程的阶段2中)分选的EpCAM阴性(-)、EpCAM阳性(+)和总细胞群体的在阶段3的末期生成的CiPSC群落数量。图16D示出了由在第12天(在化学重编程的阶段1中)的FACS分选之后的阳性(+)、阴性(-)群体和总细胞生成的在第16天的XEN样群落数量。误差条表示SD(n≥2)。图16E示出了由神经干细胞(NSC，左)、由指定群体和肠上皮细胞(IEC，右)诱导的CiPSC群落数量。分别在第13天(对于 IEC来说)和第20天(对于NSC来说)通过FACS对EpCAM阴性(-)、阳性 (+)和总群体进行分选。

图17A示出了在用DMSO和VC6TF(CHIR，10μM和20μM)处理12 天之后SALL4和GATA4双阳性群落的数量。图17B示出了在用VC6TF (CHIR，10μM和20μM)处理12天之后XEN细胞标记(Gata4、Gata6、 Sox17、Sall4)表达的qRT-PCR分析。将eXEN设定为阳性对照。图17C 示出了在VC6TF(CHIR，10μM和20μM)处理12天之后MET标记 (EpCAM、Cdh1)表达的qRT-PCR分析。图17D示出了用对照混合物(具有 CHIR的VC6TF，20μM)和用额外的小分子EPZ004777(E)和AM580(A)处理16天之后XEN样群落数量和相位图。在第12天以1∶2将细胞重新接种。图17E示出了在阶段1期间用不同的小分子混合物处理的细胞中的Sall4 表达的qRT-PCR分析。图17F示出了用VC6TF(CHIR，20μM)和 AM580(A)、EPZ004777(E)或A加E诱导12天的XEN细胞标记(Gata4、 Gata6、Sox17、Sox7和Sall4)表达的qRT-PCR分析。将eXEN设定为阳性对照。图17G示出了在用VC6TF(CHIR、20μM)、用AM580、 EPZ004777(EPZ)和它们的组合处理12天之后SALL4和GATA4双阳性群落的数量。图17H示出了在用VC6TF(CHIR，20μM)和用AM580(A)、EPZ004777(E)和A加E处理12天之后MET标记(Cdh1、EpCAM)表达的 qRT-PCR分析。图17I示出了在阶段1期间通过不同的小分子混合物处理的细胞中的Gata4、Gata6、Sox17、Lin28a、EpCAM和Cdh1表达的qRT-PCR 分析。将eXEN和CiPSC设定为对照。误差条表示SD(n≥2)。图18A示出了在12天的阶段2中用对照混合物(VC6TFZ)和用5-aza-dC、5-aza-dC 加EPZ004777(EPZ)或SGC0946(SGC)诱导的CiPSC群落在第44天的数量。图18B和C示出了在阶段2中在用对照(VC6TFZ)和用EPZ004777(EPZ) 或SGC0946(SGC)处理的情况下的CiPSC群落的数量以及在阶段3中在用不同组分处理的情况下在2i培养基中的CiPSC群落的数量。图18D示出了来自在第12天重新接种的在每个孔(6孔板)中不同密度的细胞的在重编程末期的CiPSC群落的数量。#1和#2是两个独立的实验。图18E示出了在阶段2中具有不同时间过程的在重编程末期的CiPSC群落的数量。误差条表示SD(n≥3)。图18F示出了5-aza-dC的浓度(左)和持续时间(右)的影响。5-aza-dC在阶段2中加入。图18G示出了SGC0946(SGC)的浓度(左) 和持续时间(右)的影响。SGC在阶段2中加入。图18H示出了在第40天通过新型方案在5个批次的实验中重编程为CiPSC群落的XEN样群落的百分比，和通过新型方案在3个批次的实验中在XEN样群落内部(蓝色) 和外部(红色)生成的CiPSC群落的数量。误差条表示SD(n≥2)。

图19A是在本研究中的新型方案和在Hou等，2013中公开的方案的示意性比较。在使用初始方案的60天的诱导中，由初始的50,000个成纤维细胞诱导总计1-40个CiPSC群落(在2个孔中)。然而，在使用新型方案的40天小分子处理之后，由初始的50,000个成纤维细胞得到1,000-9,000 个CiPSC群落(在10-15个孔中)。图19B是之前描述的方案(无XEN样状态偏置)和利用CEN样状态的优点的方案在分别由新生小鼠成纤维细胞 (MNF，左)和成体小鼠成纤维细胞(MAF，右)诱导的原代CiPSC群落数量 (第40天)方面的比较。图19C示出了在针对每个阶段缩短的持续时间下生成的CiPSC群落的数量。例如，“12+10+6”表示对于阶段1来说12天、对于阶段2来说10天、和对于阶段3来说6天的连续持续时间。CiPSC 诱导所需的最小时间过程是26天(12+8+6)，通过其得到一个CiPSC群落。图19D示出了在通过新型方案诱导的CiPSC群落中的、通过qRT-PCR分析的多能性标记表达。

图20A示出了通过qRT-PCR检查的、在化学重编程期间的指定时间点的多能性相关基因(Oct4、Sox2、Nanog、Sall4、Lin28a、Zfp42、Dppa2、 Esrrb)和MET相关基因(Cdh1、EpCAM)的动态表达变化。图20B是在指定时间点的Sall4和Gata4、Gata4和Sox17、和Sall4和Sox2各自的表达的单细胞qRT-PCR分析的散点图。基因表达水平以log2(在这些样品中相对于最低水平的倍数变化)表示。图20C是通过qRT-PCR测量的在化学重编程(上)和OSKM诱导的重编程(下)期间的指定时间点的XEN相关基因表达模式的比较。将CiPSC、4F-iPSCs、ESC和eXEN设定为对照。图20D 是在用如阶段2中指定的不同混合物处理的细胞中的一些多能性相关基因的qRT-PCR分析。图20E是通过使用化学方法(左)和转基因方法(右)进行体细胞重编程的两种途径的示意图。误差条表示生物学重复和SD(n≥2)。

图21A示出了在化学重编程的第12天敲除Sall4、Gata4、Gata6或 Sox17的SALL4和GATA4双阳性群落的数量。使用非靶向载体shRNA(sh 对照)作为阴性对照。Sh1和sh2表示针对每个基因的两种shRNA载体。图21B示出了相对于用非靶向载体(sh对照)处理的表达通过qRT-PCR测量的敲除Sall4、Gata4、Gata6或Sox17的Oct4在第28天的表达。图21C 示出了敲除Sall4、Gata4、Gata6或Sox17的CiPSC群落的数量。图21D 示出了相对于在非靶向载体(sh对照)中的表达在第16天通过qRT-PCR测量的敲除Sall4、Gata6、Gata4或Sox17的Sall4、Gata4、Gata6和Sox17 的表达。图21E示出了相对于在非靶向载体(sh对照)中的表达在第28天通过qRT-PCR测量的敲除Sall4、Gata6、Gata4或Sox17的Sox2的表达。图21F示出了敲除Sall4、Gata4、Gata6或Sox17的由神经干细胞(NSC) 和肠上皮细胞(IEC)诱导的iPSC群落的数量。图21G示出了通过敲除Sall4、 Gata4、Gata6或Sox17的OSKM诱导的iPSC群落的数量。图21H通过 SALL4(S4)、GATA4(G4)、GATA6(G6)或它们的组合的过度表达在小分子混合物VTAE(从VC6TFAE中取出C6F)处理的存在下示出了XEN样群落的数量。(-)表示在没有XEN相关基因的过度表达的情况下用VTAE处理的细胞。DMSO处理的细胞显示为阴性对照。图21I通过VC6TFAE的处理或Sall4(S4)加Gata4(G4)或Gata6(G6)的过度表达在VTAE的存在下示出了XEN细胞标记Sall4、Gata4、Sox17、Gata6和Sox7的qRT-PCR分析。将eXEN设定为阳性对照。图21J示出了在第20天在VTAE的存在下通过SALL4、GATA4、GATA6和它们的组合的过度表达诱导的Oct4的 qRT-PCR分析。图21K通过SALL4(S4)、GATA4(G4)、GATA6(G6)和SALL4 加GATA6或GATA4在VTAE存在下的过度表达示出了Sox2的表达。图 21L借助Sall4加Gata4或Gata6的表达在VTAEZ的存在下示出了通过在指定时间过程内的Dox诱导的Sox2表达生成的iPSC群落的数量。

误差条表示SD(n≥2)。

图22A示出了通过qRT-PCR测量的XEN相关基因在所指定的不同细胞类型中的相对表达。eXEN-1和eXEN-2是eXEN的两个亚系，其分别维持在XEN培养基(Kunath等，2005)和化学重编程的阶段1培养基中。图22B示出了在不同细胞类型中的总体基因表达谱的分层聚类。将在化学重编程期间的不同时间点(第16、20、26和28天)的XEN样细胞样品表示为D16、D20、D26和D28。对照是两个批次的MEF(MEF-1、MEF-2)、 eXEN-1、eXEN-2、两个CeXEN细胞系(CeXEN-1、CeXEN-2)、两个CiPS 细胞系(CiPSC-1、CiPSC-2)和两个ES细胞系(ESC-1、ESC-2)。图22C示出了在所指定的不同类型的XEN细胞中的EpCAM、Cdh1和Sox2的 qRT-PCR分析。将MEF和ESC设定为对照。图22D示出了在由eXEN诱导的两个CiPSC群落和由CeXEN诱导的两个CiPSC群落中的多能性标记表达的qRT-PCR分析。将MEF和ESC设定为对照。

误差条表示SD(n≥2)。

发明详述

I.定义

如在本文中所使用的术语“化学诱导的多能干细胞”(CiPSC)是指通过使非多能细胞与化合物接触而不是通过一种或多种转染的基因的表达而来源于非多能的细胞的多能细胞，即专能或分化的细胞。

如在本文中所使用的，“培养物”意指在培养基中生长并且任选传代的细胞群体。细胞培养物可以是原代培养物(例如，尚未被传代的培养物)或者可以是传代或继代培养物(例如，已经传代培养或传代一次或多次的细胞群体)。

如在本文中所使用的，“增强”或“增加”重编程的效率意指当与不通过将细胞偏置以编程为XEN样状态进行的化学重编程方法相比时，减少由相同的起始细胞密度、相同的时间长度得到的重编程的细胞的总重编程时间和/或增加所述重编程的细胞的数量。

如在本文中所使用的术语“诱导的多能干细胞”(iPSC)是通过人工方式来源于非多能细胞的多能干细胞类型。CiPSC是iPSC；然而，它们与一些 iPSC不同之处在于它们未被遗传改造。

当涉及CiPSC时，术语“分离的”或“纯化的”意指至少30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或 99％无污染细胞类型如非多能细胞的化学诱导的多能干细胞。分离的干细胞还可以基本不含可溶性、天然存在的分子。

如在本文中所使用的术语“多能性”(或多能的)是指具有分化为三个胚层中的任一种的潜力的干细胞：内胚层(例如，内部胃粘膜、胃肠道、肺)、中胚层(例如，肌肉、骨骼、血液、泌尿生殖器)、或外胚层(例如，表皮组织和神经系统)。术语“非多能的”意指细胞不具有分化为全部三个胚层的潜力。专能干细胞是较低可塑性并且更大程度分化的，并且可以成为在给定器官内的多种类型细胞中的一种。例如，专能血液干细胞可以发育为红细胞祖细胞、白细胞或血小板生成细胞。成体干细胞是专能干细胞。脂肪来源的干细胞是专能的。

如在本文中所使用的“重编程”是指将一种特定细胞类型转化为另一种。例如，可以将非多能的细胞重编程为多能细胞。在使用化合物将非多能细胞重编程为多能细胞的情况下，所得细胞是化学诱导的多能干细胞。

如在本文中所使用的“重编程培养基”是指包含一种或多种多能性化学诱导剂的细胞培养基。

如在本文中所使用的“2i培养基”是指具有糖原合成酶激酶-3和促分裂原活化的蛋白激酶信号传导的双重抑制的ESC培养基，例如补充有2i (CHIR99021和PD0325901)的ESC培养基。

术语“小分子”是指具有小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于1,000道尔顿的分子量的分子，如有机或有机金属化合物。

在本文中使用“XEN样细胞”是指被表征为上皮细胞、并且表达XEN 标记如SALL4、GATA4和SOX17的细胞。当与细胞一起使用时，XEN样状态是指一种或多种XEN标记的表达。

II.组合物

A.诱导多能性的小分子

诱导多能性的化合物，即多能性化学诱导剂(CIP)，包括单独或与蛋白质组合的具有小于2,000道尔顿、更优选小于1,500道尔顿、最优选小于 1,000道尔顿的分子量的小分子。小分子可以具有小于或等于900道尔顿或小于或等于500道尔顿的分子量。可以在化学诱导的重编程、优选靶向相同的通路中使用较大的分子作为在这里确定的小分子。已经证实多种蛋白因子如重组bFGF在之后的方案中有效用于化学重编程。

因此，已经鉴别了可以用于使部分或完全分化的细胞(包括未被遗传改造以表达一种或多种多能性标记如Oct4并且不自然表达Oct4的细胞)重编程为XEN样状态并且随后重编程为多能细胞增强的小分子混合物。所需的多能性化学诱导剂(CIP)包括(1)糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂，(2)TGFβ受体抑制剂，(3)环AMP激动剂，(4)S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂，(5)组蛋白乙酰化剂如丙戊酸(“V”)，(6)DOT1L甲基转移酶抑制剂，(7) 视黄酸受体(RAR)激动剂，(8)表观遗传调节剂，(9)组蛋白去甲基化抑制剂以及它们的组合。CIP可以单独提供或者作为CIP组合物而组合提供。一种或多种表观遗传调节剂和视黄酸受体激动剂，例如视黄酸受体配体也可以与CIP一起施用。在一些优选的实施方案中，CIP包含DZNep作为 SAH抑制剂。

(1).GSK抑制剂

优选的GSK抑制剂是氨基嘧啶，具有化学名[6-[[2-[[4-(2，4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈](“C”)的 CHIR99021，其以约20μM的浓度使用。也可以在本文中所公开的方法中使用其他GSK抑制剂，并且它们包括，但不限于BIO-丙酮肟(例如1μM)； GSK 3I抑制剂XV；SB-216763；CHIR 99021三盐酸化物，其为CHIR99021 的盐酸盐；GSK-3抑制剂IX[((2Z，3E)-6’-溴-3-(羟基亚氨基)-[2，3’-二亚吲哚啉基]-2’-酮]；GSK 3IX[6-溴靛玉红-3’-肟]；GSK-3β抑制剂XII[3-[[6-(3- 氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基]氧基]苯酚]；GSK-3抑制剂XVI [6-(2-(4-(2，4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基)乙基-氨基)-烟腈]；SB-415286[3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯 -2，5-二酮]；和Bio[(2’Z，3’E)-6-溴靛玉红-3’-肟]，其以与20μM CHIR99021 等同的浓度使用。

(2).TGFβ受体抑制剂

TGFβ抑制剂在一些实施方案中优选抑制TGFβ 1型受体激活素受体样激酶(ALK)5，并且在其他实施方案中可以额外抑制ALK 4和nodal型受体1受体ALK7。

优选的TGFβ受体抑制剂是616452。其他TGFβ抑制剂是本领域中已知的并且可商购的。实例包括E-616452[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶]；A 83-01[3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺(carbothioamide)]；SB 505124[2-[4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1，1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶]；GW 788388 [4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺]；和SB 525334[6-[2-(1，1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑 -4-基]喹喔啉]，和dorsomorphine。

(3).cAMP激动剂

优选的cAMP激动剂是毛喉素(F)。然而，可以在本文中所公开的CINP 的混合物中包含任何cAMP激动剂。实例包括，但不限于前列腺素E2 (PGE2)、咯利普兰、金雀异黄素(genistein)和cAMP类似物如DBcAMP或 8-溴-cAMP。

(4).SAH抑制剂

优选的SAH抑制剂是3-脱氮瓶菌素A(DZNep；“Z”)。可以在本文中所公开的CIP组合组合物中包含的其他可用的SAH水解酶抑制剂包括，但不限于(-)Neplanocin A(NepA)、腺苷高碘酸盐(氧化的)Adox和3-脱氮腺苷(DZA)以及它们的组合。

(5).组蛋白乙酰化剂/去乙酰化酶抑制剂

优选的组蛋白乙酰化剂是丙戊酸。然而，其他组蛋白去乙酰化酶抑制剂是可商购的并且可以使用。非限制性实例包括apicidin、Cl 994(N-乙酰地那林(acetyldinaline)4-(乙酰氨基)-N-(2-氨基苯基)苯甲酰胺)、缩酚酸肽 (Depsipeptide)、KD 5170(S-[2-[6-[[[4-[3-(二甲基氨基)丙氧基]苯基]磺酰基] 氨基]-3-吡啶基]-2-氧代乙基]硫代乙酸酯)、4-苯基丁酸钠、丁酸钠、UF 010 等。

(6).DOT1L甲基转移酶抑制剂

DOT1L甲基转移酶抑制剂是优选的。优选实例包括甲基转移酶抑制剂，包括SGC0946(“S”)和EPZ004777(“E”)。

(7).视黄酸受体(RAR)激动剂

Ch 55([4-[(1E)-3-[3，5-双(1，1-二甲基乙基)苯基]-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸]，一种具有对RAR-α和RAR-β受体的高亲和力和对细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)的低亲和力的高度有效的合成类视色素]；AM580([4-[(5、6、7、 8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸]；起选择性RARα激动剂作用的视黄酸的类似物)；[4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1- 丙烯基]苯甲酸](TTNPB)。

优选的RAR激动剂包括AM 580(“A”)和Ch 55。

(8).表观遗传调节剂

可以在CIP组合物中包含的表观遗传调节剂包括5-氮杂胞苷、地西他滨(decitabine)和RG108以及它们的组合中的一种或多种。优选的表观遗传调节剂是5-氮杂胞苷(“D”)。

(9).组蛋白去甲基化的抑制剂

优选的组蛋白去甲基化抑制剂是反苯环丙胺(“T”)。反苯环丙胺是非选择性和不可逆的单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。也作为组蛋白去甲基化的抑制剂的另一种可用MAOI包括苯乙肼(Lee等，Chem and Biol.，13：563-567 (2006))。额外的非限制性实例包括在Zhou等，Chem Biol.and Drug Design， 85(6)：659-671(2015)中公开的化合物XZ09以及非肽丙炔基胺(Schmidttt 等，J.Med.Chem.，56(18)，pp 7334-7342(2013))。

(10).额外的小分子增强剂

在一些实施方案中，包括促进后期重编程的小分子和将化学重编程效率提高/增加至对于VC6TFZ见到的水平以上的小分子。提高/增加的效率可以通过减少生成这样的多能细胞所需的时间(例如，通过与在不使用小分子的情况下的相似或相同过程相比将多能细胞发育的时间缩短至少一天) 来证明。备选地或组合地，小分子可以增加通过特定过程生成的多能细胞的数量(例如，与在不使用小分子的情况下的相似或相同过程相比，在给定时间段内将数量增加至少10％、50％、100％、200％、500％等)。

提高/增加化学重编程效率的小分子包括[N-(9，10-二氧代-9，10-二氢菲 -2-基)棕榈酰胺](SFl670)；[N-(4-(二乙基氨基亚苄基)-N’-(4-羟基苯甲酰基)-肼](DY131)；[2-环己基-6-甲氧基-N-[1-(1-甲基乙基)-4-哌啶基]-7-[3-(1- 吡咯烷基)丙氧基]-4-喹唑啉胺](UNC0638)；[N-(2-(3-(哌嗪-1-基甲基)咪唑并[2，1-b]噻唑-6-基)苯基)喹喔啉-2-羧酰胺盐酸盐](SRTl720)；2-Me-5HT (“2M5”2-甲基-5-羟色胺)；[3，7-二氢-1-甲基-3-(2-甲基丙基)-1H-嘌呤-2，6-二酮](IBMX)和D4476(D4476(CAS 301836-43-1)(4-[4-(2，3-二氢-1，4-苯并二

英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)，高纯度酪蛋白激酶抑制剂和TGF-βI型受体(ALK5)抑制剂)。

在表1A中示出了用于将细胞重编程的小分子组合的实例。表1A用于诱导多能性的小分子组合

在表1B中提供了可以在本文中所公开的配制物中包含的示例性小分子的浓度范围。

表1B小分子浓度的总结

*在XEN-混合物中50μM毛喉素是优选的；在XEN-XiPSC混合物中 10μM毛喉素是优选的。

B.蛋白因子

已经证实蛋白因子如重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在之后的方案中有效用于化学重编程。bFGF可以以在10ng/mL-200ng/mL的范围内的浓度、优选以100ng/mL的浓度使用。

C.要诱导的细胞

通过诱导获得自哺乳动物如任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)、优选人的部分或完全分化的细胞，得到诱导的多能干细胞。来源包括骨髓、成纤维细胞、胎儿组织(例如，胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。在优选的实施方案中，CiPSC获得自化学诱导的成纤维细胞、脂肪来源的干细胞、神经干细胞或来自肠上皮的细胞。在更优选的实施方案中，CiPSC获得自化学诱导的新生(例如包皮)或成体成纤维细胞。然而，CiPSC可以获得自其他细胞类型，包括但不限于：多能干细胞、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞、和结缔组织细胞。多能干细胞、血液来源的细胞、胚胎来源的细胞、皮肤来源的细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、实质细胞、神经细胞、和结缔组织细胞。要重编程的细胞可以获得自从哺乳动物受试者得到的样品。受试者可以是任何哺乳动物(例如，牛、牛、猪、犬、猫、马、灵长类动物)，包括人。细胞的样品可以获得自多种不同来源中的任一种，包括骨髓、胎儿组织(例如，胎儿肝组织)、外周血、脐带血、胰腺、皮肤或任何器官或组织。

在优选的实施方案中，CiPSC获得自成纤维细胞和脂肪来源的干细胞。在更优选的实施方案中，CiPSC获得自成纤维细胞，其可以是新生(例如包皮成纤维细胞)或成体成纤维细胞。在又一个优选实施方案中，非多能细胞不表达Oct4和/或未被遗传改造以表达一种或多种多能性标记。

可以通过使用本领域技术人员已知的技术将充当细胞来源的适当的器官或组织分解来分离细胞。例如，可以将组织或器官机械分解和/或用消化酶和/或削弱相邻细胞之间连接的螯合剂处理，从而可以将组织分散以形成个体细胞的悬浮液，而没有可察觉的细胞损坏。可以通过将组织切碎并且用一种或多种酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、和/或透明质酸酶、DNA酶、链霉蛋白酶、分散酶等处理切碎的组织来完成酶解离。也可以通过多种方法完成机械破坏，包括但不限于使用粉碎机、搅拌机、筛、均化器、压力盒(pressure cell)、或声波器(insonator)。

D.化学诱导的多能干细胞(CiPSC)

CiPSC在生理学上和形态学上不能区分与胚胎干细胞(ESC)区分。实例显示，CiPSC以与ESC相似的倍增时间生长，并且像ESC一样表达多能性标记，具有与ESC相似的基因表达谱，并且在Oct4和Nanog启动子处具有相似的DNA甲基化和组蛋白修饰。核型分析还证明CiPSC没有获得染色体异常。CiPSC是多能性的另外的证据是它们分化为三个胚层的组织的能力。这些发现证明了操控分化的人细胞生成无限供应的病人特异性多能干细胞的能力。

CiPSC拥有ESC样性质如ESC形态，与ESC相似的倍增时间，ESC 标记如碱性磷酸酶(AP)、nanog、Rex1、Sox2、Dax1、Sall4、未分化胚胎细胞转录因子(Utf1)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)的表达，细胞分化为三个胚层的组织的能力。这样的细胞也可以特征在于CiPSC所诱导自的分化的细胞的标记特征的下调。例如，来源于成纤维细胞的CiPSC可以特征在于成纤维细胞细胞标记Thy1的下调和/或SSEA-1的上调。不存在必须在CiPSC上显示的多能性标记的最小数量。多能性的金标准是成为所有三个胚层的细胞类型的分化潜力。畸胎瘤测定、嵌合体测定和种系传递 (germ-line transmission)能力是测试它们分化潜力的一些直接测定。

III.方法和制备

A.CiPSC的诱导

可以通过在足够的时间段内在含有CIP的培养基在中提供部分或完全分化的细胞以使得将细胞重编程为化学诱导的多能干细胞(CiPSC)来诱导 CiPSC。基于拥有ESC样性质如形态，倍增时间，ESC标记例如碱性磷酸酶(AP)；nanog、Rex1；Sox2；Dax1；Sall4；未分化胚胎细胞转录因子(Utf1)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)的表达，细胞分化为三个胚层的组织的能力，将重编程的细胞定义为多能细胞。

使CIP化合物与有效诱导和/或增强非多能细胞重编程为多能细胞的量的要诱导的细胞接触。本领域技术人员可以使用在以下实例中概述的方法或本领域中已知的其他方法容易地确定提供完整重编程所需的在本文中所公开的CIP化合物的浓度。在一些优选的实施方案中，CIP包括SAH 抑制剂。

VPA向细胞施用至在500μM至0.5mM之间的浓度，CHIR施用至在 10至20μM之间、优选20μM的浓度，616452施用至在5至10μM之间的浓度，FSK施用至在10至50μM之间的浓度，并且DZNep施用至在 20nM至0.1μM之间、优选在0.05至0.1μM之间、并且更优选在20至 200nM之间的浓度。在表1A和B中提供了可以用于诱导非多能细胞中的多能性的小分子的示例性组合和浓度范围。

616452和毛喉素需要在使用2i培养基之前的全部时间存在。 CHIR99021应当在前12天使用，并且优选在使用2i培养基之前的全部时间存在。DZNep应当在重编程的后期(第12天至第40天)、优选其他小分子的初期处理之后第16天加入。在第26天至第48天之间的时间点、优选第28天之后，应当将小分子组合更换为2i培养基。不同的细胞类型具有不同的最佳小分子浓度。这些可以通过常规实验基于在本文中所述的研究来确定。在各种细胞类型之间暴露的顺序和暴露的时间段是相似的。

在优选的实施方案中，方法包括在含有CIP的重编程培养基中培养细胞，并且在用重编程培养基处理后约第28天之后在糖原合成酶激酶-3 (GSK3)和促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号传导的双重抑制的情况下在ESC培养基中将细胞进一步培养多于4天。在一个实施方案中，GSK3 和MAPK的双重抑制使用CHIR99021和PD0325901实现。

在一些实施方案中，所述方法还包括使细胞与在本文中所公开的除毛喉素和/或表观遗传调节剂外的促进后期重编程的额外小分子例如cAMP 激动剂、和/或在本文中所公开的提高/增加化学重编程效率的小分子接触。可以在含有VC6TF的组合物中包含表观遗传调节剂。备选地，可以在用 VC6TF处理细胞之后在细胞培养基中包含这些小分子。优选将细胞暴露于小分子多于1天。在一些实施方案中，用cAMP激动剂和表观遗传调节剂处理细胞不超过用VC6TF处理的时间段。在其他实施方案中，用cAMP 激动剂和表观遗传调节剂处理细胞不超过用VC6TFZ处理的时间段。在另外的实施方案中，用cAMP激动剂和表观遗传调节剂处理细胞不超过用 VC6TF加VC6TFZ处理的时间段。用于增加化学重编程效率的优选的小分子是TTNPB。

公开的方法得到诱导的多能干细胞，而不需要用基因如Oct4、KLF4、 SOX2、C-Myc或NANOG转染细胞，也不需要使细胞与KLF、Oct、Myc 和/或Sox多肽中的任一种接触。

B.借助XEN样状态偏置的条件的具体选择的CiPSC的诱导

通过XEN样状态偏置将非多能细胞重编程包括以下步骤：(a)使要重编程的细胞与CIP的第一混合物(XEN-混合物)接触足够的时间段以将所述细胞偏置为XEN样状态，由此生成亚群XEN样细胞；(b)使XEN样细胞群体与CIPS的第二混合物(XEN-CiPSC混合物)接触足够的时间段以将细胞重编程为化学诱导的多能干细胞(CiPSC)和(c)在2i培养基中培养所述细胞。优选在步骤(a)期间将细胞以约50,000-100,000细胞/孔的密度重新接种在6孔板中。

在优选的实施方案中，首先在含有CIP的重编程培养基中将要重编程的细胞培养优选在26-30天之间的总时间段。之后在2i培养基中将细胞培养多于4天。在2i培养基中将细胞培养优选10-14天之间(图19A)。在优选的实施方案中，VC6TF混合物在使用2i培养基之前的全部时间存在。 AM 580应当在步骤(a)中使用，并且优选在使用2i培养基之前的全部时间存在。EPZ004777优选在步骤(a)中加入，并且可以在使用2i培养基之前的全部时间存在。因此，用于将要重编程的细胞偏置/引发为XEN样状态的优选的XEN-混合物是VC6TFAE。5-氮杂胞苷应当在步骤(b)中在用优选的VC6TFAE混合物处理之后在重编程的后期(例如，第16天至第28天) 加入。SGC 0946优选不包含在用于将细胞偏置为XEN样状态的步骤(a)中的重编程培养基中，但是优选包含在用于将XEN样细胞重编程为帽(cap) 的步骤(b)中。因此，用于步骤(b)的优选的混合物(XEN-CiPSC-混合物)是 VC6TFZASD。在一些优选的实施方案中，在XEN-混合物中的毛喉素的浓度与其在XEN-CiPSC混合物中的浓度不同(5∶1)。应当在第26天至第30 天之间、并且优选第28天将XEN-CiPSC-混合物更换为2i培养基。2i培养基优选另外包括N2B27。N2B27-2i培养基(500mL)包含以下：240ml DMEM/F12(Invitrogen)、240ml Neurobasal(Invitrogen)、5ml N2补充剂 (Invitrogen)、10ml B27补充剂(Invitrogen)、2mM GlutaMAXTM-I (Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇(Invitrogen)、 1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、3μM CHIR99021、1μMPD0325901和1,000 U/ml LIF。

通过XEN样状态偏置来诱导CiPSC增加了重编程的效率。例如，当与不选择性地将细胞偏置以重编程为XEN样状态的化学重编程方法相比时，首先将要程序化的细胞由相同的起始细胞群体偏置为XEN样状态而得到的群落的数量增加和/或得到相同的群落的数量所花费的时间长度减少。

C.CiPSC的分离

可以维持未分化状态和ES细胞的多能性或诱导分化的培养基是在本领域中已知的。分离的诱导的多能干细胞的分化和增殖能力可以由本领域技术人员通过使用广泛应用于ES细胞的确认手段容易地确认。

例如，通过从培养源中提取(例如，通过密度梯度离心和/或流式细胞仪)，可以得到基本上纯化的CiPSC群体。纯度可以通过任何适当的方法进行测量。例如，通过流式细胞仪(例如，FACS分析)，可以将多能细胞99％-100％纯化。例如，通过使用与在诱导的多能干细胞上的标记(例如， TRA-1-81、TRA-1-61或标记的组合)结合的分子(例如，抗体、抗体衍生物、配体或Fc-肽融合分子)并且从而对结合分子的细胞进行阳性选择(即，阳性选择)，可以将人诱导的多能干细胞分离。阳性选择方法的其他实例包括优先促进在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的希望的细胞类型的生长的方法。备选地，通过使用与在希望的细胞类型上不存在、但是在不希望的细胞类型上存在的标记结合的分子，可以从希望的细胞中移除含有这样的标记的不希望的细胞(即，阴性选择)。其他阴性选择方法包括优先杀伤在希望的和不希望的细胞类型的混合群体中的不希望的细胞类型或抑制其生长。因此，通过使用阴性选择、阳性选择、或它们的组合，可以制备干细胞的富集群体。

用于分离的过程可以包括磁性分离，使用涂布有抗体的磁珠，亲和色谱，与单克隆抗体连接的细胞毒性剂，或与单克隆抗体结合使用的这样的试剂，例如补体和细胞毒素，以及使用附着至固体基质(例如，平板)的抗体的“淘选(panning)”，或其他方便的技术。提供准确分离的技术包括荧光活化的细胞分选器，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、和阻抗通道。抗体可以与标记如允许直接分离的磁珠、可以利用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白移除的生物素、或可以与荧光活化的细胞分选器一起使用的荧光染料缀合，以允许特定细胞类型的容易的分离。可以采用对诱导的多能干细胞的活力不过度地有害的任何技术。在一个实施方案中，用针对标记的抗体(例如， TRA-1-81抗体)温育细胞，并且手动选择并且传代培养对于标记来说正染色的细胞。

可以使用富集方法的组合以改善纯化或富集的时间或效率。例如，在移除具有不指示目标细胞类型的标记的细胞的富集步骤之后，可以通过荧光活化的细胞分选器(FACS)或具有高特异性的其他方法对细胞进行进一步分离或富集。可以与FACS一起使用多颜色分析。可以基于针对特定抗原的染色水平或缺乏所述染色水平将细胞分离。可以使用荧光染料标记对特定抗原特异性的抗体。这样的荧光染料包括藻胆蛋白例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素、和德克萨斯红(Texas red)。

可以使用任何细胞类型特异性标记以对或针对特定细胞类型进行选择。可用于富集的诱导的干细胞标记包括表达的标记如TRA-1-81和与逆转录病毒载体或其他外源载体结合为多种标记(例如，GFP)。

C.CiPSC(及其子代)的培养和保存

可以将CiPSC在培养物中扩增并且储存以用于以后的回收(retrieval) 和使用。一旦建立细胞的培养物或干细胞的混合培养物，即在有利于细胞增殖的条件下、在具有或不具有组织形成的情况下通过细胞密度所指示的传代至新鲜培养基来以有丝分裂方式对细胞群体进行体外扩增。这样的培养方法可以包括，例如在缺少诱导分化的特定生长因子(例如，IGF、EGF、 FGF、VEGF、和/或其他生长因子)的培养基中将细胞传代。当达到足够的细胞密度时，可以将培养的细胞转移至新鲜培养基。当密度最大时，一些干细胞类型不显示出典型的接触抑制-细胞凋亡或者它们变得静止 (quiescent)。因此，可以使用适当的传代技术以减少接触抑制和静止。

根据已知方法，如在Doyle等，(eds.)，1995，Cell&Tissue Culture： LaboratoryProcedures(细胞&组织培养：实验室操作)，John Wiley&Sons， Chichester中描述的那些，可以将细胞低温保存以进行储存。例如，可以将细胞在“冷冻培养基”中悬浮，如含有15-20％胎牛血清(FBS)和10％二甲亚砜(DMSO)的培养基，其具有或不具有5-10％甘油，密度为例如约4-10x 10⁶细胞/ml。将细胞分配至玻璃或塑料瓶中，之后将其密封并且转移至可编程或被动冰箱的冷冻室。可以通过经验确定冷冻的最佳速率。例如，可以使用通过熔化热提供-1℃/min的温度变化的冷冻程序。一旦含有细胞的瓶达到-80℃，即将它们转移至液氮存储区域。可以将低温保存的细胞储存数年的时间段。

IV.方法和应用

对于治疗性治疗、组织工程和研究来说，可以产生希望的细胞类型或形态的干细胞的容易获得的来源是重要的。在移植、组织工程、血管发生 (angiogenesis)的调节、血管形成(vasculogenesis)、和细胞替代或细胞治疗以及某些疾病的预防中，干细胞的可得性是极其有用的。也可以使用这样的干细胞将基因引入至受试者中作为基因治疗方案的一部分。

A.提供分化的体细胞(再分化的细胞)

一旦建立，即可以使用干细胞的培养物制备子代细胞，例如能够产生新组织的成纤维细胞。可以诱导CiPSC以分化为来自三个胚层中的任一种的细胞，例如皮肤和毛细胞，包括上皮细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、脂肪细胞，形成骨骼、肌肉和结缔组织的细胞如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞，实质细胞如肝实质细胞、肾细胞、肾上腺细胞、和胰岛细胞，血细胞，视网膜细胞(和涉及感官知觉的其他细胞，如形成耳朵中的毛细胞或舌头上的味蕾的那些)，和包括神经在内的神经组织。

在一个实施方案中，通过使细胞暴露于“外胚层分化”培养基来诱导 CiPSC以分化为外胚层来源的细胞。在另一个实施方案中，通过使细胞暴露于“中胚层分化”培养基来诱导CiPSC以分化为中胚层来源的细胞。在又一个实施方案中，通过使细胞暴露于“内胚层”培养基来诱导CiPSC以分化为内胚层来源的细胞。“内胚层”、“中胚层”和“外胚层”培养基的组分对本领域技术人员来说是已知的。可以使用已知的细胞表面标记确认细胞确实分化为相应细胞培养基的谱系的细胞。确认三个胚层的分化的最通常接受的标记是内胚层细胞的甲胎蛋白(alpha fetal protein)、中胚层的α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscleactin)、和外胚层的β-III微管蛋白(Beta-III tubulin)的表达，其全部通常在这些组织的发育的非常早期表达。

可以通过特定外源生长因子或通过改变干细胞培养物的培养条件(例如，密度)触发干细胞分化为成纤维细胞或其他细胞类型和随后由其产生组织。用于诱导细胞分化为希望的细胞类型的细胞的方法是在本领域中已知的。例如，可以通过向细胞的环境中加入物质(例如，生长因子、酶、激素、或其他信号传导分子)来诱导CiPSC以进行分化。可以用于诱导分化的因子的实例包括促红细胞生成素，集落刺激因子例如GM-CSF、G-CSF、或 M-CSF，白介素例如IL-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8，白血病抑制因子 (LIF)，青灰因子(Steel Factor，Stl)，与组织定向细胞的共同培养物，或将干细胞诱导成为定向为特定谱系的其他谱系定向细胞类型。

可以将再分化的细胞在培养物中扩增并且储存以用于以后的回收和使用。

B.细胞治疗

诱导的多能干细胞的治疗用途包括将诱导的多能干细胞、干细胞群体、或其子代移植至个体中以治疗多种病理状态，包括由癌症、创伤、赘生物、损伤、病毒感染、糖尿病等引起的疾病和病症。根据在本领域中目前已知的或将来开发的任何方法，治疗可能需要使用细胞以产生新的组织，并且使用由此产生的组织。可以将细胞直接植入、注射或施用至组织损伤的部位，从而它们将会在体内产生新的组织。在一个实施方案中，施用包括基因修饰CiPSC或它们的子代的施用。

在优选的实施方案中，CiPSC获得自自体细胞即，供体细胞是自体的。然而，细胞可以获得自异源细胞。在一个实施方案中，供体细胞获得自与受体遗传相关的供体。在另一个实施方案中，供体细胞获得自与受体非遗传相关的供体。

如果人CiPSC来源于与受体受试者相比异源(非自体/同种异体)的来源，则通常施用伴随的免疫抑制治疗，例如施用免疫抑制剂环孢菌素或 FK506。然而，归因于人诱导的多能干细胞的不成熟状态，可以不需要这样的免疫抑制治疗。因此，在一个实施方案中，可以在不存在免疫调节(例如，免疫抑制)治疗的情况下向受体施用人诱导的多能干细胞。备选地，可以将细胞封装在允许流体交换但是防止细胞/细胞接触的膜中。微囊化细胞的移植是在本领域中已知的，例如Balladur等，Surgery，117：189-94，1995；和Dixit等，CellTransplantation 1：275-79(1992)。

(i)糖尿病

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是其中受试者因为胰腺不产生足够的胰岛素或因为细胞不响应所产生的胰岛素而具有高血糖的一组代谢疾病。

针对胰岛素治疗的有希望的代替物是向需要胰岛素的患者提供胰岛细胞。Shapiro等，N Engl J Med.，343(4)：230-8(2000)已经证实了β细胞/ 胰岛的移植为患有糖尿病的患者提供治疗。尽管许多胰岛素类型是可商购的，这些制剂作为注射剂提供。人诱导的多能干细胞提供了备选的胰岛细胞来源以预防或治疗糖尿病。例如，可以将诱导的多能干细胞分离并且分化为胰腺细胞类型并且递送给受试者。备选地，可以将诱导的多能干细胞递送至受试者的胰腺并且在体内分化为胰岛细胞。因此，细胞可用于移植，从而预防或治疗糖尿病的发生。例如，在Naziruddin等的美国专利号 8,637,494中公开了用于在不影响胰岛细胞的活力和效力的情况下在细胞因子暴露之后减少炎症的方法。

(ii)神经变性病症

神经变性病症特征在于涉及作为疾病的结果的神经元的劣化的病况，遗传的病况或损伤，如创伤性或缺血性脊髓或脑损伤。神经变性病况包括涉及神经元的损伤或劣化的任何疾病或病症或症状或其原因或影响。神经变性病况可以包括，但不限于亚历山大病(Alexander Disease)、阿耳珀病 (Alper’s Disease)、阿尔茨海默病(AlzheimerDisease)、肌萎缩侧索硬化 (Amyotrophic Lateral Sclerosis)、共济失调性毛细血管扩张症(Ataxia Telangiectasia)、卡纳万病(Canavan Disease)、科凯恩综合征(CockayneSyndrome)、皮质基底节变性(Corticobasal Degeneration)、克雅病 (Creutzfeldt-JakobDisease)、亨廷顿病(Huntington Disease)、肯尼迪病 (Kennedy’s Disease)、克拉伯病(Krabbe Disease)、路易体痴呆(Lewy Body Dementia)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph Disease)、多发性硬化症 (Multiple Sclerosis)、帕金森病(ParkinsonDisease)、佩梅病 (Pelizaeus-Merzbacher Disease)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick'sDisease)、原发性侧索硬化(Primary Lateral Sclerosis)、雷弗素姆病(Refsum’sDisease)、桑德霍夫病(Sandhoff Disease)、谢尔德病(Schilder’s Disease)、斯-里-奥病(Steele-Richardson-Olszewski Disease)、脊髓痨(Tabes Dorsalis)或与受损神经元相关的任何其他病况。其他神经变性病况可以包括创伤性脊髓损伤、缺血性脊髓损伤、卒中、创伤性脑损伤、和遗传病况，或者由它们引起。

尤其是，所公开的方法包括向需要其的受试者中移植已经在体外扩增的NSC、神经祖细胞、或神经前体以使得细胞可以改善神经变性病况。扩增的神经干细胞的移植可以用于改善在患有具有痉挛、僵直、发作、麻痹或任何其他肌肉过度活跃的症状的多种形式的脊髓病的受试者中的动态功能(ambulatory function)。例如，在Johe等的美国专利号8,236,299中公开了用于扩增和移植神经细胞和神经祖细胞以治疗不同神经变性病况的方法。

(iii)癌症治疗

CiPSC和它们的子代的治疗用途包括将诱导的多能干细胞、干细胞群体、或其子代移植至个体中以治疗和/或改善与癌症相关的症状。例如，在一个实施方案中，可以将CiPSC施用于已经经历了杀伤、降低、或破坏受试者的细胞的化学疗法的癌症患者。在用于癌症的典型的干细胞移植中，通常连同放射疗法一起使用非常高剂量的化学疗法，以试图破坏所有癌细胞。这种治疗也杀伤了骨髓中的干细胞。在治疗之后不久，提供干细胞以替换被破坏的那些干细胞。

在另一个实施方案中，可以(除了去分化因子以外)用至少一种额外的治疗性因子将CiPSC转染或转化。例如，一旦将CiPSC分离，即可以用编码治疗性多肽的多核苷酸将细胞转化并且之后向受试者植入或施用，或者可以将细胞分化为希望的细胞类型并且向受试者植入和递送。在这样的情况下，在受试者内表达多核苷酸以递送多肽产物。

(iii)组织工程

CiPSC和它们的子代可以用于使用在本领域中已知的方法制备组织改造的结构。组织改造的构建体可以用于多种目的，包括作为用于修复或代替受损器官或组织的假体装置。它们还可以充当用于由构建体的细胞分泌的蛋白质或其他分子的体内递送体系或者通常充当药物递送体系。组织改造的构建体还发现了作为组织功能的体外模型或作为用于测试多种治疗或药物的效果的模型的用途。在Willerth，S.M.和Sakiyama-Elbert，S.E.，Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues andcell delivery(用于构建组织和细胞递送的组合干细胞和生物材料构架) (July 09，2008)，StemBook，ed.The Stem Cell Research Community， StemBook中综述了用于干细胞移植的最常用的生物材料构架。组织工程技术通常包括选择适当的培养基质以维持并且促进组织生长。通常，这些基质应当是三维的并且应当是可加工的以形成用于目标组织的希望形状的构架。

美国专利号6,962,814概括地公开了用于制备组织改造的构建体和改造的天然组织的方法。关于具体实例，Vacanti等的美国专利号7,914,579 公开了组织改造的韧带和肌腱。美国专利号5,716,404公开了用于使用与聚合物基质组合植入的解离的肌细胞重建或增大乳腺组织的方法和组合物。美国专利号8,728,495公开了使用自体皮肤成纤维细胞修复软骨。 Duailibi等的美国公布申请号20090029322公开了使用干细胞形成牙组织以用于制造牙齿替代物。美国公布申请号2006/0019326公开了用于治疗颅内动脉瘤的细胞-种子组织改造的聚合物。Atala的美国公布申请号 2007/0059293公开了可以用于替换受损器官例如肾、心脏、肝、脾、胰腺、膀胱、输尿管和尿道的组织改造的构建体(和用于制备这样的构建体的方法)。

(ii)由CiPSC(子代)产生的细胞

可以诱导CiPSC以分化为来自三个胚层中的任一种的细胞，例如皮肤和毛细胞，包括上皮细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、脂肪细胞，形成骨骼、肌肉和结缔组织的细胞如肌细胞、软骨细胞、骨细胞、肺泡细胞，实质细胞如肝实质细胞、肾细胞、肾上腺细胞、和胰岛细胞(例如，α细胞、δ细胞、PP细胞、和β细胞)，血细胞(例如，白细胞、红细胞、巨噬细胞、和淋巴细胞)，视网膜细胞(和涉及感官知觉的其他细胞，如形成耳朵中的毛细胞或舌头上的味蕾的那些)，和包括神经在内的神经组织。

(iii)治疗组合物

可以配制CiPSC以用于施用、递送或与受试者、组织或细胞接触以促进体内或体外/离体的去分化。可以结合额外的因子，如生长因子、诱导分化或去分化的其他因子、分泌产物、免疫调节剂、抗炎药、回归因子 (regression factor)、促进神经支配、血管化或增强淋巴网络的生物活性化合物、以及药物。

可以通过单独或在载体或支持结构上或中包含CiPSC或CiPSC子代的群体的组合物的方式将诱导的多能细胞施用于患者。在许多实施方案中，将会不需要载体。可以通过注射至需要细胞的部位上或中来施用细胞。在这些情况中，细胞通常将会被洗涤以移除细胞培养基并且将会在生理缓冲液中悬浮。

在其他实施方案中，细胞设置有支持结构或者结合至支持结构上或中。支持结构可以是网状物、固体支持物、构架、管、多孔结构、和/或水凝胶。支持结构可以是整体或部分可生物降解的或生物不可降解的。支持物可以由天然或合成的聚合物、金属如钛、骨骼或羟磷灰石、或陶瓷形成。天然聚合物包括胶原蛋白、透明质酸、多糖、和糖胺聚糖。合成的聚合物包括聚羟基酸如聚乳酸、聚乙醇酸、和它们的共聚物，聚羟基链烷酸酯如聚羟基丁酸酯，聚原酸酯，聚酐，聚氨酯，聚碳酸酯，和聚酯。这些可以是植入物、管、网状物、或水凝胶的形式。

固体支持物

支持结构可以是疏松的编织或非编织网状物，其中细胞接种在网状物中并且接种至网状物上。结构可以包括固体结构支持物。支持物可以是管，例如用于神经轴突的再生长的神经管。支持物可以是支架或阀。支持物可以是关节假体如膝盖或臀部，或其一部分，其具有允许细胞向内生长和/ 或j细胞接种至多孔结构中的多孔界面。许多其他类型的支持结构也是可行的。例如，支持结构可以由海绵、泡沫、珊瑚、或具有内部孔的生物相容性无机结构形成，或者可以是交错编织的聚合物纤维的网片。这些支持结构可以使用已知方法制备。

支持结构可以是具有定形并且支持水凝胶-细胞混合物孔状腔或空隙的可透过结构。例如，支持结构可以是多孔聚合物网状物、天然或合成的海绵、或由金属或如骨骼或羟磷灰石的材料形成的支持结构。支持结构的孔隙率应当使得营养物质可以扩散至结构中，从而有效地到达细胞内部，并且由细胞产生的废产物可以从结构中扩散出来。

可以使支持结构定形以符合其中需要新组织的空间。例如，可以使支持结构成形以符合已经被烧伤的皮肤的区域或已经丧失软骨或骨骼的部分的形状。根据制造其的材料，可以通过切除、模制、浇铸、或任何产生希望的形状的其他方法使支持结构成形。如以下描述的，可以在将支持结构用细胞接种或用水凝胶-细胞混合物填充之前或之后使支持物成形。

适合的聚合物的实例是聚半乳糖结合蛋白(polyglactin)，其为乙交酯和丙交酯的90∶10共聚物，并且作为VICRYL^TM编织的可吸收缝合线制造 (Ethicon Co.，Somerville，N.J.)。可以将聚合物纤维(如VICRYL^TM)编织或压缩为毡状聚合物片，其之后可以被切成任何希望的形状。备选地，可以将聚合物纤维在将它们浇铸为支持结构所需的形状的模具中压缩在一起。在一些情况中，可以将额外的聚合物在它们模制时加入至聚合物纤维中，以为纤维网状物修正或赋予额外结构。例如，可以将聚乳酸溶液加入至这种聚乙醇酸纤维网状物片中，并且可以将该组合模制在一起以形成多孔支持结构。聚乳酸与聚乙醇酸纤维的交联物结合，从而涂布这些个体纤维并且固定模制的纤维的形状。聚乳酸还填充在纤维之间的空间中。因此，孔隙率可以根据引入至支持物中的聚乳酸的量而变化。将纤维网状物模制为希望的形状所需的压力可以是非常适中的。全部所需的是，将纤维固定在足够长的位置以实现聚乳酸的结合和涂布作用。

备选地，或此外，支持结构可以包括通过在本领域中已知的技术制备的其他类型的聚合物纤维或聚合物结构。例如，可以通过将溶剂从聚合物溶液中蒸发而得到细聚合物膜。如果将聚合物溶液从具有希望形状的凸纹图案(relief pattern)的模具中蒸发，可以将这些膜铸造为希望的形状。也可以使用在本领域中已知的压缩成型技术将聚合物凝胶模制为细的、可透过聚合物结构。

Hydrogels

在另一个实施方案中，将细胞与水凝胶混合以形成细胞-水凝胶混合物。可以通过注射或导管、或在植入其他支持结构时施用水凝胶。可以在施用之前、期间、或之后进行交联。

V.试剂盒

提供包含在本文中所公开的多能性化学诱导剂(CIP)的试剂盒。CIP是如上所述的。这些可以是具有限定浓度的形式以促进向细胞培养基中的添加，从而产生希望的浓度。试剂盒可以包括基于要诱导的细胞的类型提供希望的浓度范围和施用时间的说明。试剂盒还可以包含用于培养细胞以诱导多能性的与CIP预混合的细胞培养基。

参照以下非限制性实例，将会进一步理解本发明。

实施例

材料和方法

小鼠

按照Li，Cell Res.，21：196-204(2011)所描述的，购买小鼠品系 C57BL/6J-Tg(GOFGFP)11Imeg/Rbrc(OG)、C57BL/6NCrlVr(C57)、ICR和 129S2/SvPasCrlVr(129)。使OG小鼠与其他品系交配以产生携带Oct4启动子驱动的GFP的后代。使用包括ICR、C57 X 129、OGX ICR、OG X 129 和OG X C57的小鼠品系以分离原代胚胎小鼠成纤维细胞(MEF)、新生小鼠成纤维细胞(MNF)、成体小鼠成纤维细胞(MAF)和脂肪来源的干细胞 (ADSC)。将这些细胞用于CiPSC诱导。所使用的新生小鼠是2-3日龄并且所使用的成体小鼠是7周龄。Tet-OnPOU5F1小鼠品系B6； 129t(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae Colla1tm2(tetO-Pou5f1)Jae/J购自 Jackson Laboratory(Hochedlinger等，Cell，121：465-477(2005))并且仅用于使用Oct4加VC6T进行重编程。根据中国北京大学动物保护准则进行动物实验。

细胞培养

按照Takahashi等，Cell，126：663-676(2006))所描述的，分离原代MEF，并且仔细注意移除生殖嵴。按照Lichti等，Nat.Protoc.3：799-810(2008)； Seluanov等，J.Vis.Exp.2010：2033(2010)；Tat等，Cell Transplant. 19：525-536(2010)和McQualter等，Stem Cells，27：623-633(2009)所描述的，分离来自皮肤的MNF、来自肺的MAF和来自腹股沟脂肪垫的ADSC。

将MEF、MNF、MAF和ADSC在含有10％胎牛血清(Hyclone)的 DMEM/高葡萄糖(Hyclone)中培养。在重编程中使用的细胞来自第1至5 代。

将小鼠ESC(R1和TT2)、iPSC和CiPSC维持在ESC培养基(含有10％敲除血清代替物(Invitrogen)、10％胎牛血清(Hyclone)、2mM GlutaMAXTM-I(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)和1,000U/ml白血病抑制因子(LIF，Millipore)的KnockOut DMEM(Invitrogen))或2i培养基(补充有 2i(3μM CHIR99021和1μM PD0325901)的ESC培养基)中的丝裂霉素处理的MEF的饲养层上。培养基每天更换一次。ESC、iPSC和CiPSC通过胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)传代。对于CiPSC诱导来说，使用补充有 20-100ng/ml bFGF(Origene)的无LIF ESC培养基作为化学重编程培养基。

按照之前描述的(Li等，2011)，在胚胎第13.5天将胎儿小肠上皮细胞从小鼠胚胎小肠中分离，并且在补充有10％胎牛血清(FBS；Pan-Biotech)、 10％敲除血清代替物(KSR)、1％非必需氨基酸(NEAA)、2mM GlutaMAX^TM-I(GlutaMAX)、10U青霉素-链霉素(PS)、和55μM β-巯基乙醇(β-me)(全部来自Invitrogen)的Knockout^TMDMEM(Invitrogen)中培养。

按照之前描述的(Fischer等，2011)，在胚胎第13.5天将胎儿神经干细胞(NSC)从小鼠前脑中分离，并且将出生后的NSC从出生后的小鼠脑的室下区中分离(Fischer等，2011；Guo等，2012)。将NSC在含有N2和B27 补充剂、1％NEAA、2mM GlutaMAX、10U PS、55μMβ-me(全部来自 Invitrogen)、25ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Origene)、和20ng/mL表皮生长因子(EGF)(R&D)的NSC培养基(DMEM/F-12(1∶1)，DF12) 中培养，并且每4-5天通过accutase(Millipore)进行传代。在2-3天内，将 NSC单细胞悬浮并且形成神经球。

将小鼠ESC(R1)维持在2i培养基加LIF(含有10％KSR、10％FBS、 2mM GlutaMAX、1％NEAA、55μMβ-me、10U PS(全部来自Invitrogen)、 3μM CHIR99021(CHIR)、1μMPD0325901(PD03)和10ng/mL小鼠白血病抑制因子(mLIF；Millipore)的Knockout^TMDMEM)中的丝裂霉素处理的 MEF的饲养层上。培养基每天更换一次。ESC和CiPSC通过胰蛋白酶 -EDTA(Invitrogen)传代。

对于CiPSC诱导来说，使用补充有bFGF和Vc的不具有CHIR、PD03 和LIF的ESC培养基作为化学重编程培养基。在2i培养基阶段，基础培养基是DMEM/F12加N2和B27补充剂(N2B27-2iL培养基)。

XEN细胞来源和培养

按照之前描述(Kunath等，2005)，培养常规eXEN(胚胎来源的XEN) 细胞系(由Rossant博士的实验室赠送)。简而言之，使用含有20％胎牛血清、2mM GlutaMAXTM-I(Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1 mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、和1％丙酮酸钠(Invitrogen；RPMI培养基)的RPMI1640(Invitrogen)，将eXEN细胞接种在MEF饲养层上。对于大多数实验来说，在补充有70％MEF条件培养基 (RPMI-CM)的明胶(0.1％猪皮明胶，Sigma)涂布的平板上，在无饲养体系中培养eXEN细胞。备选地，可以在明胶涂布的平板上在阶段1培养基(具有 VC6TFAE或VC6TF；具有20ng/ml bFGF)中长期培养eXEN(在VC6TF 中的eXEN)。细胞通常每2天供给一次，并且每3天以1∶20至1∶30传代一次。eXEN还直接来源于E3.5胚泡，其使用阶段1培养基(具有VC6TFAE或VC6TF；具有20ng/ml bFGF；CeXEN)。简而言之，将E3.5胚泡接种在阶段1培养基中的MEF饲养层上。培养基每2天更换一次。大约4-7 天(根据生长物的尺寸)以后，可以将生长物以1∶1至1∶2分解到新的饲养细胞上。培养基每2天更换一次，并且XEN细胞可以生长以在大约4-7天内汇合。之后，通常将CeXEN细胞在阶段1培养基中培养并且每3天以 1∶20-1∶30传代一次。以这种方式得到三个CeXEN细胞系并且长期扩增多于25代。

小分子化合物和文库

如在表1D中描述的，购买或合成在本研究中使用的小分子化合物。在表1D中示出了化合物的浓度。如在表1C中描述的，购买或内部生成用于筛选的小分子文库。

表1C.在重编程中使用的小分子文库

*这个文库是内部生成的，包括与多能性、重编程或表观遗传修饰相关的88个选择的小分子

表1D.在重编程中测试的小分子化合物

表1D续

表1D续

表1D续

注：*对于由MEF进行CiPSC诱导来说，CHIR99021的浓度是10μM。对于由MNF、MAF、或ADS进行CiPSC诱导以及在不重新接种的情况下进行CiPSC诱导来说，在第0-12天期间，CHIR99021的浓度提高至20μM。

**对于由MEF进行CiPSC诱导来说，毛喉素的浓度是10μM。对于由MNF、MAF、或ADS进行CiPSC诱导来说，在第0-12天期间，毛喉素的浓度提高至50μM。

质粒构建和慢病毒制备

由(McQualter等，Stem Cells，27：623-633(2009))描述了pLL3.7-ΔU6 载体。将小鼠Sall4由ESC(TT2)通过RT-PCR扩增，克隆至pEASY钝性载体(TransGen Biotech)中，通过测序确认并且之后引入至pLL3.7-ΔU6的 XhoI/EcoRI位点中。引物在表2中列出。

表2.用于PCR反应的引物集合

由Zhao等，Cell Stem Cell，3：475-479(2008)描述了含有其他个体重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4或c-Myc)的慢病毒载体。对于tet-on Oct4体系米说，Fu-tet-hOct4和FUdeltaGW-rtTA与Li等，Cell Res.，21：196-204(2011)； Maherali等，Cell Stem Cell，3：340-345(2008)所描述的相同。根据制造商规程，使用shRNA(SIGMA MissionR shRNA)进行遗传敲除。shRNA序列在表3中列出。慢病毒制备、收集和感染是由Zhao等，Cell Stem Cell，3：475-479(2008)描述的。

表3.shRNA的序列

CiPSC诱导

在没有针对XEN样细胞群体的选择性引发的情况下的CiPSC诱导

将初始细胞(MEF、MNF、MAF或ADSC)以50,000细胞/6孔板的孔或300,000细胞/100mm培养皿的密度接种。在第二天(第0天)，用含有小分子组合的化学重编程培养基替换初始培养基。含有小分子组合的培养基每2天更换一次。在第12天，将这些细胞在PBS中洗涤并且用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37℃消化3-5min。在中和之后，通过彻底移液将细胞团块解离为单细胞。将细胞收获(300,000-1,000,000细胞/6孔板的孔)并且以300,000-500,000细胞/6孔板的孔的密度重新接种在含有小分子组合的化学重编程培养基中。在第16天或第20天将DZNep加入至细胞培养物中。在第28-36天，将包含DZNep的小分子组合移除。同时，用 2i培养基替换化学重编程培养基。在另外8-12天之后，将2i感受态 (2i-competent)、ESC样和GFP阳性群落计数为原代CiPSC群落。对于由不具有OG报告蛋白的野生型细胞进行CiPSC诱导来说，将2i感受态和 ESC样群落计数为原代CiPSC群落。挑取这些CiPSC群落以用于扩增和表征。备选地，可以在不在第12天重新接种的情况下诱导CiPSC。

IEC-CiPSC诱导

将初始IEC以100,000细胞/12孔板的孔的密度接种。在第二天(第0 天)，用含有小分子混合物(0.5mM VPA、20μM CHIR、10μM 616452、10 μM反苯环丙胺、50μM毛喉素、0.05μMAM 580)的化学重编程培养基替换培养基并且每4天更换一次。从第12天开始，将0.01μMDZnep加入至化学重编程培养基中，并且取出AM 580。从第32天开始，用N2B27-2iL 培养基替换培养基。在另外12天之后，将2i感受态(2i-competent)、ESC 样和OG阳性群落计数为原代CiPSC群落。挑取原代CiPSC群落以用于扩增和进一步表征。

NSC-CiPSC诱导

将初始NSC以50,000细胞/6孔板的孔的密度接种。用含有小分子混合物(0.5mMVPA、15μM CHIR、5μM 616452、10μM反苯环丙胺、20μM 毛喉素、1μM Ch 55、5μM EPZ)的化学重编程培养基替换初始培养基并且每4天更换一次。从第20天开始，将0.01μM DZNep加入至化学重编程培养基中。从第40-44天，用N2B27-2iL培养基替换培养基。在另外12 天之后，将2i感受态(2i-competent)、ESC样和OG阳性群落计数为原代 CiPSC群落。挑取原代CiPSC群落以用于扩增和进一步表征。

通过针对XEN样细胞群体的选择性引发/偏置的CiPSC诱导

如下制备诱导培养基：阶段1和阶段2的基础培养基分别是含有100 ng/ml和20ng/ml bFGF(Origene)的无LIF ESC培养基。阶段3培养基是 N2B27-2i培养基。产生N2B27-2i培养基(500m1)，其包含以下：240ml DMEM/F12(Invitrogen)、240ml Neurobasal(Invitrogen)、5ml N2补充剂 (Invitrogen)、10ml B27补充剂(Invitrogen)、2mMGlutaMAXTM-I (Invitrogen)、1％非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、 1％青霉素-链霉素(Invitrogen)、3μM CHIR99021、1μM PD0325901和1,000U/ml LIF。

将MEF、MNF或MAF以300,000细胞/100mm培养皿接种，或者以 50,000细胞/孔接种在6孔板上。第二天(第0天)，将培养物更换为补充有小分子混合物VC6TFAE(0.5mM VPA、20μM CHIR99021、10μM 616452、 5μM反苯环丙胺、50μM FSK、0.05μM AM580和5μM EPZ004777)的阶段1培养基。在第12天，将细胞在PBS中洗涤并且用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)在37℃消化2-3min。在中和之后，通过彻底移液将细胞团块解离为单细胞。将细胞收获并且之后以100,000细胞/6孔板的孔重新接种 (1∶15)。在第12-16天期间，在补充有修饰的小分子混合物VC6TFA(0.5mM VPA、10μM CHIR99021、10μM 616452、5μM反苯环丙胺、10μM FSK、 0.05μM AM580)的阶段1培养基中培养细胞。在第16天，形成XEN样上皮群落并且将培养物更换为补充有小分子混合物VC6TFAZDS(0.5mM VPA、10μM CHIR99021、10μM616452、5μM反苯环丙胺、10μM FSK、 0.05μM AM580、0.05μM DZNep、0.5μM 5-aza-dC和5μMSGC0946)的阶段2培养基。在第28天，将培养物转入阶段3培养基中。在另外8-12 天之后，出现2i感受态(2i-competent)、ESC样和GFP阳性群落(如果使用 pOct4-GFP报告蛋白)并且之后将其挑取以用于扩增和表征。在CiPSC诱导期间，培养基和小分子每4天更换一次。

eXEN细胞的化学重编程

将eXEN细胞或CeXEN细胞以2,000-10,000细胞/12孔板的孔接种在 MEF饲养层上。在用阶段1培养基处理4天(对于诱导来说是非必需的)、用阶段2培养基处理12天和用阶段3培养基处理另外8-12天之后，出现 2i感受态、ESC样CiPSC群落并且之后将其挑取以用于扩增和表征。对于大多数实验来说，饲养细胞有助于XEN细胞的存活，并且较低的细胞密度有益于CiPSC诱导。

质粒构建和慢病毒制备

按照之前描述(Zhao等，2008)，构建质粒。简而言之，将SALL4、GATA4 和GATA6通过qRT-PCR扩增，克隆至pEASY钝性载体(TransGen Biotech) 中，通过测序确认并且之后引入至pLL3.7-ΔU6的XhoI/EcoRI位点中。引物在表4中列出。

表4.用于质粒构建的引物

前面描述了Fu-tet-hSOX2和FUdeltaGW-rtTA(Li等，2011；Maherali 等，2008)。遗传敲除、慢病毒制备和感染也与之前描述的(Hou等，2013) 相同。

免疫荧光、RT-PCR、基因组PCR、畸胎瘤形成和核型分析

免疫荧光、RT-PCR、基因组PCR和畸胎瘤形成全部按照Hou等， Science，341：651-654(2013)中描述的进行。对于免疫荧光米说，一级抗体包括SSEA-1(Millipore，MAB4301)，OCT4(Abcam，ab18976)，SOX2(Santa Cruz，sc-17320)，KLF4(Santa Cruz，sc-20691)，REX1(Santa Cruz，sc-99000)， NANOG(R&D，AF2729)，UTF1(Abcam，ab24273)，SALL4(SantaCruz， sc-166033)。一级抗体是若丹明缀合的，包括驴抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch，715-025-150)，驴抗山羊IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，705-025-147)，和驴抗兔IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch，711-025-152)。用于RT-PCR的引物与前面描述的相同(Li 等，CellRes.，21：196-204(2011))。用于基因组PCR的引物在表2中示出。按照所报道的(Longo等，Transgenic Res.6：321-328(1997))，进行核型分析。

对于成像分析来说，使用Andor’s Revolution WD旋转盘共聚焦显微镜系统(Andor)或ImageXpress Micro XL宽视野高内涵筛选系统(Molecular Devices)对细胞进行成像。

实时PCR

使用RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN)分离来自培养的细胞的整个孔的总RNA。对于单一群落来说，使用RNeasy Micro Kit(QIAGEN)分离RNA。使用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech) 将RNA转化为cDNA。使用SYBRRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行PCR并且在ABI Prism 7300序列检测系统上进行。使用Δ-ΔCt法分析数据。用于实时PCR的引物在表2中列出。

嵌合体构建

通过将CiPS细胞使用尖锐的注射针注射至胚泡中或者使用XY克隆激光系统(Hamilton ThorneBioscience)注射至八细胞胚胎中，得到嵌合小鼠。对于胚泡注射来说，在3.5d(交配后的天数)将10-15个CiPS细胞注射至F2(B6D2F1的互交)或CD-1(白化病)雌性小鼠的受体胚腔中。在2.5d 从雌性小鼠中收集宿主八细胞胚胎，并且将7-10个CiPS细胞注射至每个胚胎中。在注射之后，分别将胚泡和八细胞胚胎(在每个输卵管或子宫角中 6-8个胚胎)转入至2.5d或0.5d假孕CD-1雌性中。嵌合小鼠通过涂层颜色鉴别并且之后通过与ICR小鼠交配来对种系传递进行评估。

XEN嵌合体测定

由从GFP(ICR X ICR)小鼠中分离的GFP标记的MEF诱导GFP标记的XEN样细胞。对于嵌合体试验来说，挑取GFP标记的XEN样细胞群落并且通过0.25％胰蛋白酶-EDTA将其分解为单细胞。将大约10至15个 XEN样细胞注射至胚泡中并且转移至E2.5假孕雌性的子宫。小心地解剖在E6.5-8.5之间的嵌合体孕体以保持腔壁卵黄囊(parietal yolk sac)完整并且用荧光立体镜检查法(fluorescence stereoscopy)观察。

对于使用eXEN和CeXEN的嵌合体试验来说，用表达EGFP的慢病毒载体感染细胞并且进行FASC分选以用于纯化EGFP阳性细胞。

DNA微阵列和RNA-seq

从小鼠成纤维细胞、CiPSC和ESC中分离总mRNA。按照Li等，Cell Res.，21：196-204(2011)所报道的，进行微阵列。使用Illumina mRNA-seq Prep试剂盒(Illumina)构建RNA测序文库。使用Illumina HiSeq 2000对片段化和随机引发的200bp双末端文库进行测序。按照Li等，Cell Res.， 21：196-204(2011)所报道的，进行微阵列数据的分层聚类。使用R(Bioconductor)生成热图。在一些研究中，使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen) 分离总RNA。使用用于

的

Ultra^TM RNA文库Prep试剂盒(NEB)构建RNA测序文库。使用Illumina HiSeq 2500对片段化和随机引发的200bp双末端文库进行测序。分别使用amap包、图形包和pheatmap 包在R v3.2.0中生成分层聚类、散射图和热图。

亚硫酸氢盐基因组测序

将基因组DNA通过亚硫酸氢盐处理进行修饰并且使用 MethylCodeTM亚硫酸氢盐转化试剂盒(Invitrogen)根据制造商规程纯化。引物在表2中列出。将扩增的片段克隆至pEASY钝性载体中(转基因)。对来自每个样品的十个随机挑取的克隆进行测序。

cAMP、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH)量化

使用直接cAMP ELISA试剂盒(Enzo)根据制造商规程对cAMP进行量化。对于SAM和SAH量化米说，对培养的细胞(1,000,000个细胞)进行胰蛋白酶化并且通过在200μl PBS中超声处理进行均化。之后，加入40μl 的400mg/ml TCA。将细胞提取物在冰上温育30min。在4℃离心(13,000 rpm，15min)之后，将上清液通过0.22μm过滤器过滤并且通过高效液相色谱法(HPLC，Shimadzu)使用HILIC柱(Waters)进行分析。

比较基因组杂交(CGH)分析。

对于CGH实验来说，提取基因组DNA并且使用C57BL/6MEF DNA 作为参照(GeneBioDesign)通过Imagenes与NimbleGen 3x720K小鼠全基因组tiling阵列杂交。

流式细胞仪分析

将培养的细胞胰蛋白酶化为单细胞并且之后在含有3％胎牛血清的 PBS中重悬。使用内源性Oct4-GFP，用FACSCalibur仪器(BD Biosciences) 进行FACS分析。使用FCSExpress 4(De Novo)分析数据。

染色质免疫沉淀(ChIP)

使用EZ-Magna ChIP A/G试剂盒(Millipore)根据制造商规程进行ChIP。使用抗H3K27me3(Abcam，ab6002)，抗H3K9me2(Millipore， 07-441)，抗H3K4me3(Abcam，ab8580)和抗H3K9ac(Abcam，ab4441)抗体。在免疫沉淀之后，通过实时PCR分析DNA。所使用的引物在表2中列出。

DNA印迹

参照“用于DIG标记的探针与印迹杂交的Roche技术”，使用DIG高引物DNA标记和检测引发剂试剂盒II(Roche，11 585 614 910)进行DNA 印迹。用EcoRI和XbaI消化从iPS细胞或MEF分离的20μg基因组DNA。 DNA探针基于在pLL 3.7-_U6载体和Fu-tet载体中存在的psi序列设计，并且因此可以在病毒感染之后与外源转基因一起整合至基因组中。

荧光素酶活性测定

将MEF以40,000细胞/24孔板的孔的密度接种并且使用Lipofectamine LTX&Plus试剂(Invitrogen)根据制造商的说明书用Oct4启动子报告蛋白瞬时转染。将pRL-TK质粒(Promega)在每个孔中共转染作为内部参照，并且通过加入空pLL 3.7-_U6载体使所有转染的总DNA浓度相等。在转染之后48小时，将细胞在PBS中洗涤并且在被动裂解缓冲液(Promega)中裂解。使用Centro LB960 96孔照度计(Berthold Technologies)用双荧光素酶报告蛋白测定系统(Promega)测量荧光素酶活性，并且将其相对于海肾 (Renilla)荧光素酶活性归一化。使用空表达载体质粒作为阴性对照。倍数活化(fold activation)描述了针对与空载体对照相比的每种病况的萤火虫与海肾荧光素酶活性的比率。

蛋白印迹分析

将细胞在100mm培养皿中培养，在PBS中洗涤并且在裂解缓冲液中刮抹。将试样加载至8-10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上并且印迹至硝基纤维素膜上。将膜在4℃与以1∶1000稀释的兔抗EZH2(Abcam，ab3748)温育。使用山羊抗兔IgG(H+L)/HRP(ZSBIO，ZB-2301)作为二抗。使用 SuperSignal West Pico溶液(Pierce)进行检测。

实施例1：Oct 4的化学替代物

为了鉴别Oct4的化学替代物，将来自OG小鼠的MEF以20,000细胞 /12孔板的孔的密度接种并且用编码Sox2，Klf4和c-Myc的慢病毒感染。在感染之后，用无LIF ESC培养基替换培养基。将来自小分子文库的个体化学物质加入至每个孔中。培养基和化学物质每4天更换一次。将化学处理继续14-20天或直到GFP阳性群落出现。选择首次命中(primary hit)以用于进一步确认和优化。

在具有Sox2，Klf4，和c-Myc的病毒表达的情况下，使用Oct4启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)表达(OG)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)搜索能够在不存在Oct4的情况下实现重编程的小分子。在筛选多至10,000个小分子(表1C)之后，将毛喉素(FSK)，2-甲基-5-羟色胺(2-Me-5HT)，和 D4476(表1D)鉴别为Oct4的化学“替代物”(图1A至1F)。

传代的SKM-FSK-iPSC展现出典型的ESC形态并且均匀地表达GFP (图1B)。SKM-FSK-iPSC可以有利于嵌合小鼠，包括性腺组织。类似地，通过SKM用2-Me-5HT处理诱导的iPSC可以有利于嵌合小鼠。

接下来使用能够使用单一基因Oct4实现重编程(Li等，Cell Res.， 21：196-204(2011))的小分子组合“VC6T”[VPA、CHIR99021(CHIR)、 616452、反苯环丙胺]以在不存在转基因的情况下处理OG-MEF加Oct4的化学替代物。数据显示，VC6T加FSK(VC6TF)诱导了表达作为间充质至上皮过渡标记的E-钙粘着蛋白的一些GFP阳性簇，使人想起了借助转录因子的早期重编程(Li等，Cell Stem Cell，7：51-63(2010)；Samavarchi-Tehrani等，Cell StemCell，7：64-77(2010))(图2)。然而，Oct4 和Nanog的表达是不可检测的，并且它们的启动子保持超甲基化，表明了阻遏的表观遗传状态。

实施例2：促进后期重编程的小分子

为了鉴别促进后期重编程的小分子，使用可多西环素(doxycycline， DOX)诱导的Oct4表达筛选系统。(Li等，Cell Res.21：196-204(2011))。

将来自OG小鼠的MEF如上所述接种并且用Fu-tet-hOct4和 FUdeltaGW-rtTA慢病毒感染。如上所述进行诱导方案。

在感染之后，用含有VC6T(VPA、CHIR99021、616452、反苯环丙胺) 加DOX(1μg/ml)的无LIF ESC培养基替换培养基。备选地，在这个筛选中使用来自Tet-On POU5F1小鼠品系B6； 129-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(rtTA*M2)Jae}Colla1^{tm2(tetO-pou5f1)Jae}/J的携带可DOX诱导的 Oct4的MEF。(Li等，Cell Res.，21：196-204(2011))。仅在这个筛选中而不是在全部化学重编程中使用这两种可DOX诱导的系统。将来自小分子文库的个体化学物质加入至每个孔中。小分子的浓度在表1D中列出。小分子在不同的培养时间点加入。从第8天开始加入5-aza-C(5-氮杂胞苷)和 DZNep。培养基和化学物质每4天更换一次；仅在前4-8天加入DOX。将化学处理继续16-24天或直到GFP阳性群落出现。选择首次命中(primary hit)以用于进一步确认和优化。在第44天对CiPSC群落进行计数。选择首次命中(primary hit)以用于进一步确认和优化。

在这个筛选中鉴别了小分子命中，包括多种cAMP激动剂(FSK、前列腺素E2、和咯利普兰)和表观遗传调节剂[3-脱氮瓶菌素A(DZNep)、5-氮杂胞苷、丁酸钠、和RG108](图3和表1D)。

实施例3：不使用可Oct-4诱导的系统的完整化学重编程

为了不使用可Oct4诱导的系统实现完整化学重编程，在不具有转基因的OG-MEF的化学重编程中进一步测试小分子。当在用VC6TF (VC6TFZ)处理之后16天加入DZNep时，与用VC6TF处理的那些相比，以多至65倍的更多的频率得到GFP阳性细胞，形成不具有清晰边缘的致密、上皮状、GFP阳性群落(图4A-B和4E)。在这些细胞中，大多数多能性标记基因的表达水平提高，但是仍然比在ESC中低，表明了不完整的重编程状态。在处理后第28天后切换为具有糖原合成酶激酶-3 和促分裂原活化的蛋白激酶信号传导的双重抑制(2i)的2i培养基之后，某些GFP阳性群落形成ESC样形态(圆顶，透亮，均匀，具有清晰边缘)(图 4C)(Silva等，PLoS Biol.，6：e253(2008)；Theunissen等，Curr.Biol.，21：65-71 (2011))。可以将这些群落进一步培养多于30代，维持ESC样形态(图4A、 4D)。这些被称为作为化学诱导的多能干细胞(CiPSC)的2i感受态、 ESC样、和GFP阳性细胞。

接下来，优化小分子的剂量和处理持续时间，导致由50,000个首先接种的MEF产生1至20个CiPSC群落(图5A-K)。图5A-F示出了在诱导CiPSC中的VPA、CHIR99021、616452、反苯环丙胺和毛喉素的可能的浓度。其还指出，重编程效率可以与使用不同浓度的小分子的实验不同。示出了每种小分子的优选浓度(VPA，0.5mM；CHIR99021，10μM；616452， 10μM；毛喉素，50μM至DZNep 50nM)。图5G示出了bFGF的优选浓度(100ng/mL)，其还指出bFGF在诱导CiPSC中是必需的。图5H、I、J 示出了在诱导CiPSC中使用的小分子和bFGF的优选持续时间。图5K指出了将含有VC6TF的培养基更换为2i培养基的优选时间点。图5A-F示出了在诱导CiPSC中的VPA、CHIR99021、616452、反苯环丙胺和毛喉素的可能的浓度。其还指出，重编程效率可以与使用不同浓度的小分子的实验不同。示出了每种小分子的优选浓度(VPA，0.5mM；CHIR99021，10μM； 616452，10μM；毛喉素，50μM至DZNep 50nM)。图5G示出了bFGF 的优选浓度(100ng/mL)，其还指出bFGF在诱导CiPSC中是必需的。图5H、 I、J示出了在诱导CiPSC中使用的小分子和bFGF的优选持续时间。图5K 指出了将含有VC6TF的培养基更换为2i培养基的优选时间点。

在额外的筛选之后，鉴别化学重编程的一些小分子增强剂，其中合成视黄酸受体配体TTNPB以多至40倍将化学重编程效率提高至可与转录因子诱导的重编程相比的频率(多至0.2％)(图6A-C；和表1D)。用来源于 MAF的CiPSC产生成体嵌合小鼠(克隆MAF-CiPS-84)(F)并且用来源于 MAF的CiPSC产生黑色F2后代(克隆MAF-CiPS-85)。基因组PCR分析显示，CiPSC不含转基因污染(图6D和E)。

使用小分子组合VC6TFZ，以比获得自MEF的CiPSC系低～10倍的效率从新生小鼠成纤维细胞(MNF)、成体小鼠成纤维细胞(MAF)、和具有 OG盒的脂肪来源的干细胞(ADSC)获得CiPSC品系。表5.

此外，以与由具有OG盒的MEF实现的效率相当的效率由不具有OG 盒或任何其他遗传修饰的野生型MEF诱导CiPSC。还通过基因组聚合酶链式反应(PCR)和DNA印迹分析确认CiPSC不含病毒载体(图7A-D)。

此外，使用小分子组合由神经干细胞并且由获得自肠上皮的细胞生成 CiPSC(表6)。

AM580是4-[(5，6，7，8-四氢-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸]；Ch55是4-[(1E)-3-[3，5-双(1，1-二甲基乙基)苯基]-3-氧代-1-丙烯基]苯甲酸]和EPZ。尽管具有不同效率，可以使用VC6TFZ在不加入指定小分子的情况下重编程肠和神经干细胞，如MEF。

接着进行实验以确定这些小分子中的哪一个在诱导CiPSC中是关键的。四种基本小分子(以下所示)(发生了它们从组合中的个体取出)明显降低了GFP阳性群落并且未鉴别CiPSC(图8A-B)。

这些小分子(C6FZ)是：CHIR(C)，糖原合成酶激酶3抑制剂(Ying等， Nature，453：519-523(2008))；616452(Zhang等，Cell Res.21：196-204 (2011))，转化生长因子β受体抑制剂(Maherali等，Curr.Biol.，19：1718-1723 (2009))；FSK(F)，cAMP激动剂(图14F)(Insel等，Cell.Mol.Neurobiol.， 23：305-314(2003))；和DZNep(Z)，S-腺苷高半胱氨酸(SAH)水解酶抑制剂(图14A)(Chiang等，Pharmacol.，Ther.77：115-134(1998)；Gordon等，Eur.J.Biochem.，270：3507-3517(2003))。

C6FZ能够由MEF和MAF二者诱导CiPSC，尽管是以比通过VC6TFZ 诱导的效率低10倍的效率(表5)。

测试抑制腺苷酸环化酶对通过VC6TFZ生成的群落的数量的影响。通过2’5’ddAdo抑制腺苷酸环化酶降低了通过VC6TFZ形成的群落的数量 (图14F)。还测试了单独或与磷酸二酯酶抑制剂IBMX或磷酸二酯酶抑制剂咯利普兰和IBMX组合使用cAMP类似物(DBcAMP)替代FSK对细胞重编程的影响。在组合处理中以50μM使用DBcAMP和IBMX二者。数据在图14G-J中示出。将在用咯利普兰(10uM)、IBMX(50μM)、DBcAMP(50 μM)和FSK(10μM)处理之后在MEF中的cAMP浓度的细胞内水平与对照 (-)DMSO进行比较(图14K)。毛喉素明显提高cAMP水平，这与其他cAMP 激动剂(咯利普兰和IBMX)或类似物(DBcAMP)相似。使用用于替代毛喉素的其他cAMP激动剂或类似物诱导GFP+多能干细胞。cAMP抑制剂 2’5’ddAdo抑制CiPSC诱导的效率。这些共同表明，毛喉素通过调节cAMP 信号传导通路而促进化学重编程。

由获得自Oct4-GFP转基因小鼠的NSC生成CiPSC

在其他实验中，用重编程混合物“VC6TF”(VPA，V；CHIR99021， CHIR，C；616452，6；反苯环丙胺，T；毛喉素，F)处理NSC(获得自Oct4-GFP 转基因小鼠)。这不能由NSC诱导多能性。之后，加入包括RA激动剂Ch 55(5)和Dot11抑制剂EPZ 004777(EPZ，E)的可能的重编程增强剂，即 VC6TFZE5。在图14N中示出了获得自30,000以及不同RAR激动剂的 CiPSC群落的数量。上皮簇在将616452的浓度从常规的10μM调节至2μM (数据未示出)之后第8天出现，并且随时间增殖。在从第20天开始加入 DZNep(Z)之后，在第32天观察到致密且上皮状的群落(数据未示出)。随后，在将这些群落切换为具有MAPK信号传导和GSK3的双重抑制(2i)的 2i培养基之后逐渐打开Oct4-GFP报告蛋白，并且观察到具有清晰边缘的 ESC样OG阳性群落。最终的细胞被称为NSC-CiPSC。使用相同的小分子组合由出生后小鼠的NSC得到CiPSC(数据未示出)。收获原代NSC-CiPSC 群落并且在2i培养基加小鼠白血病抑制因子(LIF)中传代多于20代，并且具有稳定的ESC样形态和Oct4-GFP表达。这些研究表明，在重编程的早期和后期阶段之间的616452的浓度的选择影响使用化学重编程从NSC得到的CiPSC的数量(14L)。在后期，应当从第20天开始将616452的浓度重新调节为5μM(数据未示出)。

由获得自Oct4-GFP转基因小鼠的小肠上皮细胞生成CiPSC

在这些研究中使用在第13.5天从Oct4-GFP转基因小鼠的小肠组织中分离的IEC。分离的IEC展现出上皮细胞形态，并且免疫荧光染色显示IEC 高度表达特异性肠上皮细胞标记KERATIN 20(KRT20)(数据未示出)。

使用报道的化学重编程混合物VC6TF和RAR激动剂AM 580培养分离的IEC。之后从第16-20天将DZnep加入至混合物中。在这个过程期间，从第4-8天观察到上皮状簇，并且从第16天开始观察到形成的群落(数据未示出)。在从第32-36天切换为2i培养基之后，形成具有清晰边缘的致密、上皮状、ESC样OG阳性群落(数据未示出)。在第44-46天计算并且收获原代CiPSC群落，并且在2i培养基加小鼠LIF中传代多于20代，维持ESC样形态(数据未示出)。这些细胞被称为IEC-CiPSC。

使用与表达位于Rosa26基因座中的loxP-stop-loxP-td-Tomato的小鼠杂交的通过Villin(上皮特异性基因启动子)驱动而表达Cre重组酶的转基因小鼠，进行谱系示踪实验。IEC通过tdTomato荧光标记(数据未示出)。在暴露于化学混合物之后，由IEC生成tdTomato荧光CiPSC群落(图14M 和未示出的数据)。与NSC所示的数据相比，在前12天期间将616452的浓度增加至高达20μM最好地支持IEC重编程，而降低的616452的浓度有益于NSC重编程(图14L，下图)。

实施例4：CiPSC品系的表征

获得自成纤维细胞的CiPSC的表征

之后进一步表征所建立的CiPSC品系。如通过免疫荧光和逆转录(RT)-PCR检测的，它们以与ESC的倍增时间(14.7小时)相似的倍增时间 (14.1至15.1小时)生长，维持碱性磷酸酶活性，并且表达多能性标记(图 9A-9D)。具体地，将来自第21代的CiPS-25、来自第7代的CiPS-26和来自第22代的CiPS-30培养另外6代。使用来自第29代的ESC(R1)作为对照。将细胞每三天传代一次并且在没有在2i培养基中的饲养层的情况下以 20,000细胞/孔的密度接种在12孔板中。误差条表示s.d.(n＝3)。这些细胞的计算的群体倍增时间是14.8±2.1(CiPS-25)、15.1±1.9(CiPS-26)、和 14.1±1.7(CiPS-30)小时。这些时间与ESC的时间(14.7±1.2小时)相等。

在CiPSC、ESC、和OSKM-iPSC(通过Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc 诱导的iPSC)中基因表达谱是相似的。在CiPSC中的Oct4和Nanog启动子处的DNA甲基化状态和组蛋白修饰与在ESC中的相似。此外，在至多 13代内，CiPSC维持正常核型和遗传完整性，即CiPS细胞维持正常染色体数量、较少的变异拷贝数和遗传突变，并且使得它们安全用于进一步临床应用。

为了表征它们的分化潜力，将CiPSC注射至免疫缺陷(SCID)小鼠中。细胞能够分化为全部三个胚层的组织——呼吸上皮(内胚层)；肌细胞(中胚层)；神经上皮(内胚层)和色素上皮(外胚层)。当注射至八细胞胚胎或胚泡中时，CiPSC能够整合至包括性腺在内的全部三个胚层的器官中，并且传输至后续的子代。由克隆ciPS-34以及F2后代产生成体嵌合小鼠。克隆 CiPS-45的种系贡献在睾丸中示出。还用来源于MNF的CiPSC(克隆 MNF-CiPS-1)产生成体嵌合小鼠。用来源于MAF的CiPSC(克隆 MAF-CiPS-62)产生成体嵌合小鼠。用来源于MAF的CiPSC(克隆 MAF-CiPS-62)产生黑色F2后代。用来源于MAF的CiPSC(克隆 MAF-CiPS-63)产生黑色F2后代。用来源于WT MEF的CiPSC(克隆 CiPS-WT1，ICR)产生嵌合体，将其微注射至(C57×DBA)×ICR胚胎中。不同于由通过包括c-Myc在内的转录因子诱导的iPSC生成的嵌合小鼠 (Nakagawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：14152-14157(2010))，由 CiPSC生成的嵌合小鼠在多达6个月内100％存活并且明显健康(图10A)。这些观察显示，CiPSC完全被重编程为多能性细胞(表5)。

NSC和IEC来源的CiPSC的表征

对所建立的NSC-CiPSC品系和IEC-CiPSC品系进行进一步表征。与小鼠ESC相似，所建立的CiPSC品系的倍增时间是18h-24h(图14M)。如通过定量实时PCR和免疫荧光染色检测的，在得到的CiPSC品系中的多能性基因表述可与mESC相比，p(图10B-C)。通过RNA测序进行总体基因表达分析，并且相对于初始细胞，NSC-CiPSC和IEC-CiPSC与ESC 聚集(数据未示出)。为了检测表观遗传重编程状态，通过亚硫酸氢盐测序在多能性基因的两个核心Oct4和Nanog启动子处进行DNA甲基化分析。结果显示，在CiPSC和mESC中Oct4和Nanog启动子被超甲基化(数据未示出)。此外，将正常核型维持多至7代(数据未示出)，以及表7。

表7.借助核型分析的在NSC-CiPSC和IEC-CiPSC中的染色体的数量

为了评价来源于NSC和IEC的CiPSC的多能性，检查它们的体内发育潜力。在注射至免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠中之后，两种CiPSC品系可以用来自全部三个胚层的组织形成充分分化的畸胎瘤(数据未示出)。当注射至胚泡中时，CiPSC能够生成具有种系传递能力的嵌合小鼠(数据未示出)。这些结果证明，来源于NSC和IEC的CiPSC品系是多能性的并且完全重编程的。

实施例5：小分子的多能性诱导性质

为了更好地理解这些小分子的多能性诱导性质，概述了在化学重编程期间的总体基因表达。为了确定在化学重编程期间的基因表达谱的聚集，对在化学重编程期间在第12、20和32天用VC6TFZ(Z从第20天开始加入)处理的细胞培养样品进行分析。使用在第0天的MEF、CiPSC和ESC 作为对照。观察到某些关键多能性基因的连续活化，其通过实时PCR和免疫荧光验证。与MEF(第0天)相比在ESC中以多于10倍并且在样品中 (第32天)以多于3倍进行表达的基因包括Sall4、Sox2、Lin28a、Dppa2、 Esrrb、Klf4和Pou5f1。与MEF(第0天)和ESC相比，在样品中(第32天) 以多于3倍进行表达的基因包括Sox 17、Gata6和Gata4。两种多能性相关基因Sall4和Sox2的表达水平在早期响应于VC6TF而被最显著地诱导，多种胚胎外内胚层(XEN)标记Gata4、Gata6、和Sox17的表达一样(图 11A-J)。早在小分子处理之后12小时最显著地提高Sall4的表达，表明针对在化学重编程中的多能性可以在第一步中涉及Sall4(图11D)。对于其中从所使用的处理中取出小分子的实验来说，数据显示，毛喉素、CHIR99021 和616452中的每一种在12天之后活化Sall4和Sox2的内源性表达(图11G 和11H)和随后的其他多能性基因的表达(图11I)方面是必需的。在活化 XEN-基因如Gata6、Gata4和Sox17中也需要这些分子。

使用基因过度表达和敲除策略检查这些基因的内源性表达在化学重编程中的作用。数据显示，伴随的Sall4和Sox2的过度表达能够活化Oct4 启动子驱动的荧光素酶报告蛋白(图12A-C)并且足以在诱导Oct4表达和生成iPSC中代替C6F(图12D-E)。Sall4而不是Sox2的内源性表达需要XEN 基因的活化，并且反之亦然(图13A-D)。这暗示了与之前在小鼠XEN形成中描述的相似的通过Sall4、Gata4、Gata6、和Sox17形成的正反馈网络(Lim 等，Cell Stem Cell，3：543-554(2008))。Sall4或这些XEN基因的敲除损害了Oct4活化和随后的多能性的建立(图13E-F)，与之前的Gata4和Gata6 可以有利于诱导多能性的发现不一致。(Shu等，Cell，153：963-975(2013))。总之，这些发现揭示了在化学重编程的早期起作用的Sall4介导的分子通路(图13G)。这个步骤类似于在两栖动物四肢再生期间体内的Sall4介导的去分化过程(Neff等，Dev.Dyn.，240：979-989(2011))。

接下来，研究在化学重编程的后期中加入的DZNep的作用。数据显示，在化学重编程中加入DZNep之后，Oct4表达显著提高(图11A)，并且对于刺激Oct4而不是其他多能性基因的表达来说，DZNep是关键的(图 11K)。作为SAH水解酶抑制剂，DZNep提高了SAH与S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)的浓度比并且从而可以抑制SAM依赖性细胞甲基化过程(图14A)。在图14B中示出了用SAH水解酶抑制剂((-)NeplanocinA(Nep A)、腺苷高碘酸盐(氧化的)Adox和3-脱氮腺苷(DZA))(Chiang等，Pharmacol.Ther.， 77：115-134(1998)，Gordon等，Eur.J.Biochem.270：3507-3517(2003))代替DZNep、与VC6TF处理组合以诱导CiPSC生成。数据显示，NEPA、 ADOX和DZA各自可用于在重编程中代替DZNep。它们调节与DZNep 相同的靶标，并且可以在生成CiPSC中代替DZNep。

一贯地，DZNep显著降低在Oct4启动子处的DNA甲基化和H3K9 甲基化(图11L)，并且可以解释其在Oct4活化中的作用(Feldman等，Nat. Cell Biol.，8：188-194(2006)；Chen等，Nat.Genet.，45：34-42(2013))。DZNep 在诱导CiPSC中的功能不能通过下调Ezh2表达来代替(图14C-E)。不同于其他群落，在原代培养物中的GFP+/ES样群落表达高mRNA水平的Nanog 和低水平的Gata6，类似于ESC和所建立的CiPSC(数据未示出)。作为主多能性基因，Oct4和Sox2因此可以在2i的存在下活化其他多能性相关基因并且执行化学重编程过程，连同Nanog的活化和Gata6的沉默(Silva等， PLoS Biol.，6：e253(2008)，Theunissen等，Curr.Biol.，21：65-71(2011).Boyer 等，Cell，122：947-956(2005)；Chazaud等，Dev.Cell，10：615-624(2006))。

总而言之，作为控制多能性的主开关，在体细胞中通过多种表观遗传修饰保持被阻遏的Oct4表达在化学重编程中通过表观遗传调节剂DZNep 解锁并且通过Sox2和Sall4的C6F诱导的表达进行刺激(图13G)。

在化学重编程中在不同细胞类型之间初始基因活化是保守的

在化学诱导重编程为多能性的初始阶段，NSC和IEC被转化为高折射率、透亮且上皮状的细胞，其在MEF化学重编程期间共有部分群落的相似形态。在大约第20-32天观察到致密、上皮状群落(数据未示出)，并且在至少十个独立实验中全部CiPSC群落来源于这些上皮状群落。在NSC 和IEC的化学重编程期间进行时间过程定量实时PCR。数据分析结果显示，在NSC和IEC的重编程期间，多能性基因Sall4以及分化相关基因 Gata4、Gata6和Sox17早在第4天被活化并且在早期中随时间增加，而其他多能性基因如Lin28a、Dppa2、Esrrb和Oct4被活化晚得多(图15B、15C 和15E)，这与来自MEF的化学重编程过程相似。此外，在NSC中没有检测到Sall4、Gata4、Gata6和Sox17的先天表达(图15D和未示出的数据)。有趣的是，对于不同细胞类型的重编程来说关键的616452的浓度的精细调节引起Sall4、Gata4和Sox17的较高的基因表达(图15F和15D)。这些结果表明，来自全部三个胚层的细胞类型的化学重编程共有相似的初始基因活化程序，而不考虑细胞来源和先天细胞特征。

这个原理论证研究表明，可以仅使用小分子化合物操纵针对多能性的体细胞重编程(图15A)。确定的是，通过借助小分子调节对多能性非特异性的分子途径而不是通过外源提供的“主基因”，可以建立内源性多能性程序。这些发现增加了细胞身份建立的理解并且在再生医学中通过使用特异性化学物质或药物代替遗传操作和难以制造的生物制剂进行细胞命运重编程而开启了生成功能上希望的细胞类型的可能性。

总之，当前数据确定，尽管对于不同细胞类型来说通常需要相似的化学混合物，精细调节小分子的处理在不同细胞类型中提供了改善的重编程启动。尤其是对于NSC的化学重编程来说，与针对MEF所使用的10μM 相比，应当将616452的浓度降低至2μM。尤其是，降低的616452浓度引起Sall4和Gata4基因的提高的表达(图15D)，这进一步支持了这些基因的高表达在多能性的化学启动中的作用。此外，616452在化学重编程和常规转录因子诱导的重编程中显示出不同的功能。在常规转录因子诱导的重编程中，Oct4和Klf4或c-Myc的异位表达足以在不存在外源Sox2的情况下由NSC生成iPS细胞(Kim等，2008)。此外，也被命名为RepSox的616452 据报道在常规转录因子诱导的重编程中代替Sox2过度表达(Ichida等，2009)。然而，相比之下，在由NSC进行化学重编程中，尽管Sox2的内源性表达高，不能将616452移除。在化学重编程中，616452反而促进Sall4、 Gata4、Gata6和Sox17的早期表达和随后的上皮状群落形成(图15F和 15D)。这些发现表明，化学重编程是与转录因子诱导的重编程不同的过程。

有趣的是，NSC和IEC的重编程动力学和频率彼此不同。前者经历较长的早期，并且生成较少的上皮状群落，但是几乎100％的群落可以转化为CiPSC群落。相反，后者可以容易地形成更多上皮状群落，但是这些群落的仅20-30％转化为CiPSC群落。

实施例6.作为化学重编程期间作为基础事件的表达XEN细胞标记的细胞群落的诱导的鉴别

在Hou等，Science 341，651-654(2013)中描述的用于由非多能干细胞诱导多能干细胞的方法中，在化学重编程过程中存在三个基本阶段。将细胞重编程为CiPSC得到五种小分子的混合物，在阶段1中使用“VC6TF” 16-20天，之后在阶段2开始时在接下来的20-24天内加入另一种小分子 DZNep(即，VC6TFZ)，并且在阶段3中在最后12-16天内使用2i培养基，在一些情况下加入额外的小分子。总之，可以采取长达48-60天的化学重编程过程，得到约40个群落的最大值(图19A)。

为了提高将非多能细胞重编程为CiPSC的效率，通过小心关注在每个阶段中的化学重编程期间的细胞形态的变化，进行研究以表征化学重编程过程。这些研究揭示了在阶段1的末期形成的大量上皮群落，其在阶段2 期间迅速扩增。通过跟踪在化学重编程期间细胞命运的动态变化，这些研究揭示了，CiPSC主要从这些上皮细胞群落内部出现(图16A)。在一些实验中，100％的CiPSC由这些群落生成，即使当以较低密度重新接种细胞时；上皮细胞群落生长至小于20％汇合。这些发现表明，在重编程期间存在细胞的亚群，其更适合准备用于转化为CiPSC。

之后使用免疫荧光和定量实时PCR(qRT-PCR)检查这些上皮细胞群落的基因表达模式。免疫荧光显示，在阶段1的末期中形成的全部上皮群落共表达SALL4、GATA4和SOX17，即XEN的主基因(Lim等，Cell Stem Cell， 3：543-554(2008))(数据未示出)。qRT-PCR分析进一步检测了在这些群落中的其他XEN标记基因如Sox7和Gata6的表达(图16B)，其可与胚胎来源的XEN细胞(eXEN)的表达相比(Kunath等，2005)(图16C)。这些表达XEN 标记的上皮细胞在本文中被称为XEN样细胞。

进一步进行研究以确定这些XEN样细胞是否代表化学重编程的中间状态。使用表达表面蛋白EpCAM的XEN，在第20天通过FACS分选使 XEN样细胞富集，并且发现针对EpCAM阳性细胞的选择使形成XEN样细胞群落并且随后生成CiPSC的细胞的比例富集多于20倍(图16C和 16D)。当起始细胞是神经干细胞和肠上皮细胞时，得到相似的结果。 EpCAM还使在化学重编程期间形成XEN样群落的细胞强烈富集并且提高由这两种初始细胞类型生成CiPSC的能力(图16E)。

为了确定在由XEN样细胞诱导多能干细胞的情况下是否存在共表达 XEN主基因和多能性相关基因的过渡群落，在阶段2中评估两种标记的表达。在重编程的阶段2期间检测共表达GATA4和OCT4的细胞(数据未示出)。在阶段3中鉴别在外周表达GATA4的细胞群落和在群落中间表达 pOct4-GFP的细胞群落，它们可以是从XEN样到多能干细胞的细胞命运转变的中间体细胞群落(数据未示出)。总之，这些结果表明，XEN样细胞代表针对多能性的化学重编程的中间状态。

实施例7.促进从成纤维细胞到XEN样细胞的转变的小分子的鉴别

在实施例6中化学重编程的中间状态的鉴别提供了用于增强重编程条件和用于通过使用XEN样群落数量作为读数在早期重编程中筛选新型小分子增强剂的目标。增加的CHIR99021的浓度被证明有益于由MEF形成 XEN样群落(图17A)。通过qRT-PCR分析显示，这种增加的CHIR99021 的浓度促进了XEN主基因Gata4和Soxl7和上皮细胞标记EpCAM的表达多至10倍的增加(图17B和17C)。

接下来，在小分子混合物VC6TF与20μM CHIR99021的存在下测试之前报道的重编程增强剂的选择的小分子文库对从成纤维细胞到XEN样细胞的细胞命运的重编程的影响。在测试的小分子中，RA激动剂AM580(A) 和DOT1L抑制剂EPZ004777(E)各自将XEN样群落的形成提高2至3倍。当在七种小分子的混合物VC6TFAE中一起使用这些小分子时，XEN样群落的数量提高多于5倍(图17D)。通过对SALL4和GATA4双阳性群落的数量进行计数并且通过借助qRT-PCR检测XEN标记基因的表达，进一步验证这些发现(图17E-I)。总之，通过选择小分子浓度的组合和在细胞培养基中包含的额外的小分子类型，可以将XEN样群落的数量，即早期重编程的指标提高多于50倍。

实施例8.促进从XEN样到多能状态的转变的小分子的鉴别

接着进行研究以鉴别在阶段2和3期间促进XEN样群落到CiPSC的转变的小分子。在小分子混合物VC6TFA加DZNep(Z)的存在下进行小分子筛查12天，并且成功提高CiPSC群落的生成。相比之下，在Hou等， Science 341：651-654(2013)中，阶段2的最佳持续时间是20-24天；如果将阶段2缩短至12天，则得到很少的CiPSC群落。

在选择和筛选88种小分子之后，发现仅当在阶段2期间细胞培养基补充有5-aza-dC时CiPSC群落在阶段3中形成。5-aza-dC(D)和EPZ004777 (E)具有协同效应并且促进阶段2的动力学。因此，通过在阶段2期间使用八种小分子的混合物VC6TFA+ZDE 12天，在44天的重编程过程的末期从100,000个重新接种的细胞得到多至20个CiPSC群落(图18A)。相反，在不使用5-aza-dC和EPZ004777的情况下，在相同的时间过程期间，得到很少的CiPSC群落。然而，当在阶段2期间使用另一种DOT1L抑制剂 SGC0946(S)代替EPZ004777时，在100,000或20,000细胞/6孔板中的孔的重新接种密度下重编程效率进一步增加多至5倍(图18A-C)(300,000至 500,000细胞/6孔板中的孔的初始细胞密度)，尤其是当使用进一步补充的 2i培养基(N2B27-2i培养基)时(图18B和18C)。接下来，如果存在的话，研究小分子的重新接种密度和浓度对所得到的CiPSC群落的数量的影响。在阶段2期间使用小分子混合物VC6TFA+ZDS 12天，在化学重编程的最终阶段期间由50,000个重新接种的细胞得到大约100-600个CiPSC群落。数据显示，尽管在阶段2期间SGC0946可以比EPZ004777更有效，在阶段1期间SGC0946不能代替EPZ004777，因为如果从化学重编程开始使用SGC0946的话，细胞活力降低。(图18D-18G)。重要的是，在五个独立实验中，CiPSC群落从24-53％的XEN样群落中出现，指出了在阶段2的开始的单一XEN样细胞与在阶段3的末期的CiPSC的转变比(图18H)。此外，几乎全部CiPSC群落都来源于XEN样群落，即使效率大幅提高(图 18H)。

这些研究显示，在重编程的稍后阶段期间，小分子处理的持续时间和重新接种细胞密度二者都是非常关键的。不遵循偏置/富集XEN样细胞群体的重编程途径的之前的研究有利于300,000细胞/孔的重新接种细胞密度。(Hou等，(2013))。然而，当通过富集XEN样细胞进行CiPSC重编程时，优选以50,000-100,000细胞/6孔板的孔的细胞密度重新接种细胞(图 18D)。此外，之前描述的方案在阶段2期间需要24天的重编程以实现最佳重编程效率(Hou等，(2013))。相比之下，如在本文中所描述的偏置/富集XEN样细胞群体的方案需要12天的最佳阶段2持续时间(图18E)。

总而言之，通过选择小分子的第一混合物以富集/偏置要重编程为 XEN样状态的细胞、选择小分子的第二混合物以及重新接种密度和用于从 XEN到CiPSC的转变的细胞培养时间，在本文中所公开的方法大幅改善了从非多能到多能细胞的细胞转变。

实施例9.稳健CiPSC诱导方案的建立是通过调节经由XEN样状态的细胞转变而建立的

条件接下来，将在实施例8中确定的阶段1、2和3的重编程条件组合以将成纤维细胞重编程为CiPSC。使用这种新方案，诱导50,000个初始成纤维细胞的孔，并且将细胞扩增为多于1,000,000或更多个重新接种的细胞(重新接种至10-15个孔中)。在重编程阶段的末期得到总计1,000-9,000 个CiPSC群落，并且总诱导时间为40天(阶段1、2和3分别为16、12、和12天)。在图19A中示出了包括偏置为XEN样细胞的重编程方案和在实施例3中例示出的之前的方案的比较。此外，这种新方案独立重现多于 20次，并且也可以以显著提高的效率由新生皮肤成纤维细胞(MNF)和成体肺成纤维细胞(MAF)生成CiPSC(图19B)。

通过使用这种新型小分子混合物和在实施例8中确立的重编程条件，进一步在诱导CiPSC中所需的最小时间过程。在XEN样群落的形成中需要12天的最小值(在第8天将细胞重新接种)，并且需要至少另外14天以由XEN样细胞诱导CiPSC(图19C)。总之，以效率为代价，通过使用新方案，需要26天的最小值以诱导CiPSC(图19C)。相比之下，使用初始方案，需要至少44天以由40,000个初始细胞生成仅0-1个CiPSC群落，并且如果将处理时间期限延长至多于60天，可以生成多至约40个CiPSC群落(表1A)。

之后挑取CiPSC群落以建立CiPSC品系，以用于进一步表征。如通过免疫染色和qRT-PCR示出的，CiPSC表达针对多能干细胞的全部测试的标记基因，如Oct4、Sox2和Nanog(图19D)。RNA-seq分析显示，用这种方案诱导的CiPSC具有与ESC的那些相似的基因表达谱(数据未示出)。针对它们用于体内发育的潜力，对CiPSC进行进一步测试。全部测试的6个CiPSC品系都能够在注射至SCID小鼠中之后形成畸胎瘤(数据未示出)并且在胚泡注射之后产生嵌合小鼠(数据未示出)。在5个测试的 CiPSC品系中，4个品系显示出在嵌合小鼠中的种系整合潜力(数据未示出)。此外，维持CiPSC具有正常核型(数据未示出)。总之，这些结果建立了通过更精确地经由XEN样状态操纵细胞命运转变得到的稳健的CiPSC 诱导方案。

在CiPSC生成期间的基因表达动力学

在化学重编程的不同阶段检查在化学重编程期间的一些典型的多能性相关基因的表达。数据显示出多能性基因的连续表达(图20A)。单细胞 qRT-PCR分析显示，在阶段2中大约50％的细胞共表达XEN细胞标记(图 20B)。与胚胎来源的XEN细胞相似，在重编程的早期阶段期间，在化学重编程期间形成的XEN样细胞表达多种多能性基因，如Sall4和Lin28a。(Lim等，Cell Stem Cell，3：543-554(2008)；McDonald等，Cell Reports， 9：780-793(2014))。在长时间的培养期间，XEN样细胞在第16-28天表达其他多能性相关基因，如Oct4和Dppa2。在阶段3期间，包括Nanog在内的大多数多能性标记基因的表达在CiPSC中活化(图20A和20C)。这个发现指出了从XEN样细胞到多能干细胞的连续基因活化的过程。有趣的是，之前已经报道了在细胞重编程的阶段1和2期间高度表达的与多能性相关的主要基因Sall4、Lin28a、Esrrb是转录因子诱导的重编程的预测的标记并且当与Nanog同时表达时足够用于诱导高质量的iPSC。(Buganim 等，Cell，150：1209-1222(2012)；Buganim等，CellStem Cell，15：295-309 (2014))。

通过qRT-PCR分析和RNA测序，将AM580和EPZ004777鉴别为在从成纤维细胞到XEN样细胞的化学重编程的阶段1期间均促进XEN标记基因如Sall4、Gata4和Sox17的表达的分子(图17F)。在化学重编程的阶段2期间，SGC0946和5-aza-dC促进在XEN样细胞中的多能性基因如 Oct4和Dppa家族基因的表达(图20D)。这些发现表明，通过借助提高XEN 主基因的表达发挥作用的额外小分子促进了化学重编程为XEN样细胞的阶段1，并且由于通过额外小分子提高了多能性相关基因的活化，可以缩短阶段2。接着进行研究以确定与使用OSKM的转基因策略的重编程过程相比，经由XEN样状态的重编程过程是否是针对多能性的独特途径(Takahashi等，Cell，131：861-872(2007)；Takahashi等，Nature Communications 5：3678(2014)；Takahashi和Yamanaka，Cell，126：663-676 (2006)。尤其是，通过qRT-PCR分析，OSKM诱导的重编程过程未显示出 XEN样基因特征(图20C)。这个发现还与其他报道中的重编程过程期间来自RNA测序或微阵列的初始数据一致(Golipour等，Cell Stem Cell 11：769-782(2012)；Mikkelsen等，Nature，454：49-55(2008)；Polo等，Cell 151：1617-1632(2012)；Sridharan等，Cell 136：364-377(2009))。

还检查了在化学重编程过程期间是否表达原始条纹基因(primitive streakgene)，因为在OSKM诱导的重编程过程期间已经报道了原始条纹状态。(Takahashi等，Nature Communications，5：3678(2014))。在化学重编程期间未检测到原始条纹标记如T和Mixl1的表达(数据未示出)，证实了在化学重编程过程期间独特的XEN样状态，这与通过转基因诱导的重编程不同(图20E)。

XEN主基因表达是化学重编程期间必需的

为了进一步支持作为用于化学重编程的中间体的XEN状态并且为了理解XEN主基因在化学重编程中的作用，进行敲除和异位表达实验。关键XEN基因Sall4、Gata4、Gata6或Sox17中的任一种的敲除均导致其他 XEN基因的mRNA水平的明显下调和XEN样群落数量的减少，因此在重编程阶段的末期得到较低的Oct4表达和较少的CiPSC(图21A-E)。XEN 基因的表达对于Oct4表达来说是必需的。还在由神经干细胞和肠上皮细胞进行化学重编程中提高了XEN基因表达(数据未示出)，并且这些基因的敲除损害XEN样群落形成以及此外由这两种初始细胞类型进行的CiPSC 诱导(图21F)。这些结果进一步表明，XEN样状态对于化学重编程过程来说是必需的。相反，在OSKM诱导的重编程中不需要这些XEN主基因，如Gata4、Gata6和Sox17(图21G)，这暗示了构成化学重编程和OSKM诱导的重编程的不同的路线图(20E)。

此外，在成纤维细胞中的XEN主基因(SALL4加GATA4或SALL4加 GATA6)中的两种的过度表达足够在不存在三种关键小分子CHIR99021、 616452和毛喉素的情况下诱导XEN样群落形成(图21H)。所得的XEN样细胞显示出与小分子诱导的XEN样细胞的基因表达模式相似的基因表达模式(图21I)。此外，在通过XEN细胞主转录因子的两种组合诱导的XEN 样群落中检测Oct4表达(图21J和未示出的数据)。这些发现表明，XEN基因是必需的且足够的以引发作为多能性主基因的Oct4的表达。

值得注意的是，尽管这些XEN主基因诱导的XEN样细胞表达Oct4，即使在2i培养基中长时间培养，它们也不能被进一步重编程为iPSC。外源XEN基因下调Sox2的内源性表达(图21K)。

因此，当在XEN基因过度表达之后的适当时间窗口外源提供Sox2时，得到iPSC(图21L和未示出的数据)。这个发现与我们之前在调节多能性建立中的跷跷板模型的发现一致，其中Gata家族基因和Sox2应当处于平衡中以实现多能性(Shu等，Cell，153：963-975(2013))，然而在化学重编程中，这样的平衡可以是动态过程，而不是稳定的平衡。

在基因表达模式、体内发育潜力和重编程潜力方面类似于胚胎来源的 XEN细胞的XEN样中间体

针对体外培养条件，将化学诱导的XEN样细胞与胚胎来源的XEN细胞(eXEN)进行比较(Kunath等，Development 132：1649-1661(2005))。研究显示，可以不将XEN样细胞维持在常规XEN培养基(RPMI CM(常规XEN 培养基；具有70％MEF条件培养基的RPMI-培养基))中(Kunath等， Development，132：1649-1661(2005))(数据未示出)。此外，可以在化学重编程的阶段1培养基中将eXEN细胞系长期维持其扩增多于20代，并且基因表达模式和体内发育潜力与维持在常规XEN培养基中的eXEN相似(数据未示出)。

通过使用包含化学混合物VC6TF的阶段1培养基，可以由胚泡直接建立化学来源的eXEN细胞系(CeXEN)并且将其长期扩增多于25代，其具有XEN样基因表达模式和到胚外腔壁内胚层(extraembryonic parietal endoderm)中的体内整合能力(图22A-B，表7，和未示出的数据)。

表7.所指出的不同细胞类型对腔壁内胚层的XEN整合嵌合能力的统计表。将EGFP标记的成纤维细胞设定为阴性对照。

qRT-PCR分析显示，XEN样细胞表达与eXEN和CeXEN的水平相当的水平的XEN主基因(图16B，22A和未示出的数据)。在阶段1和2的末期的总体基因表达谱显示，XEN样细胞显示出与eXEN和CeXEN接近的基因表达谱(图22B)。基因表达谱的主要组分分析(PCA)分析显示出从成纤维细胞经由与eXEN和CeXEN接近的XEN样状态到多能干细胞的清楚的路线图(数据未示出)。

尤其是，在基因表达谱方面，与常规eXEN相比，在化学重编程中的 XEN样中间体更接近CeXEN(图22B和未示出的数据)。此外，在XEN 样细胞和CeXEN中的EpCAM、Cdh1和Sox2的mRNA水平明显高于在常规eXEN中的mRNA水平(图22C)。可能的是，XEN样细胞和常规eXEN 之间的基因表达模式的差异是由于它们的不同培养条件造成的。有趣的是，可靠的XEN细胞以可与ESC的水平相比的高水平体内表达EPCAM 和CDH1，并且以较低水平、与XEN样细胞和CeXEN而不是eXEN的模式相似的模式表达SOX2(图22D)。这表明，尽管XEN样细胞显示出与eXEN在培养条件和基因表达模式方面的一些差异，它们与另一种类型的胚胎来源的XEN细胞CeXEN更相似。

还检查了在化学重编程期间XEN样细胞的体内发育潜力。将在化学重编程的不同时间过程中诱导的XEN样细胞注射至小鼠胚泡中。与eXEN 细胞类似，在化学重编程的第11-25天的XEN样细胞能够以与eXEN相当的效率整合至胚外组织的腔壁内胚层中，而没有在胚胎中的任何整合(数据未示出和表7)。尤其是，在化学重编程的第16天中的XEN样细胞显示出最高的XEN整合比率(表7)。这些发现表明，XEN样细胞在发育潜力方面与胚胎来源的XEN细胞类似。此外，通过在阶段2和3中使用后期化学重编程的方案，通过常规XEN培养基得到的eXEN或通过化学重编程的阶段1培养基建立的CeXEN能够进一步重编程为CiPSC(数据未示出)。值得注意的是，在24天内由2,000个CeXEN生成17-34个CiPSC群落，这是甚至高于XEN样细胞的重编程效率的重编程效率。

由eXEN和CeXEN生成的CiPSC的另外的特征为拥有与多能性干细胞相似的表达模式(图22D和未示出的数据)。这些发现进一步支持，与 CeXEN相似的、在CiPSC生成的早期中诱导的XEN样细胞易于在化学重编程的后期中进一步重编程。

讨论

总而言之，我们证明XEN样状态为用于化学重编程的中间体，其与其他重编程情况不同。可以将化学重编程过程分为两个主要步骤。在重编程的第一步中，将成纤维细胞直接转化为XEN样细胞，而在重编程的稍后的步骤中，将XEN样细胞转化为CiPSC(图15D)。

XEN样状态在化学重编程中的作用的确定揭示了针对多能性的体细胞的化学重编程中、而不是在OSKM诱导的重编程中的独特途径(图20E)。这个途径还与通过转录因子诱导的、原始条纹样状态介导的重编程过程不同。(Takahashi等，Nature Communications 5：3678(2014))。此外，将来自小鼠胚胎的成纤维细胞诱导为类似于在化学重编程过程中的胚外谱系的细胞类型，这明显不是如最近报道的具有基因表达变化的多个一过性波(transient wave)的反向正常发育过程(Cacchiarelli等，Cell 162：412-424 (2015))。还需要XEN样状态以由其他细胞类型如神经干细胞和肠上皮细胞生成CiPSC，指出了使用小分子将其他细胞类型重编程的一般途径。有趣的是，在化学重编程期间诱导的XEN样细胞与胚胎来源的XEN细胞在基因表达模式、发育潜力和重编程潜力方面相似。这些共同提供了新的框架，以进一步研究XEN细胞和多能细胞的细胞命运以及这些细胞命运的转变。

此外，XEN样状态是独特的，因为其准备用于经历向多能性状态的进一步转化。与体内XEN细胞类似，诱导的XEN样细胞已经表达了Sall4 和Lin28a，即两种多能性主基因。可能的是，在XEN细胞和多能干细胞二者中表达的共有基因，如Sall4和Lin28a，在从XEN样状态到多能性的细胞命运转变期间使得多能性状态更易接触。此外，还证明了在化学重编程的阶段2期间在XEN样细胞中的许多多能性标记基因的连续表达。例如，活化Esrrb和Oct4的表达，并且Oct4的表达与XEN基因的表达相容。这个发现表明，容易在XEN样细胞中建立多能性网络。这个发现与体内 XEN细胞自发转变为处于引发的多能性状态的外胚层干细胞的近期报道一致(Xenopoulos等，Cell Reports，10：1508-1520(2015))。XEN样基因的相容性和多能性基因的表达使得XEN样状态成为体细胞和多能细胞之间的理想桥梁。

这些研究确立，对于在化学重编程期间诱导多能性来说，XEN样状态是必需的，可能是因为XEN的主基因直接有利于多能性的建立。

此外，研究表明，XEN样基因可以在化学重编程中具有双重作用。如之前报道的，在XEN基因和多能性相关基因之间存在多种相互拮抗机制，如Sox17与Sox2之间和Gata6与Nanog之间的不相容。(Aksoy等，The EMBO Journal 32：938-953(2013)；Chazaud等，Developmental Cell， 10：615-624(2006)；Niakan等，Genes&Development，24：312-326(2010))。在本研究中，Sox2的表达受XEN基因阻遏。此外，在化学重编程的阶段 3期间，Nanog和Sox2的表达与Gata4的表达不相容，使人想起了如之前报道的通过在小鼠胚泡中的FGF/ERK信号传导调节的XEN和外胚层之间的细胞命运确定(Yamanaka等，Development，137：715-724(2010)。在化学重编程的早期期间，需要XEN状态以引发选择的多能性基因如Sall4、 Lin28a和Oct4的表达。然而，在重编程的稍后阶段中，需要将这些XEN 基因沉默以引发额外多能性基因如Nanog和Sox2的表达。

最重要的是，在本研究中，通过操纵经由XEN样状态的细胞命运转变，通过仔细选择将细胞偏置为XEN样状态以及之后的CiPSC的小分子混合物、浓度、持续时间和在每个阶段期间的细胞操作的其他详情，大幅改善了化学重编程，与不通过如在本文中所描述的偏置为XEN样状态进行的化学重编程方案相比大幅提高了CiPSC生成的效率并且将CiPSC群落的总收率增加高达1,000倍。

Claims

1.一种用于诱导非多能真核细胞中的多能性的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含选自以下组中的每一种中的多能性化学诱导剂(CIP)：

(1)糖原合成酶激酶(GSK)抑制剂，

(2)TGFβ受体抑制剂，

(3)环AMP(cAMP)激动剂，

(4)S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAH)抑制剂，

(5)组蛋白乙酰化剂，

(6)DOT1L甲基转移酶抑制剂，

(7)视黄酸受体(RAR)激动剂，

(8)表观遗传调节剂，和

(9)组蛋白去甲基化抑制剂，

其中所述GSK抑制剂是[6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈](“C”)；所述TGFβ受体抑制剂是[2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶](“6”)；所述cAMP激动剂是毛喉素(“F”)，所述SAH抑制剂是3-脱氮瓶菌素A(“Z”)，所述DOT1L甲基转移酶抑制剂是SGC 0946(“S”)(1-[3-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基](异丙基)氨基]丙基]-3-[4-(2,2-二甲基乙基)苯基]脲)或EPZ004777，“1-(3-((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲(“E”)；RAR激动剂包括AM 580(“A”)(4-[(5，6，7，8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸)；所述表观遗传调节剂是5-氮杂胞苷(“D”)并且所述组蛋白去甲基化抑制剂是反苯环丙胺(“T”)，所述组蛋白乙酰化剂是丙戊酸(“V”)，所述组合物包含VC6TFZASD，

其中所述多能性化学诱导剂的量有效诱导XEN样细胞重编程为多能干细胞，其中所述XEN样细胞是指被表征为上皮细胞、并且表达XEN标记SALL4、GATA4和SOX17的细胞。

2.权利要求1所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含2i培养基，其中所述2i培养基是包含6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈(CHIR99021)和PD0325901的ESC培养基。

3.权利要求1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物还包含选自由前列腺素E2(PGE2)和咯利普兰组成的组的小分子。

4.权利要求1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物还包含提高/增加化学重编程效率的小分子，所述小分子选自由下列组成的组：SF1670[N-(9,10-二氧代-9,10-二氢菲-2-基)棕榈酰胺]；DY131[N-(4-(二乙基氨基亚苄基)-N’-(4-羟基苯甲酰基)-肼]；UNC0638[2-环己基-6-甲氧基-N-[1-(1-甲基乙基)-4-哌啶基]-7-[3-(1-吡咯烷基)丙氧基]-4-喹唑啉胺]；SRT1720[N-(2-(3-(哌嗪-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)喹喔啉-2-羧酰胺盐酸盐]；2-Me-5HT(2-甲基-5-羟色胺)；IBMX[3,7-二氢-1-甲基-3-(2-甲基丙基)-1H-嘌呤-2,6-二酮]；和(4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二

英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)和TTNPB[4-[(E)-2-(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸]。

5.权利要求1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物还包含N2B27。

6.权利要求1或2所述的试剂盒或细胞培养基组合物，所述组合物包含蛋白生长因子。

7.一种诱导部分或完全分化的非多能真核细胞中的多能性的方法，所述方法包括：

(a)使细胞与第一混合物接触足够的时间段以将所述细胞偏置为XEN样细胞群体，其中所述第一混合物包含VC6TFAE，其中VC6TFAE分别表示：丙戊酸(“V”)，6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈(“C”)，2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“6”)，反苯环丙胺(“T”)，毛喉素(“F”)，4-[(5，6，7，8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸(“A”)，1-(3-((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙基)氨基)丙基)-3-(4-(叔丁基)苯基)脲(“E”)，其中所述XEN样细胞是指被表征为上皮细胞、并且表达XEN标记SALL4、GATA4和SOX17的细胞；

(b)使所述XEN样细胞群体与第二混合物接触足够的时间段以将所述细胞重编程为化学诱导的多能干细胞(CiPSC)，其中所述第二混合物包含VC6TFZASD，其中VC6TFZASD分别表示：丙戊酸(“V”)，6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈(“C”)，2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“6”)，反苯环丙胺(“T”)，毛喉素(“F”)，3-脱氮瓶菌素A(“Z”)，4-[(5，6，7，8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲酸(“A”)，1-[3-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-5-溴-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基](异丙基)氨基]丙基]-3-[4-(2,2-二甲基乙基)苯基]脲(“S”)，和5-氮杂胞苷(“D”)；和

(c)在2i培养基中培养前一步骤获得的细胞，其中所述2i培养基是包含6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈(CHIR99021)和PD0325901的ESC培养基。

8.权利要求7所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞选自由下列组成的组：成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、和神经细胞。

9.权利要求7所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞选自由下列组成的组：血液来源的细胞、胚胎来源的细胞和皮肤来源的细胞。

10.权利要求7所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞选自由下列组成的组：间充质细胞和实质细胞。

11.权利要求7所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞为结缔组织细胞。

12.权利要求7所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞选自由下列组成的组：成纤维细胞、脂肪来源的细胞、神经来源的细胞和肠上皮细胞。

13.权利要求12所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞不表达Oct4。

14.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述部分或完全分化的非多能真核细胞不被转染以表达Oct4、KLF4、SOX2、C-Myc或NANOG中的任一种。

15.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中将所述部分或完全分化的非多能真核细胞在步骤(a)和(b)的培养基中培养26-30天之间的总时间段。

16.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中在使用2i培养基之前的全部时间使用包含VC6TFA的细胞培养基培养，其中VC6TFA分别表示：丙戊酸(“V”)，6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶腈(“C”)，2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(“6”)，反苯环丙胺(“T”)，毛喉素(“F”)，3-脱氮瓶菌素A(“Z”)。

17.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中在第6-10天之间将步骤(a)的细胞以50,000至100,000/孔之间的密度转移至6孔板中。

18.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中在第8天将步骤(a)的细胞以50,000至100,000/孔之间的密度转移至6孔板中。

19.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中在第26天至第30天之间将所述培养基更换为2i培养基。

20.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中在第28天将所述培养基更换为2i培养基。

21.权利要求20所述的方法，其中所述2i培养基还包含N2B27。

22.权利要求20所述的方法，其中将细胞在2i培养基中培养10-14天。

23.权利要求20所述的方法，其中将细胞在2i培养基中培养12天。

24.权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述第一混合物不包含SGC 0946。

25.权利要求7-13中任一项所述的方法，所述方法还包括分离步骤(c)获得的细胞。