CN104673741B - 高效非整合性人类iPSC诱导平台 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高效非整合性人类iPSC诱导平台。包括用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。在前诱导剂组合物作用下，iPSC的前诱导效率达6.4%。通过后诱导培养，可以将全培养物诱导达到20.8%，或者将前诱导物克隆全部进一步诱导为接近ESC的人类iPSC克隆。诱导效率远高于现有技术，得到的iPSC成熟度高，无外源基因插入，细胞形态、性能更接近于ESC，稳定性好，具有极高的应用价值。

Description

高效非整合性人类iPSC诱导平台

技术领域

本发明涉及一种将人类体细胞诱导为iPSC的诱导剂、诱导方法及诱导培养基。

背景技术

iPSC的成功诱导是干细胞研究的一个重大突破，iPSC解决了人 ESC 研究中存在的伦理学等问题，避开了核移植技术缺乏人卵母细胞的难题，为干细胞和再生医学的临床应用提供新的种子细胞来源；同时，也为发育生物学、疾病发生发展机制、基因与蛋白质功能研究以及药物筛选等提供重要的研究平台。

现有将体细胞诱导为iPSC方法有多种，如基因敲除、整合外源基因、细胞因子诱导或其结合。基因敲除、在基因组中整合外源基因会改变基因组，导致得到的iPSC不够稳定，存在极大的癌变可能，这些风险的存在阻碍了其应用。

2007 年日本、美国的科学家 (Takahashi et al. 2007 ；Yu et al. 2007 ；Parket al. 2008) 相继报道，在人类体细胞中通过逆转录病毒（或慢病毒）过表达四个转录因子基因（Oct4，Sox2，Klf4 与c-Myc，或者Oct4，Sox2，Nanog 与Lin28），逆转人类成体细胞的分化状态，获得多能潜能干细胞（iPSC，induced pluripotent stem cell）。有报道证实，通过病毒载体导入Oct3/4 和Sox2 两种转录因子基因，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞（Danwei Huangfu，2008）。2009 年3 月5 日，Cell报道Rudolf Jaenisch 研究组利用Cre-重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPSC 无外源因子，使iPSC 临床应用又推进了一步。2009 年3 月26 日，Science 报道俞君英等通过一种非整合质粒Episomal Vector 成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPSC（俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞，科学，2009.324:7797-801）。人类体细胞重编程为多潜能干细胞（iPSC）是近两年来干细胞研究领域的重要里程碑事件。在2007-2008 年连续两年被science 杂志评为十大科学进展(Kennedy 2007 ；Vogel 2008)。多种研究表明，通过引入利于iPSC诱导的外源基因，有助于将体细胞诱导为iPSC。特别的，使用附加型（非整合型）载体转染外源基因，可以有效避免外源基因整合到基因组中，安全性有所提高，日益受到人们的重视。

纯化学试剂诱导iPSC完全避免了引入外源基因，具有更高的安全性，日益成为iPSC研究中的热点。小鼠体细胞是进行iPSC诱导研究时常用的对象，人们从其中获得了大量的研究数据。Ying et al，2008指出，包含糖原合酶激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号抑制剂的（2i）培养基可以维持小鼠ES细胞处于基态。2013年7月18日，北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在《Science》杂志上发表了题为“Pluripotent StemCells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds ”的文章。文章中他们仅使用4个小分子化合物的组合对体细胞进行处理，成功逆转其“发育时钟”，重新赋予体细胞“多潜能性”，为诱导体细胞成为多能性干细胞提供了更加简单和安全的方法。此项工作之前，该研究小组报道了一种将多种小分子化合物“VC6T” [VPA，CHIR99021(CHIR)，616452，Tranylcypromine]联合Oct4单个外源基因导入实现小鼠体细胞重编程的方法。通过在小鼠成纤维细胞（ mouse embryonic fibroblasts ，MEFs）中转入由OCT4启动子启动GFP表达的质粒系统（Oct4 promoter-driven GFP expression ，OG），利用启动GFP表达对10000多种化学小分子进行筛选，选出了For-skolin (FSK)等OCT4“替代物”。 随后，研究人员对多种化合物组合进行优化，并通过添加DZNep，一种已知可促成晚期重编程阶段的化合物，得到了完全重编程的细胞，并最终利用7个化合物组合的混合物，将重编程效率提高至0.2%，与目前常用的建立小鼠iPS细胞的技术相当。

由于遗传背景和培养条件差异过大，我们和别人的研究表明适用于小鼠的iPSC诱导条件根本无法应用于人iPSC的诱导，还没有化学诱导人类iPS 细胞的成功报道。目前发展的游离体载体等诱导方法用于人类iPSC的诱导也能成功，并且比较安全，但是与小鼠的iPS细胞 的诱导效率更低，只有0.1～1%。开发出高效安全的将人体细胞诱导为iPSC的技术具有非常实际的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以将人体细胞高效诱导为iPSC的组合物及培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，

前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；

后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。

作为本发明的进一步改进，上述前诱导剂和后诱导剂中，转化生长因子β抑制剂选自E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin、LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDE1、ITD1、SD208、A83-01。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，糖原合成酶激酶3抑制剂选自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone、TCG24、TCS2002、FRATide、Indirubin-3’-oxime、ARA-A014418、BIO、MeBio。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，cAMP激动剂选自Forskolin、NKH477。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂选自DZNep、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，p21活化激酶抑制剂选自IPA-3、FRAX486。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂选自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。

一种将人体细胞诱导为iPSC的方法，包括如下步骤：

1)将人体细胞置于转染培养液中，加入附加型载体及至少一种有利于iPSC诱导的外源基因进行转染培养；

2)将转染后的细胞恢复培养，之后加入ESC培养液中，添加前诱导剂进行诱导培养，得到前诱导培养细胞；

3)将前诱导培养细胞置于添加有后诱导剂的ESC培养液中，继续培养得到iPSC；

前诱导剂和后诱导剂的组成如上所述。

作为上述将人体细胞诱导为iPSC方法的进一步改进，有利于iPSC诱导的外源基因选自OCT3/4、 p53 shRNA、SOX2、KLF4、 L-MYC、LIN28、Nanog。

一种将人体细胞诱导为iPSC的培养基，由前诱导培养基和后诱导培养基组成，前诱导培养基中上述的前诱导剂，后诱导培养基中添加有上述的后诱导剂。

本发明的有益效果是：

本发明的诱导剂，诱导效率高，iPSC的前诱导效率达6.4%。通过后诱导培养，可以将前诱导物进一步诱导为iPSC，诱导效率远高于现有技术，有利于iPSC的分离和纯化。

本发明的诱导方法，不会在基因组中引入外源基因，得到的iPSC成熟度高，细胞形态、性能更接近于ESC，最终得到的iPSC中无外源基因插入，细胞的遗传背景与原有的体细胞保持一致，具有极高的应用价值。同时，诱导得到的iPSC具有很好的稳定性。

附图说明

图1是前诱导培养24 D后不同组细胞的ALP染色结果；

图2是前诱导培养24 D后不同组细胞的SSEA4免疫染色和流式细胞分析结果；

图3是不同处理组诱导得到的细胞中ESC的标记物SSEA4的表达情况分析；

图4是诱导得到的成熟iPSC细胞的iPSC特异性抗体染色结果，红色为 Oct-4，绿色为 Tra-1-60；

图5是不同处理组诱导得到的细胞中ESC的标记物Oct4、Nanog和Sox2的表达情况分析；

图6是不同细胞集落的外源基因整合情况分析；

图7是诱导得到的iPSCs的畸胎瘤实验结果；

图8是诱导前后的成纤维细胞的形态照片。

具体实施方式

用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，

前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；

后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。

作为本发明的进一步改进，上述前诱导剂和后诱导剂中，转化生长因子β抑制剂选自E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin、LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDE1、ITD1、SD208、A83-01。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，糖原合成酶激酶3抑制剂选自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone、TCG24、TCS2002、FRATide、Indirubin-3’-oxime、ARA-A014418、BIO、MeBio。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，cAMP激动剂选自Forskolin、NKH477。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂选自DZNep、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，p21活化激酶抑制剂选自IPA-3、FRAX486。

特别的，前诱导剂的活性成分为：10μM的616452、10μM的 Chir99021、20μM的Forskolin、50nM的DZNep和1～50uM的 p21活化激酶抑制剂Ⅲ；后诱导剂的活性成分为：1uMPD0325901、10uM CHIR099021、50nM DZNep。

作为本发明的进一步改进，上述组合物中，选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂选自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。

因为各种化合物的活性不一，无法统一定义其用量。本领域技术人员可以参考相关的小分子抑制剂文献报道等确定其最低用量和最高用量，使用这些小分子化合物的浓度等一系列数据已有完整的相关报道，此外下述的文献实验方案可为本发明的参考之一。

转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂这一组合是已经被广泛研究的小鼠CiPSC诱导剂，具体可参见Hou P.，LiY.，Zhang X.，Liu C.，Guan J.，Li H. Zhao T.，Ye J.，Yang W.，Liu K.，Ge J.，Xu J.，Zhang Q.，Zhao Y.，& Deng H.，2013，Pluripotent stem cells induced from mousesomatic cells by small-molecule compounds， Science，341 (2013): 651-654。

P21活化激酶抑制剂，如IPA-3可以参考文献（Deacon，S. W. et al. An isoform-selective，small-molecule inhibitor targets the autoregulatory mechanism ofp21-activated kinase. Chemistry & biology 15，322-331）。前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂。在前诱导剂组合物作用下，iPSC的前诱导效率达6.4%。

已有研究证实，添加有2I（含糖原合酶激酶抑制剂和丝裂原活化蛋白激酶信号抑制剂）的ESC培养液，可以保持小鼠ESC维持基态（Ying QL，Wray J，Nichols J，Batlle-Morera L，Doble B，Woodgett J，Cohen P，Smith A.，2008， The ground state ofembryonic stemcell self-renewal. Nature; 453(7194): 519-23），同时有助于小鼠iPSC进一步转化至更为接近ESC。但是将2I用于人的iPSC诱导中，并不能促进细胞进一步重编程转化为接近ESC的人类iPSC。

发明人在2I的基础上，筛选添加另外一个已知效果小分子化合物S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂（具体可参见Hou 等，2013），组成后诱导剂组合。完整的后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。将前诱导培养细胞置于添加有后诱导剂的ESC培养液中，可以提高诱导效率，将全诱导物可以提高效率至20.8%，也可以将前诱导物克隆全部进一步重编程转化为接近ESC的人类iPSC克隆。诱导效率远高于现有技术，有利于iPSC的分离和纯化。

一种将人体细胞诱导为iPSC的方法，包括如下步骤：

1)将人体细胞置于转染培养液中，加入附加型载体及至少一种有利于iPSC诱导的外源基因进行转染；

2)将转染后的细胞恢复培养，之后加入ESC培养液中，添加前诱导剂进行诱导培养，得到前诱导培养细胞；

3)将前诱导培养细胞置于添加有后诱导剂的ESC培养液中，继续培养得到iPSC；

前诱导剂和后诱导剂的组成如上所述。

附加型载体的作用在于不改变原基因组的情况下，将外源基因转入细胞中。外源基因的转染操作可以按已有文献报导的方法进行。附加型载体可以是现有公知的附加型载体。

已经发现有利于iPSC诱导的外源基因有多种，其中OCT3/4、 p53 shRNA、SOX2、KLF4、L-MYC、 LIN28又称Y4因子（Okita K.，Nakagawa M.，Hyenjong H.，Ichisaka T.，&Yamanaka S.，2008，Generation of mouse induced pluripotent stem cells withoutviral vectors，Science，322: 949-953），其功能也已被深入研究，已有研究表明Y4可以将小鼠体细胞诱导为iPSC。

作为上述将人体细胞诱导为iPSC方法的进一步改进，有利于iPSC诱导的外源基因选自OCT3/4、 p53 shRNA、SOX2、KLF4、 L-MYC、LIN28、Nanog。

一种将人体细胞诱导为iPSC的培养基，由前诱导培养基和后诱导培养基组成，前诱导培养基中添加有上述的前诱导剂，后诱导培养基中添加有上述的后诱导剂。添加前诱导剂或后诱导剂的培养基可以是公知的hESC培养基，或其他类似的干细胞培养基。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

患者成纤维细胞的培养

从患者的皮肤取直径约为2mm的样品，取样在广东省中医医院伦理委员会的指导和批准之下进行并获得患者的书面同意。将样品进行消毒、灭菌处理，之后切成4块培养在容纳在T25培养瓶中的MEF培养液中（(DMEM 11965，450ml; Glutamax，5 mL，热失活处理的FBS（Hyclone），50mL，添加有1×青霉素/链霉素的β-巯基乙醇 (1000×，1mL)），培养液每周更换一次。

当细胞培养至80～90%满时，用胰蛋白酶消化，按1:3的比例继代培养。起始培养一般约需要1个月或更长的时间。之后，继代成纤维细胞培养分裂可每周进行一次。

附加型载体及外源基因组合

附加型载体源自Yamanaka实验室，购自Addgene，详情如下：Y4载体组合由3种载体组合，pCXLE-hOCT3/4-shp53携带有外源基因OCT3/4，p53 shRNA；pCXLE-hSK携带有外源基因SOX2，KLF4；pCXLE-hUL携带有外源基因L-MYC，LIN28。使用GFP载体监测转染效率。

使用附加型载体转染人成纤维细胞

使用Lonza-4D的核转染仪进行转染，试剂盒为推荐的试剂盒（4D-Nucleotector XKit，Cat.No. V4XP-2024），细胞为2～5代细胞，实验按推荐的方法进行，确定添加的外源基因DNA及其他条件如下：

外源基因包括Oct4/hsP53，hSK，hUL，总DNA量为2μg/转染回到核转染仪工作液中，核转染仪工作液与外源基因的比例为4.5：1，每转染的Nucleocuvette工作液的总体积为100μL。

iPSC的诱导

1)转染后的人成纤维细胞恢复培养2天，培养液使用胰蛋白酶消化，之后均分到覆盖有人工基底膜的6孔板，细胞密度为3×10⁴个/孔，细胞培养液为添加有bFGF的ESC培养液；对照组未添加小分子组合物；化合物处理组添加有4M或4M+9。4M分别为10μM的616452、10μM Chir99021、20μM的Forskolin和50nM的DZNep，4M+9为在4M的基础上额外添加1～50uM的 p21活化激酶抑制剂Ⅲ IPA-3；

2)培养4天后，在对照组的孔内添加等量的0.4ml新鲜hESC培养液，在处理组的孔内添加0.4ml添加有PCZ（PD0325901 1uM、CHIR099021 10uM 、DZNep 50nM）的hESC培养液；继续诱导培养至第24天；

3)第二代培养的细胞Accutase进行消化，并以1：6的比例接种覆盖有人工基底膜的新板孔中，培养液为添加有1 μM Thiazovivin的hESC培养液；第二天，将培养液更换为添加有PCZ的hESC培养液并持续培养至第36天，培养液每2～3天更换一次。

hESC培养液的组成为：培养基DMEM/F12（11330-032）；knockout血清替代品（knockout SR，试剂，10828-028）；NEAA（Gibco 11140-050，MEM氨基酸，谷氨酰胺（100×）；试剂，25030081，100×）；β-巯基乙醇（Gibco 55mm，21985-023）；碱性成纤维生长因子（AA10-155）重组人蛋白（Gibco phg0023，1mg）；青霉素、链霉素谷氨酰胺（Gibco 10378-016100m，L 100×）；胎牛血清（胎牛血清，16000-044）。参考文献（Okita，2011）公开的配方及制备方法。

iPSC的细胞形态、特性

外源DNA整合检测

参考使用Yamanaka实验室的研究报告，用RNA提取试剂盒（Qiagen公司），从细胞中提取总RNA。使用Superscript III第一链合成试剂盒，并按照其说明书进行cDNA的合成。cDNA以ddH₂O稀释50倍后，各取5 uL 用于在30个PCR循环的RT-PCR扩增，采用的扩增仪为BIO-RAD RT-PCR CFX96，PCR程序为PCR仪推荐的标准程序。

免疫化学分析

使用4%v/v的多聚甲醛固定细胞，然后使用0.2% v/v吐温（PBST）（FisherScientific）的PBS洗三次，使用含有0.2% v/v TritonX-100 (Sigma-Aldrich)的PBS室温处理1 h提高细胞的通透性；通透处理之后，使用含有1% V / V BSA阻断（Sigma）的PBST（Fisher Scientific）在室温下轻摇30分钟，阻断细胞的非特异性结合；温和去除PBSTB，将细胞与一抗、添加有1 μg/ml DAPI的PBSTB 4℃混合孵育过夜；过夜后，使用PBST清洗细胞三次，接着使用PBSTB稀释1000倍的二抗（Alexa Fluor 488 或 555; Invitrogen）室温染色1 h。细胞核使用DAPI复染，显微镜观察。

实验中使用的抗体为：SSEA4 (Stemgent，Stain Alive Dylight 550 anti-humanSSEA-4 Antibody，MC-813-70); Oct3/4 Alexa Fluor 647 (BD Pharmgen，560307); Hu-Nanog-PE (BD Pharmgen，100TSTN31-355); HU-TRA-1-60-AG-FITC (BD Pharmgen，MAB100TST); HU-TRA-1-81(BD pharmgen，ALEXA 647 FC 100TST); SOX2 (BD Pharmgen，ALEXA 555 MAB 45610)。

ALP染色

使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒（Sigma，86R ALP）检测诱导得到的iPSC。

畸胎瘤实验

将混合有基质胶的3百万iPSC细胞注入严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠的肾囊。6周后，切除肿瘤并使用4%多聚甲醛固定并进行组织学分析。NOD / SCID小鼠的使用由广东中医院动物研究委员会伦理委员会批准。

实验结果

实验结果表明：

在培养24 d后，对不同组的细胞进行ALP染色，结果如图1所示。4M处理组提高了细胞集落数，但是细胞集落（克隆）的大部分与人类ESC集落的紧密形态、ALP染色、SSEA4染色，和Oct4表达均不相同，说明4M处理并不能将人的体细胞诱导为iPSC； 4M+9处理组可以使重编程的细胞的成熟度进一步提高。

SSEA4免疫染色和流式细胞分析显示4M处理组可以提高集落数，而4M+9处理处理组可以使细胞的转化率提高至6.1%（图2）。

在添加有PCZ的培养液中进一步培养后，发现PCZ可以进一步改善人类iPSC的维持和扩增。在第二代培养的细胞继续诱导培养后的第36天，ESC的标记物SSEA4显著增加到20.8%（图3）。而且iPSC克隆能表达所有成熟的iPSC标记蛋白（图4-5）。 此外，这些hiPSCs的ESC标记物Nanog、Oct4同样呈阳性（图5）。这些结果显示PCZ的长期处理可以进一步提高iPSC的转化率。

定量PCR检测iPSC克隆的附加体载体的整合情况，结果表明5个iPSC克隆中的4个克隆没有载体基因存在于iPSC基因组中（图6），说明附加体载体并不能将外源基因永久性地导入到基因组中，这大大提高了iPSCs的安全性。

除了对ESC特异性标记物的表达，畸胎瘤实验结果表明，非整合iPSC的细胞系可以有效地形成分化好的畸胎瘤，分化出所有3个胚层细胞类型，进一步证实人类诱导多能干细胞具有完全的多能性（图7）。

图8左是培养前人体成纤维细胞的显微照片，右侧是诱导培养60天（24+36）后的成熟iPSC的显微照片。从图中可以看出，培养前后细胞的形态具有显著的区别。诱导得到的iPSC的形态上更接近于ESC。

Claims (10)

1.用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，

前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；

后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：转化生长因子β抑制剂选自E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin、LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDE1、ITD1、SD208、A83-01。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：糖原合成酶激酶3抑制剂选自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone、TCG24、TCS2002、FRATide、Indirubin-3’-oxime、ARA-A014418、BIO、MeBio。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：cAMP激动剂选自Forskolin、NKH477。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂选自DZNep、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：p21活化激酶抑制剂选自IPA-3、FRAX486。

7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂选自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。

8.一种将人体细胞诱导为iPSC的方法，包括如下步骤：

1）将人体细胞置于转染培养液中，加入附加型载体及至少一种有利于iPSC诱导的外源基因进行转染培养；

2）将转染后的细胞恢复培养，之后加入ESC培养液中，添加前诱导剂进行诱导培养，得到前诱导培养细胞；

3）将前诱导培养细胞置于添加有后诱导剂的ESC培养液中，继续培养得到iPSC；

前诱导剂和后诱导剂的组成如权利要求1～7任意一项所述。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：有利于iPSC诱导的外源基因选自OCT3/4、p53 shRNA、SOX2、KLF4、 L-MYC、LIN28、Nanog。

10.一种将人体细胞诱导为iPSC的培养基，由前诱导培养基和后诱导培养基组成，其特征在于：前诱导培养基中添加有权利要求1～7任意一项组合物中的前诱导剂，后诱导培养基中添加有权利要求1～7任意一项组合物中的后诱导剂。