CN106086071B - 一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs - Google Patents

一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs Download PDF

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Abstract

本发明公开一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs。具体地，该诱导方法包括以下步骤：1)将表达重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa‑miR‑302s的DNA序列构建到附加体质粒中，得到重组质粒；2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞中，进行诱导培养，得到iPSCs。该方法在不加入高风险重编程因子，如c‑MYC、SV40‑LT、TP53抑制因子等的情况下，使用安全性高的重编程因子组合，降低了iPSCs的临床适用风险；该方法具有较高的适用性。

Description

一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得 的iPSCs
技术领域
本发明涉及一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs，属于生物工程技术以及再生医学领域。
背景技术
经典干细胞生物学通常认为细胞分化是单向不可逆的，1962年，英国科学家JohnB.Gurdon将青蛙肠细胞核移植入去核的青蛙卵细胞内，并发育成一只正常的蝌蚪，首次证实了体细胞核可以重编程为具有类似胚胎发育早期阶段的多能细胞状态，类似的技术也催生了各种克隆的哺乳动物诞生。在Gurdon成果报道四十年后，日本科学家Shinya Yamanaka于2006年利用逆转录病毒携带的四个转录因子(OCT4(标准基因名为：POU5F1)、SOX2、KLF4、c-MYC，简称OSKM)成功地将小鼠成纤维细胞重编程为具备胚胎干细胞(embryonic stemcells，ESCs)多能性的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，次年Yamanaka研究小组利用相同的方法获得了人的iPSCs，与此同时James A.Thomson研究小组也通过慢病毒携带另外四个转录因子(OCT4、SOX2、Nanog、Lin28，简称OSNL)成功获得了人的iPSCs(hiPSCs)。由于iPSCs不受如克隆技术以及ESCs(来源于胚胎组织)使用的伦理限制，且与ESCs在形态、基因表达谱系、表观遗传谱系、自我更新能力以及多能性等方面表现出高度的相似，甚至不可区分，能够向所有成体细胞、组织、器官分化，使其具备在器官组织细胞移植、肿瘤治疗、遗传病修复、药物筛选等领域能够发挥重要的作用，因此iPSCs的诞生给干细胞与再生医学带来前所未有的一场革命。
我们将重编程因子导入细胞的方式分为病毒和非病毒介导两种，经典的方法采用病毒携带重编程基因，然而由于慢病毒或逆转录病毒会将其基因组插入整合到宿主基因组中，存在染色质不稳定甚至细胞癌变的可能。2008年Stadtfeld等人使用非整合腺病毒载体携载四因子获得了小鼠iPSCs(miPSCs)。2009年，Fusaki等人使用非整合的仙台病毒获得了hiPSCs。尽管如此，有活性的病毒仍然只限于实验研究，仍存在未知的临床风险，Okita等人于2008年报道使用普通真核表达质粒成功地获取了miPSCs，但是普通质粒极易丢失，需要多次转染，造成诱导效率极低，较难得到hiPSCs，不能广泛应用相关研究。2009年俞君英报道使用附加体质粒携带重编程因子获得了hiPSCs，附加体质粒包含OriP/EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen-1)两个DNA元件(本专利所涉及的附加体质粒，统一为包含OriP/EBNA1元件的附加体质粒)，其中EBNA1基因的表达产物可以结合到OriP元件上，使附加体质粒比普通质粒在细胞内能更高效地复制，因此重编程过程中附加体质粒只需转染一次即可，然而附加体大约在2个月后便可完全丢失，迄今该技术已广泛应用于体细胞非整合诱导重编程。然而目前已报道广泛使用的附加体质粒进行体细胞重编程的系统，均包含许多高风险的致癌基因或因子中的至少一个，如c-MYC、SV40-LT、TP53抑制因子等致癌因子，使用这些高风险因子得到的iPSCs可能存在诸如细胞致瘤的风险。iPSCs要在临床上广泛应用，必须得到安全性高且适合大规模制备iPSCs的相关技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种安全性高、适合临床应用的非病毒iPSCs诱导方法。
实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒中，得到重组质粒；
其中，所述hsa-miR-302s序列为包含hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d中的任一种或两种以上的序列；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞中，进行重编程诱导培养，得到iPSCs。
作为优选，步骤1)中，所述hsa-miR-302s DNA序列中还包含hsa-miR-367的DNA序列。
作为优选，步骤1)中，通过II型启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表达。
作为优选，步骤1)中，通过EF-1α、CMV或CAG启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表达。
作为优选，步骤1)中，通过I型、II型或III型启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达。
作为优选，步骤1)中，通过CMV、U6或H1启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达。
作为优选，步骤1)中，所述重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES类或2A类共表达元件，进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因在单启动子下共表达。
作为优选，步骤1)中，所述重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES1、IRES2、P2A或F2A共表达元件，进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因在单启动子下共表达。
作为优选，步骤1)中，将重编程因子POU5F1和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有POU5F1、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子MYCL和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒。
作为优选，步骤2)中，在诱导培养过程中加入小分子化合物，所述小分子化合物为MEK抑制剂、GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂中一种或两种以上。
作为优选，步骤2)中，所述小分子化合物为PD0325901、CHIR-99021、丁酸钠和反苯环丙胺盐酸盐的组合。
作为优选，步骤2)中，所述PD0325901浓度为0.1-2μM，所述CHIR-99021浓度为0.1-6μM，所述丁酸钠浓度为0.05-2mM，所述反苯环丙胺盐酸盐的浓度为0.1-10μM。
作为优选，步骤2)中，在诱导培养的第0天至第12天的任意一天或两天以上加入上述小分子化合物。
作为优选，步骤2)中，在诱导培养的第0天至第8天每天加入上述小分子化合物。
本发明的目的之二在于提供一种用于上述方法的诱导组合物，包括若干重组质粒，所述若干重组质粒是由将表达重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒所制得。
作为优选，所述诱导组合物还包括小分子化合物，所述小分子化合物为MEK抑制剂、GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂中一种或两种以上。
本发明的目的之三在于提供一种试剂盒，包括上述的诱导组合物。
本发明的目的之四在于提供上述的方法获得的iPSCs。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种非病毒iPSC诱导方法，该方法不加入高风险重编程因子，如c-MYC、SV40-LT、TP53抑制因子等的情况下，使用安全性高的重编程因子组合，降低了iPSCs的临床适用风险；
2)本发明提供的非病毒iPSC诱导方法，具有较高的适用性，其不局限于启动子的类型、附加体质粒数量、共表达元件、hsa-miR-302s前体的长度，均能成功地诱导培养出iPSCs；
3)本发明提供的小分子化合物能有效缩短诱导培养时间，在整个诱导过程中小分子化合物刺激最短2天便能顺利高效地最终获得iPSCs。
附图说明
图1为pCEP4质粒图谱；
图2为实施例1重组质粒图谱；
图3为实施例1的显微镜视野图；
图4为实施例1的细胞染色质核型鉴定图；
图5为实施例1的畸胎瘤鉴定图；
图6为实施例1的多能性分子标记鉴定图；
图7为实施例2的试验组和对照组的AP染色效果图；
图8为实施例3的核型异常率柱形图；
图9为实施例4的AP染色扫描图；
图10为实施例4的AP染色计数柱形图；
图11为实施例5的AP染色扫描图；
图12为实施例5的AP染色计数柱形图；
图13为实施例6的AP染色扫描图；
图14为实施例6的AP染色计数柱形图；
图15为实施例7的AP染色扫描图；
图16为实施例7的AP染色计数柱形图；
图17为实施例8的AP染色扫描图；
图18为实施例8的AP染色计数柱形图；
图19为实施例9的AP染色扫描图；
图20为实施例9的AP染色计数柱形图；
图21为实施例10第1组的重组质粒图谱示例；
图22为实施例10第3组的重组质粒图谱示例；
图23为实施例10第4组的重组质粒图谱示例；
图24为实施例10第5组的重组质粒图谱示例；
图25为实施例10的AP染色扫描图；
图26为实施例10的AP染色计数柱形图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述。
我们研发出一种使用附加体质粒在不加入高风险重编程因子，如c-MYC、SV40-LT、TP53抑制因子等的情况下，使用安全性高的重编程因子组合，并在极短的低风险性小分子化合物刺激条件下高效获得hiPSCs，使非整合iPSCs的获取技术更能满足临床安全级别和规模化生产所需求。
以下具体实施方式中，如未特殊说明，所用到的试剂、质粒及基因均可通过市售途径或常规试验手段获得。
以下具体实施方式中，用到的试剂信息如下：
PD0325901(CAS号：391210-10-9)、PD98059(CAS号：167869-21-8),Tideglusib(CAS号：865854-05-3),1-Azakenpaullone(CAS号：676596-65-9；1-氮杂坎帕罗酮),CHIR-99021(CAS号：252917-06-9),TDZD-8(CAS号：327036-89-5),TWS119(CAS号：601514-19-6),AR-A014418(CAS号：487021-52-3),AZD2858(CAS号：486424-20-8),IM-12(CAS号：1129669-05-1),M 344(CAS号：251456-60-7),NCH 51(CAS号：848354-66-5),NSC 3852(CAS号：3565-26-2；5-亚硝基-8-羟基喹啉),Sodium Phenylbutyrate(CAS号：1716-12-7；4-苯基丁酸钠盐),Pyroxamide(CAS号：382180-17-8；N-羟基-N'-3-吡啶基辛二酰胺),SBHA(CAS号：38937-66-5；软木肟酸),Scriptaid(CAS号：287383-59-9),Sodium butyrate(CAS号：156-54-7；丁酸钠),Valproic acid,sodium salt(CAS号：1069-66-5；丙戊酸钠)Pifithrin-μ(CAS号：64984-31-2),Pifithrin-αhydrobromide(CAS号：63208-82-2),Tranylcyprominehydrochloride(CAS号：1986-47-6；反苯环丙胺盐酸盐)。
本申请提供的方法适用于人的大部分体细胞或成体干细胞(又称成体细胞)，包括但不限于肾上皮细胞。以下具体实施方式中，以下除了标注的适合多种细胞重编程外，均为尿液中来源的细胞实施例；所采用的人的体细胞是尿液来源的肾上皮细胞，通过离心人的尿液，收集人尿液来源肾上皮细胞并进行扩大培养得来，所有的尿液供体均签署由广州市搏克肿瘤研究所伦理委员会审查通过的知情同意书。
本申请提供的方法同样还适用于人成纤维细胞或人间充质干细胞等成体细胞，这些成体细胞均可通过商业购买途径获得。
本申请中，所述的附加体质粒(或载体)中的“附加体”是由Episomal翻译而来的，又可译为附加型(质粒或载体)、游离型质粒(质粒或载体)。以下具体实施方式中，所采用的附加体质粒为Episomal-EBNA1/OriP质粒，均改造自pCEP4质粒，该附加体质粒来源于Invitrogen pCEP4 Mammalian Expression Vector，货号为V04450，其结构如图1所示。本申请中，POU5F1又名OCT4；MYCL又名L-MYC。
以下具体实施方式中，所采用的重编程因子名称、种属和基因登录号、长度如下如表所示：
表1重编程因子名称、种属、登录号和长度
以下具体实施例中，所述hsa-miR-302s的信息如下：
表2hsa-miR-302s的信息
以下具体实施方式中，采用不同长度的hsa-miR-302s构建重组质粒，其中，其中不同长度的hsa-miR-302s信息如下所示：
hsa-miR-302b(5’+75bp,3’+27bp)序列如SEQ ID No.1所示；
hsa-miR-302b(5’+150bp,3’+54bp)序列如SEQ ID No.2所示；
hsa-miR-302c(5’+27bp,3’+56bp)序列如SEQ ID No.3所示；
hsa-miR-302c(5’+54bp,3’+111bp)序列如SEQ ID No.4所示；
hsa-miR-302a(5’+55bp,3’+56bp)序列如SEQ ID No.5所示；
hsa-miR-302a(5’+111bp,3’+111bp)序列如SEQ ID No.6所示；
hsa-miR-302d(5’+55bp,3’+31bp)序列如SEQ ID No.7所示；
hsa-miR-302d(5’+111bp,3’+62bp)序列如SEQ ID No.8所示；
hsa-miR-302bcad(5’+75bp,3’+31bp)序列如SEQ ID No.9所示；
hsa-miR-302bcad(5’+150bp,3’+62bp)序列如SEQ ID No.10所示；
hsa-miR-302cluster(5’+75bp,3’+130bp)序列如SEQ ID No.11所示；
hsa-miR-302cluster(5’+150bp,3’+260bp)序列如SEQ ID No.12所示。
以下具体实施方式中，采用c-MYC、SV40-LT和TP53抑制因子TP53 shRNA构建到附加体质粒或者将TP53抑制因子TP53 siRNA通过转染方式以进行对比试验。其中TP53抑制因子TP53 shRNA1和TP53 shRNA2分别构建到附加体质粒中并采用电转方式进行实验，TP53siRNA1和TP53 siRNA2采用脂质体转染方式进行实验；
其中：
TP53 shRNA1靶位点为5’-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3’；
TP53 shRNA2靶位点为5’-GTCCAGATGAAGCTCCCAGAA-3’；
TP53 siRNA1购买自Santa Cruz Biotechnology，货号为sc-45917；
TP53 siRNA2购买自Cell Signalling Technology，货号为#6231。
以下具体实施方式中，通过AP染色、核型、畸胎瘤及流式细胞术多能性鉴定检测(简称FACS)各实施例是否能形成iPSCs及能否良好地维持iPSCs的染色体稳定、自我更新能力以及多能性。
1、AP染色法的具体操作步骤如下
a)细胞培养完后，吸弃培养基，1×PBS洗1遍；4％多聚甲醛室温固定2min；
b)吸弃固定液，1×TBST洗3遍；AP buffer室温平衡5min；
c)AP显色液室温避光显色15min(5-15min，需克隆颜色变深而又无背景时终止，若颜色未完全染色，可适当延长染色时间)，吸弃显色液，1×PBS洗两遍，适量1×PBS覆盖住细胞，显微镜下观察并计数。
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)是一种单酯磷酸水解酶，细胞质中的碱性磷酸酶在碱性条件下能够水解磷酸萘酚钠产生α萘酚，后者与一种稳定的偶氮盐发生反应并呈现深紫色，以此判断碱性磷酸酶的存在以及表达丰度。碱性磷酸酶在未分化的多能干细胞中表达量很高，分化后的多能干细胞碱性磷酸酶活性下降，因此可以用碱性磷酸酶染色(AP染色)实验来判断细胞是否为iPSCs克隆，并由此可以方便地根据AP阳性克隆效率来判断iPSCs产生的效率。
对于实施例1-2以及4-6，AP阳性克隆效率是基于电转后传代种到每组中的细胞数量所决定的，即AP阳性克隆效率＝AP阳性克隆数/电转后每组每孔传代细胞数量；
对于实施例3以及7-10，AP阳性克隆效率是基于电转细胞的总数决定的，即：AP阳性克隆效率＝AP阳性克隆数/电转细胞量。
核型鉴定方法
1)实验试剂：
20μg/mL秋水仙素；PBS；生理盐水；0.25％trypsin；0.075M氯化钾溶液；MEF；卡诺固定液；Giemsa染色液；3％Tris。
2)实验用品：
37℃恒温培养箱；移液枪(100μl，1mL)；低速离心机；恒温水浴锅；载玻片；胶头滴管；烘箱；酸缸；染色缸；显微镜。
3)实验步骤
3.1)细胞准备
生长状态良好，如有feeder存在，需事先去除feeder细胞层，无分化，生长密度在80～90％之间。
3.2)秋水仙素处理
培养终止前在培养基的量加入浓度为20μg/mL的秋水仙素，使其终浓度为0.2μg/mL，37℃培养箱中处理100～130min。
3.3)低渗处理
秋水仙素处理完后，先吸弃培养液，用PBS洗两次，加入0.5mL0.25％胰酶消化，轻轻敲打培养皿，使未脱落的细胞脱落，加入1mL MEF终止消化,用吸管吸取转移入15mL离心管，离心(1200rpm，5min)，收集细胞。然后加入37℃预热的0.075mol/L KCL溶液7mL,用吸管吹打成细胞悬液，置37℃水浴处理18-28min。
3.4)预固定
新鲜配制卡诺固定液(甲醇冰醋酸3:1配制)，用胶头滴管加入约1mL固定液进行预固定3min。
3.5)固定
预固定后，1200r/min离心5min，弃上清，加入约7mL新鲜的固定液，用胶头滴管轻轻打匀，于37℃水浴固定40min。
3.6)滴片
固定完成后，1200r/min离心5min，然后用胶头滴管吸弃大部分固定液，留部分固定液(根据细胞的量确定留液多少)重悬细胞，距离载玻片30cm左右距离滴片。注意使用冰冻干净的载玻片进行滴片。
3.7)烤片
滴片后马上把载玻片移进75℃烘箱烘3h。
3.8)染色(G显带)
往55mL生理盐水加入0.03g胰酶粉，轻轻摇匀，用3％Tris调节其PH约为7.2。将制片放入胰酶消化液处理8秒后，迅速放入生理盐水终止其消化，再放入Giemsa染液染色5～10min,然后用镊子夹出玻片，用自来水轻轻冲洗两面，室温干燥或电吹风吹干。
3.9)镜检
待玻片干后，在显微镜下检查，先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍油镜观察。
3.10)分析(对染色体数目，带型进行分析),每个细胞共分析20个分裂视野，若染色体数出现异常数的次数大于或等于3，则为异常。
FACS检测多能性标记物(Marker)：
1)用0.25％胰酶消化细胞，离心，之后用PBS重悬细胞，转移到1.5mL的EP管中。
2)加入200μL 1％多聚甲醛，37℃，5-10min。
3)离心，用PBS洗1次，之后加入200μL 90％预冷后的甲醇，冰上30min。
4)离心，用PBS洗2次。加一抗(抗体1：50稀释)，加50μL，37℃，30min。
5)离心，用PBS洗1-2次，加二抗(抗体1：500稀释)，加100μL，37℃，30min，加二抗要避光。
6)用PBS洗1次，之后用300μL PBS重悬，过滤，上机，收488(绿色)或568(红色)阳性细胞。
本发明采用流式细胞术检测多能性标记物OCT4、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达；
其中，1)OCT4是多能干细胞最核心的转录因子，在分化的细胞或其他成体干细胞中几乎不表达或极低表达，其被作为多能干细胞最重要的分子标记特征。
2)SSEA4是阶段特异性胚胎抗原，在人多能干细胞表面大量表达，是一种糖脂类抗原表位，人多能干细胞分化会导致SSEA4表达降低，因此，它也经常被用作多能干细胞分子标记的特征。
3)Tra-1-60和Tra-1-81是高分子量的糖蛋白抗原，是多能干细胞表面抗原，在多能干细胞中是高表达的，其用作多能干细胞多能性分子标记。
因此，可通过FACS鉴定OCT4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81四种抗原的表达，以判断包括iPSCs在内的人多能干细胞的属性分子标记特征。
畸胎瘤鉴定方法
1)细胞生长至75％-80％，用IV型胶原酶消化10min，DMEM/F12轻洗3遍，用机械法将细胞刮落。
2)加入DMEM/F12，100g离心5min。
3)在冰上先将Matrigel与DMEM/F12按1：2混匀，再与细胞进行混匀。
4)将混合物注射入NOD-SCID小鼠四肢的肌肉或皮下，待畸胎瘤长至一定大小进行取瘤，并进行HE染色及分析。
5)畸胎瘤染色后三个胚层代表分析：
外胚层：黑色素细胞分化；放射状排列的神经组织分化等。
中胚层：肌肉组织分化；软骨组织分化；脂肪组织分化等。
内胚层：腺体分化；腔状肠上皮组织分化等。
实施例1
本实施例1提供一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒中，得到重组质粒；
其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；其重组质粒图谱如图2所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养15天，得到iPSCs；所述人的体细胞为从尿液中分离的肾上皮细胞。
步骤2)中，具体操作如下：
a)电转：使用胰酶消化肾上皮细胞，取步骤1)得到的重组质粒加入到肾上皮细胞，将重组质粒电转入肾上皮细胞，电转后将细胞种于包被有细胞外基质的细胞培养板中；
所述细胞培养板可采用Matrigel或其他人多能干细胞培养细胞外基质；通常一个培养体系中，取2-10μg重组质粒和50-400万肾上皮细胞；
b)诱导培养：步骤1)进行后1-3天或待细胞贴壁汇合率达30％以上，换人多能干细胞培养基继续诱导培养，约15-30天iPSCs克隆成熟后，使用AP染色鉴定iPSCs阳性克隆数，并计算AP阳性效率；
经AP染色检测，AP阳性克隆浓度达到38个/2×105个细胞每孔。其采用显微镜(4×物镜)观察iPSCs的显微镜视野图如图3所示，展现出使用本实施例的方法诱导获得的iPSCs的形态与胚胎干细胞一致，在体外培养具备自我更新的能力；
体细胞重编程过程中会因各种因素导致诱导所得的iPSCs染色体(质)核型出现异常，可能导致肿瘤或其他异常细胞的发生。G带染色体核型分析即通过吉萨母染料染色后使染色体显带(即G带)，然后对染色体进行计数、配对及排列来进行染色体的核型分析，以此来判断iPSCs的核型是否正常。本实施例得的iPSCs细胞染色质核型鉴定结果如图4所示，鉴定结果显示iPSCs核型正常，说明采用本实施例提供的方法可以获得核型正常的iPSCs；
iPSCs与其他多能干细胞一样具有向三胚层所有类型的细胞分化的能力，在免疫缺陷小鼠体内通过皮下或肌肉注射多能干细胞，可以自发分化为包含三个胚层的畸胎瘤，以此判断其具备多能干细胞的多能性(如三胚层分化能力)。畸胎瘤鉴定结果如图5所示，表明本实施例获得的iPSCs可以向外中内三个胚层分化，由左至右分别为内胚层(肠样上皮分化)，中胚层(软骨分化)，外胚层(放射状排列的神经组织和黑色素细胞)，表明其具有多能性；
多能性分子标记鉴定结果如图6所示，使用FACS分别鉴定获得的iPSCs中OCT4、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81的表达情况，结果显示多能性分子标记均在90％以上，说明使本方法获得的iPSCs具备多能干细胞的分子标记特征。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上，在步骤2)的诱导培养过程中，加入小分子化合物刺激诱导重编程过程。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒中，得到重组质粒；
其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养15天，得到iPSCs；
其中，在诱导培养day0-day8天，每天向诱导培养中加入0.5μM PD0325901、3μMCHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM的反苯环丙胺盐酸盐的混合物，作为试验组；以不加入小分子化合物诱导培养基作为对照组。
本实施例中，试验组和对照组的AP染色效果图如图7所示。由图7可知，在诱导培养过程中，试验组的诱导培养条件下的诱导效率远高于对照组，加入小分子化合物诱导培养条件更具有优势。加入小分子化合物能有效刺激诱导重编程过程，提高iPSCs的诱导重编程效率。
实施例3
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，该方法中，除了重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s以外，还同时研究高风险因子c-MYC、SV40-LT或TP53对iPSCs的影响，以研究不同的重编程因子对iPSCs核型的影响。
其中，分别将c-MYC、SV40-LT或TP53 shRNA构建到附加体质粒，或将TP53抑制因子TP53 siRNA直接转染体细胞，或者直接向体细胞中加入Pifithrin-μ或Pifithrin-αhydrobromide。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，作为对照组，即第1组；在对照组的基础上，将下表所示添加高风险因子c-MYC、SV40-LT或TP53 shRNA同时构建到附加体质粒或将TP53抑制因子TP53 siRNA直接转染体细胞，或者直接向体细胞中加入Pifithrin-μ或Pifithrin-αhydrobromide等方式进行的试验组作为第2-12组，得到重组质粒；
表3高风险重编程基因c-MYC、SV40-LT和TP53抑制因子的组合表
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒。其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
将表3中的c-MYC、SV40-LT或TP53 shRNA构建到另一新的附加体质粒，其中，c-MYC和SV40-LT采用EF-1a连接并起始转录，其共表达元件为P2A；TP53 shRNA采用U6启动子连接并起始转录；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，或将TP53 siRNA转染体细胞，或者直接向体细胞中加入Pifithrin-μ或Pifithrin-αhydrobromide，进行诱导培养15天，得到iPSCs。
经AP染色检验，第1-12组的核型异常率柱形图如图8所示；从图8可知，没有加入高风险因子c-MYC、SV40-LT或TP53抑制因子的第1组核型异常率最低，约为6％，而加入高风险因子SV40LT的第3组，在只加1种高风险因子的试验组中，核型异常率相对最高；从第10-11组与第12组比较可知，加入3种高风险因子的核型异常率相对加入2种高风险因子高。
实施例4
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，在实施例1的基础上，对不同的小分子化合物对iPSCs的影响，用AP染色法检测诱导效率。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养，在诱导培养的day0-day8，分别加入如下表所示的小分子化合物，得到iPSCs。
表4小分子化合物加入组合表
注：a)MEK抑制剂的浓度为0.5μM；
b)GSK-3β抑制剂的浓度为3μM；
c)组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度为0.25mM；
d)赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂的浓度为2μM；
经AP染色检验，第1-13组的AP染色扫描图如图9所示，AP染色计数柱形图如图10所示，以上结果表明，本发明公开的4个种类的小分子化合物均能较好地促进细胞进行重编程，其中，相对地，第13组的阳性克隆的效率最高，即同时加入4个种类的小分子化合物能较好地促进细胞重编程过程。
实施例5
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，在实施例1的基础上，对比不同浓度的小分子化合物对iPSCs的影响，然后用AP染色法检测诱导效率。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养，在诱导培养的day0-day8，分别加入如下表所示的浓度的小分子化合物，得到iPSCs。
表5不同浓度的小分子化合物对诱导培养的影响
第1-16组的AP染色扫描图如图11所示，其AP染色计数柱形图如图12所示，从左至右依次为第1-16组，上述AP染色结果表明，不同浓度的小分子化合物均可有效促进诱导过程中细胞进行重编程。较理想的PD0325901浓度为0.5μM，较理想的CHIR-99021浓度为3μM，较理想的丁酸钠浓度为0.25mM、较理想的反苯环丙胺盐酸盐浓度为2μM。
实施例6
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，对比小分子化合物的加入时间对iPSCs培养的影响，然后用AP染色法检测诱导效率。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养，在如下表所述的时间，每天加入0.5μM PD0325901、3μM CHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM反苯环丙胺盐酸盐的混合物，得到iPSCs。
注：D表示天数，D0表示试验处理当天，以此类推。
第1-11组的AP染色扫描图如图13所示，AP染色计数柱形图如图14所示，上述AP染色结果表明，在诱导培养的期间加入小分子化合物的时间对细胞重编程过程没有显著的影响。其中第4组的阳性克隆效率最高，即小分子化合物较理想的加入时间为诱导培养的当天至第8天。
实施例7
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，对比不同长度的hsa-miR-302s对iPSCs培养的影响，用AP染色法检测诱导效率。
一种非病毒iPSCs诱导方法，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，将重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子L-MYC和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒；
其中，hsa-miR-302s的信息如下表所示：
表6hsa-miR-302s信息
组别 hsa-miR-302s
1 hsa-miR-302b(5’+75bp,3’+27bp)
2 hsa-miR-302b(5’+150bp,3’+54bp)
3 hsa-miR-302c(5’+27bp,3’+56bp)
4 hsa-miR-302c(5’+54bp,3’+111bp)
5 hsa-miR-302a(5’+55bp,3’+56bp)
6 hsa-miR-302a(5’+111bp,3’+111bp)
7 hsa-miR-302d(5’+55bp,3’+31bp)
8 hsa-miR-302d(5’+111bp,3’+62bp)
9 hsa-miR-302bcad(5’+75bp,3’+31bp)
10 hsa-miR-302bcad(5’+150bp,3’+62bp)
11 hsa-miR-302cluster(5’+75bp,3’+130bp)
12 hsa-miR-302cluster(5’+150bp,3’+260bp)
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养，在诱导培养的Day0-Day8，每天加入0.5μM PD0325901、3μM CHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM反苯环丙胺盐酸盐的混合物，得到iPSCs。
第1-12组的AP染色扫描图如图15所示，AP染色计数柱形图如图16所示，上述AP染色结果表明，不同长度的hsa-miR-302s对重编程过程没有显著的影响。其中，第9-10组的hsa-miR-302bcad是hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302a和hsa-miR-302d四种的组合，相对于第1-8组单一的hsa-miR-302s阳性克隆效率较高；第11-12组为在上述四种的组合基础上增加了hsa-miR-367，其诱导培养得到的阳性克隆效率更高。
实施例8
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，对比启动子对iPSCs培养的影响，然后用AP染色法检测诱导效率。
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，将表达重编程因子OCT4和GLIS1通过P2A共表达元件连接到一个启动子上起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接到一个启动子上起始转录，将OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2构建到同一个附加体质粒；L-MYC和hsa-miR-302s构建到另一附加体质粒。
其中，采用如下表所示的启动子连接并起始转录编码表达蛋白的基因(OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4和L-MYC)和非编码表达蛋白的基因hsa-miR-302s；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
表7启动子组合表
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养15天，其中，在诱导培养的Day0-Day8，每天加入0.5μM PD0325901、3μM CHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM反苯环丙胺盐酸盐的混合物，得到iPSCs。
第1-6组的AP染色扫描图如图17所示，AP染色计数柱形图如图18所示；由图18可知，由不同启动子组合分别构建而来的质粒均可以对细胞进行诱导重编程；当采用启动子EF-1a连接并启动转录编码表达蛋白的基因，且采用启动子CMV连接并启动转录hsa-miR-302s，阳性克隆的效率最高。
实施例9
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，对比不同共表达元件对iPSCs培养的影响，然后用AP染色法检测诱导效率。
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1和KLF4在进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因在单启动子下共表达时，共表达元件如下表所示：
表8共表达元件组合
其中，在构建到附加体质粒过程中，将OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2构建到同一个附加体质粒，L-MYC和hsa-miR-302s构建到另一附加体质粒；用EF-1a启动子连接并起始转录编码表达蛋白的基因(OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4和L-MYC)，用CMV启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养15天，其中，在诱导培养的Day0-Day8，每天加入0.5μM PD0325901、3μM CHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM反苯环丙胺盐酸盐的混合物，得到iPSCs。
第1-4组的AP染色扫描图如图19所示，AP染色计数柱形图如图20所示；由图20可知，由不同的共表达元件分别构建而来的质粒均可以对细胞进行诱导重编程；第3组的阳性克隆效率最高，即当采用P2A共表达元件时，细胞的诱导重编程效率较高。
实施例10
本实施例提供一种非病毒iPSCs诱导方法，对比重编程因子与附加体质粒的组合对iPSCs培养的影响，然后用AP染色法检测诱导效率。
1)将表达重编程因子OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4、L-MYC和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒，得到重组质粒；
其中，在进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因(OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4和L-MYC)在单启动子下共表达时通过P2A共表达元件连接到一个启动子上起始转录；第1、3-5组的重组质粒图谱示例见图21-24；
表9重编程因子与附加体质粒的组合
注：a)此处KLF4的长度为1440bp，除特别注明以外，KLF4的长度为1413bp；
其中，在构建到附加体质粒过程中，用EF-1a启动子连接并起始转录编码表达蛋白的基因(OCT4、SOX2、GLIS1、KLF4和L-MYC)，用CMV启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达；其中，所述hsa-miR-302s为hsa-miR-302cluster，其序列如SEQ ID No.12所示；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞，进行诱导培养15天，其中，在诱导培养的Day0-Day8，每天加入0.5μM PD0325901、3μM CHIR-99021、0.25mM丁酸钠和2μM反苯环丙胺盐酸盐的混合物，得到iPSCs。
第1-5组的AP染色扫描图如图25所示，其阳性克隆效率的柱形图如图26所示；由图26可知，重编程因子构建至不同数量的附加体质粒，均可对细胞进行重编程；第4组的阳性克隆效率最高，即将OCT4、GLIS1、KLF4和SOX2构建到同一个附加体质粒，L-MYC和hsa-miR-302s构建到同一附加体质粒，细胞的诱导重编程效率较高。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种非病毒iPSCs诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将表达重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4、MYCL和hsa-miR-302s的DNA序列构建到附加体质粒中，得到重组质粒；
其中，所述hsa-miR-302s序列为包含hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d中的任一种或两种以上的序列；
所述重编程因子不包含TP53抑制因子、SV40-LT或c-MYC中的任意一种；
2)将步骤1)得到的重组质粒导入人的体细胞中，进行重编程诱导培养，得到iPSCs。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述hsa-miR-302s DNA序列中还包含hsa-miR-367的DNA序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，通过II型启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表达。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，通过EF-1α、CMV或CAG启动子连接并起始转录POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL表达。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，通过I型、II型或III型启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，通过CMV、U6或H1启动子连接并起始转录hsa-miR-302s表达。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES类或2A类共表达元件，进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因在单启动子下共表达。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述重编程因子POU5F1、SOX2、GLIS1、KLF4和MYCL采用IRES1、IRES2、P2A或F2A共表达元件，进行两个或两个以上表达蛋白的重编程因子基因在单启动子下共表达。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，将重编程因子POU5F1和GLIS1通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，KLF4和SOX2通过P2A共表达元件连接并使用EF-1α启动子起始转录，将含有POU5F1、GLIS1、KLF4和SOX2四个基因的DNA序列共同构建至一附加体质粒；将重编程因子MYCL和hsa-miR-302s分别通过EF-1α启动子和CMV启动子起始转录，并将其DNA序列构建至一附加体质粒。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，在诱导培养过程中加入小分子化合物，所述小分子化合物为MEK抑制剂、GSK-3β抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、赖氨酸特异性去甲基化酶抑制剂中一种或两种以上。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述小分子化合物为PD0325901、CHIR-99021、丁酸钠和反苯环丙胺盐酸盐的组合。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述PD0325901浓度为0.1-2μM，所述CHIR-99021浓度为0.1-6μM，所述丁酸钠浓度为0.05-2mM，所述反苯环丙胺盐酸盐的浓度为0.1-10μM。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)中，在诱导培养的第0天至第12天的任意一天或两天以上加入上述小分子化合物。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)中，在诱导培养的第0天至第8天每天加入上述小分子化合物。
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