CN103756969B - 建立iPS的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种建立iPS的方法，该方法包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法培养8天，将episomal的三个质粒用lonza的Human？CD34+CellKit电转到单核细胞中，之后用vitrinectin处理的板子上培养，利用E6培养基培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基培养，传代到10后鉴定。本发明建立在无插入的episomal技术上，无FBS，无feeder甚至是无动物源的iPS诱导和培养技术。

Description

建立iPS的方法

技术领域

本发明涉及一种建立iPS细胞的方法，特别涉及一种在无插入的基础上建立了无FBS，无Feeder无动物源的人iPS的方法。

背景技术

2006年，日本科学家Yamanaka的研究组将4种转录因子（Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc）导入小鼠皮肤成纤维细胞，获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，称之为“诱导性多能性干细胞”(inducedpluripotentstemcells,iPS细胞)^[1]。2007年，Yamanaka博士^[2]和美国Thomson博士研究组^[3]分别用特定的因子诱导人类成纤维细胞，也使之成为了iPS细胞。iPS细胞的分离培养成功是干细胞研究乃至生命科学领域的里程碑，它首次证明：可以用已知的几种因子在体外逆转已经分化的细胞，使之成为全新的具有发育全能性的细胞，这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题。

尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而重编程效率低下一直都是科学家们头疼的问题，成为了iPS临床转化的重要障碍之一。经典的利用病毒为载体将转录因子导入分化细胞的方法，很可能导致外源基因插入细胞的基因组中,引起插入突变,存在很大的弊端，iPS细胞的致瘤性影响其在再生医学和临床细胞治疗中的应用^[4]。转录因子c-Myc本身就是一种原癌基因。解析体细胞重编程过程中的分子调控机制，开发出高效安全的iPS技术成为了近年来干细胞领域研究人员的热点。

供体细胞类型影响iPS细胞的形成效率和安全性。2008年，Yamanaka博士的研究组尝试利用小鼠胃和肝的细胞诱导iPS细胞，发现由胃和肝细胞产生的iPS细胞的成瘤性明显低于皮肤成纤维细胞来源的iPS细胞^[5]。采集皮肤细胞重编程为iPS细胞需要六七十天时间，而从血液采集细胞制备iPS细胞只需3周左右，而且人外周血细胞来源丰富，采集方法便利，创伤性小，安全性好。人外周血细胞是当前最理想的供体细胞之一，具有安全、方便、数量多等优势^[6]。

使用病毒载体转染外源基因制备iPS细胞不仅操作过程复杂、对实验室设备和管理要求严格，而且细胞有可能引发肿瘤的形成，这就阻碍了iPS细胞技术的普及和在临床应用的推广。当前应用基因非整合方法建立iPS细胞主要有以下几个方面1）腺病毒载体，2）质粒或者minicircleDNA，3）蛋白直接导入，但是这三种方法重建效率均非常低，难以满足基础实验需要和临床应用研究。仙台病毒^[7]及改良mRNA方法^[8]建立非整合iPS细胞的效率很高，但是费用相当高，不适用于大规模临床治疗的开展。EpisomalVectors是目前最高效最经济的基因非整合建立iPS细胞的方法^[9]。

2013年5月张孝兵教授^[10]应用改良的表达Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc的EV成功地将人外周血单个核细胞重编程为iPS细胞，重编程效率显著高于以往实验报导。

虽然我们利用episomal技术可以获得没有外源基因插入的iPS技术。解决了因为外源基因的插入，诱导基因组不稳定和成瘤性的危险，大大促进了iPS技术临床应用的可能性。但在体外培养细胞Feeder细胞以及处理板子的metrigel都是鼠源的和牛源的FBS，这些可能会造成免疫和异源病毒或蛋白造成的疾病的产生，增加疾病治疗的风险，而且增加了IPS的使用成本，不适合广泛的、大规模的临床应用，研究在无插入外源基因建立IPS的技术基础上，无添加FBS、Feeder建立IPS的方法，具有重要的临床价值。在发明中，我们在无插入的基础上建立了无FBS，无Feeder无动物源的iPS建立技术。使iPS技术更符合临床应用的需求。

[1]TakahashiK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell.2006;126:663--76.

[2]TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,etal.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell.2007;131:861--72.

[3]YuJ,VodyanikMA,Smuga--OttoK,etal.Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science.2007;318:1917--20.

[4]OkitaK,YamakawaT,MatsumuraY,etal.Anefficientnonviralmethodtogenerateintegration-freehuman-inducedpluripotentstemcellsfromcordbloodandperipheralbloodcells.StemCells.2013;31:458--66.

[5]AoiT,YaeK,NakagawaM,etal.Generationofpluripotentstemcellsfromadultmouseliverandstomachcells.Science.2008;321:699-702.

[6]LohYH,AgarwalS,ParkIH,etal.Generationofinducedpluripotentstemcellsfromhumanblood.Blood.2009;113:5476--9.

[7]SekiT,YuasaS,FukudaK.GenerationofinducedpluripotentstemcellsfromasmallamountofhumanperipheralbloodusingacombinationofactivatedTcellsandSendaivirus.NatProtoc.2012;7:718-28.

[8]LinT,AmbasudhanR,YuanX,etal.AchemicalplatformforimprovedinductionofhumaniPSCs.NatMethods.2009;6:805-8.

[9]YuJ,HuK,Smuga--OttoK,etal.Humaninducedpluripotentstemcellsfreeofvectorandtransgenesequences.Science.2009;324:797-801.

[10]SuRJ,BaylinkDJ,NeisesA,etal.EfficientGenerationofIntegration-FreeiPSCellsfromHumanAdultPeripheralBloodUsingBCL--XLTogetherwithYamanakaFactors.PLoSOne.2013;8:e64496.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种没有基因插入，没有FBS，没有Feeder的利用外周血细胞建立人iPS的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种建立iPS的方法(没有基因插入，没有FBS，没有Feeder的利用外周血细胞建立iPS的方法)，包括如下步骤：

利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法（无血清）培养8天，将episomal的三个质粒：pEVSFFV-OS(OS)，pEVSFFV-MK(MK)，pEVSFFV-B(B)用lonza的HumanCD34+CellKit电转到单核细胞中，之后用vitrinectin（人源蛋白）处理的板子上培养，利用E6培养基(invitrogen)培养12-15天后会看到克隆，20天左右将单克隆调到用vitrinectin处理的板子上用E8培养基(invitrogen)培养，传代到10后鉴定。

优选的，所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL-3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml。

其中Serumfreemedium(SFM)组成为：

注：SFM配置后，用0.2μmfilter过滤消毒，4℃冰箱保存，3周内使用。

更优选地，该建立iPS的方法，包括如下步骤：

利用ficoll分离外周血单核细胞，红系培养方法（无血清）培养8天，利用Amaxa细胞核转染仪(AmaxaNucleofector^TM)进行细胞核转染，单个核细胞培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配置好的电转缓冲液（包含不同组合质粒如5ugpEVSFFV-OS(OS)+2.5ugpEVSFFV-MK(MK)+2.5ugpEVSFFV-B(B)），混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。将电转后细胞种到预先vitrinectin（人源蛋白）处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养1天，加等量的hESC培养基E6（1:1）+bFGF100ng/ml培养1天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液。在调单克隆之前在低氧培养条件下培养（5%O₂，5%CO₂，90%N₂）。

并在培养基中加入NaB(0.25mM)提高重编程效率，第10天停止。第12-15天开始可见克隆开始形成。第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统。一周后可用化学方法（EDTA）消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系。

本发明所具有的有益效果：

本发明建立在无插入的episomal技术上，无FBS，无feeder甚至是无动物源的iPS诱导和培养技术。为iPS应用到临床减少了外源基因，动物源的困扰。是建立人iPS细胞库的最佳方案，无FBS，无feeder，简化了培养体系，为大规模临床治疗的开展提供基础。

附图说明

图1为无FBS，无feeder无插入iPS的克隆及Tra-1-60活染鉴定图片；其中Tra-1-60阳性的就是重编程的克隆。

图2为没有feeder的和有feeder的iPS效率对比图；

利用同一批Ficoll分离的细胞，同样的培养条件，同样的方式电转后，将细胞等量分为两份，一份用无feeder培养，一份用有feeder方式培养，20天后用AP染色鉴定，发现没有feeder的效率较有feeder的低10倍左右。但是利用无feeder的方式，仍然可以拿到足够多的克隆。

图3为无feeder的iPS多能型鉴定图片；

用人的Oct4,Tra-1-60,SSEA-4抗体检测发现iPS均表达ESMarker基因。DAPI定位细胞核。

图4为无feeder的iPS畸胎瘤组织切片H&E染色结果图；将iPS细胞打到NOD/SCID小鼠腹股沟皮下，可以生成畸胎瘤，组织切片H&E染色鉴定有三个胚层的组织形态，说明iPS具有分化为三胚层细胞的多能性。

图5为iPS细胞核型鉴定图；显示有正常的人23对染色体，证明iPS具有正常的人核型特征。

图6为利用episomal质粒特异序列设定引物，PCR鉴定10代iPS细胞系中有无插入序列图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1：一种没有基因插入，没有FBS，没有Feeder的利用外周血细胞建立iPS的方法：

1、采集健康志愿者外周血，分离单个核细胞、髓系CD33⁺细胞或者淋系CD3⁺CD19⁺细胞并预刺激培养

采集健康志愿者静脉血10ml，用PBS-EDTA1:1稀释后，缓慢加入10mlFicoll上，400g离心30分钟，吸弃上清后小心收集单个核细胞层（白膜层）。

天津市血液中心购买新鲜白细胞，同上Ficoll法收集单个核细胞。

将收集的单个核细胞计数后，利用红系诱导培养基培养8天。

红系诱导培养基包括：

Serumfreemedium(SFM)100ml

注：SFM配置后，用0.2μmfilter过滤消毒，4℃冰箱保存，3周内使用

红系诱导培养基包括：SFM,SCF浓度100ng/ml,IL-3浓度10ng/ml,EPO浓度2U/ml，IGF-1浓度40ng/ml，地塞米松1μM，转铁蛋白100μg/ml。

这些因子共同组成完整的红系诱导培养基。

2、Episomal质粒电转，iPS克隆培养与传代

利用Amaxa细胞核转染仪(AmaxaNucleofector^TM)进行细胞核转染，按操作说明书进行。步骤1中单个核细胞体外培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配置好的电转缓冲液（包含不同组合质粒如5ugpEVSFFV-OS(OS)+2.5ugpEVSFFV-MK(MK)+2.5ugpEVSFFV-B(B)），混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转。将电转后细胞种到预先vitrinectin（人源蛋白）处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养1天，加等量的hESC培养基E6（1:1）+bFGF100ng/ml培养1天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液。在调单克隆之前在低氧培养条件下培养（5%O₂，5%CO₂，90%N₂）。

并在培养基中加入NaB(0.25mM)提高重编程效率，第10天停止。第12天开始可见克隆开始形成。第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统。一周后可用化学方法（EDTA）消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系。

对照组：有feeder的对照是将电转后细胞种到预先铺有feeder细胞的6孔板的一个孔中，应用MNC培养基（红系诱导培养基）和hESC培养基（1:1）培养。

hESCCultureMedium(hESC培养基)100ml

注：配置后0.2μmfilter过滤消毒，4℃冰箱保存，3周内使用

电转后第2天开始用hESC培养基隔天半量换液，并在培养基中加入NaB(0.25mM)提高重编程效率，第10天停止。第12天开始可见克隆开始形成。在调单克隆之前在低氧培养条件下培养（5%O2，5%CO2，90%N2）。

并比较有无feeder培养体系对克隆效率的影响。

结果如图2所示：无feeder可能会影响其诱导效率。但是利用无feeder的方式，仍然可以拿到足够多的克隆。

3、iPS克隆染色鉴定：TRA-1-60活染鉴定完全重编程的克隆

将含有克隆的6孔板中，吸掉培养基，PBS洗一遍，每孔加入0.5ml含有抗体的hESC培养基，37℃,5%CO2培养箱中孵育1小时。吸掉培养基，每孔加入1mlPBS洗一遍。每孔加入1mlhESC培养基，在倒置荧光显微镜下观察阳性克隆的情况。如图1所示，重编程20天后ips克隆以及Tra-1-60活染照片，Tra-1-60阳性的就是重编程的克隆。

实施例2、NOD/SCID小鼠体内畸胎瘤分析

选取核型鉴定为正常染色体的hiPS细胞，计数，5x10⁶细胞加入100μl的Matrigelsolution，混匀。用1ml注射器种植到NOD/SCID小鼠腹股沟皮下。1个月左右可见小鼠皮下肿物。切下的肿瘤组织，放入10%甲醛溶液中固定24小时后，进行石蜡包埋、组织切片和H.E.染色来确定肿瘤的组织形态。如图4所示，将iPS细胞打到NOD/SCID小鼠腹股沟皮下，可以生成畸胎瘤，组织切片H&E染色鉴定有三个胚层的组织形态，说明iPS具有分化为三胚层细胞的多能性。

实施例3、iPSCs基因组非整合性分析

iPS克隆传代1，10和15次后，收集细胞，应用QiagenDNeasykit提取总DNA。将电转前细胞的DNA作为阴性对照，将基因组中混有1个拷贝pCEP-OS作为阳性对照，SYBR染料法进行real-timePCR检测多次传代后iPS细胞中Episomal质粒残留量。CEP质粒DNA的引物可同时检测游离和整合这两种形式，引物序列如下：

利用

episomal质粒特异序列设定引物，PCR鉴定10代iPS细胞系中有无插入序列，检测6个不同细胞系中未发现转入基因，如图6所示。证明iPS是无插入的iPS细胞系。

实施例4、iPS细胞的多能性基因鉴定

4%多聚甲醛PFA配制：1)称取4gPFA（有毒，注意防护），置于三角烧瓶或烧杯中。2)加入50-80mlDPBS，加热至60℃左右，磁力搅拌使粉末完全溶解。3)通常加入少许1nNaOH才能使溶液清亮。4)最后补足PBS于100ml，充分混匀。

注意：因为PFA有毒、有味，且加热PFA会挥发，通风橱中操作，并用塑料手套或灭菌用封口膜封口搅拌。

（1）第一天，细胞大约3天时状态比较好（分化细胞较少，细胞足够大），将长好的iPS细胞用PBS洗涤2次,每次5min。

（4）4%多聚甲醛室温固定15min（4%多聚甲醛实验前准备好）。

（5）PBS洗涤3次，每次5min。

（6）用含0.1%的Triton透膜10min（如为细胞表面标记，此步骤则省略）。

（7）PBS浸泡5min。

（8）将几个孔中加入山羊血清工作液，室温封闭15min。

（9）吸出山羊血清工作液后，每孔分别加入稀释好的anti-Sox2(1:300),anti-SSEA1(1:500),anti-NANOG(1:100),anti-OCT4(1:200)抗体工作液50-100μl，4℃过夜或37℃孵育1.5-2小时。

（10）吸出液体，然后用PBS洗涤3次，每次5min。

（11）每孔再加入相对应的二抗AlexaFLuor488DonkenAnti-rabbitIgG或Alexa555-conjugatedgoatanti-mouseIgM/IgG(1:1000)，室温避光孵育1小时或4℃过夜。

（12）吸出液体，PBS洗涤3次，每次5min。

（13）DAPI复染，5min。

（14）PBS洗涤两次，然后用蒸馏水冲洗后晾干。

（15）共聚焦显微镜下观察实验结果。

如图3所示：用人的Oct4（绿色）,Tra-1-60（红色）,SSEA-4（绿色）抗体检测发现iPS均表达这些ESMarker基因。DAPI定位细胞核。

实施例5、细胞核型鉴定

准备配置：1)低渗液配制：0.4%KCL用时放入37℃预热。2)固定液配制：甲醇：冰醋酸=3：1，现用现配。3)G显带消化液配制：胰酶(SigmaG4507-5G)30mg，加入0.9%生理盐水（orD-Hanks）50ml中，用时37℃水浴30min。

步骤如下：

（1）当iPS细胞大小合适时，约传代2天时，加入0.2-0.25g/ml的秋水仙素处理细胞3.5-4小时。

（2）配低渗液（0.4%KCl现用现配，一个系用5mL），并在水浴锅中预热胰酶（每个细胞系约500μl胰酶）和低渗液。

（3）加入EDTA消化iPS细胞，5分钟后，加入PBS吹打为单细胞，800～1000rpm离心5分钟后，弃上清，收获细胞。

（4）将收获的细胞中加入预热的低渗液20ml，低渗5minat37℃。同时配固定液（甲醇与冰醋酸按3：1配，现用现配，一个系7mL)。

（5）预固定。加固定液7滴，轻轻以气泡冲匀，离心800～1000rpm离心5min。

（6）固定：去上清，加入固定液4ml，轻轻以气泡冲匀，固定40分钟。离心800～1000rpm离心5min，去上清，加固定液2ml，第二次固定20min。（这两步固定都可以4℃或室温过夜）。

（7）滴片：离心800～1000rpm离心5min，去上清，加入新鲜固定液3～4滴，气泡冲匀，即可进行滴片2～3张。

（8）滴片时将细胞悬液1～2滴，滴到预先遇冷过的4℃冰水或干燥的洁净玻片上，晾干。

（9）放入65℃烤箱中烘烤过夜或80℃烘烤两小时。

（10）染色：第二天取出烤干的载玻片加入1滴Giemsa原液，15秒后，加入2滴稀释后的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液的稀释为：1份磷酸缓冲液原液加上9份等体积的蒸馏水），并用吸耳球吹打均匀后，进行染色。染色时间为室温10分钟。10分钟后用流水轻轻清洗，室温晾干后进行核型分析。在一组实验中，我们随机选择20个以上的细胞中期分裂相进行观察并统计核型的正确率。

（11）核型显带：将配好的消化液放入水浴中30分钟，并加入3%Tris（PH=7.6）15滴打匀起泡，放入烤后的片子，继续打泡，20s-25s（每个地方条件不一样，较干燥的地方时间较短)后，取出片子迅速放入干净清水中洗掉胰酶，用Giemsa染液室温10min。然后用流水轻轻清洗，室温晾干后就可以进行核型分析。

如图5所示：利用G带核型鉴定，有正常的人23对染色体，从而证明iPS具有正常的人核型特征。

上述描述，是说明性的而不是限定性的，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属于本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种建立iPS的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用ficoll分离外周血单核细胞，无血清红系培养方法培养8天；利用Amaxa细胞核转染仪进行细胞核转染，单个核细胞培养8天后，计数，1x10⁶细胞加入100μl配制好的电转缓冲液,包含不同组合质粒即5ugpEVSFFV-OS+2.5ugpEVSFFV-MK+2.5ugpEVSFFV-B，混合均匀后转入电转杯，放到电转槽内，利用U-008转染程序进行电转；将电转后细胞种到预先vitronectin处理的6孔板的一个孔中，应用红系诱导培养基培养1天，加等量的hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养1天后半数换液，只加hESC培养基E6+bFGF100ng/ml，之后隔一天完全换成hESC培养基E6+bFGF100ng/ml培养液，并隔天换液；在挑单克隆之前在低氧培养条件下培养，所述的低氧培养条件为5％O₂、5％CO₂、90％N₂；

并在培养基中加入0.25mMNaB提高重编程效率，第10天停止，第12-15天开始可见克隆开始形成，第20天左右克隆逐渐成熟，通过机械传代方法，在显微镜下分离克隆，切成3,4块后吸出，转入hESC培养基E8培养系统，一周后用EDTA消化再传代，一直传10代，形成稳定的iPS细胞系；

所述的红系培养方法所使用的红系诱导培养基为在SFM的基础上进一步添加如下组分：SCF终浓度100ng/ml,IL-3终浓度10ng/ml,EPO终浓度2U/ml，IGF-1终浓度40ng/ml，地塞米松终浓度1μM，转铁蛋白终浓度100μg/ml，

其中Serumfreemedium(SFM)组成为：