ES2866411T3 - Una tecnología que utiliza células madre pluripotentes inducidas por proteínas - Google Patents

Una tecnología que utiliza células madre pluripotentes inducidas por proteínas Download PDF

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Abstract

Un método para generar células madre pluripotentes inducidas por proteínas, que comprende: poner en contacto células somáticas con proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ, en el que las proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ son proteínas de reprogramación expresadas en bacterias que se han modificado con un cóctel que comprende polietilenimina (PEI) y DOTAP/DOPE, suministrando así las proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas; realizar varios ciclos de la etapa de contacto anterior para crear células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPS) reprogramadas; mover las células piPS reprogramadas a un medio sin alimentador para su expansión; y expandir y pasar las células piPS reprogramadas generando así células piPS homogéneas.

Description

DESCRIPCIÓN
Una tecnología que utiliza células madre pluripotentes inducidas por proteínas
Antecedentes de la invención
1. Campo técnico
La presente invención se refiere a la transducción de proteínas y sus usos. Más específicamente, la presente invención se refiere a una tecnología de células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPSC) que generan células piPS de alta calidad en una semana con una eficiencia de conversión de casi el 100% y sus aplicaciones. La presente invención también se refiere a una condición de cultivo de piPSC sin alimentador y una expansión de placa completa sin recolección de colonias y expansión clonal y sus aplicaciones.
2. Descripción de la técnica relacionada
Las células madre embrionarias (ES) son células madre derivadas de un embrión. Con el estado actual de la tecnología, la creación de una línea de células ES humanas requiere la destrucción de un embrión humano, lo que plantea una cuestión ética controvertida para la investigación de células ES humanas. Las células ES se distinguen de otros tipos de células por dos propiedades distintivas: pluripotencia y autorrenovación ilimitada. En condiciones definidas, las células ES son capaces de renovarse indefinidamente, lo que permite que las células ES se utilicen como herramientas útiles tanto para la investigación como para la medicina regenerativa, ya que se pueden producir células ES ilimitadas para la investigación continua o el uso clínico. Las células ES también pueden diferenciarse en todos los derivados de las tres capas germinales primarias: ectodermo, endodermo y mesodermo, que incluyen más de 220 tipos de células en el cuerpo adulto. La pluripotencia distingue las células ES de las células madre adultas que se encuentran en los tejidos adultos; mientras que las células ES pueden generar todos los tipos de células en el cuerpo, las células madre adultas son multipotentes y solo pueden producir un número limitado de tipos de células dentro de este tipo de tejido.
Las terapias con células ES pueden usarse para la medicina regenerativa y el reemplazo de tejidos para tratamientos de lesiones o enfermedades, tales como enfermedades genéticas relacionadas con la sangre, el sistema inmunológico y diferentes enfermedades, cánceres, enfermedades cardiovasculares, diabetes juvenil, enfermedades de Parkinson y Alzheimer, cicatrización de heridas, artritis reumatoide, calvicie, sordera, ceguera, esclerosis lateral amiotrófica, distrofia muscular y lesiones medulares. Además de las preocupaciones éticas de la terapia con células madre, existe un problema técnico de la enfermedad de injerto contra huésped asociada con el trasplante alogénico de células madre. Dado que las células ES utilizadas para la medicina de regeneración proceden de embriones humanos, el rechazo inmunológico será siempre un problema importante cuando se realice el trasplante de células ES a pacientes individuales para el tratamiento de enfermedades. Otros usos potenciales de las células ES incluyen la investigación del desarrollo humano temprano, el estudio de enfermedades genéticas, sistemas in vitro para pruebas de toxicología y cribado de fármacos.
El proceso para cultivar células ES es bastante oneroso. Las células ES humanas se aíslan transfiriendo la masa celular interna a una placa plástica de cultivo de laboratorio. La superficie interna de la placa de cultivo generalmente está cubierta con una capa alimentadora: células de piel embrionarias de ratón que han sido tratadas para que no se dividan, pero que proporcionan a las células ES una superficie pegajosa a la que se adhiere. Las células alimentadoras también liberan nutrientes en el medio de cultivo. Los investigadores han ideado formas de cultivar células ES sin células alimentadoras de ratón. Este es un avance científico significativo debido al riesgo de que los virus u otras macromoléculas en las células de ratón puedan transmitirse a las células humanas.
El proceso para la expansión de células ES también consume bastante tiempo. Las células ES forman colonias. Por lo general, la expansión de células ES es primero para seleccionar colonias de células ES individuales y luego expandir las colonias seleccionadas. Esto ralentiza significativamente la expansión de las células ES y puede provocar una mayor tasa de mutaciones si las colonias seleccionadas contienen mutaciones genéticas.
En 2006, Shinya Yamanaka y sus colegas demostraron que la introducción de cuatro genes de transcripción: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc usando retrovirus en fibroblastos de ratón podrían generar células madre pluripotentes inducidas (células iPS), que muestran pluripotencia. Este es un descubrimiento revolucionario ya que por primera vez se demuestra que las células somáticas se pueden reprogramar de nuevo a células de tipo ES. Se cree que las células iPS son idénticas a las células ES naturales en muchos aspectos, tales como la expresión de ciertos genes y proteínas de células madre, patrones de metilación de la cromatina, tiempo de duplicación, formación de cuerpos embrioides, formación de teratomas, formación de quimeras viables, autoexpresión ilimitada, nueva propiedad y diferenciabilidad. Sin embargo, todavía se está evaluando el alcance total de su relación con las células madre pluripotentes naturales.
Se cree que la tecnología de células iPS es menos controvertida desde el punto de vista ético, ya que esta tecnología permite la generación de células madre pluripotentes sin embriones humanos. Esta tecnología también puede permitir la generación de líneas de células ES específicas del paciente que podrían usarse potencialmente para terapias de reemplazo celular para tratar diversas enfermedades humanas y permite la generación de líneas de células ES a partir de pacientes con una variedad de enfermedades genéticas y proporcionará modelos invaluables para estudiar esas enfermedades y para el cribado de fármacos.
En 2007, varios grupos demostraron que las células iPS generadas a partir de fibroblastos de ratón mediante el suministro retroviral de cuatro genes producían quimeras viables. Estos grupos utilizaron Nanog para la detección de células iPS, lo que indica que Nanog es un determinante importante de la pluripotencia celular. Sin embargo, c-Myc es oncogénico y el 20% de los ratones quiméricos desarrollaron cáncer. En un estudio posterior, Yamanaka informó que las iPSC podrían generarse sin c-Myc. El proceso lleva más tiempo y no es tan eficiente, pero las quimeras resultantes no desarrollaron cáncer.
También en 2007, se generaron células iPS a partir de células somáticas humanas, lo que representa un hito para la tecnología de células iPS. Sin embargo, los sistemas de transfección viral utilizados insertaron los genes en ubicaciones aleatorias en el genoma del huésped y crearon una gran preocupación por las posibles aplicaciones terapéuticas de estas iPSC, porque las células creadas podrían ser propensas a formar tumores. Para superar estos peligros, se utilizó un adenovirus para transportar los cuatro genes necesarios a los genomas de las células de la piel y el hígado de los ratones, lo que dio como resultado células idénticas a las células madre embrionarias. Dado que el adenovirus no combina ninguno de sus propios genes con el huésped objetivo, se elimina el peligro de crear tumores, aunque este método aún no se ha probado en células humanas. Yamanaka y varios otros laboratorios han demostrado desde entonces que la reprogramación se puede lograr mediante un plásmido sin ningún sistema de transfección de virus, aunque con eficiencias muy bajas.
En mayo de 2009, dos informes de los laboratorios de Ding y Kim informaron que se generaron células iPS de ratón y humanas (piPSC) mediante el suministro directo de cuatro proteínas, que fueron codificadas por los cuatro genes de reprogramación, eliminando así la necesidad de virus o modificación genética de células somáticas humanas. Un informe reciente mostró además que las iPSC podrían generarse utilizando ARNm para generar células iPS inducidas por ARNm (riPSC). Esto resolvió uno de los obstáculos de seguridad más desafiantes asociados con la medicina personalizada basada en células madre y permite a los científicos producir células piPS sin alterarlas genéticamente. Debido a que las proteínas eventualmente se degradan, no debería haber rastros de su existencia en las células en el momento en que se utilicen para experimentos o terapias, lo que representa un gran avance en la tecnología de las células iPS.
A pesar de los intensos esfuerzos de investigación en todo el mundo, la tecnología actual de células iPS todavía sufre CUATRO problemas principales: 1. Ineficiencia; 2. Consumo de tiempo; 3. Complejo y caro; y 4. Problema de calidad.
La tecnología actual de células iPS solo convierte un 0,001-1% de células somáticas en células iPS. Para el suministro de genes utilizando vectores virales, la eficiencia de conversión de células somáticas a células iPS podría alcanzar el 0,1-1%, dependiendo de las diferentes células somáticas iniciales. Usando fibroblastos embrionarios como células de partida, la eficiencia de conversión alcanza ~ 1%; sin embargo, utilizando células somáticas adultas, la eficiencia de conversión es <0,1%. Para el suministro de genes utilizando medios no virales, esta eficiencia de conversión es <0,1%. La eficiencia de conversión de las células iPS inducidas por proteínas humanas es extremadamente baja y solo alcanza el 0,001%.
Además, la tecnología actual de células iPS, que incluye tanto el suministro de genes como el de proteínas, normalmente tarda de 4 a 8 semanas en completar la reprogramación de las células somáticas humanas en células iPS y requiere muchos ciclos de transfección de genes o suministro de proteínas. Esto hace que la tecnología actual de células iPS sea una tecnología complicada y costosa. Además, la calidad de las células iPS generadas por la tecnología actual de células iPS es cuestionable en términos de semejanza con las células ES humanas. Estos importantes problemas técnicos bloquean la traducción de las células iPS de sus aplicaciones clínicas humanas.
La razón principal que causa estos problemas importantes de la tecnología actual de células iPS se debe a los desafíos técnicos del suministro de genes y el suministro de proteínas, que sufren una baja eficiencia y una estequiometría difícil de controlar de los genes administrados con suministro de múltiples genes/proteínas. Para la generación de células iPS, se tienen que suministrar cuatro genes o cuatro proteínas simultáneamente en núcleos de células somáticas para activar los circuitos autorreguladores intracelulares que inician las "expresiones de genes madre" y silencian las "expresiones de genes somáticos", por lo que las células somáticas pueden convertirse en células como las células madre embrionarias.
Es de conocimiento común que la tecnología actual de suministro de genes, que incluye enfoques tanto de vectores virales como no virales, sufre un problema de baja eficiencia para el suministro de cuatro genes simultáneamente. Además, no hay garantía de que los cuatro genes se suministren dentro de las células con una estequiometría igual. En la mayoría de los casos, el suministro de cuatro genes es aleatorio, dependiendo de los diferentes vehículos de suministro utilizados. Para resolver este problema, se ha desarrollado un enfoque alternativo que inserta los cuatro genes en un vector viral con diferentes enlazadores entre cada gen. En este caso, solo se requiere administrar un vector viral en las células somáticas para la generación de células iPS, mejorando la eficiencia de administración. Sin embargo, incluso con este enfoque, se alcanza un máximo de eficiencia de conversión de células iPS de sólo ~ 1% para células somáticas adultas y podría alcanzar <5% para células somáticas embrionarias.
Además de la baja eficacia de el suministro de genes, este enfoque también adolece de otro problema: consume mucho tiempo. Una vez que se han suministrado los genes de reprogramación, se trasladan aleatoriamente dentro de las células y solo una pequeña fracción de los genes puede llegar a los núcleos. Sin embargo, solo las células somáticas que tienen los genes de suministro ubicados dentro de los núcleos pueden reprogramarse para generar células iPS. Esto redujo aún más significativamente la eficiencia de conversión de las células iPS. Para resolver este problema, se ha realizado una transfección genética repetida para mejorar la probabilidad aleatoria de incorporación nuclear de genes suministrados, lo que requiere mucho tiempo. Los genes suministrados tardan entre 7 y 14 días en comenzar a expresarse y menos de 30 días en observar la formación de colonias de células no iPS. Para completar la reprogramación, generalmente se necesitan de 4 a 8 semanas para generar células iPS a partir de células somáticas adultas humanas.
Para la reprogramación de células inducidas por proteínas, se deben suministrar proteínas en los núcleos de los fibroblastos. Los laboratorios de Ding y Kim diseñaron las proteínas de reprogramación agregando un péptido que penetra en las células (CPP, 9R-11R) en el extremo terminal C. Aunque el método de fusión de CPP suministra las proteínas de reprogramación a las células, existen varios inconvenientes importantes del suministro de proteínas basada en CPP:
(1) La fusión de CPP tiene un alto riesgo de alterar las propiedades/funciones de reprogramación de proteínas. (2) El CPP tiene una baja eficiencia de suministro de proteínas.
(3) Las proteínas administradas por CPP son sensibles a las proteasas intracelulares ya que la CPP está basada en péptidos, lo que provoca la degradación de las proteínas administradas.
(4) El CPP no tiene la capacidad de dirigirse a los núcleos de las proteínas para iniciar la reprogramación.
Una vez que las proteínas están dentro del citosol, las proteasas intracelulares primero intentarán degradarlas si no se pliegan correctamente. Para aquellas proteínas que sobrevivieron a la degradación de la proteasa intracelular, colisionarán aleatoriamente con diferentes compartimentos intracelulares y solo una fracción muy pequeña de proteínas puede alcanzar los núcleos para iniciar la reprogramación inducida por proteínas. Para mejorar la probabilidad de ubicación de los núcleos de las proteínas de reprogramación, tanto el laboratorio de Ding como el de Kim adoptaron círculos repetidos (7-10 ciclos) de suministro de proteínas.
Estos principales inconvenientes provocan una eficiencia extremadamente baja de conversión de células somáticas en células iPS (<0,005%). Además, también tomó mucho tiempo para que las proteínas iniciaran la reprogramación de las células de fibroblastos en células iPS. En el artículo de Ding, se necesitaron 5 semanas para observar la formación de colonias de células iPS a partir de fibroblasto embrionario de ratón, que es mucho más fácil de reprogramar en células iPS en comparación con el fibroblasto adulto humano. Cuando Kim et al., utilizaron fibroblastos de recién nacidos humanos para generar células iPS, se necesitaron 8 semanas para observar la colonia de células iPS.
Como se discutió anteriormente, la falta de eficiencia de suministro, la falta de direccionamiento nuclear/naturaleza aleatoria del tráfico intracelular y el largo proceso de la tecnología actual de suministro de genes y proteínas hacen que sea muy difícil controlar la calidad de las células iPS generadas. Esto se demuestra en varios informes recientes, que indican que las células iPS recién generadas muestran patrones distintos de expresión génica de aquellos de las células ES humanas. Sin embargo, las células iPS muestran un patrón de expresión génica muy similar al de las células ES humanas después de 50-60 pases. Con base en estos resultados, se ha propuesto un concepto de reprogramación continua durante la etapa continuo de células iPS. Desafortunadamente, también se observó que en pasadas posteriores (50-60 pasadas), las células iPS muestran cambios cromosómicos importantes en comparación con las células somáticas iniciales, lo que hace imposible el uso de estas células iPS para aplicaciones clínicas humanas.
Por lo tanto, sería beneficioso desarrollar una tecnología de células iPS que pueda generar células iPS de alta calidad a partir de células somáticas adultas humanas en unos pocos días con una eficiencia de conversión cercana al 100%.
Sumario de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una tecnología de piPSC que puede generar células piPS de alta calidad a partir de diferentes células somáticas de partida directamente usando proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias.
La presente invención proporciona una técnica de piPSC que utiliza una técnica de suministro de proteína de QQ que permite el suministro dirigido de la proteína de reprogramación directamente en los núcleos de las células somáticas humanas dentro de la primera hora después del suministro. Esto inicia la reprogramación celular de las células somáticas en 12 horas y completa la reprogramación celular en una semana para generar células piPS.
La presente invención proporciona procedimientos de piPSC que generan células piPS de ratón, rata y humanas a partir de fibroblastos adultos y otras células somáticas con una eficiencia de conversión cercana al 100%.
La presente invención proporciona procedimientos para generar células iPS de alta calidad a partir de muchas células somáticas diferentes, incluidos fibroblastos primarios de ratón, fibroblastos de ratón adultos, fibroblastos de recién nacidos humanos, fibroblastos de adultos primarios humanos, queratinocitos de adultos humanos y líquido amniótico humano.
La presente invención también proporciona los procedimientos para generar células iPS de alta calidad a partir de diferentes células somáticas enfermas, incluidas células tumorales de rata, tales como células de glioma 9L, células de cáncer de mama metastásico de ratón, tales como células 4T1, líneas celulares de cáncer de mama humano, tales como MDA-MB-231, líneas celulares de tumores cerebrales humanos, tales como células de glioma U87 y U251, células GBM primarias humanas en etapa 4, fibroblastos primarios humanos de pacientes con Alzheimer con isoformas apoE3 o apoE4.
La presente invención proporciona una tecnología de piPSC que es simple y solo implica una etapa de incubación de células somáticas con proteínas de reprogramación, ya sea cuatro proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc) o tres proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2/Klf4), o dos proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2), o solo una proteína de reprogramación (Oct4).
La presente invención también usa otras combinaciones de proteínas de reprogramación, tales como Sox2, Oct4 y Nanog (SON), además de los cuatro factores de transcripción tradicionales de Yamanaka (Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc), para generar piPSC dentro de 1 semana con una eficiencia cercana al 100%. Dado que Klf4 y c-Myc son proteínas oncogénicas y los factores SON, son los reguladores maestros de la pluripotencia, la reprogramación celular utilizando los factores SON puede reducir significativamente las tasas de mutación y mejorar significativamente la calidad de las piPSC generadas que son seguras para aplicaciones clínicas humanas.
La presente invención describe una condición de cultivo de piPSC sin alimentador que se centra en el cultivo de piPSC monocapa para la autorrenovación a largo plazo de las piPSC. Esta condición de cultivo de piPSC sin alimentador evita la capa alimentadora de ratón y resuelve el principal problema de seguridad de la posible contaminación cruzada de especies de las piPSC generadas para futuras aplicaciones clínicas humanas seguras.
La presente invención describe un método de pasaje de placa completa en monocapa que elimina la selección de colonias y la expansión clonal de la generación y expansión de células iPS tradicionales, mejorando significativamente la calidad de las células piPS generadas y acelerando la expansión de las células piPS.
En particular, la presente invención proporciona un método para generar células madre pluripotentes inducidas por proteínas, que comprende: poner en contacto células somáticas con proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ, en el que las proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ son proteínas de reprogramación expresadas en bacterias que se han modificado con un cóctel que comprende polietilenimina (PEI) y DOTAP/DOPE, suministrando así las proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas; realizar varios ciclos de la etapa de contacto anterior para crear células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPS) reprogramadas; mover las células piPS reprogramadas a un medio sin alimentador para su expansión; y expandir y pasar las células piPS reprogramadas generando así células piPS homogéneas. Estas y otras características de la presente invención se pueden encontrar en las reivindicaciones adjuntas.
Estos y otros objetivos, ventajas y características de la invención se comprenderán y apreciarán más completamente con referencia a la descripción de la realización actual y los dibujos.
Breve descripción de los dibujos
Otras ventajas de la presente invención se apreciarán fácilmente a medida que se entienda mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere en relación con los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1 es un diagrama de flujo que representa el protocolo de la presente invención, que muestra un esquema de cada etapa de esta tecnología de piPSC. La Figura 1 también muestra las concentraciones de cuatro proteínas de reprogramación utilizadas en la reprogramación celular. La Figura 1 describe además los ciclos de reprogramación celular.
Figura 2, A: muestra los métodos de expresión bacteriana utilizados para producir cuatro proteínas de reprogramación, incluido el método de inducción de IPTG tradicional y el método de inducción de IPTG de alta densidad celular. Estos métodos incluyen etapas y parámetros clave utilizados en la expresión bacteriana. El panel superior derecho es una tabla de las recetas optimizadas del medio que se utilizan en la expresión bacteriana. B: muestra el SDS-PAGE y la transferencia Western de las proteínas de reprogramación purificadas para Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Los rendimientos de la expresión bacteriana de estas cuatro proteínas de reprogramación están entre 80-120 mg/litro.
Figura 3: Imágenes de fluorescencia de inmunotinciones de células de fibroblastos de recién nacidos humanos después del suministro de QQ de proteínas de reprogramación durante 1,5 h, incluidas Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, que muestran las ubicaciones nucleares de las proteínas administradas. La condición experimental se muestra en el panel superior. Dado que las imágenes de fluorescencia se tomaron para las células de fibroblastos durante el suministro de proteínas, se pueden observar proteínas de reprogramación tanto en el citosol como en los núcleos de las células. Figura 4: Un experimento de curso temporal usando inmunotinciones con anticuerpos contra varios marcadores de pluripotencia. Se incubó HNF con los cuatro factores modificados con QQ durante 12 horas y luego se cambió a un medio regular durante otras 108 horas. A las 24, 48, 72 y 108 horas, se prepararon células monocapa para inmunotinción. Se observaron señales de fluorescencia dentro de las células teñidas con Oct4 a las 24 horas en ubicaciones tanto nucleares como en el citosol. Sin embargo, el Oct4 citosólico se redujo significativamente a las 48 horas y solo se observó en los núcleos a las 72 horas con una intensidad de fluorescencia reducida. A las 108 horas, las tinciones nucleares vuelven a mejorar significativamente. Estos datos, por primera vez, sugieren un cambio a las 72 horas que controla la expresión del gen de Oct4 endógeno y la degradación del Oct4 exógeno suministrado por QQ dentro de los núcleos. Una expresión de Oct4 endógena constante a las 108 horas indica el mantenimiento de la reprogramación celular inducida por cuatro proteínas de reprogramación, que se confirma mediante inmunotinciones de otros marcadores de pluripotencia, incluidos ALP, Nanog, Rex1 y Tra-160. Claramente, las señales de fluorescencia de estos marcadores de pluripotencia se observan a las 24 horas y se vuelven mucho más fuertes en los puntos de tiempo posteriores, lo que indica que la expresión endógena de estos genes de pluripotencia se inicia a las 24 horas y se mantiene bien en los puntos de tiempo posteriores. Las fuertes tinciones de fluorescencia de Rex1 y TRA1-60 indican la expresión de proteínas endógenas de marcadores de pluripotencia tardíos, lo que sugiere que la reprogramación celular inducida por proteínas se completa posiblemente en 4-5 días. Este resultado se confirmó mediante la observación de un gran número de formación de colonias en los días 6-8 (recuadros).
Figura 5: A: una imagen microscópica de colonias de piPSC seis días después de la reprogramación con cuatro proteínas, que muestra muchas colonias de piPSC en esta pequeña área de visualización en un medio sin alimentador. En general, se observaron 500-1500 colonias de piPSC en una placa de cultivo celular. B: una vista ampliada de una colonia de piPSC, que muestra un borde claro. C-F: Una optimización del procedimiento de reprogramación utilizando ALP como marcador pluripotente temprano. C: Se cultivó fibroblasto humano de recién nacido (HNF) durante 24 horas sin reprogramar proteína, sirviendo como control negativo. Este panel solo muestra núcleos de HNF mediante tinción con DAPI sin tinción con ALP. D: Se cultivó HNF con cuatro proteínas de reprogramación durante 3 horas y luego se cambió a un medio sin proteínas de reprogramación. E: Se cultivó HNF con cuatro proteínas de reprogramación durante 5 horas y luego se cambió a un medio sin proteínas de reprogramación. F: Se cultivó HNF con cuatro proteínas de reprogramación durante 24 horas a una concentración de proteína más baja (0,5 |jg/ml). Las muestras se trataron con kits de ALP para la reacción enzimática y se tiñeron con fluorescencia roja para la expresión de la proteína ALP. Los paneles C-F indican que la condición de reprogramación se puede optimizar para obtener la mejor eficiencia de conversión de las células piPS de HNF. Sólo alrededor del 30% de las células mostró una tinción con ALP fuerte en D, mientras que el resto de las células no mostró tinción con ALP o débil. Cuando se realizó una reprogramación de proteínas de 5 horas, significativamente más células (60%) mostraron una fuerte tinción con ALP, aunque todavía se observaron células con tinción débil y sin ALP (40%). Las condiciones experimentales se optimizaron incubando HNF con una concentración más baja de las cuatro proteínas de reprogramación durante 24 horas (F). Prácticamente todas las células eran positivas para ALP en esta condición, lo que sugiere que se inicia la reprogramación celular de cada una de las células y que es posible generar células piPS en esta condición de reprogramación de un ciclo.
Figura 6: A, una placa de colonias de piPSC en el primer pase de reprogramación # 33 (izquierda) y una vista ampliada del área encuadrada, que muestra colonias de piPSC rojas. Las colonias se tiñeron con ALP (rojo). B, Imágenes de fluorescencia de inmunotinciones simples (paneles izquierdos) e inmunotinciones dobles (derecha) de piPSC monocapa utilizando diferentes marcadores de pluripotencia como se etiquetan en cada panel. Para las tinciones dobles, se consideraron las células teñidas positivas solo cuando tanto los marcadores de superficie como los nucleares eran positivos. Para aquellas células en las que solo el marcador nuclear o de superficie fue teñido positivo, se consideró que eran negativas. También se realizaron y visualizaron controles negativos de inmunotinciones usando el HNF de partida. ALP y SSEA4 son marcadores de superficie y Oct4, Sox2, Nanog y Rex1 son marcadores de núcleo. C, Diagramas de barras que muestran la eficiencia de conversión de la técnica de piPSC basada en seis inmunotinciones simples (izquierda) y tres tinciones dobles (derecha). Contando manualmente las tinciones positivas y negativas de más de 300 células, se calculó la eficiencia de conversión. En la parte superior de cada barra, el número rojo superior en es la eficiencia de conversión y el número azul inferior es el número de células que se contaron para el cálculo de la eficiencia de conversión correspondiente.
Figura 7: Imágenes de fluorescencia de un experimento de control interno para inmunotinciones usando seis marcadores de pluripotencia (como están etiquetados) en una mezcla de células de 30% de piPSC (cuarto pase) y 70% de HNF, que muestran la dilución esperada de las células teñidas positivamente. Abajo a la derecha: imágenes de fluorescencia de dos colonias con células monocapa, que muestran que tanto las colonias como las células monocapa están teñidas positivamente para ALP y SSEA4.
Figura 8: Caracterización de la pluripotencia de las células piPS generadas utilizando un enfoque de pase de una sola colonia. Brevemente, después de completar la reprogramación celular, se eligió una sola colonia con un borde claro (A) y se pasó por tres generaciones más utilizando la condición sin alimentador. Se notó que esta única colonia comenzó a perder el borde claro varios días después del pase y las células se desplazaron fuera de la colonia durante la proliferación celular. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, las células se levantaron y se pasaron a una nueva placa, se formaron muchas colonias de bordes claros en el segundo día. Sin embargo, las células repitieron el proceso anterior durante su proliferación. Se observaron células desplazadas fuera de las colonias (flecha verde), mientras que otras colonias mantienen un borde claro (flechas blancas) (B). Usando los mismos marcadores de pluripotencia, se realizaron inmunotinciones tanto en colonias de bordes claros (C1 y C3) como en células monocapa que salieron de las colonias (C2 y C4) para Oct4 y Nanog como ejemplos. Se evidencia que ambos tipos de células fueron positivas, lo que sugiere que son células similares a piPSC. También se pasaron todas las células de la placa sin recoger colonias durante tres generaciones. Luego se compararon las células con el pase de una sola colonia y el pase de células de monocapa de placa completa y no se observaron diferencias en la inmunotinción usando seis marcadores de células madre pluripotentes.
Figura 9: Imágenes de fluorescencia de inmunotinciones de las colonias de piPSC del trigésimo pase de la reprogramación No 19 (6,5 meses, utilizando el método de pase de células de monocapa de placa completa) bajo nuestra condición de cultivo sin alimentador utilizando ALP, Oct4, Nanog, SSEA4, Tra1-60 y Rex1. Los núcleos se marcaron con DAPI.
Figura 10: Imágenes de fluorescencia de inmunotinciones de las colonias de piPSC de la reprogramación celular 19 en el sexto pase (50 días) utilizando un enfoque de pase de placa completo en nuestra condición de cultivo de piPSC sin alimentador. Brevemente, se pasó todo la placa levantando las células de toda la placa y pasándolas en dos placas sin recoger una sola colonia. Las placas pasadas formaron cientos de colonias al día siguiente. En el sexto pase, estas células piPS se caracterizaron, incluyendo tanto colonias de piPSC como células monocapa, usando inmunotinciones. Se utilizaron seis marcadores de pluripotencia, incluidos ALP (marcador temprano), Oct4, Nanog, SSEA4 (marcador intermedio), Rex1 y Tra1-60 (marcadores tardíos). También se muestra un control negativo con el anticuerpo SSEA4 usando HNF. Los HNF muestran solo células individuales sin formación de colonias. Esta figura muestra que las colonias de piPSC generadas se tiñeron positivas para los seis marcadores de pluripotencia, lo que sugiere que las colonias de piPSC generadas son células madre pluripotentes.
Figura 11: Caracterizaciones de células piPS expandidas usando el método de paso de células monocapa de placa completa. A: Derecha: Mapas de calor (log2) de las matrices de pluripotencia de células madre TagMan® para la expresión génica en células iPS en el pase1 y pase 5 en comparación con aquellos de los HNF de partida. Se utilizó además RT-PCR en tiempo real TaqMan® sencillo para confirmar los datos de la matriz. Izquierda: diagrama de barras de qRT-PCR para evaluar la expresión génica de Oct4, Sox2 y Nanog en piPSC en los pases 1 y 5 y células de HNF. La expresión génica relativa representa las veces que cambia (log2) en relación con aquella de las células de HNF. B: Se realizó un análisis del cromosoma SKY para HNF (17° pase) y piPSC (10° pase), mostrando el mismo cariotipo entre las células piPS generadas y las células HNF parentales. C: resultado de la transferencia Western de las proteínas pluripotentes clave, incluidos tres reguladores maestros (Oct4, Sox2 y Nanog) y un marcador pluripotente tardío (Rex1), de piPSC (quinto pase) y HNF de partida (derecha). Una proteína de mantenimiento (actina) muestra que se usaron cantidades iguales de piPSC y células HNF para estas transferencias Western. D: Desmetilación del gen de Nanog de las piPSC (~ 85%, reprogramación # 33ava, 2do pase) y NHF (~ 15%).
Figura 12: Capacidad de diferenciación de las células piPS expandidas utilizando el método de pase de placa completa. Superior: diferenciación espontánea in vitro de piPSC. Las imágenes de inmunotinción muestran las tres células de la capa germinal en el día 14, incluidas las células neurales (A, Nestina, ectodérmicas), musculares y de tipo endotelial (B, Desmina, mesodérmicas) y similares al endodermo (C, AFP, endodermo). Inferior: A: Imágenes de fluorescencia de diferenciaciones específicas in vitro de piPSC a linajes neurales. A, neuronas (Tuj1+, flecha blanca). B, astrocitos de tipo I (GFAP+). C, astrocitos de tipo II (GFPA+). D, oligodendrocitos (O1+). F, células madre neurales (Sox2+). G, células madre neurales (Nestina+). Se observan diferencias morfológicas celulares significativas en todos los paneles. Sin embargo, las células en A, B, C, D en los paneles inferiores muestran morfologías típicas de neuronas/astrocitos/oligodendrocitos y las células en F, G muestran una morfología típica de células madre neurales, lo que confirma que las inmunotinciones NO son falsos positivos.
Figura 13: A: Formación de teratoma (1). Se utilizó el método de pase de placa completa para generar suficientes piPSC para la formación de teratomas. En el pase 3 (25 días), las piPSC se suspendieron en DMEM que contenía FBS al 10%. Se anestesiaron ratones SCID (NxGen Biosciences) con éter dietílico y se inyectó la suspensión celular debajo de la cápsula renal y debajo del músculo. Los tumores eran claramente visibles en la cuarta semana (A) y se diseccionaron quirúrgicamente en la sexta semana. El riñón inyectado con piPSC se comparó con el riñón sin inyección (B), mostrando claramente un agrandamiento del riñón inyectado con piPSC. C: Imágenes de fluorescencia de inmunotinciones de las colonias de piPS y células monocapa utilizadas para la formación de teratomas con un método de pase de placa completa. También se mostró un control negativo de la misma inmunotinción con SSEA4 usando el HNF de partida (derecha). Las colonias de piPSC se rompieron en células monocapa y luego se realizaron inmunotinciones. Los resultados indicaron que prácticamente todas las células mostraban tinciones positivas para los seis marcadores de pluripotencia, lo que sugiere una alta eficiencia de conversión utilizando el método de pase de placa completa. Solo se trasplantaron 200.000 células piPS a la cápsula renal de ratones desnudos.
Figura 14: A: Formación de teratoma (2). A la sexta semana, los animales se diseccionaron quirúrgicamente. Las muestras de tejido renal se fijaron en PBS que contenía formaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E). Se realizaron tinciones con H & E para la formación de teratomas derivados de células piPS. Los teratomas se desarrollaron bien a partir de un único sitio de inyección después de que se trasplantaran células bajo las cápsulas de riñón de ratones SCID. Los teratomas resultantes contenían varios tejidos que representan la diferenciación de ectodermo, mesodermo y endodermo. Los datos histológicos de los portaobjetos de tejido indicaron que estos teratomas contenían tejidos de las tres capas germinales primarias, incluidos los tejidos neurales y los tejidos epidérmicos (ectodermo), el cartílago y músculo estriado (mesodermo) y los tejidos epiteliales de tipo intestinal (endodermo), lo que confirma que las células piPS generadas utilizando pases de placa completa exhiben pluripotencia in vivo.
Figura 15: Las células piPS derivadas de un paciente individual se pueden utilizar para generar un modelo de enfermedad para ese paciente. Brevemente, se pueden obtener fibroblastos dérmicos primarios de un paciente mediante biopsia de piel y estos fibroblastos se pueden usar para generar células piPS mediante el suministro de cuatro proteínas de reprogramación. Las células piPS generadas se pueden expandir o conducir a un linaje específico de células madre adultas, que pueden diferenciarse aún más en tejidos enfermos. Por lo tanto, estas células se pueden utilizar para generar un modelo de enfermedad, ya que se generan a partir de un paciente individual con una enfermedad específica. Por lo tanto, se puede estudiar esta enfermedad específica en una placa para este paciente individual.
Figura 16: Las células piPS se pueden utilizar para el cribado de fármacos y la prueba de toxicidad de fármacos como se ilustra en esta figura. Para aquellos pacientes que tienen enfermedades genéticas, es posible que deba tomar una etapa adicional que incluya la reparación genética por recombinación homóloga.
Figura 17: Las células piPS se pueden utilizar para la terapia con células madre basada en pacientes. Brevemente, se pueden obtener fibroblastos dérmicos primarios de un paciente y estos fibroblastos se pueden usar para generar células piPS mediante el suministro de cuatro proteínas de reprogramación. Las células piPS generadas se pueden expandir o conducir a un linaje específico de células madre adultas. Estas células piPS y células madre adultas se pueden trasplantar a pacientes individuales para tratar una enfermedad específica. Para aquellos pacientes que tienen enfermedades genéticas, es posible que deba tomar una etapa adicional que incluya la reparación genética por recombinación homóloga antes del trasplante del paciente.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona una tecnología de células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPSC). La presente invención proporciona el uso de esta tecnología de piPSC que puede generar células iPS de alta calidad a partir de diferentes células somáticas de partida directamente usando proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias.
La tecnología de piPSC de la presente invención es simple y solo implica una etapa de incubación de células somáticas con proteínas de reprogramación. Las proteínas de reprogramación pueden ser cualquier proteína conocida por los expertos en la técnica que sea capaz de realizar la función mencionada. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, cuatro proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc), o tres proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2/Klf4), o dos proteínas de reprogramación (Oct4/Sox2), o sólo una reprogramación de proteínas (Oct4).
La tecnología de piPSC de la presente invención también usa otras combinaciones de proteínas de reprogramación, tales como Sox2, Oct4 y Nanog (SON), o Nanog/Oct4, o Nanog solamente, además de los cuatro factores de transcripción tradicionales de Yamanaka (Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc), para generar piPSC. Dado que Klf4 y c-Myc son proteínas oncogénicas y los factores SON, son el regulador maestro de la pluripotencia, la reprogramación celular utilizando los factores SON puede reducir las tasas de mutación y mejorar significativamente la calidad de las piPSC generadas que son seguras para aplicaciones clínicas humanas.
La tecnología de piPSC de la presente invención utiliza una técnica de suministro de proteína de QQ que permite el suministro dirigido de la proteína de reprogramación directamente en los núcleos de las células somáticas humanas dentro de la primera hora después del suministro. Esto inicia la reprogramación celular de las células somáticas en 12 horas y completa la reprogramación celular en una semana para generar células piPS. Además, los procedimientos generan células piPS humanas, de ratón y de rata a partir de fibroblastos adultos y otras células somáticas con una eficiencia de conversión cercana al 100%.
La tecnología de piPSC proporciona un procedimiento universal que no solo se puede usar para generar de manera eficiente células madre pluripotentes inducidas por proteínas con los factores de Yamanaka o los factores SON, sino que también se puede usar ampliamente para generar células madre adultas, tales como células madre neurales, células madre epiteliales, células madre cutáneas, células madre mesenquimales y células madre hematopoyéticas, así como trans-diferenciaciones para generar directamente cardiomiocitos, neuronas, adipocitos marrones, células de secreción de insulina y otros tipos de células terminales diferenciadas de células somáticas adultas utilizando diferentes conjuntos de proteínas de reprogramación.
La tecnología de piPSC se puede utilizar para generar células iPS de alta calidad a partir de muchas células somáticas diferentes, que incluyen, entre otras: fibroblastos primarios de ratón de animales sanos, fibroblastos de ratón adultos, fibroblastos de recién nacidos humanos, fibroblastos de adultos primarios humanos, queratinocitos de adultos humanos y líquido amniótico humano. También se pueden generar células iPS de alta calidad a partir de diferentes células somáticas enfermas, incluidas, entre otras: células tumorales de rata, como células de glioma 9L, células de cáncer de mama metastásico de ratón, tales como células 4T1, líneas celulares de cáncer de mama humano, tales como MDA-MB-231, líneas celulares de tumores cerebrales humanos, tales como células de glioma U87 y U251, células GBM primarias humanas en etapa 4, fibroblastos primarios humanos de pacientes con Alzheimer con isoformas apoE3 y apoE4.
La presente invención describe una condición de cultivo de piPSC sin alimentador que se centra en el cultivo de piPSC monocapa para la autorrenovación a largo plazo de las piPSC. Esta condición de cultivo de piPSC sin alimentador evita la capa alimentadora de ratón y resuelve una de las principales preocupaciones de seguridad de la posible contaminación cruzada de especies de las piPSC generadas para futuras aplicaciones clínicas humanas seguras.
La presente invención describe un nuevo método de pase de piPSC: pase de placa completa, para autorrenovación y expansión a largo plazo de piPSC, ya que la eficiencia de conversión de esta tecnología de piPSC alcanza cerca del 100%. Este nuevo método de pase de piPSC se centra en el pase y expansión de piPSC monocapa y es simple y rápido. También evita la selección de colonias durante la reprogramación celular, la selección de colonias y la expansión clonal, puede reducir significativamente las tasas de mutación y mejorar la calidad de las piPSC generadas que son seguras para aplicaciones clínicas humanas.
La presente invención puede usarse para producir grandes cantidades de proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias, que incluyen, pero no se limitan a: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28, Nanog, BMP4 y otras proteínas de reprogramación.
Más específicamente, la presente invención se basa en la tecnología de transducción de proteína de QQ y una tecnología de replegamiento in vivo como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 12/128.320 en tramite junto con la presente. Los reactivos de QQ tienen la capacidad de administrar múltiples proteínas de forma simultánea o consecutiva en las células a una concentración casi milimolar y la capacidad de administrar proteínas de manera dirigida a los compartimentos intracelulares corregidos. Además, los reactivos de QQ protegen las proteínas de las proteasas del interior de las células. Las proteínas suministradas se replegan adecuadamente y se modifican postraduccionalmente mediante la maquinaria intracelular y siguen las mismas vías de secreción y tráfico intracelular que sus contrapartes endógenas. Por lo tanto, la transducción de proteínas QQ es una tecnología de transducción de proteínas fisiológicamente relevante.
La presente invención extiende el suministro de proteína de QQ a la tecnología de células piPS mediante la optimización de la receta del reactivo de QQ. La nueva receta suministra de manera eficiente proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas iniciales. Por consiguiente, la cantidad de modificación de las proteínas diana con la nueva receta se puede ajustar alterando las composiciones de QQ para obtener la mejor eficiencia de suministro en diferentes células somáticas para proteínas de reprogramación específicas para la reprogramación celular.
La presente invención también proporciona evidencia experimental directa de que la reprogramación celular puede iniciarse varias horas después de el suministro de la proteína de QQ, por lo que los genes pluripotentes comienzan a expresarse endógenamente durante este período de tiempo. Además, la presente invención también proporciona evidencia experimental directa de que la reprogramación celular puede completarse dentro de una semana después de el suministro de la proteína de QQ, por lo que los genes de los marcadores de reprogramación completa comienzan a expresarse endógenamente durante este período de tiempo.
El método y los productos de la presente invención son una forma eficaz y flexible de optimizar la composición y las concentraciones de las proteínas de reprogramación para optimizar la calidad de las células iPS generadas utilizando el suministro de proteína de QQ.
Otro beneficio es que la tecnología de piPSC presentada en el presente documento genera células piPS específicas de tejido utilizando proteínas de reprogramación sin manipulaciones genéticas de las células parentales. Además, esta tecnología de piPSC utiliza las proteínas "SON", los reguladores maestros de ESC, para la reprogramación celular, y elimina las proteínas oncogénicas KLF4 y c-MYC, resolviendo los principales obstáculos de seguridad para futuras aplicaciones clínicas humanas para una posible terapia personalizada de enfermedades.
La tecnología de piPSC se puede utilizar en aplicaciones clínicas humanas, incluida la medicina de regeneración y la terapia de reemplazo celular, la generación de bancos de células iPS a partir de pacientes individuales con trastornos genéticos, modelos de enfermedades basados en células piPS de pacientes individuales y pruebas de eficacia de diferentes fármacos, incluidos fármacos de molécula pequeña, fármacos de proteínas, fármacos de ADN, fármacos de ARN, fármacos de hidrato de carbono y fármacos a base de lípidos.
La presente invención describe la aplicación de esta tecnología de piPSC en aplicaciones clínicas humanas para tratar diferentes enfermedades humanas, que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares, diabetes, obesidad, enfermedades de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, infarto de miocardio, distrofia muscular, CMT-1A, lesión de la médula espinal, lesión cerebral traumática, defectos de aprendizaje, pérdida de dientes, cicatrización de heridas, trasplante de médula ósea, osteoartritis, artritis reumatoide, calvicie, ceguera, sordera, enfermedad de Crohn y enfermedades genéticas, y otras enfermedades similares.
Lo más importante es que se ha logrado una eficiencia de conversión superior al 85 ± 4%. Las piPSC generadas muestran características de células madre embrionarias humanas (hESC) y se pueden expandir de manera estable y homogénea durante 6 meses en una condición sin alimentador. Estas piPSC también tienen el potencial de diferenciarse en las tres capas germinales tanto in vitro como in vivo.
Tal eficiencia de esta tecnología de piPSC se basa en una tecnología de suministro de proteína de QQ de última generación. El reactivo de QQ protege las proteínas suministradas de la degradación por las proteasas intracelulares y tiene capacidad para dirigirse a compartimentos intracelulares específicos en función de las secuencias señal transportadas por las proteínas suministradas. El suministro de QQ se aplicó a la reprogramación celular de HNF inducida por proteínas, que generó piPSC en 1 semana con una eficiencia de conversión superior al 85 ± 4%. Esta alta eficiencia de conversión permite la eliminación de la selección de colonias durante la reprogramación celular y la expansión clonal para mantener una población pura de piPSC, acelerando así drásticamente todo el procedimiento de generación y expansión de piPSC. Se desarrolló un método de pase de piPSC monocapa utilizando una condición sin alimentador para la expansión de las piPSC generadas. Esta tecnología de piPSC también puede mejorar significativamente la calidad de las piPSC para aplicaciones clínicas humanas seguras mediante la reducción de las tasas de mutación durante la extracción tradicional de colonias y la expansión clonal.
La tecnología de piPSC de la presente invención incluye un método de expresión bacteriana muy eficiente que puede usarse para producir proteínas de reprogramación puras con un rendimiento muy alto (80-120 mg/litro) y las recetas de los medios que se usaron para expresión bacteriana. Esto redujo significativamente el coste de esta tecnología de piPSC.
La tecnología de piPSC de la presente invención utiliza una tecnología de replegamiento de proteínas in vivo, que suministra directamente las proteínas de reprogramación expresadas en bacterias en las células somáticas utilizando la tecnología de suministro de proteína de QQ para el replegamiento por la maquinaria de plegamiento celular en mamíferos. Por lo tanto, esta tecnología de piPSC omite la etapa del replegamiento de proteínas in vitro complicado e ineficiente de las proteínas de reprogramación expresadas en bacterias, lo que hace que esta tecnología de piPSC sea una tecnología mucho más simple y económica.
La tecnología de piPSC de la presente invención utiliza tecnología de administración de proteína de QQ para administrar directamente proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas para iniciar y mantener la reprogramación celular. Se ha demostrado que esta tecnología de piPSC podría suministrar específicamente proteína de reprogramación en los núcleos de prácticamente todas las células somáticas en 1,5 horas después del suministro de proteína de QQ.
La tecnología de piPSC de la presente invención también puede iniciar la reprogramación celular en las primeras 24 horas después del suministro de proteínas y la reprogramación celular podría completarse en 5 días para generar células piPs , lo que demuestra por primera vez que la reprogramación celular no es un proceso estocástico, sino un proceso definido y repetible para generar células piPS a partir de células somáticas utilizando tecnología de suministro de proteína de QQ.
La tecnología de piPSC de la presente invención incluye una condición de cultivo celular sin alimentador para pasar las piPSC generadas. En el presente documento se describe el procedimiento detallado de esta condición sin alimentador y también se informa sobre los posibles cambios de forma y morfología de las colonias. Usando esta condición sin alimentador, más de 30 pases de las células piPS generadas han pasado con éxito durante más de 6 meses.
La tecnología de piPSC de la presente invención describe un método de pase que es claramente diferente del método de pase tradicional que recoge una única colonia para el pase. Dado que esta tecnología de piPSC convierte casi el 100% de las células somáticas en células piPS, se desarrolló un método de pase de placa completa que pasa las células de toda la placa a nuevas placas para el pase. Esto permite evitar la recolección de colonias y la expansión clonal y puede reducir significativamente las tasas de mutación de las células piPS generadas. Esto resolvió el principal problema de la generación de suficientes células piPS para aplicaciones y puede mejorar significativamente la calidad de las células piPS para aplicaciones clínicas humanas seguras.
La tecnología de piPSC de la presente invención sugiere un procedimiento para desarrollar modelos de enfermedad para pacientes individuales. Esta es una de las aplicaciones importantes de esta tecnología de piPSC que permite estudiar enfermedades humanas en una placa.
La tecnología de piPSC de la presente invención sugiere un procedimiento para el cribado de fármacos y la prueba de toxicidad de los fármacos para pacientes individuales. Esta es otra aplicación importante de esta tecnología de piPSC que potencialmente permite desarrollar nuevos medicamentos en una placa para cada paciente individual.
La tecnología de piPSC de la presente invención sugiere una terapia con células madre basada en el paciente para tratar enfermedades humanas, que incluyen pero no se limitan a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular, defectos de aprendizaje, lesión cerebral traumática, cicatrización de heridas, lesión de la médula espinal, osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, cánceres de sitios múltiples, diabetes, distrofia muscular, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, calvicie, ceguera y sordera. Esta es la aplicación más importante de esta tecnología de piPSC que potencialmente nos permite tratar muchas enfermedades humanas en pacientes individuales.
Se desarrollaron tres tecnologías para resolver los problemas más desafiantes de la tecnología iPSC disponible anteriormente o actual. Estas tecnologías incluyen un sistema de expresión bacteriana, que permite una cantidad de gramos/litro de producción de proteína recombinante pura; una técnica de replegamiento de proteínas in vivo para replegar eficazmente proteínas expresadas en bacterias utilizando maquinaria de plegado intracelular de células de mamífero; y la tecnología de transducción de proteína de QQ que tiene una capacidad de direccionamiento a orgánulos intracelulares específicos, incluido el núcleo.
Utilizando la primera tecnología, se prepararon proteínas Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc expresadas en bacterias con rendimientos de 80-120 mg por cada litro de expresión, que se confirman mediante transferencias Western. Esto hace que la proteína de reprogramación recombinante sea mucho más barata y asequible. La segunda tecnología, una tecnología de replegamiento de proteínas in vivo, permite omitir la etapa de replegamiento in vitro adoptada por Ding et al., que es ineficiente, costosa y complicada. Generalmente, este método administra las proteínas expresadas por bacterias en células de mamíferos utilizando la tecnología de administración de proteínas QQ. La maquinaria de plegado intracelular podría replegar eficazmente las proteínas expresadas en bacterias.
La tercera tecnología es una tecnología avanzada de suministro de proteínas QQ, que tiene varias características, lo que garantiza la relevancia fisiológica de esta tecnología de suministro de proteínas:
(1) El reactivo de QQ se asocia de forma no covalente con proteínas y no se añaden etiquetas a las proteínas suministradas.
(2) El reactivo de QQ enmascara/protege las proteínas suministradas de las proteasas intracelulares (alta estabilidad metabólica).
(3) El reactivo de QQ suministra proteínas específicamente a su compartimento objetivo en función de las señales de localización de las secuencias transportadas por las proteínas administradas (capacidad de direccionamiento). (4) El reactivo de QQ tiene una alta eficiencia de suministro de proteínas, hasta una concentración intracelular milimolar (mM).
Los reactivos de QQ son cócteles basados en polietilenimina (PEI), con otros ingredientes clave, tales como lípidos y potenciadores. Pueden formularse para aplicaciones específicas. El reactivo de QQ se une a las proteínas suministradas de forma no covalente, que recubre una capa del reactivo de QQ en la superficie de la proteína suministrada. Esto ENMASCARA la proteína de la degradación por la proteasa intracelular. El reactivo de QQ SE disocia gradualmente de las proteínas suministradas una vez dentro de las células. Estas características únicas de los reactivos de QQ hacen que las proteínas suministradas sean indistinguibles de sus contrapartes endógenas dentro de las células. Una vez que las proteínas suministradas alcanzan sus compartimentos objetivo, la maquinaria de la célula se comporta como si fueran las contrapartes endógenas. Se demostró que las proteínas suministradas por QQ se pliegan y se modifican después de la traducción correctamente dentro de las células y siguen la misma ruta de tráfico y secreción intracelular que sus contrapartes endógenas.
El 28 de mayo de 2008 se presentó una solicitud de patente de la tecnología de suministro de proteína de QQ y la tecnología de replegamiento de proteína in vivo. Estas tres tecnologías avanzadas RESOLVIERON los principales problemas de la tecnología iPSC actual. Esto permite el desarrollo de una tecnología de piPSC, para generar células iPS de alta calidad a partir de muchas células somáticas diferentes utilizando proteínas de reprogramación en 1 semana con una eficiencia de conversión cercana al 100%. Además, la tecnología de iPSC es una tecnología simple y asequible.
Más específicamente, usando la técnica de administración de proteína de QQ de última generación, las proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias se administran directamente al núcleo de prácticamente todos los fibroblastos de recién nacidos humanos (HNF) de partida. Las proteínas de reprogramación recombinantes se replegan correctamente mediante la maquinaria de plegado intracelular e inician la reprogramación celular dentro de las 24 horas posteriores a el suministro de la proteína. Esta reprogramación celular se mantiene bien y se puede completar en 1 semana. Las piPSC generadas muestran características de células madre embrionarias humanas (ESC), se pueden expandir de manera estable y homogénea durante más de 30 generaciones en una condición sin alimentador y tienen los potenciales de diferenciación tanto in vitro como in vivo en tres capas germinales principales. Lo más importante es que esta técnica de piPSC genera piPSC a partir de HNF con una eficiencia de conversión superior al 85 ± 4%. Una eficiencia de reprogramación tan alta puede mejorar significativamente la calidad de las piPSC generadas que son seguras para futuras aplicaciones clínicas en humanos.
Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los Ejemplos representan técnicas y composiciones que los inventores han descubierto que funcionan bien en la práctica de las realizaciones descritas en este documento y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su práctica.
Ejemplos
Materiales y métodos
Construcción de plásmidos. Cuatro genes, Oct4 (NP_002692), Sox2 (NP_003097), Klf4 (NP_004226), Nanog (NM_024865.2) y c-Myc (NP_002458), se subclonaron en un vector de expresión bacteriano sHT-pET30a, en el que una pequeña etiqueta His: 'HHHHHHSS' reemplazó la etiqueta His larga. Un sitio de escisión del factor Xa (IEGR) se encuentra entre la etiqueta His corta y los genes codificantes. Las secuencias de los vectores de expresión bacterianos se confirmaron mediante secuenciación de ADN.
Expresión y purificación de proteínas. Los constructos de ADN de las proteínas de reprogramación se transformaron individualmente en la cepa BL-21 (DE3) de E. Coli. Se seleccionó una sola colonia para la expresión de proteínas bacterianas. Después de una breve optimización, las expresiones de proteínas se indujeron mediante IPTG 0,5 mM y se siguieron cultivando a 18 °C durante 16 horas. Las células se recogieron en el tampón de unión que contenía urea 6 M y se sonicaron tres veces. Las proteínas recombinantes se purificaron usando una columna His-Bind Resin (Novagen) de acuerdo con el manual con modificaciones. Las proteínas purificadas se dializaron frente a agua y se liofilizaron en polvos de proteína.
Modificación de QQ. Las proteínas de reprogramación se disolvieron en fosfato de sodio 50 mM pH 7,4 con urea 2 M. Los reactivos de QQ se prepararon en forma fresca con base en la receta. Brevemente, el reactivo de QQ es un cóctel de polietilenimina (PEI) 2.000 (2K, 0,2-1,0 mg/ml) y DOTAP/DOPE (25-50 |jg/ml). La modificación de QQ de las proteínas de reprogramación se realizó mezclando el cóctel de QQ con una proteína (Oct4/Sox2: 1 mg/ml; Klf4/c-Myc: 0,5 mg/ml; Nanog: 1 mg/ml) durante 4 horas a temperatura ambiente o durante la noche en una cámara fría.
Cultivo celular y reprogramación celular. Los HNF se cultivaron en una placa de cultivo celular de 35 x 10 mm hasta una confluencia del 70-80% (5x104 células) en el medio DMEM con f Bs al 10%. Las proteínas de reprogramación modificadas con QQ también se mezclaron con medio DMEM con FBS al 10% (Invitrogen) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La concentración final de Oct4, Sox2 y Klf4 fue de 0,2-0,5 jg/m l mientras que la de c-Myc fue de 0,02-0,05 jg/ml. Para iniciar la reprogramación, el medio de cultivo celular se reemplazó por el medio de reprogramación (medio DMEM con FBS al 10%, aminoácidos no esenciales 0,1 mM y L-glutamina 2 mM). La concentración de proteína se redujo gradualmente como sigue: En el ciclo 1, Oct4/Sox2/Klf4 fueron 0,5 jg/m l y c-Myc fue 0,05 jg/ml. En el ciclo 2, la concentración de proteínas se redujo a la mitad. En el ciclo 3, la concentración de proteínas se redujo aún más a la mitad. Cada ciclo contenía una incubación de 3 a 12 horas con proteínas QQ modificadas, más una incubación de 12 a 21 horas sin reprogramar proteínas. Después de 3 ciclos, las células se cultivaron en medio DMEM con KSR al 20%, 2-ME 0,1 mM, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, suplementado con 10 ng/ml de bFGF (Stemgent) para reprogramar posteriormente el cultivo durante 48 horas. Este medio de cultivo después de la reprogramación de 48 horas se guardó como medio condicional. Al final de la reprogramación posterior del cultivo, las células eran completamente confluentes. Una placa confluente después de la reprogramación posterior del cultivo promovería la formación de colonias en una condición sin alimentador.
Generación de piPSC bajo una condición sin alimentador. Se trató previamente una nueva placa (recubierta de gelatina al 0,2%) con el medio condicional durante 15 minutos. Las células reprogramadas se disociaron como una suspensión de células monocapa usando tripsina (0,05%) y se transfirieron a las nuevas placas. Las células se cultivaron en un medio que contenía DMEM desactivado con KSR al 20% (Invitrogen), bFGF 10 ng/ml, 2-ME 0,2 mM (Sigma), aminoácido no esencial 0,1 mM (Invitrogen) y L-glutamina 2 mM. (Invitrogen). Al día siguiente, se observaron cientos de colonias de bordes claros. Las células se pasaron cada 5-7 días cuando la placa tenía una confluencia del 80-90%. Para comparar la pluripotencia de las poblaciones de piPSC, se seleccionó una sola colonia de piPSC para el pase (pase de una sola colonia) o se pasaron las células de la mitad de una placa (pase de placa completa). Se continuó la expansión celular usando ambos métodos de pase hasta el décimo pase (2 meses) y se realizó la inmunotinción. Durante la etapa de piPSC, el medio se cambió cada dos días reemplazando la mitad del medio con medio fresco sin alimentador. Se preparó medio sin alimentador cada dos semanas y se mantuvo en una cámara fría.
Dosificación de proteínas de reprogramación frente a la formación de colonias de piPSC. Se utilizaron diferentes concentraciones de proteínas de reprogramación para generar colonias de piPSC. Se realizó una reprogramación de dos ciclos por triplicado a cada concentración de proteína. Después de la reprogramación y la incubación posterior a la reprogramación (48 horas), la placa completa se pasó a placas de 60 x 15 mm. El número de colonias se contó al microscopio durante tres días consecutivos comenzando en el pase 2.
Direccionamiento nuclear de proteínas de reprogramación. Se sembraron HNF en 4 pocillos un día antes del experimento. Los HNF se incubaron con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (1 jg/m l) modificado con QQ individualmente durante 1,5 horas a 37 °C. Las células se lavaron con PBS 3 veces y se fijaron con formaldehído al 4% y luego se lavaron 3 veces con PBS. Las células se bloquearon y se permeabilizaron con suero de oveja al 2% que contenía tritón al 0,2% durante 2 horas y se incubaron con anticuerpos primarios con suero de oveja - PBS al 2% durante la noche en una cámara fría. Las células se lavaron 3 veces con suero al 1% y luego se incubaron con anticuerpos secundarios (dilución 1:300) a temperatura ambiente durante 2 horas. Las células se lavaron 3 veces usando suero - PBS al 1% y se sometieron a formación de imágenes con fluorescencia.
Análisis de la matriz de genes de pluripotencia de células madre humanas. El ARN total se extrajo de los HNF y las iPSC en los pases 1 y 5 utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVana (Ambion, EE. UU.). Para el análisis de expresión génica se utilizaron matrices de pluripotencia de células madre TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, cA, EE. UU.), que contienen 92 genes validados bien definidos. La reacción de transcripción inversa, la RT-PCR en tiempo real y el análisis de datos para obtener los valores de Ct se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, el ADNc se transcribió de forma inversa a partir de 1,0 jg de ARN total, respectivamente, utilizando cebadores aleatorios del kit de ADNc Archive de alta capacidad (Applied Biosystems). La RT-PCR se llevó a cabo en un termociclador ABI Veriti (Applied Biosystems). Se mezclaron 500 ng de ADNc con una mezcla maestra de PCR universal TaqMan® por depósito, dos depósitos para cada muestra. La mezcla de PCR específica de la muestra se cargó en la matriz de pluripotencia de células madre TaqMan®, cada depósito de 100 pl. Después de la centrifugación, la matriz TaqMan se procesó en un sistema 7900HT (Applied Biosystems) para análisis cuantitativo de PCR en tiempo real. Los valores de Ct sin procesar se calcularon utilizando el software SDS versión 2.3 y RQ Manager 1.2 (Applied Biosystems) aplicando configuraciones de línea de base automáticas y un umbral de 0,05. Para el análisis de datos de matriz, solo se tuvieron en cuenta aquellos miARN con un valor de Ct igual o inferior a 36. Los valores de Ct sin procesar se importaron a un StatMiner 4.2 en tiempo real (Integromics, Inc.). Se seleccionó GAPDH como gen de control endógeno para determinar la expresión relativa de los genes candidatos. Las expresiones génicas de HNF se eligieron como calibrador para identificar los marcadores específicos de piPSC expresados diferencialmente. Se calculó el -AACt y se realizó el análisis del mapa de calor con agrupamiento jerárquico. Se utilizó además RT-PCR en tiempo real Single TaqMan® para confirmar los datos de la matriz.
RT-PCR en tiempo real. Se aisló el ARN total de fibroblastos del recién nacido humano y las piPSC (1ero y 5to pases) utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVana (Ambion, EE. UU.), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para cada reacción de RT, se usó ARN de 200 ng para síntesis de ADNc usando kits de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystem, EE. UU.). La reacción de PCR se realizó en el sistema HT-7900. Los resultados fueron el promedio medido por triplicado y normalizado a un gen de control GAPDH. La expresión relativa de los genes diana se calculó utilizando el método de ciclo de umbral comparativo. Las diferencias de expresión se generaron calculando -AACt.
Transferencia Western. Las proteínas purificadas o los lisados de piPSC se separaron mediante SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los anticuerpos contra Oct4 (Santa Cruz), Sox2 (Santa Cruz), KLF4 (R&D SYSTEMS) y c-Myc (R&D SYSTEMS) humanos se utilizaron para detectar las proteínas. Se utilizaron anticuerpos secundarios contra IgG de ratón (Santa Cruz), IgG de conejo (Santa Cruz) e IgG de cabra (Sigma), respectivamente. Las señales de proteína se detectaron mediante el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pigmo (Thermo Scientific, EE. UU.).
Formación de cuerpos embrionarios (EB) y diferenciación espontánea in vitro. Las piPSC se tripsinizaron en células monocapa y se cultivaron en suspensión sobre placas de baja adhesión (Corning) en medio DMEM con FBS al 10%, que contenía 2-ME 0,1 mM. Se observaron EB en varios días en suspensión. Para la diferenciación espontánea, el medio se cambió cada 2 días durante 10 a 15 días. Las diferenciaciones espontáneas se examinaron mediante inmunotinción de marcadores específicos de linaje representativos con los anticuerpos indicados. Para la diferenciación del linaje neural específico, el medio se cambió a un medio de inducción neural el día 3 después de la formación de EB: DMEM con FBS al 5% que contenía 20 ng/ml de factor de crecimiento neural (PROSpect). Para la diferenciación específica del linaje de cardiomiocitos, el medio se cambió a un medio especial el día 3 después de la formación de EB.
Ensayo de citoquímica e inmunofluorescencia. El ensayo de ALP (kit I de sustrato de ALP Vector Red) se realizó de acuerdo con el fabricante. La inmunocitoquímica se realizó utilizando un protocolo estándar para marcadores de pluripotencia y diferenciación. Brevemente, se sembraron piPSC y HNF en cámaras de cultivo de 8 pocillos y se fijaron con paraformdehído al 4% (Sigma), se lavaron tres veces con PBS. Las células se incubaron en Triton-X al 0,2% y suero de oveja al 5% (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las células se incubaron con anticuerpo primario a 4 °C durante la noche: kit de anticuerpos marcadores de células madre (R&D Systems, 1:300), anti-Tra-1-60 (Stemgent, 1:300) y anti-Rex1 (Stemgent, 1:300) se utilizaron para los marcadores de pluripotencia. Para la diferenciación in vitro, se usaron Tuj1 (Covance, 1:500), Nestina (Millipore, kit de caracterización de células madre neurales, 1:10), MF20 (Development Studies Hybrioloma Bank, Super, 1:300), APF (Thermo Scientific, 1:200), Desmina (Thermo Scientific, 1:300) y Brachyury (Santa Cruz, 1:300). Después de lavar tres veces en suero-PBS al 1% durante 10 minutos, las células se incubaron con anticuerpos secundarios (1:400 en suero-PBS al 2%) durante 2 horas a temperatura ambiente: IgG anti-cabra de burro Alexa Fluor 555 (1:2000, Invitrogen ), IgG anti-conejo de burro Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen) y IgG anti-pollo de burro Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen). Los núcleos fueron detectados por DAPI usando el medio de montaje cooperado por DAPI (VactorLab). Las imágenes de fluorescencia se tomaron utilizando un sistema de formación de imágenes ApoTom (Zeiss) Ax10plan 2.
Formación de teratoma. Se utilizó todo el pase de la placa para expandir las piPSC para la formación de teratomas. En el pase 3, las piPSC se suspendieron en DMEM que contenía f Bs al 10%. Se anestesiaron ratones SCID o Balb/c atímicos (NxGen Biosciences) con éter dietílico y se inyectó la suspensión celular debajo de la cápsula renal y debajo del músculo. Los tumores eran claramente visibles en la cuarta semana y se diseccionaron quirúrgicamente a la sexta semana después de la inyección. Las muestras de tejido se fijaron en PBS que contenía formaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina.
Estudio de metilación de ADN. El ADN genómico se aisló tanto de HNF como de piPSC usando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Valencia, CA) y se fragmentó mediante sonicación para cortar el ADN en un pequeño fragmento (400 ~ 1000 pb de tamaño). El ADN metilado se aisló del ADN genómico fragmentado mediante la unión al dominio de unión metil-CpG de la proteína MBD2 humana usando un kit de enriquecimiento de ADN metilado MethylMiner (Invitrogen) usando un protocolo sugerido por el fabricante. Se realizó una qRT-PCR usando un sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) para determinar el valor Ct de la secuencia de la región promotora del gen Nanog para cada una de las muestras de ADN metilado usando un par de cebadores (región promotora del gen Nanog: -1519 a 1498 y -1307 a -1327) para amplificar un fragmento de a Dn de 192 pb. Como control interno, también se determinó el valor de Ct del gen de la p-actina para cada una de las muestras de ADN metilado usando un par de cebadores (Exón 5) para amplificar un fragmento de ADN de 154 pb. El nivel del ADN de la región promotora del gen Nanog en los HNF se contó como 100% y el nivel del ADN de la región promotora del gen Nanog en piPSC se calculó como las veces que cambia con respecto a aquella de los HNF utilizando un software StepOne v2.1 (Applied Biosystems).
Análisis SKY. Cultivos celulares y preparación de cromosomas: Las células se recolectaron después de un tratamiento de 2 horas con Colcemid (0,1 |jg/ml). Después del tratamiento hipotónico convencional (KCl al 0,4%, 37 °C durante 10 minutos), las preparaciones de cromosomas se fijaron con metanol: ácido acético 3:1 (3x) y los portaobjetos se prepararon mediante el método de secado al aire. Después del tratamiento con pepsina y la fijación con formaldehído, los portaobjetos se deshidrataron. A continuación, los portaobjetos cromosómicos se desnaturalizaron en formamida al 70% y 2 x SSC y se hibridaron con sondas de pintura humana desnaturalizadas (SKYPaint) durante más de 48 horas a 37 °C. Las señales se detectaron siguiendo una serie de etapas de lavado de portaobjetos. La tinción DAPI también se utilizó para visualizar el cromosoma/núcleos. Se capturaron aleatoriamente 50 figuras mitóticas con buena calidad de hibridación utilizando una cámara CCD. Después de la adquisición de imágenes, los cromosomas se cariotiparon con el software Applied Spectral Image.
Resultados
Un protocolo simple de piPSC. Esta técnica de piPSC contiene etapas de preparación de proteínas de reprogramación expresadas en bacterias, modificaciones de q Q y 1-5 ciclos de reprogramación celular, dependiendo de las diferentes células de partida (Fig. 1). Recientemente se informó de un método de expresión bacteriana eficiente (Fig. 2A), que permite la producción de 80-120 mg de proteínas recombinantes puras para Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc a partir de un litro de expresión bacteriana (Fig. 2B). Dado que las proteínas recombinantes expresadas en bacterias pueden no plegarse correctamente, se utilizó un método de replegamiento de proteínas in vitro en el protocolo anterior de piPSC de Zhou et al., que era ineficaz y se requería una etapa de purificación adicional. Sin embargo, recientemente se desarrolló una técnica de replegamiento de proteínas in vivo que suministra directamente proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias en células de mamíferos utilizando el suministro de proteína de QQ, en el que la maquinaria de plegado intracelular pliega eficientemente las proteínas. El protocolo de piPSC aplica el principio de esta técnica de replegamiento de proteínas in vivo. Las cuatro proteínas de reprogramación se administraron en los núcleos de los HNF utilizando la técnica de administración de proteínas QQ para replegarse y funcionar para iniciar la reprogramación celular (Fig. 3). Cada ciclo de reprogramación es de 24 horas: los HNF se incubaron con cuatro proteínas de reprogramación durante 3-12 horas, lo que permitió el suministro de proteínas a las células, seguido de un cambio a un medio de cultivo celular normal durante 12-21 horas (Fig. 1).
Para la reprogramación celular inducida por proteínas, se requiere que los factores de transcripción suministrados alcancen los núcleos para iniciar la reprogramación celular. Las proteínas de reprogramación administradas por QQ alcanzaron los núcleos de prácticamente todas las células 1,5 horas después del suministro (Fig. 3). Las proteínas suministradas también se observaron en el citosol, ya que se realizaron imágenes de fluorescencia durante el suministro de proteínas. Este resultado muestra que la reprogramación celular inducida por proteínas puede iniciarse pocas horas después del suministro de proteínas. Se demostró que la reprogramación celular de HNF inducida por proteínas se inició dentro de las primeras 24 horas y se completó dentro de los 5 días, a juzgar por la inmunotinción utilizando marcadores de pluripotencia tardía como Rex1 y Tra1-60 (Fig. 4). Esto se confirmó además por la formación de colonias en las placas de reprogramación celular el día 8 (Fig. 4).
Optimizaciones del protocolo de piPSC. Las concentraciones de proteínas se optimizaron primero utilizando el número de colonias positivas para fosfatasa alcalina (ALP) como criterio para la optimización. Los datos indicaron una baja eficiencia de conversión con una alta concentración de proteínas de reprogramación. Cuando se utilizó una concentración de proteína de 5 jg/ml, solo se encontraron unas pocas colonias positivas para ALP. Una concentración más baja generó más colonias positivas para ALP, con una concentración de proteínas de reprogramación de 0,25­ 0,50 jg/m l generando la mayoría de las colonias positivas para ALP en 5 días (Tabla 1). Este resultado está respaldado por los datos publicados de células ES humanas (hESC), que indican que la concentración de Oct4 dentro de las ESC es crítica, porque una concentración más alta de Oct4 causa la diferenciación de células ES, mientras que una concentración más baja de Oct4 no logra mantener la pluripotencia. Además, c-Myc es una proteína oncogénica que puede causar tasas más altas de mutaciones y participar en la tumorigénesis a altas concentraciones intracelulares. Una concentración optimizada de cuatro proteínas de reprogramación es fundamental para la calidad de las células piPS generadas. El suministro de proteína de QQ permite controlar la concentración de las proteínas suministradas dentro de los núcleos de los HNF (Tabla 1), lo que permite optimizaciones rápidas de las concentraciones de proteínas.
También se realizaron optimizaciones del protocolo de reprogramación celular. El protocolo inicial (reprogramación de 3 horas) se repitió con un solo ciclo de reprogramación y las células se inmunotiñeron utilizando el anticuerpo anti-ALP al final del ciclo. Sólo menos del 30% de los HNF mostraron una fuerte tinción de ALP (Fig. 5D). Como control, el HNF cultivado con un medio de cultivo regular sin proteínas de reprogramación durante 24 horas no mostró tinción de ALP (Fig. 5C). Cuando se realizó una reprogramación de 5 horas, significativamente más células (~ 60%) mostraron una fuerte tinción de ALP (Fig. 5E). Un cultivo continuado de 24 horas de HNF con cuatro proteínas de reprogramación (0,1 |jg/ml) indicó que prácticamente todas las células de HNF eran positivas para ALP (Fig. 5F), lo que sugiere una posible eficiencia de conversión muy alta de la reprogramación celular. Estos datos proporcionan evidencia directa de la capacidad habilitadora del suministro de proteína de QQ en la reprogramación celular inducida por proteínas.
El protocolo de piPSC optimizado usualmente suministró una relación de Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc de 1:1:1:0,1 con una concentración de proteína de 0,5 jg/m l para Oct4 para el primer ciclo y una concentración de proteína reducida a la mitad en el ciclo a partir de entonces. Normalmente se realizaron de 1 a 5 ciclos de reprogramación, dependiendo de las células somáticas humanas de partida. Para HNF, 2-3 ciclos de reprogramación fueron suficientes para generar células piPS. Al final de la reprogramación, el medio de cultivo se cambió a un medio de mantenimiento sin alimentador que contenía FGF (10 ng/ml) durante 2 días. Las células se levantaron y se transfirieron a nuevas placas, que se trataron previamente con el medio acondicionado durante 10 minutos. Las células se cultivaron con la mitad de medio acondicionado y la otra mitad con nuevo medio de mantenimiento sin alimentador. En el día 5-6, se observaron muchas colonias de bordes claros (Fig. 5A y 5B). La placa completa contiene 500-1500 colonias de piPSC de 105 células de partida. En un estudio reciente que utilizó extractos de proteínas de células ES de ratón, también se produjeron células similares a piPS en 5 días, pero con una eficiencia mucho menor.
Alta eficiencia de conversión. Esta técnica de piPSC proporciona una alta eficiencia de conversión de piPSC de células somáticas humanas. Habitualmente se obtuvieron muchas colonias en el primer o segundo pase. En la Fig. 6A, el panel de la izquierda muestra muchas colonias en una placa. Las colonias se tiñeron con un kit de ALP rojo; el panel de la derecha muestra la imagen ampliada del área encuadrada, mostrando las colonias de piPSC teñidas con ALP rojo. Para evaluar la eficiencia de conversión, se prepararon intencionalmente piPSC monocapa a partir de colonias y se realizó la inmunotinción con células monocapa usando anticuerpos ALP, SSEA4, Nanog, Oct4, Rex1 y Sox2 (Fig. 6B). La inmunotinción también se realizó en los HNF de partida, mostrando tinciones negativas (Fig. 6B). Para estimar la eficiencia de conversión, se puntuó un mínimo de 10 campos seleccionados al azar para las células teñidas positiva y negativamente (> 400 células) de una manera doble ciega para minimizar las interpretaciones subjetivas después de la obtención de imágenes de fluorescencia. A continuación, se calculó la eficacia de conversión mediante la relación de células teñidas positivamente/células totales contadas. En la Fig. 6C, el panel derecho muestra los resultados, lo que indica que la eficiencia de reprogramación promedio está entre 80-91%. Este resultado es consistente con el curso de tiempo anterior, lo que sugiere que esta tecnología de piPSC puede generar piPSC con un promedio de 85 ± 4% de eficiencia de conversión. En un experimento de curso de tiempo anterior, también se demostró un promedio de 88 ± 2% de eficiencia de conversión con un protocolo de reprogramación celular similar que utilizó el suministro de proteína de QQ (Tabla 2).
Para confirmar este resultado, se realizó una doble inmunotinción usando tres pares de marcadores de pluripotencia: SSEA4/Oct4, Tra1-60/Nanog y Tra1-60/Oct4 (marcadores de superficie/nucleares). En la Fig. 6B, el panel derecho muestra ejemplos de estas tinciones dobles con Oct4/Nanog en rojo, Tra1-60 en verde y DAPI en azul. Las piPSC positivas se consideraron solo cuando tanto los núcleos como los marcadores de superficie mostraron tinciones positivas. Una vez más, los resultados confirmaron una eficiencia de conversión de -80% (Fig. 6B, panel derecho). Para verificar además que la inmunotinción es verdaderamente positiva, se realizó un experimento de control interno usando seis marcadores de pluripotencia en una mezcla de células que contiene 30% de piPSC y 70% de HNF de partida. Los datos indicaron la dilución esperada de las células teñidas positivamente (Fig. 7), proporcionando un apoyo adicional a la alta eficiencia de conversión.
Tal alta eficiencia de conversión sugiere que la selección de colonias puede no ser necesaria durante la reprogramación celular para generar células piPS y que la expansión clonal puede no ser necesaria durante la expansión de piPSC. Un informe reciente indicó que el cultivo a largo plazo de ESC humanas bajo una condición similar sin alimentador solo contenía una población de 85-94% de hESC por citometría de flujo usando diferentes marcadores de pluripotencia. Este resultado es similar a la eficiencia de conversión informada en el presente documento, lo que sugiere que el método de piPSC genera una población casi pura de piPSC.
Se realizaron experimentos tanto con recogida de colonias como con pase de placa completa. Primero, se recogió una sola colonia de bordes claros (Fig. 8A) y se colocó en la condición sin alimentador. Se notó que esta única colonia comenzó a perder su borde claro durante varios días y las células se extendieron en una monocapa. Rodin et al., también notaron que las hESC puras se esparcen en una monocapa cuando se siembran en placa en grupos pequeños en una condición similar sin alimentador. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, fueron levantadas y pasadas a nuevas placas. Muchas colonias de bordes claros se formaron al día siguiente y las piPSC a menudo migraron fuera de las colonias (flecha verde), mientras que algunas colonias mantuvieron un borde claro (flechas blancas) (Fig. 8B). Estas células migratorias forman células monocapa que pueden servir como células alimentadoras para las colonias restantes. La inmunotinción de colonias de bordes claros (Figuras 8C1 y 8C3) y células monocapa (Figuras 8C2 y 8C4) se realizó usando anticuerpos Oct4 y Nanog. Los datos indicaron claramente que ambos tipos de células se tiñeron positivamente, lo que sugiere que tanto las células de colonia como las monocapa son piPSC. Se repitió el mismo procedimiento con el pase de toda la placa y se observaron los mismos resultados. Para el pase de toda la placa, los datos indicaron que el 80-90% de las células tenían inmunotinciones positivas con seis marcadores de pluripotencia (Fig. 6C), lo que sugiere que no hay diferencia entre los dos métodos de pase en estas condiciones.
Caracterizaciones de piPSC. Usando el pase de placa completa, las piPSC humanas generadas se han expandido de manera estable y homogénea durante más de 30 generaciones en una condición de cultivo sin alimentador durante 6 meses (Fig. 9). Formaron colonias con una morfología que es indistinguible de las hESC. Estas colonias de piPSC expresaron de forma destacada marcadores ESC, incluidos ALP, Oct4, Nanog, SSEA4, Rex1 y Tra1-60 (Fig. 10). Como controles, se realizó la misma inmunotinción usando los HNF de partida, mostrando resultados negativos (Derecha, Fig. 10). El análisis de PCR con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) confirmó expresiones génicas endógenas significativamente mejoradas de genes de pluripotencia en piPSC en el pase 5, que incluyen: Oct4, Sox2, Nanog, en comparación con la expresión génica de HNF (Fig. 11A). Se observa que la expresión génica de estos reguladores maestros de pluripotencia mostró una mejora menor en el primer pase (día 6), pero una mejora importante en el pase 5 (día 22), lo que indica la dependencia del tiempo del desarrollo de la pluripotencia después de la reprogramación celular. Para verificar la expresión de la proteína de pluripotencia, se realizaron transferencias Western de las piPSC y se compararon con las células de HNF de partida. Los resultados indicaron expresiones de proteína significativas de las piPSC para cuatro marcadores de pluripotencia, incluidos Sox2, Oct4, Nanog y Rex1. Sox2, Oct4 y Nanog son los tres reguladores pluripotentes maestros y Rex-1 es un marcador de pluripotencia tardío. Por el contrario, las células de HNF de partida no mostraron expresiones de proteína de estos cuatro marcadores de pluripotencia. Como control, una proteína de mantenimiento, la actina, mostró un nivel de expresión de proteína igual entre piPSC y HNF (Fig. 11C). El análisis de metilación del ADN del gen Nanog reveló que las regiones promotoras de Nanog estaban desmetiladas significativamente en las piPSC, mientras que las mismas regiones estaban densamente metiladas en las células de HNF parentales (Fig. 11D). Este resultado proporciona evidencia adicional de que las piPSC generadas muestran una regulación epigenética de los promotores de este regulador maestro de pluripotencia, lo que sugiere una reprogramación celular epigenética apropiada en las piPSC generadas. No hubo cambio de cariotipo entre las piPSC generadas y las HNF parentales (Fig. 11B), lo que indica que no hay cambios cromosómicos importantes entre las HNF parentales y las piPSC hijas.
Diferenciaciones in vitro e in vivo. Para examinar el potencial de desarrollo de las piPSC generadas, se realizaron la diferenciación in vitro y la formación de teratomas in vivo. Los cuerpos embrioides (EB) se formaron en 1-2 días usando el método de cultivo en suspensión. Estos EB se diferenciaron fácilmente en las tres capas germinales primarias in vitro, incluidos los derivados del ectodermo (células que expresan Nestina y Pax6), derivados del mesodermo (células que expresan Desmina y Brachyury y cardiomiocitos latentes maduros) y derivados del endodermo (células que expresan AFP), según lo confirma la inmunotinción (Fig. 12, superior). Se han realizado controles negativos adecuados para la inmunotinción utilizando los HNF parentales, que muestran inmunotinciones negativas. Cuando los EB se cultivaron en un medio especial que conduce al linaje neural, estos EB cambiaron fácilmente sus morfologías en 1-2 semanas a la morfología típica de las células neurales, incluidas neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. El análisis inmunocitoquímico confirmó la existencia de estos tipos de células neurales positivas para Tuj1 (Fig. 12, A inferior), GFAP (Fig. 12, B inferior, C) y O1 (Fig. 12, D inferior). Las células madre neurales (NSC) también se observaron en un momento anterior, como lo confirman las tinciones positivas con Sox2 (Fig.12, F inferior) y Nestina (Fig. 12, G inferior).
Cuando se trasplantaron piPSC a la cápsula renal de ratones desnudos, se observó la formación de teratoma en 6 semanas (Fig. 13A y B). Se utilizaron para el trasplante las piPSC del tercer pase obtenidas a partir de pases de placas completas. Antes del trasplante, estas piPSC se caracterizaron mediante inmunotinción con seis marcadores de pluripotencia. De nuevo, se prepararon intencionalmente piPSC monocapa para inmunotinción (Fig. 13C). Los resultados indicaron que prácticamente todas las células mostraban tinciones positivas para los seis marcadores de pluripotencia. Aproximadamente 200.000 piPSC se trasplantaron a la cápsula del riñón izquierdo de ratones desnudos. Se observaron formaciones en forma de nódulos en el área del flanco izquierdo de los ratones entre tres y cuatro semanas después de la implantación. Los ratones se sacrificaron a las seis semanas. Los datos histológicos de los portaobjetos de tejido indicaron que estos tejidos que contienen teratoma forman las tres capas germinales primarias, incluidos los tejidos neurales y epidérmicos (ectodermo), el músculo estriado y el cartílago (mesodermo) y los tejidos del epitelio de tipo intestinal (endodermo) (Fig.14), confirmando que las piPSC generadas exhiben pluripotencia in vivo. Este resultado proporciona además una verificación in vivo de la alta eficiencia de conversión, ya que las piPSC generadas expandidas con el pase de la placa completa fueron capaces de generar teratomas de manera eficiente.
Recientemente, los cuatro factores de reprogramación de Yamanaka fueron reemplazados por Sox2, Oct4 y Nanog, que son los reguladores maestros de la pluripotencia para generar células piPS. Estos datos nuevamente indicaron una eficiencia de conversión muy alta de 87 ± 3% (Tabla 3). Este nuevo cóctel de proteínas de reprogramación elimina las proteínas oncogénicas, Klf4 y c-Myc en los factores de Yamanaka, las células piPS generadas tendrán una mayor calidad y una tumorigénesis minimizada.
Discusión
El protocolo de piPSC descrito en este documento aplicó la tecnología de administración de proteína de QQ de última generación que resolvió los desafíos técnicos asociados con las técnicas actuales de iPSC. En primer lugar, los reactivos de QQ se unen de forma no covalente a las proteínas suministradas y las camuflan de la degradación de las proteasas intracelulares, lo que garantiza que las proteínas suministradas mantengan su forma nativa y la estabilidad metabólica. Más importante aún, las proteínas suministradas QQ tienen la capacidad de localizarse específicamente en los compartimentos intracelulares diana basándose en sus señales de localización de secuencia. Estas características permiten que las proteínas suministradas sean indistinguibles de las proteínas endógenas, la maquinaria celular funciona como si fueran las contrapartes endógenas, lo que demuestra la relevancia fisiológica de la tecnología de suministro de proteínas QQ.
Usando el suministro de proteína de QQ, las proteínas de reprogramación recombinantes expresadas en bacterias se administraron directamente en los núcleos de HNF en 1,5 horas (Figura 3), lo que permite omitir la etapa ineficaz de replegamiento de proteínas in vitro. La maquinaria de plegado de proteínas intracelulares vuelve a plegar directamente las proteínas de reprogramación suministradas por q Q, lo que hace que este protocolo de piPSC sea un procedimiento rápido, simple y económico. El suministro de proteína de QQ es capaz de suministrar de manera eficiente cuatro proteínas de reprogramación en el núcleo de esencialmente cada HNF, lo que sugiere una posible alta eficiencia de conversión de generar piPSC a partir de HNF. Los datos indicaron además que la reprogramación celular podría iniciarse dentro de las 24 horas posteriores al suministro de la proteína de QQ y se mantuvo bien durante 48-72 horas y se completó en 5 días después del suministro de la proteína de QQ (Fig. 4). Esto acelera significativamente el procedimiento de generación de piPSC, demostrando la capacidad habilitadora de la técnica de suministro de proteína de QQ.
Para generar piPSC con alta eficiencia de conversión, tanto el silenciamiento génico de desarrollo como la activación génica pluripotente de células somáticas humanas deben lograrse de manera eficiente. Esto requiere el suministro eficiente de las proteínas de reprogramación en los núcleos para la interacción con diferentes regiones promotoras y represoras de diferentes genes. El suministro de proteína de QQ cumple con este requisito y el suministro dirigido de proteínas de reprogramación en el núcleo de casi todos los HNF, lo que da como resultado una eficiencia de conversión del 85 ± 4% de las piPSC a partir de los HNF de partida. Esto genera una población de piPSC casi pura que es similar a una población de hESC pura durante la autorrenovación a largo plazo de hESC en condiciones similares sin alimentador. Esta alta eficiencia de conversión elimina la selección de colonias durante la reprogramación celular y la expansión clonal. Se desarrolló un pase de placa completa, lo que generó una población de piPSC monocapa uniforme que es fundamental para reducir la diferenciación durante la autorrenovación a largo plazo. El uso de piPSC monocapa homogénea también proporciona condiciones más controlables para el diseño de la condición de diferenciación, teniendo la principal ventaja de conducir la diferenciación a una población más homogénea de células de linaje especial cuando se colocan en un medio inductor de linaje especial.
Las piPSC generadas eran células de tipo ESC humanas, que mostraban expresiones significativamente mejoradas de los genes de pluripotencia, incluidos tres reguladores maestros de pluripotencia Sox2, Oct4 y Nanog (Figura 11A). Estos tres reguladores de pluripotencia maestros también mostraron expresiones de proteínas importantes (Fig. 11C). Las piPSC generadas mostraron potencial de diferenciación en las tres capas germinales primarias tanto in vitro como in vivo (Figuras 12 y 14). De hecho, estas piPSC fueron capaces de diferenciarse eficazmente en linaje neural con morfología típica de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Fig. 12, inferior). El laboratorio de Jaenisch demostró recientemente que la reprogramación mediante cuatro factores de transcripción era un proceso estocástico continuo en el que casi todas las células de los donantes de ratón finalmente daban lugar a iPSC con el crecimiento continuo y la expresión del factor de transcripción. Sin embargo, este método requirió 8 semanas para generar iPSC con inhibición de la vía p53/p21 o sobreexpresión de Lin28. La técnica de piPSC descrita en este documento confirmó la alta eficiencia de conversión sin manipular ninguna ruta más adelante. Esto tiene las principales ventajas para futuras aplicaciones clínicas humanas seguras de las piPSC generadas.
Los avances recientes en el uso de diversos enfoques genéticos han abordado algunos de los desafíos de la tecnología iPSC actual. Esto incluye adenovirus no integrantes, transfección transitoria para administrar genes de reprogramación, un sistema de transposición piggyBac, virus Creexcisable y sistema de expresión episomal basado en oriP/EBNA1. Los estudios también demuestran que la presente invención puede reemplazar y/o reducir aún más el número de factores transcripcionales necesarios para la reprogramación celular. Sin embargo, estos métodos solo proporcionan una baja eficiencia de conversión y también alteran genéticamente las células, imponiendo importantes problemas de bioseguridad de las iPSC generadas para aplicaciones clínicas humanas seguras. Actualmente, solo hay publicados dos informes sobre la reprogramación celular inducida por proteínas para células de ratón y humanas con una eficiencia de conversión extremadamente baja. La tecnología de piPSC descrita en este documento ofrece un método rápido y eficaz para generar piPSC humanas. Esta tecnología suministra directamente proteínas expresadas en bacterias para la reprogramación celular, lo que hace que este método sea simple y económico. La naturaleza no estocástica de esta técnica de piPSC hace posible estudios mecánicos fiables y precisos de la reprogramación celular. Es importante destacar que esta técnica de piPSC acelera significativamente todo el proceso de generación de piPSC específicas del paciente con alta eficiencia, lo que permite generar rápidamente un panel de piPSC específicas de la enfermedad como materiales de partida para generar modelos sustitutos de enfermedades humanas para pacientes individuales, para ganar información valiosa sobre la fisiopatología de las enfermedades, para descubrir nuevos biomarcadores de pronóstico y para garantizar un suministro continuo de tipos de células afectadas para el cribado y el descubrimiento de fármacos.
Se han planteado preocupaciones importantes acerca de la calidad de las iPSC generadas utilizando los métodos actuales de iPSC. Los resultados indicaron ligeras diferencias de patrón en los cambios epigenéticos entre las iPSC generadas y las ESC humanas. En lugar de restablecerse a un estado similar al de un embrión, los patrones de mutilación cerca de las puntas y centros de los cromosomas en las iPSC se parecían a los de los tejidos adultos de los que se habían derivado las iPSC. Para resolver este problema, se debe desarrollar un método de reprogramación celular eficiente que restablezca por completo el reloj epigenético de las células somáticas iniciales para volver a un estado similar a ESC. Además, la mayoría de los métodos de iPSC/piPSC actuales utilizan oncogenes que pueden aumentar la tasa de mutaciones. Los datos informados recientemente demostraron que las mutaciones nuevas y preexistentes que ocurren durante y después de la reprogramación contribuyen a la alta carga mutacional encontrada en las líneas actuales de hiPSC. La selección durante la reprogramación celular, la recolección de colonias y la posterior expansión clonal podrían ser los factores contribuyentes. De hecho, si la eficiencia de la reprogramación se mejora a un nivel tal que no sea necesaria la extracción de colonias ni la expansión clonal, las hiPSC resultantes podrían estar potencialmente libres de mutaciones. La técnica de piPSC descrita en este documento proporciona dicha alta eficiencia de reprogramación. Además, es posible que se requieran nuevas proteínas de reprogramación, como ADN desmetilasas o metilcitosina dioxigenasas, para restablecer completamente el reloj epigenético de las células somáticas iniciales, esta técnica piPSC descrita en este documento se puede utilizar para cribar estos nuevos factores de reprogramación de una manera de alto rendimiento. Finalmente, dado que se evita la tediosa selección de colonias durante la reprogramación y la recolección de colonias/expansión clonal que pueden generar piPSC humanas libres de mutaciones, esto ofrece una técnica de reprogramación celular que mejora significativamente la calidad de las piPSC generadas para futuras aplicaciones clínicas humanas seguras (Figs. 15 -17).
A lo largo de esta solicitud, el autor y el año y las patentes por número hacen referencia a varias publicaciones, incluidas las patentes de los Estados Unidos. Las citas completas de las publicaciones se enumeran a continuación.
La invención se ha descrito de manera ilustrativa, y debe entenderse que la terminología, que se ha utilizado en el presente documento, pretende ser de naturaleza descriptiva más que de limitación.
Obviamente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, debe entenderse que, dentro del alcance de la invención descrita, la invención se puede poner en práctica de otra manera que la descrita específicamente.
Tabla 1: Número de colonias frente a las concentraciones de proteínas de reprogramación utilizando el mismo ________________________________ procedimiento de reprogramación________________________________ No. Ciclos Condición Relación No. de Células de Concentración Número de experimentos partida de proteína Tiempo colonias 1 2 5 h/19 h 1:1:1:0,1 3 105 2 (|jg/ml) 5 días 120 ± 20 2 2 5 h/19 h 1:1:1:0,1 3 105 1 (jg/m l) 5 días 220 ± 30 3 2 5 h/19 h 1:1:1:0,1 3 105 0,50 (|jg/ml) 5 días 505 ± 25 4 2 5 h/19 h 1:1:1:0,1 3 105 0,25 (jg/m l) 5 días 520 ± 13
Se realizaron 2 ciclos de reprogramación de proteínas, cada ciclo contenía una incubación de 5 horas con cuatro proteínas de reprogramación y una incubación de 19 horas sin proteínas. La proporción de proteínas es: Oct4: Sox2: Klf4: c-Myc = 1:1:1:0,1. Se comenzó con el mismo número de células de h Nf y se realizó por triplicado para cada condición experimental. Los números de colonias se contaron el día 5 y se informaron como la media y las desviaciones estándar (media ± desviación estándar). Las colonias de células piPS generadas se tiñeron con AP (un marcador pluripotente temprano) el día 5 y Rex-1 el día 8 (un marcador pluripotente tardío).
Tabla 2: Porcentaje de células inmunoteñidas positivamente que utilizan diferentes marcadores de pluripotencia en ______ diferentes puntos de tiempo durante el transcurso de tiempo que se muestra en la Figura 4.______ ALP Nanog Oct4 Rex1 Tra1-60
24 horas 73% (438) 74% (530) 80% (547) 83% (517) 72% (340)
48 horas 79% (387) 74% (338) 83% (309) 84% (350) 80% (289)
72 horas 79% (265) 83% (334) 78% (425) 87% (280) 84% (221)
108 horas 86% (308) 87% (355) 86% (378) 90% (387) 90% 87% (277)
El porcentaje que se muestra aquí es el porcentaje de células teñidas positivamente con cinco marcadores de pluripotencia diferentes. Porcentaje = células teñidas positivamente/células totales contadas.
El número entre paréntesis es el número total de células contadas para el cálculo de células teñidas positivamente.
Tabla 3: Una tabla de eficiencia de conversión de la generación de células piPS a partir de fibroblasto humano de recién nacido usando diferentes combinaciones de Sox2, Oct4 y Nanog, que muestra intervalos de eficiencia de conversión 84-90%. La eficiencia de conversión de los factores s On es del 90 ± 3,5%. Los números entre paréntesis ______________ son los números de células contadas para el cálculo de la eficiencia de conversión.______________ Marcadores Namog, (N) Oct4 (O) Nanog/Oct4 Sox2/Oct4 Sox2/Oct4/Nanog Nanog 81 ± 1 (639) 83 ± 3 (661) 86 ± 4 (890) 88 ± 2 (593) 87 ± 5 (856) Oct4 85 ± 5 (800) 85 ± 5 (713) 91 ± 1 (716) 85 ± 4 (820) 93 ± 3 (856) Rex1 90 ± 2 (2 (965) 85 ± 4 (788) 91 ± 1 (777) 92 ± 2 (1207) 94 ± 2 (613) Tra1-60 85 ± 1 (271) -- 84 ± 2 (738) -- 86 ± 3 (290) Promedio_______ 85,3 ± 4%_______ 84,3 ± 1%________ 88 ± 3%_________88,3 ± 2,8% 90 ± 3,5%
Se puntuó un mínimo de 10 campos seleccionados al azar para las células teñidas positiva y negativamente de una manera triple ciega para minimizar las interpretaciones subjetivas (> 300 células).
Se calculó la eficiencia de conversión usando la proporción de células positivas/células totales.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para generar células madre pluripotentes inducidas por proteínas, que comprende:
poner en contacto células somáticas con proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ, en el que las proteínas de reprogramación modificadas con reactivo de QQ son proteínas de reprogramación expresadas en bacterias que se han modificado con un cóctel que comprende polietilenimina (PEI) y DOTAP/DOPE, suministrando así las proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas;
realizar varios ciclos de la etapa de contacto anterior para crear células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPS) reprogramadas;
mover las células piPS reprogramadas a un medio sin alimentador para su expansión; y
expandir y pasar las células piPS reprogramadas generando así células piPS homogéneas.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se logra una eficiencia de conversión para convertir las células somáticas de partida en células piPS del 85% o más.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende además producir las proteínas de reprogramación usando un sistema de expresión bacteriano.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además marcar las proteínas de reprogramación con sondas de fluorescencia de moléculas pequeñas antes de dicha etapa de modificación.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además controlar la eficacia del suministro de las proteínas de reprogramación en los núcleos de las células somáticas de partida.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para generar células piPS, células madre adultas específicas, células progenitoras específicas y un tipo de célula somática diferente mediante transdiferenciación de células somáticas humanas y animales sanas y enfermas.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las proteínas de reprogramación se seleccionan del grupo que consiste esencialmente en cuatro proteínas de reprogramación Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc, tres proteínas de reprogramación Oct4/Sox2/Klf4 o Sox2/0ct4/Nanog, dos proteínas de reprogramación Oct4/Sox2 o Oct4/Nanog, y solo una proteína de reprogramación Oct4 o Nanog.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las proteínas de reprogramación son Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además diferenciar las células piPS en una de las tres células principales de la capa germinal in vitro o in vivo.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células somáticas son células somáticas de animales o humanos sanos, fibroblastos primarios de ratón, fibroblastos de ratón adultos, fibroblastos de recién nacidos humanos, fibroblastos de adultos primarios humanos, queratinocitos de adultos humanos o células obtenidas del líquido amniótico humano.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células somáticas son células somáticas de animales o humanos enfermos, fibroblastos primarios de ratón de ratones con ALS, células tumorales de rata, células de glioma 9L, células de cáncer de mama metastásico de ratón, células 4T1, células de una línea celular de cáncer de mama humano, células MDA-MB-231, células de una línea celular de tumor cerebral humano, células de glioma U87 o U251, células GBM primarias humanas en etapa 4 o fibroblastos primarios humanos de pacientes con Alzheimer con genotipos apoE3 y/o apoE4.
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