ES2575605T3 - Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas - Google Patents

Abstract

Un método para generar células diferenciadas de interés a partir de células de donantes de otro tipo de células, que comprende i) expansión de las células de orina somáticas exfoliadas de la orina y ii) generación de células diferenciadas a partir de dichas células expandidas mediante la reprogramación de dichas células para que se conviertan en células madre pluripotentes derivadas de orina inducidas (CMPOi) y la diferenciación de dichas CMPOi a dichas células de interés.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de generacion de celulas madre pluripotentes inducidas y celulas diferenciadas

La invencion se refiere a celulas madre pluripotentes inducidas y celulas diferenciadas y a los metodos para generarlas.

Antecedentes de la invencion

Las celulas madre embrionarias (CME) son celulas derivadas de blastocistos obtenidos a partirde la fertilizacion in vitro que tienen el potencial de auto-renovarse y de diferenciarse en cualquier tipo de celula madura de un organismo de mairnfero, p. ej., ser humano (esta propiedad se conoce como "pluripotencia"). En condiciones de cultivo de tejidos espedficas, las CME se pueden mantener indiferenciadas durante penodos prolongados de tiempo sin que pierdan sus caractensticas pluripotentes. Debido a estas propiedades, las CME han suscitado un enorme interes en la medicina regenerativa. Potencialmente, los tejidos derivados de las CME se podnan utilizar para el tratamiento clmico de los seres humanos (ya sea en afecciones agudas ya sea en enfermedades geneticas y degenerativas). Las CME tambien se podnan utilizar para el escrutinio de farmacos, por ejemplo para el estudio de la susceptibilidad espedfica de un tejido a los tratamientos, y para modelar enfermedades geneticas in vitro. Sin embargo, graves limitaciones eticas y practicas (el riesgo de rechazo inmunitario) han obstaculizado seriamente la aplicacion de las CME en la medicina clmica y, en muchos pafses, tambien en la investigacion.

El reciente descubrimiento de que las celulas somaticas se pueden transformar en CMPi por medio de factores exogenos (este metodo tambien se ha denominado "reprogramacion nuclear por factores exogenos" (Takahashi y Yamanaka, Cell 2006; 126: 663-76) tiene el potencial de cambiar el percepcion actual de la medicina personalizada y tambien puede proporcionar valiosos modelos in vitro de enfermedades humanas (Yamanaka y Blau, 2010; Nature 465, 704-712; Lian et al., 2010; Thromb Haemost 104, 39-44).

Sorprendentemente, las CMPi son similares a las CME y tienen el potencial de ser utilizadas en tratamientos espedficos para cada paciente, evitando asf el riesgo de rechazo inmunitario. Debido a estas caractensticas, las CMPi han recibido una gran atencion en todo el mundo. La generacion de CMPi requiere la recoleccion de tejido del donante, la expansion de las celulas del donante in vitro, y la exposicion de las celulas a un coctel de factores exogenos que se proporcionan a la celula en forma de protemas purificadas, extractos de protemas, moleculas de ARN, plasmidos no integrantes, virus (p. ej., retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus Sendai), con o sin cocteles qmmicos y con variaciones en las condiciones de cultivo celular.

La aplicacion de estos factores tiene el efecto de que las colonias con una morfologfa de tipo CME emergen progresivamente. Estas colonias representan colonias de CMPi que pueden ser recogidas y posteriormente expandidas y caracterizadas para verificar que su comportamiento es similar al de las CME.

Hasta el momento, las CMPi humanas se han generado utilizando celulas de la piel del donante (fibroblastos y queratinocitos), lfquido amniotico, tejidos extra-embrionarios (placenta y cordon umbilical; (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234) sangre del cordon umbilical, membrana periostica, tejido dental, tejido adiposo, celulas madre neurales, hepatocitos, celulas madre mesenquimales derivadas de amnios y celulas de sangre periferica (Ye y Cheng, 2010; Regen Med 5, 521-530; Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234). La reprogramacion de las celulas de estos tejidos se ha logrado con frecuencias variables, lo que indica que la celula de origen ("celula de donante") importa. Debido a la heterogeneidad de las celulas del donante actualmente utilizadas para la generacion de CMPi, es diffcil establecer normas para la realizacion de ensayos comparativos con CMPi y cMe, asf como para extraer conclusiones significativas a partir de los resultados de los ensayos.

El tipo de celula de donante ideal para la generacion de celulas CMPi debe ser facilmente accesible, facilmente reprogramable, y universal (de cualquier edad, sexo, grupo etnico y condicion corporal). Hoy en dfa, los fibroblastos dermicos se encuentran entre las fuentes de celulas utilizadas con mas frecuencia para la reprogramacion, pero requieren no solo una biopsia incomoda que necesita ser realizada en un ambiente aseptico por un especialista, sino tambien una expansion prolongada antes de su uso. Tambien tienen riesgo de mutaciones de celulas somaticas debido a la exposicion a la luz y la radiacion, y el procedimiento esta contraindicado en enfermedades de la piel o quemaduras graves. Recientemente, se ha informado de que tres grupos de investigacion lograron la reprogramacion de celulas de sangre periferica sin necesidad de movilizacion de celulas CD34+ (Loh et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 15-19; Seki et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 11-14; Staerk et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 20-24). Brown et al., 2010, PLoS ONE, 2010, 5, 6, 1-9, describen la generacion de CMPi derivadas de linfocitos T de sangre periferica. Dado que estos procedimientos son mnnimamente invasivos, requieren una cantidad pequena de sangre y no es necesario un cultivo celular prolongado, representan un avance significativo a pesar del hecho de que su eficacia es muy baja. Sin embargo, las principales celulas de donante utilizadas de acuerdo con estos informes son celulas T maduras que llevan reordenamientos de receptores de celulas T espedficas, lo cual no es deseable para ciertas aplicaciones clmicas potenciales. Asimismo, las celulas T no llevan la informacion genetica completa que se requiere para la diferenciacion ilimitada en cualquier tipo de celula.

Ademas, en casos raros, la recepcion/donacion de sangre no esta exenta de problemas eticos, por ejemplo debido a las creencias religiosas, y puede no ser factible en pacientes con enfermedades infecciosas, enfermedades de la

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sangre, o inmunodepresion. En este ultimo contexto, se deben considerar las condiciones que afectan a la coagulacion (p. ej., hemofilia), la leucemia y la inmunodepresion genetica o adquirida (p. ej., cancer y SIDA).

En la busqueda de una reprogramacion de nuevos tejidos, tambien se han producido celulas CMPi a partir de la membrana menmgea de raton (Qin et al., 2008; J Biol Chem, 283, 33730-33735 ) y de celulas epiteliales mamarias (Li et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 51-63 ), y en los seres humanos a partir de celulas madre del periostio y adiposas (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79), matriz de cordon umbilical y placenta (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234).

Compendio de la invencion

Para acelerar el progreso hacia las futuras aplicaciones de la tecnologfa de CMPi, es deseable proporcionar CMPi, asf como celulas diferenciadas de cualquier tipo celular, tejidos u organoides derivados de los mismos, a partir de celulas del donante que representan una fuente universal, asf como celulas diferenciadas directamente derivadas de tales celulas del donante. Ademas, puesto que el aislamiento de las celulas del donante para generar CMPi de acuerdo con metodos de la tecnica anterior por lo general requiere una etapa invasiva para obtener el tejido de donante de interes, los autores de la presente invencion buscaron proporcionar CMPi derivadas de una fuente de celulas no invasiva y los metodos para producir estas celulas CMPi.

El documento WO2008/153685 describe un metodo para producir un cultivo de celulas progenitoras de la orina (CMO), proporcionando una muestra de orina y despues aislando celulas progenitoras de la orina de la muestra. Las celulas progenitoras tienen el potencial de diferenciarse aun mas a otros tipos de celulas.

Para obtener un cultivo de celulas diferenciadas, el documento WO2010/065239 sugiere aislar celulas madre a partir de la orina y luego diferenciarlas a ciertos tipos de celulas.

Es comun a estos metodos que la diferenciacion de las celulas de orina obtenidas solo permita un numero limitado de tipos de celulas.

Un objeto de la invencion es proporcionar un metodo para obtener, a partir de una fuente de celulas obtenidas de forma no invasiva, celulas pluripotenciales con una capacidad de diferenciacion que es ilimitada con respecto al tipo de celula generada en ultima instancia.

Para resolver el problema subyacente de la invencion, los autores de la presente invencion consideran los criterios que deben ser cumplidos por una fuente de celulas ideal para ser aislada a partir de individuos y luego reprogramadas a CMPi (que se pueden diferenciar en cualquier tipo espedfico de celula) o diferenciadas directamente ( "transdiferenciadas", es decir, diferenciadas directamente, sin la etapa intermedia de la generacion de CMPi) a tipos espedficos de celulas, tejidos u organoides: las celulas deben ser facilmente accesibles con un riesgo asociado nulo o mmimo, deben estar disponibles en cantidades suficientes, presentes universalmente tanto en machos como en hembras (sin restriccion alguna en cuanto a la preocupacion etica, la raza, la edad o el estado de salud o enfermedad), y deben ser susceptibles de reprogramacion con una buena eficiencia. Los autores de la presente invencion encontraron sorprendentemente que las celulas somaticas, es decir, las celulas diferenciadas terminalmente, a partir de una fuente no invasiva como la orina, pueden reprogramarse de manera eficaz a CMPi o celulas espedficas o linajes de celulas de interes.

La descripcion se refiere a un metodo para generar celulas diferenciadas de interes a partir de celulas de donantes de otro tipo de celulas, que comprende

i) la expansion de las celulas a partir de una fuente de celulas obtenidas de un donante de una manera no invasiva, en donde dicha fuente de celulas se selecciona entre orina, heces, saliva, pelo, secrecion nasal, cerumen, fluido lacrimal o del tracto vaginal, y

ii) la generacion de celulas diferenciadas a partir de dichas celulas expandidas por medio de

a) reprogramacion de dichas celulas para que se conviertan en CMPi y a continuacion diferenciacion de las CMPi a celulas de interes, o por medio de

b) reprogramacion directa de dichas celulas para que se conviertan en una celula diferenciada de interes.

De acuerdo con una realizacion preferida, dichas celulas de donantes obtenidas en la etapa i) son celulas exfoliadas del tracto urinario que estan presentes en la orina (en lo sucesivo, estas celulas se denominan "celulas de orina").

En lo sucesivo, las CMPi derivadas de celulas de orina se denominan "CMPOi" (si no se indica de otro modo, por ejemplo, con respecto a la utilizacion de CMPOi, este termino tambien abarca las CMPi obtenidas de otras celulas de donante obtenidas de forma no invasiva).

En la realizacion de acuerdo con la cual la fuente de celulas es la orina, la etapa i) se puede realizar de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, esta por lo general comprende las subetapas

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a) recogida de la orina de un donante,

b) aislamiento de celulas exfoliadas de la orina, y

c) expansion de dichas celulas exfoliadas.

Las celulas exfoliadas ii) pueden ser cualquier tipo de celula que se encuentre en la orina que sea susceptible de reprogramacion.

De acuerdo con ciertas realizaciones, las celulas exfoliadas son celulas epiteliales, por ejemplo, celulas tubulares renales como celulas epiteliales tubulares proximales humanas exfoliadas (HEPTEC).

De acuerdo con otras realizaciones, las celulas exfoliadas son celulas fibroblastoides. De acuerdo con otras realizaciones mas, las celulas exfoliadas son celulas de tipo progenitor, celulas de tipo endotelial, celulas de tipo musculatura lisa o celulas de tipo intersticial como describen Zhang et al., 2008; J Urol 180, 2226-2233).

Las celulas ii) tambien pueden ser celulas cancerosas exfoliadas, p. ej. celulas de cancer renal o de cancer de vejiga.

Despues de la recogida de orina, las celulas de orina se centrifugan y el tipo de celula de interes, p. ej., celulas orfiborblastoides HEPTEC, se enriquecen haciendo crecer las celulas en un medio que favorezca su crecimiento, evitando de ese modo el crecimiento de las celulas de un tipo celular no deseado.

Tales medios se conocen de la bibliograffa y/o se encuentran disponibles en el mercado. A modo de ejemplo, los medios que satisfacen espedficamente los requisitos de las celulas epiteliales incluyen, pero no se limitan a Medio Basal Epitelial Renal (REBM) y SingleQuot Kit CC-4127 REGM, ambos disponibles de Lonza, medio EpiGRO de Millipore, Medio Basal de Celulas Epiteliales Renales (ATCC), otros medios para las celulas epiteliales de las vfas respiratorias incluyendo medios para celulas epiteliales de las vfas respiratorias o mamarias, p. ej., como los disponibles de Lonza, ATCC, o Cellapplications, o una combinacion de los mismos. Del mismo modo, el medio o los medios basados en el descrito por Wieser et al., 2008 (Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

Un ejemplo de un medio adecuado para el enriquecimiento de las celulas fibroblastoides de la orina es FGM®-2 Fibroblast Growth Medium, tambien disponible de Lonza.

Ademas de celulas de orina, que son las celulas de donante preferidas para ser utilizadas en el metodo de la invencion, otras celulas que se han obtenido de un individuo donante en una forma no invasiva se pueden expandir y reprogramar para que se conviertan en CMPi, o directamente se diferencien a un tipo de celula de interes, p. ej. celulas obtenidas de heces, saliva, cabello, secrecion nasal, cerumen, fluido lacrimal o del tracto vaginal. Los metodos para aislar y expandir tales celulas son conocidos en la tecnica, p. ej. para las celulas exfoliadas de colon en las heces (Bandaletova et al., 2002. Apmis 110, 239-246), o a partir de celulas de la papila dermica del cabello (Warren et al., 1992; J Invest Dermatol 98, 693-699).

Otra fuente de celulas util es el lfquido que, durante la hemodialisis, se inserta en la cavidad peritoneal para el intercambio de sustancias con la sangre a traves de los vasos sangumeos en el peritoneo, lo que permite que la sangre sea filtrada de una manera "similar" a la del rinon. Este lfquido se puede recoger y se sabe que contiene muchas celulas.

"Reprogramacion" [(etapa ii), realizacion a)] es un termino reconocido en el campo para la transformacion de celulas somaticas en celulas CMPi por medio de factores exogenos.

En los experimentos de la presente invencion, la reprogramacion de celulas de orina a CMPOi se realizo utilizando vectores retrovirales que liberan los cuatro factores de reprogramacion Sox2, Oct4, Klf4 y c-Myc ("factores de Yamanaka" o "coctel de Yamanaka"), como han descrito originalmente Takahashi y Yamanaka, 2006; Cell 126: 66376).

En principio, se puede utilizar cualquier metodo de reprogramacion que sea capaz de transformar las celulas del donante, celulas de orina en particular, en CMPi, en particular CMPOi.

La reprogramacion se puede conseguir mediante uno o mas factores seleccionados entre un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf y un gen de la familia Sox. Ademas, la combinacion de factores puede comprender uno o mas productos genicos de un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf, junto con una citoquina. La citoquina puede ser al menos una de factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y factor de celulas madre (SCF).

Preferiblemente, estos factores se insertan en vectores de expresion no virales que se introducen en una celula somatica.

Si las CMPOi, o las celulas diferenciadas de las mismas, estan destinadas a la aplicacion terapeutica, se utilizan metodos que no emplean oncogenes y/o no implican la integracion del ADN que codifica el factor de reprogramacion en el ADN genomico del individuo.

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Por lo tanto, los metodos preferidos de la invencion para la generacion de CMPOi o celulas diferenciadas de las mismas, con fines terapeuticos no emplean lentivirus o retrovirus o utilizan virus modificados de tal manera que el riesgo de integracion genomica de los transgenes y los efectos secundarios no deseables asociados con dicha integracion se reducen al mmimo o se anulan completamente. Ademas, tambien se debe considerar que la integracion del transgen asume el riesgo de mutagenesis de insercion, que puede estar asociada con la tumorigenicidad en el paciente tratado.

Los metodos preferidos para la generacion de CMPOi para aplicacion terapeutica son aquellos que evitan la integracion genomica de los genes de reprogramacion (revisado por Sun et al., 2010; Cell Cycle 9: 5, 880-885) y/o que evitan oncogenes como Klf4 o c-Myc, p. ej.,

o utilizando lentivirus escindibles por recombinasa Cre (Soldner et al., 2009; Cell 136: 964-77);

o utilizando Oct4, SOX2, y NANOG solos, omitiendo c-Myc y Klf4 (Li y et al., 2010; Cell Reprogram. Jun 12(3): 237-47);

o logrando la derivacion de celulas CMPi humanas libres de transgen y libres de virus mediante el uso de vectores episomales basados en oriP/EBNA1 (antfgeno nuclear 1 de Epstein-Barr) que codifican los factores de reprogramacion Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28 y SV40LT (Yu et al., 2009; Science 324: 797-801);

o utilizando una tecnica de reprogramacion libre de virus empleando vectores de expresion de transposon piggyBac que llevan un transgen policistronico de los factores de Yamanaka (Woltjen et al., 2009, Nature 458: 766-70); ADN minicircular no viral (Jia et al., 2010; Nat Methods Mar 7(3): 197-9);

o metodos basados en protemas recombinantes, p. ej. tratamiento de las celulas con los cuatro factores de Yamanaka en forma de protemas recombinantes conjugadas con un peptido de penetracion celular (cpp) (Kim et al., 2009; Cell Stem Cell 4: 472-6); exponiendo las celulas a un coctel de factores exogenos que se proporcionan a la celula en forma de protemas purificadas, extractos de protemas con o sin tratamiento qmmico previo (Cho et al., 2010; Blood 116, 386-395; Han et al., 2010; PLoS One. 19 Ago; 5(8): e12297; Solanki y Lee, 2010; Chembiochem 11, 755-757).

o anadiendo moleculas pequenas, p. ej. acido valproico, un inhibidor de la histona desacetilasa (Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol. 26: 795-7; Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol 26:1269-1275 ); u otras numerosas moleculas pequenas, p. ej., inhibidores de la glucogeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), de la ruta MEK-ERK e inhibidores de la ruta TGFp para aumentar la eficacia o reemplazar algunos de los factores de reprogramacion (Lin et al., 2009; Nat Methods 6: 805-8; Li et al., 2009; Cell Stem Cell. 4: 16-9; Shi et al., 2008; Cell Stem Cell. 2: 525-8; Ichida et al., 2009; Cell Stem Cell. 5: 491-503 ); o anadir vitamina C (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79);

o anadiendo ARN de interferencia pequenos (ARNip), p. ej. ARNip de p53, para mejorar la eficacia de la reprogramacion de los factores de Yamanaka (Zhao et al., 2008; 3: Cell Stem Cell 475-9);

o anadiendo micro ARN (miARN) a los cocteles de reprogramacion (p. ej. Wilson et al., 2009; Stem Cells Dev. 18: 749-58; Judson et al., 2009; Nat Biotechnol Mayo; 27(5): 459-461).

o suministrando ARNm o ARNm modificado, que codifica factores de reprogramacion (Yakubov et al., 2010; Biochem. Biophys Res Commun 394, 189-193), por medio de lo cual, en el caso de la modificacion, esta es tal que aumenta la traduccion y/o la estabilidad, p. ej. como describen Kowalska et al., 2008, RNA. Jun 2008; 14(6): 1119-1131.

La seguridad y/o eficacia de la reprogramacion se pueden optimizar aun mas cambiando el medio de cultivo de tejidos o el entorno, p. ej. sustitucion de un medio que contiene suero por Knock Out Serum Replacement (KSR, Invitrogen), o cambiando el entorno (p. ej. baja oxigenacion utilizando incubadoras espedficas en las que se puede controlar la concentracion de oxfgeno).

La optimizacion se puede lograr p. ej. mediante la realizacion de experimentos en serie de una poblacion de celulas de orina expandidas dada. A modo de ejemplo, se pueden hacer crecer celulas de orina de numerosos individuos en diferentes medios (p. ej. medio para celulas epiteliales o fibroblastos) antes de la infeccion con los retrovirus que produce los factores exogenos, con el fin de seleccionar poblaciones de celulas que sean reprogramadas mas facilmente. Despues de la infeccion, se emplean diferentes cocteles de medios (con los cambios en diferentes momentos espedficos), que contienen suero o libres de suero, y con o sin la adicion de productos qmmicos (vease mas arriba) para ver en que condiciones se puede lograr una eficacia optima. Asimismo, las celulas se pueden infectar con diferentes combinaciones de factores, por ejemplo los 4 factores de Yamanaka con o sin Nanog (u otros factores p. ej. microARN). Tambien se puede analizar con cuantas rondas de infeccion (1, 2 o 3 rondas) se pueden obtener los mejores resultados. Cuando las celulas se dividen en celulas de alimentacion, se pueden utilizar diferentes tipos de capas de alimentacion, p. ej., fibroblastos de raton, fibroblastos humanos, amniocitos, membrana amniotica, etc.

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La reprogramacion directa de la celula de donante, sin generar primero una CMPi, para que se convierta en una celula diferenciada de interes [etapa ii), realizacion b)] tambien se conoce como "transdiferenciacion", que representa el cambio de una celula o tejido de un estado diferenciado a otro (Vierbuchen y Wernig, 2011, Nat Biotechnol 2011; 29(10): 892-907.

En esta realizacion, los factores de transcripcion espedficos del tipo de celulas se expresan en exceso utilizando vectores virales, vectores basados en plasmidos etc. como factores para la reprogramacion de CMPi.

Para la transdiferenciacion directa de las celulas de orina (u otras celulas obtenidas de manera no invasiva) a neuronas, se pueden utilizar los 3 factores AscI1, Brn2, y Myt1I como se describe para la conversion de fibroblastos humanos en neuronas (Vierbuchen et al., 2010; Nature 463, 1035-1041), o de hepatocitos en neuronas, segun lo descrito por Marro et al., 2011, Stem Cell. 4 Oct; 9(4): 374-82.

Efe et al., 2011, Nat Cell Biol. Mar 2011; 13(3): 215-22, describen un metodo por el que los fibroblastos embrionarios de raton (MEF) pueden ser reprogramados directamente para contraer de manera espontanea parches de cardiomiocitos diferenciados.

Para la conversion de las celulas de donante de orina en cardiomiocitos, se puede utilizar un metodo que se ha llevado a cabo con exito para obtener cardiomiocitos de mesodermo, utilizando Gata4, Tbx5, y Baf60c (Takeuchi et al., 2009; Nature 459, 708-711).

La transdiferenciacion a celulas hematopoyeticas se puede realizar mediante el uso de la expresion en exceso de Oct4 solo (Szabo et al., 2010; Nature 468, 521-526).

El escrutinio de factores que transdiferencian celulas de orina a neuronas, queratinocitos, fribroblastos, cardiomiocitos, celulas de hugado, rinon, sangre, etc. se puede llevar a cabo de una manera similar a los protocolos de transdiferenciacion descritos anteriormente y al protocolo inicial de Yamanaka (Takahashi y Yamanaka, 2006). Basandose en el abundante conocimiento acerca de los factores de transcripcion espedficos de los linajes, tales factores se pueden someter a ensayo combinados (como en los artfculos descritos anteriormente) por su potencial para transdiferenciar directamente celulas derivadas de orina combinadas con las condiciones de cultivo que se utilizan comunmente para mantener y cultivar el tipo de celula espedfica de interes. Tambien se pueden llevar a cabo experimentos en serie de acuerdo con los principios descritos anteriormente para la optimizacion de la eficacia de reprogramacion para optimizar la eficacia transdiferenciacion.

Aunque el metodo de la invencion se utiliza preferiblemente para la produccion de CMPOi o celulas diferenciadas a partir de celulas de donante humano, tambien se puede aplicar a las celulas de otros marnfferos (p. ej. mono, caballo, perro, gato, cerdo, rata y raton).

La produccion de celulas diferenciadas de interes, ya sea directamente ya sea a traves de CMPOi intermedias, a partir de celulas exfoliadas de orina, proporciona un metodo facil de reproducir, universal para la generacion de celulas de tipo CME de alta calidad. Esto tiene la ventaja de que la recoleccion de las celulas del donante se puede realizar en cualquier lugar y por cualquier persona, siempre que se tomen las medidas mmimas de higiene, asf como a partir de cualquier ser humano, independientemente de su edad, sexo o afeccion. Ademas, el lfquido perfundido al peritoneo para la sustitucion de la falta de la funcion renal en pacientes con insuficiencia renal que requieren dialisis o pacientes despues de operaciones de la vejiga que no producen orina, puede ser utilizado como una fuente de celulas para la reprogramacion o transdiferenciacion.

El metodo de la invencion proporciona una oportunidad unica para comparar los metodos de reprogramacion en todo el mundo y avanzar en el campo hacia la aplicacion clmica de celulas CMPi seguras.

En principio, las CMPOi, o las CMPi obtenidas por el metodo de la invencion a partir de otras celulas de donante obtenidas de forma no invasiva, se pueden utilizar para los mismos fines que las CMPi conocidas en la tecnica generadas a partir de otros tipos de celulas.

Las caractensticas ventajosas de las CMPOi las hacen utiles tanto desde el punto de vista de la investigacion como comercial, este ultimo, p. ej. proporcionando CMPOi, o celulas, linajes de celulas, organoides o tejidos, derivados de las mismas, de un individuo sano o de un paciente con una enfermedad), p. ej. a efectos de escrutinio.

Las CMPOi se pueden utilizar para generar celulas para la reparacion o sustitucion de tejidos a la vez que evitan los problemas eticos e inmunologicos que son inherentes al uso de celulas CM.

Las CMPOi de la invencion, los tejidos u organoides derivados de los mismos, respectivamente, son particularmente utiles para el tratamiento de pacientes con quemaduras graves, a los que se proporcionara piel artificial, obtenida a partir de celulas diferenciadas, derivadas de celulas de orina, ya sea directamente o a traves de CMPOi.

Para el tratamiento de enfermedades de la sangre, las CMPOi o las celulas diferenciadas obtenidas a partir de ellas, o las celulas obtenidas por transdiferenciacion directa de las celulas de orina, pueden ser infundidas a pacientes que padecen leucemia p. ej. leucemia inducida por mutacion somatica.

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En el tratamiento de la hemofilia, las CMPOi corregidas geneticamente se pueden utilizar para el trasplante autologo, y en el caso de las enfermedades que disminuyen la cantidad de celulas inmunitarias como por ejemplo, el VIH, se pueden utilizar CMPOi convertidas en celulas hematopoyeticas para reponer la poblacion de celulas inmunitarias por medio de infusion. En la anemia de celulas falciformes, tambien se pueden utilizar CMPi con genes corregidos (Hanna et al., 2007; Science 318, 1920-1923).

Las CMPOi (o CMPi obtenidas a partir de otras celulas de donante obtenidas de manera no invasiva) se pueden utilizar, como las CMPi conocidas en la tecnica, en la terapia de enfermedades degenerativas, en las que un tipo espedfico de celula o tejido es destruido o tiene un mal funcionamiento y el cuerpo es incapaz de reponerlo. En las afecciones degenerativas, p. ej. la enfermedad de Parkinson, el tratamiento con CMPOi proporciona al sitio afectado celulas indiferenciadas que luego se pueden utilizar para la reparacion del dano en los tejidos. De ese modo, la terapia con CMPOi volvera a introducir nuevas celulas o tejidos sanos para satisfacer la misma funcion. Las CMPOi tambien tienen el potencial de ser utilizadas para desarrollar organos enteros nuevos que sean compatibles con el paciente y reduzcan las posibilidades de rechazo de trasplantes, ya que son celulas autologas, es decir, celulas derivadas de celulas de donante del paciente a tratar, p. ej. en el caso de la diabetes, se pueden generar agrupaciones de tipo islote que segregan insulina a partir de celulas de tipo CMPi (Tateishi et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

Las CMPOi tambien se pueden utilizar (como fue revisado para las CMPi por Lau et al., 2009; F1000 Biol Rep 1: 84) para la generacion de lmeas celulares espedficas de enfermedades que son utiles como modelos de enfermedad y/o para el escrutinio de candidatos a farmacos in vitro y/o para corregir defectos geneticos por medio de terapia genica. La generacion de celulas diferenciadas terminalmente (p. ej. hepatocitos o cardiomiocitos) a partir de CMPOi (u obtenidas por medio de transdiferenciacion directamente a partir de las celulas de la orina), por ejemplo, permitira la deteccion y el perfilado adicional de los compuestos sobre el respectivo linaje celular, con el objetivo de definir la especificidad del paciente (para la medicacion personalizada) o la aplicabilidad general de un compuesto. A modo de ejemplo, como describen Dimos et al. 2008 (Science 29 Ago; 321 (5893): 1218-2). Las CMPOi se pueden utilizar como un modelo para la forma familiar de la esclerosis lateral amiotrofica; o como un modelo, o para el tratamiento, respectivamente, de otras enfermedades geneticas, segun lo descrito por Park et al., 2008 (Cell 5 Sep; 134 (5): 8778), que produjeron celulas CMPi a partir de pacientes con 10 enfermedades geneticas diferentes, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la diabetes de tipo 1, la distrofia muscular de Duchenne y Becker, la inmunodeficiencia combinada grave relacionada con el deficit de adenosina desaminasa, el smdrome de Shwachman-Bodian-Diamond, la enfermedad de Gaucher tipo III, la enfermedad de Huntington, el smdrome de Down, y el estado de portador del smdrome de Lesch-Nyhan. Asimismo, se pueden generar modelos basados en celulas humanas de atrofia muscular espinal y enfermedad de Parkinson de manera similar a la descrita por Ebert et al.; 2009 (Nature 15 Enero; 457 (7227): 277-8 y Soldner et al., 2009 (Cell 6 Marzo; 136 (5): 964-77), o se pueden utilizar CMPOi derivadas de celulas de un paciente con beta-talasemia homocigota de una manera similar a la descrita por Ye et al., 2009 (Proc Natl Acad Sci USA 16 Junio; 106 (24): 9826-3) para CMPi derivadas de fibroblastos de la piel, que se diferenciaron a continuacion a celulas hematopoyeticas productoras de hemoglobina. Tales CMPOi, tras una modificacion genetica, podnan producir celulas hematopoyeticas autologas que funcionanan normalmente. Las CMPOi tambien se pueden utilizar para corregir los defectos geneticos en pacientes con anemia de Fanconi, segun lo descrito por Raya et al., 2009 (Nature 2 Jul; 460 (7251):53), que obtuvieron celulas CMPi a partir de fibroblastos dermicos recolectados de pacientes con anemia de Fanconi, corregidos utilizando vectores lentivirales que codificaban FANCA y FANCD2, y, posteriormente, obtuvieron celulas somaticas que estaban fenotfpicamente libres de la enfermedad.

Las CMPOi tambien se pueden utilizar como las CMPi generadas por Lee et al., 2009 (Nature 17 Sep; 461 (7262): 402), que generaron celulas CMPi a partir de pacientes con disautonomfa familiar (FD), re-diferenciaron las celulas CMPi y utilizaron el modelo in vitro para escrutar los farmacos candidatos.

Otro ejemplo de una enfermedad para la que las CMPOi tienen un gran valor potencial como modelo de enfermedad, es el smdrome de Prader Willi (Yang et al., 2010; J Biol Chem 285, 40303-40311). Otros ejemplos de enfermedades geneticas para las cuales la terapia genica que utiliza CMPOi tiene un gran potencial son la Epidermolisis bullosa (p. ej. mediante la reprogramacion del ARNm de K14, tal como describen Wally et al., 2010. Hum Mol Genet 19, 47154725; Wally et al., 2008; J Invest Dermatol 128, 568-574). En general, la terapia genica basada en la modificacion genetica de CMPOi tiene el mayor potencial para el tratamiento de enfermedades causadas por trastornos de genes individuales; hasta la fecha, se han descrito aprox. 4000 de tales enfermedades geneticas.

En los modelos de enfermedad anteriores que utilizan celulas diferenciadas terminalmente, tales celulas pueden, de forma alternativa, ser obtenidas a partir de CMPOi, ser obtenidas por medio de reprogramacion directa de las celulas del donante. Para el proposito de la presente invencion "reprogramacion directa" se utiliza como sinonimo de "transdiferenciacion", segun se define en la presente memoria.

Si las celulas del donante son celulas de cancer, p. ej. celulas de cancer renal o de vejiga, que representan presumiblemente las primeras etapas de cancer, las CMPOi o celulas diferenciadas de las mismas son utiles como modelos para el respectivo cancer.

La terapia genica comprende la insercion, alteracion, o anulacion de uno o mas genes dentro de las celulas de un individuo, para corregir un efecto genetico que causa una enfermedad. Hasta el momento, principalmente se han

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considerado para el tratamiento las enfermedades monogenicas, que son causadas por mutaciones en genes individuals. La forma mas comun de terapia genica implica la insercion de genes funcionales en una localizacion genomica no especificada con el fin de reemplazar un gen mutado. Una mutacion tambien se puede corregir directamente.

Para las aplicaciones de la terapia genica, las celulas modificadas geneticamente son CMPOi o celulas diferenciadas derivadas de las mismas (u obtenidas por reprogramacion directa de las celulas del donante); alternativamente, aunque menos preferidas, las celulas del donante expandidas pueden ser modificadas geneticamente antes de la reprogramacion. En el alcance de la invencion, las celulas modificadas geneticamente se van a utilizar predominantemente en la terapia genica somatica. Dado que la correccion de los defectos geneticos se realiza in vitro antes de la re-infusion o el trasplante de las CMPOi o celulas diferenciadas derivadas de las mismas (u obtenidas por reprogramacion directa de las celulas del donante), el riesgo de transferencia de genes a la lmea germinal se minimiza. Las celulas corregidas se infundiran o trasplantaran como celulas diferenciadas derivadas de CMPOi (o directamente se transdiferenciaran sin reprogramacion previa de CMPi) con el fin de complementar o reemplazar tejidos y organos no funcionales. El gen de correccion se puede introducir en las celulas de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, p. ej. por medio de vectores virales (modificados para reducir al mmimo el riesgo de reactivacion), incluyendo retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, lentivirus, virus Herpes simplex, mediante el uso de vectores basados en plasmidos, o incluso ADN desnudo.

La correccion de los defectos de los genes se puede llevar a cabo de muchas maneras, p. ej., mediante el suministro de ADN que codifica el gen que funciona correctamente, la modificacion para disminuir la expresion del gen mutado mediante la liberacion de ARNhc o miARN, mediante el uso de protemas en dedos de zinc para llevar a cabo una modificacion para inactivar un gen o recombinaciones, o mediante el uso de vectores que permiten eventos trans- empalme.

Se puede prever que, debido a la forma no invasiva de obtencion de las celulas del donante, puede haber una alta aceptacion por parte de los individuos sanos para tener, de antemano y de forma profilactica, CMPOi preparadas y almacenadas derivadas de su propia orina, asf como linajes celulares derivados, organoides o tejidos como piel artificial, lo que permitira una utilizacion mas rapida en el caso de la aparicion de una enfermedad grave o una lesion, como una quemadura.

Los fibroblastos, queratinocitos o piel artificial generados a partir de CMPOi (Bilousova et al., 2010; J Invest Dermatol 9 Dic), p. ej. derivados de las celulas de los donantes de los individuos con diferentes tipos de piel, tambien pueden ser utiles para los ensayos en la industria cosmetica.

Las CMPOi pueden ser tambien utiles para la clonacion de animales, especialmente mairnferos, p. ej. caballos de carreras o animales domesticos).

Breve descripcion de las figuras

Figura 1

Diapositivas tenidas con hematoxilina/eosina de teratomas que comprenden derivados complejos de las 3 capas germinales producidas con 2 clones de CMPOi representativos

Figura 2

A: Contraste de fases y fotograffas de inmunofluorescencia de celulas de tipo neuronal producidas siguiendo un protocolo referido a partir de un clon de CMPOi representativo.

B: Se diferencio un clon de CMPOi representativo a celulas de tipo cardiomiocito utilizando un protocolo referido. Contraste de fase, tincion de PAS y fotograffas de inmunofluorescencia.

C: Se diferencio un clon de CMPOi representativo a celulas de tipo hepatocito utilizando un protocolo referido. Contraste de fase, tincion de PAS y fotograffas de inmunofluorescencia.

D: Potenciales de accion medidos en cardiomiocitos derivados de un clon de CMPOi representativo.

EJEMPLO Materiales y metodos Microscop^a de inmunofluorescencia

Las celulas se fijaron en paraformaldetudo al 4% durante la noche, se lavaron, se bloquearon y se permeabilizaron en solucion de bloqueo (PBS que contema suero normal de cabra al 3% y Triton X-100 al 0,2%) durante 30 minutos. A continuacion, se incubaron con anticuerpos primarios en solucion de bloqueo a 4°C durante la noche, se lavaron dos veces y se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes durante 1 hora a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron dos veces y se tineron con DAPI (Sigma) durante 5 minutos, y a continuacion para la observacion y la fotograffa utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP2 Spectral (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). Antes de la inmunofluorescencia, las zonas de latido se cortaron con tijeras, se recogieron en un tubo de 1,5 ml con PBS con bajos niveles de calcio, y se dejaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Estos grupos de celulas se transfirieron a tampon de enzima que contema de 0,5 a 1 mg/mL de colagenasa 2 y se incubaron a 37° durante 30-40 minutos. La digestion se termino con DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). Las muestras se

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centrifugaron a continuacion y el sedimento se resuspendio en DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). Las suspensiones celulares se cultivaron sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina y se cultivaron a 37° durante al menos 2 dfas antes de la fijacion y la inmunofluorescencia.

Diferenciacion espedfica de tejido y mediciones electrofisiologicas

La diferenciacion neuronal, de hepatocitos y cardiomiocitos se realizo como se ha descrito (Pankratz et al., 2007, Stem Cells 25, 1511-1520; Song et al., 2009, Cell Res 19, 1233-1242; Zwi et al., 2009, Circulation 120, 15131523). N2 y B27 se adquirieron de Invitrogen, la heparina se adquirio de Sigma, el EGF se adquirio de R & D Systems. La activina A y la oncostatina M se adquirieron de R & D Sistems (Minneapolis, MN, USA), BMP2, FGF4, HGF y KGF de PeproTech (Rocky Hill, USA), y la dexametasona de Enzo Life Sciences (Farmingdale, USA). La tincion con acido peryodico Schiff (PAS), hepatoZYME-SPF, en RPMI 1640 se realizo utilizando un kit adquirido de Polysciences (Warrington, USA). La caracterizacion electrofisiologica de los cardiomiocitos derivados de CMPi (dfa 23) se realizo utilizando el metodo de fijacion de membrana ("patch clamp") de celulas enteras convencional para registrar los fenotipos potenciales de accion (HEKA Instruments Inc., Southboro, MA) (Chan et al., 2009 J Cardiovasc Electrophysiology 20, 1048-1054). Se prepararon las pipetas del parche a partir de tubos de vidrio de borosilicato de 1,5 mm de pared fina utilizando un extractor de micropipeta Sutter P-97 y tuvieron resistencias tfpicas de 3-5 MQ cuando se cargaron con una solucion interna que contema (mM): aspartato K+110, KCl 20, MgCh 1, Na- GTP 0,1, Mg-ATP 5, Na2-fosfogreatina 5, EGTA5, HEPES 10, y se ajusto el pH a 7,3 con KOH. La solucion de bano de Tyrode externa consistio en (mM): NaCl 140, KCl 5, MgCh 1, KH2PO4 0,4, CaCl21,8, glucosa 10, HEPES 5, y se ajusto el pH a 7,4 con NaOH. La actividad electrica espontanea se midio mientras los cardiomiocitos derivados de CMPi se quedaron pasivos sin entrada de corriente. Se registraron veinte potenciales de accion consecutivos a partir de los cardiomiocitos derivados de CMPi con descargas espontaneas para asegurar formas de onda estables para el analisis. Los datos fueron corregidos para los potenciales de union lfquida de +15,9 mV. Se detectaron elevaciones transitorias de calcio con formacion de imagenes de calcio confocales utilizando un protocolo descrito previamente (Ng et al., 2010; J Mol Cell Cardiol 48, 1129-1137). Brevemente, se cargaron cardiomiocitos aislados derivados de CMPi con Fluo-3 AM 5 |jM (Invitrogen) durante 25 minutos a 37°C en solucion de Tyrode que contema (mM): NaCl 140, KCl 5, MgCl21, KH2PO4 0,4, CaCl21,8, glucosa 10, HEPES 5 a pH 7,4. Las elevaciones transitorias de calcio se registraron con un sistema de formacion de imagenes confocal (Olympus Fluoview System version 4,2 FV300 TIEMPO) montado sobre un microscopio Olympus vertical (IX71) y a continuacion se cuantificaron como cambios de intensidad de fluorescencia restada del fondo normalizados a la fluorescencia en el momento inicial restada del fondo. Los datos se introdujeron en el soporte logico Felix 32 (Photon Technology International) para el analisis.

i) Recogida de orina y expansion de las celulas

Se esterilizaron los recipientes apropiados (hasta 500 ml) antes de la recoleccion de orina. Solamente se recogio la porcion central del flujo de orina en los recipientes esteriles. El volumen normal de las muestras fue de 150 a 200 ml. Las muestras de orina se transfirieron a continuacion a una campana de cultivo de tejido en tubos de 50 mL y estos tubos se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue descartado cuidadosamente dentro de una campana de cultivo de tejido, dejando aproximadamente 1 mL o menos de la orina en el tubo. Los sedimentos se resuspendieron individualmente y todos los tubos de 50 mL derivados de una recogida de muestras se agruparon en un unico tubo de 50 mL. Se anadieron alrededor de 10 mL de PBS que contema amfotericina B y penicilina/estreptomicina. Las muestras se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos. Se desecho el sobrenadante, dejando solo alrededor de 0,2 mL de muestra. Se anadio alrededor de 1 mL de medio principal para volver a suspender el sedimento celular. La receta de medio primario contema DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza), amfotericina B, y penicilina/estreptomicina. Las celulas se transfirieron a placas de 12 pocillos recubiertas con L-gelatina en 1 mL de medio principal. Los 2 primeros dfas se anadieron unos pocos cientos de mL de medio principal para retener la concentracion de los antibioticos y mantener alto el nivel de nutricion. Los siguientes dfas se cambio el medio con cuidado por medio REBM (Medio Basal Renal Epitelial, Lonza) que contema SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza) (la combinacion de los dos se refiere como medio de celulas de orina), el procedimiento no se llevo a cabo completamente para permitir la presencia de factores secretados por las celulas de orina y evitar un estres innecesario. Las celulas/colonias visibles aparecieron de manera rutinaria despues de 3-6 dfas. El primer cambio de medio completo se hizo despues de que se observaran las primeras celulas/colonias. Las celulas se dividieron sobre una superficie mas grande con la ayuda de tripsina al 0,25% que contema EDTA 1 mM cuando el cultivo crecio hasta la confluencia. Este y otros procedimientos fueron aprobados por el comite de etica de Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health. Se generaron RPTEC como describen Wieser et al., 2008, Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375, y se mantuvieron en medio de celulas de orina. Los fibroblastos se obtuvieron a partir de fibroblastos de la piel adquiridos de Coriell Cell Repository y se mantuvieron en DMEM (Invitrogen) + 10% (vol/vol) de suero bovino fetal (FBS; Hyclone).

A primera vista, los cultivos de celulas de orina consistfan principalmente en las celulas escamosas (probablemente provenientes de la uretra) y algunas celulas sangumeas (eritrocitos en su mayona), pero despues de 2-3 dfas estas celulas desaparecieron y fueron sustituidas por colonias pequenas (3 por muestra de promedio) que crecieron rapidamente. Estas colonias se correspondfan con 2 morfologfas principales: tipo 1 o tipo 2, de acuerdo con los informes anteriores sobre el aislamiento de celulas de la orina (Dorrenhaus et al., Arch Toxicol 2000; 74, 618-

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626.). Las celulas de tipo 1 tend^an a ser mas redondeadas y credan estrechamente unidas a las celulas vecinas, lo que sugiere un fenotipo epitelial. Las celulas de tipo 2 eran moderadamente mas alargadas y tendfan a crecer un poco mas dispersas. En algunas recolecciones de muestras todas las colonias correspondfan a 1 de los 2 tipos, pero en otros se mezclaban. Estos cultivos celulares se agruparon al alcanzar una alta densidad y se dividieron para su caracterizacion adicional o su reprogramacion paralela. Los enriquecidos en celulas de tipo 1 presentaban uniones celula a celula bien formadas positivas para E-cadherina y beta catenina (marcadores de union adherente), y ZO-1 (protema 1 Zonula Occluddens; un marcador de union estrecha), como se evaluo mediante microscopfa de inmunofluorescencia. Tambien eran positivos para el filamento intermedio queratina 7, un marcador epitelial, y el marcador de los tubulos proximales renales CD13. Ademas, la distribucion de la actina era cortical mas que en fibras de traccion. La PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) tambien apoyo un origen epitelial predominante, como lo demuestra el analisis de E-cadherina, ocludina y claudina 1 (protemas de union estrecha), y el transportador de la familia 2 de portadores de soluto de los tubulos proximales renales SLC2A1. Se utilizaron celulas epiteliales proximales renales (RPTEC; Wieser et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375) y fibroblastos de la piel como controles positivos y negativos, respectivamente, para la inmunofluorescencia y la qPCR. Los cultivos enriquecidos en celulas de tipo 2 mostraron un patron de inmunofluorescencia bastante similar, pero la intensidad fue mas leve y la distribucion mas desigual; los resultados de la qPCR fueron igualmente comparables. En ambos casos, se observo poca tincion para los marcadores de tipo fibroblastico fibronectina y vimentina.

ii) Generacion y expansion de CMPOi

Se reprogramaron muestras de 12 adultos jovenes de origen Chino o de raza Caucasica, 7 correspondiente a hombres y 5 a mujeres. Las celulas de orina en los pases 2-3 fueron transducidas con retrovirus que produdan Sox2, Klf4, Oct4 y c-Myc (Cai et al 2010; J Biol Chem 285, 11227 a 11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79): Los plasmidos retrovirales que produdan los factores de transcripcion Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc humanos se adquirieron de Addgene (Cambridge, Ma, USA). Los sobrenadantes virales se recogieron en 2 dfas consecutivos comenzando 48 horas despues de la transfeccion. Las celulas de orina en los pases 2-4 se trataron con tripsina y se sembraron en placas de seis pocillos. Se anadieron 60.000 celulas por pocillo. Las celulas se infectaron con los sobrenadantes virales generados por transfeccion de celulas 293T (utilizando Lipofectamine 2000, Invitrogen) con vectores retrovirales pMXs (Addgene) que conteman los ADNc de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc humanos. Se realizaron dos rondas de infeccion sucesivamente (12 horas cada una). Se anadio polibreno (Sigma) para aumentar la eficacia de la infeccion. Despues de la segunda ronda de infeccion (la eficacia de infeccion estaba cerca de 100%, como se demuestra por la transduccion de control con vectores que expresan GFP), el medio de cultivo de tejido de las celulas transducidas se cambio por medio de celulas de orina, y se renovo cada dfa. Los dfas 3 o 4, se trataron con tripsina las celulas y se conto su numero. De manera rutinaria, se sembraron 50.000 celulas sobre una capa de alimentadores en una placa de cultivo de 10 cm y se utilizo un medio de CME humanas (F12 [Invitrogen] + KSR al 20% [Remplazo de Suero para modificacion genetica para inactivacion de un gen, Invitrogen] + 10 ng/mL de factor crecimiento de fibroblastos basico + aminoacidos no esenciales [Invitrogen], L-glutamina, y beta mercaptoetanol), que se renovo todos los dfas. El dfa 5, el medio se cambio por medio de CME humanas + acido valproico 1 mM (VPA; Sigma) o mitad de medio de CME + mitad de medio dFBS (que consistfa en DMEM con alto contenido de glucosa [Invitrogen] + suero bovino fetal definido humano al 20% [FBS, Hyclone] + VPA. El VPA solamente se mantuvo desde el dfa 5 al 12. El medio se cambio por medio mTesR1 (Stemcell), y se renovo todos los dfas hasta el ultimo dfa del experimento. A partir del dfa 16, las colonias que eran lo suficientemente grandes y que se podfan identificar como de tipo CME humanas (esto es, morfologfa plana con bordes definidos y grandes nucleos que conteman nucleolos prominentes), pudieron ser succionadas mecanicamente y expandidas en medio de CME humanas sobre alimentadores o sobre medio mTesR1 en Matrigel.

iii) Caracterizacion de CMPOi

La tincion de AP, la integracion del transgen, la cariotipificacion y la secuenciacion con bisulfato se realizaron como describen Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79.

El analisis STR se realizo utilizando un Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI3130, ABI). El ADN genomico fue extrafdo utilizando DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y el ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, Paisley, USA). La qPCR se realizo con un Thermal Cycler DiceTM Real Time System (ABI7300, ABI, Foster, California, USA) y SYBR Green Premix EX TaqTM (Takara, Shiga, Japon); la beta actina se utilizo para la normalizacion y todos los artfculos se midieron por triplicado. Se prepararon micromatrices de ADN utilizando Human HT-12 V4.0 Expression Beadchip de Illumina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los chips se escanearon utilizando Illumina BeadChip Reader y los datos se analizaron utilizando Illumina BeadStudio Application. Para los teratomas, se inyectaron por via subcutanea o por via intramuscular 2 * 10 6 CMPOi en la pata trasera derecha de ratones NOD-SCID inmunocomprometidos. Los tumores fueron extirpados 8-10 semanas despues, se fijaron y se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tineron con hematoxilina/eosina. Para la diferenciacion EB, se trataron las CMPi sobre el alimentador con dispasa (Invitrogen) y se recogieron por medio de raspado. Despues de la centrifugacion, los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de CME humanas sin bFGF y se cultivaron durante 8 dfas en placas de no adherentes. Los EB fueron transferidos a continuacion a placas recubiertas con gelatina para permitir la diferenciacion de otros 8 dfas antes del procesamiento para el analisis de inmunofluorescencia.

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La caracterizacion del cultivo primario y las CMPOi resultantes mostraron que, de manera rutinaria, aparedan pequenas colonias en los dfas 9-16, variando esto entre los donantes, sin patron perceptible. Muchas de estas colonias adoptaban progresivamente una morfologfa de tipo CME humanas y se recogfan a partir del d^a 16 a 25. La eficiencia de reprogramacion tambien vario entre los donantes, pero en general era bastante alta, oscilando entre 0,1% y 4%. Las CMPOi tambien se produjeron a partir de un individuo varon de 65 anos de edad, la eficiencia de reprogramacion fue menor (0,01%), pero aun significativamente mayor que la referida para las celulas de sangre periferica. Por otra parte, era posible congelar y descongelar las celulas de orina de varios donantes antes de la transduccion, y esto no alteraba la eficacia de reprogramacion. Las celulas de orina tambien podnan estar infectadas en pases posteriores aunque con una cafda menor de la eficacia.

Despues de la expansion de colonias, las CMPOi se caracterizaron por medio de procedimientos convencionales, incluyendo la tincion con fosfatasa alcalina (AP), y mostraron colonias de celulas claramente positivas con fuerte tincion AP visualizadas por la tincion oscura de toda la colonia. Estas colonias presentaron una tincion positiva adicional en la tincion por inmunofluorescencia indirecta para los marcadores ME TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog, SSEA-3 y SSEA-4. Ademas, se observo la qPCR para los genes CME endogenos mas el silenciamiento de estos transgenes. Las micromatrices de ADN demostraron una expresion genica global cercana a CME H9, ya que las unidades de fluorescencia arbitrarias de las micromatrices de las celulas ME representadas frente a las de las CMPOi muestran una pendiente lineal con un angulo de 45°. El analisis de repeticion en tandem individual (STR) de las celulas de orina de donantes y de CMPOi mostro un origen coincidente en todos los casos. Si las circunstancias eran tales, esto ultimo excluye la contaminacion poco probable y reprogramacion de celulas de un companero sexual.

Despues de la expansion de colonias, las CMPOi se caracterizaron por procedimientos convencionales, incluyendo la tincion con fosfatasa alcalina y mostraron colonias de celulas claramente positivas con fuerte tincion AP visualizadas por la tincion oscura de toda la colonia, mientras que las celulas no transfectadas no mostraban ninguna tincion para la fosfatasa alcalina. Estas mostraron un cariotipo normal despues de la integracion del transgen en el ADN genomico, y presentaron una tincion positiva adicional en la tincion de inmunofluorescencia indirecta para los marcadores ME TRa-1-60, Tra-1-81, Nanog, SSEA-3 y SSEA-4. Por otra parte, se observo la qPCR para los genes endogenos de las CME, mas el silenciamiento de estos transgenes (que se muestran en la siguiente Tabla; hTERT indica la transcriptasa inversa de la telomerasa humana). Los valores se refieren a las celulas de orina de donantes; las CME H9 fueron utilizadas como control). Las micromatrices de ADN demostraron una expresion genica global cercana a CME H9 ya que las unidades de fluorescencia arbitrarias de las micromatrices de las celulas ME representadas frente a las de las CMPOi muestran una pendiente lineal con un angulo de 45°. La secuenciacion con bisulfito mostro una extensa desmetilacion en los promotores proximales Oct4 y Nanog en 2 clones de CMPOi representativos del mismo donante. El analisis de repeticiones en tandem individuales (STR) de las celulas de orina de donantes y las CMPOi mostro un origen coincidente y las micromatrices de ADN demostraron perfil de expresion genico global proximo a las CME H9.

Celulas de donantes UC-c0406 CMPi C1P5 UC-c0406 CMPi C4P7 UC-S0730 CMPi 2P4 UC-S0730 CMPi C3P4 UC-GZ0816 CMPi C3P3 UC-ZGZ0816 CMPi C4P2 CME H9

OCT4

1 110,43 120,98 101,28 91,59 153,20 108,96 269,94

SOX2

1 992,36 1331,22 4195,71 3884,33 1651,03 1133,96 1587,38

NANOG

1 1178,53 856,14 111,00 113,12 1128,93 1172,23 402,32

hTERT

1 11,964,73 14,498,34 1311,36 1263,01 10,149,00 7608,26 9768,02

iv) Demostracion del potencial de multi-diferenciacion de las CMPOi

Para demostrar que las CMPOi son pluripotentes, se llevo a cabo la diferenciacion no espedfica a traves de la formacion de teratoma (Figura 1) y cuerpo embrioide (EB). En ambos casos, se observo la aparicion de derivados de las capas 3 germinales, y los teratomas conteman en cambio estructuras bastante complejas sin signo obvio de necrosis o invasion de la capsula del tumor (Figura 1). A continuacion, se llevo a cabo la diferenciacion de CMPOi dirigida a linajes neuronales (celulas madre neurales, neuronas y astrocitos) (Figura 2A), cardiomiocitos (Figura 2B) y hepatocitos (Figura 2B); se detecto la acumulacion de glucogeno con tincion de acido peryodico de Schiff), que fue verificada por microscopfa de inmunofluorescencia para los marcadores adecuados y tambien la qPCR (solo para los hepatocitos y cardiomiocitos). Cabe senalar que se produjo la diferenciacion neural para 12 CMPOi correspondientes a 11 donantes, hepatocitos para 4 clones de 3 donantes, y cardiomiocitos para 14 clones de 11 donantes. Un video mostro una alta proporcion de EB con latido espontaneo (entre 30-75%). Del mismo modo, la medicion de la electrofisiologfa de los potenciales de accion (Figura 2D) y los aumentos transitorios de calcio (propiedades electrofisiologicas de cardiomiocitos de dos clones mostraron un comportamiento similar a los cardiomiocitos humanos producidos a partir de las CME humanas o CMPi derivadas de fibroblastos).

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para generar celulas diferenciadas de interes a partir de celulas de donantes de otro tipo de celulas, que comprende

   i) expansion de las celulas de orina somaticas exfoliadas de la orina y

   ii) generacion de celulas diferenciadas a partir de dichas celulas expandidas mediante la reprogramacion de dichas celulas para que se conviertan en celulas madre pluripotentes derivadas de orina inducidas (CMPOi) y la diferenciacion de dichas CMPOi a dichas celulas de interes.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas de orina exfoliadas se han obtenido a partir de un individuo enfermo o sano y se seleccionan entre celulas epiteliales, fibroblastoides o cancerosas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha reprogramacion se realiza por medio de una mezcla de factores de reprogramacion exogenos que comprenden factores seleccionados entre un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf y un gen de la familia Sox.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha reprogramacion se realiza por medio de una mezcla de factores de reprogramacion exogenos que comprenden factores seleccionados entre Sox2, Oct4, Klf4, c-Myc y Nanog.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 3 o 4, en donde dicha reprogramacion implica la expresion de factores de reprogramacion por las celulas sin integracion genomica y/o sin expresion de oncogenes.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde dicha reprogramacion comprende adicionalmente la aplicacion de moleculas pequenas, ARN de interferencia pequenos o microARN que aumentan la eficacia o reemplazan uno o mas de dichos factores de reprogramacion.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas son celulas humanas.
8. 8. Un metodo para generar celulas madre derivadas de orina pluripotentes inducidas (CMPOi), que comprende

   i. la expansion de celulas de orina somaticas exfoliadas y

   ii. la reprogramacion de dichas celulas expandidas para que se conviertan en CMPOi.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de modificar geneticamente las CMPOi, o celulas diferenciadas derivadas de las mismas, para que porte una molecula de acido nucleico que corrija un defecto causalmente implicado en una enfermedad genetica.
10. 10. El uso de celulas de orina somaticas exfoliadas para la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas.
11. 11. El uso de celulas de orina somaticas exfoliadas para la generacion de celulas diferenciadas de interes, en donde dichas celulas diferenciadas se han obtenido mediante la reprogramacion de celulas de orina somaticas exfoliadas para que se conviertan en celulas madre pluripotentes inducidas (CMPi) y a continuacion diferenciando dichas CMPi a las celulas de interes.

    Rosetas neurales

    Musculo liso

    Epitelio tipo intestinal

    imagen1

    imagen2

    Epitelio pigmentado Cartflago

    Glandula pequena

    (Q

    Celulas tipo heurona Beta-tubulima III Map 2 e <

    .Cardiomiocito CTNT Actinina

    imagen3

    imagen4

    ■*3

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