ES2575605T3 - Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas - Google Patents
Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2575605T3 ES2575605T3 ES11805858.5T ES11805858T ES2575605T3 ES 2575605 T3 ES2575605 T3 ES 2575605T3 ES 11805858 T ES11805858 T ES 11805858T ES 2575605 T3 ES2575605 T3 ES 2575605T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- urine
- reprogramming
- cmpoi
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 259
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 51
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 13
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 8
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 7
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 7
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 7
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 5
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 claims 1
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 claims 1
- 101100400452 Caenorhabditis elegans map-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000000020 capillary micro-extraction Methods 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100394230 Caenorhabditis elegans ham-1 gene Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 101100045395 Mus musculus Tap1 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 206010050337 Cerumen impaction Diseases 0.000 description 2
- 206010053138 Congenital aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 2
- 201000004939 Fanconi anemia Diseases 0.000 description 2
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- -1 Nanog Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000002939 cerumen Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 2
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 210000000512 proximal kidney tubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101100468275 Caenorhabditis elegans rep-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000004162 Claudin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000600 Claudin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000777300 Congiopodidae Species 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000011345 Duchenne and Becker muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012824 ERK inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010014989 Epidermolysis bullosa Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 208000028735 Gaucher disease type III Diseases 0.000 description 1
- 102000058063 Glucose Transporter Type 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000757160 Homo sapiens Aminopeptidase N Proteins 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 208000009625 Lesch-Nyhan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000056189 Neutrophil collagenases Human genes 0.000 description 1
- 108030001564 Neutrophil collagenases Proteins 0.000 description 1
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 1
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 1
- 102100026459 POU domain, class 3, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108091006296 SLC2A1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035317 Total hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- AMJRSUWJSRKGNO-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-2-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-(2,7-dichloro-3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)phenoxy]ethoxy]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O AMJRSUWJSRKGNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008668 cellular reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 101150003286 gata4 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940121372 histone deacetylase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000003276 histone deacetylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000053563 human MYC Human genes 0.000 description 1
- 102000052983 human POU5F1 Human genes 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 101150027852 pou3f2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036555 skin type Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 208000002320 spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 101150115978 tbx5 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un método para generar células diferenciadas de interés a partir de células de donantes de otro tipo de células, que comprende i) expansión de las células de orina somáticas exfoliadas de la orina y ii) generación de células diferenciadas a partir de dichas células expandidas mediante la reprogramación de dichas células para que se conviertan en células madre pluripotentes derivadas de orina inducidas (CMPOi) y la diferenciación de dichas CMPOi a dichas células de interés.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Metodo de generacion de celulas madre pluripotentes inducidas y celulas diferenciadas
La invencion se refiere a celulas madre pluripotentes inducidas y celulas diferenciadas y a los metodos para generarlas.
Antecedentes de la invencion
Las celulas madre embrionarias (CME) son celulas derivadas de blastocistos obtenidos a partirde la fertilizacion in vitro que tienen el potencial de auto-renovarse y de diferenciarse en cualquier tipo de celula madura de un organismo de mairnfero, p. ej., ser humano (esta propiedad se conoce como "pluripotencia"). En condiciones de cultivo de tejidos espedficas, las CME se pueden mantener indiferenciadas durante penodos prolongados de tiempo sin que pierdan sus caractensticas pluripotentes. Debido a estas propiedades, las CME han suscitado un enorme interes en la medicina regenerativa. Potencialmente, los tejidos derivados de las CME se podnan utilizar para el tratamiento clmico de los seres humanos (ya sea en afecciones agudas ya sea en enfermedades geneticas y degenerativas). Las CME tambien se podnan utilizar para el escrutinio de farmacos, por ejemplo para el estudio de la susceptibilidad espedfica de un tejido a los tratamientos, y para modelar enfermedades geneticas in vitro. Sin embargo, graves limitaciones eticas y practicas (el riesgo de rechazo inmunitario) han obstaculizado seriamente la aplicacion de las CME en la medicina clmica y, en muchos pafses, tambien en la investigacion.
El reciente descubrimiento de que las celulas somaticas se pueden transformar en CMPi por medio de factores exogenos (este metodo tambien se ha denominado "reprogramacion nuclear por factores exogenos" (Takahashi y Yamanaka, Cell 2006; 126: 663-76) tiene el potencial de cambiar el percepcion actual de la medicina personalizada y tambien puede proporcionar valiosos modelos in vitro de enfermedades humanas (Yamanaka y Blau, 2010; Nature 465, 704-712; Lian et al., 2010; Thromb Haemost 104, 39-44).
Sorprendentemente, las CMPi son similares a las CME y tienen el potencial de ser utilizadas en tratamientos espedficos para cada paciente, evitando asf el riesgo de rechazo inmunitario. Debido a estas caractensticas, las CMPi han recibido una gran atencion en todo el mundo. La generacion de CMPi requiere la recoleccion de tejido del donante, la expansion de las celulas del donante in vitro, y la exposicion de las celulas a un coctel de factores exogenos que se proporcionan a la celula en forma de protemas purificadas, extractos de protemas, moleculas de ARN, plasmidos no integrantes, virus (p. ej., retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus Sendai), con o sin cocteles qmmicos y con variaciones en las condiciones de cultivo celular.
La aplicacion de estos factores tiene el efecto de que las colonias con una morfologfa de tipo CME emergen progresivamente. Estas colonias representan colonias de CMPi que pueden ser recogidas y posteriormente expandidas y caracterizadas para verificar que su comportamiento es similar al de las CME.
Hasta el momento, las CMPi humanas se han generado utilizando celulas de la piel del donante (fibroblastos y queratinocitos), lfquido amniotico, tejidos extra-embrionarios (placenta y cordon umbilical; (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234) sangre del cordon umbilical, membrana periostica, tejido dental, tejido adiposo, celulas madre neurales, hepatocitos, celulas madre mesenquimales derivadas de amnios y celulas de sangre periferica (Ye y Cheng, 2010; Regen Med 5, 521-530; Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234). La reprogramacion de las celulas de estos tejidos se ha logrado con frecuencias variables, lo que indica que la celula de origen ("celula de donante") importa. Debido a la heterogeneidad de las celulas del donante actualmente utilizadas para la generacion de CMPi, es diffcil establecer normas para la realizacion de ensayos comparativos con CMPi y cMe, asf como para extraer conclusiones significativas a partir de los resultados de los ensayos.
El tipo de celula de donante ideal para la generacion de celulas CMPi debe ser facilmente accesible, facilmente reprogramable, y universal (de cualquier edad, sexo, grupo etnico y condicion corporal). Hoy en dfa, los fibroblastos dermicos se encuentran entre las fuentes de celulas utilizadas con mas frecuencia para la reprogramacion, pero requieren no solo una biopsia incomoda que necesita ser realizada en un ambiente aseptico por un especialista, sino tambien una expansion prolongada antes de su uso. Tambien tienen riesgo de mutaciones de celulas somaticas debido a la exposicion a la luz y la radiacion, y el procedimiento esta contraindicado en enfermedades de la piel o quemaduras graves. Recientemente, se ha informado de que tres grupos de investigacion lograron la reprogramacion de celulas de sangre periferica sin necesidad de movilizacion de celulas CD34+ (Loh et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 15-19; Seki et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 11-14; Staerk et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 20-24). Brown et al., 2010, PLoS ONE, 2010, 5, 6, 1-9, describen la generacion de CMPi derivadas de linfocitos T de sangre periferica. Dado que estos procedimientos son mnnimamente invasivos, requieren una cantidad pequena de sangre y no es necesario un cultivo celular prolongado, representan un avance significativo a pesar del hecho de que su eficacia es muy baja. Sin embargo, las principales celulas de donante utilizadas de acuerdo con estos informes son celulas T maduras que llevan reordenamientos de receptores de celulas T espedficas, lo cual no es deseable para ciertas aplicaciones clmicas potenciales. Asimismo, las celulas T no llevan la informacion genetica completa que se requiere para la diferenciacion ilimitada en cualquier tipo de celula.
Ademas, en casos raros, la recepcion/donacion de sangre no esta exenta de problemas eticos, por ejemplo debido a las creencias religiosas, y puede no ser factible en pacientes con enfermedades infecciosas, enfermedades de la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
sangre, o inmunodepresion. En este ultimo contexto, se deben considerar las condiciones que afectan a la coagulacion (p. ej., hemofilia), la leucemia y la inmunodepresion genetica o adquirida (p. ej., cancer y SIDA).
En la busqueda de una reprogramacion de nuevos tejidos, tambien se han producido celulas CMPi a partir de la membrana menmgea de raton (Qin et al., 2008; J Biol Chem, 283, 33730-33735 ) y de celulas epiteliales mamarias (Li et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 51-63 ), y en los seres humanos a partir de celulas madre del periostio y adiposas (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79), matriz de cordon umbilical y placenta (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234).
Compendio de la invencion
Para acelerar el progreso hacia las futuras aplicaciones de la tecnologfa de CMPi, es deseable proporcionar CMPi, asf como celulas diferenciadas de cualquier tipo celular, tejidos u organoides derivados de los mismos, a partir de celulas del donante que representan una fuente universal, asf como celulas diferenciadas directamente derivadas de tales celulas del donante. Ademas, puesto que el aislamiento de las celulas del donante para generar CMPi de acuerdo con metodos de la tecnica anterior por lo general requiere una etapa invasiva para obtener el tejido de donante de interes, los autores de la presente invencion buscaron proporcionar CMPi derivadas de una fuente de celulas no invasiva y los metodos para producir estas celulas CMPi.
El documento WO2008/153685 describe un metodo para producir un cultivo de celulas progenitoras de la orina (CMO), proporcionando una muestra de orina y despues aislando celulas progenitoras de la orina de la muestra. Las celulas progenitoras tienen el potencial de diferenciarse aun mas a otros tipos de celulas.
Para obtener un cultivo de celulas diferenciadas, el documento WO2010/065239 sugiere aislar celulas madre a partir de la orina y luego diferenciarlas a ciertos tipos de celulas.
Es comun a estos metodos que la diferenciacion de las celulas de orina obtenidas solo permita un numero limitado de tipos de celulas.
Un objeto de la invencion es proporcionar un metodo para obtener, a partir de una fuente de celulas obtenidas de forma no invasiva, celulas pluripotenciales con una capacidad de diferenciacion que es ilimitada con respecto al tipo de celula generada en ultima instancia.
Para resolver el problema subyacente de la invencion, los autores de la presente invencion consideran los criterios que deben ser cumplidos por una fuente de celulas ideal para ser aislada a partir de individuos y luego reprogramadas a CMPi (que se pueden diferenciar en cualquier tipo espedfico de celula) o diferenciadas directamente ( "transdiferenciadas", es decir, diferenciadas directamente, sin la etapa intermedia de la generacion de CMPi) a tipos espedficos de celulas, tejidos u organoides: las celulas deben ser facilmente accesibles con un riesgo asociado nulo o mmimo, deben estar disponibles en cantidades suficientes, presentes universalmente tanto en machos como en hembras (sin restriccion alguna en cuanto a la preocupacion etica, la raza, la edad o el estado de salud o enfermedad), y deben ser susceptibles de reprogramacion con una buena eficiencia. Los autores de la presente invencion encontraron sorprendentemente que las celulas somaticas, es decir, las celulas diferenciadas terminalmente, a partir de una fuente no invasiva como la orina, pueden reprogramarse de manera eficaz a CMPi o celulas espedficas o linajes de celulas de interes.
La descripcion se refiere a un metodo para generar celulas diferenciadas de interes a partir de celulas de donantes de otro tipo de celulas, que comprende
i) la expansion de las celulas a partir de una fuente de celulas obtenidas de un donante de una manera no invasiva, en donde dicha fuente de celulas se selecciona entre orina, heces, saliva, pelo, secrecion nasal, cerumen, fluido lacrimal o del tracto vaginal, y
ii) la generacion de celulas diferenciadas a partir de dichas celulas expandidas por medio de
a) reprogramacion de dichas celulas para que se conviertan en CMPi y a continuacion diferenciacion de las CMPi a celulas de interes, o por medio de
b) reprogramacion directa de dichas celulas para que se conviertan en una celula diferenciada de interes.
De acuerdo con una realizacion preferida, dichas celulas de donantes obtenidas en la etapa i) son celulas exfoliadas del tracto urinario que estan presentes en la orina (en lo sucesivo, estas celulas se denominan "celulas de orina").
En lo sucesivo, las CMPi derivadas de celulas de orina se denominan "CMPOi" (si no se indica de otro modo, por ejemplo, con respecto a la utilizacion de CMPOi, este termino tambien abarca las CMPi obtenidas de otras celulas de donante obtenidas de forma no invasiva).
En la realizacion de acuerdo con la cual la fuente de celulas es la orina, la etapa i) se puede realizar de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, esta por lo general comprende las subetapas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
a) recogida de la orina de un donante,
b) aislamiento de celulas exfoliadas de la orina, y
c) expansion de dichas celulas exfoliadas.
Las celulas exfoliadas ii) pueden ser cualquier tipo de celula que se encuentre en la orina que sea susceptible de reprogramacion.
De acuerdo con ciertas realizaciones, las celulas exfoliadas son celulas epiteliales, por ejemplo, celulas tubulares renales como celulas epiteliales tubulares proximales humanas exfoliadas (HEPTEC).
De acuerdo con otras realizaciones, las celulas exfoliadas son celulas fibroblastoides. De acuerdo con otras realizaciones mas, las celulas exfoliadas son celulas de tipo progenitor, celulas de tipo endotelial, celulas de tipo musculatura lisa o celulas de tipo intersticial como describen Zhang et al., 2008; J Urol 180, 2226-2233).
Las celulas ii) tambien pueden ser celulas cancerosas exfoliadas, p. ej. celulas de cancer renal o de cancer de vejiga.
Despues de la recogida de orina, las celulas de orina se centrifugan y el tipo de celula de interes, p. ej., celulas orfiborblastoides HEPTEC, se enriquecen haciendo crecer las celulas en un medio que favorezca su crecimiento, evitando de ese modo el crecimiento de las celulas de un tipo celular no deseado.
Tales medios se conocen de la bibliograffa y/o se encuentran disponibles en el mercado. A modo de ejemplo, los medios que satisfacen espedficamente los requisitos de las celulas epiteliales incluyen, pero no se limitan a Medio Basal Epitelial Renal (REBM) y SingleQuot Kit CC-4127 REGM, ambos disponibles de Lonza, medio EpiGRO de Millipore, Medio Basal de Celulas Epiteliales Renales (ATCC), otros medios para las celulas epiteliales de las vfas respiratorias incluyendo medios para celulas epiteliales de las vfas respiratorias o mamarias, p. ej., como los disponibles de Lonza, ATCC, o Cellapplications, o una combinacion de los mismos. Del mismo modo, el medio o los medios basados en el descrito por Wieser et al., 2008 (Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).
Un ejemplo de un medio adecuado para el enriquecimiento de las celulas fibroblastoides de la orina es FGM®-2 Fibroblast Growth Medium, tambien disponible de Lonza.
Ademas de celulas de orina, que son las celulas de donante preferidas para ser utilizadas en el metodo de la invencion, otras celulas que se han obtenido de un individuo donante en una forma no invasiva se pueden expandir y reprogramar para que se conviertan en CMPi, o directamente se diferencien a un tipo de celula de interes, p. ej. celulas obtenidas de heces, saliva, cabello, secrecion nasal, cerumen, fluido lacrimal o del tracto vaginal. Los metodos para aislar y expandir tales celulas son conocidos en la tecnica, p. ej. para las celulas exfoliadas de colon en las heces (Bandaletova et al., 2002. Apmis 110, 239-246), o a partir de celulas de la papila dermica del cabello (Warren et al., 1992; J Invest Dermatol 98, 693-699).
Otra fuente de celulas util es el lfquido que, durante la hemodialisis, se inserta en la cavidad peritoneal para el intercambio de sustancias con la sangre a traves de los vasos sangumeos en el peritoneo, lo que permite que la sangre sea filtrada de una manera "similar" a la del rinon. Este lfquido se puede recoger y se sabe que contiene muchas celulas.
"Reprogramacion" [(etapa ii), realizacion a)] es un termino reconocido en el campo para la transformacion de celulas somaticas en celulas CMPi por medio de factores exogenos.
En los experimentos de la presente invencion, la reprogramacion de celulas de orina a CMPOi se realizo utilizando vectores retrovirales que liberan los cuatro factores de reprogramacion Sox2, Oct4, Klf4 y c-Myc ("factores de Yamanaka" o "coctel de Yamanaka"), como han descrito originalmente Takahashi y Yamanaka, 2006; Cell 126: 66376).
En principio, se puede utilizar cualquier metodo de reprogramacion que sea capaz de transformar las celulas del donante, celulas de orina en particular, en CMPi, en particular CMPOi.
La reprogramacion se puede conseguir mediante uno o mas factores seleccionados entre un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf y un gen de la familia Sox. Ademas, la combinacion de factores puede comprender uno o mas productos genicos de un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf, junto con una citoquina. La citoquina puede ser al menos una de factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y factor de celulas madre (SCF).
Preferiblemente, estos factores se insertan en vectores de expresion no virales que se introducen en una celula somatica.
Si las CMPOi, o las celulas diferenciadas de las mismas, estan destinadas a la aplicacion terapeutica, se utilizan metodos que no emplean oncogenes y/o no implican la integracion del ADN que codifica el factor de reprogramacion en el ADN genomico del individuo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Por lo tanto, los metodos preferidos de la invencion para la generacion de CMPOi o celulas diferenciadas de las mismas, con fines terapeuticos no emplean lentivirus o retrovirus o utilizan virus modificados de tal manera que el riesgo de integracion genomica de los transgenes y los efectos secundarios no deseables asociados con dicha integracion se reducen al mmimo o se anulan completamente. Ademas, tambien se debe considerar que la integracion del transgen asume el riesgo de mutagenesis de insercion, que puede estar asociada con la tumorigenicidad en el paciente tratado.
Los metodos preferidos para la generacion de CMPOi para aplicacion terapeutica son aquellos que evitan la integracion genomica de los genes de reprogramacion (revisado por Sun et al., 2010; Cell Cycle 9: 5, 880-885) y/o que evitan oncogenes como Klf4 o c-Myc, p. ej.,
o utilizando lentivirus escindibles por recombinasa Cre (Soldner et al., 2009; Cell 136: 964-77);
o utilizando Oct4, SOX2, y NANOG solos, omitiendo c-Myc y Klf4 (Li y et al., 2010; Cell Reprogram. Jun 12(3): 237-47);
o logrando la derivacion de celulas CMPi humanas libres de transgen y libres de virus mediante el uso de vectores episomales basados en oriP/EBNA1 (antfgeno nuclear 1 de Epstein-Barr) que codifican los factores de reprogramacion Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28 y SV40LT (Yu et al., 2009; Science 324: 797-801);
o utilizando una tecnica de reprogramacion libre de virus empleando vectores de expresion de transposon piggyBac que llevan un transgen policistronico de los factores de Yamanaka (Woltjen et al., 2009, Nature 458: 766-70); ADN minicircular no viral (Jia et al., 2010; Nat Methods Mar 7(3): 197-9);
o metodos basados en protemas recombinantes, p. ej. tratamiento de las celulas con los cuatro factores de Yamanaka en forma de protemas recombinantes conjugadas con un peptido de penetracion celular (cpp) (Kim et al., 2009; Cell Stem Cell 4: 472-6); exponiendo las celulas a un coctel de factores exogenos que se proporcionan a la celula en forma de protemas purificadas, extractos de protemas con o sin tratamiento qmmico previo (Cho et al., 2010; Blood 116, 386-395; Han et al., 2010; PLoS One. 19 Ago; 5(8): e12297; Solanki y Lee, 2010; Chembiochem 11, 755-757).
o anadiendo moleculas pequenas, p. ej. acido valproico, un inhibidor de la histona desacetilasa (Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol. 26: 795-7; Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol 26:1269-1275 ); u otras numerosas moleculas pequenas, p. ej., inhibidores de la glucogeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), de la ruta MEK-ERK e inhibidores de la ruta TGFp para aumentar la eficacia o reemplazar algunos de los factores de reprogramacion (Lin et al., 2009; Nat Methods 6: 805-8; Li et al., 2009; Cell Stem Cell. 4: 16-9; Shi et al., 2008; Cell Stem Cell. 2: 525-8; Ichida et al., 2009; Cell Stem Cell. 5: 491-503 ); o anadir vitamina C (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79);
o anadiendo ARN de interferencia pequenos (ARNip), p. ej. ARNip de p53, para mejorar la eficacia de la reprogramacion de los factores de Yamanaka (Zhao et al., 2008; 3: Cell Stem Cell 475-9);
o anadiendo micro ARN (miARN) a los cocteles de reprogramacion (p. ej. Wilson et al., 2009; Stem Cells Dev. 18: 749-58; Judson et al., 2009; Nat Biotechnol Mayo; 27(5): 459-461).
o suministrando ARNm o ARNm modificado, que codifica factores de reprogramacion (Yakubov et al., 2010; Biochem. Biophys Res Commun 394, 189-193), por medio de lo cual, en el caso de la modificacion, esta es tal que aumenta la traduccion y/o la estabilidad, p. ej. como describen Kowalska et al., 2008, RNA. Jun 2008; 14(6): 1119-1131.
La seguridad y/o eficacia de la reprogramacion se pueden optimizar aun mas cambiando el medio de cultivo de tejidos o el entorno, p. ej. sustitucion de un medio que contiene suero por Knock Out Serum Replacement (KSR, Invitrogen), o cambiando el entorno (p. ej. baja oxigenacion utilizando incubadoras espedficas en las que se puede controlar la concentracion de oxfgeno).
La optimizacion se puede lograr p. ej. mediante la realizacion de experimentos en serie de una poblacion de celulas de orina expandidas dada. A modo de ejemplo, se pueden hacer crecer celulas de orina de numerosos individuos en diferentes medios (p. ej. medio para celulas epiteliales o fibroblastos) antes de la infeccion con los retrovirus que produce los factores exogenos, con el fin de seleccionar poblaciones de celulas que sean reprogramadas mas facilmente. Despues de la infeccion, se emplean diferentes cocteles de medios (con los cambios en diferentes momentos espedficos), que contienen suero o libres de suero, y con o sin la adicion de productos qmmicos (vease mas arriba) para ver en que condiciones se puede lograr una eficacia optima. Asimismo, las celulas se pueden infectar con diferentes combinaciones de factores, por ejemplo los 4 factores de Yamanaka con o sin Nanog (u otros factores p. ej. microARN). Tambien se puede analizar con cuantas rondas de infeccion (1, 2 o 3 rondas) se pueden obtener los mejores resultados. Cuando las celulas se dividen en celulas de alimentacion, se pueden utilizar diferentes tipos de capas de alimentacion, p. ej., fibroblastos de raton, fibroblastos humanos, amniocitos, membrana amniotica, etc.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La reprogramacion directa de la celula de donante, sin generar primero una CMPi, para que se convierta en una celula diferenciada de interes [etapa ii), realizacion b)] tambien se conoce como "transdiferenciacion", que representa el cambio de una celula o tejido de un estado diferenciado a otro (Vierbuchen y Wernig, 2011, Nat Biotechnol 2011; 29(10): 892-907.
En esta realizacion, los factores de transcripcion espedficos del tipo de celulas se expresan en exceso utilizando vectores virales, vectores basados en plasmidos etc. como factores para la reprogramacion de CMPi.
Para la transdiferenciacion directa de las celulas de orina (u otras celulas obtenidas de manera no invasiva) a neuronas, se pueden utilizar los 3 factores AscI1, Brn2, y Myt1I como se describe para la conversion de fibroblastos humanos en neuronas (Vierbuchen et al., 2010; Nature 463, 1035-1041), o de hepatocitos en neuronas, segun lo descrito por Marro et al., 2011, Stem Cell. 4 Oct; 9(4): 374-82.
Efe et al., 2011, Nat Cell Biol. Mar 2011; 13(3): 215-22, describen un metodo por el que los fibroblastos embrionarios de raton (MEF) pueden ser reprogramados directamente para contraer de manera espontanea parches de cardiomiocitos diferenciados.
Para la conversion de las celulas de donante de orina en cardiomiocitos, se puede utilizar un metodo que se ha llevado a cabo con exito para obtener cardiomiocitos de mesodermo, utilizando Gata4, Tbx5, y Baf60c (Takeuchi et al., 2009; Nature 459, 708-711).
La transdiferenciacion a celulas hematopoyeticas se puede realizar mediante el uso de la expresion en exceso de Oct4 solo (Szabo et al., 2010; Nature 468, 521-526).
El escrutinio de factores que transdiferencian celulas de orina a neuronas, queratinocitos, fribroblastos, cardiomiocitos, celulas de hugado, rinon, sangre, etc. se puede llevar a cabo de una manera similar a los protocolos de transdiferenciacion descritos anteriormente y al protocolo inicial de Yamanaka (Takahashi y Yamanaka, 2006). Basandose en el abundante conocimiento acerca de los factores de transcripcion espedficos de los linajes, tales factores se pueden someter a ensayo combinados (como en los artfculos descritos anteriormente) por su potencial para transdiferenciar directamente celulas derivadas de orina combinadas con las condiciones de cultivo que se utilizan comunmente para mantener y cultivar el tipo de celula espedfica de interes. Tambien se pueden llevar a cabo experimentos en serie de acuerdo con los principios descritos anteriormente para la optimizacion de la eficacia de reprogramacion para optimizar la eficacia transdiferenciacion.
Aunque el metodo de la invencion se utiliza preferiblemente para la produccion de CMPOi o celulas diferenciadas a partir de celulas de donante humano, tambien se puede aplicar a las celulas de otros marnfferos (p. ej. mono, caballo, perro, gato, cerdo, rata y raton).
La produccion de celulas diferenciadas de interes, ya sea directamente ya sea a traves de CMPOi intermedias, a partir de celulas exfoliadas de orina, proporciona un metodo facil de reproducir, universal para la generacion de celulas de tipo CME de alta calidad. Esto tiene la ventaja de que la recoleccion de las celulas del donante se puede realizar en cualquier lugar y por cualquier persona, siempre que se tomen las medidas mmimas de higiene, asf como a partir de cualquier ser humano, independientemente de su edad, sexo o afeccion. Ademas, el lfquido perfundido al peritoneo para la sustitucion de la falta de la funcion renal en pacientes con insuficiencia renal que requieren dialisis o pacientes despues de operaciones de la vejiga que no producen orina, puede ser utilizado como una fuente de celulas para la reprogramacion o transdiferenciacion.
El metodo de la invencion proporciona una oportunidad unica para comparar los metodos de reprogramacion en todo el mundo y avanzar en el campo hacia la aplicacion clmica de celulas CMPi seguras.
En principio, las CMPOi, o las CMPi obtenidas por el metodo de la invencion a partir de otras celulas de donante obtenidas de forma no invasiva, se pueden utilizar para los mismos fines que las CMPi conocidas en la tecnica generadas a partir de otros tipos de celulas.
Las caractensticas ventajosas de las CMPOi las hacen utiles tanto desde el punto de vista de la investigacion como comercial, este ultimo, p. ej. proporcionando CMPOi, o celulas, linajes de celulas, organoides o tejidos, derivados de las mismas, de un individuo sano o de un paciente con una enfermedad), p. ej. a efectos de escrutinio.
Las CMPOi se pueden utilizar para generar celulas para la reparacion o sustitucion de tejidos a la vez que evitan los problemas eticos e inmunologicos que son inherentes al uso de celulas CM.
Las CMPOi de la invencion, los tejidos u organoides derivados de los mismos, respectivamente, son particularmente utiles para el tratamiento de pacientes con quemaduras graves, a los que se proporcionara piel artificial, obtenida a partir de celulas diferenciadas, derivadas de celulas de orina, ya sea directamente o a traves de CMPOi.
Para el tratamiento de enfermedades de la sangre, las CMPOi o las celulas diferenciadas obtenidas a partir de ellas, o las celulas obtenidas por transdiferenciacion directa de las celulas de orina, pueden ser infundidas a pacientes que padecen leucemia p. ej. leucemia inducida por mutacion somatica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En el tratamiento de la hemofilia, las CMPOi corregidas geneticamente se pueden utilizar para el trasplante autologo, y en el caso de las enfermedades que disminuyen la cantidad de celulas inmunitarias como por ejemplo, el VIH, se pueden utilizar CMPOi convertidas en celulas hematopoyeticas para reponer la poblacion de celulas inmunitarias por medio de infusion. En la anemia de celulas falciformes, tambien se pueden utilizar CMPi con genes corregidos (Hanna et al., 2007; Science 318, 1920-1923).
Las CMPOi (o CMPi obtenidas a partir de otras celulas de donante obtenidas de manera no invasiva) se pueden utilizar, como las CMPi conocidas en la tecnica, en la terapia de enfermedades degenerativas, en las que un tipo espedfico de celula o tejido es destruido o tiene un mal funcionamiento y el cuerpo es incapaz de reponerlo. En las afecciones degenerativas, p. ej. la enfermedad de Parkinson, el tratamiento con CMPOi proporciona al sitio afectado celulas indiferenciadas que luego se pueden utilizar para la reparacion del dano en los tejidos. De ese modo, la terapia con CMPOi volvera a introducir nuevas celulas o tejidos sanos para satisfacer la misma funcion. Las CMPOi tambien tienen el potencial de ser utilizadas para desarrollar organos enteros nuevos que sean compatibles con el paciente y reduzcan las posibilidades de rechazo de trasplantes, ya que son celulas autologas, es decir, celulas derivadas de celulas de donante del paciente a tratar, p. ej. en el caso de la diabetes, se pueden generar agrupaciones de tipo islote que segregan insulina a partir de celulas de tipo CMPi (Tateishi et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).
Las CMPOi tambien se pueden utilizar (como fue revisado para las CMPi por Lau et al., 2009; F1000 Biol Rep 1: 84) para la generacion de lmeas celulares espedficas de enfermedades que son utiles como modelos de enfermedad y/o para el escrutinio de candidatos a farmacos in vitro y/o para corregir defectos geneticos por medio de terapia genica. La generacion de celulas diferenciadas terminalmente (p. ej. hepatocitos o cardiomiocitos) a partir de CMPOi (u obtenidas por medio de transdiferenciacion directamente a partir de las celulas de la orina), por ejemplo, permitira la deteccion y el perfilado adicional de los compuestos sobre el respectivo linaje celular, con el objetivo de definir la especificidad del paciente (para la medicacion personalizada) o la aplicabilidad general de un compuesto. A modo de ejemplo, como describen Dimos et al. 2008 (Science 29 Ago; 321 (5893): 1218-2). Las CMPOi se pueden utilizar como un modelo para la forma familiar de la esclerosis lateral amiotrofica; o como un modelo, o para el tratamiento, respectivamente, de otras enfermedades geneticas, segun lo descrito por Park et al., 2008 (Cell 5 Sep; 134 (5): 8778), que produjeron celulas CMPi a partir de pacientes con 10 enfermedades geneticas diferentes, incluyendo la enfermedad de Parkinson, la diabetes de tipo 1, la distrofia muscular de Duchenne y Becker, la inmunodeficiencia combinada grave relacionada con el deficit de adenosina desaminasa, el smdrome de Shwachman-Bodian-Diamond, la enfermedad de Gaucher tipo III, la enfermedad de Huntington, el smdrome de Down, y el estado de portador del smdrome de Lesch-Nyhan. Asimismo, se pueden generar modelos basados en celulas humanas de atrofia muscular espinal y enfermedad de Parkinson de manera similar a la descrita por Ebert et al.; 2009 (Nature 15 Enero; 457 (7227): 277-8 y Soldner et al., 2009 (Cell 6 Marzo; 136 (5): 964-77), o se pueden utilizar CMPOi derivadas de celulas de un paciente con beta-talasemia homocigota de una manera similar a la descrita por Ye et al., 2009 (Proc Natl Acad Sci USA 16 Junio; 106 (24): 9826-3) para CMPi derivadas de fibroblastos de la piel, que se diferenciaron a continuacion a celulas hematopoyeticas productoras de hemoglobina. Tales CMPOi, tras una modificacion genetica, podnan producir celulas hematopoyeticas autologas que funcionanan normalmente. Las CMPOi tambien se pueden utilizar para corregir los defectos geneticos en pacientes con anemia de Fanconi, segun lo descrito por Raya et al., 2009 (Nature 2 Jul; 460 (7251):53), que obtuvieron celulas CMPi a partir de fibroblastos dermicos recolectados de pacientes con anemia de Fanconi, corregidos utilizando vectores lentivirales que codificaban FANCA y FANCD2, y, posteriormente, obtuvieron celulas somaticas que estaban fenotfpicamente libres de la enfermedad.
Las CMPOi tambien se pueden utilizar como las CMPi generadas por Lee et al., 2009 (Nature 17 Sep; 461 (7262): 402), que generaron celulas CMPi a partir de pacientes con disautonomfa familiar (FD), re-diferenciaron las celulas CMPi y utilizaron el modelo in vitro para escrutar los farmacos candidatos.
Otro ejemplo de una enfermedad para la que las CMPOi tienen un gran valor potencial como modelo de enfermedad, es el smdrome de Prader Willi (Yang et al., 2010; J Biol Chem 285, 40303-40311). Otros ejemplos de enfermedades geneticas para las cuales la terapia genica que utiliza CMPOi tiene un gran potencial son la Epidermolisis bullosa (p. ej. mediante la reprogramacion del ARNm de K14, tal como describen Wally et al., 2010. Hum Mol Genet 19, 47154725; Wally et al., 2008; J Invest Dermatol 128, 568-574). En general, la terapia genica basada en la modificacion genetica de CMPOi tiene el mayor potencial para el tratamiento de enfermedades causadas por trastornos de genes individuales; hasta la fecha, se han descrito aprox. 4000 de tales enfermedades geneticas.
En los modelos de enfermedad anteriores que utilizan celulas diferenciadas terminalmente, tales celulas pueden, de forma alternativa, ser obtenidas a partir de CMPOi, ser obtenidas por medio de reprogramacion directa de las celulas del donante. Para el proposito de la presente invencion "reprogramacion directa" se utiliza como sinonimo de "transdiferenciacion", segun se define en la presente memoria.
Si las celulas del donante son celulas de cancer, p. ej. celulas de cancer renal o de vejiga, que representan presumiblemente las primeras etapas de cancer, las CMPOi o celulas diferenciadas de las mismas son utiles como modelos para el respectivo cancer.
La terapia genica comprende la insercion, alteracion, o anulacion de uno o mas genes dentro de las celulas de un individuo, para corregir un efecto genetico que causa una enfermedad. Hasta el momento, principalmente se han
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
considerado para el tratamiento las enfermedades monogenicas, que son causadas por mutaciones en genes individuals. La forma mas comun de terapia genica implica la insercion de genes funcionales en una localizacion genomica no especificada con el fin de reemplazar un gen mutado. Una mutacion tambien se puede corregir directamente.
Para las aplicaciones de la terapia genica, las celulas modificadas geneticamente son CMPOi o celulas diferenciadas derivadas de las mismas (u obtenidas por reprogramacion directa de las celulas del donante); alternativamente, aunque menos preferidas, las celulas del donante expandidas pueden ser modificadas geneticamente antes de la reprogramacion. En el alcance de la invencion, las celulas modificadas geneticamente se van a utilizar predominantemente en la terapia genica somatica. Dado que la correccion de los defectos geneticos se realiza in vitro antes de la re-infusion o el trasplante de las CMPOi o celulas diferenciadas derivadas de las mismas (u obtenidas por reprogramacion directa de las celulas del donante), el riesgo de transferencia de genes a la lmea germinal se minimiza. Las celulas corregidas se infundiran o trasplantaran como celulas diferenciadas derivadas de CMPOi (o directamente se transdiferenciaran sin reprogramacion previa de CMPi) con el fin de complementar o reemplazar tejidos y organos no funcionales. El gen de correccion se puede introducir en las celulas de acuerdo con los metodos conocidos en la tecnica, p. ej. por medio de vectores virales (modificados para reducir al mmimo el riesgo de reactivacion), incluyendo retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, lentivirus, virus Herpes simplex, mediante el uso de vectores basados en plasmidos, o incluso ADN desnudo.
La correccion de los defectos de los genes se puede llevar a cabo de muchas maneras, p. ej., mediante el suministro de ADN que codifica el gen que funciona correctamente, la modificacion para disminuir la expresion del gen mutado mediante la liberacion de ARNhc o miARN, mediante el uso de protemas en dedos de zinc para llevar a cabo una modificacion para inactivar un gen o recombinaciones, o mediante el uso de vectores que permiten eventos trans- empalme.
Se puede prever que, debido a la forma no invasiva de obtencion de las celulas del donante, puede haber una alta aceptacion por parte de los individuos sanos para tener, de antemano y de forma profilactica, CMPOi preparadas y almacenadas derivadas de su propia orina, asf como linajes celulares derivados, organoides o tejidos como piel artificial, lo que permitira una utilizacion mas rapida en el caso de la aparicion de una enfermedad grave o una lesion, como una quemadura.
Los fibroblastos, queratinocitos o piel artificial generados a partir de CMPOi (Bilousova et al., 2010; J Invest Dermatol 9 Dic), p. ej. derivados de las celulas de los donantes de los individuos con diferentes tipos de piel, tambien pueden ser utiles para los ensayos en la industria cosmetica.
Las CMPOi pueden ser tambien utiles para la clonacion de animales, especialmente mairnferos, p. ej. caballos de carreras o animales domesticos).
Breve descripcion de las figuras
Figura 1
Diapositivas tenidas con hematoxilina/eosina de teratomas que comprenden derivados complejos de las 3 capas germinales producidas con 2 clones de CMPOi representativos
Figura 2
A: Contraste de fases y fotograffas de inmunofluorescencia de celulas de tipo neuronal producidas siguiendo un protocolo referido a partir de un clon de CMPOi representativo.
B: Se diferencio un clon de CMPOi representativo a celulas de tipo cardiomiocito utilizando un protocolo referido. Contraste de fase, tincion de PAS y fotograffas de inmunofluorescencia.
C: Se diferencio un clon de CMPOi representativo a celulas de tipo hepatocito utilizando un protocolo referido. Contraste de fase, tincion de PAS y fotograffas de inmunofluorescencia.
D: Potenciales de accion medidos en cardiomiocitos derivados de un clon de CMPOi representativo.
EJEMPLO Materiales y metodos Microscop^a de inmunofluorescencia
Las celulas se fijaron en paraformaldetudo al 4% durante la noche, se lavaron, se bloquearon y se permeabilizaron en solucion de bloqueo (PBS que contema suero normal de cabra al 3% y Triton X-100 al 0,2%) durante 30 minutos. A continuacion, se incubaron con anticuerpos primarios en solucion de bloqueo a 4°C durante la noche, se lavaron dos veces y se incubaron con los anticuerpos secundarios correspondientes durante 1 hora a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron dos veces y se tineron con DAPI (Sigma) durante 5 minutos, y a continuacion para la observacion y la fotograffa utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP2 Spectral (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). Antes de la inmunofluorescencia, las zonas de latido se cortaron con tijeras, se recogieron en un tubo de 1,5 ml con PBS con bajos niveles de calcio, y se dejaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Estos grupos de celulas se transfirieron a tampon de enzima que contema de 0,5 a 1 mg/mL de colagenasa 2 y se incubaron a 37° durante 30-40 minutos. La digestion se termino con DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). Las muestras se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
centrifugaron a continuacion y el sedimento se resuspendio en DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). Las suspensiones celulares se cultivaron sobre cubreobjetos recubiertos de gelatina y se cultivaron a 37° durante al menos 2 dfas antes de la fijacion y la inmunofluorescencia.
Diferenciacion espedfica de tejido y mediciones electrofisiologicas
La diferenciacion neuronal, de hepatocitos y cardiomiocitos se realizo como se ha descrito (Pankratz et al., 2007, Stem Cells 25, 1511-1520; Song et al., 2009, Cell Res 19, 1233-1242; Zwi et al., 2009, Circulation 120, 15131523). N2 y B27 se adquirieron de Invitrogen, la heparina se adquirio de Sigma, el EGF se adquirio de R & D Systems. La activina A y la oncostatina M se adquirieron de R & D Sistems (Minneapolis, MN, USA), BMP2, FGF4, HGF y KGF de PeproTech (Rocky Hill, USA), y la dexametasona de Enzo Life Sciences (Farmingdale, USA). La tincion con acido peryodico Schiff (PAS), hepatoZYME-SPF, en RPMI 1640 se realizo utilizando un kit adquirido de Polysciences (Warrington, USA). La caracterizacion electrofisiologica de los cardiomiocitos derivados de CMPi (dfa 23) se realizo utilizando el metodo de fijacion de membrana ("patch clamp") de celulas enteras convencional para registrar los fenotipos potenciales de accion (HEKA Instruments Inc., Southboro, MA) (Chan et al., 2009 J Cardiovasc Electrophysiology 20, 1048-1054). Se prepararon las pipetas del parche a partir de tubos de vidrio de borosilicato de 1,5 mm de pared fina utilizando un extractor de micropipeta Sutter P-97 y tuvieron resistencias tfpicas de 3-5 MQ cuando se cargaron con una solucion interna que contema (mM): aspartato K+110, KCl 20, MgCh 1, Na- GTP 0,1, Mg-ATP 5, Na2-fosfogreatina 5, EGTA5, HEPES 10, y se ajusto el pH a 7,3 con KOH. La solucion de bano de Tyrode externa consistio en (mM): NaCl 140, KCl 5, MgCh 1, KH2PO4 0,4, CaCl21,8, glucosa 10, HEPES 5, y se ajusto el pH a 7,4 con NaOH. La actividad electrica espontanea se midio mientras los cardiomiocitos derivados de CMPi se quedaron pasivos sin entrada de corriente. Se registraron veinte potenciales de accion consecutivos a partir de los cardiomiocitos derivados de CMPi con descargas espontaneas para asegurar formas de onda estables para el analisis. Los datos fueron corregidos para los potenciales de union lfquida de +15,9 mV. Se detectaron elevaciones transitorias de calcio con formacion de imagenes de calcio confocales utilizando un protocolo descrito previamente (Ng et al., 2010; J Mol Cell Cardiol 48, 1129-1137). Brevemente, se cargaron cardiomiocitos aislados derivados de CMPi con Fluo-3 AM 5 |jM (Invitrogen) durante 25 minutos a 37°C en solucion de Tyrode que contema (mM): NaCl 140, KCl 5, MgCl21, KH2PO4 0,4, CaCl21,8, glucosa 10, HEPES 5 a pH 7,4. Las elevaciones transitorias de calcio se registraron con un sistema de formacion de imagenes confocal (Olympus Fluoview System version 4,2 FV300 TIEMPO) montado sobre un microscopio Olympus vertical (IX71) y a continuacion se cuantificaron como cambios de intensidad de fluorescencia restada del fondo normalizados a la fluorescencia en el momento inicial restada del fondo. Los datos se introdujeron en el soporte logico Felix 32 (Photon Technology International) para el analisis.
i) Recogida de orina y expansion de las celulas
Se esterilizaron los recipientes apropiados (hasta 500 ml) antes de la recoleccion de orina. Solamente se recogio la porcion central del flujo de orina en los recipientes esteriles. El volumen normal de las muestras fue de 150 a 200 ml. Las muestras de orina se transfirieron a continuacion a una campana de cultivo de tejido en tubos de 50 mL y estos tubos se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue descartado cuidadosamente dentro de una campana de cultivo de tejido, dejando aproximadamente 1 mL o menos de la orina en el tubo. Los sedimentos se resuspendieron individualmente y todos los tubos de 50 mL derivados de una recogida de muestras se agruparon en un unico tubo de 50 mL. Se anadieron alrededor de 10 mL de PBS que contema amfotericina B y penicilina/estreptomicina. Las muestras se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos. Se desecho el sobrenadante, dejando solo alrededor de 0,2 mL de muestra. Se anadio alrededor de 1 mL de medio principal para volver a suspender el sedimento celular. La receta de medio primario contema DMEM/F12 de Ham 1:1 (Hyclone), 10% de suero bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza), amfotericina B, y penicilina/estreptomicina. Las celulas se transfirieron a placas de 12 pocillos recubiertas con L-gelatina en 1 mL de medio principal. Los 2 primeros dfas se anadieron unos pocos cientos de mL de medio principal para retener la concentracion de los antibioticos y mantener alto el nivel de nutricion. Los siguientes dfas se cambio el medio con cuidado por medio REBM (Medio Basal Renal Epitelial, Lonza) que contema SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza) (la combinacion de los dos se refiere como medio de celulas de orina), el procedimiento no se llevo a cabo completamente para permitir la presencia de factores secretados por las celulas de orina y evitar un estres innecesario. Las celulas/colonias visibles aparecieron de manera rutinaria despues de 3-6 dfas. El primer cambio de medio completo se hizo despues de que se observaran las primeras celulas/colonias. Las celulas se dividieron sobre una superficie mas grande con la ayuda de tripsina al 0,25% que contema EDTA 1 mM cuando el cultivo crecio hasta la confluencia. Este y otros procedimientos fueron aprobados por el comite de etica de Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health. Se generaron RPTEC como describen Wieser et al., 2008, Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375, y se mantuvieron en medio de celulas de orina. Los fibroblastos se obtuvieron a partir de fibroblastos de la piel adquiridos de Coriell Cell Repository y se mantuvieron en DMEM (Invitrogen) + 10% (vol/vol) de suero bovino fetal (FBS; Hyclone).
A primera vista, los cultivos de celulas de orina consistfan principalmente en las celulas escamosas (probablemente provenientes de la uretra) y algunas celulas sangumeas (eritrocitos en su mayona), pero despues de 2-3 dfas estas celulas desaparecieron y fueron sustituidas por colonias pequenas (3 por muestra de promedio) que crecieron rapidamente. Estas colonias se correspondfan con 2 morfologfas principales: tipo 1 o tipo 2, de acuerdo con los informes anteriores sobre el aislamiento de celulas de la orina (Dorrenhaus et al., Arch Toxicol 2000; 74, 618-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
626.). Las celulas de tipo 1 tend^an a ser mas redondeadas y credan estrechamente unidas a las celulas vecinas, lo que sugiere un fenotipo epitelial. Las celulas de tipo 2 eran moderadamente mas alargadas y tendfan a crecer un poco mas dispersas. En algunas recolecciones de muestras todas las colonias correspondfan a 1 de los 2 tipos, pero en otros se mezclaban. Estos cultivos celulares se agruparon al alcanzar una alta densidad y se dividieron para su caracterizacion adicional o su reprogramacion paralela. Los enriquecidos en celulas de tipo 1 presentaban uniones celula a celula bien formadas positivas para E-cadherina y beta catenina (marcadores de union adherente), y ZO-1 (protema 1 Zonula Occluddens; un marcador de union estrecha), como se evaluo mediante microscopfa de inmunofluorescencia. Tambien eran positivos para el filamento intermedio queratina 7, un marcador epitelial, y el marcador de los tubulos proximales renales CD13. Ademas, la distribucion de la actina era cortical mas que en fibras de traccion. La PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) tambien apoyo un origen epitelial predominante, como lo demuestra el analisis de E-cadherina, ocludina y claudina 1 (protemas de union estrecha), y el transportador de la familia 2 de portadores de soluto de los tubulos proximales renales SLC2A1. Se utilizaron celulas epiteliales proximales renales (RPTEC; Wieser et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375) y fibroblastos de la piel como controles positivos y negativos, respectivamente, para la inmunofluorescencia y la qPCR. Los cultivos enriquecidos en celulas de tipo 2 mostraron un patron de inmunofluorescencia bastante similar, pero la intensidad fue mas leve y la distribucion mas desigual; los resultados de la qPCR fueron igualmente comparables. En ambos casos, se observo poca tincion para los marcadores de tipo fibroblastico fibronectina y vimentina.
ii) Generacion y expansion de CMPOi
Se reprogramaron muestras de 12 adultos jovenes de origen Chino o de raza Caucasica, 7 correspondiente a hombres y 5 a mujeres. Las celulas de orina en los pases 2-3 fueron transducidas con retrovirus que produdan Sox2, Klf4, Oct4 y c-Myc (Cai et al 2010; J Biol Chem 285, 11227 a 11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79): Los plasmidos retrovirales que produdan los factores de transcripcion Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc humanos se adquirieron de Addgene (Cambridge, Ma, USA). Los sobrenadantes virales se recogieron en 2 dfas consecutivos comenzando 48 horas despues de la transfeccion. Las celulas de orina en los pases 2-4 se trataron con tripsina y se sembraron en placas de seis pocillos. Se anadieron 60.000 celulas por pocillo. Las celulas se infectaron con los sobrenadantes virales generados por transfeccion de celulas 293T (utilizando Lipofectamine 2000, Invitrogen) con vectores retrovirales pMXs (Addgene) que conteman los ADNc de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc humanos. Se realizaron dos rondas de infeccion sucesivamente (12 horas cada una). Se anadio polibreno (Sigma) para aumentar la eficacia de la infeccion. Despues de la segunda ronda de infeccion (la eficacia de infeccion estaba cerca de 100%, como se demuestra por la transduccion de control con vectores que expresan GFP), el medio de cultivo de tejido de las celulas transducidas se cambio por medio de celulas de orina, y se renovo cada dfa. Los dfas 3 o 4, se trataron con tripsina las celulas y se conto su numero. De manera rutinaria, se sembraron 50.000 celulas sobre una capa de alimentadores en una placa de cultivo de 10 cm y se utilizo un medio de CME humanas (F12 [Invitrogen] + KSR al 20% [Remplazo de Suero para modificacion genetica para inactivacion de un gen, Invitrogen] + 10 ng/mL de factor crecimiento de fibroblastos basico + aminoacidos no esenciales [Invitrogen], L-glutamina, y beta mercaptoetanol), que se renovo todos los dfas. El dfa 5, el medio se cambio por medio de CME humanas + acido valproico 1 mM (VPA; Sigma) o mitad de medio de CME + mitad de medio dFBS (que consistfa en DMEM con alto contenido de glucosa [Invitrogen] + suero bovino fetal definido humano al 20% [FBS, Hyclone] + VPA. El VPA solamente se mantuvo desde el dfa 5 al 12. El medio se cambio por medio mTesR1 (Stemcell), y se renovo todos los dfas hasta el ultimo dfa del experimento. A partir del dfa 16, las colonias que eran lo suficientemente grandes y que se podfan identificar como de tipo CME humanas (esto es, morfologfa plana con bordes definidos y grandes nucleos que conteman nucleolos prominentes), pudieron ser succionadas mecanicamente y expandidas en medio de CME humanas sobre alimentadores o sobre medio mTesR1 en Matrigel.
iii) Caracterizacion de CMPOi
La tincion de AP, la integracion del transgen, la cariotipificacion y la secuenciacion con bisulfato se realizaron como describen Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79.
El analisis STR se realizo utilizando un Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI3130, ABI). El ADN genomico fue extrafdo utilizando DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y el ARN total se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen, Paisley, USA). La qPCR se realizo con un Thermal Cycler DiceTM Real Time System (ABI7300, ABI, Foster, California, USA) y SYBR Green Premix EX TaqTM (Takara, Shiga, Japon); la beta actina se utilizo para la normalizacion y todos los artfculos se midieron por triplicado. Se prepararon micromatrices de ADN utilizando Human HT-12 V4.0 Expression Beadchip de Illumina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los chips se escanearon utilizando Illumina BeadChip Reader y los datos se analizaron utilizando Illumina BeadStudio Application. Para los teratomas, se inyectaron por via subcutanea o por via intramuscular 2 * 10 6 CMPOi en la pata trasera derecha de ratones NOD-SCID inmunocomprometidos. Los tumores fueron extirpados 8-10 semanas despues, se fijaron y se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tineron con hematoxilina/eosina. Para la diferenciacion EB, se trataron las CMPi sobre el alimentador con dispasa (Invitrogen) y se recogieron por medio de raspado. Despues de la centrifugacion, los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de CME humanas sin bFGF y se cultivaron durante 8 dfas en placas de no adherentes. Los EB fueron transferidos a continuacion a placas recubiertas con gelatina para permitir la diferenciacion de otros 8 dfas antes del procesamiento para el analisis de inmunofluorescencia.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La caracterizacion del cultivo primario y las CMPOi resultantes mostraron que, de manera rutinaria, aparedan pequenas colonias en los dfas 9-16, variando esto entre los donantes, sin patron perceptible. Muchas de estas colonias adoptaban progresivamente una morfologfa de tipo CME humanas y se recogfan a partir del d^a 16 a 25. La eficiencia de reprogramacion tambien vario entre los donantes, pero en general era bastante alta, oscilando entre 0,1% y 4%. Las CMPOi tambien se produjeron a partir de un individuo varon de 65 anos de edad, la eficiencia de reprogramacion fue menor (0,01%), pero aun significativamente mayor que la referida para las celulas de sangre periferica. Por otra parte, era posible congelar y descongelar las celulas de orina de varios donantes antes de la transduccion, y esto no alteraba la eficacia de reprogramacion. Las celulas de orina tambien podnan estar infectadas en pases posteriores aunque con una cafda menor de la eficacia.
Despues de la expansion de colonias, las CMPOi se caracterizaron por medio de procedimientos convencionales, incluyendo la tincion con fosfatasa alcalina (AP), y mostraron colonias de celulas claramente positivas con fuerte tincion AP visualizadas por la tincion oscura de toda la colonia. Estas colonias presentaron una tincion positiva adicional en la tincion por inmunofluorescencia indirecta para los marcadores ME TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog, SSEA-3 y SSEA-4. Ademas, se observo la qPCR para los genes CME endogenos mas el silenciamiento de estos transgenes. Las micromatrices de ADN demostraron una expresion genica global cercana a CME H9, ya que las unidades de fluorescencia arbitrarias de las micromatrices de las celulas ME representadas frente a las de las CMPOi muestran una pendiente lineal con un angulo de 45°. El analisis de repeticion en tandem individual (STR) de las celulas de orina de donantes y de CMPOi mostro un origen coincidente en todos los casos. Si las circunstancias eran tales, esto ultimo excluye la contaminacion poco probable y reprogramacion de celulas de un companero sexual.
Despues de la expansion de colonias, las CMPOi se caracterizaron por procedimientos convencionales, incluyendo la tincion con fosfatasa alcalina y mostraron colonias de celulas claramente positivas con fuerte tincion AP visualizadas por la tincion oscura de toda la colonia, mientras que las celulas no transfectadas no mostraban ninguna tincion para la fosfatasa alcalina. Estas mostraron un cariotipo normal despues de la integracion del transgen en el ADN genomico, y presentaron una tincion positiva adicional en la tincion de inmunofluorescencia indirecta para los marcadores ME TRa-1-60, Tra-1-81, Nanog, SSEA-3 y SSEA-4. Por otra parte, se observo la qPCR para los genes endogenos de las CME, mas el silenciamiento de estos transgenes (que se muestran en la siguiente Tabla; hTERT indica la transcriptasa inversa de la telomerasa humana). Los valores se refieren a las celulas de orina de donantes; las CME H9 fueron utilizadas como control). Las micromatrices de ADN demostraron una expresion genica global cercana a CME H9 ya que las unidades de fluorescencia arbitrarias de las micromatrices de las celulas ME representadas frente a las de las CMPOi muestran una pendiente lineal con un angulo de 45°. La secuenciacion con bisulfito mostro una extensa desmetilacion en los promotores proximales Oct4 y Nanog en 2 clones de CMPOi representativos del mismo donante. El analisis de repeticiones en tandem individuales (STR) de las celulas de orina de donantes y las CMPOi mostro un origen coincidente y las micromatrices de ADN demostraron perfil de expresion genico global proximo a las CME H9.
- Celulas de donantes UC-c0406 CMPi C1P5 UC-c0406 CMPi C4P7 UC-S0730 CMPi 2P4 UC-S0730 CMPi C3P4 UC-GZ0816 CMPi C3P3 UC-ZGZ0816 CMPi C4P2 CME H9
- OCT4
- 1 110,43 120,98 101,28 91,59 153,20 108,96 269,94
- SOX2
- 1 992,36 1331,22 4195,71 3884,33 1651,03 1133,96 1587,38
- NANOG
- 1 1178,53 856,14 111,00 113,12 1128,93 1172,23 402,32
- hTERT
- 1 11,964,73 14,498,34 1311,36 1263,01 10,149,00 7608,26 9768,02
iv) Demostracion del potencial de multi-diferenciacion de las CMPOi
Para demostrar que las CMPOi son pluripotentes, se llevo a cabo la diferenciacion no espedfica a traves de la formacion de teratoma (Figura 1) y cuerpo embrioide (EB). En ambos casos, se observo la aparicion de derivados de las capas 3 germinales, y los teratomas conteman en cambio estructuras bastante complejas sin signo obvio de necrosis o invasion de la capsula del tumor (Figura 1). A continuacion, se llevo a cabo la diferenciacion de CMPOi dirigida a linajes neuronales (celulas madre neurales, neuronas y astrocitos) (Figura 2A), cardiomiocitos (Figura 2B) y hepatocitos (Figura 2B); se detecto la acumulacion de glucogeno con tincion de acido peryodico de Schiff), que fue verificada por microscopfa de inmunofluorescencia para los marcadores adecuados y tambien la qPCR (solo para los hepatocitos y cardiomiocitos). Cabe senalar que se produjo la diferenciacion neural para 12 CMPOi correspondientes a 11 donantes, hepatocitos para 4 clones de 3 donantes, y cardiomiocitos para 14 clones de 11 donantes. Un video mostro una alta proporcion de EB con latido espontaneo (entre 30-75%). Del mismo modo, la medicion de la electrofisiologfa de los potenciales de accion (Figura 2D) y los aumentos transitorios de calcio (propiedades electrofisiologicas de cardiomiocitos de dos clones mostraron un comportamiento similar a los cardiomiocitos humanos producidos a partir de las CME humanas o CMPi derivadas de fibroblastos).
Claims (11)
- 51015202530REIVINDICACIONES1. Un metodo para generar celulas diferenciadas de interes a partir de celulas de donantes de otro tipo de celulas, que comprendei) expansion de las celulas de orina somaticas exfoliadas de la orina yii) generacion de celulas diferenciadas a partir de dichas celulas expandidas mediante la reprogramacion de dichas celulas para que se conviertan en celulas madre pluripotentes derivadas de orina inducidas (CMPOi) y la diferenciacion de dichas CMPOi a dichas celulas de interes.
- 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas de orina exfoliadas se han obtenido a partir de un individuo enfermo o sano y se seleccionan entre celulas epiteliales, fibroblastoides o cancerosas.
- 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha reprogramacion se realiza por medio de una mezcla de factores de reprogramacion exogenos que comprenden factores seleccionados entre un gen de la familia Oct, un gen de la familia Klf y un gen de la familia Sox.
- 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha reprogramacion se realiza por medio de una mezcla de factores de reprogramacion exogenos que comprenden factores seleccionados entre Sox2, Oct4, Klf4, c-Myc y Nanog.
- 5. El metodo de la reivindicacion 3 o 4, en donde dicha reprogramacion implica la expresion de factores de reprogramacion por las celulas sin integracion genomica y/o sin expresion de oncogenes.
- 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde dicha reprogramacion comprende adicionalmente la aplicacion de moleculas pequenas, ARN de interferencia pequenos o microARN que aumentan la eficacia o reemplazan uno o mas de dichos factores de reprogramacion.
- 7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dichas celulas son celulas humanas.
- 8. Un metodo para generar celulas madre derivadas de orina pluripotentes inducidas (CMPOi), que comprendei. la expansion de celulas de orina somaticas exfoliadas yii. la reprogramacion de dichas celulas expandidas para que se conviertan en CMPOi.
- 9. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente la etapa de modificar geneticamente las CMPOi, o celulas diferenciadas derivadas de las mismas, para que porte una molecula de acido nucleico que corrija un defecto causalmente implicado en una enfermedad genetica.
- 10. El uso de celulas de orina somaticas exfoliadas para la generacion de celulas madre pluripotentes inducidas.
- 11. El uso de celulas de orina somaticas exfoliadas para la generacion de celulas diferenciadas de interes, en donde dichas celulas diferenciadas se han obtenido mediante la reprogramacion de celulas de orina somaticas exfoliadas para que se conviertan en celulas madre pluripotentes inducidas (CMPi) y a continuacion diferenciando dichas CMPi a las celulas de interes.Rosetas neuralesMusculo lisoEpitelio tipo intestinal
imagen1 imagen2 Epitelio pigmentado CartflagoGlandula pequena(QCelulas tipo heurona Beta-tubulima III Map 2 e <.Cardiomiocito CTNT Actininaimagen3 imagen4 ■*3u
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| WOPCT/CN2010/002226 | 2010-12-31 | ||
| CNPCT/CN2010/002226 | 2010-12-31 | ||
| EP11152519 | 2011-01-28 | ||
| EP11152519A EP2481795A1 (en) | 2011-01-28 | 2011-01-28 | Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells |
| PCT/EP2011/073962 WO2012089669A1 (en) | 2010-12-31 | 2011-12-23 | Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2575605T3 true ES2575605T3 (es) | 2016-06-29 |
Family
ID=45464553
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11805858.5T Active ES2575605T3 (es) | 2010-12-31 | 2011-12-23 | Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9926532B2 (es) |
| EP (1) | EP2658965B1 (es) |
| JP (2) | JP2014501114A (es) |
| BR (1) | BR112013016592B1 (es) |
| CA (1) | CA2823265C (es) |
| DK (1) | DK2658965T3 (es) |
| EA (1) | EA028902B1 (es) |
| ES (1) | ES2575605T3 (es) |
| PT (1) | PT2658965E (es) |
| WO (1) | WO2012089669A1 (es) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9719068B2 (en) | 2010-05-06 | 2017-08-01 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation |
| JP2016507231A (ja) * | 2013-02-05 | 2016-03-10 | グアンジョウ インスティテュート オブ バイオメディスン アンド ヘルス、チャイニーズ アカデミー オブ サイエンスィズＧｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ | 幹細胞を使用する歯様構造物の調製 |
| US11066649B2 (en) * | 2014-03-19 | 2021-07-20 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method for inducing human cholangiocyte differentiation |
| US10174289B2 (en) | 2014-05-28 | 2019-01-08 | Children's Hospital Medical Center | Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation |
| CA2963704A1 (en) | 2014-10-17 | 2016-04-21 | Children's Hospital Medical Center | In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same |
| AU2015372420B2 (en) * | 2014-12-22 | 2021-02-25 | University Of South Australia | Method of inducing beta cells from urine-derived cells using small molecules |
| CN114058582A (zh) | 2015-01-26 | 2022-02-18 | 菲特治疗公司 | 用于诱导造血细胞分化的方法和组合物 |
| US10898522B2 (en) | 2015-08-19 | 2021-01-26 | Children's Research Institute, Children's National Medical Center | Compositions and methods for treating graft versus host disease |
| EP3371301A4 (en) * | 2015-11-04 | 2019-06-26 | Fate Therapeutics, Inc. | METHOD AND COMPOSITIONS FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF HEMATOPOIETIC CELLS |
| CA3016641A1 (en) | 2016-05-05 | 2017-11-09 | Children's Hospital Medical Center | Methods for the in vitro manufacture of gastric fundus tissue and compositions related to same |
| AU2017353982B2 (en) | 2016-11-04 | 2021-05-06 | Children's Hospital Medical Center | Liver organoid compositions and methods of making and using same |
| WO2018106628A1 (en) | 2016-12-05 | 2018-06-14 | Children's Hospital Medical Center | Colonic organoids and methods of making and using same |
| WO2018191673A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Children's Hospital Medical Center | Multi donor stem cell compositions and methods of making same |
| US12297457B2 (en) | 2017-10-10 | 2025-05-13 | Children's Hospital Medical Center | Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same |
| EP3727394A4 (en) | 2017-12-21 | 2021-09-08 | Children's Hospital Medical Center | DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF |
| KR20250163421A (ko) | 2018-07-26 | 2025-11-20 | 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 | 간-담도-췌장 조직 및 이를 제조하는 방법 |
| CN112823012A (zh) | 2018-09-12 | 2021-05-18 | 儿童医院医学中心 | 用于产生造血干细胞及其衍生物的类器官组合物 |
| KR102150489B1 (ko) * | 2019-04-09 | 2020-09-01 | 고려대학교 산학협력단 | 소변세포로부터 신장전구세포로의 직접 역분화를 유도하는 방법 및 이의 방법으로 역분화된 신장전구세포를 포함하는 신장세포 손상 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 |
| EP3976066A4 (en) | 2019-05-31 | 2023-06-28 | Children's Hospital Medical Center | Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells |
| CN112143706A (zh) * | 2020-09-27 | 2020-12-29 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法 |
| CN113122505A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-07-16 | 四川大学华西医院 | 一种通过逆病毒获取尿源诱导多能干细胞的方法 |
| WO2024157711A1 (ja) | 2023-01-23 | 2024-08-02 | ポーラ化成工業株式会社 | 上皮系細胞を用いた人工多能性幹細胞の製造方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW438973B (en) | 1995-12-19 | 2001-06-07 | Sysmex Corp | Apparatus and method for analyzing solid components in urine |
| JP3589113B2 (ja) * | 1998-09-24 | 2004-11-17 | 田辺製薬株式会社 | 腎疾患治療薬およびそのスクリーニング方法 |
| KR101722033B1 (ko) * | 2007-05-21 | 2017-03-31 | 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 | 소변으로부터의 전구 세포 및 이를 사용하는 방법 |
| US20100111914A1 (en) * | 2007-05-21 | 2010-05-06 | Yuanyuan Zhang | Stem cells from urine and methods for using the same |
| MX2010002242A (es) | 2007-08-31 | 2010-06-01 | Whitehead Biomedical Inst | Estimulación de ruta wnt en reprogramacion de celulas somaticas. |
| JP2011525794A (ja) | 2008-06-26 | 2011-09-29 | 国立大学法人大阪大学 | ｉＰＳ細胞の製造方法および製造キット |
| JP5340265B2 (ja) * | 2008-06-27 | 2013-11-13 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
| WO2010036923A1 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Salk Institute For Biological Studies | Induced pluripotent stem cells and methods of use |
| WO2010084275A1 (fr) * | 2009-01-26 | 2010-07-29 | Fred Zacouto | Procédé simplifié de reprogrammation génétique et épigénétique partielle de cellules. |
| JP2010207162A (ja) * | 2009-03-11 | 2010-09-24 | Japan Health Science Foundation | Ｂａｃクローンを用いる尿路上皮癌の発生リスク評価方法及び予後予測方法 |
-
2011
- 2011-12-23 WO PCT/EP2011/073962 patent/WO2012089669A1/en not_active Ceased
- 2011-12-23 BR BR112013016592-8A patent/BR112013016592B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-12-23 EP EP11805858.5A patent/EP2658965B1/en active Active
- 2011-12-23 DK DK11805858.5T patent/DK2658965T3/da active
- 2011-12-23 EA EA201300780A patent/EA028902B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-12-23 CA CA2823265A patent/CA2823265C/en active Active
- 2011-12-23 US US13/997,976 patent/US9926532B2/en active Active
- 2011-12-23 JP JP2013546688A patent/JP2014501114A/ja active Pending
- 2011-12-23 PT PT118058585T patent/PT2658965E/pt unknown
- 2011-12-23 ES ES11805858.5T patent/ES2575605T3/es active Active
-
2017
- 2017-04-24 JP JP2017085186A patent/JP2017169574A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2823265A1 (en) | 2012-07-05 |
| US20130323782A1 (en) | 2013-12-05 |
| CA2823265C (en) | 2019-05-21 |
| WO2012089669A1 (en) | 2012-07-05 |
| EP2658965B1 (en) | 2016-03-02 |
| DK2658965T3 (da) | 2016-06-13 |
| BR112013016592A2 (pt) | 2021-03-30 |
| BR112013016592B1 (pt) | 2022-03-15 |
| JP2014501114A (ja) | 2014-01-20 |
| EA201300780A1 (ru) | 2013-11-29 |
| EP2658965A1 (en) | 2013-11-06 |
| EA028902B1 (ru) | 2018-01-31 |
| JP2017169574A (ja) | 2017-09-28 |
| PT2658965E (pt) | 2016-06-06 |
| US9926532B2 (en) | 2018-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2575605T3 (es) | Método de generación de células madre pluripotentes inducidas y células diferenciadas | |
| CN104508131B (zh) | 通过合成的自我复制的RNA形成人iPS细胞 | |
| ES2729563T3 (es) | Derivación sin alimentadores de células madre pluripotentes inducidas humanas con ARN mensajero sintético | |
| Novak et al. | Enhanced reprogramming and cardiac differentiation of human keratinocytes derived from plucked hair follicles, using a single excisable lentivirus | |
| WO2010042800A1 (en) | Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells | |
| EP2164952A1 (en) | Human pluripotent stem cells induced from undifferentiated stem cells derived from a human postnatal tissue | |
| CN103562376A (zh) | 复壮细胞的方法 | |
| JP2015198664A (ja) | 体細胞を再プログラムするためのｒｎａの使用 | |
| JP2013535966A (ja) | 引き抜かれた毛包由来のケラチン生成細胞から誘導多能性幹細胞を生成させる方法 | |
| WO2009114949A1 (en) | Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof | |
| JP5745533B2 (ja) | 多能性幹細胞を製作するための材料と方法 | |
| ES2745704T3 (es) | Células madre y células pancreáticas útiles para el tratamiento de diabetes mellitus insulinodependiente | |
| Lorenzo et al. | Generation of mouse and human induced pluripotent stem cells (iPSC) from primary somatic cells | |
| EP2481795A1 (en) | Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells | |
| KR102849512B1 (ko) | 성체 줄기 세포로부터의 유도된 심장박동기 및 푸르키네 세포 | |
| Hu et al. | Derivation, expansion, and motor neuron differentiation of human-induced pluripotent stem cells with non-integrating episomal vectors and a defined xenogeneic-free culture system | |
| Li et al. | Generation of induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid cells by reprogramming with two factors in feeder-free conditions | |
| Matsumura et al. | Establishment of integration-free induced pluripotent stem cells from human recessive dystrophic epidermolysis bullosa keratinocytes | |
| CN110184299B (zh) | 诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程的方法 | |
| CN110029086B (zh) | 诱导体细胞重编程的因子以及使用该因子诱导体细胞重编程的方法 | |
| Tweedell | New paths to pluripotent stem cells | |
| WO2016076507A1 (ko) | 렙틴을 포함하는 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법 | |
| WO2012165740A1 (en) | Composition for improving dedifferentiation of cells and method for producing inducted pluripotent stem cells using the same | |
| CN116529361A (zh) | 使用多顺反子sox2、klf4和任选的c-myc产生诱导多能干细胞 | |
| Acosta | Identification of novel regulators of transcription in iPSC-derived cardiovascular progenitors |