PT2658965E - Método para a generação de células induzidas e células diferenciadas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO Método para a generação de células induzidas e célulasdiferenciadas A invenção refere-se a células induzidas pluripotentesestaminais e células diferenciadas e métodos para as gerar.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Células estaminais embrionárias (CES) são células derivadasa partir de blastocistos obtidos a partir da fertilizaçãoin vitro que têm a potencial de autorrenovação e de sediferenciar em qualquer tipo de célula madura de ummamífero, e.g. humano, corpo (esta propriedade éconhecida como "pluripotência")· Sob condições de culturade tecidos específicos, a CES pode ser mantida indiferenciada para prolongados períodos de tempo semperder as suas características pluripotentes. Devido aestas propriedades, os CES têm despertado enorme interessena medicina regenerativa. Potencialmente, tecidos derivadosda CES podem ser utilizados para o tratamento clínico deseres humanos (tanto em condições agudas como em doençasgenéticas e degenerativas). As CES também podem serutilizadas para o rastreio de drogas, por exemplo, paraestudar a suscetibilidade específica do tecido paratratamentos, e para modelar doenças genéticas in vitro. Noentanto, severas práticas de ética (o risco de rejeiçãoimunológica) de limitações têm dificultado seriamente aaplicação das CES na clínica e, em muitos países, ainvestigação também. A recente descoberta de que as células somáticas podem sertransformadas em iPSCs por meio de fatores exógenos (este método também tem sido chamado de "reprogramação nuclearpor fatores exógenos" (Takahashi and Yamanaka, Cell 2006;126:663-76) têm o potencial de mudar a perceção atual damedicina personalizada e também podem fornecer valiososmodelos in vitro de doenças humanas (Yamanaka and Blau,2010; Nature 465, 704-712; Lian et al., 2010. ThrombHaemost 104, 39-44) .

Surpreendentemente, iPSCs são semelhantes aos ECSs e tem opotencial para serem usados em tratamentos específicos dopaciente, assim evitando o risco de rejeição imunológica.Devido a estas características, iPSCs têm recebido grandeatenção em todo o mundo. A geração de iPSCs requer arecolha de tecido a partir do dador, a expansão das célulasdoadoras in vitro, e a exposição das células a um cocktailde fatores exógenos que são fornecidos para a célula comoproteínas purificadas, proteínas extratos, moléculas deRNA, plasmídeos não integrando plasmídeos, vírus (porexemplo, retrovirus, lentivírus, adenovirus, vírus deSendai),com ou sem cocktails químicos e com variações nascondições de cultura de células. A aplicação destes fatores tem o efeito de colónias com umamorfologia ESC-como que emerge progressivamente. Estascolónias representam colónias iPSC que podem serselecionadas e posteriormente expandidas e caracterizadaspara verificar se o seu comportamento é semelhante ao ESCs.

Até agora, iPSCs humanos foram gerados utilizando célulasdo doador de pele (fibroblastos e queratinócitos), fluidosde amniótico, tecidos extraembrionários (placenta e docordão umbilical; (Cai et al, 2010; J Biol Chem 285, 11227-11.234) sangue do cordão umbilical, membrana de periósteo,tecidos dentais, tecido adiposo, as células estaminais neurais, hepatócitos, mesenquimais derivadas de âmnio ecélulas do sangue periférico (Ye and Cheng, 2010; Regen Med5,521-530; Cai et al, 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234).A reprogramação das células a partir destes tecidos foiconseguida com frequências variadas, indicando que a célulade origem ("célula doadora"). Devido à heterogeneidade dascélulas do doador atualmente utilizadas para a geração deIPSC é dificil de definir normas para a realização detestes comparativos com iPSCs e CES e tirar conclusõessignificativas a partir dos resultados do teste. O tipo de célula doadora ideal para gerar iPSCs deve estarfacilmente acessível, reprogramável e universal (qualqueridade, sexo, etnia e condição corporal). Hoje em dia,fibroblastos dérmicos estão entre os mais utilizadas fontesde células de reprogramação, mas eles exigem não só umabiópsia desconfortável que tem de ser realizada numambiente asséptico por um especialista, mas também aexpansão prolongada antes da utilização. Eles também têmrisco de células somáticas com mutações devido à exposiçãoà luz e à radiação, e o procedimento é contraindicado emdoenças cutâneas graves ou queimaduras. Recentemente, trêsgrupos de pesquisa alcançaram a reprogramação de células dosangue periférico, sem necessidade de mobilização decélulas CD34+ foi relatado (Loh et al., 2010; Cell StemCell 7, 15-19; Seki et al, 2010; Cell Stem Cell 7,11-14;Staerk et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 20-24). Brown etal., 2010, PloS ONE, 2010, 5, 6, 1-9, descrevem a geraçãode linfócitos T derivadas de iPSCs do sangue periférico.Uma vez que estes procedimentos são minimamente invasiva,requerem uma pequena quantidade de sangue e nãonecessita de cultura de células prolongada, elesrepresentam um avanço significativo apesar do facto de quea sua eficácia é muito baixa. No entanto, as principais células doadoras usadas de acordo com estes relatórios sãocélulas T maduras, que suportam o recetor de células-Tespecífico e rearranjos, o que é indesejável em certasaplicações clínicas potenciais. Além disso, as células-Tnão levam a completa informação genética que é necessáriopara a diferenciação ilimitada em qualquer tipo de célula.

Além disso, em casos raros, de recepção/doação de sanguenão está isento de preocupações éticas, por exemplo, devidoa crenças religiosas, e pode não ser viável em pacientescom doenças infeciosas, doenças do sangue, ouimunodepressão. Dentro do último contexto, são consideradascondições que afetam a coagulação (por exemplo ahemofilia) , a leucemia ou genética adquirida (por exemplo,câncer e AIDS) e imunodepressão.

Em busca de reprogramação de novos tecidos, iPSCs tambémforam produzidos a partir de membrana de rato meningea(Qin et al, 2008; J Biol Chem, 283, 33730-33735) e célulasepiteliais mamárias (Li et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 51-63),e em humanos a partir de células-tronco periósteo etecido adiposo (Esteban et al, 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79), do cordão umbilical matriz e da placenta (Cai et al,2010; J Biol Chem 285, 11227-11234).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Para acelerar os progressos para futuras aplicações datecnologia iPSC, é desejável para fornecer iPSCs, assimcomo células diferenciadas de qualquer tipo de células,tecidos ou organoides deles derivados, a partir de célulasdo dador que representam uma fonte universal, bem comocélulas diferenciadas diretamente derivados a partir detais células dadoras. Além disso, uma vez que o isolamento de células do dador para gerar iPSCs de acordo com métodosda técnica anterior requerem usualmente um passo invasivopara se obter o tecido de interesse do doador, osinventores procuraram fornecer iPSCs derivados a partir deuma fonte de células não-invasivas e os métodospara produzir tais iPSCs. WO2008/153685 descreve um método para a produção de umacultura de células progenitoras de urina (UPCs), fornecendouma amostra simples de urina e, em seguida, o isolamento decélulas progenitoras de urina a partir da amostra. Ascélulas progenitoras têm o potencial para promovere diferenciar em outros tipos de células.

Para a obtenção de uma cultura de células diferenciadas,W02010/065239 sugere o isolamento de células estaminais apartir da urina e em seguida, diferenciando-os emdeterminados tipos de células.

Comum a estes métodos é que a diferenciação das células deurina obtidas permite apenas para um número limitado detipos de células.

Tem sido um objetivo da invenção proporcionar um métodopara a obtenção, a partir de uma célula não-invasiva obtidada célula da fonte, as células pluripotentes com umacapacidade de diferenciação que é ilimitada no que dizrespeito ao tipo de célula, em última análise gerado.

Para resolver o problema subjacente à invenção, osinventores consideraram os critérios que devem sercumpridos por uma fonte celular ideal para ser isolada apartir de indivíduos e depois reprogramados para iPSCs (quepode diferenciar-se para qualquer tipo especifico de célula) ou diretamente diferenciado (transdiferenciado",isto é diferenciado diretamente, sem a etapa intermediáriade iPSC da geração) para tipos celulares, tecidos ouorganoides específicos: as células devem ser facilmente acessíveis com nenhum ou apenas um mínimo risco associado,eles devem estar disponíveis em quantidades suficientes,universalmente presentes em ambos os machos e fêmeas (semrestrição em termos de preocupação ética, raça, idade ou oestado de saúde ou doença), e devem ser susceptíveis areprogramação com boa eficiência. Os inventoresverificaram, surpreendentemente, que as células somáticas,ou seja terminalmente diferenciadas. As células, a partirde uma urina de fonte como não-invasiva, pode sereficientemente reprogramado para iPSCs ou célulasespecíficas ou linhagens celulares de interesse. A descrição refere-se a um método para a geração de célulasdiferenciadas a partir de células de interesse a partir dedoadores de outra célula tipo, que compreende i) células expandidas a partir de uma fonte de célulasobtidas a partir de um dador de uma forma não invasiva, emque a referida célula é de origem selecionada a partir deurina, fezes, saliva, cabelo, nasais secretos, cerume,fluidos lacrimais ou do trato vaginal, e ii) a geração de células diferenciadas a partir de célulasexpandidas por a) as referidas células de reprogramação se tornaremiPSCs e, em seguida, diferenciando as iPSCs para ascélulas de interesse, ou por b) diretamente a reprogramação referida das célulaspara se tornarem uma célula de interesse diferenciada.

De acordo com uma forma de realização preferida, as referidas células doadoras obtidas no passo i) são célulasesfoliadas a partir do trato urinário que estão presentesna urina (seguidamente, estas células são designadas por"células de urina").

Seguidamente, os iPSCs derivados de células de urina sãodenominados "UiPSCs" (se não forem indicados de outraforma, por exemplo no que diz respeito à utilização de

UiPSCs, este termo abrange também iPSCs obtidos a partir deoutras células dadoras obtidas de forma não invasiva).

Na forma de realização de acordo com a qual a fonte de células é a urina, passo i) pode ser realizado de acordocom métodos conhecidos na técnica, que geralmentecompreendem os sub-paços a) recolha de urina de um dador, b) isolamento de células esfoliadas a partir da urina, e c) a expansão das referidas células esfoliadas.

As células esfoliadas ii) podem ser qualquer tipo de células encontradas na urina que seja passível dereprogramação.

De acordo com certas formas de realização, as célulasesfoliadas são células epiteliais, e.g. células tubularesrenais tal como células humanas esfoliadas proximaistubulares epiteliais (HEPTECs) .

De acordo com outras formas de realização, as células sãocélulas fibroblastóides esfoliadas. De acordo com outrasformas de realização, as células esfoliadas são célulasprogenitoras-como, células endoteliais do tipo, células do músculo-tal como lisas ou intersticiais como células comodescrito por Zhang et al., 2008; J Urol 180, 2226-2233) .

As células ii) também podem ser células esfoliadascancerosas, e.g. células cancerosas ou cancro renal oucélulas cancerosas da bexiga.

Após a coleta da urina, as células da urina sãocentrifugadas e o tipo de célula de interesse, por exemplo,HEPTECs células orfibroblastoides, são enriquecidos pelocrescimento das células num meio que favorece o seucrescimento, evitando deste modo o crescimento de célulasde um tipo de célula indesejável.

Os referidos meios são conhecidos a partir da literaturae/ou comercialmente disponíveis. A título de exemplo, meiosespecificamente num alojamento para os requisitos decélulas epiteliais incluem, mas não estão limitados a renalepitelial Meio Basal (REBM) e SingleQuot Kit CC-4127 REGM,ambos disponíveis a partir de Lonza, EpiGRO médio daMillipore, Renal Epithelial Cell Basal (ATCC), outros meiosde células epiteliais das vias aéreas incluindo ou célulasepiteliais mamárias, por exemplo, tal como aquelesdisponíveis a partir de Lonza, ATCC, ou Cellapplications,ou uma combinação dos mesmos. Do mesmo modo, o meio oumeios de comunicação com base no descrito por Wieser etal., 2008 (Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

Um exemplo de um meio adequado para o enriquecimento decélulas fibroblastoides a partir da urina é FGM®-2Fibroplast Growth Medium, também disponível a partir deLonza.

Além de células de urina, que são as células do doador preferenciais a serem utilizadas no método da invenção,outras células que tenham sido obtidas a partir de umindivíduo doador de uma forma não-invasiva podem serexpandidas e reprogramadas para se tornarem iPSCs, oudiretamente diferenciados para um tipo de célula deinteresse, por exemplo, as células obtidas a partir defezes, saliva, cabelo, secretos nasais, cerume, fluidolacrimal ou o trato vaginal. Os métodos para o isolamento ea expansão de tais células são conhecidos na arte, porexemplo para células esfoliadas a partir de cólon em fezes(Bandaletova et ai., 2002. Apmis 110, 239-246), ou a partirde células de papila dérmica a partir de cabelo (Warren etai, 1992; J Invest Dermatol 98, 693-699).

Uma outra fonte de células úteis é o fluido que é, durantea hemodiálise, inserido na cavidade peritoneal de troca desubstâncias com sangue através dos vasos sanguíneos noperitoneu, o que permite que o sangue a ser filtrado numa"semelhante" maneira como no rim. Este líquido pode serrecolhido e é conhecido por conter muitas células. "A reprogramação" [ (passo ii), uma forma de realização) ] éum termo reconhecido na técnica para a transformação decélulas somáticas em iPSCs por meio de fatores exógenos.

Nas experiências da presente invenção, a reprogramação decélulas de urina para UiPSCs foi realizada utilizandoretroviral vetores que entregam os quatro reprogramaçãofatores Sox2, Oct4, Klf4 e c-Myc ( "fatores de Yamanaka" ou"Yamanaka cocktail"), tal como inicialmente descrito porTakahashi e Yamanaka, 2006; célula 126: 663-76).

Em princípio, qualquer método de reprogramação pode serusado que seja capaz de transformar as células do doador, em células especiais de urina, para iPSCs, em particularUiPSCs. A reprogramação pode ser alcançada por um ou mais elementosseleccionados a partir de um gene da família Oct, um geneda família Klf, e um gene da família Sox. Além disso, acombinação de fatores pode compreender um ou mais genesprodutos de um PTU da família de genes, um gene da famíliaKlf, em conjunto com uma citocina. A citocina pode ser,pelo menos, um fator de crescimento de fibroblastos básicos(bFGF) e fator de células estaminais (SCF).

De preferência, estes fatores são inseridos em vetores deexpressão não-virais que são introduzidos numa célulasomática.

Se os UiPSCs, ou células diferenciadas dos mesmos,destinam-se a aplicação terapêutica, são utilizados métodosque não empregam oncogenes e/ou não envolvem integração doADN que codifica o fator de reprogramação para o indivíduode DNA genómico.

Assim, os métodos preferidos da invenção para gerar UiPSCsou células diferenciadas dos mesmos, para efeitos deterapêutica não empregam lentivírus ou retrovirus ou vírusmodificados de uso de tal modo que o risco de integraçãogenómico dos transgenes e efeitos secundários indesejáveisassociados com essa integração são minimizados oucompletamente abolidos. Além disso, tem de ser consideradoque a integração do transgeno tem o risco de mutagénese deinserção, que pode ser associado com tumorigenicidade nopaciente tratado.

Os métodos preferidos para gerar UiPSCs para aplicação na terapêutica são aquelas que evitam a integração genómicados genes de reprogramação (revisto por Sun et ai, 2010;Cell Cycle 9:5, 880-885) e/ou evitar que os oncogenes como KLF4 ou c-myc, por exemplo • usando Cre-recombinase lentivirus sujeitos a impostosespeciais (Soldner et ai, 2009; Célula 136:964-77); • usando OCT4, SOX2 e NANOG sozinho, omitindo c-Myc e Klf4(Li et ai, 2010; Cell Reprogram. Jun 12 (3) :237-47); • realização de derivação de células iPS humanas livre devirus e livre de transgenes usando oriP/EBNAl (antigenonuclear de Epstein-Barr-1)baseados em vetores episomaisbaseados na reprogramação de fatores Octs4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, e Lin28 SV40LT (Yu et ai, 2009; Science 324:797-801); • usando uma técnica livre de reprogramação sem virususando piggyBac vetores de expressão transposon carregandouma policistronic transgene dos fatores de Yamanaka(Woltjen et ai, 2009, Nature 458:766-70); ADN minicirculonão-viral (Jia et ai. ,2010; Nat Métodos 07 de Março (3) :197-9); • métodos à base de proteínas recombinantes, e.g. otratamento das células com os quatro fatores Yamanaka sob aforma de recombinante de proteínas conjugadas com umpéptido de penetração celular (cpp) (Kim et al, 2009; CellStem Cell. 4:472-6); expondo as células para um cocktail defatores exógenos que são fornecidos para a célula comoproteínas purificadas, extratos de proteína com ou semtratamento químico prévio (Cho et al, 2010; Sangue 116, 386-395; Han et al, 2010; PLoS One. Aug 19; 5 (8) : 122 97 ;Solanki and Lee, 2010; ChemBioChem 11, 755-757). • adicionando pequenas moléculas, por exemplo, ácidovalpróico, um inibidor da histona de acetilasse (Huangfu etal, 2008; Nat. Biotechnol 26:795-7; Huangfu et al., 2008;Nat Biotechnol 26:1269-1275); ou um número de outrasmoléculas pequenas, por exemplo inibidores de glicogéniosintase quinase 3(GSK-3), MEK-ERK caminho e inibidores davia de TGF3 para aumentar a eficiência de ou substituiralguns dos fatores de reprogramação (Lin et al, 2009;Métodos Nat. 6:805-8; Li et al, 2009; Cell Stem Cell 4:16-9; Shi et al. , 2008; Cell Stem Cell 2: 525-8; Ichida etal., 2009; Cell Stem Cell 5:491-503); ou a adição devitamina C (Esteban et al, 2010; Cell Stem Cell 6,71-79); • A adição de pequenos RNAs de interferência (siRNAs), porexemplo, p53 siRNA, para melhorar a eficiência dereprogramação pelo Yamanaka fatores (Zhao et al, 2008;3:Cell Stem Cell 475-9); • A adição de micro-RNAs (miRNAs) para os cocktails dereprogramação (por exemplo, Wilson et al, 2009; Stem CellsDev. 18:749-58;Judson et al. , 2009; Nat Biotechnol. Maio;27(5) : 459-461) . • entregar ARNm ou ARNm modificado, código para areprogramação de fatores (Yakubov et al, 2010; BiochemBiophys Res Commun 394, 189-193), em que, no caso demodificação, isto é de tal modo que aumenta a tradução e/ouestabilidade, e.g. como descrito por Kowalska et al,, 2008,RNA. Junho 2008,-14 (6):1119-1131.

Segurança/e ou a eficiência da reprogramação pode ser ainda mais otimizada, mudando o meio de cultura de tecidos ouo meio ambiente, por exemplo a substituição de meioscontendo soro por Knock Out Serum (KSR, Invitrogen),ou mudando o meio ambiente (por exemplo, baixa oxigenaçãousando incubadoras especificas em que a concentração de oxigénio pode ser controlada).

Otimização pode, por exemplo, ser alcançada fazendoexperiências em série para uma determinada população decélulas expandidas de urina. A titulo de exemplo, ascélulas de urina a partir de um número de indivíduos podemser cultivadas em meios diferentes (por exemplo, célulasepiteliais ou fibroblastos médios) antes da infeção com oretrovirus produzir os fatores exógenos, de modo aselecionar para populações de células que são maisfacilmente reprogramadas. Após a infeção, diferentescocktails de média são empregues (com mudanças emdiferentes pontos de tempo), contendo soro ou isento de soro, e com ou sem produtos quimicos adicionados (veracima) para ver em que condições de eficiência podem seralcançadas. Além disso, as células podem ser infetadas comdiferentes combinações de fatores, por exemplo, a 4Yamanaka fatores com ou sem Nanog (ou outros fatores, porexemplo, microRNAs). Ele também pode ser testado comciclos de infeção (1, 2 ou 3 ciclos) os melhores resultadospodem ser obtidos. Quando as células se dividem no alimentador células, diferentes tipos de camadas alimentadoras podem ser utilizados, por exemplo, fibroblastos de rato, fibroblastos humanos, amnióticos,membrana amniótica, etc.

Reprogramando diretamente a célula doadora, sem antes geraruma iPSC, para se tornar uma célula diferenciada de interesse [passo ii) , forma de realização b) ] é também conhecido como "transdiferenciação", o que significa que aalteração de uma célula ou tecido de umestado diferenciado para outro (Vierbuchen e Wernig, 2011,Nat Biotechnol 2011;29 (10):892-907.

Nesta forma de realização, os fatores de transcriçãoespecíficos do tipo célula são sobre expressos usandovetores virais, o plasmideo baseado em vetores etc., comopara os fatores de reprogramação de iPS.

Para a transdiferenciação direta de células de urina (ououtras células obtidas não-invasivas) em neurônios, os 3fatores Ascll, Brn2, e Mytll pode ser usados como descritospara a conversão de fibroblastos humanos para os neurônios(Vierbuchen et ai., 2010; Nature 463, 1035-1041), ouhepatócitos para os neurônios, como descrito por Marro etai., 2011, Stem Cell. 04 de outubro;9(4):374-82.

Efe et al., 2011, Nat Cell Biol. 2011 Mar; 13(3):215-22,descrevem um método pelo qual os fibroblastos de ratoembrionários (MEFs) podem ser diretamente reprogramadospara contrair espontaneamente manchas de cardiomiócitosdiferenciados.

Para a conversão de células do dador de urina paracardiomiócitos, um método pode ser utilizado que tem sidoêxito, obtendo-se os cardiomiócitos de mesoderma, usandoGATA4, Tbx5 e Baf60c (Takeuchi et al, 2009; Nature459,708-711).

As transdiferenciação de células hematopoiéticas podem serfeitas por meio de Oct4 super expressão sozinho (Szabo etal.,2010; Nature 468,521-526). A triagem para fatores que transdiferenciam células deurina para os neurônios, queratinócitos, fibroblastos,cardiomiócitos, fígado, rim, células do sangue, etc., podemser realizadas do mesmo modo com os protocolos detransdiferenciação acima descritos e o protocolo inicialYamanaka (Takahashi e Yamanaka, 2006) . Com base noconhecimento rico sobre a transcrição especifica de fatoresde linhagem, tais fatores podem ser testados em combinações(como nos artigos acima descritos) para o seu potencial decélulas derivadas diretamente de urina transdiferenciam emcombinação com condições de cultivo que são comummenteusados para manter e cultivar o tipo especifico de célulade interesse. Experiências em série de acordo com osprincípios acima descritos para otimizar a eficiência dereprogramação que pode também ser feito para otimizar aeficiência de transdiferenciação.

Embora o método da invenção seja de preferência utilizadopara a produção de UiPSCs ou células diferenciadas a partirde células de dador humano, pode também ser aplicada acélulas de outros mamíferos (por exemplo macaco, cavalo,cão, gato, porco, ratazana e ratinho). A produção de células diferenciadas de interesse, sejadiretamente ou através das UiPSCs intermediárias, a partirde células da urina esfoliada, proporciona um método-reprodução fácil e universal para a geração de células ESC-como de alta qualidade. Tem a vantagem que a recolha dascélulas do dador pode ser executada em qualquer lugar e emqualquer um, desde que as medidas de higiene minimassejam tomadas, e de qualquer ser humano, independentementeda idade, sexo ou condição. Além disso, o fluido deperfusão para o peritónio para substituir a falta da funçãorenal em pacientes com insuficiência renal que necessitam de diálise, ou pacientes após operações à bexiga que nãoproduzem urina, pode ser usado como uma fonte de célulaspara a reprogramação ou transdiferenciação. 0 método da invenção proporciona uma oportunidade únicapara comparar métodos de reprogramação em todo o mundo eavançar no campo para a aplicação da clinica de iPSCs defor segura.

Em principio, UiPSCs, ou iPSCs obtidos pelo método doinvento a partir de outra forma não invasiva decélulas do doador, podem ser utilizados para os mesmos finsque os iPSCs conhecidos na arte gerados a partir de outrostipos de células.

As caracteristicas vantajosas de UiPSCs tornam-se úteis,tanto a partir de uma pesquisa ou de um ponto de vistacomercial, o último, por exemplo, fornecendo por UiPSCs, oucélulas, linhagens de células ou tecidos, Organoides, delesderivados, a partir de um indivíduo saudável ou de umpaciente com uma doença), por exemplo, para fins derastreio.

UiPSCs podem ser usados para gerar células para a reparaçãode tecidos ou de substituição, evitando questões de éticaimunológica que são inerentes ao uso de células-troncoembrionárias.

UiPSCs da invenção, tecidos ou Organoides deles derivados,respetivamente, são particularmente úteis para otratamento de pacientes com queimaduras graves, os quaisserão fornecidos com pele artificial obtida a partir decélulas diferenciadas, derivadas a partir de células deurina, quer diretamente quer através UiPSCs.

Para o tratamento de doenças do sangue, UiPSCs ou célulasdiferenciadas obtidas a partir destas células, ou obtidaspor transdiferenciação direta de células de urina, podemser infundidas em pacientes que sofrem de, por exemplo,leucemia induzida por mutação somática.

No tratamento de hemofilia, UiPSCs geneticamente corrigidospodem ser utilizados para transplante autologos, eno caso de doenças que diminuem a quantidade de célulasimunes como, por exemplo em HIV, UiPSCs convertidas emcélulas hematopoiéticas podem ser utilizadas parareconstituir a população de células imunitárias porinfusão. Na anemia falciforme, gene corrigido as iPS tambémpode ser utilizadas (Hanna et ai, 2007;Science 318,1920-1923).

UiPSCs (ou iPSCs obtidas a partir de outras células dadorasde forma não invasiva) podem ser utilizadas, como asconhecidas iPSCs na técnica, na terapia de doençasdegenerativas, em que um tipo específico de célula outecido é destruído e o corpo é incapaz de a repor. Emcondições degenerativas, por exemplo doença, o tratamentode Parkinson com UiPSCs, fornece o local afetado comcélulas indiferenciadas que podem então ser utilizadas paraa reparação de danos nos tecidos. Assim, a terapiacom UiPSCs vai reintroduzir novas células ou tecidossaudáveis para cumprir a mesma função. UiPSCs também têm opotencial de ser utilizados para desenvolver novos órgãosinteiros que serão compatíveis com o paciente e reduzir aspossibilidades de rejeição de transplante uma vez que sãocélulas autologos, isto é, células derivadas de células dodoador doente a ser tratado, por exemplo no casode diabetes, insulina de ilhotas secretoras como os cachos podem ser gerados como os iPSCs (Tateishi et al, 2008;Am JPhysiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

UiPSCs também pode ser utilizados (como revisto por iPSCsLau et al, 2009;F1000 Biol Rep. 1:84) para a geração de linhas celulares de doenças especificas que são úteiscomo modelos de doenças e/ou para o rastreio de candidatosa drogas in vitro e/ou para corrigir defeitos genéticos porterapia genética. A geração de células terminalmentediferenciadas (por exemplo, hepatócitos ou cardiomiócitos)de UiPSCs (ou obtidas por transdiferenciação diretamente apartir de células de urina) vontade, por exemplo, permitirque o rastreio e ainda mais perfis de compostos sobre arespetiva linhagem celular, com o objetivo de definir aespecificidade do paciente (por medicação personalizada) ouaplicabilidade geral de um composto. A titulo de exemplo,tal como descrito por Dimos et al. 2008 (Science Aug 29;321 (5893) :1218-2) . UiPSCs podem ser usados como um modelo para a forma familiar da esclerose lateral amiotrófica;ou como um modelo, ou para o tratamento, respetivamente, deoutras doenças genéticas, tal como descrito por Park etal. , 2008 (Cell setembro 5; 134 (5):877-8), produzido a partir de células iPS de pacientes com doenças genéticasdiferentes 10, incluindo a doença de Parkinson,Diabetes tipo-1, de Duchenne e Becker, distrofia muscular,deficiência de adenosina-desaminase relacionados com graveimunodeficiência combinada com, sindrome de Shwachman-Bodian-Diamond, Gaucher tipo de doença III, doença deHuntington, sindrome de Down, e o estado do portador desindrome de Lesch-Nyhan. Além disso, os modelos baseados emcélulas humanas de atrofia muscular espinal e doença deParkinson podem ser gerados de forma semelhante comodescrito por Ebert et al. 2009 (Nature 15 de janeiro; 457 (7227): 277-8) e Soldner et al, 2009 (Cell Mar 6;136 (5): 964-77), ou UiPSCs derivadas de células de um paciente comhomozigótica beta-talassemia podem ser utilizadas de formasemelhante como descrito por Ye et ai, 2009 (Proc Natl AcadSei USA Jun 16; 106 (24) :9826-3) para iPSCs derivadas apartir de fibroblastos da pele, os quais foramsubsequentemente diferenciados em hematopoiéticasprodutoras de células de hemoglobina. Tais UiPSCs, medianteengenharia genética, podem produzir células hematopoiéticasautologos que funcionam normalmente. UiPSCs também podemser utilizadas para corrigir os defeitos genéticos empacientes com anemia de Fanconi, tal como descrito por Rayaet ai., 2009 (Nature Jul 2,-460 (7251):53), que deriva decélulas iPS a partir de fibroblastos dérmicos colhidos depacientes com anemia de Fanconi, corrigidos utilizandovetores lentivirais que codificam para FANCA e FANCD2, ecélulas somáticas derivadas subsequentemente que eramfenotipicamente livres de doenças.

UiPSCs também podem ser utilizados como as iPS geradas porLee et ai, 2009 (Nature Sep 17,-461 (7262):402) que gerou asiPSCs de pacientes com da autonomia familiar (FD), re-diferenciada das células iPS e usou o in vitro modelo parapesquisar drogas candidatas.

Outro exemplo de uma doença para a qual UiPSCs têmpotencialmente um grande valor como um modelo de doença, éPrader Willi (Yang et ai, 2010;J Biol Chem 285, 40303-40311). Outros exemplos de doenças genéticas para as quaissão usadas terapia de genes UiPSCs tem um grande potencial,são Epidermólises bolhosas (por exemplo por mRNA K14reprogramação, como descrito por Wally et ai., 2010;Hum MolGenet 19, 4715-4725; Wally et ai., 2008; J Invest Dermatol128, 568-574). Geralmente, terapia genética baseada emUiPSCs geneticamente modificadas possuem maior potencial para o tratamento de doenças causadas por uma únicadesordem genética; Até à data, ca. 4000 estas doençasgenéticas têm sido descritas.

Nos modelos de doença acima utilizados que usam terminaisde células diferenciadas, tais células podem, emalternativa, ser obtidas a partir de UiPSCs, ser obtidaspor reprogramação direta das células do doador. Para afinalidade do presente invento "Reprogramação direta" éusada como sinónimo de "transdiferenciação", tal como aquidefinido.

Se as células do doador forem células cancerosas, porexemplo, células cancerosas renais ou na bexiga,representando presumivelmente estágios iniciais decancro, as UiPSCs ou células diferenciadas são úteis comomodelos para o respetivo cancro. A terapia genética compreende a inserção, alteração, ou aablação de um ou mais genes no interior das células de umindivíduo, para corrigir um efeito genético que causa umadoença. Até agora, principalmente doenças monogénicas, quesão causadas por mutações no gene individuais, têm sidoconsiderados para o tratamento. A forma mais comum deterapia genética envolve a inserção de genes funcionaisnuma localização genómica não especificada de modo asubstituir um gene mutado. Uma mutação pode também serdiretamente corrigida.

Para as aplicações de terapia genética, as célulasgeneticamente modificadas são UiPSCs ou células delasderivadas ou diferenciadas (ou obtidas por reprogramaçãodireta das células do doador); Alternativamente, emboramenos preferida, as células dadoras expandidas podem ser geneticamente modificadas antes da reprogramação. No âmbitoda invenção, as células geneticamente modificadas são paraser utilizadas prevalentemente na terapia de genessomáticos. Uma vez que a correção dos defeitos genéticos érealizado in vitro antes da reinfusão ou da transplantaçãodas células diferenciadas UiPSCs ou derivadas (ou obtidaspor reprogramação direta das células do doador), o risco detransferência de genes para a linha germinal sãominimizados. As células corrigidas vão ser infundidas outransplantadas como células diferenciadas derivadas deUiPSCs (ou diretamente sem transdiferenciação iPSanteriores de reprogramação) , a fim de complementar ousubstituir tecidos e órgãos não-funcionais. 0 gene decorreção pode ser introduzido nas células de acordocom métodos conhecidos na arte, por exemplo por vetoresvirais (modificados para minimizar o risco de reativação)incluindo retrovirus, adenovirus, virus adeno-associados,lentivirus, virus Herpes simplex, usando os vetoresbaseados em plasmideo, ou mesmo numa ADN. A correção de defeitos do gene pode ser realizada de váriasmaneiras, por exemplo por entregar o ADN que codificacorretamente o gene funcional, ao derrubar o gene mutado,entregando shRNA ou miRNA, usando proteínas de dedos dezinco para executar knock-out ou recombinações, ouutilizando vetores que permitem eventos trans-splicing.

Pode prever-se que, devido à forma não-invasiva de obtençãode células do dador, pode haver uma grande aceitaçãopor indivíduos saudáveis para ter, com antecedência e deforma profilática, UiPSCs preparada e armazenada derivadada sua própria urina, bem como as linhagens celularesderivadas, organoides ou tecidos, como a pele artificial,que irá permitir uma utilização incitadora no caso do surgimento de uma doença grave ou uma lesão, como umaqueimadura.

Os fibroblastos, queratinócitos ou pele artificial gerada apartir de UiPSCs (Bilousova et ai, 2010;J Invest Dermatol.Dec 9),derivada de células do dador de indivíduos comdiferentes tipos de pele, também podem ser úteis naindústria de cosméticos para o teste.

UiPSCs pode ser também útil para a clonagem de animais,especialmente mamíferos, por exemplo, cavalos de corrida ouanimais de estimação).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 Hematoxilina/eosina slides manchadas de teratomascompreendendo derivados de complexos das 3 camadasgerminativas produzidas com dois clones representativo deUiPSC

Figura 2 A:Fase de contraste e fotografias deimunofluorescência de células neuronais semelhantes eproduzidos seguindo um protocolo relatado a partir de umclone UiPSC representativo. B: Um clone UiPSC representante foi diferenciado em célulasde cardiomiócitos-como usando um protocolo relatado.Fase de contraste, de coloração PAS e imunofluorescência defotografias. C: Um clone representativo de UiPSC foi diferenciado emcélulas de hepatócitos-como usando um protocolo relatado.Fase contrastante, de coloração PAS e de imunofluorescênciade fotografias. D: As ações potenciais medidas em cardiomiócitos derivadosde um clone UiPSC representativo.

EXEMPLO

Materiais e métodos

Microscopia de imunofluorescência

As células foram fixadas em 4% para formaldeido durante anoite, lavadas e permeabilizadas em solução de bloqueio(PBS contendo 3% de soro normal de cabra e 0,2% de TritonX-100) durante 30 minutos. Em seguida, elas foram incubadascom anticorpos primários em solução a 4 ° C durante anoite, lavadas duas vezes e incubadas com os anticorpossecundários correspondentes durante 1 hora à temperaturaambiente. As células foram lavadas duas vezes e coradas comDAPI (Sigma) durante 5 minutos, e em seguida foramobservadas e fotografadas usando um microscópio confocalLeica TCS SP2 Spectral (Leica Microsystems GmbH,Wetzlar, Alemanha). Antes da imunofluorescência, áreasbatendo foram cortados com uma tesoura, coletadas num tubode 1,5 mL com baixo teor de cálcio PBS e deixado durante 30minutos à temperatura ambiente. Estes aglomerados decélulas foram transferidos para enzimas num tampão contendo0,5-1 mg/mL de colagenase 2 e incubou-se a 37°C durante 30-40 minutos. A digestão foi terminada com DMEM/F12 de Ham1:1 (Hyclone) , 10% de soro fetal bovino (FBS;PAA),

SingleQuotKit CC-4127 REGM (Lonza). As amostras foram entãocentrifugadas e o sedimento re-suspenso em DMEM /F12 de Ham1:1 (Hyclone), 10% de soro de fetal de bovino(FBS;PAA),SingleQuotKit CC-4127 REGM (Lonza). As suspensõesde células foram plaqueadas em lamelas revestidas com gelatina e cultivou-se a 37°C durante pelo menos 2 diasantes da fixação e imunofluorescência. Ά diferenciação especifica de tecido e mediçõeseletrofisiológicas

Neuronal, de hepatócitos e cardiomiócitos foram realizadase diferenciadas como descrito (Pankratz et al., 2007,

Stem Cells 25, 1511-1520; Song et al, 2009, Cell Res 19,1233-1242; Zwi et al., 2009, Circulation, 120, 1513-1523). N2 e B27 foram adquiridos a partir de Invitrogen, aheparina foi adquirida de Sigma, EGF foram adquiridos de R&D Systems. Activina A oncostatina M foram adquiridos apartir de R&D System (Minneapolis, MN, USA), BMP2, FGF4,HGF e KGF de PeproTech (Rocky Hill, USA), e dexametasona deEnzo Life Sciences (Farmingdale, USA). RPMI 1640, hepatoZYME-SPF, Ácido periódico de Schiff (PAS) decoloração foi realizada utilizando um kit adquirido naPolysciences (Warrington, USA) . Caracterização deeletrofisiológica de iPSC-derivados de cardiomiócitos (dia23) foi feito usando o padrão Whole-cell patch-clamp pararegistar a ação potencial de fenótipos (HEKA InstrumentsInc., Southboro, MA) (Chan et al., 2009 J Cardiovasc

Electrophysiol 20, 1048-1054). Pipetas de Patch foram preparadas a partir de 1,5-mm de boro silicato de paredefina usando tubos de vidro uma micropipeta extrator SutterP-97 e tinha resistência tipica de 3-5 ΜΩ quando preenchidocom uma solução interna contendo (mM): 110 K+ de aspartato,20 KC1, MgC12, 0,1, Na-GTP 0,1, 5 Mg-ATP, 5 Na2- fosfocreatina, 5EGTA,10 HEPES, e o pH ajustado para 7,3 comKOH. A solução do banho de Tyrode externa consistiu em(mM): 140 NaCl, 5KC1, lMgC12, 0,4 KH2P04, 1,8 de CaC12, 10glicose, 5 HEPES, e o pH ajustado para 7,4 com NaOH. Aatividade espontânea elétrica foi medida enquanto os cardiomiócitos iPSC-derivados foram deixados de formapassiva, sem entrada de corrente. Vinte consecutivas açõespotenciais de queima espontânea de cardiomiócitos iPSCderivados foram registados para garantir formas de ondaestáveis para analise. Os dados foram corrigidos para ospotenciais de junção liquida de +15,9 mV. OS transientes decálcio foram detetados com imagiologia confocal de cálcioutilizando um protocolo descrito anteriormente (Ng et ai,2010;JMol Cell Cardiol 48, 1129-1137). Resumidamente, oscardiomiócitos iPSC derivados isolados foram carregados com5μΜ de Fluo-3 AM (Invitrogen) durante 25 minutos a 37°C emsolução de Tyrode contendo (mM) : 140 NaCl, 5KC1, 1 MgC12,0,4 de KH2P04, 1,8 CaC12, 10 glicose, 5 de HEPES, a pH 7,4.Transientes de cálcio foram gravadas com um sistema deimagem confocal (versão Olympus Fluoview System 4.2 FV300TIEMPO) montado num Olympus microscópio vertical (1X71) edepois quantificados como fluorescência subtraida-fundointensidade normalizada que muda para o fundo subtraído defluorescência da base. Os dados foram alimentados no Félix32(Photon Technology International) para análise. i)coleta de urina e expansão celular

Recipientes apropriados (até 500 ml) foram esterilizadosantes da coleta de urina. Apenas o fluxo médio de urina foirecolhido em recipientes estéreis. O volume usual deespécimes era de 150-200 mL. As amostras de urina foramentão transferidas dentro de um capuz de cultura de tecidosem tubos de 50 ml e estes tubos foram centrifugados a 400 gdurante 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadantefoi cuidadosamente descartado dentro de um capuz de culturade tecido, deixando aproximadamente 1 mL ou menos de urinano tubo. Os sedimentos foram re-suspensos e individualmentetodos os tubos de 50 mL provenientes de uma recolha de amostra foram reunidas para um único tubo de 50 mL. Cercade 10 mL de PBS contendo ampotericina B epenicilina/estreptomicina foram adicionados. As amostrasforam centrifugadas a 400g durante 10 minutos. Osobrenadante foi eliminado, deixando apenas cerca de 0,2 mlde amostra. Cerca de 1 ml de meio primário foi adicionadopara re-suspender o sedimento celular. A receita do meioprimário contido DMEM/Ham's F12 1:1 (Hyclone), 10% de sorofetal bovino (FBS;PAA), SingleQuotKit CC-4127 REGM (Lonza),ampotericina B, e penicilina/estreptomicina. As célulasforam transferidas para placas de 12 poços revestidas comgelatina-L em 1 mL de meio primário. Os primeiros 2 dias aalgumas centenas de mL de meio primário foram adicionadospara reter os antibióticos concentrados e manter o nivel denutrição para cima. Nos dias seguintes, o meio foicuidadosamente alterado para REBM (Renal Epithelial BasalMedium, Lonza) meio contendo SingleQuot Kit de CC-4127 REGM(Lonza) (a combinação de dois é referido como meio decélulas de urina) , o processo não foi levado para foracompletamente para permitir a presença de fatores secretospelas células de urina e de evitar o stress desnecessário.Células visiveis/colónias apareceram rotineiramente após 3-6 dias. A primeira mudança completa de midia foi feita apósas primeiras células/colônias serem vistas. As célulasforam divididas numa superfície maior auxiliada por0,25% de tripsina contendo 1 mM de EDTA quando a culturacresceu confluente. Este e outros procedimentos foramaprovados pelo comité de ética do Guangzhoul Institutes ofBiomedicine and Health. RPTECs foram geradas como descritopor Wieser et ai., 2008, Am J Physiol Renal Physiol 295,F1365-1375, e mantidas em meio de células urina.Fibroblastos foram obtidos a partir de fibroblastos da pelea partir do repositório de células compradas a Coriell e mantidas em DMEM (Invitrogen) + 10% (Vol/vol) de soro fetalde bovino (FBS; Hyclone). À primeira vista, as culturas de células de urina consistemprincipalmente em células escamosas (provavelmente a partirda uretra) e algumas células do sangue (principalmenteeritrócitos), mas depois de 2-3 dias essas célulasdesapareceram e foram substituídas por pequenas colónias (3por amostra em média), que cresceu rapidamente. Estascolónias correspondem a 2 morfologias principais: tipo 1 outipo 2, de acordo com relatórios anteriores sobre oisolamento de células de urina (Dorrenhaus et ai, Arch

Toxicol 2000;74, 618-626). Tipo 1 de células tendem a ser mais arredondadas e crescem fortemente ligados acélulas vizinhas, sugestivas de um fenótipo epitelial. Tipocélulas 2 foram moderadamente mais alongadas e tenderam acrescer mais um pouco dispersas. Em algumas coleções deamostras todas as colónias correspondem para um dos tipos2, mas em outros foram misturados. Estas culturas de células foram reunidas ao atingir alta densidade e dividir para melhor caracterização ou reprogramaçãoparalelas. Essas enriquecidas em células tipo 1 exibidajunções de células positivas bem-formadas para E-caderina ebeta catenina (marcadores aderentes de junção), e ZO-1(Zonula occludens-proteina-1; um marcador de junçãoestanque), conforme avaliado por microscopia deimunofluorescência. Eles eram também positivos para o intermediário de queratina do filamento 7, um marcadorepitelial, e o túbulo marcador renal proximal CD13. Alémdisso, a distribuição de actina foi cortical em vez defibras de stress. Quantitativa PCR em tempo-real PCR (qPCR)também apoiou uma predominante de origem epitelial, comodemonstrado por análise de E-caderina, ocludina e claudina1 (proteínas apertado de junção), e a Renal proximal túbulo soluto família transportadora-2 SLC2A1. Células epiteliaisrenais proximais (RPTECs; Wieser et al., 2008;Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375) e fibroblastosda pele foram utilizados como controlos positivos enegativos, respetivamente, para a imunofluorescência eqPCR. Tipos de células 2 enriquecidas mostram umaimunofluorescência de padrão bastante semelhante, mas aintensidade foi mais suave e a distribuição mais desigual;qPCR os resultados foram igualmente comparáveis. Em ambosos casos, pouca coloração para os marcadores defibronectina de fibroblásticas como em vimentina foiobservada. ii) UiPSC geração e expansão

As amostras de 12 jovens adultos ambos de origem chinesa oucaucasiana foram reprogramados, 7 correspondente ao sexomasculino e 5 a fêmeas. Células de urina em passagens 2-3foram transduzidas com retrovirus que produzem Sox2, Klf4,Oct4 e c-Myc (Cai et al, 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Esteban et al, 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79):Plasmídeos retrovirais produzem fatores de transcriçãohumana Oct4, Sox2, Klf4 e c-myc foram adquiridos a Addgene(Cambridge, MA, USA) . Os sobrenadantes virais foramcolhidos em 2 dias consecutivos começando 48h após atransfeção. Células de urina 2-4 com passagens foramtripsinizadas e semeadas em pratos de seis poços. 60.000células foram adicionadas por poço. As células foraminfetadas com os sobrenadantes virais gerados portransfeção de células 293T (usando Lipofectamina 2000,Invitrogen) com vetores retrovirais pMXs (Addgene) contendoo cDNAs de humano Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Duas rodadas deinfeção foram realizadas sucessivamente (12 horas cada).Polibreno (Sigma) foi adicionado para aumentar a eficiência da infeção. Após a segunda ronda de infeção (eficiência dainfeção foi de quase 100%, tal como demonstrado através datransdução de controlo com GFP-expressando vetores), o meiode cultura de tecido das células transduzidas foi mudadopara meio de células de urina, e renovado diariamente. Nodia 3 ou 4, as células foram tratadas com tripsina e onúmero contado. Rotineiramente, 50.000 células foramsemeadas sobre uma camada de alimentadores numa placa decultura de 10cm e utilizando um meio de ESC humano (F12[Invitrogen] + 20% KSR [Knock-out Serum, Invitrogen] + 10ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos básico +aminoácidos não essenciais [Invitrogen], L-glutamina, ebeta mercaptoetanol), que foi renovada diariamente. No dia5, o meio foi mudado para humanos ESC médias + 1 mM ácidovalpróico (VPA;Sigma) ou meia ESC media+meio dFBS(consistindo de DMEM alta glicose médio [Invitrogen] + 20%humana definido a partir de soro fetal de bovino definido[FBS, Hyclone] + VPA.VPA só foi mantida a partir do dia 5 a12. O meio foi mudado para meio mTesRl (Stemcell), erenovada diariamente até ao último dia da experiência. Apartir do dia 16, aquelas colónias que eram suficientementegrandes e identificáveis como ESC-como humano (esta é amorfologia plana como definem as fronteiras e grandesnúcleos contendo nucléolos proeminentes), podem serretirados mecanicamente e expandidas em meio CES humano emalimentadores ou na forma mTesRl em Matrigel.

iii) caracterização de UiPSC

Coloração AP, a integração do transgeno, cariotipagem, esequencialmente bissulfato foram realizadas como descritopor Cai et ai., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Estebanet ai., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79. A análise STR foi realizada utilizando um aplicadoBiosystems Genetic Analyzer (ABI3130, ABI) . 0 ADN genómicofoi extraído utilizando-se o kit de tecido DNeasy (Qiagen,Hilden, Germany) e o RNA foi totalmente extraído usandoTrizol (Invitrogen, Paisley, USA). qPCR foi realizadautilizando uma térmica Cycler DiceTM Time Real System(ABI7300, ABI, Foster, Califórnia, USA) e pré-mistura SYBRGreen Premix EX TaqTM (Takara, Shiga, Japão); beta actinafoi utilizada para normalização e todos os itens forammedidos em triplicado. Micra arranjos de DNA foramrealizados utilizando Humano HT-12 V4.0 Expressão daIllumina Beadchip de acordo com as instruções dofabricante. Chips foram digitalizados usando IlluminaBeadChip Reader e os dados analisados através da aplicaçãoda Illumina BeadStudio. Para teratomas, 2X106 UiPSCs foraminjetados por via subcutânea ou por via intramuscular napata traseira direita de ratinhos NOD-SCIDimunocomprometidos. Os tumores foram excisados 8-10 semanasdepois, fixados, e embebidos em parafina, seccionados ecorados com hematoxilina/eosina. Para EB a diferenciação,iPSCs em alimentador foram tratados com dispase(Invitrogen) e recolhidas por raspagem. Após acentrifugação, os sedimentos celulares foram re-suspensosCES em meios humanos de bFGF e cresceram durante 8 dias emplacas não aderentes. EBs foram então transferidasaos pratos revestidos com gelatina para permitir adiferenciação durante mais de 8 dias antes do tratamentopara a análise de imunofluorescência. A caracterização da cultura primária e as UiPSCsresultantes mostraram que pequenas colónias apareceramrotineiramente nos dias 9-16, esta varia entre doadores sempadrão percetível. Muitas destas colonias adotamprogressivamente morfologia humana ESC-como e foram escolhidas a partir do dia 16 a 25. A eficiência dareprogramação também variou entre doadores, mas, em geral,foi bastante elevada, oscilando entre 0,1% e 4%. UiPSCstambém foram produzidas a partir de um dador comidade a partir dos 65 anos do sexo masculino, a eficiênciada reprogramação foi inferior a (0,01%), mas aindasignificativamente maior do que o relatado para célulassanguíneas periféricas. Além disso, foi possível congelar edescongelar células de urina a partir de vários doadoresantes da transdução, e isso não prejudicou a eficiência dareprogramação. Células de urina também podem ser infetadaspor passagens posteriores embora com uma menor queda naeficiência.

Após a expansão da colónia, UiPSCs foram caracterizadas pormeio de procedimentos convencionais incluindo a fosfatassealcalina de coloração (AP), e mostrou colónias de célulasclaramente positivas com a coloração de AP fortevisualizado por coloração escura de toda a colónia. Estascolónias ainda manchadas de forma positiva emimunofluorescência indireta para o ES de marcadores TRA-1-60,TRA-1-81, Nanog, SSEA-3 e SSEA-4. Além disso, para qPCRde genes endógenos ESC foram observados mais silenciamentode transgenes. DNA de micro arranjos demonstraram aexpressão génica global perto de H9 CES, uma vez que asunidades de fluorescência arbitrárias de micromatrizes decélulas ES plotadas contra os UiPSCs mostraram umainclinação linear de 45° ângulo. A análise de repetiçãoúnica em tandem (STR) de células de urina de dadores eUiPSCs mostraram uma combinação para todos os casos. Se ascircunstâncias eram tais, este último exclui a contaminaçãoprovável e a reprogramação de células de um parceirosexual.

Após a expansão da colónia, UiPSCs foram caracterizados pormeio de procedimentos convencionais incluindo a fosfatassealcalina da coloração e mostrou claramente as colónias decélulas positivas com coloração AP fortemente visualizadasatravés da coloração escura de toda a colónia, enquanto queas células não transfetadas não mostraram qualquercoloração para fosfatasse. Elas mostraram um cariótiponormal depois da integração do transgene no ADN genómico, emais manchado positivamente na coloração deimunofluorescência indireta para os ES marcadores TRA-1-60,TRA-1-81, NANOG, SSEA-3 e SSEA-4. Além disso, para os genesde qPCR para endógenos ESC mais silenciosos dos transgenes(descritos no quadro abaixo; hTERT indica que foi observadatelomerase humana transcriptase reversa). Os valores sãoreferidos como células do dador de urina; H9 CES foramutilizados como controlo). DNA de micro-arranjosdemonstraram uma expressão génica global perto de H9 CESdesde as unidades de fluorescência arbitrárias dos microarranjos das células ES plotadas contra os UiPSCs quemostraram uma inclinação linear de 45° de ângulo. Umasequência de bissulfito mostrou uma extensa desmetilação em0ct4 e Nanog de promotores proximais em 2 clonesrepresentantes de UiPSC do mesmo dador. A análise derepetição única em tandem (STR) de doadores de células deurina de UiPSCs mostraram o combinado de origem e de DNA demicro arranjos num gene de perfil global de expressão pertode H9 ESCs.

iv) Provando multi-diferenciação potencial de UiPSCs

Para provar que os UiPSCs são pluripotentes, adiferenciação não especifica através de teratoma (Figura 1)e corpo de formação embroide (EBs) foi realizada. Em ambosos casos, observou-se o aparecimento de derivados de 3camadas germinativas, e os teratomas continham estruturasbastante complexas, sem sinais óbvios de necrose ou invasãoda cápsula do tumor (Figura 1) . Em seguida, dirigiu adiferenciação de UiPSC em linhagens neuronais (-tronconeural células, neurônios e astrócitos) (Figura 2A),cardiomiócitos (Figura 2B) e hepatócitos (Figura 2b);acumulação de glicogênio foi detetado com ácido periódicode coloração de Schiff) foi realizada, o que foi verificadopor microscopia de imunofluorescência para os marcadoresapropriados e também qPCR (apenas para os hepatócitos ecardiomiócitos). Notável, a diferenciação neural foiproduzida para 12 UiPSCs correspondentes a 11 doadores,hepatócitos para 4 clones de 3 doadores e cardiomiócitospor 14 clones de 11 doadores. Um video mostrou uma altaproporção de bater espontaneamente EBs (entre 30-75%) . Damesma forma, eletrofisiologia de medição de potenciais deação (Figura 2D) e cálcio transientes (propriedadeseletrofisiológicas de cardiomiócitos de dois clonesapresentaram comportamento semelhante ao cardiomiócitosproduzidos a partir de CES humanos ou de iPSCs defibroblastos derivados).

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem comoúnico objectivo ajudar o leitor e não forma parte dodocumento de patente europeia. Ainda que na sua elaboraçãose tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir errosou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade aeste respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

WO 2008153685 AWO 2010065239 A

Literatura que não é Patente citada na Descrição :«1P3]' {0838} |#3# *3 YAMAM&amp;KA i SLAB, «<#;, ;20ÍÍ5, sM 4®; * HUANOPU *t ai te Bkftedmot, »68. vnl 2S, íix^illieell i:gs®-T5|e§3®j .*.' tàtai**}, mm. * u&amp;»*ai. Λ&amp;?Α&amp;#κ^$,2δδ®,«>ι e, aes-B {603¾ |ββ»3|· * Li et ai, CM Stem Ce#. 2006, voi. 4, 16*S {0036} * CA! et aí. J Βοί teto 28ID. ooi m 7122.7-11234 * SRi Bt al, C&amp;8 Sfsm C-eí 2003, voi. 2, Sí;S-S p33«l ia*0«j pe-OSl {ϋ07ϊ] [0673} * iCNtQA et si, tei tee CM. 2009. v»i. 3, 481-603 * YE ·, CHfifSG. Begm Mesà 20Í&amp;. voi S. 521-530 f6»M] Ρ&amp;6&amp;Γ f ,ZMAÕ.et*i CeSStistt&amp;stf, 20â€,vcA3.4?5-${E»í*l :* LOSelAi:àpí:Pí.piS&amp;0T} V· W«J50«***L Stem C«S$mv. $108. «4. t8f?AS-58

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12207 |e036f: SOLOREM a! ai Ce». 06 ttetii 2009, voi 5 36 iSL * . "Sj&amp;ANÉ'} Lj^;' M ft, 2S4.-77 pOSSi* 755-757 {80363 * YEr <4 »i ^ Ai4f. 5ta i/S4, ^ è Jooe 2¾¾¾. v>! 1i56 í2S), 96.56 1 {6656} ? 'RAYA sí aiT^itMMJtíiY'®^ * SEjtíiS ft aL Ce^ Ke-s, 20156, » 1®, 1¾¾¾¾¾ 33{005S{ {O064[ »i. Lis 73¾¾ 17 Segléíai^ gÒOSv:oei, 4S1 » 7¥tfi st ai. Císt.^US™ ÍSO?, «9 IJÇí {7:262}, 462 pOSTJ pSOOi ‘ : i^Si et i at, J Bkj Ctimy 2016 v;7. 205, :*: CtíAf* ei Si- J Csfâsa^i- £fo&amp;>apttysi&amp;. 20m voi. 4tí303-403:t4:1O6S8} " 28 i6*a-tQS4!MI»} * .Μ1^ϊ:${φ:'(Ηίφί'pi'·:06^..-^à.Yai; 7¾ * MsHvLJmfCeiSC»··*® 28tA.v«i 4¾ < 12(3-1137 :471S-47:Ss4: pggf{ jOS«®{ * :=0t>«A.</:áíS^Sf.. 2É@8* stei,: li®, * SiiiiÊSER «t aí. Am J ^«4 ftm*l 2fc®8, :il#|3®0S{: wh 295, pi 765- 5 5?5 [0070} pwt] »: PANARAT2 et »5. «tew Cs«t. 200?. eôl 26, « eORR£8«HA<3£t «t *1 Α>Φ 7w<ti &amp;M. *3» 74 161is55S0:[S660{ .1®18^®{0β71·ϊ·

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um método para a geração de células diferenciadas apartir de células de interesse de doadores de outro tipo decélula, compreendendo i) expansão esfoliada de células somáticas de urina apartir de urina e ii) a geração de células diferenciadas a partir de célulasexpandidas por reprogramação que as referidas células parase tornar induzida células derivadas de urina pluripotentesestaminais (UiPSCs) e diferenciando disse UiPSCs nasreferidas células de interesse. 2. 0 método da reivindicação 1, em que as referidas célulasesfoliadas de urina foram obtidas a partir de um doente oude um indivíduo saudável e são selecionadas a partir decélulas epiteliais, fibroblastóides ou cancerosas. 3. 0 método da reivindicação 1, em que a referida reprogramação é efetuada por uma mistura de fatores exógenos de reprogramação compreendendo fatores seleccionados a partir de um gene de Oct. família, um geneda família Klf, e um gene da família Sox. 4. 0 método da reivindicação 1, em que a referida reprogramação é efetuada por uma mistura de fatores exógenos de reprogramação compreendendo fatores seleccionados de entre Sox2, 0ct4, Klf4, c-Myc e Nanog. 5. 0 método da reivindicação 3 ou 4, em que a referidareprogramação envolve a expressão de fatores de reprogramação pelas células sem integração genómica e/ousem expressão de oncogenes. 6. 0 método de qualquer uma das reivindicações 3 a 5, emque a referida reprogramação adicional compreende aaplicação pequenas moléculas RNAs de interferência ou microRNAs que aumentam a eficiência ou substituem um ou mais dosreferidos fatores de reprogramação. 7. 0 método da reivindicação 1, em que as referidas célulassão células humanas.
2. 8. Um método para gerar células derivadas de urina pluripotentes estaminais induzidas (UiPSCs), quecompreendem i. expansão de células esfoliadas e urina somática, e ii. reprogramação das referidas células expandidas para setornarem UiPSCs. 9. 0 método da reivindicação 1, que compreende adicionalmente o passo de UiPSCs engenharia genética, oucélulas diferenciadas derivadas das mesmas, paratransportar uma molécula de ácido nucleico que corrige umdefeito causal envolvido numa doença genética.
3. 10. A utilização de células somáticas de urina esfoliadaspara a geração de células estaminais pluripotentesinduzidas.
4. 11. A utilização de células somáticas de urina esfoliadaspara a geração de células diferenciadas de interesse, emque o referido diferenciador das células foram obtidos por reprogramação esfoliada de células somáticas de urina parase tornarem células estaminais pluripotentes induzidasem (IPSCs) e depois com diferenciação das referidas iPSCsem células de interesse. Lisboa, 25 de Maio de 2016