BR112013016592B1 - Método de geração de células-tronco pluripotentes induzidas e células diferenciadas - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE GERAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS E CÉLULAS DIFERENCIADAS. Esta invenção refere-se a métodos para a geração de iPSCs e células diferenciadas de interesse através da reprogramação de célula de doadores que tenham sido obtidas de forma não-invasiva. Em particular, as células de doador são células uroepiteliais esfoliadas. As células diferenciadas podem ser obtidas através da diferenciação de iPSCs reprogramadas ou por reprogramação direta das células de urina.

Description

A invenção refere-se a células-tronco pluripotentes induzidas e células diferenciadas e métodos para gerá-las.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Células-tronco embrionárias (ESCs) são células derivadas de blastocistos obtidas por fertilização in vitro que têm potencial para auto-renovação e se diferenciar em qualquer tipo de célula madura de mamíferos, por exemplo, de um humano, corpo (esta propriedade é conhecida como "pluripotência"). Sob condições específicas de cultura de tecidos, ESCs podem ser mantidas indiferenciadas por períodos prolongados de tempo sem perder suas características de pluripotência. Devido a essas propriedades, ESCs têm despertado enorme interesse na medicina regenerativa. Potencialmente, tecidos derivados de ESCs poderiam ser usadas para o tratamento clínico dos seres humanos (tanto em condições agudas ou doenças genéticas e degenerativas). ESCs também poderiam ser utilizadas para triagem de drogas, por exemplo, para estudar a sensibilidade tecido-específica para tratamentos, e para modelar doenças genéticas in vitro. No entanto, graves limitações éticas e práticas (o risco de rejeição imune) têm prejudicado seriamente a aplicação de ESCs na clínica e, em muitos países, também a pesquisa.

A recente descoberta de que células somáticas podem ser transformadas em iPSCs por meio de fatores exógenos (este método também foi denominado "reprogramação nuclear por fatores exógenos" (Takahashi and Yamanaka, Cell 2006; 126:663-76) tem potencial para mudar a percepção atual da medicina personalizada e também pode fornecer valiosos modelos in vitro de doenças humanas (Yamanaka and Blau, 2010; Nature 465, 704-712; Lian et al., 2010; Thromb Haemost 104, 39-44).

Notavelmente, iPSCs (Células-Tronco pluripotentes induzidas) são semelhantes às ESCs e tem potencial para ser usadas em tratamentos para um paciente específico, evitando assim o risco de rejeição imunológica. Devido a estas características, iPSCs têm recebido grande atenção em todo o mundo. A geração de iPSCs requer a coleta de tecido do doador, a expansão in vitro das células doadas e a exposição das células a um coquetel de fatores exógenos que são fornecidos para a célula tais como proteínas purificadas, extratos de proteínas, moléculas de RNA plasmídeos não-integrativos, vírus (e.g. retrovírus, lentivírus, adenovírus, Sendai vírus), com ou sem coquetéis químicos e com variações das condições da cultura celular.

A aplicação destes fatores tem o efeito que colônias com uma morfologia do tipo ESC surgem progressivamente. Estas colônias representam colônias iPSC que podem ser colhidas e posteriormente expandidas e caracterizadas para verificar se seu comportamento é semelhante às ESCs.

Até agora, iPSCs humanas foram geradas usando células de pele de doadores (fibroblastos e queratinócitos), liquido amniótico, tecidos extra-embriônicos (placenta e cordão umbilical; (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234) sangue do cordão umbilical, membrana periosteal, tecidos dentários, tecido adiposo, células-tronco neurais, hepatócitos, células-tronco mesenquimais derivadas do âmnio e células de sangue periférico (Ye and Cheng, 2010; Regen Med 5, 521-530; Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234). Reprogramação de células desses tecidos foi atingida com frequências variadas, indicando que a célula de origem ("célula doada") é importante. Devido à heterogeneidade das células doadas atualmente utilizadas para geração de iPSC, é difícil estabelecer padrões para a realização de testes comparativos com iPSCs e ESCs e tirar conclusões significativas dos resultados do teste.

O tipo ideal de célula doada para a geração de iPSCs deve ser facilmente acessível, facilmente reprogramável, e universal (qualquer idade, sexo, etnia e condição corporal). Hoje em dia, fibroblastos dérmicos estão entre as fontes de célula mais frequentemente usadas para reprogramação, mas eles exigem não só uma biópsia desconfortável que precisa ser executada em um ambiente asséptico, por um especialista, mas também prolongada expansão prévia para o uso. Eles também sofrem risco de mutações de células somáticas devido à exposição à luz e radiação, e o procedimento é contraindicado em doenças graves da pele ou queimaduras. Recentemente, foi noticiado que a pesquisa de três grupos alcançou a reprogramação de células de sangue periférico sem a necessidade de mobilização de células CD34+ (Loh et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 15-19; Seki et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 11-14; Staerk et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 20-24). Brown et al., 2010, PloS ONE, 2010, 5, 6, 1-9, descreve a geração de iPSCs derivadas de linfócitos T do sangue periférico. Desde que estes procedimentos são minimamente invasivos, necessitam de pequena quantidade de sangue e não precisam de cultura celular prolongada, eles representam um avanço significativo, apesar do fato de que sua eficiência é muito baixa. No entanto, de acordo com esses relatórios, as principais células doadas usadas são células T maduras que carregam rearranjos de receptor de células T específicos, que não é desejável para certas aplicações clínicas potenciais. Além disso, as células T não carregam a informação genética completa que é necessária para a diferenciação ilimitada em qualquer tipo de célula.

Além disso, em casos raros, a recepção/doação de sangue não é isenta de questões éticas, por exemplo, devido a crenças religiosas, e pode não ser viável em pacientes com doenças infecciosas, doenças do sangue, ou imunodepressão. No último contexto, devem ser consideradas condições que afetam a coagulação (por exemplo, hemofilia), leucemia e imunodepressão genética ou adquirida (por exemplo, câncer e AIDS).

Na busca de reprogramação de novos tecidos, iPSCs também foram produzidas de membrana meníngea de ratos (Qin et al., 2008; J Biol Chem; 283, 33730-33735) e células epiteliais mamárias (Li et al., 2010; Cell Stem Cell 7, 51-63), e em seres humanos de células-tronco do periósteo e adiposas (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79), matriz de cordão umbilical e placenta (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234).

RESUMO DA INVENÇÃO

Para acelerar o progresso em relação a futuras aplicações da tecnologia de iPSC, é desejável fornecer iPSCs, bem como células diferenciadas de qualquer tipo de células, tecidos ou organoides derivados, de células doadas que representam uma fonte universal, bem como células diferenciadas derivadas diretamente de tais células doadas. Além disso, uma vez que o isolamento de células doadas para a geração de iPSCs de acordo com métodos do estado da técnica geralmente requer uma etapa invasiva para obter o tecido doador de interesse, os inventores procuraram fornecer iPSCs derivadas de uma fonte não-invasiva de células e os métodos para produzir tais iPSCs. WO2008/153685 descreve um método para produzir uma cultura de células progenitoras de urina (UPCs), fornecendo uma amostra de urina e, em seguida, o isolamento de células progenitoras urinárias da amostra. As células progenitoras têm potencial para se diferenciar ainda mais em outros tipos de células.

Para a obtenção de uma cultura de células diferenciadas, WO2010/065239 sugere o isolamento de células-tronco de urina e, em seguida, diferenciando-as em certos tipos de células.

Comum a esses métodos é que a diferenciação das células de urina obtidas permite apenas um número limitado de tipos de células.

Tem sido objeto de invenção fornecer um método para obtenção de células pluripotentes com capacidade de diferenciação, que seja ilimitado no que diz respeito ao tipo de célula finalmente gerada, obtidas de uma fonte não invasiva de células.

Para resolver o problema subjacente à invenção, os inventores consideraram os critérios que devem ser atendidos por uma fonte ideal de células a ser isoladas de indivíduos e então reprogramadas a iPSCs (que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula específica) ou diretamente diferenciada ("transdiferenciada", ou seja, diferenciada diretamente, sem a etapa intermediária da geração de iPSC) a tipos específicos de células, tecidos ou organoides: as células devem ser facilmente acessíveis com nenhum ou apenas um mínimo risco associado, devem estar disponíveis em quantidades suficientes, universalmente presentes em machos e fêmeas (sem restrições em termos de questões éticas, raça, idade ou estado de saúde ou doença), e devem ser susceptíveis de reprogramação com boa eficiência. Os inventores surpreendentemente descobriram que células somáticas, ou seja, células terminalmente diferenciadas, de uma fonte do tipo não invasiva tal como da urina, podem ser eficientemente reprogramadas a iPSCs ou células específicas ou linhagens de células de interesse.

A invenção refere-se a um método para gerar células diferenciadas de interesse a partir de células de doadores de outro tipo de célula, compreendendo i) expandir as células de uma fonte de células obtida de um doador de forma não-invasiva, em que a referida fonte de células seja selecionada de urina, fezes, saliva, cabelo, secreções nasais, cerume, fluido lacrimal ou do trato vaginal, e ii) gerar células diferenciadas de ditas células expandidas através da a) reprogramação de ditas células para se tornarem iPSCs e, em seguida, diferenciação das iPSCs em células de interesse, ou através da b) reprogramação direta de ditas células para se tornarem uma célula de interesse diferenciada.

De acordo com uma incorporação preferencial, ditas células de doador obtidas na etapa i) são células esfoliadas do trato urinário que estão presentes na urina (a seguir, essas células são denominadas "células de urina").

A seguir, iPSCs derivadas de células de urina são denominadas "UiPSCs" (se não indicadas de outra forma, por exemplo, em relação ao uso de UiPSCs, este termo também abrange iPSCs obtidas de outras células de doador obtidas de forma não invasiva).

Na incorporação, segundo a qual a fonte de células é urina, a etapa i) pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos na arte, geralmente compreende as sub-etapas a) coleta de urina de um doador, b) isolamento de células esfoliadas da urina, e c) expansão de ditas células esfoliadas.

As células esfoliadas ii) podem ser qualquer tipo de célula encontradas na urina que sejam passíveis de reprogramação.

De acordo com determinadas incorporações, as células esfoliadas são células epiteliais, por exemplo, as células tubulares renais tais como as células humanas epiteliais tubulares proximais esfoliadas (HEPTECs).

De acordo com outras incorporações, as células esfoliadas são células fibroblastóides. Ainda de acordo com as mais incorporações, as células esfoliadas são células tipo progenitoras, células tipo endotelial, células tipo musculo liso ou células tipo intersticiais conforme descrito por Zhang et al., 2008; J Urol 180, 22262233).

As células ii) também podem ser células de câncer esfoliadas, por exemplo, células de câncer renal ou de câncer de bexiga.

Após a coleta de urina, as células de urina são centrifugadas e o tipo de célula de interesse, por exemplo, células HEPTECs fibroblastóides, é enriquecido por meio do cultivo das células em um meio que favorece o seu crescimento, evitando assim o crescimento de células de um tipo de célula não desejado.

Tais meios são conhecidos na literatura e/ou disponíveis comercialmente. A título de exemplo, os meios que especificamente atendem as exigências das células epiteliais incluem, mas não estão limitadas a, meio Renal Epithelial Basal Medium (REBM) e SingleQuot Kit CC-4127 REGM, ambos disponíveis da Lonza, meio EpiGRO da Millipore, Renal Epithelial Cell Basal Medium (ATCC), outros meios para células epiteliais, incluindo meios de célula epiteliais de vias aéreas ou mamárias, por exemplo, tais como os disponíveis da Lonza, ATCC, ou Cellapplications, ou uma combinação destes. Da mesma forma, o meio, ou com base no meio, descrito por Wieser et al., 2008 (Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

Um exemplo de um meio adequado para enriquecer células fibroblastóides da urina é meio de crescimento de fibroblastos FGM®-2 Fibroblas Growth Medium, também disponível da Lonza.

Além de células de urina, que são as células doadas preferenciais, a ser usadas no método da invenção, outras células que tenham sido obtidas de um doador individual de uma forma não invasiva podem ser expandidas e reprogramadas para se tornar iPSCs, ou diretamente diferenciadas a um tipo de célula de interesse, por exemplo, células obtidas de fezes, saliva, cabelo, secreção nasal, cerume, fluido lacrimal ou do trato vaginal. Métodos para isolamento e expansão dessas células são conhecidos na arte, por exemplo, para células esfoliadas do cólon nas fezes (Bandaletova et al., 2002. Apmis 110, 239-246), ou a partir de células da papila dérmica do cabelo (Warren et al., 1992; J Invest Dermatol 98, 693-699).

Outra fonte de células útil é o fluido que é, durante a hemodiálise, inserido na cavidade peritoneal para troca de substâncias com o sangue através de vasos sanguíneos no peritônio, o que permite que o sangue seja filtrado de uma forma "semelhante" tal como no rim. Este fluido pode ser colhido e é conhecido por conter muitas células. “Reprogramação” [(etapa ii), incorporação a)] é um termo conhecido na área para transformar células somáticas em iPSCs por meio de fatores exógenos.

Nos experimentos da presente invenção, a reprogramação de células de urina a UiPSCs foi executada usando vetores retrovirais que entregam os quatro fatores de transcrição Sox2, Oct4, Klf4 e c-Myc (“fatores de Yamanaka” ou “coquetel de Yamanaka”), conforme originalmente descrito por Takahashi e Yamanaka, 2006; Cell 126:663-76).

Em princípio, pode ser usado qualquer método de reprogramação que seja capaz de transformar as células doadas, em particular células de urina, em iPSCs, em particular UiPSCs.

A reprogramação pode ser alcançada por um ou mais fatores selecionados a partir de um gene da família Oct, um gene da família Klf e um gene da família Sox. Além disso, a combinação de fatores pode compreender um ou mais produtos de genes de um gene da família Oct, um gene da família Klf, juntamente com uma citocina. A citocina pode ser pelo menos um fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e fator de célula-tronco (SCF).

De preferência, esses fatores são inseridos em vetores de expressão não- viral que são introduzidos em uma célula somática.

Se UiPSCs, ou células diferenciadas derivadas, são destinadas a aplicação terapêutica, são usados métodos que não empregam oncogenes e / ou não envolvam integração da reprogramação fator de codificação do DNA no DNA genômico do indivíduo.

Por isso, métodos da invenção preferidos para gerar UiPSCs ou células diferenciadas derivadas, para fins terapêuticos, não empregam lentivírus ou retrovírus ou usam vírus modificados de tal forma que o risco de integração genômica dos transgenes e efeitos colaterais indesejáveis associados com tal integração estão minimizados ou completamente abolidos. Além disso, deve-se considerar que a integração do transgene suporta o risco de mutagênese insercional, que pode estar associado à tumorigenicidade no paciente tratado.

Métodos preferenciais para gerar UiPSCs para aplicação terapêutica são aqueles que evitam integração genômica dos genes de reprogramação (revisto por Sun et al., 2010; Cell Cycle 9:5, 880-885) e / ou que evitam oncogenes tais como Klf4 ou c-Myc, ex.. • usando lentivírus Cre-recombinase coletável (Soldner et al., 2009; Cell 136:964-77); • usando OCT4, SOX2 e NANOG apenas, omitindo c-Myc e Klf4 (Li et al., 2010; Cell Reprogram. Jun 12(3):237-47); • alcançando a derivação de células iPS livre de vírus e livre de transgene humano usando oriP/EBNA1 (Epstein-Barr antígeno nuclear 1) com base em vetores epissomais, codificando os fatores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc, Nanog, Lin28, SV40LT (Yu et al., 2009; Science 324:797-801); • usando uma técnica de reprogramação livre de vírus usando vetores de expressão de transposição piggyBac carregando um transgene policistrônico dos fatores de Yamanaka (Woltjen et al., 2009, natureza 458:766-70); minicírculo de DNA não-viral (Jia et al., 2010; Nat Methods Mar 7(3):197-9); • métodos baseados em proteínas recombinantes, por exemplo, tratando as células com os quatro fatores de Yamanaka na forma de proteínas recombinantes conjugadas com um peptídeo célula-penetrante (cpp) (Kim et al., 2009; Cell Stem Cell 4:472-6); expondo as células a um coquetel de fatores exógenos que são providos a célula como proteínas purificadas, extratos de proteínas, com ou sem tratamento químico prévio (Cho et al., 2010; Blood 116, 386-395; Han et al., 2010; PLoS One. Aug 19; 5(8):e12297; Solanki and Lee, 2010; Chembiochem 11, 755-757). • adição de pequenas moléculas, por exemplo, ácido valpróico, um inibidor da histona desacetilase (Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol 26:795-7; Huangfu et al., 2008; Nat Biotechnol 26:1269-75); ou uma quantidade de outras pequenas moléculas, por exemplo, inibidores de glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), inibidores da via MEK-ERK e da via TGFβ para aumentar a eficiência ou substituir alguns dos fatores de reprogramação (Lin et al., 2009; Nat Methods 6:805-8; Li et al., 2009; Cell Stem Cell 4:16-9; Shi et al., 2008; Cell Stem Cell 2:525-8; Ichida et al., 2009; Cell Stem Cell 5:491-503); ou adição de vitamina C (Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79); • Adicionando pequenos RNAs interferentes (siRNAs), por exemplo p53 siRNA, para melhorar a eficiência de reprogramação pelos fatores de Yamanaka (Zhao et al., 2008;3: Cell Stem Cell 475-9); • Adicionando micro RNAs (miRNAs) para os coquetéis de reprogramação (por exemplo, Wilson et al., 2009; Stem Cells Dev 18:749-58; Judson et al., 2009; Nat Biotechnol. May; 27(5): 459-461). • entregando mRNA ou mRNA modificado, codificando para reprogramação de fatores (Yakubov et al., 2010; Biochem Biophys Res Commun 394, 189-193), o qual, no caso de modificação, é tal que aumenta a tradução e / ou estabilidade, por exemplo, como descrito por Kowalska et al, 2008, RNA. 2008 Jun;14(6):1119-31.

Segurança e / ou eficiência de reprogramação pode ser ainda mais otimizada, alterando o meio de cultura ou o ambiente do tecido, por exemplo, substituição de meio contendo soro por Knock Out Serum Replacement (KSR, Invitrogen), ou mudando o ambiente (por exemplo, baixa oxigenação usando incubadoras específicas nas quais a concentração de oxigênio pode ser controlada).

A otimização, por exemplo, pode ser atingida fazendo experimentos seriais para uma determinada população de células de urina expandidas. A título de exemplo, células de urina de um número de indivíduos podem ser cultivadas em diferentes meios (por exemplo, meio de células epiteliais ou fibroblastos) antes da infecção com retrovírus, produzindo os fatores exógenos, a fim de selecionar populações de células que sejam mais facilmente reprogramadas. Após a infecção, diferentes coquetéis de meios são empregados (com alterações em diferentes pontos de tempo), contendo soro ou sem soro, e com ou sem produtos químicos adicionais (veja acima) para ver sob quais condições é possível atingir ótima eficiência. Além disso, as células podem ser infectadas com diferentes combinações de fatores, por exemplo, os 4 fatores de Yamanaka, com ou sem Nanog (ou outros fatores, por exemplo, microRNAs). Também pode ser testado com quantas rodadas de infecção (1, 2 ou 3 rodadas) podem ser obtidos os melhores resultados. Quando as células são divididas em células do alimentador, diferentes tipos de camadas de alimentador podem ser usados, por exemplo, fibroblastos de rato, fibroblastos humanos, amnióticos, membrana amniótica, etc.

A reprogramação direta da célula doada, sem primeiro gerar uma iPSC, para se tornar uma célula diferenciada de interesse (etapa ii), incorporação b) (é também conhecida como "transdiferenciação celular", que significa a mudança de uma célula ou tecido de um estado diferenciado para outro (Vierbuchen and Wernig, 2011, Nat Biotechnol. 2011;29(10):892-907 .

Na presente incorporação, fatores de transcrição específicos do tipo celular são superexpressados usando vetores virais, vetores com base em plasmídeos etc para os fatores para reprogramação de iPS.

Para a transdiferenciação direta das células de urina (ou outras células obtidas de modo não invasivo), em neurônios, os 3 fatores Ascl1, Brn2 e Myt1l podem ser utilizados tal como descrito para a conversão de fibroblastos humanos em neurônios (Vierbuchen et al., 2010; Nature 463, 1035-1041), ou hepatócitos em neurônios, tal como descrito por Marro et al., 2011, Stem Cell. Oct 4; 9(4):374-82.

Efe et al., 2011, Nat Cell Biol. 2011 Mar; 13(3):215-22, descrevem um método através do qual fibroblastos embrionários de ratos (MEFs) podem ser diretamente reprogramáveis a “patchs” de contração espontânea de cardiomiócitos diferenciados.

Para a conversão de células de urina de doadores em cardiomiócitos, um método pode ser usado que foi realizado com sucesso para obter cardiomiócitos do mesoderma, usando Gata4, Tbx5 e Baf60c (Takeuchi et al., 2009; Nature 459, 708711).

A transdiferenciação celular de células hematopoiéticas pode ser feita usando superexpressão de Oct4 apenas (Szabo et al., 2010; Nature 468, 521-526).

Triagem de fatores que transdiferenciam células de urina a neurônios, queratinócitos, fibroblastos, cardiomiócitos, fígado, rim, glóbulos etc. pode ser feita da mesma forma para os protocolos de transdiferenciação celular acima descritos e o protocolo inicial de Yamanaka (Takahashi and Yamanaka, 2006). Com base no vasto conhecimento sobre fatores de transcrição específico de linhagem, tais fatores podem ser testados em combinações (como os artigos descritos acima) para seu potencial de transdiferenciar diretamente células derivadas de urina em combinação com as condições de cultivo que são comumente usadas para manter e cultivar o tipo específico de célula de interesse. Experiências em série de acordo com os princípios descritos acima para otimizar a eficiência de reprogramação também podem ser feitas para otimizar a eficiência de transdiferenciação celular.

Embora o método da invenção seja preferencialmente usado para produzir UiPSCs ou células de células diferenciadas de um doador humano, também pode ser aplicado às células de outros mamíferos (por exemplo, macaco, cavalo, cão, gato, porco, rato e camundongo).

Produção de células diferenciadas de interesse, tanto diretamente quanto via UiPSCs intermediária, a partir de células de urina esfoliadas, fornece um método universal fácil de reproduzir para gerar células tipo ESC de alta qualidade. Este tem a vantagem que a coleta de células de doadores pode ser realizada em qualquer lugar e por qualquer pessoa, desde que sejam tomadas medidas mínimas de higiene, e de qualquer ser humano, independentemente da idade, sexo ou condição. Além disso, o líquido perfundido no peritônio para substituir a falta de função renal em pacientes com insuficiência renal que necessitam de diálise, ou pacientes após operações de bexiga que não produzem urina, pode ser usado como fonte de células para reprogramação ou transdiferenciação celular.

O método da invenção fornece uma oportunidade única para comparar métodos de reprogramação em todo o mundo e fazer avançar o campo para a aplicação clínica de iPSCs seguras.

Em princípio, UiPSCs, ou iPSCs obtidas através do método da invenção a partir de outras células de doador obtidas de modo não invasivo, podem ser utilizadas para os mesmos fins que iPSCs conhecidas na arte geradas a partir de outros tipos de células.

As características vantajosas de UiPSCs as tornam úteis tanto a partir de uma perspectiva de pesquisa e comercial, esta última, por exemplo, fornecendo UiPSCs, ou células, linhagens de células, organoides ou tecidos, derivados, de um indivíduo saudável ou um de paciente com alguma doença), por exemplo, para fins de triagem.

UiPSCs podem ser usadas para gerar células para reparação ou substituição de tecido, evitando as questões éticas e imunológicas que são inerentes no uso de células ES.

UiPSCs da invenção, tecidos ou organoides, derivados, respectivamente, são particularmente úteis para o tratamento de pacientes com queimaduras graves, que será provido com pele artificial obtida a partir de células diferenciadas, derivadas de células de urina, diretamente ou através de UiPSCs.

Para o tratamento de doenças do sangue, UiPSCs ou células diferenciadas obtidas a partir delas, ou células obtidas por transdiferenciação celular direta das células de urina, podem ser infundidas em pacientes que sofrem de leucemia por mutação somática induzida, por exemplo.

No tratamento da hemofilia, UiPSCs geneticamente corrigidas podem ser usadas para transplante autólogo e, em caso de doenças que diminuem a quantidade de células do sistema imunológico, como por exemplo em HIV, UiPSCs convertidas em células hematopoiéticas podem ser usadas para repor a população de células imunes por infusão. Na anemia falciforme, gene corrigido das iPS também pode ser usado (Hanna et al., 2007; Science 318, 1920-1923).

UiPSCs (ou iPSCs obtidas a partir de outras células doadas obtidas de modo não invasivo) podem ser usadas, como as iPSCs conhecidas na arte, na terapia de doenças degenerativas, na qual um determinado tipo de célula ou tecido está destruído ou com defeito e o corpo não é capaz de repô-la. Em condições degenerativas, por exemplo, doença de Parkinson, o tratamento com UiPSCs provisiona o local atingido com células indiferenciadas que pode ser usadas para reparar os danos do tecido. Assim, a terapia com UiPSCs vai reintroduzir novas células saudáveis, ou tecido, para cumprir a mesma função. UiPSCs também têm potencial para ser usadas para desenvolver órgãos totalmente novos, que irão ser compatíveis com o paciente e irão reduzir as chances de rejeição de transplante, uma vez que são células autólogas, ou seja, as células derivadas de células doadas do paciente a ser tratado, por exemplo, no caso de diabetes, ilhotas secretoras de insulina como clusters podem ser geradas como a partir de iPSCs (Tateishi et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375).

UiPSCs também podem ser usadas (como revisto por iPSCs por Lau et al., 2009; F1000 Biol Rep. 1: 84) para a geração de linhas celulares de doenças específicas que são úteis como modelos de doenças e /ou para a triagem in vitro de drogas candidatas e / ou para corrigir defeitos genéticos através de terapia de gene. A geração de células diferenciadas terminalmente (por exemplo, hepatócitos ou cardiomiócitos) a partir de UiPSCs (ou obtidas por transdiferenciação celular diretamente a partir de células de urina) permitirá, por exemplo, a triagem e ainda traçar o perfil de compostos na respectiva linhagem de células, com o objetivo de definir a especificidade do paciente (para medicamento personalizado) ou aplicabilidade geral de um composto. A título de exemplo, conforme descrito por Dimos et al. 2008 (Science Aug 29; 321(5893):1218-2). UiPSCs podem ser usadas como um modelo para forma familiar de esclerose lateral amiotrófica; ou como um modelo, ou para o tratamento, respectivamente, de outras doenças genéticas, conforme descrito por Park et al., 2008 (Cell Sep 5;134(5):877-8), que produziu células iPS em pacientes com 10 diferentes doenças genéticas, incluindo a doença de Parkinson, diabetes tipo-1, distrofia muscular de Duchenne e Becker, imunodeficiência combinada grave relacionada com deficiência de adenosina deaminase, síndrome de Shwachman-Diamond-Bodian, doença de Gaucher tipo III, a doença de Huntington, síndrome de Down e o estado de portador da síndrome de Lesch-Nyhan. Além disso, modelos baseados em células humanas de atrofia muscular espinhal e doença de Parkinson podem ser gerados da mesma forma conforme descrito por Ebert et al.; 2009 (Nature Jan 15; 457(7227):277-8) e Soldner et al., 2009 (Cell. Mar 6; 136(5):964-77), ou UiPSCs derivadas de células de um paciente com beta-Talassemia homozigótica podem ser usadas da mesma forma conforme descrito por Ye et al., 2009 (Proc Natl Acad Sci USA Jun 16;106 (24):9826-3) para iPSCs derivadas de fibroblastos da pele, que posteriormente foram diferenciadas em células hematopoiéticas produção de hemoglobina. Tais UiPSCs, pela engenharia genética, poderiam produzir células hematopoiéticas autólogas que funcionam normalmente. UiPSCs também pode ser usadas para corrigir os defeitos genéticos em pacientes com anemia de Fanconi, conforme descrito por Raya et al., 2009 (Nature Jul 2; 460 (7251):53), que derivou iPS de células de fibroblastos dérmicos, colhidas de doentes com anemia de Fanconi, corrigidas usando vetores lentivirais codificando para FANCA e FANCD2, e 18 / 32 posteriormente derivaram células somáticas que eram fenotipicamente livres de doença.

UiPSCs também podem ser usadas como as iPS geradas por Lee et al., 2009 (Nature Sep 17; 461(7262):402), que gerou iPSCs de pacientes com Disautonomia Familiar (FD), re-diferenciou as células iPS e usou o modelo in vitro para rastrear drogas candidatas.

Outro exemplo de uma doença para a qual UiPSCs potencialmente possuem grande valor como um modelo de doença, é a síndrome de Prader-Willi (Yang et al., 2010; J Biol Chem 285, 40303-40311). Outros exemplos de doenças genéticas para as quais a terapia genética usando UiPSCs tem um grande potencial são Epidermólise bolhosa (por exemplo reprogramação K14 mRNA, conforme descrito por Wally et al., 2010; Hum Mol Genet 19, 4715-4725; Wally et al., 2008; J Invest Dermatol 128, 568-574). Geralmente, a terapia genética com base na engenharia genética de UiPSCs tem o maior potencial para o tratamento de doenças causadas por desordens de gene único; até à data, cerca de 4000 doenças genéticas foram descritas.

Nos modelos de doença acima que usam células terminalmente diferenciadas, tais células podem, como alternativa de serem obtidas a partir de UiPSCs, ser obtidas pela reprogramação direta das células doadas. Para efeitos da presente invenção "reprogramação direta" é usado como sinônimo de "transdiferenciação celular", conforme definido aqui.

Se as células dadoras são células cancerosas, por exemplo, células de câncer renal ou de bexiga, presumivelmente representando os estágios iniciais do câncer, UiPSCs ou células diferenciadas derivadas são úteis como modelos para o respectivo câncer.

Terapia gênica compreende a inserção, alteração ou ablação de um ou mais genes dentro das células de um indivíduo, para corrigir um efeito genético causando uma doença. Até agora, principalmente doenças monogênicas, que são causadas por mutações em genes únicos, foram consideradas para o tratamento. A forma mais comum de terapia genética envolve a inserção de genes funcionais em um local genômico não especificado de modo a substituir um gene mutado. Uma mutação pode também ser corrigida diretamente.

Para aplicações de terapia genica, as células geneticamente modificadas são UiPSCs ou células diferenciadas derivadas (ou obtidos por reprogramação direta das células doadas); como alternativa, ainda que menos preferível, as células doadas expandidas podem ser geneticamente modificadas antes de reprogramação. No escopo da invenção, células geneticamente modificadas devem ser utilizadas prevalentemente na terapia gênica somática. Uma vez que a correção dos defeitos genéticos é realizada in vitro, antes da reinfusão ou da transplantação de UiPSCs ou células diferenciadas derivadas (ou obtidas pela reprogramação direta das células doadas), o risco de transferência de genes na linha germinal é minimizado. As células corrigidas serão infundidas ou transplantadas como células diferenciadas derivadas de UiPSCs (ou diretamente transdiferenciadas sem prévia reprogramação de iPS) a fim de complementar ou substituir os órgãos e tecidos não-funcionais. O gene corrigido pode ser introduzido nas células de acordo com os métodos conhecidos na arte, por exemplo, através de vetores virais (modificados para minimizar o risco de reativação) incluindo retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados, lentivírus, vírus Herpes simplex, usando vetores baseados no plasmídeo, ou mesmo DNA nu.

A correção de defeitos gênicos pode ser realizada de várias maneiras, por exemplo, entregando DNA codificando o gene funcionando corretamente, abatendo o gene mutado, entregando shRNA ou miRNA, usando proteínas dedo de zinco para executar o nocaute ou recombinações, ou usando vetores que permitem eventos de trans-processamento .

Pode ser antecipado que, devido à forma não-invasiva de obtenção de células doadas, pode haver uma alta aceitação por indivíduos saudáveis em ter, antecipadamente e profilaticamente, UiPSCs preparadas e armazenadas derivadas de sua própria urina, bem como derivadas linhagens de células, organoides ou tecidos tal como pele artificial, o que permitirá um uso de pronto no caso de aparecimento de uma doença grave ou uma lesão, como uma queimadura.

Fibroblastos, queratinócitos ou pele artificial gerados a partir de UiPSCs (Bilousova et al., 2010; J Invest Dermatol. Dec 9), por exemplo, derivados de células doadas de indivíduos com diferentes tipos de pele, também pode ser útil na indústria de cosméticos para testes.

UiPSCs também pode ser útil para a clonagem de animais, especialmente mamíferos, por exemplo, cavalos de corrida ou animais de estimação).

Breve descrição das figuras

Figura 1 Laminas coradas com Hematoxilina / eosina de teratomas compreendendo complexos derivados das 3 camadas germinativas produzidos com 2 clones representante de UiPSC. Figura 2 A: fotografias de contraste de fase e imunofluorescência de células tipo neuronais produzidas seguindo um protocolo informado de um clone representante de UiPSC. B: Um clone representante de UiPSC foi diferenciado em células tipo cardiomiócitos usando um protocolo informado. Fotografias de contraste de fase, coloração PAS e imunofluorescência. C: Um clone representante de UiPSC foi diferenciado em células tipo hepatócitos usando um protocolo informado. Fotografias de contraste de fase, coloração PAS e imunofluorescência. D: Potenciais de ação medidos em cardiomiócitos, derivados de um clone representante de UiPSC. EXEMPLO Materiais e Métodos Microscopia de imunofluorescência

As células foram fixadas em paraformaldeído 4% de um dia para o outro, lavadas, bloqueadas e permeabilizadas em solução de bloqueio (PBS contendo soro de cabra normal 3% e 0,2% Triton X-100) por 30 minutos. Então, foram incubadas com anticorpos primários em solução de bloqueio a 4° C de um dia para o outro, lavadas duas vezes e incubadas com os anticorpos secundários correspondentes por 1 hora em temperatura ambiente. As células foram lavadas duas vezes e coradas com DAPI (Sigma) por 5 minutos e, em seguida, levadas para observação e fotografias usando um microscópio confocal Leica TCS SP2 Spectral (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany). Antes da imunofluorescência, áreas de batimento foram cortadas com tesouras, coletadas em um tubo de 1,5 mL com PBS baixo cálcio e deixadas por 30 minutos em temperatura ambiente. Estes grupos de células foram transferidos para buffer de enzima contendo colagenase 2 0,5 - 1 mg/mL e incubados a 37°C por 30-40 minutos. A digestão foi encerrada com DMEM/Ham's F12 1:1 (Hyclone), soro bovino fetal 10% (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). As amostras então foram centrifugadas e o sedimento foi ressuspenso em DMEM/Ham's F12 1:1 (Hyclone), soro bovino fetal 10% (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza). Suspensões celulares foram banhadas em lamínulas revestidas de gelatina e cultivadas a 37° pelo menos 2 dias antes da fixação e imunofluorescência.

Diferenciação tecido-específica e medidas eletrofisiológicas Diferenciação neuronal, de hepatócitos e cardiomiócitos foi realizada conforme descrito (Pankratz et al., 2007, Stem Cells 25, 1511-1520; Song et al., 2009, Cell Res 19, 1233-1242; Zwi et al., 2009, Circulation 120, 1513-1523). N2 e B27 foram adquiridos da Invitrogen, heparina foi adquirida da Sigma, EGF foi adquirido da R&D Systems. Activin A e oncostatin M foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA), BMP2, FGF4, HGF e KGF da PeproTech (Rocky Hill, EUA) e dexametasona da Enzo Life Sciences (Farmingdale, EUA). RPMI 1640, hepatoZYME-SPF, Coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) foi realizada utilizando um kit comprado de Polysciences (Warrington, EUA). Caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de iPSC (dia 23) foi feita usando o padrão "whole-cell patch-clamp" ( técnica de retalho controlado na configuração de célula inteira) para registrar os fenótipos de potencial de ação (HEKA Instruments Inc., Southboro, MA) ( Chan et al., 2009 J Cardiovasc Electrophysiol 20, 10481054). Pipetas de patch foram preparadas a partir de tubos de vidro de borosilicato de paredes finas de 1,5 mm, utilizando um extrator de micropipeta Sutter P-97 e com resistências típicas de 3 a 5 MQ quando preenchido com uma solução interna contendo (mM): 110 de aspartato K+, 20 de KCl, 1 d MgCl2, 0,1 de Na-GTP, 5 de Mg- ATP, 5 de Na2-fosfocreatina, 5 de EGTA, 10 de HEPES e pH ajustado a 7,3 com KOH. Solução de banho externa de Tyrode consistida de (mM): 140 de NaCl, 5 de KCl, 1 de MgCl2, 0,4 de KH2PO4, 1,8 de CaCl2, 10 de glicose, 5 de HEPES, e pH ajustado a 7,4 com NaOH. Atividade elétrica espontânea foi medida, considerando que os cardiomiócitos derivados de iPSC ficaram passivos sem entrada de corrente. Vinte potenciais de ação consecutivos de cardiomiócitos derivados de iPSC disparando espontaneamente foram gravados para garantir formas de onda estáveis para análise. Dados foram corrigidos para potencial de junção líquida de +15,9 mV. Transientes de cálcio foram detectados com imagem de cálcio confocal usando um protocolo descrito previamente (Ng et al., 2010; J Mol Cell Cardiol 48, 1129-1137). Brevemente, cardiomiócitos derivados de iPSC isolados foram carregados com 5 μM de Fluo-3 AM (Invitrogen) por 25 minutos a 37oC em solução de Tyrode (mM): 140 de NaCl, 5 de KCl, 1 de MgCl2, 0,4 de KH2PO4, 1,8 de CaCl2, 10 de glicose, 5 de HEPES em pH 7,4. Transientes de cálcio foram gravados com um sistema da imagem confocal (Olympus Fluoview System version 4.2 FV300 TIEMPO) montado em um microscópio Olympus vertical (IX71) e, em seguida, quantificados como mudanças de intensidade da subtração da fluorescência de fundo normalizadas a linha de base de fluorescência de fundo subtraída. Dados foram alimentados para análise no software Felix 32 (Photon Technology International). i) Coleta de urina e expansão celular

Recipientes adequados (até 500 ml) foram esterilizados antes da coleta de urina. Apenas o fluxo médio de urina foi coletado nos recipientes esterilizados. O volume habitual de espécimen foi 150 - 200 mL. As amostras de urina foram então transferidas, dentro de uma câmara de fluxo laminar de cultura de tecidos, para tubos de 50 mL e estes tubos foram centrifugados a 400 g por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi cuidadosamente descartado dentro de uma câmara de fluxo laminar de cultura de tecidos, deixando cerca de 1 mL ou menos de urina no tubo. O sedimento foi ressuspendido individualmente e todos os tubos de 50 mL derivados de uma coleta de amostra foram agrupados em um tubo único de 50 mL. Cerca de 10 mL de PBS contendo anfotericina B e penicilina / estreptomicina foram adicionados. As amostras foram centrifugadas a 400 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado, deixando apenas cerca de 0,2 mL da amostra. Cerca de 1 mL de meio primário foi adicionado ao sobrenadante de células ressuspendido. A fórmula do meio primário continha DMEM/Ham's F12 1:1 (Hyclone), 10% de soro bovino fetal (FBS; PAA), SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza) e anfotericina B penicilina / estreptomicina. As células foram transferidas para placas de 12 poços revestidas com L-gelatina em 1 mL de meio primário. Nos 2 primeiros dias algumas centenas de mL de meio primário foram adicionados para manter a concentração de antibióticos e para manter o nível de nutrição elevado. Nos dias seguintes o meio foi cuidadosamente mudado para meio REBM (Renal Epithelial Basal Medium, Lonza) meio contendo SingleQuot Kit CC-4127 REGM (Lonza) (a combinação dos dois é referida como meio de células de urina), o procedimento nunca foi executado completamente para permitir a presença de fatores secretados pelas células de urina e evitar estresse desnecessário. Células / colônias visíveis apareceram rotineiramente após 3 a 6 dias. A primeira mudança completa de meio foi feita após as primeiras células / colônias serem vistas. As células foram divididas em uma superfície maior, auxiliada por tripsina 0,25% contendo 1 mM de EDTA quando a cultura cresceu confluente. Este e outros procedimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health (Instituto Guangzhou de Biomedicina e Saúde). RPTECs (células epiteliais do túbulo proximal) foram geradas conforme descrito por Wieser et al., 2008, Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375, e mantidas no meio de células de urina. Fibroblastos foram obtidos a partir de fibroblastos de pele adquiridos do repositório de células Coriell e mantidos em DMEM (Invitrogen) + 10% (vol / vol) de soro bovino fetal (FBS; Hyclone). À primeira vista, culturas de células de urina consistiam principalmente de células escamosas (provavelmente de uretra) e algumas células do sangue (principalmente hemácias), mas após 2-3 dias, estas células desapareceram e foram substituídas por pequenas colônias (3 por amostra, em média) que cresceram rapidamente. Estas colônias correspondiam a 2 morfologias principais: tipo 1 ou tipo 2, de acordo com relatórios anteriores a respeito do isolamento de células de urina (Dorrenhaus et al., Arch Toxicol 2000; 74, 618-626). As células do tipo 1 tendiam a ser mais arredondadas e cresceram estreitamente ligadas às células vizinhas, sugestivo de um fenótipo epitelial. As células do tipo 2 eram moderadamente mais alongadas e tendiam a crescer um pouco mais dispersas. Em algumas coleções de amostras todas as colônias correspondiam a 1 dos 2 tipos, mas em outras eram misturadas. Estas culturas de células foram agrupadas ao atingir alta densidade e divididas para maior caracterização ou reprogramação paralela. As enriquecidas em células do tipo 1 exibiam junções positivas célula-célula bem-formadas para E- caderina e beta catenina (marcadores de junções aderentes), e ZO-1 (Zonula

Occludens-protein 1 (Proteína da Zônula de Oclusão-1); um marcador das junções apertadas), avaliada por microscopia de imunofluorescência. Bem como, eram positivo para filamento intermediário de queratina 7, um marcador epitelial, e um marcador do túbulo proximal renal CD13. Além disso, a distribuição de actina foi cortical em vez de nas fibras de estresse. PCR Quantitativo em tempo real (qPCR) também suportou uma origem epitelial predominante, conforme demonstrado pela análise da E-caderina, ocludina e claudina 1 (proteínas de junções apertadas) e o soluto portador família 2-transportador SLC2A1 do túbulo proximal renal. Células epiteliais renais proximais (RPTECs; Wieser et al., 2008; Am J Physiol Renal Physiol 295, F1365-1375) e fibroblastos da pele foram usados como controles positivos e negativos, respectivamente, para a imunofluorescência e qPCR. Culturas enriquecidas com células do tipo 2 mostraram um padrão de imunofluorescência bastante semelhante, mas a intensidade foi mais amena e a distribuição mais desigual; resultados de qPCR foram comparáveis da mesma forma. Em ambos os casos, foi observada a pouca coloração para os marcadores tipo fibroblásticos fibronectina e vimentina. ii) Geração e expansão de UiPSC Amostras de 12 jovens adultos de origem chinesa ou caucasiana foram reprogramadas, correspondendo 7 a machos e 5 a fêmeas. Células de urina em passagens 2-3 foram transfectadas com retrovírus que produzem Sox2, Klf4, Oct4 e c-Myc (Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79): plasmídeos retrovirais de produção de fatores de transcrição Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc humanos foram adquiridos de Addgene (Cambridge, MA, EUA). Sobrenadantes virais foram colhidos em 2 dias consecutivos a partir de 48 horas após a transfecção. Células de urina em passagens 2-4 foram tripsinizadas e semeadas em placas de seis poços. Foram adicionadas 60.000 células por poço. As células foram infectadas com sobrenadantes virais gerados pelo transfecção das células 293T (utilizando Lipofectamine 2000, Invitrogen) com vetores retrovirais pMXs (Addgene) contendo os cDNAs de Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc humanos. Duas rodadas de infecção foram realizadas sucessivamente (12 horas cada). Foi adicionado Polybrene (Sigma) para aumentar a eficiência da infecção. Após a segunda rodada de infecção (eficiência de infecção foi perto de 100%, conforme demonstrado por transdução de controle com vetores expressando GFP), o meio de cultura de tecido das células transduzidas foi alterado para meio de células de urina, e renovado diariamente. No dia 3 ou 4, as células foram tripsinizadas e seu número contado. Rotineiramente, 50.000 células foram semeadas em uma camada de alimentadores em uma placa de cultura de 10 cm e usando meio de ESC humanas (F12 [Invitrogen] + 20% de KSR [Knock-out Serum Replacement, Invitrogen] + 10 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico + aminoácidos não-essenciais [Invitrogen], L-glutamina e beta Mercaptoetanol), que foi renovado diariamente. No dia 5, o meio foi alterado para meio de ESC humanas + ácido valpróico 1 mM (VPA; Sigma) ou metade meio ESC + metade meio dFBS (consistindo de DMEM alta glicose [Invitrogen] + 20% de soro bovino fetal definido humano [FBS, Hyclone] + VPA. VPA foi mantido apenas dos dias 5 ao 12. O meio foi alterado para meio mTesR1 (Stemcell), e renovado diariamente até o último dia do experimento. A partir do dia 16, as colônias que eram suficientemente grandes e identificáveis como tipo ESC humanas (morfologia plana com bordas definidas e grandes núcleos contendo nucléolos proeminentes), poderiam ser colhidas mecanicamente e expandidas em meio de ESC humanas em alimentadores ou no meio mTesR1 em Matrigel. iii) Caracterização de UiPSC

Coloração AP, integração do transgene, cariótipo e sequenciamento de bissulfato foram feitas conforme descrito por Cai et al., 2010; J Biol Chem 285, 11227-11234; Esteban et al., 2010; Cell Stem Cell 6, 71-79.

Análise STR foi realizada utilizando um sistema de analise Applied Biosystems Genetic Analyzer (ABI3130, ABI). O DNA genômico foi extraído usando o kit DNeasy Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha) e o RNA total foi extraído usando Trizol (Invitrogen, Paisley, EUA). qPCR foi realizada utilizando um sistema de tempo real Thermal Cycler DiceTM Real Time System (ABI7300, ABI, Foster, Califórnia, EUA) e SYBR Green Premix EX TaqTM (Takara, Shiga, Japão); beta actina foi usada para normalização e todos os itens foram medidos em triplicata. Os microarranjos de DNA foram realizados usando Illumina’s Human HT-12 V 4.0 Expression Beadchip de acordo com as instruções do fabricante. Chips foram escaneados usando Illumina BeadChip Reader e os dados analisados usando o aplicativo Illumina BeadStudio Application. Para teratomas, 2 x 106 UiPSCs foram injetadas por via subcutânea ou intramuscular na pata traseira direita de ratos NOD- SCID imunocomprometidos. Os tumores foram extirpados 8-10 semanas mais tarde, fixados, e incorporados em parafina, seccionados e corados com hematoxilina / eosina. Para diferenciação de EB, iPSCs no alimentador foram tratadas com dispase (Invitrogen) e coletadas através de raspagem. Após a centrifugação, aglomerados de células foram ressuspensas em meio de ESC humanas sem bFGF e cultivadas por 8 dias em placas não aderentes. EBs (corpos embrióides) foram transferidos para placas revestidos de gelatina, para permitir a diferenciação por mais 8 dias antes do processamento para análise por imunofluorescência.

A caracterização da cultura primária e as UiPSCs resultantes mostrou que pequenas colônias rotineiramente apareceram nos dias 9-16, isso variando entre doadores sem padrão perceptível. Muitas destas colónias progressivamente adoptaram morfologia tipo ESC humanas e foram colhidas do dia 16 a 25. A eficiência de reprogramação também variou entre doadores, mas em geral foi bastante elevada, oscilando entre 0,1% e 4%. UiPSCs também foram produzidas a partir de um indivíduo masculino de 65 anos de idade, a eficiência de reprogramação foi menor (0,01%) mas ainda significativamente maior do que os relatados para as células do sangue periférico. Além disso, foi possível congelar e descongelar as células de urina de vários doadores antes da transdução, e não prejudicar a eficiência de reprogramação. Células de urina podem também ser infectadas em passagens tardias se em que com uma menor queda na eficiência.

Após a expansão da colônia, UiPSCs foram caracterizadas através de procedimentos padrão, incluindo coloração para fosfatase alcalina (AP), e mostrou colônias de células claramente positivas com coloração para AP forte visualizada pela coloração escura da colônia inteira. Estas colônias coraram positivas ainda na coloração por imunofluorescência indireta para os marcadores ES TRA-1-60, TRA-1- 81, Nanog, SSEA-3 e SSEA-4. Além disso, foi observada qPCR para genes ESC endógenos além do silenciamento desses transgenes. Microarranjos do DNA demonstraram expressão de gene global próxima a ESCs H9, uma vez que as unidades arbitrárias de fluorescência de microarranjos das células ES (= células estaminais embrionárias) plotadas contra aqueles das UiPSCs mostram uma inclinação linear de ângulo de 45°. Análise única repetida em tandem (STR) de células de urina de doador e UiPSCs mostrou origem correspondente em todos os casos. Se as circunstâncias eram tais, este último exclui a contaminação improvável e reprogramação de células de um parceiro sexual.

Após a expansão da colônia, UiPSCs foram caracterizadas através de procedimentos padrão, incluindo coloração para fosfatase alcalina e mostraram colônias de células claramente positivas com coloração para AP forte visualizada pela coloração escura da colônia inteira, enquanto que as células não transfectadas não apresentaram qualquer coloração para fosfatase alcalina. Mostraram um cariótipo normal após a integração transgênica no DNA genômico, e ainda coraram positivas na coloração por imunofluorescência indireta para os marcadores ES TRA- 1-60, TRA-1-81, Nanog, SSEA-3 e SSEA-4. Além disso, foi observada qPCR para genes ESC endógenos além do silenciamento desses transgenes (mostrado na tabela abaixo; hTERT indica transcriptase reversa da telomerase humana). Valores são referidos as células de urina do doador; ESCs H9 foram utilizadas como controle). Os microarranjos do DNA demonstraram expressão de gene global próximo a ESCs H9 desde que as unidades arbitrárias de fluorescência de microarranjos das células ES plotadas contra aquelas das UiPSCs mostram uma inclinação linear de ângulo de 45°. O sequenciamento de bissulfito mostrou extensa desmetilação em promotores proximais Oct4 e Nanog em 2 clones de UiPSC representantes do mesmo doador. Análise única repetida em tandem (STR) de células de urina de doador e UiPSCs mostram origem correspondente e microarranjos do DNA demonstram um perfil de expressão de gene global próximo a ESCs H9.

iv) Provando o potencial de multi-diferenciação de UiPSCs

Para provar que UiPSCs são pluripotentes, realizou-se a diferenciação não- específica através da formação de teratoma (Figura 1) e de corpos embrióides (EBs). Em ambos os casos, observou-se o aparecimento de derivados das 3 camadas 5 germinativas, e os teratomas continham estruturas bastante complexas sem sinal evidente de necrose ou invasão da cápsula tumoral (Figura 1). Em seguida, foi executada diferenciação direta de UiPSC em linhagens neurais (células-tronco neurais, neurônios e astrócitos) (Figura 2A), cardiomiócitos (figura 2B) e hepatócitos (figura 2B); foi detectado acúmulo de glicogênio com coloração com ácido periódico 10 de Schiff), que foi verificada através de microscopia por imunofluorescência para os marcadores apropriados e também qPCR (somente para hepatócitos e cardiomiócitos). Digno de nota, a diferenciação neural foi produzida para 12 UiPSCs correspondente a 11 doadores, hepatócitos para 4 clones de 3 doadores e cardiomiócitos para 14 clones de 11 doadores. Um vídeo mostrou uma alta proporção 15 de EBs batidos espontaneamente (entre 30-75%). Da mesma forma medidas eletrofisiológicas de potenciais de ação (Figura 2D) e transientes de cálcio (Propriedades eletrofisiológicas de cardiomiócitos de dois clones apresentaram comportamento semelhante aos cardiomiócitos produzidos a partir de ESCs humanas ou iPSCs derivadas de fibroblasto).

Claims (8)

1. MÉTODO DE GERAÇÃO DE CÉLULAS DIFERENCIADAS de interesse a partir de células doadas de outro tipo de célula, caracterizado por compreender: i) expandir as células somáticas esfoliadas de urina e ii) gerar células diferenciadas de ditas células expandidas através da a) reprogramação de ditas células para se tornarem células-tronco pluripotentes (iPSCs) derivadas de urina e diferenciação das ditas iPSCs em células de interesse.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ditas células esfoliadas terem sido obtidas de um indivíduo doente ou saudável e serem selecionadas a partir de células epiteliais, fibroblastóides ou de câncer.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela reprogramação ser realizada através de uma mistura de fatores exógenos de reprogramação, compreendendo fatores selecionados de um gene da família Oct, um gene da família Klf, e um gene da família Sox.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por dita reprogramação ser realizada por uma mistura de fatores exógenos de reprogramação, compreendendo fatores selecionados de Sox2, Oct4, Klf4, c-Myc e Nanog.

5. MÉTODO, de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado por dita reprogramação envolver a expressão de fatores de reprogramação na célula sem a integração do genoma e/ou sem expressão de oncogenes.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado por dita reprogramação adicionalmente compreender a aplicação de pequenas moléculas, pequenos RNAs interferentes ou micro RNAs que aumentam a eficiência ou substituem um ou mais dos ditos fatores de reprogramação.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ditas células serem células humanas.

8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por adicionalmente compreender a etapa de produzir por engenharia genética UiPSCs ou células diferenciadas derivadaspara carregar uma molécula de ácido nucléico que corrige um defeito causalmente envolvido em uma doença genética.

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