CN102712903A

CN102712903A - 从脐带血产生诱导的多能干细胞

Info

Publication number: CN102712903A
Application number: CN201080035756XA
Authority: CN
Inventors: 阿莱斯桑德拉·吉奥盖帝; 胡安·卡洛斯·伊兹皮苏阿贝尔蒙特
Original assignee: Center for Regenerative Medicine of Barcelona; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Center for Regenerative Medicine of Barcelona; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2012-10-03
Also published as: US20110044961A1; CA2766049A1; EP2443231A4; EP2443231A2; SG176925A1; WO2010148334A2; WO2010148334A3; RU2012101874A; IN2012DN00581A; KR20120099363A; AU2010263055A1; IL217063A0; JP2012530497A

Abstract

提供了用于产生和使用基因修正的诱导的多能干细胞的方法和组合物。

Description

从脐带血产生诱导的多能干细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月19日提交的美国临时申请第61/218,611号的权益，其全部内容在此援引加入，并用于所有目的。

发明背景

利用整合病毒法使多能性因子和癌基因异位表达足以诱导小鼠和人类成纤维细胞的多能性^3-9。然而，该过程缓慢、效率低下，并且载体被永久整合入基因组限制了iPS细胞在治疗应用中的使用¹。进一步的研究证实，老化程度、来源和所用的细胞类型对重新编程效率具有重要影响，最终需要表达较少的因子和/或减少整个过程的时间。最近证实，人类角质细胞的逆转录病毒转导导致重新编程而具有多能性，效率比成纤维细胞高100倍，并且速率比成纤维细胞快2倍。据推测，这些差异是可能是由于起始角质细胞群体中KLF4和c-MYC的内源表达和/或存在未分化的祖细胞库，所述未分化的祖细胞呈现出更易于重新编程的表观遗传状态¹⁰。小鼠中的其它研究进一步支持后一推测^11，12。然而，干细胞通常是稀有的，并且难以大量获取和分离(例如，神经干细胞^13，14)。

诱导的多能干细胞(iPS)已引起了再生医学的关注，因为其允许体外产生患者特异性的祖细胞，对细胞治疗具有潜在价值¹。然而，在很多情况下，现成的方法可能是理想的，例如对于急性疾病状态的细胞治疗，或当患者的体细胞由于慢性病或衰老而改变时。脐带血(CB)干细胞正适合于此目的，因为它们是新生的、免疫未成熟的细胞，具有最小的基因和表观遗传学改变，并且通过CB库的世界网络可容易地获得成几十万的免疫分型的CB单位²。CB细胞被认为是能替代骨髓(BM)作为用于造血移植的干细胞来源，并且可以收集足够量的CB细胞而不会为供体带来任何风险¹⁵。除了易于获取之外，CB细胞结合了年轻细胞具有最小体细胞突变的性质和新生细胞的免疫学未成熟性所提供的优势¹⁵。这些性质允许较宽松的HLA供体-受体选择标准，为移植提供了决定性的益处。此外，脐带血库的世界性综合网络确保能快速且有效地搜索CB干细胞的相容供体²。最后，已证实CB CD133⁺干细胞能表达OCT4、SOX2、NANOG、REX1和其它多能性相关标志物^16-18，并因此原则上可能更易于重新编程。本文首次描述了包括以下的实施方案：通过4种(OSKM)、3种(OSK)以及少至2种(OS)转录因子的逆转录病毒转导而无需2种强的癌基因(c-MYC和KLF4)或其它化合物，使CB干细胞快速且有效重新编程而具有多能性。

利用本文所述的某些方法和组合物，能在非常有效且快速的过程中通过OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的逆转录病毒转导而将CB干细胞重新编程而具有多能性。得到的CB来源的iPS(CBiPS)细胞在表型和分子学上不同于人胚胎干细胞(hES)。此外，无需使用c-MYC和KLF4癌基因并仅通过OCT4和SOX2的过表达即可有效实现脐带血iPS的产生。本文所述的方法和组合物克服了本领域中的问题，并且可以为创建用于现成应用的HLA匹配的CBiPS细胞的综合库奠定基础。

发明概述

本文特别提供了用于从脐带血产生和使用诱导的多能干细胞的高效方法和组合物。

一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了按照本文的方法制备的诱导的多能干细胞。

一方面，提供了包含编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸的脐带血干细胞。

另一方面，提供了包含编码OCT4蛋白的核酸的脐带血干细胞。

一方面，提供了产生人类体细胞的方法。所述方法包括使诱导的多能干细胞与细胞生长因子接触。允许所述诱导的多能干细胞进行分裂，从而形成所述人类体细胞。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞：用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞：用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了治疗需要组织修复的哺乳动物的方法。所述方法包括将诱导的多能干细胞给予所述哺乳动物，并允许所述诱导的多能干细胞进行分裂并分化为所述哺乳动物中的体细胞，从而提供所述哺乳动物的组织修复。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞：用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，通过包括以下步骤的过程制备所述诱导的多能干细胞：用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成所述诱导的多能干细胞。

附图简要描述

图1A-1E.仅利用OCT4和SOX2因子产生CBiPS细胞系。图1A：脐带血干细胞重新编程的时间线。感染后3天，将CB CD133+细胞转移到饲养细胞上。在第9天左右观察到小的附着集落。12天后，典型hES样集落清晰可见。图1B：基因组DNA PCR确认插入4个、3个和仅2个转基因。图1C：CBiPS2F-1、3F-10和4F-3细胞系的代表性相差图像和碱性磷酸酶(AP)染色。图1D：CBIPS2F、3F和4F细胞系的代表性端粒酶活性(HI：热失活，HFF：人类包皮成纤维细胞，-C：作为阴性对照的裂解缓冲液，+C：阳性对照和QC：定量对照)。图1E：CBIPS2F-1细胞系的多能性标志物的免疫荧光分析。集落表达胚胎标志物SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和转录因子OCT4、SOX2和NANOG。下方的成纤维细胞提供阴性对照。比例尺：250μm

图2A-2G.CBiPS细胞系的表征。图2A：描述多能性标志物OCT4、SOX2、NANOG、REX1、CRIPTO、KLF4和c-MYC的定量RT-PCR分析的柱状图。分析了ES[2]和角质细胞iPS(KiPS)细胞系以及来源于新鲜和冷冻样品的不同CBiPS细胞系。误差棒代表三个平行样品的s.d.(标准差)。柱状图图例(从左至右)：CBiPS4F-3、CBiPS4F-5、CBiPS3F-10、CBiPS3F-12、CBiPS2F-1、CBiPS2F-2、CBiPSF-1、CBiPSF-5、ES2和KiPS。图2B：描述定量RT-PCR的柱状图显示了CBiPS细胞系中OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转基因的抑制。柱状图图例(从左至右)：CBiPS4F-3、CBiPS3F-10和CBiPS2F-1。图2C：CBiPS2F-1体外分化为3个原代胚细胞层(外胚层-Tuj1、内胚层-AFP和FOXA2、以及中胚层-ASA和GATA4)。图2D：睾丸内注射CBiPS2F-1后60天的畸胎瘤切片的免疫荧光分析显示出Tuj1/GFAP阳性外胚层、AFP/FoxA2阳性内胚层和ASM/ASA阳性中胚层。比例尺：75-250μm。CBiPS2F-1(图2E)和CBiPS3F-12(图2F)的特异性体外分化为免疫学表型成熟的多巴胺能神经(Tuj1/TH酪氨酸羟化酶)。图2G：柱状图描述的是比较人类成纤维细胞和CD133+细胞中OCT4、NANOG、HOXB4和HOXB5的启动子中K4(H3K4me2)、K27(H3K27me3)和K9(H3K9me3)处的组蛋白H3甲基化水平的染色质免疫沉淀分析。柱状图图例：成纤维细胞(阵列点)，CD133+(黑色)。

图3A-3C.人类CD133+细胞的流式细胞术分析。图3A：描述了免疫选择后的CD133细胞纯度的代表性点图。图3B：描述了感染后3天总GFP+细胞和双阳性GFP/CD133细胞的定量。图3C：柱状图描述的是hES条件下培养3周的未转导的CD133+干细胞的流式细胞术分析。分析了细胞的造血标志物CD45、CD34、CD38和CD133和包括SSEA3、SSEA4和TRA-1-60的胚胎干细胞标志物。

图4A-4B.pMXs-OSKMG和pMXs-OSKG多顺反子逆转录病毒的示意图。图4A：pMXs-OSKG多顺反子逆转录病毒。图4B：pMXs-OSKMG多顺反子逆转录病毒。

图5A-5C.多能性标志物的免疫荧光分析。图5A：CBiPS3F-10。图5B：CBiPS4F-3细胞系表达包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81的其它典型多能性标志物和转录因子OCT4、SOX2和NANOG。图5C：用OSK逆转录病毒对从冻/融CB单位纯化出的CD133+细胞进行转导之后而产生的CBiPS冷冻(CBiPSFr)-1细胞系表达包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81的其它典型多能性标志物和转录因子OCT4、SOX2和NANOG。下方的成纤维细胞提供阴性对照。比例尺：250μm

图6.CBiPS2F的流式细胞术分析。柱状图描述的是，流式细胞术分析证实了CBiPS2F-1细胞已丧失了诸如CD45和CD34的造血标志物并获取了包括TRA-1-181和SSEA-4的典型多能性标志物。

图7A-7B.全局基因表达分析。图7A：比较了CBiPS(2种系，每个系2个重复)和ES2(2个重复)的平均全局基因表达模式，其显示出非常高的相关性水平。图中标出了某些多能性基因。图7B：不同多能系和各自的起始群体的所有配对比较的全基因组转录谱的相关系数。

图8A-8B.逆转录病毒转基因沉默。针对OCT4与特异性FLAG-抗体的组合的免疫荧光染色，其仅检测任何FLAG标记的逆转录病毒转录因子的转基因表达。图8A：CBiPS2F-1中内源OCT4的表达和转基因的沉默。图8B：用作为阳性对照的OCT4和SOX2感染的原代人类成纤维细胞。比例尺：250μm

图9.通过重亚硫酸盐基因组测序进行的甲基化启动子分析。OCT4启动子甲基化分析证实了所有CBiPS细胞系中启动子的一致性去甲基化。

图10.Southern印迹。评价CBiPS2F-1系和亚克隆中的逆转录病毒整合数量的Southern印迹。1：用PstI消化的基因组DNA与KLF4特异性探针杂交。内源条带：5.9kb和0.9kb(黑色箭头)。正如所预期的，用该探针未检测出其它条带。2：用PstI消化的基因组DNA与SOX2特异性探针杂交。内源条带：0.9kb(黑色箭头)。同一其它条带存在于CBiPS2F-1、CBiPS2F-1a和CBiPS2F-1b中，其对应于独特的转基因插入(红色星号)。3：用HindIII消化的基因组DNA与OCT4特异性探针杂交。内源特异性条带：4.5kb(黑色箭头)。内源非特异性条带(灰色箭头)。同一其它条带存在于CBiPS2F-1、CBiPS2F-1a和CBiPS2F-1b中，其对应于独特的转基因插入(红色星号)。4：用HindIII消化的基因组DNA与c-MYC特异性探针杂交。内源条带：11kb(黑色箭头)。正如所预期的，用该探针未检测出其它条带。

图11A-11C.CBiPS2F、3F和4F细胞系的核型分析。高分辨率G显带核型表明第10代后分析的CBiPS2F-1(图11A)、CBiPS3F-10(图11B)和CBiPS4F-3(图11C)细胞的正常的、二倍体的、雄性和雌性染色体含量。

图12A-12F.CBiPS细胞系的体外和体内多能性。图12A：来源于CBiPS2F-1细胞系的类胚胎体。CBiPS3F-10(图12B)和CBiPS4F-3(图12C)能体外分化为3个胚层，包括神经(Tuj1/GFAP)、内胚层(AFP/FoxA2)和中胚层(ASM)细胞。图12D：CBiPSFr-1细胞系体外分化为3个胚层，包括神经(Tuj1)、内胚层(AFP/FoxA2)和中胚层(ASM)细胞。CBiPS3F-10(图12E)和CBiPS4F-3(图12F)体内分化。得到的含畸胎瘤的组织表现出所有3个胚层：外胚层(Tuj1/GFAP)、内胚层(AFP/FoxA2)和中胚层(ASM/ASA)。

图13A-13D.CB CD133+细胞的基因表达分析。图13A：表现了CD133+、角质细胞、成纤维细胞、ES细胞、KiPS和CBiPS的全基因组转录谱的层级聚类的系统树状图显示出，CD133+细胞并不比成纤维细胞和角质细胞更接近多能细胞。图13B：柱状图描述了通过定量RT-PCR比较的CD133+细胞、成纤维细胞和角质细胞中多能性标志物和KLF4的基因表达分析。柱状图图例(从左至右)：CD133+(黑色)、成纤维细胞(空心)和角质细胞(灰色)。图13C：通过定量RT-PCR证实CD133+细胞中SALL2、ZNF589、DPPA4、DNMT3A和DNMT3B基因上调。柱状图图例：与图13B相同。图13D：CD133+细胞、成纤维细胞和角质细胞中c-MYC表达的定量RT-PCR分析。误差棒表示三个平行样的标准差。柱状图图例：与图13B相同。

发明详述

I.定义

提供下述定义是为了便于理解本文常用的某些术语，而并非意图限制本申请的范围。

“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，以及以上的互补物。

术语“互补的”或“互补性”指多核苷酸中的核酸与另一多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T与序列T-C-A是互补的。互补性可以是部分的，其中仅一部分核酸按照碱基配对而相匹配；或是完全的，其中所有核酸都按照碱基配对而相匹配。

对于两个或更多个核酸，术语“同一的”或“同一性”百分比是指利用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法以及下文所述默认参数或通过手工比对和肉眼检查(参阅如NCBI网站等)进行测定时，相同的或具有规定的相同核苷酸的百分比(即，当在比较窗或指定区域上进行比较和为最大一致性进行比对时，在规定区域上具有约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)的两条或更多条序列或亚序列。此类序列被认为是“基本上同一的”。该定义还指或可适用于测试序列的互补物。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下文所述，优选的算法能够解决空位等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

短语“严紧杂交条件”指探针与通常在核酸复合混合物中的探针靶序列杂交而不与其它序列杂交的条件。严紧条件是序列依赖性的，并且视情况的不同而不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指导可参见Tijssen，Techniques In Biochemistry and molecularBiology-Hybridization With Nucleic Probes，″Overview of principles ofhybridization和the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。通常，将严紧条件选择为低于规定离子强度、pH下具体序列的热解链温度(Tm)约5-10℃。Tm是(在规定离子强度、pH以及核酸强度下)在平衡时与靶标互补的探针中的50％与靶序列杂交的温度(因为靶序列过量存在所以在Tm下，50％的探针在平衡时被占据)。也可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景两倍的杂交，优选为背景10倍的杂交。示例性的严紧杂交条件可以为如下所述：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS、42℃下孵育，或5×SSC、1％SDS、65℃下孵育，同时在65℃下、在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。

使用核酸杂交技术的各种具体DNA和RNA测量方法对本领域技术人员而言是已知的(参见Sambrook，同上)。部分方法涉及电泳分离(如检测DNA的Southern印迹和检测RNA的Northern印迹)，但DNA和RNA的测量也可以在缺少电泳分离的情况下进行(如利用斑点印迹)。

可以通过使用能增加所检测的靶核酸的核酸扩增系统来增强杂交测定的敏感性。这类系统的实例包括聚合酶链式反应(PCR)系统和连接酶链式反应(LCR)系统。本领域中最近描述的其它方法是基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)和Qβ复制酶系统。这些系统可用于直接鉴定突变体，其中PCR或LCR引物被设计为仅当所选序列存在时才会进行延伸或连接。可选地，通常可以利用例如非特异性PCR引物来扩增所选序列，并随后探测所扩增的靶区域中指示突变的特定序列。应当理解，包括Taqman

和分子信标探针在内的各种检测探针可用于监测扩增反应产物，例如实时监测。

词语“多核苷酸”指核苷酸的线性序列。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核苷核苷酸或两者的混合物。本文所考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括miRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA混合物的杂交分子。

词语“蛋白”、“肽”以及“多肽”可互换使用，表示氨基酸聚合物或一组两个或更多个相互作用的或结合的氨基酸聚合物。

术语“基因”指参与产生蛋白的DNA的区段；其包含编码区前后的区域(前导区和拖尾区)，以及各编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。前导区、拖尾区以及内含子包含基因转录和翻译过程所必需的调节元件。此外，“蛋白基因产物”是由具体基因表达的蛋白。

“病毒载体”是能将另一核酸转运到细胞中的病毒来源的核酸。当病毒载体存在于适当的环境中时，其能指导该载体所携带的一个或多个基因所编码的一种或多种蛋白的表达。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。

术语“转染(transfection)”或“转染(transfecting)”被定义为：将核酸分子通过非病毒或基于病毒的方法引入细胞的过程。非病毒转染方法包括不利用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统而将核酸分子引入细胞的任何合适的转染方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染(nucleofection)、声波穿孔(sonoporation)、通过热休克转染、磁转染(magnetifection)和电穿孔。对于基于病毒的转染方法，任何有用的病毒载体都可以用于本文所述的方法中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。

本文所用词语“表达(expression)”或“表达(expressed)”，当涉及基因时，表示该基因的转录和/或翻译产物。可以根据细胞中存在的相应mRNA的量或细胞所产生的DNA所编码的蛋白的量来确定细胞中DNA分子的表达水平(Sambrook et al.，1989 Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，18.1-18.88)。

术语“质粒”指编码基因和/或基因表达所必需的调节元件的核酸分子。基因从质粒的的表达可以顺式发生或反式发生。如果基因顺式表达，则基因和调节元件由同一质粒编码。反式表达指基因和调节序列由单独的质粒编码的情况。

术语“附加的”指细胞中质粒的染色体外状态。附加型质粒是指不是染色体DNA的一部分并且独立于染色体DNA进行复制的核酸分子。

“细胞培养物”是存在于生物体外的细胞群体。这些细胞任选地是分离自细胞库、动物或血液库的原代细胞，或是来自这些来源之一并且已经永生化为长期存活的体外培养物的次代细胞。

“干细胞”是特征为能通过细胞有丝分裂而进行自我更新且能分化成组织或者器官的细胞。在哺乳动物干细胞中，胚胎干细胞和成体干细胞是有区别的。胚胎干细胞存在于胚泡中，并且产生胚胎组织，而成体干细胞存在于成体组织中，用于组织再生和修复。

术语“多能的”或“多能性”指能产生后代的细胞所述后代在适当的条件下能分化为共同表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞能为出生前、出生后或成体生物体的组织提供贡献。本领域中公认的标准测试，例如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可用于建立细胞群的多能性。然而，各种多能干细胞特征的鉴定也可以用于鉴定多能细胞。

“多能干细胞特征”指能将多能干细胞与其它细胞区分开的细胞特征。分子标志物的特定组合的表达或不表达是多能干细胞特征的实例。具体而言，人类多能干细胞可以表达下述非限制性标志物中的至少一些以及任选地表达所有标志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、Sox2、E-钙粘蛋白、UTF-I、Oct4、Lin28、Rex1以及Nanog。与多能干细胞有关的细胞形态也是多能干细胞的特征。

术语“重新编程”是指使非多能细胞去分化成为表现多能干细胞特征的细胞的过程。

术语“治疗”表示改善、抑制、根除所治疗的疾病和/或延迟所治疗的疾病的发作。

II.从脐带血制备诱导的多能干细胞的方法

一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许所述转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。

“诱导的多能干细胞”指通过人为方式来源于非多能细胞的多能干细胞。“非多能细胞”可以是自我更新能力和分化能力比多能干细胞差的细胞。能力较差的细胞可以是但不限于成体干细胞、组织特异性祖细胞、原代或次代细胞。成体干细胞是胚胎发育之后在全身均可发现的未分化的细胞。成体干细胞通过细胞分裂进行扩增，从而补充将死亡的细胞并再生受损组织。成体干细胞能分裂并产生与其相似的另一细胞，并且还能分裂并产生比其分化程度更高的细胞。尽管成体干细胞与多能性标志物例如REX1、Nanog、Oct4或Sox2的表达有关，但是它们不具有多能干细胞的分化为所有3个胚层的细胞类型的能力。成体干细胞的自我更新能力和产生独特细胞类型的后代的能力是有限的。成体干细胞可以是造血干细胞、脐带血干细胞、间充质干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞或神经干细胞，但不限于此。组织特异性祖细胞指缺乏自我更新潜能、已定向为向特定器官或组织分化的细胞。原代细胞包括除了卵细胞、精细胞和干细胞之外的成体或胎儿生物体的任何细胞。有用的原代细胞的实例包括但不限于皮肤细胞、骨细胞、血液细胞、内部器官的细胞和结缔组织的细胞。次代细胞来源于原代细胞，并且已经永生化为长期存活的体外细胞培养物。

“脐带血干细胞”是指存在于脐带血中的成体干细胞，其特征为自我更新能力和分化能力比多能干细胞差。

术语“转染(transfection)”或“转染(transfecting)”被定义为：将核酸分子通过非病毒或基于病毒的方法引入细胞的过程。非病毒转染方法包括不利用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统而将核酸分子引入细胞的任何合适的转染方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声波穿孔、通过热休克转染、磁转染和电穿孔。在一些实施方案中，利用电穿孔、按照本领域公知的标准步骤将核酸分子引入细胞。对于基于病毒的转染方法，任何有用的病毒载体都可以用于本文所述的方法中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，利用逆转录病毒载体、按照本领域公知的标准步骤将核酸分子引入细胞。

转染的基因的表达在细胞中可以瞬时或稳定发生。在“瞬时表达”过程中，转染的基因在细胞分裂过程中不会转移到子代细胞中。因为其表达限于转染的细胞，因此，该基因的表达随时间而丧失。相比之下，当转染的基因与赋予转染的细胞选择优势的另一基因共转染时，会发生该转染的基因的稳定表达。所述选择优势可以是对提供给细胞的某种毒素的抗性。还可以通过转座子介导的宿主基因组插入来实现转染的基因的进一步表达。在转座子介导的插入过程中，基因位于两个转座子连接序列之间，所述连接序列允许所述基因插入到宿主基因组中以及随后的切除。

本文涉及的“OCT4蛋白”包括任何天然存在形式的Octomer 4转录因子或它的能保持Oct4转录因子活性(例如，与Oct4相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的Oct4多肽(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，Oct4蛋白是由以下NCBI参考号所确定的蛋白：对应于同种型1的gi：42560248(SEQ ID NO：1)、对应于同种型2的gi：116235491和gi：291167755(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)。

本文涉及的“Sox2蛋白”包括任何天然存在形式的Sox2转录因子或它的能保持Sox2转录因子活性(例如，与Sox2相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的Sox2多肽(如SEQ ID NO：4)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，Sox2蛋白是NCBI参考号gi：28195386(SEQ ID NO：4)所确定的蛋白。

本文涉及的“KLF4蛋白”包括任何天然存在形式的KLF4转录因子或它的能保持KLF4转录因子活性(例如，与KLF4相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的KLF4多肽(如SEQ ID NO：5)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，KLF4蛋白是NCBI参考号gi：194248077(SEQ IDNO：5)所确定的蛋白。

本文涉及的“cMYC蛋白”包括任何天然存在形式的cMyc转录因子或它的能保持cMyc转录因子活性(例如，与cMyc相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的cMyc多肽(如SEQ ID NO：6)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，cMyc蛋白是NCBI参考号gi：71774083(SEQ ID NO：6)所确定的蛋白。

本文涉及的“NANOG蛋白”包括任何天然存在形式的Nanog转录因子或它的能保持Nanog转录因子活性(例如，与Nanog相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的Nanog多肽(如SEQ ID NO：7)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，Nanog蛋白是NCBI参考号gi：153945816(SEQID NO：7)所确定的蛋白。

本文涉及的“LIN28蛋白”包括任何天然存在形式的Lin28转录因子或它的能保持Lin28转录因子活性(例如，与Lin28相比，活性在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的变体。在一些实施方案中，与天然存在的Lin28多肽(如SEQ ID NO：8)相比，变体在全序列或序列的一部分(如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，Lin28蛋白是NCBI参考号gi：13375938(SEQ ID NO：8)所确定的蛋白。

允许转染的脐带血干细胞进行分裂并从而形成诱导的多能干细胞可以包括，在转染后扩增脐带血干细胞、任选地选择转染的细胞并鉴定多能干细胞。本文所用的扩增包括在本领域公知的条件下、在容器中由转染的脐带血干细胞产生后代细胞。扩增可以在合适的培养基和细胞生长因子的存在下发生。细胞生长因子是使细胞发生迁移、分化、转化或成熟和分裂的试剂。它们是通常能从各种正常和恶性哺乳动物细胞类型分离的多肽。某些生长因子也可以由基因工程微生物产生，例如细菌(大肠杆菌(E.coli))和酵母。可以将细胞生长因子补充到培养基中和/或通过与分泌所述细胞生长因子的照射的胚胎成纤维细胞共培养来提供细胞生长因子。细胞生长因子的实例包括但不限于FGF、bFGF2和EGF。

在合适的情况下，转染的脐带血干细胞的扩增可以经历选择过程。选择过程可以包括通过转染引入脐带血干细胞的选择标记。选择标记可以是编码具有酶活性的多肽的基因。酶活性包括但不限于乙酰转移酶和磷酸转移酶活性。在一些实施方案中，选择标记的酶活性是磷酸转移酶活性。选择标记的酶活性可以赋予转染的脐带血干细胞在毒素存在下扩增的能力。这类毒素通常抑制细胞扩增和/或导致细胞死亡。这类毒素的实例包括但不限于潮霉素、新霉素、嘌呤霉素以及庆大霉素。在一些实施方案中，毒素是潮霉素。通过选择标记的酶活性，毒素可以被转变为不再抑制转染的脐带血干细胞扩增和导致细胞死亡的非毒素。一旦暴露于毒素，缺少选择标记的细胞可以被清除，并由此阻止其扩增。

诱导的多能干细胞的鉴定可以包括但不限于评价上述多能干细胞的特征。这类多能干细胞的特征包括但不限于，分子标志物的某些组合的表达或不表达。此外，与多能干细胞有关的细胞形态也是多能干细胞的特征。

如上文所述，可以用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染本文的方法所提供的脐带血干细胞。在一些实施方案中，不用编码cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸转染脐带血干细胞。

在一些实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸形成质粒的一部分，并且编码SOX2蛋白的核酸形成质粒的一部分。在另一实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸形成同一质粒的一部分。在一个实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸形成第一质粒的一部分，并且编码SOX2蛋白的核酸形成第二质粒的一部分。

另一方面，提供了制备诱导的多能干细胞的方法。所述方法包括用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。

在一个实施方案中，不用编码cMYC蛋白、LIN28蛋白、NANOG蛋白或KLF4蛋白的其它核酸转染脐带血干细胞。

在一些实施方案中，本文提供的方法所用的脐带血细胞表达CD133抗原。“CD133抗原”是5个跨膜结构域的糖蛋白，大小为120kD。成体干细胞和祖细胞可以表达CD133抗原。CD133抗原还称为PROML1、AC133、造血干细胞抗原、hProminin、prominin样1、prominin、RP41、MCDR2、STGD4、CORD12或MSTP061。在一些实施方案中，CD133抗原是由NCBI参考号gi：225690512(SEQ ID NO：9)确定的基因所编码的蛋白。

在一些实施方案中，本文提供的方法所用的脐带血干细胞来源于新鲜脐带血。“新鲜脐带血”是来自新生儿的脐带的血液，如果不过早地夹住脐带，脐带血会返回新生儿的循环。本文所指的新鲜脐带血不是从脐带分离后低温保存的。术语“低温保存”是指利用液氮冷冻诸如脐带血的生物材料，从而长期保存所述生物材料的过程。在其它实施方案中，本文提供的方法所用的脐带血干细胞来源于冷冻脐带血。冷冻脐带血是来自新生儿的脐带的血液，但是该血液在按照本文提供的方法处理之前被低温保存。

III.诱导的多能干细胞

另一方面，提供了按照本文的方法制备的诱导的多能干细胞。上文名为“从脐带血制备诱导的多能干细胞的方法”的章节中所述的方法同等地适用于本文提供的诱导的多能干细胞。

IV.脐带血干细胞

一方面，提供了包含编码OCT4蛋白的核酸(例如编码OCT4蛋白的外源核酸或编码OCT4蛋白的重组核酸)和编码SOX2蛋白的核酸(例如编码SOX2蛋白的外源核酸或编码SOX2蛋白的重组核酸)的脐带血干细胞。当涉及编码本文所用的蛋白的核酸时，术语“外源”表示不是天然存在于其所在的细胞(例如脐带血细胞)。在一些实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸形成质粒的一部分，并且编码SOX2蛋白的核酸形成质粒的一部分。在另一实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸形成同一质粒的一部分。在一个实施方案中，编码OCT4蛋白的核酸形成第一质粒的一部分，并且编码SOX2蛋白的核酸形成第二质粒的一部分。在一些实施方案中，脐带血干细胞不包含编码已知可用于iPS细胞形成的其它转录因子的核酸，例如编码cMYC蛋白的核酸(例如编码cMYC蛋白的外源核酸或编码cMYC蛋白的重组核酸)、编码LIN28蛋白的核酸(例如编码LIN28蛋白的外源核酸或编码LIN28蛋白的重组核酸)、编码NANOG蛋白的核酸(例如编码NANOG蛋白的外源核酸或编码NANOG蛋白的重组核酸)和/或编码KLF4蛋白的核酸(例如编码KLF4蛋白的外源核酸或编码KLF4蛋白的重组核酸)。

在其它实施方案中，所述脐带血干细胞基本上由编码OCT4蛋白的核酸(例如编码OCT4蛋白的外源核酸或编码OCT4蛋白的重组核酸)和编码SOX2蛋白的核酸(例如编码SOX2蛋白的外源核酸或编码SOX2蛋白的重组核酸)组成。如果脐带血干细胞“基本上由编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸组成”，则所述脐带血干细胞不包含编码已知可用于iPS细胞形成的其它转录因子的核酸，例如编码cMYC蛋白的核酸(例如编码cMYC蛋白的外源核酸或编码cMYC蛋白的重组核酸)、编码LIN28蛋白的核酸(例如编码LIN28蛋白的外源核酸或编码LIN28蛋白的重组核酸)、编码NANOG蛋白的核酸(例如编码NANOG蛋白的外源核酸或编码NANOG蛋白的重组核酸)和/或编码KLF4蛋白的核酸(例如编码KLF4蛋白的外源核酸或编码KLF4蛋白的重组核酸)。在一些实施方案中，所述脐带血干细胞不包含编码其它转录因子的核酸(例如编码转录因子的其它外源核酸或编码转录因子的其它重组核酸)。在其它实施方案中，所述脐带血干细胞不包含编码其它蛋白表达基因的核酸(例如编码蛋白的其它外源核酸或编码蛋白的其它重组核酸)。

另一方面，提供了包含编码OCT4蛋白的核酸(例如编码OCT4蛋白的外源核酸或编码OCT4蛋白的重组核酸)的脐带血干细胞。在其它实施方案中，所述脐带血干细胞基本上由编码OCT4蛋白的核酸(例如编码OCT4蛋白的外源核酸或编码OCT4蛋白的重组核酸)组成。如果脐带血干细胞“基本上由编码OCT4蛋白的核酸组成”，则所述脐带血干细胞不包含编码已知可用于iPS细胞形成的其它转录因子的核酸，例如编码cMYC蛋白的核酸(例如编码cMYC蛋白的外源核酸或编码cMYC蛋白的重组核酸)、编码LIN28蛋白的核酸(例如编码LIN28蛋白的外源核酸或编码LIN28蛋白的重组核酸)、编码NANOG蛋白的核酸(例如编码NANOG蛋白的外源核酸或编码NANOG蛋白的重组核酸)和/或编码KLF4蛋白的核酸(例如编码KLF4蛋白的外源核酸或编码KLF4蛋白的重组核酸)。在一些实施方案中，所述脐带血干细胞不包含编码其它转录因子的核酸(例编码转录因子的其它外源核酸或编码转录因子的其它重组核酸)。在其它实施方案中，所述脐带血干细胞不包含编码其它蛋白表达基因的核酸(例如编码蛋白的其它外源核酸或编码蛋白的其它重组核酸)。

在一些实施方案中，所述脐带血干细胞表达CD133抗原。在其它实施方案中，所述脐带血干细胞来源于新鲜脐带血。在一些实施方案中，所述脐带血干细胞来源于冷冻脐带血。

V.从无足迹的人类诱导的多能干细胞制备人类体细胞的方法

一方面，提供了制备人类体细胞的方法。所述方法包括使诱导的多能干细胞与细胞生长因子接触。允许诱导的多能干细胞进行分裂，从而形成人类体细胞。允许诱导的多能干细胞在合适的培养基和细胞生长因子的存在下进行分裂。细胞生长因子的实例包括但不限于SCF、GMCSF、FGF、TNF、IFN、EGF、IGF和白介素家族的成员。按照本发明提供的方法制备诱导的多能干细胞。在一些实施方案中，制备诱导的多能干细胞的方法包括以下步骤：用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，制备诱导的多能干细胞的方法包括以下步骤：用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。

另一方面，提供了治疗需要组织修复的哺乳动物的方法。所述方法包括将诱导的多能干细胞给予哺乳动物，并允许诱导的多能干细胞进行分裂并分化为哺乳动物的体细胞，从而为所述哺乳动物提供组织修复。在一些实施方案中，制备诱导的多能干细胞的方法包括以下步骤：用编码OCT4蛋白的核酸和编码SOX2蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。在另一实施方案中，制备诱导的多能干细胞的方法包括以下步骤：用编码OCT4蛋白的核酸转染脐带血干细胞，从而形成转染的脐带血干细胞。允许转染的脐带血干细胞进行分裂，从而形成诱导的多能干细胞。

实施例

为了分离CB干细胞，利用免疫磁性选择，从CB单位纯化CD133+细胞，从而获得纯度为90-94％的细胞群体(图3A)。为了促进静止的CD133+干细胞的增殖，在干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、Flt配体3(Flt3)和白介素6(IL-6)的存在下将细胞培养24小时。按照用于贴壁细胞的方案¹⁰并进行一些改动来感染这些细胞。简言之，将细胞接种在retronectin包被的平板上，事先按照之前所述¹⁹使这些平板预先吸附病毒颗粒。在对照实验中，利用组成型GFP逆转录病毒对纯化的CD133+群体进行3轮感染，每12小时一轮，并利用流式细胞术在感染后3天分析得到的群体；图3B展示了典型的实验结果：全部细胞中的28％是GFP阳性的，并且全部细胞中的58％仍然是CD133抗原阳性的。在GFP阳性群体中，17％为CD133+/GFP+，11％为CD133-/GFP+。

试图利用任何单独的OSKM因子或OSKM因子的组合对CD133+细胞进行重新编程。转导后3天，将细胞接种在照射的人类包皮成纤维细胞(HFF-I)饲养细胞上，并在含bFGF的hES培养基中培养。为了排除类似ES的培养条件本身能诱导重新编程的可能性，还在hES细胞条件下将未转导的CD133+干细胞培养3周。在这些平板中未观察到集落形成。那些细胞的流式细胞术分析表明：它们不再表达干细胞标志物CD133、CD34和CD38，仍然对造血标志物CD45是阳性的，但是未获得胚胎标志物SSEA-3、SSEA-4或TRA1-60，上述结果提示：当在hES细胞条件下培养时，未转导的CD133+细胞分化为成熟的造血细胞(图1C)。

感染后约9天，用OSKM、OSK或OS转导的细胞中开始出现小的集落。感染后12-15天时，部分的集落表现出典型的hES细胞形态，具有尖的边缘，并且由小的、紧密填充的细胞群体构成，该细胞群体具有大的细胞核和清晰可见的核仁(图1A)。从8×10⁴个CD133+细胞的标准转染中，观察到4-5个hES样集落，并将其命名为CBiPS。通过手动挑选扩增集落，并且扩增来自每种因子组合的CBiPS系(CBiPS 4F-1、CBiPS3F-1、CBiPS 2F-1)用于进一步表征。通过PCR基因分型验证每种逆转录病毒转基因的存在，分别证实了CBiPS 4F-1、CBiPS 3F-1、CBiPS 2F-1中插入了预期的4、3或2种转录因子(图1B)。

所有3种CBiPS系对于碱性磷酸酶都是阳性染色的(图1C)，并且正如免疫荧光染色所测定的，这些CBiPS系表达多能性标志物OCT4、SOX2、TRA-1-81、TRA-1-60、SSEA3、SSEA4和NANOG(图1D)。此外，正如流式细胞术所测定的，重新编程的CBiPS系对于造血干细胞标志物CD45、CD34和CD38是阴性的。然而，它们对于造血干细胞和胚胎干细胞的共同标志物CD133是阳性的(图1E)。与之前的免疫学表征相同，实时PCR分析表明：所有3种CBiPS系都表达多种多能性基因，包括OCT4、SOX2、NANOG、CRIPTO和REX，这反映出与其它iPS¹⁰和hES[2]细胞系²⁰相似的基因表达谱(图2A)。此外，正确地沉默了逆转录病毒转基因的表达，并且由相应的内源基因驱动CBiPS系中OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC的表达(图2B)。这一点也通过利用具有FLAG标签的转基因因子的特异性抗体的免疫荧光染色而得到证实(图8A-8B)。

CD133+干细胞而不是成纤维细胞和角质细胞表达低水平的内源OCT4、NANOG、SOX2、REX1和CRIPTO(图2C)，从而指向允许快速重新编程的更可塑的表观遗传学状态。此外，还发现与成纤维细胞相比，CD133+细胞中OCT4和NANOG的启动子具有低水平的组蛋白抑制型标志(H3K7和H3K9甲基化)(图2D)，这提示存在可能利于由过表达的因子结合并转录激活这些基因的更宽松的染色质组织。此外，与成纤维细胞和角质细胞相比(图2C，图2E)，CB CD133+干细胞中高水平的KLF4和c-MYC的组合可能进一步表明：这些因子的内源表达可以允许那些细胞的更快速的和/或增强的重新编程¹⁰。

细胞发生学分析表明：3种细胞系在10代后仍保持正常的46XY核型。此外，雄性染色体的含量排除了重新编程的细胞来源于已知存在于原始脐带血样品中的少部分污染性母体细胞的可能性(图11A)。然后，通过体外类胚胎体形成评价CBiPS细胞系的分化潜能。所有细胞系都能高效地形成类胚胎体(EB)(图12A)，并且EB能分化为所有3种胚胎胚层的细胞类型，包括FoxA2和α-辅肌动蛋白阳性的中胚层、GFAP和Tuj1阳性的外胚层和α-胎蛋白阳性的内胚层(图12B-12F)。结果证实：CBiPS4F-1、CBiPS 3F-1、CBiPS 2F-1细胞系在转录水平重新编程为与其它hiPS和hES细胞系相似的状态、在核型上是稳定的并且表现出符合多能性的体外发育潜能。

通过表达多能性因子和癌基因的组合能实现体细胞的重新编程。仅用两周并仅利用2种因子就能将CB CD133+干细胞重新编程的事实，突出了CB细胞作为为再生医学开发临床适用的iPS细胞的体细胞理想来源的潜能。这可以包括利用非整合或半整合方法^21-23，以及用小分子替换OCT4或SOX2^24，25。如果考虑其它易控体细胞来源，最近证实动员的外周血(mPB)细胞也能为iPS衍生提供有效来源²⁶。然而，与新生CB干细胞相比，成体mPB细胞更易于积累基因组改变，这可以由于衰老或直接由特定的疾病造成。此外，用于动员成体造血干细胞室的药学处理对供体造成健康风险：在较小但不可忽视的比例的供体中，该过程能引起严重的反应，包括脾破裂²⁷。

CB干细胞克服了这些问题，其易于获得，并且由于它们是早期来源的，因此仍然是免疫上未成熟的，从而允许较低的HLA-供体-受体选择的标准¹⁵。至今，全世界脐带血库的综合网络可提供超过400,000CB单位，这有利于快速且有效地搜索相容的供体来产生CBiPS²。尽管产生患者特异性iPS系被再三地提议为理论上理想的临床选择，但是从实际性和成本效益的方面来看，该方法在很多情况下都是不可行的。大规模生产和储备CBiPS系在公开的网络中提供多种HLA单体型，这会为人类iPS细胞的基础研究和未来的临床应用提供极其重要的工具。

VI.材料和方法

样品收集

脐带CB样品获自Bane de Sang i Teixits，Hospital Duran i Reynals，Barcelona。

CD133+细胞纯化

利用淋巴细胞-H(Cederlane，Ontario，CA)密度梯度离心从CB分离单核细胞(MNC)。利用Mini-Macs免疫磁性分离系统(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)阳性选择CD133+细胞。通过利用CD133-藻红蛋白(PE；Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)抗体染色的流式细胞术分析验证纯化效率。

构建体和逆转录病毒制备

通过RT-PCR从ES[4]总RNA扩增OCT4和SOX2的人类cDNA；从IMAGE克隆5111134扩增人类KLF4，从Luciano Di Croce赠予的DNA模板扩增突变的人类c-MYCT58A。将扩增的cDNA克隆到修改的pMSCVpuro载体的EcoRI/ClaI位点，该载体允许N末端具有FLAG标签的蛋白的表达。按照下述构建pMXs-OSKMG：利用去除了Oct4终止密码子并添加了BspEI位点的反向引物扩增小鼠Oct4cDNA，并将其克隆到pCRII(Invitrogen)，从而得到pCRII-Oct4-Bsp(方向为NotI-5′cDNA3′-Acc65I)。利用含有AgeI位点和在其后面的P2A肽序列的正向引物和去除了Sox2终止密码子并含有BspEI位点的反向引物扩增小鼠Sox2cDNA；将该片段克隆到pCRII中，从而得到pCRII-Age-Sox2-Bsp(方向为NotI-5′cDNA3′-Acc65I)。用AgeI和Acc65I切割pCRII-Age-Sox2-Bsp，并克隆到用BspEI-Acc65I切割的pCRII-Oct4-Bsp，从而产生pCRII-Oct4-P2A-Sox2-BspEI。相同的克隆方法重复两次，从而并入小鼠Klf4和eGFP(产生pCRII-OSKG)或小鼠KIf 4、c-Myc和eGFP(产生pCRII-OSKMG)。最后，用EcoRI切割pCRII-OSKG和pCRII-OSKMG，并克隆到逆转录病毒空载体pMXs的特有EcoRI位点，从而产生pMXs-OSKG和pMXs-OSKMG。利用Fugene 6试剂(Roche)、按照厂商说明书转染Phoenix Amphotropic细胞系后，独立地产生4种因子的逆转录病毒。24小时后，更换培养基，在32℃下孵育细胞，并且每12小时收获病毒上清液。

CD133+细胞的转导

在补充了10％FBS的DMEM中、在SCF(50ng/ml)+Flt3(50ng/ml)+TPO(10ng/ml)+IL-6(10ng/ml)(PeproTech)的存在下，预先刺激CBCD133+细胞(1×10⁵个细胞/ml)24小时。将非组织培养处理的多孔板用四连接素(Tetranectin，其是纤连蛋白片段CH-296)(Takara，Otsu，Japan，www.takara-bio.com)进行包被(15mg/cm²)，并且通过将含有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC因子的逆转录病毒上清液的过滤的1∶1∶1∶1混合物的平板在2,500RPM下离心30分钟进行预装。在DMEM+10％FBS和上述细胞因子混合物的存在下接种约80,000个CD133+细胞。每12小时，用含有细胞因子混合物的新鲜病毒上清液更换一半的培养基，并在37℃、5％CO₂下孵育；进行3个感染周期。第3天时，收获细胞，并将其转移到含照射的人类成纤维细胞和ES培养基的6孔板，ES培养基的组成为：KO-DMEM培养基(Invitrogen)并补充20％KO-血清替代品(GIBCO)、非必需氨基酸(Lonza)、2-β-巯基乙醇(GIBCO)、青霉素/链霉素(GIBCO)、GlutaMAX^TM(Invitrogene)和10ng/ml bFGF(Peprotech)。CBiPS细胞在照射的人类成纤维细胞的顶部进行培养并且手动挑取。

总RNA的纯化和定量RT-PCR

利用Trizol

试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)或RNAqueous

微型试剂盒(Ambion Inc.，Austin TX)，根据可用细胞数，从CB CD133+干细胞、hES[2]细胞、KiPS细胞(14)和CBiPS分离总RNA。用TURBO DNA酶抑制剂(Ambion)处理所有样品，从而去除任何残留基因组DNA，并利用Invitrogen Superscript^TM II逆转录酶试剂盒，使用1μg RNA来合成cDNA。通过定量RT-PCR、利用之前所述的引物¹⁰，使用25ng cDNA来定量基因表达。

GeneChip

表达分析

按照厂商说明(Affymetrix，Santa Clara，CA)，由生物医学研究所(Institute for Research in Biomedicine(Barcelona，Spain))的功能基因组学中心(Functional Genomica Core)进行GeneChip

微阵列处理。按照Nugen流程的说明、利用25ng起始RNA进行扩增和标记。对于每个样品，将3.75μg ssDNA进行标记，并使其与Affymetrix HG-U133 Plus 2.0芯片杂交。在Affymetrix基因芯片扫描仪(7G升级)上扫描表达信号。利用Affymetrix GCOS软件v.1.4进行数据提取。利用计算机统计学R Project的程序R进行数据的统计学分析。首先，利用R中执行的gcRMA算法将原始数据标准化，并且对标准化的数据进行利用皮尔逊相关系数的分级群聚。为了整合从两个不同实验获得的数据集(我们的角质细胞重新编程(GEO登录号：GSE12583)和本实验(GSE16694))，我们利用R中的gcRMA算法将原始CEL文件共同标准化并，然后利用本领域已知的ComBat算法校正批次效应。参见，例如Johnson et al.，2007，Biostatistics8：118-127。

Southern印迹

利用All Prep DNA/RNA柱(Qiagen)、按照厂商指导，从每种细胞系分离基因组DNA。Southern印迹的每个泳道对应于用40U PstI或HindIII限制性酶(New England Biolabs)消化的4μg基因组DNA，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，转移到中性尼龙膜(Hybond^TM-N，Amersham)，并与DIG-dUTP标记的探针杂交，DIG-dUTP标记的探针是通过利用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)的PCR生成的。利用AP偶联DIG抗体(Roche Diagnostics)并利用CDP-Star(Sigma-Aldrich)作为化学发光底物来检测探针。条件遵照厂商的说明。用SOX2、OCT4、KLF4和c-MYCcDNA作为模板并利用下述引物(F：正向；R：反向)生成探针：

SOX2 F：5′-AGTACAACTCCATGACCAGC-3′(SEQ ID NO：10)；

SOX2 R：5′-TCACATGTGTGAGAGGGGC-3′(SEQ ID NO：11)；

OCT4 F：5′-TAAGCTTCCAAGGCCCTCC-3′(SEQ ID NO：12)；

OCT4 R：5′-CTCCTCCGGGTTTTGCTCC-3′(SEQ ID NO：13)；

KLF4 F：5′-AATTACCCATCCTTCCTGCC-3′(SEQ ID NO：14)；

KLF4 R：5′-TTAAAAATGCCTCTTCATGTGTA-3′(SEQ ID NO：15)；

c-MYC F：5′-TCCACTCGGAAGGACTATCC-3′(SEQ ID NO：16)；

c-MYC R：5′-TTACGCACAAGAGTTCCGTAG-3′(SEQ ID NO：17)。

免疫荧光分析和AP分析

使CBiPS在塑料盖片槽上生长，并用4％多聚甲醛(PFA)进行固定。使用以下抗体：TRA-1-60(MAB4360，1∶200)、TRA-1-81(MAB4381，1∶200)、SOX2(AB5603，1∶500)(以上均来自Chemicon)、SSEA-4(MC-813-70，1∶2)、SSEA-3(MC-631，1∶2)(以上均来自Iowa)，Tuj1(1∶500；Covance)，α-胎蛋白(1∶400；Dako)，α-辅肌动蛋白(1∶100；Sigma)、OCT4(C-10，SantaCruz，sc-5279，1∶100)、NANOG(Everest Biotech EB06860，1∶100)、GATA4(1∶50，SantaCruz)、平滑肌肌动蛋白(1∶400，Sigma)、FoxA2(1∶50R&D System)、GFAP(1∶1000，Dako)、α-横纹肌肌动蛋白(1∶400，Sigma)、抗Flag(Sigma M2)。利用Leica SP5共聚焦显微镜采集图像。利用碱性磷酸酶蓝/红膜底物溶液试剂盒(Sigma)、按照厂商指导，分析直接AP活性。

体外分化

从手动收集的集落碎块诱导EB形成，并然后在hES培养基中悬浮保持24小时。我们进行了2-3天的预条件培养，其中将EB保持在超低贴壁平板的3种不同的分化培养基中。具体而言，对于内胚层分化，将EB培养在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM 2-β-巯基乙醇、非必需氨基酸和青霉素/链霉素的KO-DMEM培养基中。对于中胚层分化，我们使用与上述相同的培养基，但添加了抗坏血酸(0.5mM)。对于外胚层诱导，将EB培养在N2/B27培养基中。预条件步骤后，将内胚层和中胚层条件下的EB转移到0.1％明胶包被的塑料槽滑片中，并分别在分化培养基和分化培养基+抗坏血酸(0.5nM)中培养2周。对于外胚层分化，将EB转移到基质细胞系PA6并在N2/B27培养基中培养2周。每隔一天更换每种条件的培养基。

染色质免疫沉淀

利用Diagenode的Magnetic Low cell ChIP试剂盒、按照厂商说明并且每次免疫沉淀使用15,000个细胞来进行染色质免疫沉淀实验。所用抗体来自Millipore 07-440(抗H3K27me3)、07-030(抗H3K4me2)和17-625(抗H3K9me3)。

启动子甲基化分析

利用QIA AMP DNA小型试剂盒(Qiagen)，从约500,000个CD133+和CBiPS细胞的样品提取基因组DNA。利用Epitect Bisulfite试剂盒(Qiagen)、按照厂商说明，诱变2μg纯化的DNA。通过利用之前所述引物的2次连续PCR¹⁰来扩增目的启动子序列。将得到的扩增产物克隆到pGEM T Easy质粒中，在TOP10细胞中扩增，进行纯化并测序。

畸胎瘤形成

将重度联合免疫缺陷(SCID)拜格小鼠(Charles River Laboratories)麻醉，并且将悬浮于20-40μl hES培养基中的约0.5×10⁶个CBiPS细胞注射到睾丸中。细胞注射后6-8周，将小鼠处死，按照常规免疫组化(Masson三色染色)和免疫荧光流程处理和分析肿瘤。

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