JP2011525794A

JP2011525794A - ｉＰＳ細胞の製造方法および製造キット

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Publication number: JP2011525794A
Application number: JP2010550768A
Authority: JP
Inventors: 純一宮崎; 文田代; 早月宮崎; 英司倭
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2008-06-26
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2011-09-29
Also published as: WO2009157201A1

Abstract

レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターのような、外来遺伝子を宿主細胞の染色体へ組み込むベクターを用いることなくｉＰＳ細胞を製造する方法、およびそのためのキットを提供する。核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する核初期化因子導入工程と、エピゾーマルベクターが導入された体細胞を培養する培養工程と、体細胞から変化したｉＰＳ細胞を選抜する選抜工程とを包含するｉＰＳ細胞の製造方法である。

Description

本発明は、ｉＰＳ細胞の製造方法および製造キットに関するものであり、特に、エピゾーマルベクターを用いることで外来遺伝子が染色体に組み込まれない安全なｉＰＳ細胞の製造方法および製造キットに関するものである。

ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells、人工多能性幹細胞もしくは誘導多能性幹細胞とも称される）とは、分化した体細胞（例えば、線維芽細胞）へ数種類の転写因子（遺伝子）を導入することにより樹立された、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）に似た分化万能性（pluripotency）を持つ細胞のことである。京都大学の山中伸弥らのグループによって世界で初めて作出された（特許文献１、非特許文献１）。元来、生物を構成する種々の細胞に分化し得る分化万能性は、胚盤胞期の胚の一部である内部細胞塊や、そこから培養されたＥＳ細胞、ＥＳ細胞と体細胞の融合細胞、および一部の生殖細胞由来の培養細胞のみに見られる特殊能力であった。しかし、ｉＰＳ細胞樹立法の発見により、受精卵やＥＳ細胞をまったく使用せずに分化万能細胞を作製することが可能となった。

上記山中伸弥らは、レトロウイルスベクター遺伝子発現系を用いてマウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ-Ｍｙｃを発現させると、全能性細胞（ｉＰＳ細胞）が樹立できることを示した（非特許文献１，２）。マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ（Rudolf Jaenisch）らのグループ（非特許文献３）、ハーバード幹細胞研究所のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループ、ＵＣＬＡ医科大学のキャスリン・プラース（Kathrin Plath）らのグループ（非特許文献４）も、同様の方法を用いてマウスｉＰＳ細胞の樹立に成功した。さらに、ルドルフ・ヤニッシュらは、ＥＳ細胞特異的遺伝子の発現指標を使用しなくても、細胞の形態変化を観察するだけでｉＰＳ細胞を単離できることを示した（非特許文献５）。カリフォルニア大学サンフランシスコ校のミゲル・ハマーリョ−サントス（Miguel Ramalho-Santos）らのグループは、レトロウイルスベクターの一種であるレンチウイルスベクターを用いてもｉＰＳ細胞の樹立は可能であることを示した（非特許文献６）。

山中伸弥らは、ｃ−Ｍｙｃの遺伝子導入をせずにＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４の３因子だけでも、効率は悪いもののマウスおよびヒトにおいてｉＰＳ細胞の樹立が可能であることを示し、ｉＰＳ細胞が癌細胞に変化するのを抑えることに成功した（非特許文献７）。ほぼ同時に、ルドルフ・ヤニッシュらもマウスで同様の実験に成功した（非特許文献８）。

ジェームズ・トムソン（James Thomson）らのグループは、山中伸弥らがマウスｉＰＳ細胞樹立に成功した時と同じ戦略を用い、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功した。すなわち、ヒトＥＳ細胞で特異的に発現している１４遺伝子をリストアップし、この中から、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｌｉｎ２８の４遺伝子を胎児胚由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入することで、ヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功した（非特許文献９）。時を同じくして、山中伸弥らのグループも、マウスｉＰＳ細胞樹立で使用されたマウス遺伝子のヒト相同遺伝子であるＯｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃを用いて、３６歳女性の顔の皮膚から単離された線維芽細胞、６９歳男性の線維芽様滑膜細胞、および新生児包皮由来の線維芽細胞から、それぞれヒトｉＰＳ細胞の樹立に成功した（非特許文献１０）。

分化万能性を持った細胞は、理論上体を構成するすべての組織や臓器に分化誘導することが可能であり、ヒトの患者自身からｉＰＳ細胞を樹立する技術が確立されれば、免疫拒絶の無い移植用組織や臓器の作製が可能になると期待されている。従来、ヒトＥＳ細胞の使用において懸案であった受精卵を使用することに対する倫理的問題の抜本的解決に繋がることから、再生医療の実現に向けて、世界中の注目が集まっている。

国際公開第２００７／０６９６６６号公報

Takahashi K, Yamanaka S. (2006). "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.". Cell 126: 663-676. Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. (2007). "Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.". Nature 448: 313-317. Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein BE, Jaenisch R. (2007). "In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.". Nature 448: 318-324. Maherali N, Sridharan R, Xie W, Utikal J, Eminli S, Arnold K, Stadtfeld M, Yachechko R, Tchieu J, Jaenisch R, Plath K, Hochedlinger K. (2007). "Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution". Cell Stem Cell 1: 55-70. Meissner A, Wernig M, Jaenisch R. (2007). "Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells.". Nat Biotechnol 25: 1177-1181. Blelloch R, Venere M, Yen J, Ramalho-Santos M. (2007). "Generation of induced pluripotent stem cells in the absence of drug selection". Cell Stem Cell 1: 245-247. Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. (2008). "Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts". Nat Biotechnol 26: 101-106. Wering M, Meissner A, Cassady JP, Jaenisch R. (2008). "c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts". Cell Stem Cell 2: 10-12. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. (2007). "Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells". Science 318: 1917-1920. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. (2007). "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.". Cell 131: 861-872.

ｉＰＳ細胞樹立の成功により、ＥＳ細胞の持つ生命倫理的問題を回避することができるようになり、免疫拒絶の無い再生医療の実現に向けて大きな一歩となったが、これまでのｉＰＳ細胞の作製には、レトロウイルスベクターあるいはそれに類似したレンチウイルスベクターによる遺伝子導入が使われている。これらのウイルスベクターは、染色体内のランダムな位置に遺伝子を導入するため、内在性遺伝子に変異を起こしたり、内在性発癌遺伝子の活性化を引き起こす可能性があり、将来的なｉＰＳ細胞の再生医療への利用において、細胞の癌化や機能異常などを起こす危険性をはらむ。それゆえ、染色体に影響を与えずにｉＰＳ細胞を作製する方法を開発することは、今後のｉＰＳ細胞の応用に向けて非常に重要な課題である。

そこで、本発明は、ｉＰＳ細胞の製造においてレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターのような、外来遺伝子を宿主細胞の染色体へ組み込むベクターを用いることなくｉＰＳ細胞を製造する方法、およびそのためのキットを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、エピゾーマルベクターを用いて核初期化因子をコードする遺伝子を線維芽細胞に導入することにより、外来遺伝子が染色体に組み込まれることなく核初期化因子が発現し、レトロウイルスベクターを用いた場合と同様に体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されることを見出した。さらに、導入されたエピゾーマルベクターは、ｉＰＳ細胞から除去することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明はｉＰＳ細胞の製造方法およびｉＰＳ細胞の製造キットに関し、以下の発明を包含する。
［１］体細胞の核初期化によりｉＰＳ細胞を製造する方法であって、核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する核初期化因子導入工程と、エピゾーマルベクターが導入された体細胞を培養する培養工程と、体細胞から変化したｉＰＳ細胞を選抜する選抜工程とを包含することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法。
［２］前記核初期化因子導入工程の前に、さらに複製因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する複製因子導入工程を包含することを特徴とする前記［１］に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
［３］前記選抜工程の後に、さらにｉＰＳ細胞からエピゾーマルベクターを除去するベクター除去工程を包含することを特徴とする前記［１］または［２］に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
［４］エピゾーマルベクターが、レトロウイルス由来のプロモーターにより核初期化因子をコードする遺伝子および／または前記複製因子をコードする遺伝子を発現させることを特徴とする前記［３］に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
［５］エピゾーマルベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子および／または複製因子をコードする遺伝子の発現を、薬剤により制御可能に構成されていることを特徴とする前記［３］に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
［６］エピゾーマルベクターが、マウスポリオーマウイルス由来エピゾーマルベクター、ＢＫウイルス由来エピゾーマルベクター、エプスタイン−バールウイルス由来エピゾーマルベクター、ウシパピローマウイルス由来エピゾーマルベクター、および、Ｓ／ＭＡＲを含むエピゾーマルベクターからなる群より選ばれることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
［７］核初期化因子が、以下の(1)、(2)および(3)からなる群より選ばれることを特徴とする前記［１］〜［６］のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
(1) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(2) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種と、iv)ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃからなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(3) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｎａｎｏｇと、iv)Ｌｉｎ２８との組み合わせ
［８］核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを包含することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造キット。
［９］エピゾーマルベクターが、マウスポリオーマウイルス由来エピゾーマルベクター、ＢＫウイルス由来エピゾーマルベクター、エプスタイン−バールウイルス由来エピゾーマルベクター、ウシパピローマウイルス由来エピゾーマルベクター、および、Ｓ／ＭＡＲを含むエピゾーマルベクターからなる群より選ばれることを特徴とする前記［８］に記載のｉＰＳ細胞の製造キット。
［１０］核初期化因子が、以下の(1)、(2)および(3)からなる群より選ばれることを特徴とする前記［８］または［９］に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
(1) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(2) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種と、iv)ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃからなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(3) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｎａｎｏｇと、iv)Ｌｉｎ２８との組み合わせ

本発明のｉＰＳ細胞の製造方法によれば、外来遺伝子が染色体に組み込まれていないｉＰＳを製造することができる。それゆえ、得られるｉＰＳ細胞は非常に安全性が高く、外来遺伝子の染色体への組み込みに起因する内在性遺伝子の変異誘発や、内在性発癌遺伝子の活性化を引き起こす可能性がない。したがって、本発明の製造方法を用いて患者の体細胞からｉＰＳ細胞を製造し、得られたｉＰＳ細胞を所望の分化細胞や組織に誘導後患者に戻す自家移植療法において、癌化や機能異常発生のリスクを低く抑えることができる。このように、本発明は再生医療分野に高い利用価値を有し、将来の再生医療発展に大きな貢献をもたらす。

エピゾーマルベクターを用いたｉＰＳ細胞の製造方法を、実施例に即して模式的に示した説明図である。ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏの構造を示す図である。ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏの構造を示す図である。ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏを導入したＢＭＴ１０細胞株の免疫染色結果を示す蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はＯｃｔ３／４の免疫染色画像、（ｂ）はＫｌｆ４の免疫染色画像、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせた画像、（ｄ）は（ｃ）にＤＡＰＩ染色を重ね合わせた画像である。ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを導入したＢＭＴ１０細胞株の免疫染色結果を示す蛍光顕微鏡画像であり、（ａ）はＳｏｘ２の免疫染色画像、（ｂ）はｃ−Ｍｙｃの免疫染色画像、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせた画像、（ｄ）は（ｃ）にＤＡＰＩ染色を重ね合わせた画像である。ゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上で培養開始してから１５日後の顕微鏡写真である。ゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上で培養開始してから１５日後の顕微鏡写真であり、図６Ａとは異なるコロニーを示す。ゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上で培養開始してから１５日後にコロニーを分離し、さらに４日間培養した後の顕微鏡写真である。本図は、低倍率で観察したコロニーの画像を示す。ゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上で培養開始してから１５日後にコロニーを分離し、さらに４日間培養した後の顕微鏡写真である。本図は、高倍率で観察したコロニーの画像を示す。実施例１で作製したマウス胚性線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示す写真である。ｐＢＫ−ＣＯＫ−ＣＳＭの構造を示す図である。実施例２で作製したヒト角化細胞由来ｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示す写真である。

〔ｉＰＳ細胞の製造方法〕
本発明は、体細胞の核初期化によりｉＰＳ細胞を製造する方法であって、核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する核初期化因子導入工程と、エピゾーマルベクターが導入された体細胞を培養する培養工程と、体細胞から変化したｉＰＳ細胞を選抜する選抜工程とを包含することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という。）を提供する。

「ｉＰＳ細胞」とはＥＳ細胞に類似した性質を有する細胞のことであり、具体的には、分化多能性および増殖能を有する細胞である。ｉＰＳ細胞は、「人工多能性幹細胞」や「誘導多能性幹細胞」とも称される。
「体細胞」とは、ＥＳ細胞等の未分化・多能性維持細胞を除く全ての細胞を意味する。具体的には、例えば、(i) 神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、(ii) 組織前駆細胞、(iii) リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分化細胞、などが挙げられる。本発明の製造方法に用いる体細胞の種類は特に限定されず、いずれの体細胞でも好適に用いることができる。

「核初期化因子」とは、分化した体細胞を初期化してｉＰＳ細胞を誘導する作用を有する物質を意味する。本発明の製造方法では、核初期化因子をコードする遺伝子が体細胞に導入され、体細胞内で核初期化因子（タンパク質）が発現することにより、体細胞をｉＰＳ細胞に誘導する。本発明に用いられる核初期化因子は、上記の作用を有するものであれば特に限定されない。好ましい核初期化因子としては、(1) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種との組み合わせ、(2) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種と、iv)ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃからなる群より選ばれる１種との組み合わせ、(3) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｎａｎｏｇと、iv)Ｌｉｎ２８との組み合わせを挙げることができる。
なかでも(1)としてはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ（非特許文献７参照）、(2)としてはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ（非特許文献１参照）、(3)としてはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ（非特許文献９参照）が特に好ましい。
上記Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ５、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８については、非特許文献７に記載されている。これら以外にもｎ−Ｍｙｃ（非特許文献６参照）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ｌａｒｇｅＴ（以上、Park IH, Zhao R, West JA, Yabuuchi A, Huo H, Ince TA, Lerou PH, Lensch MW, Daley GQ. (2007). “Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.” Nature 451: 141-146.参照）などが核初期化因子として知られており、上記(1)〜(3)の組み合わせに、さらにこれらの核初期化因子の１種以上を加えて用いることができる。なお、本発明の製造方法に用いられる核初期化因子は、上記例示したものに限定されず、例示していない核初期化因子や、今後見出される核初期化因子も本発明に好適に用いることができる。

「エピゾーマルベクター」とは、有核細胞の核内で環状ＤＮＡとして自己複製し、数コピーから数十コピーで維持されるプラスミドベクターを意味する。このような性質を有するエピゾーマルベクターであれば、特に限定されることなく本発明の製造方法に用いることができる。具体的には、例えばマウスポリオーマウイルス由来のエピゾーマルベクター（Gassmann M, Donoho G, Berg P.: Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 92: 1292-1296, 1995）、ヒトポリオーマウイルスの一種であるＢＫウイルス由来のエピゾーマルベクター（De Benedetti A, Rhoads RE.: A novel BK virus-based episomal vector for expression of foreign genes in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 19:1925-1931, 1991.）、エプスタイン−バールウイルス由来のエピゾーマルベクター（Margolskee RF, Kavathas P, Berg P.: Epstein-Barr virus shuttle vector for stable episomal replication of cDNA expression libraries in human cells. Mol. Cell. Biol. 8: 2837-2847, 1988.）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来のエピゾーマルベクター（Ohe Y, Zhao D, Saijo N, Podack ER.: Construction of a novel bovine papillomavirus vector without detectable transforming activity suitable for gene transfer.Hum Gene Ther. 6:325-333, 1995.）などのウイルス由来のエピゾーマルベクターが挙げられる。これらのなかで、ＢＫウイルス由来のエピゾーマルベクターおよびエプスタイン−バールウイルス由来のエピゾーマルベクターは、ヒト細胞に好適に用いられる。

これらのベクターは、それぞれの起源ウイルスの複製開始点（ｏｒｉ）を含み、この複製開始点（ｏｒｉ）に「複製因子」が結合することにより複製される。本発明において「複製因子」とは、ｏｒｉに結合して核酸の倍加を引き起こす、複製に必須の因子を意味する。上記に例示した各ウイルス由来のエピゾーマルベクターの場合、「複製因子」は、それぞれ、マウスポリオーマウイルスのラージＴ抗原、ＢＫウイルスのラージＴ抗原、エプスタイン−バールウイルスのＥＢＮＡ１、ウシパピローマウイルスのＥ１およびＥ２であ
る。

また、Ｓ／ＭＡＲ（scaffold/matrix attachment region）と呼ばれる塩基配列を含むエピゾーマルベクターも、本発明の製造方法に好適に用いることができる。このエピゾーマルベクターは、少なくとも１個のＳ／ＭＡＲと、少なくとも１個のウイルスまたは真核細胞の複製起点（ｏｒｉ）を含み、上記のようなｏｒｉに対応する複製因子を必要としない。具体的には、例えば、「Piechaczek C, Fetzer C, Baiker A, Bode J, Lipps HJ.: A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27:426-428, 1999.」に記載されたヒトインターフェロンβ遺伝子の上流約２ｋｂの配列をＳ／ＭＡＲとして含むエピゾーマルベクターが挙げられる。

また、２種類のアデノウイルスベクターを細胞に導入し、細胞内で環状のエピゾーマルベクターを完成させる系が知られており（Leblois H, Roche C, Di Falco N, Orsini C, Yeh P, Perricaudet M.: Stable transduction of actively dividing cells via a novel adenoviral/episomal vector. Mol Ther. 2000 Apr;1(4):314-22.）、この系を用いて得られるエピゾーマルベクターも、本発明の製造方法に用いることができる。この系はＣｒｅ−ｌｏｘＰを利用したものであり、詳細には、一方のアデノウイルスベクターからＣｒｅを発現させ、他方のアデノウイルスベクターには、ｌｏｘＰで挟まれる領域にエピゾーマルベクターとして必要な構成を組み込んでおく。このｌｏｘＰで挟まれる領域がＣｒｅにより切り出され、環状ＤＮＡとなる。ｌｏｘＰで挟まれる領域に、発現ユニットと複製開始点と複製因子をコードする遺伝子（例えば、エプスタイン−バールウイルスの複製開始点ｏｒｉＰと複製因子ＥＢＮＡ１をコードする遺伝子）が含まれるようにデザインすれば、切り出された環状ＤＮＡは細胞内でエピゾームとして維持される。

エピゾーマルベクターには、核初期化因子をコードする遺伝子および／または複製因子をコードする遺伝子を発現させるための発現ユニットが含まれる。発現ユニットに用いられるプロモーターは、哺乳動物細胞で使用されるプロモーターであればよく、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭｕＬＶＬＴＲプロモーターなどが挙げられる。発現させる遺伝子（ＤＮＡ）をプロモーターの下流に挿入することにより、当該遺伝子産物が細胞内で発現する。また、ＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）を用いることにより、１つのプロモーターから複数の遺伝子を発現させることができる。使用するＩＲＥＳは特に限定されないが、例えば、ヒトＨＣＶ由来のＩＲＥＳ、ピコルナウイルス由来のＩＲＥＳなどが挙げられる。

エピゾーマルベクターは、当該エピゾーマルベクターが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子は、エピゾーマルベクターが導入された細胞を選択できるものであれば特に限定されないが、薬剤耐性遺伝子が好適に用いられる。選択に用いられる薬剤としては、例えば、ネオマイシン（ジェネティシン（Ｇ４１８））、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ブラスチサイジンなどが挙げられる。
エピゾーマルベクターは、さらに大腸菌で増殖させるために必要な複製開始点（ｏｒｉ）および選択マーカー遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子など）を含む。

以下、本発明の製造方法の各工程について詳細に説明する。
（１）核初期化因子導入工程
核初期化因子導入工程では、核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する。使用する体細胞の種類に応じた適切な培地および適切な培養条件で、体細胞を予め培養しておく。エピゾーマルベクターを体細胞に導入する方法は、用いるエピゾーマルベクターおよび体細胞に応じて、公知の導入方法から適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法などが挙げられる。エピゾーマルベクターが選択マーカー遺伝子を含む場合は、用いたマーカーを指標としてエピゾーマルベクターが導入された細胞を選択することができる。例えば、エピゾーマルベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合は、エピゾーマルベクター導入後に培地に薬剤を添加することにより、エピゾーマルベクターが導入された細胞のみを生存させることができる。

エピゾーマルベクターの複製に複製因子が必要である場合は、同一ベクター上に２つの発現ユニットを含む構成とするか、あるいはＩＲＥＳを用いて１つのプロモーターで複数の遺伝子を発現できるように構成することにより、複製因子をコードする遺伝子と核初期化因子をコードする遺伝子を同時に導入することができる。また、複数の核初期化因子を発現させる場合は、同一ベクターに全ての遺伝子を挿入してもよく、１ベクターに１遺伝子を挿入して複数のエピゾーマルベクターを同時導入してもよく、１ベクターに２〜３個程度の遺伝子を挿入して複数のエピゾーマルベクターを同時導入してもよい。

（２）複製因子導入工程
核初期化因子をコードする遺伝子を含まず複製因子をコードする遺伝子のみを含むエピゾーマルベクター（以下、「複製因子導入ベクター」という。）を用いる場合、前記核初期化因子導入工程の前に、複製因子導入ベクターを体細胞に導入する工程を設けてもよい。当該複製因子導入ベクターは薬剤耐性遺伝子を選択マーカー遺伝子として含むことが好ましい。複製因子導入ベクターが導入され細胞内で複製因子を発現していると考えられる細胞を選択できるからである。したがって、複製因子導入工程を設ける場合、適切な方法で複製因子導入ベクターを体細胞に導入し、培地に薬剤を添加して生き残った細胞を選択し、核初期化因子導入工程に供することが好ましい。複製因子導入工程を設けることにより、目的の核初期化因子を発現するエピゾーマルベクターが導入された細胞を高効率で取得することが可能となる。なぜなら、複製因子導入工程を設けていなければ、複製因子をコードする遺伝子を含むエピゾーマルベクターと核初期化因子をコードする遺伝子を含むエピゾーマルベクターが同時に同一の細胞に導入される必要があるところ、複製因子導入工程を設けることにより、細胞内で複製因子を発現していると考えられる細胞（薬剤耐性等の選択マーカーにより選択された細胞）を核初期化因子導入工程に供することができるので、核初期化因子導入工程において核初期化因子をコードする遺伝子を含むエピゾーマルベクターが導入された目的の細胞を取得できる確率が数段高くなるからである。また、核初期化因子をコードする遺伝子を含むエピゾーマルベクターが導入されれば、既に細胞内で発現している複製因子により、直ちに効率よく複製することが可能となり、エピゾーマルベクター導入後の脱落の可能性も低下すると考えられる。

（３）培養工程
培養工程では、前段の核初期化因子導入工程でエピゾーマルベクターが導入された体細胞を培養する。培養はＥＳ細胞の培養方法に準じて行うことが好ましく、通常はフィーダー細胞を用いて培養を行う（Gene Targeting A Practical Approach Edited by A. L. Joyner, Oxford University Press, Oxford, U.K 参照）。核初期化因子導入工程で導入されたエピゾーマルベクターが選択マーカー遺伝子を含む場合は、用いた選択マーカーを指標にエピゾーマルベクターが導入された細胞を選択した後に、フィーダー細胞上での培養に移行することが好ましい。例えば、選択マーカー遺伝子に薬剤耐性遺伝子を用いた場合には、核初期化因子導入工程の後、薬剤を添加した培地で培養することにより、生存細胞を分離してフィーダー細胞上での培養に移行すればよい。

（４）選抜工程
選抜工程では、体細胞から変化したｉＰＳ細胞を選抜する。ｉＰＳ細胞を判定する方法としては、(a)細胞およびコロニーの形態観察、(b)アルカリフォスファターゼ発現の確認、(c)未分化マーカー発現の確認、などが用いられる。なお、ｉＰＳ細胞の判定は、上記(a)のみでも可能であるが、(a)と(b)および／または(c)との組み合わせにより、判定の精度を向上させることができる。

(a)細胞およびコロニーの形態観察
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の細胞およびコロニー形態を示す。具体的には、コロニーは、お椀を伏せたような円形ないし楕円形で辺縁のはっきりした形態を示し、細胞は、細胞質が少なく細胞間の境界が不鮮明となる。したがって、このような特徴的形態を示すコロニー内の細胞をｉＰＳ細胞と判定することができる。

(b)アルカリフォスファターゼ発現の確認
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様にアルカリフォスファターゼを発現する。したがって、アルカリフォスファターゼの発現が陽性であれば、ｉＰＳ細胞であると判定することができる。アルカリフォスファターゼの発現は、例えば市販のアルカリフォスファターゼ染色キット（例えば、シグマ社製）を用いて細胞（コロニー）を染色することにより確認することができる。染色された細胞（コロニー）をｉＰＳ細胞と判定することができる。

(c)未分化マーカー発現の確認
分化細胞では発現せず、未分化細胞のみに発現する遺伝子（未分化マーカー）の発現を確認することにより、ｉＰＳ細胞を判定することができる。未分化マーカーとしては、内在性のＯｃｔ３/４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｅ−Ｒａｓ、Ｒｅｘ１、ＳＳＥＡ１などが挙げられる。未分化マーカーの発現を確認する方法は特に限定されないが、例えばＲＴ−ＰＣＲ法や特異抗体を用いた免疫染色法などが挙げられる。

（５）ベクター除去工程
ベクター除去工程では、ｉＰＳ細胞からエピゾーマルベクターを除去する。導入されたエピゾーマルベクターは、細胞の増殖に伴い自然に脱落しｉＰＳ細胞から除去される場合もあるため、ベクター除去工程は必須の工程ではないが、エピゾーマルベクターが残存することにより未分化状態が不安定になる可能性や、逆に分化できなくなる可能性があるため、ベクター除去工程を設けることが好ましい。また、エピゾーマルベクターが長期間残存すると、染色体への組み込みが自然発生する可能性があり、レトロウイルスベクターを使用した場合と同様の問題が生じることになる。したがって、染色体への組み込みが自然発生する可能性を低減させて細胞の癌化や機能異常発生のリスクをできる限り低減させるためにも、ベクター除去工程を設けることが好ましい。エピゾーマルベクターベクターを除去する方法は特に限定されないが、例えば以下に挙げる方法を用いることができる。

(a)限界希釈法によるクローニング
上述のように、エピゾーマルベクターは細胞の増殖に伴い自然に脱落すると考えられるので、エピゾーマルベクターが完全に脱落したｉＰＳ細胞を限界希釈法によりクローニングすれば、エピゾーマルベクターが除去されたｉＰＳ細胞のみの集団を取得することができる。

(b)レトロウイルス由来のプロモーターの使用
レトロウイルス由来のプロモーターは未分化細胞では機能しないことが知られており（Gorman CM, Rigby PW, Lane DP: Negative regulation of viral enhancers in undifferentiated embryonic stem cells. Cell. 1985 Sep;42(2):519-26.）、レトロウイルスベクターが未分化細胞では不活化されることが多数報告されている（例えば、Pannell D, Osborne CS, Yao S, Sukonnik T, Pasceri P, Karaiskakis A, Okano M, Li E, Lipshitz HD, Ellis J.: Retrovirus vector silencing is de novo methylase independent and marked by a repressive histone code. EMBO J. 2000 Nov 1;19(21):5884-94.）したがって、例えば、複製因子をコードする遺伝子をレトロウイルス由来のプロモーターの下流に結合したエピゾーマルベクターを用いれば、体細胞がｉＰＳ細胞に変化すると複製因子が発現しなくなる。その結果、エピゾーマルベクターは複製することができなくなり、次第にベクターが除去されたｉＰＳ細胞の集団が形成される。レトロウイルス由来のプロモーターの下流に結合する遺伝子は、複製因子をコードする遺伝子に限定されず、核初期化因子をコードする遺伝子を結合してもよいが、複製を抑える観点から複製因子をコードする遺伝子を結合することが好ましい。

(c)薬剤による発現制御システムの利用
特定の薬剤が培地中に存在する場合と存在しない場合とで、目的の遺伝子産物の発現を制御するシステムが知られている。これを利用して、例えば、特定の薬剤を培地に添加すると複製因子の発現が停止されるようにすれば、複製因子の発現が抑制され、エピゾーマルベクターは複製することができなくなり、次第にベクターが除去されたｉＰＳ細胞の集団が形成される。薬剤による発現制御システムに用いられる薬剤は特に限定されず、このような系が実現できるものであればいずれの薬剤も好適に用いることができる。

例えば、公知のシステムとしてＴｅｔ−Ｏｆｆシステムが知られている。Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムを利用すれば、テトラサイクリンを培地に添加すると複製因子の発現が停止されるように、複製因子をコードする遺伝子を含むエピゾーマルベクターをデザインすることができる。具体的には、例えば、本発明者らが実施例で使用した一次ベクターにおいて、ｔＴＡ（ｔｅｔ制御性転写活性化因子）をＣＭＶプロモーターで発現させ、ｔＴＡで制御されるｔｅｔＯ（Ｔｅｔオペレーター配列）プロモーターの下流に複製因子（ラージＴ抗原）をコードする遺伝子を結合する。複製起点（ｏｒｉ）やネオマイシン耐性遺伝子はそのまま残す。このようなエピゾーマルベクターを用いることにより、ｉＰＳ細胞選抜後に培地にテトラサイクリンを添加することにより、複製因子の発現が抑制され、エピゾーマルベクターは複製することができなくなり、次第にベクターが除去されたｉＰＳ細胞の集団が形成される。

また、Ｔｅｔ−Ｏｆｆシステムとは逆に、テトラサイクリンを培地から除去すると複製因子の発現が停止するＴｅｔ−Ｏｎシステムを利用することも可能である。Ｔｅｔ−Ｏｎシステムの場合は、ｉＰＳ細胞を選抜するまではテトラサイクリンを含む培地を用い、ｉＰＳ細胞選抜後にテトラサイクリンを除去した培地に切り替えればよい。なお、Ｔｅｔ−ＯｆｆシステムおよびＴｅｔ−Ｏｎシステムは、クロンテック社から市販されている。

(d)ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの利用
エピゾーマルベクターに、複製因子をコードする遺伝子および／または核初期化因子をコードする遺伝子以外に、ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子を組み込んでおき、ｉＰＳ細胞選抜後に培地にガンシクロビルまたはアシクロビルを添加することにより、エピゾーマルベクターが除去されてチミジンキナーゼを発現しなくなったｉＰＳ細胞のみが生存することができる。これによりエピゾーマルベクターが除去されたｉＰＳ細胞の集団を取得することができる。

本発明者らは、後段の実施例で説明するように、マウスポリオーマウイルス由来のエピゾーマルベクターを用い、複製因子導入工程と核初期化因子導入工程の２段階に分けてエピゾーマルベクターを導入する方法でｉＰＳ細胞を製造した。この実施例に即して本発明の製造方法を模式的に示したものが図１である。まず、複製因子であるラージＴ抗原遺伝子を含む一次ベクターをトランスフェクションし、ベクターが導入された細胞を選択しておく（複製因子導入工程）。この細胞に、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＫｌｆ４遺伝子を含むエピゾーマルベクター、並びに、Ｓｏｘ２遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子を含むエピゾーマルベクターの２種類の二次ベクターをトランスフェクションする（核初期化因子導入工程）。この細胞は、一次ベクターによりラージＴ抗原を発現しているので、二次ベクターはこのラージＴ抗原によりエピゾームとして複製する。そして、培養工程を経て、４種類の核初期化因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）を発現する体細胞が脱分化され、ｉＰＳ細胞に変化する。ｉＰＳ細胞は、上記のようにコロニーの形態や未分化マーカーの発現を指標に選抜することができる（選抜工程）。さらに、細胞内のエピゾーマルベクターを除去することにより（ベクター除去工程）、癌化や変異の危険性が非常に低い、安全なｉＰＳ細胞を得ることができる。

本発明の製造方法により製造されるｉＰＳ細胞の用途は限定されず、ＥＳ細胞を利用して行われている試験、研究、疾病の治療、再生医療などに好適に用いることができる。特に、本発明の製造方法により製造されるｉＰＳ細胞は、癌化や機能異常発生の危険性が非常に低い、安全なｉＰＳ細胞であるため、患者の体細胞から本発明の製造方法を用いてｉＰＳ細胞を製造し、得られたｉＰＳ細胞を所望の分化細胞や組織に誘導後患者に戻す自家移植療法での使用に高い有用性を有している。

〔ｉＰＳ細胞の製造キット〕
本発明は、核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを包含するｉＰＳ細胞の製造キット（以下、「本発明の製造キット」という。）を提供する。本発明の製造キットが包含するピゾーマルベクターは、上記本発明の製造方法に使用可能なエピゾーマルベクターであればよく、そのようなエピゾーマルベクターについては既に詳細に説明したので、ここでは重複する説明を省略する。本発明の製造キットに含まれる核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターが、その複製に複製因子を必須とする場合は、複製因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターが本発明の製造キットに含まれることが好ましい。これらのエピゾーマルベクター以外の構成については特に限定されるものではなく、他に必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。本発明の製造キットを用いることにより、上記本発明の製造方法を簡便かつ迅速に実施することができ、高い再現性でｉＰＳ細胞を製造することが可能となる。特に、エピゾーマルベクターシステムや核初期化因子の発現レベルなどを最適化したキットを用いることにより、ｉＰＳ細胞の誘導の再現性をより高めることができ、得られたｉＰＳ細胞の安全性も確保される。

本明細書において「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは当該材料を使用するための使用説明書を備える。使用説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューターで読み取り可能なディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔一次ベクター〕
ラージＴ抗原を発現する一次ベクターとして、マウスポリオーマウイルス由来のｐＭＧＤ２０ｎｅｏを使用した。ｐＭＧＤ２０ｎｅｏは、マウスポリオーマウイルスのラージＴ抗原遺伝子および複製開始点（ｏｒｉ）、並びにネオマイシン耐性遺伝子を有し、マウスＥＳ細胞でエピゾームとして安定して複製、維持されるプラスミドである（Gassmann M, Donoho G, Berg P.: Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 92: 1292-1296, 1995）。本発明者らは、上記Ｇａｓｓｍａｎｎらの論文で報告されたｐＭＧＤ２０ｎｅｏをエピゾームとして安定に維持するマウスＥＳ細胞のクローン（１．１９細胞株）を、ＡｕｓｔｉｎＳｍｉｔｈ博士（School of Biological Sciences, University of Edinburgh）から入手し、この細胞からｐＭＧＤ２０ｎｅｏを分離して大腸菌で増殖させ、精製して使用した。

〔二次ベクターの作製〕
マウスのＯｃｔ３／４とＫｌｆ４を発現するエピゾーマルベクター、および、マウスのＳｏｘ２とｃ−Ｍｙｃを発現するエピゾーマルベクターの２種類の二次ベクターを、以下の手順で作製し、使用した。
まず、マウスＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの各ｃＤＮＡをＰＣＲ法により取得した。各遺伝子の塩基配列情報を公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から取得し、これに基づいてプライマーを設計した。ＰＣＲの鋳型には、マウスのＥＳ細胞または各臓器由来のトータルＲＮＡから公知の方法で調製したｃＤＮＡを用いた。なお、トータルＲＮＡは自家製であり、８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスの各臓器から調製した。ＰＣＲにより得られた各ｃＤＮＡ断片について、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）またはｐＣＲ４にクローニングし、ＡＢＩ３１００もしくはＡＢＩ３７３０を用いてシークエンスを行い、ｃＤＮＡ断片が各遺伝子の正しい塩基配列を有することを確認した。表１に、各遺伝子のGenBank Acc. No.、使用したトータルＲＮＡの由来、プライマー配列、使用ベクターを示した。

Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４を発現するエピゾーマルベクターの構築には、マウスポリオーマウイルスの複製開始点（ｏｒｉ）およびゼオシン耐性遺伝子を有するｐＰｙＣＡＧ−ＩＺ（Genes Dev. 12: 2048-60, 1998）を用いた。また、Ｓｏｘ２とｃ−Ｍｙｃを発現するエピゾーマルベクターの構築には、マウスポリオーマウイルスの複製開始点（ｏｒｉ）およびピューロマイシン耐性遺伝子を有するｐＰｙＣＡＧ−ＩＰ（Mol Cell Biol. 22: 1526-36, 2002）を用いた。ｐＰｙＣＡＧ−ＩＰおよびｐＰｙＣＡＧ−ＩＺは、上記２編の論文の著者である丹羽仁史博士から入手した。

ｐＣＩＴＥ−１プラスミド（Novagen社）からｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓｖｉｒｕｓ由来のＩＲＥＳ配列を切り出した。このＩＲＥＳの上流にＯｃｔ３／４の翻訳開始コドンＡＴＧとｓｔｏｐコドンを含むｃＤＮＡを結合し、ＩＲＥＳの下流には、ＩＲＥＳ直下のＡＴＧにＫｌｆ４の翻訳開始コドンＡＴＧをあわせるようにＫｌｆ４のｓｔｏｐコドンを含むｃＤＮＡを結合することにより、Ｏｃｔ３／４−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４断片を作製した。このＯｃｔ３／４−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４断片をｐＰｙＣＡＧ−ＩＺのＣＡＧプロモーターとＩＲＥＳ−ｚｅｏの間に挿入し、ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏを構築した（図２参照）。
同様に、ｐＣＩＴＥ−１プラスミドから切り出したＩＲＥＳ上流にＳｏｘ２の翻訳開始コドンＡＴＧとｓｔｏｐコドンを含むｃＤＮＡを結合し、ＩＲＥＳの下流には、ＩＲＥＳ直下のＡＴＧにｃ−Ｍｙｃの翻訳開始コドンＡＴＧをあわせるようにｃ−Ｍｙｃのｓｔｏｐコドンを含むｃＤＮＡを結合することにより、Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ断片を作製した。このＳｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ断片をｐＰｙＣＡＧ−ＩＰのＣＡＧプロモーターとＩＲＥＳ−ｐｕｒｏの間に挿入し、ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを構築した（図３参照）。

〔Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃの発現確認〕
得られた２種類のプラスミドをＢＭＴ１０細胞株に導入し、各タンパク質の発現を確認した。ＢＭＴ１０細胞株はサル由来の細胞株である。この細胞を使用したのは、ＳＶ４０のＴ抗原遺伝子を発現していること（Gerard RD, Gluzman Y.: New host cell system for regulated simian virus 40 DNA replication. Mol Cell Biol. 1985 Nov;5(11):3231-40.）、およびニワトリベータアクチンプロモーターを使用する発現ベクターで非常に強い発現が得られること（Miyazaki J, Takaki S, Araki K, Tashiro F, Tominaga A, Takatsu K, Yamamura K.: Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5. Gene. 1989 Jul 15;79(2):269-77.）が知られているからである。ＢＭＴ１０細胞株は、上記論文の著者であるＲ．Ｄ．Ｇｅｒａｒｄ博士より分与を受けた。
上記Ｍｉｙａｚａｋｉらの論文に記載の方法に従い、ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏまたはｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを、それぞれＢＭＴ１０細胞株にトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、表２に記載の一次抗体および二次抗体を用いて免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察および撮影した。

結果を図４および５に示した。図４は、ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏを導入したＢＭＴ１０細胞株の免疫染色結果を示す蛍光顕微鏡画像である。（ａ）〜（ｄ）は同一視野であり、（ａ）はＯｃｔ３／４の免疫染色画像、（ｂ）はＫｌｆ４の免疫染色画像、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせた画像、（ｄ）は（ｃ）にＤＡＰＩ染色（核酸を青色蛍光に染色）を重ね合わせた画像である。図４（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞とＫｌｆ４を発現する細胞は一致していた。なお、一過性の発現であるため、観察時点で導入遺伝子を発現していない細胞は、（ｄ）においてＤＡＰＩにより青色に染色されている。この結果から、ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏが導入された細胞は、Ｏｃｔ３／４とＫｌｆ４の両者を同時に発現することが確認された。

図５は、ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏを導入したＢＭＴ１０細胞株の免疫染色結果を示す蛍光顕微鏡画像である。（ａ）〜（ｄ）は同一視野であり、（ａ）はＳｏｘ２の免疫染色画像、（ｂ）はｃ−Ｍｙｃの免疫染色画像、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）を重ね合わせた画像、（ｄ）は（ｃ）にＤＡＰＩ染色を重ね合わせた画像である。図５（ａ）〜（ｄ）から明らかなように、Ｓｏｘ２を発現する細胞とｃ−Ｍｙｃを発現する細胞は一致していた。なお、一過性の発現であるため、観察時点で導入遺伝子を発現していない細胞は、（ｄ）においてＤＡＰＩにより青色に染色されている。この結果から、ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏが導入された細胞は、Ｓｏｘ２とｃ−Ｍｙｃの両者を同時に発現することが確認された。

〔ｉＰＳ細胞の作製〕
（１）線維芽細胞の培養
マウス１３日胚からＭＥＦ（mouse embryonic fibroblast）を単離し、培養した。培養液にはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用い、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。３日ごとに１／３を継代培養した。

（２）一次ベクターの導入および選抜
ｐＭＧＤ２０ｎｅｏの２４μｇを、血清を含まないＤＭＥＭ１．５ｍｌに加えた。リポフェクトアミン２０００の２０μｌを、血清を含まないＤＭＥＭ１．５ｍｌに加えた。両者を混合して、２０分間室温で静置した。他方、１０ｃｍ径の培養ディッシュに８０％コンフルエント程度に増殖したＭＥＦをトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、１５ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液に、ｐＭＧＤ２０ｎｅｏとリポフェクトアミン２０００との混合液を加え、１０ｃｍ径の培養ディッシュに播いた。翌日、培養液を交換した。２日後から、培養液にＧ４１８を３５０μｇ／ｍｌの濃度で加え、３週間培養後Ｇ４１８耐性細胞を別の培養ディッシュに移し、培養した。

（３）二次ベクターの導入および選抜
Ｇ４１８耐性細胞を別の培養ディッシュに移した翌日に、二次ベクターをトランスフェクションした。
ｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏの１０μｇと、ｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏの１０μｇとを、血清を含まないＤＭＥＭ１．５ｍｌに加えた。リポフェクトアミン２０００の２０μｌを、血清を含まないＤＭＥＭ１．５ｍｌに加えた。両者を混合して、２０分間室温で静置した。他方、前日に播いたＧ４１８耐性細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥がし、１５ｍｌの培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液に、２種類のプラスミドとリポフェクトアミン２０００との混合液を加え、１０ｃｍ径の培養ディッシュに播いた。翌日、培養液を交換した。２日後から、培養液にゼオシン（１０μｇ／ｍｌ）およびピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ）を加え、３日間培養した。生き残ったゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上に播き、培養を続けた。
フィーダー細胞は、ＭＥＦをマイトマイシンＣ処理することにより作製した。具体的には、コンフルエントのＭＥＦに１５μｇ／ｍｌの濃度でマイトマイシンＣを添加し、３７℃のＣＯ_２インキュベーターで３時間静置した。トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥がし、細胞数をカウントした後、１０ｃｍ径のゼラチンコートディッシュに３×１０^６個／１０ｍｌを播いて培養し、翌日以降にフィーダー細胞として使用した。

（４）細胞の形態観察
ゼオシンおよびピューロマイシン耐性細胞をフィーダー細胞上で培養開始してから１５日後、一部の細胞が盛り上がり、次第にコロニーを形成した。形成されたコロニーの顕微鏡写真を図６（Ａ）および（Ｂ）に示した。
このコロニーを分離し、フィーダー細胞上に播いて培養を続けた。その結果、分離後４日目のコロニーはＥＳ細胞と同様の形態を示した。すなわち、お椀を伏せたような円形ないし楕円形で、辺縁のはっきりしたコロニー形態を示した。コロニーの顕微鏡写真を図７（Ａ）および（Ｂ）に示した。
さらに、これらのコロニーを分離し、フィーダー細胞上に播いて培養を続けた。４日後にアルカリフォスファターゼ染色を行った。染色には、シグマ社のアルカリフォスファターゼ染色キットを用いた。結果を図８に示した。ＡおよびＢは本実施例の細胞であり、Ｃはフィーダー細胞のみであり、ＤはマウスＥＳ細胞（Ｅ１４由来）の染色結果である。図８から明らかなように、本実施例の細胞はＥＳ細胞と同様に赤く染色された。この結果から、本実施例の細胞がｉＰＳ細胞に変化したことが確認された。

〔ＢＫウイルス由来エピゾーマルベクターの構築〕
ｐＲＢＫプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＳｃａＩで消化して、ＢＫウイルスの複製開始点（ｏｒｉ）とＴ抗原遺伝子とを含むＤＮＡ断片を切り出した。また、ｐＭＣ１−ｔｋプラスミドから、ＭＣ１プロモーターとＨＳＶのＴｋ遺伝子とを含むＨｉｎｄIII−ＫｐｎＩＤＮＡ断片を切り出した（Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacy E. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Vol. 2. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1995. pp. 217-253）。これらのフラグメントを、前述のｐＰｙＣＡＧ−Ｓｏｘ２−ＩＲＥＳ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏプラスミドのＢａｍＨＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位にそれぞれ挿入した。また、前述のｐＰｙＣＡＧ−Ｏｃｔ３−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏプラスミドをＳｐｅＩとＢａｍＨＩで消化して、ＣＡＧ−Ｏｃｔ３/４−ＩＲＥＳ−Ｋｌｆ４−ＩＲＥＳ−ｚｅｏ−ｐｏｌｙＡ配列を切り出した。このフラグメントを、上記作製したＢＫウイルス由来のプラスミドのＳａｌＩ切断部位に挿入し、ｐＢＫ−ＣＯＫ−ＣＳＭを構築した（図９）。

〔プラスミドの構築〕
ｐＳＶ４０をＢｇｌＩで消化して、ＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子を切り出した（Miyazaki J, Araki K, Yamato E, Ikegami H, Asano T, Shibasaki Y, Oka Y, Yamamura K.: Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose inducible insulin secretion: Special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology 127: 126-132, 1990）。このＤＮＡ断片を、ｐＡｃ−ｌａｃＺプラスミドに挿入し（Miyazaki J, Takaki S, Araki K, Tashiro F, Tominaga A, Takatsu K, Yamamura K: Expression vector system based on the chicken beta-actin promoter directs efficient production of interleukin-5. Gene 79: 269-277, 1989）、ｌａｃＺ遺伝子を該断片で置き換えた。このようにして、ｐＡｃ−Ｔａｇプラスミドを構築した。また、マウスＥＳ細胞のｃＤＮＡを用いてマウスＮａｎｏｇｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、これをｐＰｙＣＡＧプラスミドに挿入して、ｐＰｙＣＡＧ−Ｎａｎｏｇを構築した。マウスＮａｎｏｇｃＤＮＡの増幅に用いたプライマーの配列は、
５’−ＡＣＴＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＴＴ−３’および
５’−ＧＣＧＴＡＡＧＴＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＴ−３’である。

〔細胞培養およびトランスフェクション〕
ヒト新生児表皮角化細胞（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を、ＥＤＧＳ（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を含むＥｐｉＬｉｆｅ培地（ＣａｓｃａｄｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を用いて培養した。この細胞を初期化するために、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、エピゾーマルプラスミドおよび非エピゾーマルプラスミド（ｐＢＫ−ＣＯＫ−ＣＳＭ、ｐＡｃ−ＴａｇおよびｐＰｙＣＡＧ−Ｎａｎｏｇ）を同時に、１０ｃｍディッシュに用意したヒト角化細胞にトランスフェクションした。翌日、トランスフェクションされた角化細胞（〜１．０×１０^６個／ディッシュ）を、あらかじめＭＥＦ（マイトマイシンＣ処理したマウス胚性線維芽細胞）を播種した２枚の１０ｃｍディッシュに直接播種した。培養液は、２ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ）を含む角化細胞培養液を用い、一日おきに交換した。トランスフェクションから４日後に、角化細胞培養液を、ＶＰＡを含むヒトＥＳ細胞培養液（２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ血清リプレースメント（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国、カリフォルニア州、カールスバッド）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１ｍＭＬ−グルタミン、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（和光純薬工業）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に交換した。細胞播種後８日目以降は、ＭＥＦを用いて調製したヒトＥＳ細胞用条件培地（ＣＭ）を用いて、初期化培養を維持した。

〔アルカリフォスファターゼ染色〕
トランスフェクションから２０日後に、ｉＰＳ細胞のコロニーと同様の形態を示すコロニーが確認された。これらのコロニーを、あらかじめＭＥＦを播種した１０ｃｍディッシュに播き直した。ヒトｉＰＳ細胞のコロニーの有無を調べるために、アルカリフォスファターゼ染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を行ったところ、形成されたコロニーは赤く染色された（図１０）。したがって、本実施例においてヒト角化細胞から得られた細胞は、ｉＰＳ細胞であると考えられた。

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

本発明の製造方法により得られるｉＰＳ細胞は、細胞の癌化や機能異常を起こす危険性が非常に低いので、再生医療用の組織や臓器の作製に高い有用性を有している。

Claims

体細胞の核初期化によりｉＰＳ細胞を製造する方法であって、
核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する核初期化因子導入工程と、
エピゾーマルベクターが導入された体細胞を培養する培養工程と、
体細胞から変化したｉＰＳ細胞を選抜する選抜工程と
を包含することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法。
前記核初期化因子導入工程の前に、さらに複製因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを体細胞に導入する複製因子導入工程を包含することを特徴とする請求項１に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
前記選抜工程の後に、さらにｉＰＳ細胞からエピゾーマルベクターを除去するベクター除去工程を包含することを特徴とする請求項１または２に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
エピゾーマルベクターが、レトロウイルス由来のプロモーターにより核初期化因子をコードする遺伝子および／または前記複製因子をコードする遺伝子を発現させることを特徴とする請求項３に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
エピゾーマルベクターが、核初期化因子をコードする遺伝子および／または複製因子をコードする遺伝子の発現を、薬剤により制御可能に構成されていることを特徴とする請求項３に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
エピゾーマルベクターが、マウスポリオーマウイルス由来エピゾーマルベクター、ＢＫウイルス由来エピゾーマルベクター、エプスタイン−バールウイルス由来エピゾーマルベクター、ウシパピローマウイルス由来エピゾーマルベクター、および、Ｓ／ＭＡＲを含むエピゾーマルベクターからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
核初期化因子が、以下の(1)、(2)および(3)からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
(1) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(2) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種と、iv)ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃからなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(3) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｎａｎｏｇと、iv)Ｌｉｎ２８との組み合わせ
核初期化因子をコードする遺伝子が発現可能に挿入されたエピゾーマルベクターを包含することを特徴とするｉＰＳ細胞の製造キット。
エピゾーマルベクターが、マウスポリオーマウイルス由来エピゾーマルベクター、ＢＫウイルス由来エピゾーマルベクター、エプスタイン−バールウイルス由来エピゾーマルベクター、ウシパピローマウイルス由来エピゾーマルベクター、および、Ｓ／ＭＡＲを含むエピゾーマルベクターからなる群より選ばれることを特徴とする請求項８に記載のｉＰＳ細胞の製造キット。
核初期化因子が、以下の(1)、(2)および(3)からなる群より選ばれることを特徴とする請求項８または９に記載のｉＰＳ細胞の製造キット。
(1) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(2) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ４およびＫｌｆ５からなる群より選ばれる１種と、iv)ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃからなる群より選ばれる１種との組み合わせ
(3) i)Ｏｃｔ３／４と、ii)Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５およびＳｏｘ１８からなる群より選ばれる１種と、iii)Ｎａｎｏｇと、iv)Ｌｉｎ２８との組み合わせ