JPWO2009057831A1 - 核初期化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
また、本発明の別の課題は、人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法を提供することにある。
本発明の特に好ましい課題は、上記の安全な人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法を提供することにある。
また、本発明者らは、c−Mycを用いることなく、L−Myc、Sall1、又はSall4を用いて核初期化を行うことにより、分化誘導して得られる細胞や組織において腫瘍化の懸念のない安全な人工多能性幹細胞を提供できること、及びこの方法により極めて効率的に安全な人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。
本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
この方法の別の好ましい態様によれば、下記の3種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、及びSox2を体細胞に導入する工程を含む方法;及び下記の3種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、及びSox2を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含む方法が提供される。
さらに、この方法の別の好ましい態様により、薬剤選択を行わずに体細胞の初期化を行う工程を含む上記の方法が提供される。
L−Mycを用いる場合には、体細胞がヒト体細胞であることが好ましい。
上記のいずれかの方法において、さらにLin28を体細胞に導入する工程を含む方法も本発明により提供され、好ましい態様としてOct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、及びLin28を体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。
さらに本発明により、上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。
(a)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Mycを体細胞に導入する工程;
(b)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall1を体細胞に導入する工程;
(c)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall4を体細胞に導入する工程;
(d)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc及びSall1を体細胞に導入する工程;
(e)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc及びSall4を体細胞に導入する工程;
(f)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall1及びSall4を体細胞に導入する工程;
(g)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(i)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall1を体細胞に導入する工程;
(j)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall4を体細胞に導入する工程;
(k)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc及びSall1を体細胞に導入する工程;
(l)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc及びSall4を体細胞に導入する工程;
(m)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにSall1及びSall4を体細胞に導入する工程;又は
(o)下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにL−Myc、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
を含んでいる。
(a−1)Oct3/4、Sox2、及びL−Mycを体細胞に導入する工程;
(a−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、及びL−Mycを体細胞に導入する工程;
(b−1)Oct3/4、Sox2、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(b−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(c−1)Oct3/4、Sox2、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(c−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(d−1)Oct3/4、Sox2、L−Myc、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(d−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(e−1)Oct3/4、Sox2、L−Myc、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(e−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(f−1)Oct3/4、Sox2、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(f−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(g−1)Oct3/4、Sox2、L−Myc、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(g−2)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(i−1)Oct3/4、Klf4、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(j−1)Oct3/4、Klf4、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(k−1)Oct3/4、Klf4、L−Myc、及びSall1を体細胞に導入する工程;
(l−1)Oct3/4、Klf4、L−Myc、及びSall4を体細胞に導入する工程;
(m−1)Oct3/4、Klf4、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程;又は
(o−1)Oct3/4、Klf4、L−Myc、Sall1、及びSall4を体細胞に導入する工程
を含む方法を挙げることができる。
(a−3)Oct3/4、Sox2、L−Myc、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(a−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(b−3)Oct3/4、Sox2、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(b−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(c−3)Oct3/4、Sox2、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(c−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(d−3)Oct3/4、Sox2、L−Myc、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(d−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(e−3)Oct3/4、Sox2、L−Myc、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(e−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(f−3)Oct3/4、Sox2、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(f−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(g−3)Oct3/4、Sox2、L−Myc、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(g−4)Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(i−2)Oct3/4、Klf4、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(j−2)Oct3/4、Klf4、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(k−2)Oct3/4、Klf4、L−Myc、Sall1、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(l−2)Oct3/4、Klf4、L−Myc、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;
(m−2)Oct3/4、Klf4、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程;又は
(o−2)Oct3/4、Klf4、L−Myc、Sall1、Sall4、及びLin28を体細胞に導入する工程
を含む方法も好ましい。
また、上記の各方法において、L−Mycとともに、又はL−Mycに換えてN−Mycを体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。
さらに、上記の各方法において、必要に応じてc−Mycを体細胞に導入する工程を含んでいてもよいが、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生を実質的に低減ないし排除するためにはc−Mycを体細胞に導入する工程を含まないほうが好ましい場合がある。
また、増殖については一般的にはコロニー形成により判定することができるが、コロニー(通常は約500個〜1,000個程度の人工多能性幹細胞からなる細胞集団である)の形状は動物種により特徴的な外観を呈することが知られているので、人工多能性幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。
例1:マウスES細胞培地におけるadult HDFからのiPS細胞の樹立
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞(adult HDF)又はヒト新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)にレンチウイルスでSlc7a1(マウスレトロウイルス受容体)遺伝子を導入し(それぞれ、「HDFa−Slc7a1」、「BJ−Slc7a1」とする)、HDFa−Slc7a1又はBJ−Slc7a1は800,000個に調製した後、フィーダー細胞(マイトマイシン処理STO細胞)上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスベクターにより遺伝子を導入した。
1.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,hTERT,Bmil
2.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,hTERT,HPV16 E6,HPV16 E7
3.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,hTERT,HPV16 E7
4.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,hTERT,SV40 Large T antigen
5.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,hTERT,HPV16 E6
6.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc
図中で示す「−」は、上記の組み合わせの「6.Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc」を示す。
(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,TERTはヒト由来、Bmi1はマウス由来)
1.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT,SV40 Large T antigen
2.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT,Bmil
3.hTERT,SV40 Large T antigen
4.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT,HPV16 E6
5.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT,HPV16 E7
6.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT,HPV16 E6,HPV16 E7
7.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc),hTERT
8.4s(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc)
9.DsRed
(Oct3/4,Sox2,Klf4,c−Myc,TERTはヒト由来、Bmi1はマウス由来)
マウスES細胞の培養条件下で2週間培養を続けたところ、4遺伝子(8)のみが導入された細胞はアルカリフォスファターゼ染色に対して陽性を呈した(図2)。
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞(adult HDF)から樹立されたヒトiPS細胞が、ES細胞で特異的に発現する遺伝子群であるECAT(ES cell associated transcript)を発現するか否かを調べた。
adult HDFに由来するiPS細胞(クローンiPS−HDFaSlc−87E6)を6ウェルプレートにあらかじめ培養していたフィーダー細胞(マイトマイシンC処理STO細胞)上に、各ウェルあたり5×104個の割合で撒き、4日間培養した。細胞を10%ホルマリンを含PBSで固定し、固定液を除去後、PBSで洗浄し、さらに室温で45分間3%BSA含PBSを加え静置した。一次抗体(抗ヒトABCG−2抗体(マウスIgG)、抗SSEA−3抗体(ラットIgM)、及び抗SSEA−4抗体(マウスIgG))を3%BSA含PBSで1:100に希釈し、4℃で一晩反応させた後、細胞を1%BSAを含むPBSで3回洗浄し、1%BSAを含むPBSで1:300に希釈した二次抗体を用いて室温で1時間、遮光下で反応させた。二次抗体としてCy−3で標識した抗マウスIgG抗体(ABCG−2及びSSEA−4に対する抗体;ケミコン)及び抗ラットIgM抗体(SSEA−3に対する抗体;ジャクソン・イムノリサーチ)を使用した。細胞をPBSで洗浄し、次いで顕微鏡下で観察及び撮影した(図3)。この結果、adult HDFに由来するiPS細胞がABCG−2、SSEA−3、及びSSEA−4を発現していることが観察された。
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞(adult HDF)に由来するiPS細胞(クローンiPS−HDFaSlc−87E3、87E4、及び87E12)をあらかじめ6ウェルプレートに播いておいたフィーダー細胞(マイトマイシンC処理STO細胞)上に各ウェルあたり5×104個の割合で撒き、5日間培養した。コントロールとして上記iPS細胞の由来細胞であるHDFを上記6ウェルプレート上に撒き、2日間維持した。細胞を10%ホルマリンを含むPBSで固定した。固定液を除去し、細胞をPBSで洗浄した後、細胞を室温で45分間ブロッキングバッファー(3%BSA含PBS)を加え静置した。一次抗体(抗ABCG−2抗体(マウスIgG;ブロッキングバッファーで1:80に希釈)、抗E−cadherin(マウスIgG;;ブロッキングバッファーで1:80に希釈)、抗SSEA−3抗体(ラットIgM;ブロッキングバッファーで1:250に希釈)、抗SSEA−4抗体(マウスIgG;ブロッキングバッファーで1:250に希釈))と4℃で一晩反応させた後、細胞をブロッキングバッファーで洗浄した。洗浄後、さらに細胞を二次抗体を用いて室温で1時間反応させた。二次抗体は、ブロッキングバッファーで1:300に希釈したCy−3で標識した抗マウスIgG抗体(ABCG−2、E−cadherin、及びSSEA−4に対する抗体)及び抗ラットIgM抗体(SSEA−3に対する抗体)を用いた。2次抗体反応後抗体溶液を除去し、PBSで洗浄した後、細胞に50%グリセロールを含むPBSを加えて観察した(図4)。
全RNAを、ヒトiPS細胞クローン(iPS−HDFaSlc87E−1〜8、11及び12)、NTERA2クローンD1ヒト胚癌細胞(継代数35)、及びマウスSlc7a1遺伝子を発現するadult HDF(継代数6)から単離した。第1鎖cDNAはoligo−dT20プライマー及びRever Tra Ace−α−kit(東洋紡)を製造業者のプロトコルに従って使用して合成した。PCRはプライマーを用いて以下の通りに行った。内在性OCT3/4に対してhOct3/4−S1165及びhOct3/4−AS1283;内在性Sox2に対してhSox2−S1430及びhSox2−AS1555;Nanogに対してECAT4−macaca−968S及びECAT4−macaca−1334AS;REX1に対してhRex1−RT−U及びhRex1−RT−L;FGF4に対してhFGF4−RT−U及びhFGF4−RT−L;GDF3に対してhGDF3−S243及びhGDF3−AS850:ECAT15−1に対してhECAT15−S532及びhECAT15−AS916;ECAT15−2に対してhECAT15−2−S85及びhECAT15−2−AS667;ESG1に対してhpH34−S40及びhpH34−AS259;hTERTに対してhTERT−S3556及びhTERT−AS3713;並びにG3PDHに対してG3PDH−F及びG3PDH−Rを使用した(表1:配列表の配列番号1から22)。
この結果、多数のヒトiPS細胞クローン(iPS−HDFaSlc87E−1〜8、11及び12)がECATを発現しており、特に87E6クローンは種々のECATを発現していた(図5)。
ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞(BJ線維芽細胞)に由来するヒトiPS細胞がECATを発現するか否かを確認した。
全RNAをヒトiPS細胞(iPS−BJSlc−97E−1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、−97G−3、5、−97H−3、及び5)、NTERA2クローンD1ヒト胚性癌細胞(継代数35)、及びマウスSlc7a1遺伝子を発現する新生児包皮由来線維芽細胞(BJ)(継代数6)から単離した。第1鎖cDNAはoligo−dT20プライマー及びRever Tra Ace−α−kit(東洋紡)を用いて製造業者のプロトコルに従って合成した。PCRはプライマーを用いて以下の通りに行った。内在性OCT3/4に対してhOct3/4−S1165及びhOct3/4−AS1283;内在性Sox2に対してhSox2−S1430及びhSox2−AS1555;Nanogに対してECAT4−macaca−968S及びECAT4−macaca−1334AS;REX1に対してhRex1−RT−U及びhRex1−RT−L;FGF4に対してhFGF4−RT−U及びhFGF4−RT−L;GDF3に対してhGDF3−S243及びhGDF3−AS850;ECAT15−1に対してhECAT15−S532及びhECAT15−AS916;ECAT15−2に対してhECAT15−2−885及びhECAT15−2−AS667;ESG1に対してhpH34−S40及びhpH34−AS259;hTERTに対してhTERT−S3556及びhTERT−AS3713;並びにG3PDHに対してG3PDH−F及びG3PDH−Rを使用した(表2:配列表の配列番号23から44)。
例6:ヒトiPS細胞による奇形腫形成
5.0×106個のヒトiPS細胞を、SCIDマウス(雌、5週齢)の背側面に皮下注射した。注射の5週間後に大きな腫瘍が観察された。腫瘍を切除して重量を計測し、外観を撮影した。この腫瘍を10%ホルマリンを含むPBSで固定した。パラフィン包理した腫瘍を4.5μm切片にスライスした薄切片をスライドガラス上に載せ風乾した後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。図7のAは、iPS−HDFaSlc−87E12クローンを皮下注射したマウス及びその奇形腫を示す。図7のBはクローンiPS−HDFaSlc−87E3、同CはクローンiPS−HDFaSlc−87E6、同DはクローンiPS−HDFaSlc−87E12を皮下注射したマウスから切除された奇形腫由来の組織像をそれぞれ示す。
浮遊培養を行うことにより胚様体(Embryoid body:EBs)を形成させて、in vitroでのヒトiPS細胞の分化能を評価した。ヒトiPS細胞(iPS−HDFaSlc−127F2、E3)を7日間浮遊培養し、胚様体を形成させた。その後、胚様体をゼラチンコートしたプレートに移し、さらに8日間培養を継続し、その後免疫組織化学分析を行った。使用した一次抗体は以下の通りである。抗α−平滑筋アクチン抗体(ダコ)、抗βIII−チューブリン抗体(ケミコン)、抗−α−フェトプロテイン抗体(ダコ)、正常マウスIgG(2mg/ml、ケミコン)、及び正常ウサギIgG(2mg/ml、ケミコン)は、それぞれ3%BSA含PBSで1:100で希釈し、一次抗体として使用した。一次抗体を室温で1時間反応させた後に細胞をPBSで洗浄し、二次抗体(3%BSA含PBSで1:300に希釈)を反応させた。なお、核はDAPIにより染色した。その結果、α−平滑筋アクチン(α−SMA、中胚葉マーカー)、βIIIチューブリン(外胚葉マーカー)、α−フェトプロテイン(内胚葉マーカー)が陽性を示したことにより、ヒトiPS細胞は胚様体形成を介してin vitroで分化することを確認した(図8)。
マウス線維芽細胞からのiPS細胞の誘導には高い遺伝子導入効率を有するレトロウイルスが有効であると考えられている(Takahashi et al.,Cell,126,pp.663−676,2006)。そこで、ヒト成人皮膚由来線維芽細胞(adult HDF)における遺伝子導入方法を最適化した。最初にPLAT−Aパッケージング細胞において作製した両種性(amphotropic)レトロウイルスを用いてadult HDFに緑色蛍光タンパク質(GFP)を導入した。対照として、PLAT−Eパッケージング細胞(Morita et al.,Gene Ther.,7,pp.1063−66,2000)において作製した同種指向性(ecotropic)レトロウイルスを用いてマウス胎児線維芽細胞(MEF)にGFPを導入した。MEFにおいては、80%以上の細胞がGFPを発現した(図9)。一方、20%未満のadult HDFはMEFの場合より明らかにGFPの発現強度が低く、GFP発現率は20%未満であった。
ヒトiPS細胞を誘導するためのプロトコルを図10Aに概略を示した。ヒトOct3/4、Sox2、Klf4、及びc−MycをレトロウイルスベクターにてをHDF−Slc7a1に導入した(図10B、8x105細胞/100mmディッシュ)。
遺伝子導入の6日後、細胞をトリプシン処理により回収し、5x104又は5x105細胞/100mmディッシュに調整した後、マイトマイシンC処理SNLフィーダー細胞(McMahon et al.,Cell,62,pp.1073−85,1990)上に撒いた。翌日、培地(10%FBSを含むDMEM)を4ng/mlの塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)を補充した霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に交換した。約2週間後、細胞形態がヒトES細胞とは類似しない幾つかの粒状コロニーが現れた(図10C)。25日目頃、平らでヒトES細胞コロニーに類似した別のタイプのコロニーが観察された(図10D)。5x104個の線維芽細胞から、約10個のヒトES細胞様コロニー及び約100個の粒状コロニーが観察された(6回の独立した実験において、7/122、8/84、8/171、5/73、6/122、及び11/213個を観察した。結果を表3にまとめた)。
免疫染色解析により、ヒトiPS細胞はSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60,TRA−1−81、及びTRA−2−49/6E(アルカリフォスファターゼ)を含むヒトES細胞特異的表面抗原(Adewumi et al.,Nat.Biotechnol.,25,pp.803−816,2007)、並びにNanog蛋白の発現を示した(図10のI〜N)。
バイサルファイトゲノミックシークエンス法により、Oct3/4、REX1及びNanogなどの多能性に関連する遺伝子のプロモーター領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド(CpG)のメチル化の状態を評価した結果、その領域のCpGジヌクレオチドは由来源の親HDF(HDF)においては高度にメチル化されているのに対して、ヒトiPS細胞(201B2,201B6,201B7)では高度に脱メチル化されていることが判明した(図14A)。これらの知見から、これらのプロモーターがヒトiPS細胞において活性化されていることが示唆された。
hTERTの高い発現レベルから推測される通り、ヒトiPS細胞は高いテロメラーゼ活性を示した(図15A)。ヒトiPS細胞は、少なくとも4ヶ月間は指数関数的に増殖した(図15B)。ヒトiPS細胞の計算上の倍増時間は、46.9±12.4(クローン201B2)、47.8±6.6(201B6)、及び43.2±11.5(201B7)時間であった(図15B)。これらの時間は、既報のヒトES細胞の倍増時間と同等であった(Cowan et al.,N.Engl.J.Med.,350,pp.1353−56,2004)。
ヒトiPS細胞のゲノムDNAのPCRにより、全クローンが4種全てのレトロウイルスの組み込みを有することが示された(図16A)。c−Myc cDNAプローブを用いたサザンブロット分析により、それぞれのクローンがレトロウイルス組み込み部位の特有のパターンを有することが判明した(図16B)。また、16のショートタンデムリピートのパターンは、ヒトiPSクローンと親のHDFとの間で完全に一致した。HDF由来iPS細胞のSTR解析の結果を表5に示す。
in vitroでのヒトiPS細胞の分化能を決定するために、浮遊培養を使用して胚様体(Embryoid body:EBs)を形成させた。浮遊培養の8日目後、iPS細胞はボール状の構造を形成した(図17A)。これらのEmbryoid body様構造をゼラチンコートしたプレートに移し、さらに8日間培養を継続した。付着した細胞は、神経様細胞、敷石様細胞、及び上皮細胞などの様々な細胞形態を示した(図17B−E)。免疫組織化学分析により、βIIIチューブリン(外胚葉マーカー)、グリア原線維酸性蛋白(GFAP、外胚葉)、α−平滑筋アクチン(α−SMA、中胚葉)、デスミン(中胚葉)、α−フェトプロテイン(内胚葉)、及びビメンチン(中胚葉及び体壁の内胚葉)に対して陽性の細胞が検出された(図17F−K)。RT−PCRの結果から、これらの分化した細胞においてFOXA2(内胚葉マーカー)、AFP(内胚葉)、サイトケラチン8及び18(内胚葉)、SOX17(内胚葉)、BRACHYURY(中胚葉)、MSX1(中胚葉)、MAP2(外胚葉)、及びPAX6(外胚葉)が発現していることが確認された(図17L)。一方、Oct3/4、Sox2、及びNanogの発現は明らかに低減していた。これらの結果より、iPS細胞が3胚葉系にインビトロで分化できることが示された。
ヒトiPS細胞からの分化をヒトES細胞についての既報の方法により誘導できるか否かを検討した。PA6フィーダー細胞層の上にヒトiPS細胞を撒き、分化条件下で2週維持・培養間した(Kawasaki et al.,Neuron,28,pp.31−40,2000)。細胞は大きく広がり、いくつかの神経構造が観察された(図18A)。免疫組織化学分析により、培養物中にチロシンヒドロキシナーゼ及びβIIIチューブリン陽性細胞が検出された(図18B)。PCR分析の結果から、AADC、ChAT、、DAT、及びLMX1Bなどのドーパミン作用性神経マーカー、並びに他の神経マーカーであるMAP2の発現が確認された(図18C)。また、Oct3/4、Sox2、及びNanogの発現は低減した(図18C)。これらの結果から、iPS細胞がPA6細胞との共培養によりドーパミン作用性ニューロンを含む神経細胞に分化できることが示された。
アクチビンA及び骨形成因子(BMP)4を利用した心臓細胞への分化に関する文献(Laflamme et al.,Nat.Biotechnol.,25,pp.1015−24,2007)を用いてヒトiPS細胞の心臓への分化を検討した。分化誘導から12日後、細胞塊は鼓動を始めた(図18D)。RT−PCRの結果から、これらの細胞がTnTc、MEF2C、NKX2.5、MYL2A、及びMYHCBなどの心筋細胞マーカーを発現していることが示された(図18E)。一方、Oct3/4、Sox2、及びNanogの発現は著しく低減していた。これらの結果から、ヒトiPS細胞がインビトロで心筋細胞へと分化できることが示された。
インビボでの多能性を試験するため、ヒトiPS細胞(クローン201B7)を免疫不全(SCID)マウスの背側の側腹部へ皮下移植した。9週間後に腫瘍形成が観察された。組織学的観察により、原腸管様上皮組織(外胚葉)、横紋筋(中胚葉)、軟骨(筋肉)、神経組織(内胚葉)、及びケラチン含有扁平組織(内胚葉)を含む様々な組織(図19)が腫瘍に含まれていることが示された。
HDFに加えて、成人男性の滑膜組織の初代ヒト由来線維芽細胞様滑膜細胞(HFLS)及び新生児の包皮由来の線維芽細胞から樹立された細胞株(BJ細胞)新生児の包皮由来の線維芽細胞から樹立された細胞株を使用した(表3)。HFLS(5x104細胞/100mmディッシュ)からiPS細胞の作成を試みた結果、600個以上の粒状コロニー及び17個のヒトES細胞様コロニーを得た。これらの17個のコロニーのうち6コロニーを試験に供したところ、それらのうちの2コロニーのみが増殖可能であった(図20)。5x105のHFLSを撒いたディッシュは粒状コロニーで覆われており、ヒトES細胞様コロニーは確認できなかった。一方、BJ細胞からiPS細胞の作成を試みた結果、5x104/100mmディッシュからの場合、僅かな粒状コロニーも認められたものの7〜13個のヒトES細胞様コロニー及び5x105/100mmディッシュからの場合は100個のヒトES細胞様コロニーを得た(表3)。そのうち6個のヒトES細胞様コロニーを取り、5個のコロニーからiPS細胞を確認した(図20)。HFLS及びBJに由来するヒトiPS細胞は、ヒトES細胞の場合と同等以上のレベルでヒトES細胞マーカー遺伝子を発現していた(図21)。これらのヒトiPS細胞は、EBsを介して3胚葉系に分化した(図22)。STR分析により、iPS−HFLS細胞及びiPS−BJ細胞はそれぞれHFLS及びBJ細胞に由来することが確認された。表6はHFLS由来iPS細胞のSTR解析の結果を示し、表7はBJ由来iPS細胞のSTR解析の結果を示す。
1.細胞培養
36歳のカフカス人女性の顔の皮膚から得たHDFs及び69歳のカフカス人男性の滑膜組織から得たHFLsはセルアプリケーション社から購入した。新生児の包皮から得たBJ線維芽細胞及びNTERA−2クローンD1ヒト胚性癌細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。ヒト線維芽細胞NTERA−2、PLAT−E、及びPLAT−A細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)、並びに0.5%ペニシリン及びストレプトマイシン(インビトロジェン)を含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、ナカライテスク)で維持した。293FT細胞は10%FBS、2mMLグルタミン(インビトロジェン)、1x10−4M非必須アミノ酸(インビトロジェン)、及び1mMピルビン酸ナトリウム(シグマ)、並びに0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するDMEMで維持した。PA6間質細胞(理研バイオリソースセンター)は、10%FBS及び0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するα−MEMで維持した。iPS細胞は4ng/ml組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、和光純薬)を補充した霊長類ES細胞用培地(リプロセル)で樹立及び維持した。継代においては、ヒトiPS細胞は、PBSで一回洗浄し、その後37℃で1mg/mlコラゲナーゼIV(インビトロジェン)を含むDMEM/F12でインキュベートした。ディッシュの縁にあるコロニーが底面から分離し始めた時に、DMEM/F12/コラゲナーゼを除去し、ヒトES細胞培地で洗浄した。細胞をかきとり、15mlの円錐形チューブに回収した。適量の培地を添加し、SNLフィーダー細胞上に新しいディッシュに移した。分割比は常に1:3とした。iPS細胞をフィーダー細胞を含まない状態で培養するためには、プレートは4℃で一晩0.3mg/mlマトリゲル(、BDバイオサイエンシス)でコートした。プレートは使用前に室温に加温した。未結合のマトリゲルは吸引除去し、DMEM/F12で洗浄した。iPS細胞は、マトリゲルコートされたプレート上に、4ng/mlのbFGFを補充したMEF−調整霊長類ES細胞用培地(MEF−CM)又はMEF−非調整霊長類ES細胞用培地(リプロセル)を用いて撒いた。培地は毎日交換した。MEF−CMの調製のために、ICRマウスの受精後13.5日目の胚を回収し得たMEFsを1x106cells/100mmでプレートにまき一晩培養した。翌日、細胞をPBSで一回洗浄し、10mlの霊長類ES細胞用培地で培養した。24時間培養後、MEF培養の培養上清液を回収し、孔径0.22μmのフィルターで濾過し、使用するまで−20℃で保存した。
ヒトOct3/4のオープンリーディングフレームをRT−PCRにより増幅し、pCR2.1−TOPOにクローニングした。pCR2.1−hOct3/4のEcoRIフラグメントを、pMXsレトロウイルスベクターのEcoRI部位に導入した。それぞれの実験を区別するために、N20バーコードと命名した20−bpのランダム配列をOct3/4発現ベクターのNotI/SalI部位へ導入した。実験間でのコンタミネーションを防ぐため、各実験において特有のバーコードを使用した。ヒトSox2,Klf4及びc−MycのオープンリーディングフレームもRT−PCRにより増幅し、pENTR−D−TOPO(インビトロジェン)へサブクローニングした。pENTR−D−TOPOへサブクローニングした全遺伝子を、ゲイトウェイクローニングシステム(インビトロジェン)を取扱説明書に従って用いてpMXsレトロウイルスベクターに導入した。マウスSlc7a1オープンリーディングフレームも増幅し、pENTR−D−TOPOにサブクローニングし、ゲイトウェイシステムによりpLenti6/UbC/V5−DEST(インビトロジェン)に導入した。ヒトOct3/4遺伝子及びREX1遺伝子の調節領域を、PCRにより増幅し、pCRXL−TOPO(インビトロジェン)にサブクローニングした。PhOCT4−Luc及びphREX1−Lucのために、pCRXLベクターからKpnI/BglII消化により除去したフラグメントをpGV−BM2のKpnI/BglII部位にサブクローニングした。pPolII−Lucのために、pQBI−polIIのAatII(平滑末端)/NheIフラグメントをpGV−BM2のKpnI(平滑末端)/NheI部位に挿入した。全てのフラグメントをシークエンスにより確認した。プライマー配列を表8(配列表の配列番号45から126)に示す。
6x106細胞の293FT細胞(インビトロジェン)を100mmディッシュに播き、一晩培養した。リポフェクトアミン2000(インビトロジェン)を取扱説明書に従って用いて293FT細胞に9μgのビラパワーパッケージングミックス(Virapower packaging mix)と一緒に3μgのpLenti6/UbC−Slc7aをトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日培地交換をおこなった。さらに24時間後、上清を回収し、孔径0.45μmのセルロースアセテートフィルター(ワットマン)により濾過した。遺伝子導入の1日前にヒト線維芽細胞を8x105細胞/100mmディッシュで撒いた。培地を4μg/mlポリブレン(ナカライテスク)を補充したウイルス含有上清液を用いて置換して24時間培養した。
PLAT−Eパッケージング細胞を8x106細胞/100mmディッシュでプレートに撒き、一晩培養した。翌日、PLAT−E細胞にFugene6トランスフェクション試薬(ロッシュ)を用いてpMXsベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、新しい培地と交換し、、さらに24時間後に培養上清をウイルス含有液として回収した。遺伝子導入の一日前にマウスSlc7a1遺伝子を発現しているヒト線維芽細胞(HDFa−Slc7a1)を8x105細胞/100mmディッシュに調整し播いておいた。ウイルス含有液を孔径0.45μmフィルターにより濾過し、4μg/mlポリブレンを補充した。4種のレトロウイルスをそれぞれ含有する等量の上清液を混合し、HDFa−Slc7a1のディッシュに移して、一晩感染させた。24時間後、ウイルスを含む上清を除去し、新しい培地と交換した。6日後、HDFa−Slc7a1細胞をトリプシン処理により採取し、SNLフィーダー細胞層の上に5x104細胞/100mmディッシュに調整し再度播いた。その翌日、培地を4ng/ml bFGFを補填した霊長類ES細胞用培地に交換した。培地は一日おきに交換した。遺伝子導入の30日後、コロニーを採取し、0.2mlの霊長類ES細胞培地に移した。コロニーを弱いピペッティングにより小さな塊に機械的に分離した。この細胞懸濁液をSNLフィーダー細胞をあらかじめ播いておいた24ウェルプレート上に移した。この段階を継代数1とした。
全RNAをトライゾール試薬(インビトロジェン)により抽出し、ゲノムDNAの混在を除去するためにターボDNAフリーキット(アンビオン)により処理した。1μgの全RNAを用いて、Rever Tra Ace−α(東洋紡)及びdT20プライマーを取扱説明書に従って用いて逆転写反応を行った。PCRはExTaq(タカラ)で行った。定量的PCRはプラチナSYBRグリーンqPCRスーパーミックスUDG(インビトロジェン)を用いて行い、7300リアルタイムPCRシステム(アプライドバイオシステム)により分析した。プライマー配列を表8に示す。
アルカリフォスファターゼ染色は、白血球アルカリフォスファターゼキット(シグマ)を用いて行った。免疫組織化学分析のために、細胞を室温で10分間4%のパラホルムアルデヒドを含有するPBSにより固定した。PBSで洗浄後、細胞を室温で45分間、5%正常ヤギ又はロバ血清(ケミコン)、1%ウシ血清アルブミン(BSA、ナカライテスク)、及び0.1%トリトンX−100を含むPBSにより処理した。一次抗体としてSSEA1(1:100に希釈、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマバンク)、SSEA3(1:10に希釈、Dr.Peter W.Andrewsから寄贈)、SSEA4(1:100に希釈、デベロップスタディーハイブリドーマバンク)、TRA−2−49/6E(1:20に希釈、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマバンク),TRA−1−60(1:50に希釈、Dr.Peter W.Andrewsから寄贈)、TRA−1−81(1:50に希釈、Dr.Peter W.Andrewsから寄贈)、Nanog(1:20に希釈、AF1997、R&Dシステム)、βIIIチューブリン(1:100に希釈、CB412、ケミコン)、グリア原繊維酸性蛋白(1:500に希釈、Z0334、ダコ)、α平滑筋アクチン(希釈済み、N1584、ダコ)、デスミン(1:100に希釈ラブビジョン)、ビメンチン(1:100に希釈、SC−6260、サンタクルズ)、α−フェトプロテイン(1:100に希釈、MAB1368、R&Dシステム)、チロシンヒドロキシラーゼ(1:100に希釈、AB152、ケミコン)を使用した。二次抗体は、cyanine3(Cy3)結合ヤギ抗ラットIgM(1:500期尺、ジャクソン・イムノリサーチ)、Alexa546結合ヤギ抗マウスIgM(1:500に希釈、インビトロジェン)、Alexa488結合ヤギ抗ウサギIgG(1:500に希釈、インビトロジェン)、Alexa488結合ロバ抗ヤギIgG(1:500に希釈、インビトロジェン)、Cy3結合ヤギ抗マウスIgG(1:500に希釈、ケミコン)、及びAlexa488結合ヤギ抗マウスIgG(1:500に希釈、インビトロジェン)を使用した。核は1μg/mlのHoechst33342(インビトロジェン)により染色した。
ヒトiPS細胞をコラゲナーゼIVにより処理した後、hydroxyrthyl methacrylateでコートしたディッシュ上に移し20%KSR(インビトロジェン)、2mM L−グルタミン、1x10−4M非必須アミノ酸、1x10−4M 2−メルカプトエタノール(インビトロジェン)及び0.5%のペニシリン及びストレプトマイシンを含むDMEM/F12培地を使用し、浮遊培養を行い胚様体(EBs)を形成した。培地は一日おきに交換した。浮遊培養の8日後、EBsをゼラチンコートしたプレートに移し、同じ培地中でさらに8日間培養した。
ドーパミン作用性ニューロンへの分化のために、まず、PA6フィーダー細胞をゼラチンコートされた6ウェルプレート上に撒き、コンフルエントになるまで4日間インキュベートした。EBsを介して培養したiPS細胞の小さな塊をPA6フィーダー細胞層上に加え、10%KSR(インビトロジェン)、1x10−4M非必須アミノ酸、及び1x10−4M 2−メルカプトエタノール(インビトロジェン)、並びに0.5%ペニシリン及びストレプトマイシンを含むグラスゴー最小必須培地(インビトロジェン)を用いて培養した。
心筋細胞への分化のためには、iPS細胞をマトリゲルコートされたプレート上で4ng/ml bFGFを補充したMEF−CM中に6日間維持した。その後、RPMI1640にB27サプリメント(インビトロジェン)を補充した培地(RPMI/B27)に100ng/mlヒト組換えアクチビンA(R&Dシステム)を添加した培地を用いて24時間培養し、続いて10ng/mlヒト組換え骨形成因子4(BMP4、R&Dシステム)を補充してさらに4日間置いた。サイトカインによる刺激後、細胞はサイトカイン無しでRPMI/B27中に維持した。培地は一日おきに交換した。
ゲノムDNA(1μg)を、CpゲノムDNA修飾キット(ケミコン)を用いて製造業者が推奨する方法に従って処理した。処理したDNAをQIAクイックカラム(QIAGEN)により精製した。ヒトOct3/4、Nanog、及びRex1遺伝子のプロモーター領域をPCRによって増幅した。PCR産物をpCR2.1−TOPOにサブクローニングした。それぞれのサンプルの10クローンをM13ユニバーサルプライマーを用いてシークエンシングした。PCR増幅に使用したプライマー配列を表8に示した。
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むそれぞれのレポータープラズミド(1μg)を50ngのpRL−TK(プロメガ)を用いてヒトiPS細胞又はHDFに導入した。遺伝子導入の48時間後、細胞を1xPassive lysis buffer(プロメガ)により溶解し、室温で15分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性をDualルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(プロメガ)及びCentro LB 960検出システム(バーソルド)を用いて製造業者のプロトコルに従って測定した。
細胞をコラゲナーゼIV処理により採取し、チューブに回収して遠心し、ペレットをDMEM/F12に懸濁した。コンフルエントな100mmディッシュから取った細胞の4分の1をSCIDマウス(日本クレア)の背側の側腹部へ皮下注入した。9週間後に腫瘍を切除して重量を測定し、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSにより固定した。パラフィン包理した組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。
セミコンフルエント状態にある細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル(ロッシュ)を補充したRIPA緩衝液(50mM Tris−HCl、pH8.0、150mMNaCl、1%Nonidet P−40(NP−40)、1%デオキシコール酸ナトリウム及び0.1%SDS)により溶解した。MEL−1ヒトES細胞株の細胞溶解物をアブカムから購入した。細胞溶解物(20μg)を8%又は12%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜(ミリポア)に移した。膜は1%スキムミルクを含むTBST(20mM Tris−HCl、pH7.6、136mM NaCl、及び0.1%Tween−20)でブロッキングし、その後、一晩4℃で一次抗体を反応させた。TBSTによる洗浄後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体とともに室温で一時間反応させた。シグナルをイモビロンウェスタン化学発光HRP基質(ミリポア)及びLAS3000画像化システム(富士フィルム)により検出した。1次抗体としては、抗Oct3/4(1:600に希釈、SC−5279、サンタクルズ)、抗Sox2(1:2000に希釈、AB5603、ケミコン)、抗Nanog(1:200に希釈、R&Dシステム)、抗Klf4(1:200に希釈、SC−20691、サンタクルズ)、抗c−Myc(1:200に希釈、SC−764、サンタクルズ)、抗E−cadherin(1:1000に希釈、610182、BDバイオサイエンス)、抗Dppa4(1:500に希釈、ab31648、アブカム)、抗FoxD3(1:200に希釈、AB5687、ケミコン)、抗テロメラーゼ(1:1000に希釈、ab23699、アブカム)、抗Sall4(1:400に希釈、ab29112、アブカム)、抗Lin28(1:500に希釈、AF3757、R&Dシステム)、抗βアクチン(1:5000に希釈、A5441、シグマ)、2次抗体としては抗マウスIgG−HRP(1:3000に希釈、#7076、セルシグナリング)、抗ウサギIgG−HRP(1:2000に希釈、#7074、セルシグナリング)、及び抗ヤギIgG−HRP(1:3000に希釈、SC−2056、サンタクルズ)を使用した。
ゲノムDNA(5μg)を、BglII,EcoRI、及びNcoIにより一晩消化した。消化したDNAフラグメントを0.8%アガロースゲルで分離し、ナイロン膜(アマシャム)に移した。膜をジゴキシゲニン(DIG)で標識したDNAプローブと共にDIG Easy Hyb緩衝液(ロッシュ)中で一定の振盪下に42℃で一晩反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合抗DIG抗体(1:10000に希釈、ロッシュ)を膜に添加した。シグナルはCDPスター(ロッシュ)により増強させ、LAS3000画像化システムにより検出した。
ゲノムDNAを用いて、パワープレックス16システム(プロメガ)によりPCRを行い、ABI PRISM 3100 Genetic analyzer及びGene Mapper v3.5(アプライドバイオシステム)により分析した。染色体Gバンド分析は日本遺伝子研究所(日本)で行った。
テロメラーゼ活性はTRAPEZEテロメラーゼ検出キット(ケミコン)により取扱説明書に従って検出した。サンプルはTBEをベースにした10%アクリルアミド非変性ゲル電気泳動により分離した。ゲルはSYBRゴールド(1:10000に希釈、インビトロジェン)により染色した。
約1x107個の細胞を室温下で1%ホルムアルデヒドで5分間架橋し、グリシン添加により反応を停止した。細胞ライセートを超音波処理することにより、クロマチン−DNA複合体を切断した。Dynabeads Protein G(インビトロジェン)結合抗トリメチルLys4ヒストンH3(07−473,Upstate)、抗トリメチルLys27ヒストンH3(07−449,Upstate)、又は正常ウサギIgG抗体を用いて免疫沈降を行った。溶出液を定量的PCRの鋳型として用いた。
HDF及びhiPS細胞(クローン201B)からの全RNAをCy3により標識した。サンプルを全ヒトゲノムマイクロアレイ4x44K(G4112F、アジレント)とハイブリダイズさせた。各サンプルは1つのカラープロトコールと1回ハイブリダイズさせた。アレイをG2565BAマイクロアレイスキャナーシステム(アジレント)を用いてスキャンし、データをGeneSpringGX7.3.1ソフトウェアを用いて分析した。2種の標準化手法を適用した。先ず、0.01未満のシグナル強度を0.01と設定した。次いで、各チップを、そのチップから取得した測定の50番目の百分位数に標準化した。hES H9細胞のマイクロアレイデータ(Tesar et al.,Nature,448,pp.196−199,2007)をGEO DataSets(GSM194390,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gds&cmd=search&term=GSE7902)から回収した。3つの全てのサンプルにおいて″present″フラグ値を有する遺伝子を分析に用いた(32,266遺伝子)。HDF及びhiPS細胞のマイクロアレイデータをGEO DataSetsにアクセッション番号GSE9561として登録した。
Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc−Mycをマウス線維芽細胞にレトロウイルスを用いて導入することにより得られるマウスiPS細胞(Takahashi et al.,Cell,126,pp.663−76,2006)のiPSクローンは各遺伝子について数個のレトロウイルスの組み込みを含んでいる。各クローンは全部で20を超えるレトロウイルスの組み込み部位を有しており、腫瘍形成の危険を増大させる可能性がある。マウスiPS細胞の場合、iPS細胞に由来するキメラマウス及びその子孫の〜20%において腫瘍が発生することが分かっており(Okita et al.,Nature,448,pp.313−17,2007)、c−Mycレトロウイルスの再活性化は、iPS細胞を用いて作製したキメラマウス及びその子孫マウスにおいて腫瘍形成発生率を増加させる可能性がある。そこでc−Mycを用いずにiPS細胞を樹立する方法を検討した。
1.プラスミドの構築
ファミリー遺伝子のコード領域を表11(配列表の配列番号127から152)にリストしたプライマーを用いたRT−PCRにより増幅し、pDONR201又はpENTR−D−TOPO(インビトロジェン)にサブクローニングし、LR反応(インビトロジェン)によりpMXs−gwに連結した。
Fugene6試薬(ロッシュ)を製造業者の指示に従って用いてpMXsに基づいたレトロウイルスベクターをPLAT−E細胞(Morita et al.,Gene Ther.,7,pp.1063−1066,2000)へトランスフェクションした。24時間後に培地を交換し、さらに24時間後にウイルス含有上清を採取し、レトロウイルス感染による遺伝子導入を行った。「混合」プロトコルでは4遺伝子をそれぞれ含むベクターの混合物を用いてPLAT−E細胞の単一ディッシュに遺伝子導入した。「個別」方法では、各ベクターをPLAT−E細胞を含む個別のディッシュに遺伝子導入した。ウイルス含有上清は遺伝子導入の前に混合した。「個別」方法において有意に高い遺伝子導入効率が観察された。
iPS細胞の誘導は既報の方法(Takahashi et al.,Cell,126,pp.663−676,2006;Okita et al.,Nature,448,pp.313−17,2007)を修正して行った。Nanog−GFP−IRES−Purorレポーター又はFbx15−βgeoレポーターのいずれか又は両方を含むMEFをSNLフィーダー細胞(McMahon et al.,Cell,62,pp.1073−1085,1990)をあらかじめ播いておいた6ウェルプレート及び100mmディッシュに1.3×105細胞/ウェル(6ウェルプレート)及び8.0×105細胞/ウェル(100mmディッシュ)の割合で撒いた。遺伝子を導入した細胞をLIF(Meiner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,pp.14041−14046,1996)を含むES細胞用培地で培養した。G418(300μg/ml)又はピューロマイシン(1.5μg/ml)による選択は既報の方法の通り開始した。遺伝子導入の25日から3日後にコロニー数を測定した。コロニーの一部を選択して継代させた。
TTFをアダルトNanogレポーターマウス又はアダルトDsRedトランスジェニックマウスから単離した(Vintersten et al.,Genesis,40,pp.241−246,2004)。レトロウイルス含有上清は「個別」方法で調製した。4遺伝子の導入のためにKlf4、c−Myc、Oct3/4、Sox2、及びDsRedのレトロウイルス含有上清を1:1:1:1:4の比率で混合した。3遺伝子を導入する場合は、Klf4、Oct3/4、Sox2、Mock(空ベクター)、及びDsRedのレトロウイルス含有上清を、1:1:1:1:4の比率で混合した。DsRedトランスジェニックマウスについては、GFPレトロウイルスをDsRedの代わりに使用した。トランスフェクションのためにTTFをフィーダー細胞層を有しない100mmディッシュに1ディッシュあたり8.0×105細胞の割合で撒いた。TTFにウイルス/ポリブレン含有上清を添加し、24時間感染させた。遺伝子導入の4日後に3遺伝子を導入したTTFをSNLフィーダー細胞層を有する100mmディッシュに1ディッシュあたり3.5×105細胞の割合で再び撒き、ES細胞用培地で培養した。4遺伝子を導入したTTFはSNLフィーダー細胞層を有する100mmディッシュに1ディッシュあたり0.5×105細胞の割合で再度撒いた。遺伝子導入の30日から40日後にコロニー数を測定した。コロニーの一部を選択して継代した。
5.iPS細胞の評価
RT−PCR及び奇形腫形成を既報の方法の通り行った。キメラ実験については15から20個のiPS細胞をBDF1由来胚盤胞に注入し、これを偽妊娠マウスの子宮に移植した。
下記遺伝子:Klf4、c−Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog、及びLin28(NCBI accession number NM_145833(マウス)又はNM_024674(ヒト))の組み合わせ、又はその組み合わせから1又は2以上の遺伝子を除いた組み合わせを用いてiPS細胞の誘導を行った。
マウス胚性線維芽細胞(MEF)及びヒト成人皮膚由来繊維芽細胞(adult HDF)を用いて実験を行った結果、3遺伝子(Klf4、Oct3/4、及びSox2)を用いたiPS細胞誘導は、Sall4をこの組み合わせに加えた場合、即ちKlf4,Oct3/4,Sox2,及びSall4を用いた場合にiPS細胞の作製効率を上昇させることが判明した(図32及び33)。Sall4を4遺伝子(Klf4、Oct3/4、Sox2、及びc−Myc)に加えた場合、より多数のiPS細胞コロニーが観察された。これらの実験から、核初期化因子にSall4を追加することによってiPS細胞の誘導効率を改善できることが示された。
既報の方法(Cell,131,pp.861−872,2007)に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピックレセプターSlc7a遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞(adult HDF)に、ヒト由来の4遺伝子(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc−Myc)又は3遺伝子(Y3F:Oct3/4、Sox2、及びKlf4)と、マウスSall4(mSall4)遺伝子又はマウスSall1(mSall1)遺伝子とをレトロウイルスを用いて導入した。
既報の方法(Cell,131,pp.861−872,2007)に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピック受容体Slc7aを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞(HDFa−Slc7a1)にヒト由来の4遺伝子(T4F:Oct3/4、Sox2、Nanog、及びLin28)又は3遺伝子(T3F:Oct3/4、Sox2、及びNanog)とともに、マウスSall4(mSall4)又はマウスSall1(mSall1)あるいはその両方をレトロウイルスを用いて導入した。
Cell,131,pp.861−872,2007に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピック受容体Slc7aを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞(HDFa−Slc7a1)を用意し、翌日、ヒト由来の4遺伝子(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc−Myc)又は3遺伝子(Y3F:Oct3/4、Sox2、Klf4)とヒトSall4(hSall4)とをレトロウイルスを用いて導入した。導入後6日目に一旦HDFを回収し、その後5x105個に調整したHDFを1.5x106個のマイトマイシンCで処理したSTO細胞の上に播種した。翌日以降は4ng/mlリコンビナントヒトbFGF(和光純薬)を含んだ霊長類ES細胞培養用培地(リプロセル)で培養した。感染後32日目及び40日目にES細胞様コロニー数をカウントした結果を図36に示す。
(A)4遺伝子(Oct3/4、Klf4、Sox2、及びL−Myc)導入による核初期化の検討
(1)ヒトiPS細胞誘導に対する効果
マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞(aHDF−Slc7a1)を既報の方法(Cell,131,pp.861−872,2007)に従って作製した。このaHDF−Slc7a1を3x105個/60mmディッシュの割合で蒔き、その翌日、上記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の4遺伝子(Oct3/4、Klf4、及びSox2の3遺伝子にL−Myc1(以下、単に「L−Myc」と称する)、c−Myc、又はN−Myc遺伝子を加えた合計4遺伝子)をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から6日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った(5x105個/100mmディッシュ)。その翌日から霊長類ES細胞培養用培地(リプロセル)に4ng/mlのリコンビナントヒトbFGF(和光純薬)を加えた培地で培養を行った。
Oct3/4、Klf4、Sox2、及びL−Mycの4遺伝子導入により樹立されたヒトiPS細胞(32R2,32R6)をlow−binding dishに播き、既報の方法(Cell,131,pp.861−872,2007)に従って胚様体(embryoid body:EB)を形成させた(100mmディッシュ)。2週間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα−フェトプロテイン(R&Dシステムズ)、中胚葉系細胞の分化マーカーであるα−平滑筋アクチン(和光純薬)、及び外胚葉系の分化マーカーであるβIII−チューブリン(ケミコン)の各抗体を用いた染色を行った。結果を図38に示す。上記染色により各マーカーの発現が確認され、得られたヒトiPS細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。
Oct3/4、Klf4、Sox2、及びL−Mycの4遺伝子導入により樹立されたヒトiPS細胞(32R6)を、リコンビナントヒトbFGF(4ng/ml)及びRhoキナーゼ阻害剤Y−27632(10μM)を含有する霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL)中で培養した。1時間後、collagen IVで処理して細胞を採取後、遠心して細胞を回収し、Y−27632(10μM)を含有するDMEM/F12中に浮遊させた。コンフルエントになった細胞(100mmディッシュ)の1/4量をSCIDマウスの精巣内に注射した。2〜3ヶ月後、腫瘍を切り刻んで4%ホルムアルデヒドを含有するPBS(−)で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。この結果を図39に示す。組織学的に腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経組織、腸管様組織、軟骨組織、毛髪組織、脂肪細胞、及び色素組織が認められたことから、iPS細胞の多能性が証明された。
Nanog遺伝子座にEGFPとピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んで作製したNanogレポーターを有するマウス(Nature,448,pp.313−317,2007)よりMEFを単離した(MEF−Ng)。同様にFbx15遺伝子座にβ−geo遺伝子を組み込んで作製したFbx15レポーターを有するマウス(Cell,126,pp.663−676,2006)よりMEFを単離した(MEF−Fbx)。これらのMEFに4遺伝子(Oct3/4、Klf4、Sox2、及びL−Myc)をレトロウイルスを用いて導入し、MEF−Ngについてはピューロマイシンで選択し、MEF−FbxについてはG418で選択することによりiPS細胞を樹立した(それぞれNanog−iPS及びFbx−iPSと称する)。これらのiPS細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスを作出した。キメラマウス及びF1マウスにおける腫瘍形成を検討した結果、現時点でそれぞれ以下の日数生存しており、また生存しているいずれのマウスにおいても腫瘍の発生は認められなかった。
キメラマウスNanog−iPS:15/16匹 363日生存中
F1 Nanog−iPS:1/1匹 255日生存中
F1 Nanog−iPS:3/3匹 181日生存中
F1 Nanog−iPS:1/1匹 132日生存中
キメラマウスNanog−iPS:30/30匹 63日生存中
キメラマウスNanog−iPS:12/14匹 62日生存中
Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc−Mycの4遺伝子により初期化を行ったiPS細胞を用いた場合には、生後100日以内に37匹中6匹のキメラマウスが腫瘍が原因で死亡したが(Nature Biotech.,26,pp.101−106,2008)、c−Mycに代えてL−Mycを用いることにより生存日数に顕著な改善が認められ、かつ腫瘍発生が劇的に減少することが明らかとなった。
(1)iPS細胞コロニー形成の有無
既報の方法(Nature Biotech.,26,pp.101−106,2008)に従い3遺伝子(Oct3/4、Klf4、及びL−Myc)導入によるiPSの樹立を試みた。上記(A)(1)ないし(4)に記載したMEF−Ngをゼラチンコートした6ウェル培養プレートに1.3x105個/ウェルの割合で蒔き、24時間後にマウス由来の3遺伝子(Oct3/4、Klf4、及びL−Myc)をレトロウイルスを用いて導入した。ウイルス感染から4日後に細胞を回収し、MSTO細胞上への蒔き直しを行った(1.5x105個/6ウェルプレート)。翌日から細胞をLIFを加えたES細胞培養用培地(DMEM(ナカライタスク)に15%牛胎仔血清、2mM L−グルタミン(インビトロジェン)、100μM非必須アミノ酸(インビトロジェン)、100μM 2−メルカプトエタノール(インビトロジェン)、50U/mLペニシリン(インビトロジェン)と50mg/mLストレプトマイシン(インビトロジェン)を加えたもの)を用いて培養した。ウイルス感染から46日目にGFP陽性コロニーをピックアップした(iPS−MEF−Ng−443−3クローン)。ピックアップした16個の細胞の写真を図40に示す。いずれの細胞もGFP陽性を示すiPS細胞コロニーであった。
前記(1)で樹立した4つのクローン(iPS−MEF−Ng−443−3−3、iPS−MEF−Ng−443−3−6、iPS−MEF−Ng−443−3−12、及びiPS−MEF−Ng−443−3−13)をlow−binding dishに播き(2x106個/6ウェルプレート)、胚様体(embryoid body:EB)を形成させた。ES細胞培養用培地で2週間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα−フェトプロテイン(R&Dシステムズ),中胚葉系細胞の分化マーカーであるα−平滑筋誘導に(ダコ),外胚葉系の分化マーカーであるβIII−チューブリン(ケミコン)の各抗体を用いた染色を行った。結果を図42に示す。染色によりこれらのマーカーの発現が確認され、得られたマウスiPS細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。
前記(1)で樹立した4つのクローン(iPS−MEF−Ng−443−3−3、iPS−MEF−Ng−443−3−6、iPS−MEF−Ng−443−3−12、及びiPS−MEF−Ng−443−3−13)をそれぞれヌードマウスの皮下に注射した。4週間後に全例で奇形腫の形成が確認された。組織学的に腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経組織、腸管様組織、筋肉組織、表皮組織、及び軟骨組織が認められたことから(図43)、iPS細胞の多能性が証明された。
マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞(aHDF−Slc7a1)を既報の方法(Cell,131,pp.861−872,2007)に記載の方法に従い作製した。このaHDF−Slc7a1を3x105個/60mmディッシュの割合で蒔き、その翌日、上記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の以下の3遺伝子、4遺伝子、又は5遺伝子をレトロウイルスで導入した。
・Sox2、Oct3/4、及びKlf4
・Sox2、Oct3/4、Klf4、及びc−Myc
・Sox2、Oct3/4、Klf4、及びL−Myc
・Sox2、Oct3/4、Klf4、及びLin28
・Sox2、Oct3/4、Klf4、c−Myc、及びLin28
・Sox2、Oct3/4、Klf4、L−Myc、及びLin28
図45に示す各種Mycキメラ遺伝子(Ms−cL−Myc、Ms−Lc−Myc、Ms−cLc−Myc、Ms−LcL−Myc、Ms−ccL−Myc、Ms−cLL−Myc、Ms−LLc−Myc、Ms−Lcc−Myc)、及びMyc点変異遺伝子(c−MycW135E、c−MycV394D、c−MycL420P、L−MycW96E、L−MycV325D、L−MycL351P)を以下のとおり構築した。まず、マウスc−Myc(Ms−c−Myc)及びL−Myc(Ms−L−Myc)をそれぞれpENTR−D−TOPO(Invitrogen)に組み込み、pENTR−D−TOPO−Ms−c−Myc及びpENTR−D−TOPO−Ms−L−Mycを作製した。次に、マウスc−Myc(NCBI Acc.No.NM_010849)及びL−Myc(NCBI Acc.No.NM_008506)の配列情報に基づいて、図45に示した点変異を導入するためのプライマーを作製し、これを用いてpENTR−D−TOPO−Ms−c−Myc及びpENTR−D−TOPO−Ms−L−Mycを鋳型としてPCRを行った。各変異についてシークエンスで確認後、LR反応にてレトロウイルスベクターのpMXsにサブクローニングした。図45に示したキメラMycについては、各フラグメントをPCRにて増幅し、それぞれの組み合わせに応じて混合したものを鋳型としてPCRを行い、先と同様にレトロウイルスベクターのpMXsにサブクローニングした。
[配列表]
Claims (19)
- 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の3種の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含む方法。
- 下記の3種の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含む請求項1に記載の方法。
- 下記の3種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、及びSox2を体細胞に導入する工程を含む請求項1に記載の方法。
- Octファミリー遺伝子を含むウイルスベクター、Klfファミリー遺伝子を含むウイルスベクター、及びSoxファミリー遺伝子を含むウイルスベクターをそれぞれ別のパッケージング細胞にトランスフェクトして該細胞を培養することにより3種類の培養上清を得る工程、及び上記工程により得られた3種類の培養上清の混合物を調製し、該混合物を用いて体細胞の初期化を行う工程を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 薬剤選択を行わずに人工多能性幹細胞を製造する請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子の組み合わせ又は下記の2種の遺伝子:Octファミリー遺伝子及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせと、下記の3種の遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子:L−Myc、Sall1、及びSall4とを体細胞に導入する工程を含む方法。
- 下記の2種の遺伝子:Oct3/4及びSox2の組み合わせ又は下記の2種の遺伝子:Oct3/4及びKlf4の組み合わせと、下記の3種の遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子:L−Myc、Sall1、及びSall4とを体細胞に導入する工程を含む請求項6に記載の方法。
- 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の3種の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びKlfファミリー遺伝子の組み合わせと、下記の3種の遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子:L−Myc、Sall1、及びSall4とを体細胞に導入する工程を含む方法。
- 下記の3種の遺伝子:Oct3/4、Sox2、及びKlf4の組み合わせと、下記の3種の遺伝子から選ばれる少なくとも1種の遺伝子:L−Myc、Sall1、及びSall4とを体細胞に導入する工程を含む請求項8に記載の方法。
- 上記の遺伝子に加えて下記の遺伝子:Lin28及び/又はNanogを体細胞に導入する工程を含む請求項6ないし9のいずれか1項に記載の方法。
- Oct3/4、Sox2、Klf4、L−Myc、及びLin28を体細胞に導入する工程を含む請求項10に記載の方法。
- 分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、請求項1ないし11のいずれか1項に記載の工程を含む方法。
- 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の6種の遺伝子:Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Lin28、及びNanogを体細胞に導入する工程を含む方法。
- 下記の6種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、Sox2、c−Myc、Lin28、及びNanogを体細胞に導入する工程を含む請求項13に記載の方法。
- 体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞である請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
- 体細胞がヒトの体細胞である請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1ないし16のいずれか1項に記載の方法により得ることができる人工多能性幹細胞。
- 請求項17に記載の人工多能性幹細胞から分化誘導された体細胞。
- 請求項18に記載の体細胞の集団である組織、臓器、体液、又は個体。
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