CN101617043A

CN101617043A - 核重编程方法

Info

Publication number: CN101617043A
Application number: CN200880000834A
Authority: CN
Inventors: 山中伸弥; 高桥和利; 中川诚人
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2007-10-31
Filing date: 2008-10-31
Publication date: 2009-12-30
Anticipated expiration: 2028-10-31
Also published as: CN101617043B; WO2009057831A1; CA2660123C; JP5349294B2; EP2096169B1; CA2660123A1; KR101564044B1; JPWO2009057831A1; EP2096169A1; KR20100075771A; AU2008297024A1; EP2096169A4; AU2008297024B2

Abstract

由体细胞有效产生安全的诱导性多能干细胞的方法，包括将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因导入体细胞的步骤；或将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合或下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合，及选自下列三种基因——L－Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

Description

核重编程方法

技术领域

[0001]本发明涉及通过重编程分化的体细胞来产生诱导性多能干细胞的方法。

背景技术

[0002]胚胎干细胞(ES细胞)是源自人或小鼠早期胚胎的具有无限增殖能力，同时保持着多能性及分化成活体中存在的所有细胞的能力。通过使用这些特性，期望将人ES细胞用作针对多种疾病(如帕金森症、青少年糖尿病和白血病)的移植疗法的来源。但问题是，ES细胞的移植引发移植后患者的组织排斥。另外还有许多来自论理学观点的对使用通过破坏人胚胎建立的人ES细胞的反对意见。

[0003]如果可将患者自身的分化体细胞用于诱导分化，并建立如ES细胞(在本说明书中，将此细胞称为“人工多能干细胞”或“iPS细胞”，还称为“诱导性多能干细胞”、“胚胎干细胞样细胞”或“ES样细胞”)一样具有多能性和增值能力的细胞，则期望将它们用作既无排斥反应，又无伦理问题的理想的多能性细胞。近来，有报道称可从小鼠和人体细胞产生所述iPS细胞，这已引起强烈反响(国际公开WO2007/69666；Cell，126，pp.663-676，2006；Cell，131，pp.861-872，2007)。

[0004]上述方法包括通过将多个特定因子(如Cell，126，pp.663-676，2006所述使用了四种因子：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入体细胞来进行重编程的步骤，并将逆转录病毒载体用于导入所述因子。但因为c-Myc是癌-相关的转录因子，当将所述包含c-Myc的四种因子导入体细胞进行重编程时，无法排除分化诱导自所得诱导性多能干细胞的所述细胞或组织具有致瘤性的可能性。已知使用逆转录病毒载体导入ES细胞的基因具有沉默功能，并也证实通过使用逆转录病毒载体产生的iPS细胞具有沉默功能(参见国际公开WO2007/69666的实施例7)。但无法保证所述导入的外源c-Myc不在其后代中表达。Thomson等人建议了使用四种因子Oct3/4、Sox2、Lin28和Nanog(不使用c-Myc)进行核重编程的方法(Science，318，pp.1917-1920，2007；国际公开WO2008/118820)。但当前世界上iPS细胞的研发过程中仍使用四种因子：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc。

[0005]此外，国际公开WO2007/69666教导可用细胞因子取代Myc家族基因，且上述文献说明书的实施例5显示，可用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)代替c-Myc实现核重编程。此外，上述国际公开显示选为重编程因子候选物的24个基因包括sall4(表4，No.13)。但这不表明Sall4具有核重编程活性。而且显示，相比使用c-Myc产生iPS细胞，可通过组合L-Myc或N-Myc(Myc家族基因之一)与Oct3/4、Sox2核Klf4有效建立iPS细胞(实施例6)。

专利文献1：国际公开WO2007/69666

专利文献2：国际公开WO2008/118820

非专利文献1：Cell，126，pp.663-676，2006

非专利文献2：Cell，131，pp.861-872，2007

非专利文献3：Science，318，pp.1917-1920，2007

发明内容

本发明拟解决的问题

[0006]本发明的问题是提供产生安全的诱导性多能干细胞的方法。具体而言，本发明的问题是提供安全的诱导性多能干细胞，由所述诱导性多能干细胞分化诱导所得的细胞或组织中无致瘤性危险。

此外，本发明的另一目的是提供有效产生诱导性多能干细胞的方法。

本发明的特别优选的目的是提供有效产生安全的诱导性多能干细胞的方法。

解决所述问题的方法

[0007]本发明人为解决上述问题，经锐意研究，结果发现可在不使用c-Myc的情况下产生安全的诱导性多能干细胞。

此外，本发明人发现，可通过使用L-Myc、Sall1或Sall4(而不使用c-Myc)进行核重编程来提供分化诱导来得到的细胞或组织中无致瘤性危险的安全的诱导性多能干细胞，且可通过实施所述方法极其有效地产生安全的诱导性多能干细胞。

基于以上发现完成了本发明。

[0008]本发明提供了由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因导入体细胞的步骤。

[0009]根据所述方法的优选方面，提供了包括在将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因导入体细胞后，培养所述细胞足够长的时间，从而使所述细胞获得多能性并增殖的步骤的方法。

根据所述方法的另一优选方面，提供了包括将下列三种基因——Oct3/4、Klf4和Sox2导入体细胞的步骤的方法；和包括在将下列三种基因——Oct3/4、Klf4和Sox2导入体细胞后，培养所述细胞足够长的时间，从而使所述细胞获得多能性并增殖的步骤的方法。

[0010]此外，根据所述方法的又一优选方面，提供了包括分别用含有Oct家族基因的病毒载体、含有Klf家族基因的病毒载体和含有Sox家族基因的病毒载体各自转染包装细胞，并培养所述细胞，以获得三种培养上清液的步骤，及制备通过上述步骤得到的三种培养上清液的混合物，并使用所述混合物重编程体细胞的步骤的方法。

此外，根据所述方法的另一优选方面，提供了包括不使用药物筛选的情况下重编程所述体细胞的步骤的方法。

[0011]上述方法中，可任选在缺乏或存在细胞因子的情况下(优选在缺乏细胞因子的情况下)进行所述基因导入。此外，可任选在缺乏或存在细胞因子的情况下(优选在缺乏细胞因子的情况下)进行所述培养。

[0012]由本发明提供的诱导性多能干细胞中，分化诱导后所得细胞或组织中的肿瘤发展基本被降低或消除。因此本发明还提供了产生诱导性多能干细胞的方法，其中分化诱导后所得细胞或组织中的肿瘤发展基本被降低或消除，包括将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因，优选将Oct3/4家族基因、Klf4基因和Sox2基因导入体细胞的步骤。

[0013]本发明另一方面提供了由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合或下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合，及选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

[0014]根据本发明的优选方面，提供了包括将下列两种基因——Oct3/4和Sox2的组合或下列两种基因——Oct3/4和Klf4的组合，及选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤的方法。包括除上述基因外，将下列基因——Lin28和/或Nanog导入体细胞的步骤的方法也是优选方面，且包括将Lin28导入体细胞的步骤的方法是更优选的方面。在上述方法中，也可通过合适的组合使用c-Myc。

[0015]根据本发明的再优选方面，提供了包括将下列三种基因——Oct家族基因、Sox家族基因和Klf家族基因的组合(优选为Oct3/4、Sox2和Klf4的组合)，及选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤的方法。

[0016]更具体而言，提供了包括将下列四种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和Sall1导入体细胞的步骤的方法；包括将下列四种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和Sall4导入体细胞的步骤的方法；包括将下列四种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc导入体细胞的步骤的方法；包括将下列五种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1和L-Myc导入体细胞的步骤的方法；包括将下列五种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall4和L-Myc导入体细胞的步骤的方法；包括将下列五种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤的方法；和包括将下列六种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1、Sall4和L-Myc导入体细胞的步骤的方法。

如果使用了L-Myc，所述体细优选是人体细胞。

在上述任意方法中，本发明还提供了包括将Lin28导入体细胞的步骤的方法，且作为优选方面，提供了包括将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28导入体细胞的步骤的方法。

[0017]在根据本发明的提供的诱导性多能干细胞中，分化诱导后所得细胞或组织中的肿瘤发展基本被降低或消除。因此本发明提供了产生诱导性多能干细胞的方法，其中分化诱导后所得细胞或组织中的肿瘤发展基本被降低或消除，包括将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因(优选为Oct3/4家族基因和Sox2基因)，及选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤。包括还在所述方法中将Klf家族基因(例如Klf4)导入体细胞的步骤的方法也是优选方面，且包括将Lin28和Klf家族基因一并或用Lin28代替Klf家族基因导入体细胞的步骤的方法也是优选方面。

[0018]本发明再一方面提供了由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将下列六种基因——Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog(优选为下列六种基因——Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog)导入体细胞的步骤。在所述方法中，可使用选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因代替c-Myc，且所述方法也是优选方面。

[0019]在上述各方法中，可使用重组载体将所述基因导入体细胞，且优选使用包括选自所述各方法中定义的基因的组合中的至少一种的重组载体，其中所述基因被导入体细胞。可将任何病毒载体和非病毒载体作为所述载体使用。

[0020]本发明还提供了包括上述各发明中定义的基因的组合的核重编程因子。还优选进一步组合TERT基因和/或SV40大T抗原基因与上述组合。

[0021]此外，本发明还提供了包括上述各发明中定义的基因的基因产物的组合的核重编程因子，且包括使所述包括上述各发明中定义的基因的基因产物的组合的核重编程因子与体细胞接触的步骤的方法。作为优选方面，提供了包括将所述核重编程因子加入体细胞培养物中的步骤的方法。

[0022]在上述各发明中，提供了其中所述体细胞是哺乳动物体(包括人)细胞(优选为灵长类体细胞，更优选为人体细胞)的方法；其中所述体细胞是人胎细胞或源自成人的体细胞的方法；其中所述体细胞是收集自患者的体细胞的方法。

[0023]本发明另一方面提供了通过上述方法得到的诱导性多能干细胞。此外，根据本发明提供了分化诱导自通过上述方法得到的诱导性多能干细胞的体细胞。本发明还提供了组织、器官、体液和个体，它们是分化诱导的体细胞群。

[0024]此外，本发明提供了干细胞疗法，包括使用回收和收集自患者的体细胞分化诱导根据上述方法得到的诱导性多能干细胞，并将得到的体细胞或组织、器官或体液(它们是所述细胞的细胞群)移植给所述患者的步骤。

本发明还提供使用多种通过分化诱导根据上述方法得到的诱导性多能干细胞得到的细胞测定化合物、药物或毒素的生理活性或毒性的方法。

附图简述

[0025]

图1：诱导自人成年皮肤细胞(成年HDF)的iPS细胞的碱性磷酸酶染色结果图。成年HDF(HDFa-Slc7a1)通过用慢病毒感染来表达小鼠逆转录病毒受体(Slc7a1)而得到，使用逆转录病毒载体导入左栏所示基因。“-”显示导入四种基因“Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc”的HDFa-Slc7a1细胞的染色结果。右数第一栏和第二栏的照片显示用相差显微镜观察的基因导入后10天时的碱性磷酸酶染色结果。

图2：诱导自新生儿阳茎外鞘(BJ)的iPS细胞的碱性磷酸酶染色结果图。BJ(BJ-Slc7a1)通过用慢病毒感染来表达小鼠逆转录病毒受体(Slc7a1)而得到，使用逆转录病毒载体导入左栏所示基因。右数第二栏的照片显示用相差显微镜观察的基因导入后10天时的碱性磷酸酶染色结果。

图3：ABCG-2、SSEA-3和SSEA-4在诱导自成年HDF(克隆iPS-HDFaSlc-87E6)的iPS细胞中表达的免疫染色分析结果图，并将仅用第二抗体(小鼠IgG或大鼠IgM)染色的结果作为阴性对照。照片显示相差图像和通过罗丹明滤光片的相差图像(分别为物镜×10)。

图4：ABCG-2、E-钙粘蛋白、SSEA-3和SSEA-4在源于成年HDF(克隆iPS-HDFaSlc-87E3、4和12)和表达小鼠Slc7a1基因的成年HDF(HDFa)的iPS细胞中的表达的免疫染色结果图。照片显示相差图像和通过罗丹明滤光片的相差图像(分别为物镜×10)。

图5：针对在基于分离自源于成年HDF(克隆iPS-HDFaSlc-87E1-8、11和12)、NTERA2克隆D1人胚胎癌细胞(NTERA2)和表达小鼠Slc7a基因的成年HDF(HDF)的iPS细胞的RNA得到的cDNA中的OCT4、Sox2、Nanog、REX1、FGF4、GDF3、DPPA4、DPPA2、ESG1、hTERT和G3PDH的各区域的PCR扩增的结果图。

图6：针对在基于分离自源于BJ(克隆iPS-BJSlc-97G3、G5、H3、H5、E1-10、E11和E12)、NTERA2克隆D1人胚胎癌细胞(NTERA2)和表达小鼠Slc7a1基因的BJ(BJ-Slc7a1)的iPS细胞的RNA得到的cDNA中的OCT4、Sox2、Nanog、REX1、FGF4、GDF3、ECAT15-1、ECAT15-2、ESG1、hTERT和G3的各区域的PCR扩增的结果图。

图7：皮下注射克隆iPS-HDFaSlc-87E12和分离自小鼠(A)的肿瘤五周后的所述小鼠(A)照片，及分离自分别皮下注射克隆iPS-HDFaSlc-87E3(B)、克隆iPS-HDFaSlc-87E6(C)和克隆iPS-HDFaSlc-87E12(D)的小鼠的畸胎瘤衍生组织的苏木精-伊红染色结果图。

图8：人iPS细胞的体外分化的免疫染色图。在包被HEMA的平板上培养人iPS样细胞7天，并在包被明胶的皿上再培养7天，然后回收细胞，并用固定溶液(含10％甲醛的PBS)固定。将所述细胞与作为第一抗体的抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(a-平滑肌肌动蛋白)、抗βIII-微管蛋白抗体(bIII-微管蛋白)和抗α-胎蛋白抗体(α-胎蛋白)反应，并用第二抗体免疫染色。

图9：将逆转录病毒基因导入人HDF的效率提高结果图。将含有GFPcDNA的亲嗜性(Eco)或兼嗜性(Ampho)逆转录病毒导入HDF或表达小鼠Slc7a1基因的HDF(HDF-Slc7a1)。图9上部的照片显示用荧光显微镜观察的结果(图中比例尺显示100μm)，图9下部的图像显示流式细胞术的结果。

图10：由成年HDF诱导iPS细胞的结果图。A显示iPS细胞产生的时序。分别为：B显示HDF的细胞形态图，C显示非ES细胞样集落的典型图，D显示人ES细胞样集落的典型图，E显示建立的第六代iPS细胞系(克隆201B7)的细胞形态，F显示iPS细胞的高倍放大图，及G显示在人iPS细胞集落中心部分处同时分化的细胞图。H-N显示分别针对SSEA-1(H)、SSEA-3(I)、SSEA-4(J)、TRA-1-60(K)、TRA-1-81(L)、TRA-2-49/6E(M)和Nanog(N)免疫细胞化学分析结果。核用Hoechst33342染色(蓝色)。各图中比例尺显示200μm(B-E、G)、20μm(F)和100μm(H-N)。

图11：显示人iPS细胞对饲养细胞的依赖性。A显示接种于包被明胶的平板上的iPS细胞图。B显示培养于包被基质胶的平板上的MEF条件培养基(MEF-CCM)中的iPS细胞图。C显示培养于包被基质胶的平板上的人ES的非条件培养基中的iPS细胞。

图12：用于在人iPS细胞中表达人ES细胞标记基因的ES细胞标记基因的RT-PCR分析结果图。分离了RNA的细胞是iPS细胞克隆201B、ES细胞、NTERA2克隆D1人胚胎癌细胞(NTERA2)和表达小鼠Slc7a1基因的成年HDF(HDF)。

图13：显示用于在人iPS细胞中表达人ES细胞标记基因的ES细胞标记基因(A)的蛋白印记分析图和逆转录病毒基因(B)表达的定量PCR结果。B显示三个独立实验的平均值，条段显示标准偏差。

图14：用于在人iPS细胞中表达人ES细胞标记基因的Oct3/4、REX1和Nanog(A)的启动子区域的亚硫酸氢盐基因组测序的结果图和荧光素酶测定结果(B)。A中，开环和闭环表示未甲基化和甲基化的CpG。B显示4个测定的结果的平均值，条段表示平均偏差。

图15：高水平的端粒酶活性和人iPS细胞的指数增殖。A显示用TRAP法检测端粒酶活性的结果图。将热灭活(+)样品用作阴性对照(IC是内部参数)。B显示iPS细胞的增殖曲线及四次平行实验的平均值和标准偏差。

图16：人iPS细胞的基因分析结果图。A是显示所有四种逆转录病毒整合入所有克隆的染色体中的基因组PCR的结果。B显示使用c-MyccDNA探针的DNA印记分析结果。图中星号显示内原性c-Myc等位基因(2.7kb)，且箭标显示源自SNL饲养细胞的小鼠c-Myc等位基因(9.8kb)。

图17：人iPS细胞的胚状体介导的分化。A显示第8天iPS细胞的漂浮培养图。B-E分别显示第16天(B)、神经元样细胞(C)、上皮细胞(D)和鹅卵石样细胞(E)。F-K分别显示α-胎蛋白(F)、波形蛋白(G)、α-平滑肌肌动蛋白(H)、结蛋白(I)、βIII-微管蛋白(J)和GFAP(K)的免疫细胞化学结果。图中比例尺显示200μm(A、B)和100μm(C-K)。在F-K中，核用Hoechst33342染色(蓝色)。L显示针对三个胚层的多种分化标记的RT-PCR分析结果。

图18：人iPS细胞的定向分化图。A在PA6细胞中培养18天后分化的iPS细胞的相差图。B显示用βIII-微管蛋白(红色)和酪氨酸羟化酶(绿色)抗体对A中所示细胞进行的免疫细胞化学结果。核用Hoechst33342染色(蓝色)。C代表多巴胺能神经元标记物的RT-PCR分析结果。D是分化成心肌细胞的iPS细胞的相差图。E显示心肌细胞标记物的RT-PCR分析结果。图中A、B和D中的比例尺显示200μm(A、D)和100μm(B)。

图19：显示源自人iPS细胞的畸胎瘤。显示了源自iPS细胞(使用了克隆201B7)的畸胎瘤的苏木精和伊红染色图。

图20：源自成年成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS，克隆243H1)和新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ，克隆246G1)的人iPS细胞的相差图。各图中比例尺显示200μm。

图21：显示ES细胞标记基因在源自HFLS和BJ的iPS细胞中的表达。

图22：源自HFLS和BJ的iPS细胞的胚状体介导的分化的细胞图。用免疫染色证实α-平滑肌肌动蛋白、βIII-微管蛋白和α-胎蛋白的表达。

图23：家族基因和省略c-Myc对由Nanog-reporter MEF小鼠产生iPS细胞的影响。A显示使用家族基因通过Nanog筛选从MEF产生iPS细胞的结果图。A的图像GFP-阳性集落数。“4因子”显示Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合。B显示嘌呤霉素筛选时间对iPS细胞产生的影响和转导四种基因或三种基因(无c-Myc)后28天时观察到的GFP-阳性集落。C显示嘌呤霉素筛选时间GFP-阳性集落/所有集落的百分比。

图24：源自iPS细胞的畸胎瘤的组织学图，用家族蛋白(Myc、Klf和Sox)由Fbx15-报告小鼠衍生MEF诱导所述细胞。

图25：显示通过用逆转录病毒将三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)导入Nanog-报告小鼠衍生MEF而产生的iPS细胞的特征图。RT-PCR结果显示ES细胞标记基因的表达水平，并显示了四种基因。通过使用特异性引物组，针对四种基因区分总转录本、来自内源基因的转录本(endo)和来自逆转录病毒的转录本(Tg)。

图26：显示对通过用逆转录病毒将三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)导入Fbx15-报告小鼠衍生MEF而产生的iPS细胞的诱导结果，及表达诱导性GFP的结果。A显示通过导入三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)产生的iPS细胞的形态。图中的比例尺显示500μm。B显示对通过导入三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)而产生的ES、MEF和iPS细胞中的ES细胞标记基因的RT-PCR分析结果。

图27：显示源自通过导入三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)而产生的iPS细胞(克隆142B-6和142B-12)的嵌合体小鼠。

图28：显示在非药物筛选下有效分离iPS细胞的结果图。A是诱导自源于含有Nanog-GFP-IRES-Puro^r报告子的成年小鼠TTF的iPS细胞的形态图。用四种基因(无c-Myc)或三种基因(无c-Myc)及DsRed转导细胞，然后在非药物筛选下培养30天。通过荧光显微镜检查Nanog报告子(Nanog-GFP)和DsRed逆转录病毒(Tg-DsRed)的表达。比例尺表示500μm。B显示诱导自源于成年小鼠(含有由具有组成型活性的启动子驱动的DsRed转基因(ACTB、β-肌动蛋白基因)，但缺少Nanog-或Fbx15-筛选盒)的TTF的的iPS细胞的形态图。用四种基因(无c-Myc)或三种基因(无c-Myc)及GFP转导细胞，然后在非药物筛选下培养30天。通过荧光显微镜检查GFP逆转录病毒(Tg-GFP)的表达。比例尺表示500μm。C显示对在非药物筛选下产生自TTF的ES细胞和iPS细胞中的ES标记基因的RT-PCR分析结果。D是源于iPS细胞的嵌合体小鼠的图，在非药物筛选下或不用c-Myc逆转录病毒由成年TTF产生所述iPS细胞。

图29：显示对通过导入三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)而产生的iPS细胞的诱导的结果图。A是经建立的人iPS细胞(克隆253G和246H)表现出人ES细胞样形态的图。B显示ES细胞标记基因在源于使用通过导入三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)而产生的iPS细胞(253G)或通过导入四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc，包括c-Myc)而产生的iPS细胞(253F)建立的HDF的人iPS细胞中的表达结果。

图30：从通过将三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4，无c-Myc)导入成年成纤维细胞(HDL；253G)和新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ；246G)而产生的人iPS细胞的胚状体介导的分化的诱导。通过免疫染色检查α-平滑肌肌动蛋白、βIII-微管蛋白和α-胎蛋白的表达。

图31：显示集落数的图像，在将六种基因(Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)或四种基因的两种不同组合(显示于Y4F的Klf4、c-Myc、Oct3/4和Sox2；和显示于T4F的Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)导入293FT细胞中后进行技术。“ES样”表示形态上像ES细胞集落的集落数，且“总”表示ES样集落和非ES样集落的总数。Exp#1、Exp#2、Exp#3和Exp#4显示独立实验的结果。纵坐标表示集落数。

图32：用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行实验的结果。A表示实验时序。将得自Nanog GFP^tg/- Fbx15^-/-小鼠的1.0×10⁵MEF细胞接种于包被明胶的6孔平板上。次日，用逆转录病毒将四种基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和Sall4；OSKA)或三种基因(Oct3/4、Klf4和Sox2；OSK)导入MEF。在感染后4天时将所述细胞以1∶2或1∶6的比例接种于覆盖经丝裂霉素C处理的STO细胞的6孔平板上。在感染后14天或21天时候开始药物筛选。28天时对GFP阳性细胞进行计数，并用碱性磷酸酶(AP)和结晶紫(CV)进行染色。B表示三个独立实验(#1、2和3)中GFP阳性集落总数。C表示三个独立实验(#1、2和3)中GFP阳性集落的百分比。

图33：显示使用人成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)进行实验的结果。将表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的1.0×10⁵成年HDF细胞接种于6孔平板上。次日，用逆转录病毒载体将图中所示多种基因的组合导入细胞。感染后6天时，将细胞数调至5.0×10⁵，并将细胞再次接种于覆盖1.5×10⁶经丝裂霉素C处理的STO细胞的100mm平板上。7天后，用补充有4ng/ml bFGF的灵长类ES细胞培养基替换所述培养基。图显示感染后30天时的集落数。

图34：显示通过用逆转录病毒载体将源于人的四种基因(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三种基因(Y3F:Oct3/4、Sox2和Klf4)和小鼠Sall4(mSall4)或小鼠Sall1(mSall1)或二者导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDF)中而进行感染后32天(左侧柱)和40天(右侧柱)时计数的集落数。“+模拟物”表示用经无Y3F或Y4F的空载体代替的逆转录病毒感染的组，“+mSall4”表示导入Sall4及Y3F或Y4F的组，“+mSall1”表示导入mSall1及Y3F或Y4F的组，而“+mSall4+mSall1”表示导入mSall4和mSall1二者及Y3F或Y4F的组。纵坐标表示在10cm陪替皿确认的人iPS细胞的集落数。重复所述实验，每次实验的图像顶部显示了总集落数。

图35：显示通过用逆转录病毒载体将源于人的四种基因(T4F:Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)或三种基因(T3F:Oct3/4、Sox2和Nanog)和小鼠Sall4(mSall4)或小鼠Sall1(mSall1)或二者导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDF)中而进行感染后32天(左侧柱)和40天(右侧柱)时计数的集落数。“+模拟物”表示用是无T3F或T4F的空载体的逆转录病毒感染的组，“+mSall4”表示导入mSall4及T3F或T4F的组，“+mSall1”表示导入mSall1及T3F或T4F的组，而“+mSall4+mSall1”表示导入mSall4和mSall1二者及T3F或T4F的组。纵坐标表示在10cm陪替皿上计数的人iPS细胞的集落数。重复所述实验，图中柱顶部显示了每次实验的总集落数。

图36：显示通过用逆转录病毒载体将源于人的四种基因(Y4F)或三种基因(Y3F)和人Sall4(hSall4)导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDF)中而进行感染后32天(左侧柱)和40天(右侧柱)时计数的集落数。“+模拟物”表示用是无Y3F或Y4F的空载体的逆转录病毒感染的组，且“+hSall4”表示导入hSall4及Y3F或Y4F的组。纵坐标表示在10cm陪替皿上计数的人iPS细胞的集落数。重复所述实验，图中柱顶部显示了每次实验的总集落数。

图37：对通过用慢病毒载体将Oct3/4、Klf4和Sox2和c-Myc、L-Myc或N-Myc基因中的共四种基因或三种基因导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDFa-Slc7a1)中而产生的人iPS细胞的集落数进行计数的结果图。每个图像的值表示iPS细胞集落数与总集落数的比率。

图38：通过用α-平滑肌肌动蛋白、α-胎蛋白和βIII-微管蛋白抗体进行免疫染色证实的通过用慢病毒载体将四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc)导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDFa-Slc7a1)中而产生的人iPS细胞(32R2、32R6)具有分化成三种胚层细胞系的能力的结果图。

图39：通过注射通过将四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc)导入SCID小鼠睾丸而产生的人iPS细胞(32R6)而得到的畸胎瘤的组织学染色图(苏木精-伊红染色)。上排图从左到右依次显示神经组织、肠道样组织和软骨组织的组织学图。下排图从左到右依次显示毛组织、脂肪组织和色素组织的组织学图。

图40：显示通过用逆转录病毒载体将三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)导入Nanog报告子小鼠衍生MEF(MEF-Ng)而得到的GFP-阳性集落(iPS-MEF-Ng-443-3)形态的照片。上排图是GFP阳性集落图，下排图是相差图。

图41：显示源于图40中所示GFP阳性集落(iPS-MEF-Ng-443-3)的克隆的RT-PCR和基因组PCR结果的照片。图中“总”显示内原基因和源于逆转录病毒的基因的表达，“Tg”显示源于逆转录病毒的基因的表达，而“基因组”显示对源于逆转录病毒的基因的存在情况的检测结果图，通过使用针对所述源于逆转录病毒的基因的特异性引物将所述基因整合入基因组DNA。照片右侧的数字表示PCR循环数。图中“RF8”表示作为对照的ES细胞，“20D17”表示通过将四种基因(Oct3/4、Klf4、L-Myc和Sox2)导入MEF-Ng而得到的iPS细胞(Nanog-iPS；Nature，448，pp.313-317，2007)，而“142E-9”表示通过将四种基因(Oct3/4、Klf4、L-Myc和Sox2)导入MEF-Fbx而得到的iPS细胞(Fbx-iPS)，及显示了对这些细胞进行的相同实验的结果。图中“质粒”显示使用含有各基因(pMXs-Sox2、pMXs-Oct3/4、pMXs-Klf4、pMXs-c-Myc和pMXs-L-Myc)的质粒的结果。

图42：显示通过抗α-平滑肌肌动蛋白抗体、抗α-胎蛋白抗体和抗βIII-微管蛋白抗体进行染色确认的通过将三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)小鼠iPS细胞(443-3-3、443-3-6、443-3-12和443-3-13)具有分化成三种胚层细胞系的能力的结果的照片。RF8是作为对照的小鼠ES细胞。

图43：通过皮下注射通过导入三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)产生的小鼠iPS细胞(443-3-3、443-3-6、443-3-12和443-3-13)得到的畸胎瘤的组织学染色图(苏木精-伊红染色)。自上而下依次为神经组织、肠道样组织、肌肉组织、上皮组织和软骨组织的组织学图。

图44：显示通过用慢病毒载体将c-Myc、L-Myc和/或Lin28基因及三种基因(Oct3/4、Klf4和Sox2)导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDFa-Slc7a1)中而产生的人iPS细胞的集落数进行计数的结果图像。黑色柱表示总集落数，白色柱表示iPS细胞集落数。

图45：多种Myc嵌合基因和突变基因的结构示意图。Ms-c-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：153和154，Ms-L-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：155和156，Ms-cL-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：157和158，Ms-Lc-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ IDNo：159和160，Ms-cLc-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：161和162，Ms-LcL-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：163和164，Ms-ccL-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：165和166，Ms-cLL-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：167和168，Ms-LLc-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：169和170，Ms-Lcc-Myc的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：171和172，c-MycW135E的核苷酸序列和氨基酸序列显示于SEQ ID No：173和174，c-MycV394D的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ IDNo：175和176，c-MycL420P的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：177和178，L-MycW96E的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：179和180，L-MycV325D的核苷酸序列和氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID No：181和182，L-MycL351P的核苷酸序列和氨基酸序列显示于SEQ ID No：183和184。

图46：对通过用慢病毒载体将多种Myc嵌合基因和突变基因导入表达小鼠逆转录病毒受体slc7a的人成年皮肤衍生成纤维细胞(HDFa-Slc7a1)中而建立的人iPS细胞的集落数进行计数的结果图。自上而下分别为iPS细胞集落数、总集落数和iPS细胞集落数与总集落数的比率(％)。

具体实施方式

[0026]本发明的方法第一方面提供由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因导入体细胞的步骤，且所述方法的优选方面包括将下列三种基因——Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因导入体细胞后，培养所述细胞足够长的时间，从而使所述细胞获得多能性并增殖的步骤。

[0027]对于Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因而言，所述家族基因的例子见于国际公开WO2007/69666。作为Oct家族基因，优选Oct3/4；作为Klf家族基因，优选Klf4；且作为Sox家族基因，优选Sox2。对于这些基因而言，除野生型基因外，也可使用突变基因(其中一些(例如1-30个，优选1-20个，更优选1-10个，再优选1-5个，且特别优选1或2个)核苷酸被取代、插入和/或删除)和嵌合基因(通过适当组合所述家族基因而得到，与其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。

[0028]本发明的方法第二方面提供由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合或下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合，及选自下列三种基因——L-Myc、Sall1和Sall4中的至少一种基因导入体细胞的步骤。不受任何特定理论束缚，选自L-Myc、Sall1和Sall4的基因是具有增强核重编程效率的活性的核重编程因子，且通过使用对于核重编程重要的核重编程因子组合(例如Oct家族基因和Sox家族基因的组合或Oct家族基因和Klf家族基因的组合)，可显著提高重编程效率。

[0029]如更具体描述，所述方法包括：

(a)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及L-Myc导入体细胞的步骤。

(b)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及Sall1导入体细胞的步骤。

(c)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及Sall4导入体细胞的步骤。

(d)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及L-Myc和Sall1导入体细胞的步骤。

(e)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及L-Myc和Sall4导入体细胞的步骤。

(f)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及Sall1和Sall4导入体细胞的步骤。

(g)将下列两种基因——Oct家族基因和Sox家族基因的组合及L-Myc、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤。

[0030]

(h)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及L-Myc导入体细胞的步骤。

(i)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及Sall1导入体细胞的步骤。

(j)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及Sall4导入体细胞的步骤。

(k)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及L-Myc和Sall1导入体细胞的步骤。

(l)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及L-Myc和Sall4导入体细胞的步骤。

(m)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及Sall1和Sall4导入体细胞的步骤。

(o)将下列两种基因——Oct家族基因和Klf家族基因的组合及L-Myc、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤。

[0031]此外，在(a)-(g)中任意方面，还可包括将Klf家族基因导入体细胞的步骤。此外，在(a)-(o)中任意方面，或在将Klf家族基因加入(a)-(g)中任意方面的方面，还包括将Lin家族基因和/或Nanog，优选Lin28和/或Nanog，更优选Lin28导入体细胞的步骤。如果需要，还可包括将c-Myc导入体细胞的步骤。

[0032]作为Oct家族基因，优选Oct3/4；作为Sox家族基因，优选Sox2；且作为Klf家族基因，优选Klf4。此外，作为Lin家族基因，已知Lin28和Lin28b，且优选Lin28。对于L-Myc的描述见于国际公开WO2007/69666的表1，且对于Sall4的描述见于所述国际公开的表4和表5。Sall1是ES细胞特异表达的基因，且已知为锌指蛋白之一，并被认为参与肾的发育。Sall1的NCBI登录号是NM_021390(小鼠)和NM_002968(人)。此外，Lin28的NCBI登录号是NM_145833(小鼠)和NM_024674(人)。

[0033]对于这些基因而言，除野生型基因外，也可使用突变基因(其中一些(例如1-30个，优选1-20个，更优选1-10个，再优选1-5个，且特别优选1或2个)核苷酸被取代、插入和/或删除)和嵌合基因(通过任意组合家族基因而得到，与其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。

[0034]例如，作为L-Myc或c-Myc，也可使用突变基因(其中一些(例如1-30个，优选1-20个，更优选1-10个，再优选1-5个，且特别优选1或2个)核苷酸被取代、插入和/或删除)和嵌合Myc基因(与其野生型基因功能相似，或具有功能提升)。对于Myc基因而言，用于具体分析多种Myc嵌合基因和Myc点突变基因功能的手段和结果。因此，通过使用这些分析手段，可容易选择并使用具有所期望的功能提升的突变c-Myc基因、突变L-Myc基因或嵌合Myc基因。所述嵌合Myc基因的优选例包括Ms-cL-Myc(SEQ ID Nos：157和158)和Ms-cLc-Mys(SEQ IDNo s：161和162)，更优选为Ms-cL-Myc。

[0035]所述方法优选方面的例子包括以下方法，在上述方法中包括：

(a-1)将Oct3/4、Sox2和L-Myc导入体细胞的步骤；

(a-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc导入体细胞的步骤；

(b-1)将Oct3/4、Sox2和Sall1导入体细胞的步骤；

(b-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4和Sall1导入体细胞的步骤；

(c-1)将Oct3/4、Sox2和Sall4导入体细胞的步骤；

(c-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4和Sall4导入体细胞的步骤；

(d-1)将Oct3/4、Sox2、L-Myc和Sall1导入体细胞的步骤；

(d-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Sall1导入体细胞的步骤；

(e-1)将Oct3/4、Sox2、L-Myc和Sall4导入体细胞的步骤；

(e-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Sall4导入体细胞的步骤；

(f-1)将Oct3/4、Sox2、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤；

(f-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤；

(g-1)将Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤；

(g-2)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤；

[0036]

(h-1)将Otc3/4、Klf4和L-Myc导入体细胞的步骤；

(i-1)将Otc3/4、Klf4和Sall1导入体细胞的步骤；

(j-1)将Otc3/4、Klf4和Sall4导入体细胞的步骤；

(k-1)将Otc3/4、Klf4、L-Myc和Sall1导入体细胞的步骤；

(l-1)将Otc3/4、Klf4、L-Myc和Sall4导入体细胞的步骤；

(m-1)将Otc3/4、Klf4、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤；

(o-1)将Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sall1和Sall4导入体细胞的步骤。

[0037]方法还优选在上述步骤中包括：

(a-3)将Oct3/4、Sox2、L-Myc和Lin28导入体细胞的步骤；

(a-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28导入体细胞的步骤；

(b-3)将Oct3/4、Sox2、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(b-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(c-3)将Oct3/4、Sox2、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(c-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(d-3)将Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(d-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(e-3)将Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(e-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(f-3)将Oct3/4、Sox2、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(f-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(g-3)将Oct3/4、Sox2、L-Myc、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(g-4)将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

[0038]

(h-2)将Otc3/4、Klf4、L-Myc和Lin28导入体细胞的步骤；

(i-2)将Otc3/4、Klf4、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(j-2)将Otc3/4、Klf4、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(k-2)将Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sall1和Lin28导入体细胞的步骤；

(l-2)将Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(m-2)将Otc3/4、Klf4、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤；

(o-2)将Otc3/4、Klf4、L-Myc、Sall1、Sall4和Lin28导入体细胞的步骤。

[0039]在上述各方法中，方法包括导入Nanog及Lin28(或无Lin28)的步骤。例如，在(a-4)方面，以使用Nanog及Lin28m的方面(即，包括将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28和Nanog导入体细胞的步骤的方法等)为例。

此外，在上述各方法中，还可包括将L-Myc及N-Myc(或无L-Myc)导入体细胞的步骤。

此外，在上述各方法中，还任选包括将c-Myc导入体细胞的步骤，但为基本上降低或消除分化诱导后得到的细胞或组织中的肿瘤发展，还优选不在上述方法中包括将c-Myc导入体细胞的步骤。

[0040]对于包括方面L-Myc的方面而言，优选将人体细胞用作待进行核重编程的体细胞。此外，如果包括Oct3/4、Sox2和Klf4的组合，或Oct3/4、Sox2、Klf4和L-Myc(或用c-Myc替代L-Myc)的组合，优选还组合了Sall4的情况，或还组合了Sall1和Sall4二者的情况。如果包括Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28的组合，优选还组合了Sall1的情况，或还组合了Sall1和Sall4二者的情况。仍对所述情况而言，优选将人体细胞用作待进行核重编程的体细胞。

[0041]本发明的方法第三方面提供由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，且包括将下列六种基因——Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog导入体细胞的步骤，优选包括将下列六种基因——Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog导入体细胞的步骤。

[0042]上述第一至第三方面提供的本发明的各方法中，“诱导性多能干细胞”是具有类ES细胞特征的细胞，更具体包括具有多能性和增值能力的未分化细胞，且此术语之含义不得受任何局限，需宽泛地理解。对于通过使用核重编程因子产生诱导性多能干细胞的方法的具体描述见于国际公开WO2007/69666、Cell，126，pp.663-676，2006和Cell，131，pp.861-872，2007，且对分离诱导性多能干细胞的方法的具体描述也见于上述期刊。

[0043]待通过本发明的方法进行重编程的“体细胞”指所有细胞，但不局限于所述细胞，无多能性细胞(如ES细胞或其类似细胞)。除胚胎期的体细胞外，也可使用成熟体细胞。优选使用源自哺乳动物(包括人)的体细胞，更优选使用源自小鼠的体细胞和源自灵长类的体细胞。特别优选使用源自人的体细胞。所述体细胞的例子具体包括：(1)组织干细胞(成体干细胞)，例如神经体细胞、造血干细胞、间质干细胞、牙髓干细胞等，(2)组织前体细胞和(3)分化细胞，例如淋巴细胞、上皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃细胞和粘膜细胞。如果将所述诱导性多能干细胞用于治疗疾病，期望使用来自患者自身的体细胞，或分离自具有同型HLA抗原的其他人的细胞，例如，可使用参与疾病的体细胞和参与疾病治疗的体细胞。

[0044]对将上述基因导入体细胞的方法无具体限制，但例如，一般使用可表达上述基因的载体。对于将逆转录病毒载体用作载体的特定方法的公开见于国际公开WO2007/69666、Cell，126，pp.663-676，2006和Cell，131，pp.861-872，2007，对于将慢病毒载体用作载体的情况的公开见于Science，318，pp.1917-1920，2007。此外，因为对于使用质粒(其为非病毒载体)的情况的描述见于Okita等人的文章(Science，Published online：October 9，2008；10.1126/Science.1164270)，本领域技术人员可选择和采用其中合适的方法。如果使用载体，可将选自上述基因中的两种或多种整合入所述载体，且可使用多种整合一种基因的载体。当一种或多种上述基因已在待重编程的细胞中表达时，可将表达了的一种或多种基因从上述待导入基因的组合中移除，但勿庸置疑，此方面亦包括在本发明的范围内。

[0045]当将病毒载体(例如，逆转录病毒载体)用作将所述基因导入体细胞的手段时，优选通过制备含各待导入基因的病毒载体，然后用各病毒载体各自转染包装细胞，并培养，从而产生含各病毒的培养上清液的混合物来独立制备含各病毒的培养上清液，并通过用含所述基因的病毒感染而用于基因导入。通过采用此方法，在一些情况下可显著增强基因导入效率，且特别优选在不用c-Myc进行核重编程的情况下使用此方法。事实上，还可能使用多个病毒载体转染单包装细胞，制备含多个病毒载体的培养上清液，并将其用于基因导入。

[0046]如果将所述基因导入体细胞，可将表达载体导入培养于饲养细胞上的体细胞中，或可将表达载体导入无饲养细胞的体细胞中。未增强表达载体的导入效率，后一种方法适于一些情况。作为所述饲养细胞，可适用用于培养胚胎干细胞的饲养细胞，且例如，可使用经药物(丝裂霉素C)处理或经照射的细胞(如受精后14-15天时的小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养细胞或STO细胞(成纤维细胞衍生细胞系))。基因导入后的体细胞培养优选在饲养细胞上进行。另外，可在基因导入后约几天到30天时用嘌呤霉素进行药物筛选。事实上已知可在非药物筛选下诱导iPS细胞的方法(国际公开WO2007/69666的实施例9)，也优选在非药物筛选下诱导iPS细胞。

[0047]通过在合适条件下培养导入核重编程因子的体细胞，核重编程自动进行，并可由体细胞产生诱导性多能干细胞。将所述基因导入体细胞后，优选将所述细胞培养足够长的时间，从而使所述细胞获得多能性并增殖。当产生人诱导性多能干细胞时，期望将导入表达载体后所述细胞的培养密度设置为低于培养动物细胞时的情况。例如，培养时优选以1-10万，优选约5万/皿的细胞密度继续培养。

[0048]通常可例如通过使用用于动物体细胞的合适的培养基(例如，用于胚胎干细胞(ES细胞)的培养基(例如，当将所述基因导入人体细胞时为用于灵长类ES细胞(优选人ES细胞)的培养基))培养25天或更久而得到所述诱导性多能干细胞。在所述第一方面的方法中，核重编程效率相比在一些情况下使用含c-Myc、L-Myc、N-Myc、Sall1和Sall4中的一种或两种或多种的组合进行核重编程的情况降低，且在许多情况下通常都需长期培养。例如，在此方法中需继续培养优选28天或更久，更优选30天或更久，再优选33天或更久，且特别优选35天或更久。如果将所述基因导入人体细胞，在一些情况下，培养40天或更久，再为培养45天或更久将成为特别合适的培养天数。事实上，根据所述第一方面提供的方法消除了残骸细胞(成为背景)污染，从而可得到纯细胞群的诱导性多能干细胞集落，使得到具有极高质量的基因表达和分化能力的诱导性多能干细胞成为可能。另一方面，在第二方面和第三方面提供的本发明的方法中，由于诱导性多能干细胞的产生效率通常足够高，可在更短培养天数(例如，在一些情况下15-30天，优选约20天)下得到期望数量的诱导性多能干细胞。

[0049]可通过检测(例如)多种未分化细胞的特异性标记物(如碱性磷酸酶(ALP)、SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-钙粘蛋白)而容易测定所述导入了基因的细胞是否获得了多能性。对于所述标记物的种类和测定方法的具体描述见于文献(例如Cell，126，pp.663-676，2006和Cell，131，pp.861-872，2007等)。如果用具有在ES细胞特异表达基因的启动子下游整合有标记基因(如GFP)的基因的体细胞进行核重编程时，可能通过将标记物(GFP)阳性用作指标来鉴定所述诱导性多能干细胞。

此外，通常可通过集落形成测定增殖情况，且已知集落形状(通常为由约500-1,000诱导性多能干细胞组成的细胞群)根据动物种类表现出特征形态，可容易鉴定通过诱导性多能干细胞增殖形成的集落。

[0050]例如，已知小鼠诱导性多能干细胞形成隆起集落，而人诱导性多能干细胞形成扁平集落，且由于这些集落形状与小鼠ES细胞和人ES细胞的形状极其相似，本领域技术人员可通过检测所产生的诱导性多能干细胞集落而确定所述诱导性多能干细胞的增殖程度。已知多种可维持ES细胞的未分化性质和多能性的培养基或不可维持所述性质的培养基，且通过使用合适的培养基组合，可有效分离所述诱导性多能干细胞。本领域技术人员可利用在ES细胞中通常使用的确定方法容易确定所述分离的诱导性多能干细胞的分化和增殖能力。

[0051]在上述方法中，可在任选缺乏或存在细胞因子(优选缺乏细胞因子)的情况下进行基因导入。此外，在上述方法中，可将基因导入后的体细胞在任选缺乏或存在细胞因子的情况下进行培养。细胞因子的例子一般包括(但不限于)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)等，可在存在或缺乏在本领域中被分类为细胞因子的生理活性物质的情况下进行基因导入和/或培养。可将基因导入后的体细胞培养于经修饰为可表达所述细胞因子的饲养细胞上。

[0052]在上述方法中，可使用无所述基因的基因编码的基因产物进行核重编程。如果使用核重编程因子(是基因产物)进行上述方法，可使所述核重编程因子与体细胞在可使所述体细胞和所述诱导性多能干细胞增殖的大气压下接触。可更具体使用例如将所述基因产物加入培养基的方法。可通过诸如微注射融合蛋白或核的方法将这些基因中的一种或两种基因产物导入核，且可通过合适的基因导入方法(例如，使用重组载体的方法)导入其余的一种或两种基因。

[0053]所述基因产物可为所述基因产生的蛋白质本身，或可为所述蛋白质与其他蛋白质或肽的融合基因产物形式。例如，可使用与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白或与肽(如组氨酸标签)的融合基因产物。通过制备和使用与源自HIV病毒的TAT肽的融合蛋白，可促进核重编程因子从质膜到细胞内的吸收，且使得仅通过将融合蛋白加入培养基而诱导重编程成为可能，避免了复杂操作(如基因导入)。因为本领域技术人员已知制备所述融合基因产物的方法，本领域技术人员可根据目的容易设计和制备合适的融合基因产物。

[0054]在上述各方法中，在一些情况下，可通过使低分子化合物与体细胞接触，以代替向体细胞中导入一种或两种或多种所述基因。作为所述低分子化合物，例如，可使用具有促进选自Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin家族基因和Sall1、Sall4和Nanog基因中的一种或多种基因表达的作用的低分子化合物，且本领域技术人员可以各基因的表达量作为指标容易筛选所述低分子化合物。

[0055]在上述方法中，除定义的各基因外，还可组合编码诱导永生细胞的因子的基因。如国际公开WO2007/69666中所公开的一样，可单独使用或适当联合使用例如TERT基因及选自下列基因——SV40大T抗原、HPV16 E6、HPV16 E7和Bmil中的一种或多种基因。除上述基因外，还可组合选自Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1和β-连环蛋白中的一种或多种基因，和/或也可组合选自ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fth117、Rex1、UTF1、Stella、Stat3和Grb2中的一种或多种基因。对这些组合的具体描述见于国际公开WO2007/69666。事实上，可用于本发明的方法中的基因不限于以上具体描述的基因。

[0056]在本发明的方法中，除其他可发挥核重编程因子功能的基因外，还可包括编码参与分化、发育或增殖的因子的基因中的一种或多种基因，或其他具有生理学活性的因子，且勿庸置疑，所述方面也被包括在本发明的范围内。例如，作为确定核重编程因子的手段，可利用筛选核重编程因子的方法(描述见于国际公开WO2005/80598)和指定特异性核重编程因子的方法(描述见于国际公开WO2007/69666)。将国际公开WO2005/80598和国际公开WO2007/69666的全部公开内容通过引用并入本说明书的公开内容中。本领域技术人员可参考这些文献筛选核重编程因子，并应用于本发明的方法中。此外，也可使用所述筛选方法的适当改进或变化方法确定核重编程因子。本领域技术人员可根据所述文献描述的方法容易确定上述方法中使用的基因组合发挥核重编程因子的作用。

[0057]本发明的方法中，为提高产生诱导性多能干细胞的效率，可导入和/或加入多种产生效率提高剂。提高iPS细胞产生效率的物质的例子包括(但不限于)组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂(例如低分子抑制剂(如丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.，26(7)，pp.795-797，2008)、制滴菌素A、乳酸钠、MC 1293和M344)和核酸表达抑制剂(HDAC的siRNAd和shRNA(例如HDAC1 siRNA Smarpool(注册商标，Millipore))、抗HDAC1(OriGene)的HuSH 29聚shRNA构建体等))和G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂(例如低分子抑制剂(如BIX-01294(Cell Stem Cell，2，pp.525-528，2008)等)和核酸系统表达抑制剂(如G9a的siRNA和shRNA(例如G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology))等))。所述核酸系统表达抑制剂可为含编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。

[0058]只要是可用于例如使用ES细胞进行的所有检测/研究及使用ES细胞治疗疾病的细胞，对通过本发明的方法产生的诱导性多能干细胞的用途并无具体限制。例如，用视黄酸、生长因子(如EGF)或糖皮质激素处理通过本发明的方法得到的诱导性多能干细胞，可诱导出所期望的分化细胞(例如，神经细胞、心肌细胞、血细胞等)，即，可形成合适的组织。对分化诱导方法的具体描述见于国际公开WO2007/69666。通过将这些所得分化细胞或组织返回给患者，可实现通过自体细胞移植进行的干细胞疗法。例如，可由患者自身体细胞有效产生具有高度安全性的诱导性多能干细胞，可将通过使这些细胞(例如心肌细胞、胰岛素产生细胞或神经细胞)分化而得到的细胞安全地用于针对多种疾病(心力衰竭、胰岛素依赖性糖尿病、帕金森病和脊髓损伤)的干细胞移植疗法。

[0059]此外，通过本发明的方法由人体细胞产生诱导性多能干细胞后，也可分化诱导这些诱导性多能干细胞，以制备体细胞、组织或器官，还可评估针对所述体细胞、组织或器官的化合物、药物、毒素等的生理学活性或毒性。此外，由患特定疾病的患者体细胞产生诱导性多能干细胞后，也可分化诱导这些诱导性多能干细胞，以制备体细胞、组织或器官，及对所述体细胞、组织或器官起作用的药物候选化合物，以测定治疗性和/或预防性效用，并从而可筛选药物候选化合物。事实上，本发明的诱导性多能干细胞的用途并不局限于上述特定方面。

实施例

[0060]以下实施例将更具体说明本发明，但本发明的范围不受以下实施例的限制。

实施例1：在小鼠ES细胞培养基中由成年HDF建立iPS细胞

用慢病毒载体将Slc7a1(小鼠逆转录病毒受体)基因导入人成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)或人新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ)(分别称为“HDFa-Slc7a1”和“BJ-Slc7a1”)，将HDFa-Slc7a1或BJ-Slc7a1调至800,000，随后接种于饲养细胞(经丝裂霉素处理的STO细胞)上，并将基因通过下列组合导入逆转录病毒载体。

1.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、hTERT、Bmil

2.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、hTERT、HPV16 E6、HPV16 E7

3.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、hTERT、HPV16 E7

4.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、hTERT、SV40大T抗原

5.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、hTERT、HPV16 E6

6.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc

图中“-”表示组合“6.Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc”(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和TERT源自人，而Bmil源自小鼠)。

[0061]在培养小鼠ES细胞的条件下，继续无药物选择地进行培养，在原位细胞中导入组合4的基因，在病毒感染8天后出现被认为是ips细胞的克隆。在其他组合(1-3和5)中，尽管不如组合1的情况清晰，也可出现iPS细胞样集落。甚至当仅导入四种基因(6)时，虽无集落出现，但在上述条件下仅导入了四种基因的细胞清晰表现出碱性磷酸酶染色阳性(图1)。

[0062]相似地，将表达小鼠Slc7a1基因的人新生儿阳茎外鞘成纤维细胞(BJ)调至80,000，随后接种于饲养细胞(经丝裂霉素C处理的STO细胞)上，并将所述基因通过下列组合导入逆转录病毒载体。

1.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、SV40大T抗原

2.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、Bmil

3.hTERT、SV40大T抗原

4.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、HPV16 E6

5.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、HPV16 E7

6.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT、HPV16 E6、HPV16 E7

7.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)、hTERT

8.4s(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc)

9.DsRed

(Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc和TERT源自人，而Bmil源自小鼠)。

当在小鼠ES细胞的培养条件下继续培养2周时，仅导入四种基因的细胞(8)表现出碱性磷酸酶染色阳性(图2)。

[0063]实施例2：iPS细胞中的ECAT表达(1)

研究了由成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)建立的人iPS细胞是否表达ECAT(ES细胞相关转录本，是在ES细胞中特异表达的一组基因)。

将源自成年HDF的iPS细胞(克隆iPS-HDFaSlc-87E6)以5×10⁴/孔的比例接种于饲养细胞(经丝裂霉素C处理的STO细胞，预先将其培养于6孔平板上)上，并培养4天。用含10％甲醛的PBS固定所述细胞，移除固定液，用PBS洗涤，再加入含3％BSA的PBS，然后在室温下静置45分钟。用含3％BSA的PBS以1∶100稀释第一抗体(抗人ABCG-2抗体(小鼠IgG)、抗SSEA-3抗体(rat IgM)和抗SSEA-4抗体(小鼠IgG))，然后使其在4℃下反应过夜，用含1％BSA的PBS洗涤细胞三次，及使用第二抗体(已用含1％BSA的PBS以1∶300稀释)在室温避光条件下与其反应1小时。作为第二抗体，使用经Cy-3标记的抗小鼠IgG抗体(抗ABCG-2和SSEA-4抗体；Chemicon)和抗大鼠IgM抗体(抗SSEA-3抗体；Jackson ImmunoResearch)。用PBS洗涤所述细胞，随后在显微镜下拍照(图3)。结果，观察到源自成年HDF的iPS细胞表达ABCG-2、SSEA-3和SSEA-4。

[0064]实施例3：iPS细胞中的ECAT表达(2)

将源自人成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)的iPS细胞(克隆iPS-HDFaSlc-87E3、87E4和87E12)以5×10⁴/孔的比例接种于饲养细胞(经丝裂霉素C处理的STO细胞，预先将其接种于6孔平板上)上，并培养5天。作为对照，将HDF(源自所述iPS细胞的细胞)接种于6孔平板上，并维持2天。用含10％甲醛的PBS固定所述细胞。移除固定液后，用PBS洗涤所述细胞，向所述细胞加入封闭缓冲液(含3％BSA的PBS)，并使其在室温下静置45分钟。于4℃下与第一抗体(抗人ABCG-2抗体(小鼠IgG；用封闭缓冲液以1∶80稀释)、抗E-钙粘蛋白(小鼠IgG；用封闭缓冲液以1∶80稀释)、抗SSEA-3抗体(rat IgM；用封闭缓冲液以1∶250稀释)和抗SSEA-4抗体(小鼠IgG；用封闭缓冲液以1∶250稀释))反应过夜后，用所述封闭缓冲液洗涤所述细胞。洗涤后，使所述细胞再于室温下与第二抗体反应1小时。作为第二抗体，使用经Cy-3标记的抗小鼠IgG抗体(抗ABCG-2、E-钙粘蛋白和SSEA-4抗体，已用封闭缓冲液以1∶300稀释)和抗大鼠IgM抗体(抗SSEA-3抗体)。与第二抗体反应后，移除抗体溶液，将其用PBS洗涤、向所述细胞加入含50％甘油的PBS，并对其进行观察(图4)。

[0065]源自表达SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-钙粘蛋白(ES细胞的表面标记物)的人成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)的iPS细胞。相反，HDFa(源自iPS细胞的细胞)不表达SSEA-3、SSEA-4、ABCG-2和E-钙粘蛋白中的任一个。

[0066]实施例4：iPS细胞中的ECAT表达(3)

从表达小鼠Slc7a1基因的人iPS细胞克隆(iPS-HDFaSlc87E-1-8、11和12)、NTERA2克隆D1人胚胎癌细胞(第35代)和成年HDF(第6代)分离总RNA。根据产品说明书用寡dT20引物和Rever Tra Ace-α-试剂盒(Toyobo)合成cDNA第一链。用下列引物进行PCR。对于内原性OCT3/4，使用了hOct3/4-S1165和hOct3/4-AS1283；对于内原性Sox2，使用了hSox2-S1430和hSox2-AS1555；对于Nanog，使用了ECAT4-macaca-968S和ECAT4-macaca-1334AS；对于REX1，使用了hRex1-RT-U和hRex1-RT-L；对于FGF4，使用了hFGF4-RT-U和hFGF4-RT-L；对于GDF3，使用了hGDF3-S243和hGDF3-AS850；对于ECAT15-1，使用了hECAT15-S532和hECAT15-AS916；对于ECAT15-2，使用了hECAT15-2-S85和hECAT15-2-AS667；对于ESG1，使用了hpH34-S40和hpH34-AS259；对于hTERT，使用了hTERT-S3556和hTERT-AS3713；及对于G3PDH，使用了G3PDH-F和G3PDH-R(表1；序列表的SEQ ID No：1-22)。

结果，许多人iPS细胞克隆(iPS-HDFaSlc87E-1-8、11和12)表达了ECAT，且特别是87E6克隆表达了多种ECAT(图5)。

[0067]表1

[0068]实施例5：iPS细胞中的ECAT表达(4)

证实了源自人新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ成纤维细胞)的人iPS细胞是否表达ECAT。

从表达小鼠Slc7a1基因的人iPS细胞(iPS-BJSlc-97E-1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、-97G-3、5、-97H-3和5)、NTERA2克隆D1人胚胎癌细胞(第35代)和新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ)(第6代)中分离总RNA。根据产品说明书用寡dT20引物和Rever Tra Ace-α-试剂盒(Toyobo)合成cDNA第一链。用下列引物进行PCR。对于内原性OCT3/4，使用了hOct3/4-S1165和hOct3/4-AS1283；对于内原性Sox2，使用了hSox2-S1430和hSox2-AS1555；对于Nanog，使用了ECAT4-macaca-968S和ECAT4-macaca-1334AS；对于REX1，使用了hRex1-RT-U和hRex1-RT-L；对于FGF4，使用了hFGF4-RT-U和hFGF4-RT-L；对于GDF3，使用了hGDF3-S243和hGDF3-AS850；对于ECAT15-1，使用了hECAT15-S532和hECAT15-AS916；对于ECAT15-2，使用了hECAT15-2-S85和hECAT15-2-AS667；对于ESG1，使用了hpH34-S40和hpH34-AS259；对于hTERT，使用了hTERT-S3556和hTERT-AS3713；及对于G3PDH，使用了G3PDH-F和G3PDH-R(表2；序列表的SEQ ID No：23-44)。

[0069]结果，许多人iPS细胞克隆(iPS-BJSlc-97E-1、2、4、5、6、7、8、10、11、12、-97G-3、5、-97H-3和5)表达ECAT(图6)。

[0070]表2

[0071]实施例6：由iPS细胞形成畸胎瘤

将5.0×10⁶人iPS细胞皮下注射给SCID小鼠(雌性，5周龄)背部。注射后五周时，观察到大肿瘤。切下肿瘤，称重，并拍照。用含10％甲醛的PBS固定所述细胞。将经石蜡包埋的所述肿瘤切成4.5μm切片，并将所得薄切片置于载波片上，风干，随后用苏木精-伊红染色。图7中的A表示皮下注射了iPS-HDFaSlc-87E12克隆的小鼠及其畸胎瘤。图7中的B表示从皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E3的小鼠中切下的畸胎瘤的组织学图，图7C表示从皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E6的小鼠中切下的畸胎瘤的组织学图，图7D表示从皮下注射了克隆iPS-HDFaSlc-87E12的小鼠中切下的畸胎瘤的组织学图。

[0072]实施例7：人iPS细胞的体外分化

通过悬浮培养形成胚状体(EB)，并评估人iPS细胞的体外分化能力。悬浮培养人iPS细胞(iPS-HDFaSlc-127F2、E3)7天，以形成胚状体。然后，将所述胚状体转移到包被明胶的平板上，继续培养8天，然后进行免疫细胞化学分析。所用第一抗体如下。用含3％BSA的PBS以1∶100分别稀释抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(Dako)、抗βIII-微管蛋白抗体(Chemicon)和抗α-胎蛋白抗体(Dako)，正常小鼠IgG(2mg/ml，Chemicon)和正常兔IgG(2mg/ml，Chemicon)，并将这些用作第一抗体。于室温下与第一抗体反应1小时后，用PBS洗涤所述细胞，并与第二抗体反应(用含3％BSA的PBS以1∶300稀释)。此外用DAPI对核进行染色。结果，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，中胚层标记物)、βIII-微管蛋白(外胚层标记物)和α-胎蛋白(内胚层标记物)表现出阳性，因此证实，人iPS细胞通过形成胚状体进行体外分化(图8)。

[0073]实施例8：优化用逆转录病毒进行的基因导入过程(用于产生人iPS细胞)

认为具有高效基因导入能力的逆转录病毒可有效从小鼠成纤维细胞诱导出iPS细胞(Takahashi et al.，Cell，126，pp.663-676，2006)。所以优化了人成年皮肤衍生成纤维细胞(成年HDF)的基因导入方法。首先，使用在PLAT-A包装细胞中制备的兼嗜性逆转录病毒将绿色荧光蛋白(GFP)导入成年HDF。作为对照，使用在PLAT-E包装细胞中制备的亲嗜性逆转录病毒(Morita et al.，Gene Ther.，7，pp.1063-1066，2000)将GFP导入小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中。在MEF中，80％或更多的细胞表达GFP(图9)。另一方面，少于20％的成年HDF的GFP表达强度明显低于MEF的情况，且GFP表达率少于20％。

[0074]为提高基因导入效率，用慢病毒将小鼠逆转录病毒的受体Slc7a1(Verrey et al.，Pflugers Arch.，447，pp.532-542，2004)(也被称为mCAT1)导入成年HDF中。随后用亲嗜性逆转录病毒将GFP导入HDFa-Slc7a1中。通过此法，可达60％的基因导入效率(图9)。

[0075]实施例9：使用灵长类ES细胞培养基由成年HDF制备iPS细胞

图10A中显示了诱导人iPS细胞的概要流程。用逆转录病毒载体将人Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc导入HDF-Slc7a1中(图10B，8×10⁵细胞/100mm皿)。

基因导入后6天时，通过胰蛋白酶处理收集所述细胞，调至5×10⁴或5×10⁵细胞/100mm皿，然后接种于经丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞(McMahon et al.，Cell，62，pp.1073-85，1990)上。次日，使用补充有4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的用于灵长类ES细胞的灵长类ES细胞培养基(Reprocell Inc.)替换培养基(含10％FBS的DMEM)。约两周后，形成几个粒状集落(granuled colonies)，其细胞形态不类似于人ES细胞(图10C)。约25天时，观察到另一种类型的类似于人ES细胞集落的扁平集落(图10D)。从5×10⁴成纤维细胞，可观察到约10个人ES细胞样集落和约100个粒状集落(在六个独立实验中观察到7/122、8/84、8/171、5/73、6/122和11/213。结果汇于表3)。

[0076]表3

[0077]30天时，挑选人ES细胞样集落，并机械解聚成小团块(不用酶消化)。当始于5×10⁵成纤维细胞时，皿几乎被多于300个粒状集落覆盖。在一些情况中，可在粒状集落之间观察到几个人ES细胞样集落，但因为所述粒状集落密度高，难以分离人ES细胞样集落。

[0078]当人iPS细胞在含bFGF的灵长类ES细胞样培养基中于SNL饲养细胞上增殖时，所述形成扁平集落的细胞密集(图10E)。每个细胞都显示出与人ES细胞相同的细胞形态，特征在于较大的核和较小的胞质(图10F)。如在人ES细胞的情况一样，在一些情况下，观察到集落中心发生同时分化(图10G)。此外，如在人ES细胞中观察到的一样，这些细胞表现出饲养细胞依赖性，且不粘附于包被明胶的组织培养板上。另一方面，这些细胞在MEF条件灵长类ES细胞培养基(MEF-CM)中于包被基质胶的平板上保持未分化状态，但在非条件灵长类ES细胞培养基中不保持未分化状态(图11)。建立的人iPS细胞克隆汇于表4。

[0079]表4

IC：免疫细胞化学，EB：胚状体

[0080]实施例10：由人iPS细胞的人ES细胞标记物的表达

通过免疫染色分析发现，人iPS细胞表现出表达人ES细胞特异性表面抗原(Adewumi et al.，Nat.Biotechnol.，25，pp.803-816，2007)，包括：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81和TRA-2-49/6E(碱性磷酸酶)及Nanog蛋白(图10的I-N)。

[0081]RT-PCR显示，人iPS细胞以等于或高于人胚胎癌细胞系NTERA-2的情况的水平的水平表达许多未分化ES细胞的基因标记物(例如Oct3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和(hTERT)等)(图12)。从蛋白印记的结果得出，Oct3/4、Sox2、Nanog、Sall4、E-钙粘蛋白和hTERT的蛋白水平等于人iPS细胞和人ES细胞(图13A)。在人iPS细胞中由整合到染色体中的逆转录病毒导入的基因的表达被有效沉默，提示所述水平依赖于这些基因的内原性表达(图13B)。

[0082]实施例11：人iPS细胞中ES细胞特异基因启动子的活性。

通过亚硫酸氢盐基因组测序法，测定了多能性相关基因——Oct3/4、REX1和Nanog的启动子区域的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的甲基化状态，结果发现，在原来的亲本HDF(HDF)的所述区域的CpG二核苷酸高度甲基化，而其在人iPS细胞中高度去甲基化(201B2，201B6，201B7)(图14A)。此发现提示，这些启动子在人iPS细胞中活化。

[0083]荧光素酶报告测定实验也显示，人Oct3/4和REX1启动子在人iPS细胞中具有高水平的转录活性，但在HDF中则不这样。广泛表达的基因(如人RNA聚合酶II(PolII))的启动子活性在人iPS细胞和HDF二者中表现出的活性相当(图14B)。

[0084]实施例12：人iPS细胞的高端粒酶活性和指数增殖

hTERT的高表达水平提示，人iPS细胞表现出高端粒酶活性(图15A)。人iPS细胞指数增殖至少4个月(图15B)。计算出人iPS细胞的倍增时间是46.9±12.4(克隆201B2)、47.8±6.6(201B6)和43.2±11.5(201B7)小时(图15B)。这些时间与已报导的人ES细胞的倍增时间相当(Cowanet al.，N.Engl.J.Med.，350，pp.1353-56，2004)。

[0085]实施例13：对源自HDF的人iPS细胞中的交叉污染的测定

对人iPS细胞的基因组DNA的PCR显示，所有克隆均整合有所有四种逆转录病毒(图16A)。用c-Myc cDNA探针进行DNA印记分析发现，每个克隆都有特异性的逆转录病毒整合位点模式(图16B)。此外，人iPS克隆和亲本HDF之间的16个短串联重复模式完全相同。对源自HDF的iPS细胞的STR分析结果汇于表5。

[0086]表5

座位/克隆	201B1	201B2	201B3	201B6	201B7	NTERA-2	HDF
座位/克隆	201B1	201B2	201B3	201B6	201B7	NTERA-2	HDF	D3S1358	15 17	15 17	15 17	15 17	15 17	15	15 17
TH01	5	5	5	5	5	9	5	D3S1358	15 17	15 17	15 17	15 17	15 17	15	15 17
TH01	5	5	5	5	5	9	5	D21S11	28	28	28	28	28	29 30	28
D18S51	14	14	14	14	14	13	14	D21S11	28	28	28	28	28	29 30	28
D18S51	14	14	14	14	14	13	14	Penta_E	7 19	7 19	7 19	7 19	7 19	5 14	7 19
D5S818	11	11	11	11	11	8 11	11	Penta_E	7 19	7 19	7 19	7 19	7 19	5 14	7 19
D5S818	11	11	11	11	11	8 11	11	D13S317	10 14	10 14	10 14	10 14	10 14	14	10 14
D7S820	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10	12	9 10	D13S317	10 14	10 14	10 14	10 14	10 14	14	10 14
D7S820	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10	12	9 10	D16S539	11 13	11 13	11 13	11 13	11 13	11 16	11 13
CSF1PO	10	10	10	10	10	9 11	10	D16S539	11 13	11 13	11 13	11 13	11 13	11 16	11 13
CSF1PO	10	10	10	10	10	9 11	10	Penta_D	8 10	8 10	8 10	8 10	8 10	11 12	8 10
AMEL	X	X	X	X	X	X Y	X	Penta_D	8 10	8 10	8 10	8 10	8 10	11 12	8 10
AMEL	X	X	X	X	X	X Y	X	vWA	15 18	15 18	15 18	15 18	15 18	19	15 18
D8S1179	8 10	8 10	8 10	8 10	8 10	13 15	8 10	vWA	15 18	15 18	15 18	15 18	15 18	19	15 18
D8S1179	8 10	8 10	8 10	8 10	8 10	13 15	8 10	TPOX	8 9	8 9	89	8 9	89	8 9	8 9
FGA	20 22	20 22	20 22	20 22	20 22	23	20 22	TPOX	8 9	8 9	89	8 9	89	8 9	8 9

[0087]这些模式与美国卫生研究所网站(http://stemcells.nih.gov/research/scunit/genotyping.htm)上报导的建立的人ES细胞系的模式不同。此外，通过染色体G水平带分析显示，人iPS细胞具有正常的46XX核型。因此结论是，人iPS克隆源自HDF，而非由ES细胞污染所致。

[0088]实施例14：通过人iPS细胞的胚状体分化

为测定人iPS细胞的体外分化能力，用悬浮培养形成胚状体(EB)。悬浮培养8天后，iPS细胞形成球状结构(图17A)。将这些胚状体样结构转移到包被明胶的平板上，并再继续培养8天。贴壁细胞显示出多种细胞形态，如神经样细胞、鹅卵石样细胞核上皮细胞(图17B-E)。通过免疫细胞化学分析，检测了呈βIII-微管蛋白(外胚层标记物)、胶质纤维脂蛋白(GFAP，外胚层)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，中胚层)、结蛋白(中胚层)、α-胎蛋白(内胚层)和波形蛋白(体壁的中胚层核内胚层)阳性的细胞(图17F-K)。RT-PCR结果证实，在这些分化细胞中表达FOXA2(内胚层标记物)、AFP(内胚层)、细胞角蛋白8和18(内胚层)、SOX17(内胚层)、BRACHYURY(中胚层)、MSX1(中胚层)、MAP2(外胚层)和PAX6(外胚层)(图17L)。另一方面，Oct3/4、Sox2和Nanog的表达明显降低。这些结果显示，iPS细胞可体外分化成三种胚层的细胞。

[0089]实施例15：人iPS细胞分化成神经细胞

测定了是否可用已报导用于人ES细胞的方法由人iPS细胞进行诱导。将人iPS细胞接种于PA6饲养细胞层上，并维持/培养2周(Kawasakiet al.，Neuron，28，pp.31-40，2000)。大量扩增所述细胞，并观察到一些神经结构(图18A)。通过免疫细胞化学分析，检测了培养中的酪氨酸羟化酶和βIII-微管蛋白阳性细胞(图18B)。PCR分析结果证实，有多巴胺能神经标记物(AADC、ChAT、DAT和LMX1B，及MAP2(其他神经标记物))表达(图18C)。此外，Oct3/4、Sox2和Nanog的表达降低(图18C)。这些结果显示，通过与PA6细胞共培养，iPS细胞可分化成含多巴胺能神经元的神经细胞。

[0090]实施例16：人iPS细胞直接分化成心脏细胞

根据使用激活素A和骨形态发生因子(BMP)4分化成心脏细胞的参考文献(Laflamme et al.，Nat.Biotechnol.，25，pp.1015-24，2007)，测定了人iPS细胞至心脏的分化。分化诱导后12天时，细胞聚集开始相冲突(beating)(图18D)。RT-PCR结果显示，这些细胞表达心肌细胞标记物，如TnTc、MEF2C、NKX2.5、MYL2A和MYHCB(图18E)。另一方面，Oct3/4、Sox2和Nanog的表达显著降低。这些结果显示，人iPS细胞可体外分化成心肌细胞。

[0091]实施例17：由分iPS细胞形成畸胎瘤

为测定体外多能性，将人iPS细胞(克隆201B7)皮下移植到免疫缺陷(SCID)小鼠背侧。9周后，观察到肿瘤发生。组织学观察显示，肿瘤中含多种组织，包括神经肠管样上皮组织(外胚层)、横纹肌(中胚层)、软骨(肌肉)、神经组织(内胚层)和含角蛋白的扁平组织(内胚层)(图19)。

[0092]实施例18：有其他人体细胞制备iPS细胞

除HDF外，使用了从成年人滑膜组织的原代人衍生成纤维细胞样滑膜细胞建立的细胞系(HFLS)和从源于新生儿阳茎外鞘的成纤维细胞建立的细胞系(BJ细胞)和从源于新生儿阳茎外鞘的成纤维细胞建立的细胞系(表3)。检查了有HFLS(5×10⁴细胞/100mm皿)的iPS细胞制备，结果得到600或更多粒状集落和17个人ES细胞样集落。当测定所述17个集落中的6个集落时，其中只有两个集落可增殖(图20)。接种5×10⁵HFLS的皿倍粒状集落覆盖，且无法确认为人ES细胞样集落。另一方面，检查了由BJ细胞制备iPS细胞，结果在5×10⁴细胞/100mm皿的情况下，识别出7-13个人ES细胞样集落和轻度粒状集落，但在5×10⁵细胞/100mm 的情况下得到100个人ES细胞样集落(表3)。收集其中六个人ES细胞样集落，且5个集落被证实为iPS细胞(图20)。源自HFLS和BJ的人iPS细胞以等于或高于人ES细胞的情况的水平的水平表达人ES细胞标记基因(图21)。这些人iPS细胞通过EB分化成3种胚层细胞(图22)。通过STR分析证实，iPS-HFLS细胞和iPS-BJ细胞分别源自HFLS细胞和BJ细胞。表6显示源自HFLS的iPS细胞的STR分析结果，而表7显示源自BJ的iPS细胞的STR分析结果。

[0093]表6

座位/克隆	243H1	243H7	HFLS
座位/克隆	243H1	243H7	HFLS	D3S1358	16 17	16 17	16 17
TH01	59	5 9	5 9	D3S1358	16 17	16 17	16 17
TH01	59	5 9	5 9	D21S11	28 30	28 30	28 30
D18S51	14 17	14 17	14 17	D21S11	28 30	28 30	28 30
D18S51	14 17	14 17	14 17	Penta_E	5 12	5 12	5 12
D5S818	10 12	10 12	10 12	Penta_E	5 12	5 12	5 12
D5S818	10 12	10 12	10 12	D13S317	13	13	13
D7S820	9 12	9 12	8 12	D13S317	13	13	13
D7S820	9 12	9 12	8 12	D16S539	11 13	11 13	11 13
CSF1PO	10 11	10 11	10 11	D16S539	11 13	11 13	11 13
CSF1PO	10 11	10 11	10 11	Penta_D	9 11	9 11	9 11
AMEL	X	X Y	X Y	Penta_D	9 11	9 11	9 11
AMEL	X	X Y	X Y	vWA	17 19	17 19	17 19
D8S1179	13	13	13	vWA	17 19	17 19	17 19
D8S1179	13	13	13	TPOX	8 11	8 11	8 11
FGA	21 22	21 22	21 22	TPOX	8 11	8 11	8 11

[0094]表7

座位/克隆	246G1	246G3	246G4	246G5	246G6	BJ
座位/克隆	246G1	246G3	246G4	246G5	246G6	BJ	D3S1358	13 15	13 15	13 15	13 15	13 15	13 15
TH01	6 7	6 7	6 7	6 7	6 7	6 7	D3S1358	13 15	13 15	13 15	13 15	13 15	13 15
TH01	6 7	6 7	6 7	6 7	6 7	6 7	D21S11	28	28	28	28	28	28
D18S51	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	D21S11	28	28	28	28	28	28
D18S51	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	Penta_E	7 17	7 17	7 17	7 17	7 17	7 17
D5S818	11	11	11	11	11	11	Penta_E	7 17	7 17	7 17	7 17	7 17	7 17
D5S818	11	11	11	11	11	11	D13S317	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10
D7S820	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	D13S317	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10	9 10
D7S820	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	D16S539	9 13	9 13	9 13	9 13	9 13	9 13
CSF1PO	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	D16S539	9 13	9 13	9 13	9 13	9 13	9 13
CSF1PO	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	Penta_D	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12
AMEL	X Y	X Y	X Y	X Y	X Y	X Y	Penta_D	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12	11 12
AMEL	X Y	X Y	X Y	X Y	X Y	X Y	vWA	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18
D8S1179	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	vWA	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18	16 18
D8S1179	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	9 11	TPOX	10 11	10 11	10 11	10 11	10 11	10 11
FGA	22 23	22 23	22 23	22 23	22 23	22 23	TPOX	10 11	10 11	10 11	10 11	10 11	10 11

[0095]以上结果显示，可通过用逆转录病毒导入四种基因：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，由成年HDF和其他体细胞制备iPS细胞。建立的人iPS细胞在很多方面类似于人ES细胞，包括细胞形态、增殖、饲养细胞依赖性、表面标记物表达模式、基因表达、启动子活性、端粒酶活性、体外分化能力和畸胎瘤形成能力。此外，四种逆转录病毒在人iPS细胞几乎完全沉默。上述描述显示，这些细胞被完全重编程，且自我更新不依赖于转基因的持续表达。

[0096]实施例8-18的实验材料与方法如下。

1.细胞培养

得自36岁的白种女人脸部皮肤的HDF和得自69岁白种男人滑膜组织的HFL购自Cell Applications公司。来自新生儿阳茎外鞘的BJ成纤维细胞和NTERA-2克隆D1人胚胎癌细胞得自美国模式培养物包藏所。将人成纤维细胞NTERA-2，和PLAT-E和PLAT-A细胞维持于含10％胎牛血清(FBS)及0.5％青霉素和链霉素(Invitrogen)的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM，Nacalai Tesque)中。将293FT细胞维持于含10％ FBS、2mM谷氨酰胺(Invitrogen)、1×10⁴M非必需氨基酸(Invitrogen)和1mM丙酮酸钠(Sigma)及0.5％青霉素和链霉素的DMEM中。将PA6间质细胞(Riken BioResource Center)维持于含10％ FBS和0.5％青霉素和链霉素的α-MEM中。将iPS细胞建立并维持于补充有4ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的用于灵长类ES细胞的培养基(ReproCeLL)中。传代过程中，用PBS洗涤人iPS细胞依次，然后于37℃下温育于含1ng/ml胶原酶IV(Invitrogen)的DMEM/F12中。当集落从皿边缘开始离底壁，移除DMEM/F-12/胶原酶，并用人ES细胞培养基洗涤。将所述细胞刮下，并收集于15ml锥管中。加入合适体积的培养基，并将所述内容物转移到收获于新皿上的SNL饲养细胞上。一般将分流比设置为1∶3。为在不含饲养细胞的条件下培养iPS细胞，于4℃下用0.3mg/ml基质胶(BDBiosciences)过夜包被平板。于使用前将所述平板温育至室温。吸出未结合的基质胶，并用DMEM/F-12洗去。将iPS细胞接种于包被基质胶的平板的MEF条件(MEF-CM)或非条件灵长类ES细胞培养基(ReproCELL)中，所述两种培养基均补充有4ng/ml bFGF。每日更换培养基。为制备MEF-CM，以1×10⁶细胞/100mm皿平板接种源自ICR小鼠的第13.5天的胚胎库的MEF，并过夜温育。次日，用PBS洗涤所述细胞一次，并培养于10ml的灵长类ES细胞培养基中。培养24小时后，收集MEF培养物的培养上清液，用孔径尺寸为0.22μm的过滤器过滤，并于使用前于-20℃下保存。

[0097]

2.质粒构建

通过RT-PCR扩增人Oct3/4的开放阅读框，并克隆于pCR2.1-TOPO中。将pCR2.1-hOct3/4中的EcoRI片段亚克隆于pMX逆转录病毒载体的EcoRI位点。为区别个实验，将20bp的随机序列(称为N₂₀条码)插入Oct3/4表达载体的NotI/Sall位点。为避免实验间污染，每个实验中使用唯一的条码序列。还通过RT-PCR扩增人Sox2、Klf4和c-Myc的开放阅读框，并亚克隆于pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中。根据产品说明书用Gateway克隆系统(Invitrogen)将亚克隆于pENTR-D-TOPO中的全基因插入到pMX逆转录病毒载体中。还扩增小鼠Slc7a1开放阅读框，亚克隆于pENTR-D-TOPO中，并使用Gateway系统插入pLenti6/UbC/V5-DEST(Invitrogen)中。用PCR扩增人Oct3/4基因和REX1基因的调控区域，并亚克隆于pCRXL-TOPO中(Invitrogen)。对于PhOCT4-Luc和phREX1-Luc，通过KpnI/BglII消化从pCRXL载体移除KpnI/BglII片段，并亚克隆于pGV-BM2中的Kpnl/BglII位点。对于pPolII-Luc，将pQBI-polII的AatII(顿端)/NheI片段插入pGV-BM2的KpnI(顿端)/NheI位点。所有片段经测序确认。引物序列显示于表8(序列表的SEQID NO：45-126)。

[0098]表8

[0099]

3.慢病毒制备和感染

以6×10⁶细胞/100mm皿平板接种293FT细胞(Invitrogen)，并过夜温育。根据产品说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用3μg pLenti6/UbC-Slc7a1连同9μg Virapower包装混合物转染293FT细胞。转染次日更换培养基。再于24小时后收集转染物的上清液，并用孔径尺寸0.45μm的醋酸纤维素过滤器过滤(Whatman)。于基因导入前日以8×10⁵细胞/100mm皿接种人成纤维细胞。用补充有4μg/ml聚凝胺(Nacalai Tesque)的含病毒上清液替换所述培养基，并温育24小时。

[0100]

4.逆转录病毒感染和iPS细胞产生

以8×10⁶细胞/100mm皿平板接种PLAT-E包装细胞，并过夜培养。次日，使用Fugene6转染剂(Roche)，用pMX载体转染PLAT-E细胞。转然后24小时时，用新培养基替换所述培养基，再24小时后，收集所述培养上清液作为含病毒上清液。在基因导入前体，将表达小鼠Slc7a1的人成纤维细胞(HDFa-Slc7a1)调至8×10⁵细胞/100mm皿，并接种。用孔径尺寸0.45μm的过滤器过滤所述含病毒上清液，并补充4μm/ml聚凝胺。将含四种中每种逆转录病毒的上清液等量混合，转移到HDFa-Slc7a1皿中，并过夜温育。24小时后，移除所述含病毒上清液，并用新鲜培养基替换所述培养基。6天后，通过胰蛋白酶消化收获HDFa-Slc7a1细胞，并以5×10⁴细胞/100mm皿重新平板接种于SNL饲养细胞上。次日，用补充有4ng/ml bFGF的灵长类ES细胞培养基替换所述培养基。隔日更换培养基。基因导入后30天时挑选集落，并转移到0.2ml灵长类ES细胞培养基中。通过温和抽吸将集落机械解聚成小团块。将所述细胞悬液转移到24孔平板中的SNL饲养细胞上。将此时期认为是第1代。

[0101]

5.RNA分离和反转录

用Trizol试剂(Invitrogen)纯化总RNA，并用Turbo DNA游离试剂盒(Ambion)处理以除去基因组DNA污染。使用Rever Tra Ace-α(Toyobo)和dT₂₀引物根据产品说明书用1μg总RNA进行反转录。用ExTaq(Takara)进行PCR。用Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG(Invitrogen)进行定量PCR，并用7300实时PCR系统(AppliedBiosystems)进行分析。引物序列显示于表8。

[0102]

6.碱性磷酸酶染色和免疫细胞化学分析

用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma)进行碱性磷酸酶染色。对于免疫细胞化学分析，于室温下用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞10分钟。用PBS洗涤后，于室温下用含5％正常山羊或驴血清(Chemicon)、1％牛血清白蛋白(BSA，Nacalai Tesque)和0.1％ Triton X-100的PBS处理所述细胞45分钟。作为第一抗体，使用了SSEA1(1∶100稀释，Developmental Studies Hybridoma Bank)、SSEA3(1∶10稀释，Peter W.Andrews博士捐赠)、SSEA4(1∶100稀释，Developmental StudiesHybridoma Bank)、TRA-2-49/6E(1∶20稀释，Developmental StudiesHybridoma Bank)、TRA-1-60(1∶50稀释，Peter W.Andrews博士捐赠)、TRA-1-81(1∶50稀释，Peter W.Andrews博士捐赠)、Nanog(1∶20稀释，AF1997，R&D Systems)、βIII-微管蛋白(1∶100稀释，CB412，Chemicon)、胶质纤维脂蛋白(1∶500稀释，Z0334，Dako)、α-平滑肌肌动蛋白(稀释，N1584，Dako)、结蛋白(1∶100稀释，Lab Vision)、波形蛋白(1∶100稀释，SC-6260，Santa Cruz)、α-胎蛋白(1∶100稀释，MAB1368，R&D Systems)和酪氨酸羟化酶(1∶100稀释，AB152，Chemicon)。作为第二抗体，使用了缀合了花菁3(Cy3)的山羊抗大鼠IgM(1∶500稀释，Jackson ImmunoResearch)、缀合了Alexa546的山羊抗小鼠IgM(1∶500稀释，Invitrogen)、缀合了Alexa488的山羊抗兔IgG(1∶500稀释，Invitrogen)、缀合了Alexa488的驴抗山羊IgG(1∶500稀释，Invitrogen)、缀合了Cy3的山羊抗小鼠IgG(1∶500稀释，Chemicon)和缀合了Alexa488的山羊抗小鼠IgM(1∶500稀释，Invitrogen)。用1μg/ml Hoechst33342(Invitrogen)对核进行染色。

[0103]

7.体外分化

用胶原酶IV处理人iPS细胞，转移到包被羟乙基甲基丙烯酸酯的皿中，并用含20％KSR(Invitrogen)、2mM L-谷氨酰胺、1×10^-4M非必需氨基酸、1×10^-4M 2-巯基乙醇(Invitrogen)和0.5％青霉素和链霉素的DMEM/F12进行悬浮培养，以形成胚状体(EB)。隔日更换所述培养基。悬浮培养8天后，将EB转移到包被明胶的平板上，并在相同培养基中再培养8天。

为分化成多巴胺能神经元，首先将PA6饲养细胞平板接种于包被明胶的6孔平板上，并温育4天至达到汇合。将iPS细胞的小团块平板接种于含10％ KSR(Invitrogen)、1×10^-4M非必需氨基酸、1×10^-4M 2-巯基乙醇(Invitrogen)及0.5％青霉素和链霉素的Glasgow最低基础培养基(Invitrogen)中的PA6饲养层上。

为分化成心肌细胞，使iPS细胞在包被基质胶的平板中的补充有4ng/ml bFGF的MEF-CM中维持6天。然后，用补充有100ng/ml人重组激活素A(R&D Systems)的补充B27的RPMI1640培养基(RPMI/B27)(Invitrogen)替换所述培养基24小时，随后用10ng/ml人重组骨形态发生蛋白4(BMP4，R&D Systems)4天。经细胞因子刺激后，将细胞维持于不含任何细胞因子的RPMI/B27中。隔日更换所述培养基。

[0104]

8.亚硫酸氢盐测序法

用Cp基因组DNA改良试剂盒(Chemicon)根据产品说明书处理基因组DNA(1μg)。用QIA Quick Column(QIAGEN)纯化经处理的DNA。通过PCR扩增人Oct3/4、Nanog和Rex1基因的启动子区域。将PCR产物亚克隆于pCR2.1-TOPO中。通过用M13通用引物进行测序来确认每个样品的10个克隆。用于PCR扩增的引物序列显示于表8。

[0105]

9.荧光素酶测定

用50ng pRL-TK(Promega)将含萤火虫荧光素酶基因的各报告质粒(1μg)导入人iPS细胞或HDF中。基因导入后48小时，用1×被动性溶解缓冲液(Promega)溶解所述细胞，并于室温下温育15分钟。用双荧光素酶报告测定系统(Promega)和Centro LB960检测系统(Barthold)根据产品说明书测量荧光素酶活性。

[0106]

10.畸胎瘤形成

通过胶原酶I V处理收获所述细胞，收集于管中，并离心，并将沉淀重悬于DMEM/F12中。将汇合的100mm皿中细胞的1/4皮下接种于SCID小鼠背侧(Clea Japan)。9周后，切下肿瘤，称重，并用含4％多聚甲醛的PBS固定。对石蜡包埋的组织进行切片，并用苏木精-伊红染色。

[0107]

11.蛋白印记

用补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的RIPA缓冲液(50mMTris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1％ Nonidet P-40(NP-40)、1％脱氧胆酸钠和0.1％ SDS)溶解半汇合状态的所述细胞。MEL-1人ES细胞系的细胞溶解物购自Abcam。通过8％或12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞溶解物(20μg)，并转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore)上。用含1％脱脂乳的TBST(20mM Tris-HCl(pH 7.6)、136mM NaCl和0.1％吐温-20)封闭所述膜，然后于4℃下与第一抗体溶液过夜温育。用TBST洗涤后，于室温下用缀合了第二抗体的辣根过氧化物酶(HRP)温育所述膜1小时。用稳定素蛋白化学荧光HRP底物(Millipore)和LAS3000成像系统(Fuji Film)检测信号。作为第一抗体，使用了抗Oct3/4(1∶600稀释，SC-5279，Santa Cruz)、抗Sox2(1∶2000稀释，AB5603，Chemicon)、抗Nanog(1∶200稀释，R&D Systems)、抗Klf4(1∶200稀释，SC-20691，Santa Cruz)、抗c-Myc(1∶200稀释，SC-764，Santa Cruz)、抗E-钙粘蛋白(1∶1000稀释，610182，BS Bioscience)、抗Dppa4(1∶500稀释，ab31648 Abcam)、抗FoxD3(1∶200稀释，AB5687，Chemicon)、抗端粒酶(1∶1000稀释，ab23699，Abcam)、抗Sall4(1∶400稀释，ab29112，Abcam)、抗Lin28(1∶500稀释，AF3757，R&D Systems)和抗β肌动蛋白(1∶5000稀释，A5441，Sigma)；而作为第二抗体，使用了抗小鼠IgG-HRP(1∶3000稀释，#7076，Cell Signaling)、抗兔IgG-HRP(1∶2000稀释，#7074，Cell Signaling)和抗山羊IgG-HRP(1∶3000稀释，SC-2056，SantaCruz)。

[0108]

12.DNA印记

用BglII、EcoRI和NcoI过夜消化基因组DNA(5μg)。在0.8％琼脂糖凝胶上分离消化的DNA片段，并转移到尼龙膜(Amersham)上。于42℃匀速搅拌下在DIG Easy Hyb缓冲液(Roche)中使所述膜与经洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针过夜反应。洗涤后，向所述膜加入缀合了碱性磷酸酶的抗DIG抗体(1∶10000稀释，Roche)。用CDP-star(Roche)激发信号，并用LAS3000成像系统检测。

[0109]

13.短串联重复分析和核型分析

对基因组DNA用使用Powerplex16系统(Promega)进行PCR，并用ABIPRISM 3100(基因分析仪和基因定位仪v3.5)(Applied Bio Systems)分析。在Nihon Gene Research Laboratories公司(日本)进行染色体G带分析。

[0110]

14.检测端粒酶活性

用TRAPEZE端粒酶检测试剂盒(Chemicon)根据产品说明书检测端粒酶活性。通过基于TBE的10％丙稀酰胺非变性凝胶电泳分离所述样品。用SYBR金(1∶10000稀释，Invitrogen)染色所述凝胶。

[0111]

15.染色质免疫沉淀测定

于室温下将约1×10⁷细胞交联于1％多聚甲醛5分钟，并通过加入甘氨酸停止所述反应。对所述细胞溶解物进行超声波处理，以共享染色质-DNA复合物。用连接有免疫磁珠蛋白G(Invitrogen)的抗三甲基Lys4组蛋白H3(07-473，Upstate)、抗三甲基Lys27组蛋白H3(07-449，Upstate)或正常兔IgG抗体进行免疫沉淀。将洗脱液用作定量PCR的模板。

[0112]

16.DNA微阵列分析

用Cy3标记来自HDF和hiPS细胞(克隆201B)的总RNA。使样品与人全基因组微阵列4×44K(G4112F，Agilent)杂交。使每个样品一次与一种颜色方案杂交。用G2565BA微阵列扫描系统(Agilent)扫描阵列，并用GeneSpringGX 7.3.1软件分析数据。进行两次校正。首先，将小于0.01的信号强度设置为0.01。然后用取自芯片测量值的第50个百分位数校正每个芯片。用hES H9细胞的微阵列数据(Tesar et al.，Nature，448，pp.196-199，2007)检索GEO数据集(GSM194390，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gds&cmd＝search&ter m＝GSE7902)。在所有三个样品中，使用具有“当前”标记值的基因进行分析(32，266基因)。将HDF和hiPS细胞的微阵列数据以登录号GSE9561储存于GEO数据集中。

[0113]实施例19：不用c-Myc建立iPS细胞

通过用逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc导入小鼠成纤维细胞而得到的小鼠iPS细胞的iPS克隆(Takahashi et al.，Cell，126，pp.663-76，2006)在每个基因中含有一些逆转录病毒。每个克隆具有共多于20个逆转录病毒整合位点，且发生肿瘤的风险的可能性升高。在小鼠iPS细胞的情况下，已知源于iPS细胞的嵌合体小鼠及其后代的肿瘤发生率达～20％(Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007)，且有c-Myc逆转录病毒再活化升高使用iPS细胞产生的嵌合体小鼠及其后代小鼠的肿瘤发生率的可能性。从而研究了不用c-Myc建立iPS细胞的方法。

[0114]此外，测定了是否可通过使用四种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的家族基因建立iPS细胞。为此，使用了含有受Nanog基因调控元件驱动的绿色荧光蛋白(GFP)-IRES-Puro^r转基因的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007)。Nanog在小鼠ES细胞和移植前胚胎中特异性表达(Chambers et al.，Cell，113，pp.643-655，2003；Mitsui et al.，Cell，113，pp.631-642，2003)，且可作为iPS细胞导入过程的筛选标记。当诱导了重编程时，GFP表达，且这成为所述细胞是iPS细胞的标志。结果显示，经Nanog筛选的i PS细胞无法与ES细胞区分开，并产生性系有功能的嵌合体小鼠(Wernig et al.，Nature，448，pp.318-324，2007；Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007；Maherali et al.，Cell Stem Cell，1，pp.55-70，2007)。

[0115]Oct3/4属于转录因子的Oc t家族，其含有POU结构域(Ryanet al.，Genes Dev 11：1207-25，1997)。最接近于Oct3/4的同源物是Oct1和Oct6。用逆转录病毒将Oct3/4、Oct1或Oct6集其余3种基因导入Nanog报告MEF中。如果使用Oct3/4，则观察到许多GFP阳性集落(图23a)。

[0116]Sox2属于Sox(SRY相关HMG盒)转录因子，其特征在于，存在高运动性基团(HMG)结构域(Schepers et al.，Dev.Cell，3，pp.167-170，2002)。检测了Sox1、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17和Sox18，且当使用Sox1时得到GFP阳性集落。此外，如果使用Sox3、Sox15和Sox18，可得到少量GFP阳性集落(图23a)。

[0117]Klf4属于克鲁佩尔样因子(Klf)，是含有类似于果蝇胚胎模式调控子克鲁佩尔的氨基酸序列的锌指蛋白(Dang et al.，Int.J.Biochem.Cell Biol.，32，pp.1103-1121，2000)。检测了Klf1、Klf2和Klf5，且当使用Klf2时得到表达GFP的集落(图23a)。使用Klf1和Klf5也可诱导iPS细胞。

[0118]c-Myc有两个相关基因(N-Myc和L-Myc)(Adhikary et al.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，6，pp.635-645，2005)。通过使用N-Myc或L-Myc，形成GFP阳性集落(图23a)。因此显示，可通过四种基因的家族基因诱导iPS细胞。

[0119]针对家族基因研究了是否可从MEF(其中将βgeo敲入Fbx15基因座位)(Tokuzawa et al.，Mol.Cell Biol.，23，pp.2699-2708，2003)诱导出iPS细胞，并得到了与通过基于Nanog的筛选得到的结果类似的结果。可用Sox1或Sox3代替Sox2，可用Klf2代替Klf4，且可用N-Myc和L-Myc代替c-Myc。可增殖所述通过所述家族基因产生的细胞，并显示可从形态上与ES细胞区分开，并在裸鼠中造成畸胎瘤(图24)。因此显示，这些家族基因可从Nanog报告MEF和Fbx15报告MEF二者诱导iPS细胞。

[0120]不使用c-Myc由Nanog报告MEF得到少数ES细胞样GFP阳性集落(图23a)。尽管Okita等人之前报导不用c-Myc得不到GFP阳性集落(Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007)，但该文报导的方法与上述方法的一个区别是药物筛选时间。该文描述的方法中，于基因导入后7天时开始嘌呤霉素筛选，而本方法中在第14天开始了药物筛选。将四种基因——Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc或三种基因(无c-Myc)中的每一个都导入Nanog报告MEF中，并于基因导入后7天、14天或21天时开始嘌呤霉素筛选(图23b)。当使用四种基因时，在所有条件下观察到GFP阳性集落，而当嘌呤霉素筛选延迟时，集落数显著增加。在不用c-Myc的用途的情况下，当在基因导入后7天时开始筛选时观察不到GFP阳性集落，但当在基因导入后14天或21天时开始筛选，可形成GFP阳性集落。在各条件下，使用三种基因的情况的集落数小于使用四种基因的情况。使用三种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4)(不用Myc逆转录病毒)产生的经Nanog筛选的iPS细胞以接近ES细胞的水平表达ES细胞标记基因(图25)，并在移植到胚泡中时产生成年嵌合体小鼠(表9)。

[0121]表9

用三种基因(不使用MYC)由MEF或TTF诱导所有iPS克隆。

*FB：Fbx15-βgeo报告子；

Ng：Nanog-GFP-IRES-Puro^r报告子；

GFP：CAG-EGFP

[0122]另一个不同是，当使用三种基因(不使用c-Myc)诱导iPS细胞时，观察到更少的GFP阴性集落和更低的背景细胞(图23c)。因此，不使用c-Myc的诱导方法具有优点，即诱导缓慢，且相比并用c-Myc的iPS细胞诱导效率降低，但iPS细胞诱导的特异性升高。

[0123]可在不使用c-Myc的情况下从MEF(其中将βgeo敲入Fbx15座位)(Tokuzawa et al.，Mol.Cell Biol.，23，pp.2699-2708，2003)产生很少的iPS细胞(图26A)。Takaha shi等人之前报导不使用c-Myc不能得到iPS细胞(Takahashi et al.，Cell，126，pp.663-676，2006)，且该文报导的方法与上述方法的G418筛选开始于相同时间(基因导入后3天)。但该文报导的方法中于基因导入后14-21天对所述集落进行了筛选，而在本实验中则在约30天后进行了集落筛选。此外，本实验中，使用各自独立的PLAT-E细胞各自制备了含四种基因(或三种基因)的逆转录病毒(Morita et al.，Gene Ther.，7，pp.1063-1066，2000)。通过此操作，逆转录病毒的转染效率提高，并观察到iPS细胞集落数相比已报导的在单个PLAT-E细胞中制备所有四种基因的方法显著提高。

[0124]通过导入四种基因产生的经Fbx15筛选的iPS细胞中的ES细胞标记基因的表达水平低于ES细胞(Takahashi et al.，Cell，126，pp.663-676，2006)。当将此iPS细胞微注射到胚泡中时不可产生成年嵌合体小鼠，但当也进行Fbx15筛选时，不使用c-Myc制备的iPS细胞的ES细胞标记基因的表达水平与ES细胞的表达水平相当(图26B)。此外，以高iPS细胞贡献率由不使用c-Myc制备的iPS细胞得到了成年嵌合体小鼠(图27，表9)。未观察到这些嵌合体小鼠中肿瘤发生率增加。即，在源自用四种基因建立的iPS细胞的嵌合体小鼠中，37只嵌合体小鼠中的6只在出生后100天内死于肿瘤，但源于用三种基因(不用c-Myc)建立的iPS的的嵌合体小鼠，因为所有26只嵌合体在观察期(短于4个月)内存活，从而表明不使用c-Myc降低了肿瘤发生风险。

[0125]研究了是否可不使用c-Myc，且不使用药物筛选有效分离iPS细胞。将四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三种基因(不使用c-Myc)导入含Nanog报告子的成年尾尖成纤维细胞(TTF)中，并在非嘌呤霉素筛选下继续培养。尾观察所述导入了基因的细胞，导入DsRed逆转录病毒集四种基因或三种基因。逆转录病毒导入后30天时，有导入四种基因的细胞的皿被许多GFP阴性集落和背景细胞覆盖(图28A，表10：Nanog-GFP报告TTF+非药物筛选)。表中括号的数值表示GFP阳性克隆或克隆数。逆转录病毒(Oct 3/4、Sox2、Klf4、(C-Myc)和DsRed)的比例在No.256中是1∶1∶1∶(1)∶4，而在No.272和309中是1∶1∶1∶(1)∶4。No.220中，DsRed未导入。

[0126]表10

[0127]使用荧光显微镜观察集落中的GFP阳性集落(在三个独立实验中4、132、424个集落)。GFP阳性集落呈DsRed阴性，这与在经Nanog筛选的iPS中观察到的逆转录病毒沉默类似(Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007)。当使用三种基因(不使用c-Myc)时，观察到集落中的有很少背景细胞的集落(在三个独立实验中7、21和43个)。这些集落中约半数以斑驳形式表达GFP。仅在一些集落的一小部分中检测到DsRed，表示其被大量沉默。未观察到GFP和DsRed之间的重叠。这些集落中的大部分可扩增，且由iPS细胞组成，其在第2代呈GFP阳性和DsRed阴性。因此显示，可在非药物筛选和不使用c-Myc的情况下增强iPS细胞的特异性产生。所述iPS细胞中Nanog-GFP活化，且逆转录病毒沉默。

[0128]试着从成年TTF(不具有筛选标记物，但具有由具有组成型活性的启动子驱动的DsRed转基因)制备iPS细胞(Vintersten et al.，Genesis，40，pp.241-246，2004)。将四种基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三种基因(不使用c-Myc)导入所述细胞。再导入GFP逆转录病毒以监控沉默。非药物筛选30天后，从导入所述四种基因的0.5×10⁵中形成约1000个集落。其中大部分是GFP阳性集落，表明这些细胞中未发生逆转录病毒沉默。另一方面，用导入三种基因(不使用c-Myc)的3.5×10⁵细胞产生16个集落(图28B)。这些集落中的大部分不表达GFP，而其余集落微量表达GFP。所有这些集落均可增殖，甚至在第2代，它们也显示出iPS细胞形态(ES细胞样形态)。此外，结果显示，这些细胞均为GFP阴性的，并产生逆转录病毒沉默。RT-PCR显示，这些细胞中ES细胞标记基因的表达水平与ES细胞相当(图28C)。通过使用这些基因制备的iPS细胞，通过RT-PCR证实了Klf4的逆转录病毒沉默和c-Myc转基因的缺失，当将这些iPS细胞移植到胚泡中时产生嵌合体小鼠(图28D和表9)。以上结果显示，可在不使用c-Myc的情况下得到具有优良特性的iPS细胞，且可在非药物筛选下由成年TTF有效制备iPS细胞。

[0129]接下来，将Oct3/4、Sox2和Klf4的逆转录病毒导入人新生儿阳茎外鞘衍生成纤维细胞(BJ)(克隆246H)或人成年皮肤衍生成纤维细胞HDF(253G)中。30天后形成很少的人iPS细胞集落。这些细胞表现出人ES细胞样集落形态，并可被增殖(图29A)。当把三种基因(不使用c-Myc)导入(253G)中，或当向所述三种基因添加c-Myc，并同时导入(253F)时，证实源于HDF的人iPS细胞表达ES细胞标记基因(图29B)。此外，证实了未使用c-Myc逆转录病毒诱导的人iPS细胞的通过胚状体的分化(图30)。

[0130]实施例19中的实验材料与方法如下：

1.质粒构建

使用列于表11的引物通过RT-PCR扩增家族基因的编码区域(序列表的SEQ ID NO：127-152)，亚克隆于pDONR201或pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中，并通过LR反应(Invitrogen)重组于pMXs-gw中。

[0131]表11

[0132]

2.逆转录病毒转导

使用Fugene6试剂(Roche)根据产品说明书将基于pMX的逆转录病毒载体转染至PLAT-E细胞(Morita et al.，Gene Ther.，7，pp.1063-1066，2000)中。24小时后更换培养基，再24小时后取含病毒上清液，并通过逆转录病毒感染进行基因导入。在“混合的”方案中，将四种基因的质粒的混合物转染至单皿的PLAT-E细胞中。在“各自的”方法中，将每个质粒转染至各自皿的PLAT-E细胞中。在基因导入前混合含病毒上清液。在所述各自的方法中，观察到显著高的基因导入效率。

[0133]

3.在药物筛选下诱导iPS细胞

通过改良已报导方法(Takahashi et al.，Cell.，126，pp.663-676，2006；Okita et al.，Nature，448，pp.313-17，2007)进行iPS细胞诱导。将MEF(含Nanog-GFP-IRES-Puro^r报告子或Fbx15-βgeo报告子，或二者)分别以1.3×10⁵细胞/孔(6孔平板)和8.5×10⁵细胞/孔(100mm皿)接种于收获了SNL饲养细胞的6孔平板和100mm皿中(McMahon et al.，Cell.，62，pp.1073-1085，1990)。用含LIF的ES细胞培养基(Meineret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，93，pp.14041-14046，1996)培养所述导入了基因的细胞。如在已报导的方法中一样开始用G418(300μg/ml)或嘌呤霉素(1.5μg/ml)进行筛选。基因导入后25天-30天时对集落数进行计数。选出一些集落用于扩增。

[0134]

4.在不使用药物进行筛选下诱导iPS细胞

TTF分离自成年Nanog报告小鼠或成年DsRed转基因小鼠(Vintersten et al.，Genesis，40，pp.241-246，2004)。用所述各自的方法制备含逆转录病毒的上清液。对于导入四种基因，以1∶1∶1∶1∶4的比例混合Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2和DsRed的含逆转录病毒上清液。当导入所述三种基因时，以1∶1∶1∶1∶4的比例混合Klf4、Oct3/4、Sox2、Mock(空载体)和DsRed的含逆转录病毒上清液。对于DsRed转基因小鼠，使用GFP逆转录病毒替代DsRed。为转染，以8.0×10⁵细胞/100mm皿(无饲养细胞)的比例接种TTF。将TTF于含病毒/聚凝胺的上清液中温育24小时。基因导入后4天时，以3.5×10⁵细胞/100mm皿(有SNL饲养细胞)的比例重接种导入了三种基因的TTF，并用ES细胞培养基进行培养。以0.5×10⁵细胞/100mm皿(有SNL饲养细胞)的比例重接种导入了四种基因的TTF。基因导入后30-40天时对集落数进行计数。选出一些集落用于扩增。

5.iPS细胞评估

根据已报导方法进行RT-PCR和畸胎瘤形成。对于嵌合体实验，将15-20个iPS细胞注射入BDF1衍生胚泡中，随后将其移植入假孕小鼠的子宫中。

[0135]实施例20：使用六种基因由上皮细胞产生人iPS细胞

使用下列六种基因——Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28(NCBI登录号NM_145833(小鼠)或NM_024674(人))的组合，或缺少所述组合中一种或两种或多种基因的组合诱导iPS细胞。

[0136]将6×10⁶ 293 FT细胞接种于10cm陪替皿中，并过夜培养，并用3μg pLenti6/UbC-Slc7a1慢病毒载体，使用9μg Virapower包装混合物及脂质体2000(Invitrogen)转染这些陪替皿。24小时后用新培养基替换所述培养基。再20小时后，取所述培养上清液，并用孔径尺寸0.45μm的醋酸纤维素过滤器(Whatman)进行过滤。于前日制备5×10⁵上皮细胞。向已移除培养上清液的上皮细胞陪替皿中加入经过滤的加入了4μg/ml聚凝胺(Nacalai Tesque)的培养上清液，并培养所述细胞24小时。

[0137]将1.0×10⁶ PLAT-E细胞接种于6cm陪替皿中，并培养。次日，使用27μl Fugene6转染试剂(Roche)，用9.0μg基于pMX的逆转录病毒载体(含Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)转染所述细胞。24小时后，用新培养基替换所述培养基。再次日，收集PLAT-E细胞的培养上清液，并用孔径尺寸0.45μm的醋酸纤维素过滤器(Whatman)进行过滤。慢病毒感染后7天时以3.0×10⁵细胞/6cm皿重接种上皮细胞，并加入上述含逆转录病毒和聚凝胺的培养上清液。

[0138]结果显示于表12中。表中，“6F”表示6种基因(Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)，分别是“L”表示Lin28，“N”表示Nanog，“M”表示c-Myc，“O”表示Oct3/4，“S”表示Sox2，及“K”表示Klf4。字母前的“-”指将由紧随“-”的字母指代的基因从六种基因中除去的情况，例如“-L”指通过从六种基因中除去ln-28而剩下的五种基因，而“-KS”指六种基因中缺失Klf4和Sox2的四种基因。表中数值表示集落数，“非ES样”表示具有非ES样形态的集落，而“ES样”表示具有ES样细胞形态的集落。

[0139]表12

[0140]表12显示两次实验的结果。第一次实验的结果显示基因导入后第23天或第29天的通过导入各基因的组合而诱导的细胞的集落数，而第二次实验(右栏的第23天)的结果显示在“6F”、“-KM”和“-NL”的情况下的集落数。因为未导入Lin-28(如“-L”)的细胞的集落数小于导入了Lin-28时的集落数，显示Lin28在提高iPS细胞产生效率中负责重要作用。

[0141]还使用六种基因(Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)和四种基因的两种不同组合(图31中Y4F代表的Klf4、c-Myc、Oct3/4和Sox2，和图31中T4F代表的Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)进行iPS细胞诱导。T4F与Yu et al.，Science，318，pp.1917-1920，2007中公开的组合相同。图31中，“ES样”表示形态类似于ES细胞集落的集落数，而“总”表示ES样集落数和非ES样集落数的总合。Exp#1、Exp#2、Exp#3和Exp#4表示各自实验的结果。在这些实验中，通过使用六种基因和Y4F的四种基因的组合得到形态类似于ES样细胞集落的iPS细胞集落。但在T4F的组合中，未观察到有形态类似于ES样细胞集落的集落形成。

[0142]实施例21：使用Sall4有效产生iPS细胞

使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和人成年皮肤成纤维细胞(成年HDF)进行实验，结果发现，当使用向三种基因(Klf4、Oct3/4和Sox2)的组合添加Sall4的组合(即使用Klf4、Oct3/4、Sox2和Sall4)诱导iPS细胞时增加iPS细胞的产生效率(图32和33)。当向四种基因(Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc)添加Sall4时观察到更多的iPS细胞集落。这些实验显示，可通过向核重编程因子添加Sall4而提高iPS细胞的诱导效率。

[0143]实施例22：小鼠Sall4和/或小鼠Sall1促进iPS细胞诱导的效应

根据已报导的方法(Cell，131，pp.861-872，2007)，并使用逆转录病毒将源于人的四种基因(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三种基因(Y3F:Oct3/4、Sox2和Klf4)和小鼠Sall4(mSall4)基因或小鼠Sall1(mSall1)基因导入成年皮肤成纤维细胞(成年HDF，通过慢病毒使其表达小鼠亲嗜性受体Slc7a基因)。

[0144]基因导入后第6天收集一次HDF，然后将调至5×10⁵的HDF接种于经丝裂霉素C处理的1.5×10⁶ STO细胞上。次日后将细胞培养于用于培养灵长类ES细胞的培养基(ReproCELL)(含4ng/ml重组人bFGF(WAKO))中。感染后第32天和第40天的ES细胞样集落数的计数结果显示于图34。在感染后第32天，当导入Y3F+模拟物(空载体)时的集落数是1，而当导入Y4F+模拟物时的集落数是37；而当同时导入Y3F或Y4F和Sall4时，在导入Y3F+mSall4的组观察到22个集落，而在导入Y4F+mSall4的组观察到73个集落。当把mSall1导入Y3F或Y4F时，在导入Y3F+mSall1的组观察到2个集落，而在导入Y4F+mSall1的组观察到43个集落，并与仅导入Y3F或Y4F的情况相比无显著的集落数差异。当把mSall4和mSall1同时导入Y3F或Y4F时，导入Y3F+mSall4+mSall1的组的集落数是34，而导入Y4F+mSall4+mSall1的组是79。

[0145]感染后第40天，当导入Y 3F+模拟物时的集落数是8，而当导入Y4F+模拟物时的集落数是57；而当同时导入Y3F或Y4F和mSall4时，在导入Y3F+mSall4的组观察到62个集落，而在导入Y4F+mSall4的组观察到167个集落。当把mSall1导入Y3F或Y4F时，在导入Y3F+mSall1的组观察到14个集落，而在导入Y4F+mSall1的组观察到103个集落。而且，当把mSall4和mSall1同时导入Y3F或Y4F时，导入Y3F+mSall4+mSall1的组的集落数是98，而导入Y4F+mSall4+mSall1的组是193。以上结果显示，可通过将mSall4导入Y3F，或同时导入mSall4和mSall1，使以20-100倍效率导入人iPS细胞。此外显示，可通过将mSall4导入Y4F，或同时导入mSall4和mSall1，使以2-4倍效率导入人iPS细胞。

[0146]实施例23：小鼠Sall4和/或小鼠Sall1促进iPS细胞诱导的效应(2)

根据已报导的方法(Cell，131，pp.861-872，2007)，将小鼠Sall4(mSall4)或小鼠Sall1(mSall1)或此二者及源于人的四种基因(T4F:Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28)或三种基因(T3F:Oct3/4、Sox2和Nanog)导入人成年皮肤成纤维细胞(用慢病毒使其表达小鼠亲嗜性受体Slc7a)(HDFa-Slc7a1)。

[0147]基因导入后第6天收集一次HDF-Slc7a1，然后将调至5×10⁵的HDF-Slc7a1接种于经丝裂霉素C处理的1.5×10⁶ STO细胞上。培养7天后将细胞培养于用于培养灵长类ES细胞的培养基(ReproCeLL)(含4ng/ml重组人bFGF(WAKO))中。感染后第32天和第40天的ES细胞样集落数的计数结果显示于图35。在感染后第32天，当导入T3F+模拟物和T4F+模拟物时的集落数是0，而当同时导入T3F或T4F和mSall4时，在导入T3F+mSall4的组检测到两个集落。未在导入T4F+mSall4的组观察到人ES细胞样集落。

[0148]当同时导入T3F或T4F和mSall1时，在导入T3F+mSall1的组观察到3个集落，而在导入T4F+mSall1的组观察到6个集落。而且，当同时导入mSall4和mSall1及T3F或T4F时，在导入T3F+mSall4+mSall1的组观察到3个集落。未在导入T4F+mSall4+mSall1的组观察到人ES样集落。感染后第40天，当导入T3F+模拟物和T4F+模拟物时的集落数是0，而当同时导入T3F或T4F和mSall4时，在导入T3F+mSall4的组观察到6个集落，而在导入T4F+mSall4的组观察到2个集落。

[0149]当同时导入T3F或T4F和mSall1时，在导入T3F+mSall1的组观察到13个集落，而在导入T4F+mSall1的组观察到22个集落。而且当把mSall4和mSall1同时导入T3F或T4F时，在导入T3F+mSall4+mSall1的组观察到17个集落，而在导入T4F+mSall4+mSall1的组观察到11个集落。在通过导入T3F和T4F产生iPS细胞时，通过加入mSall4观察到对iPS细胞集落形成的促进效应，而mSall1更有效诱导人iPS细胞集落形成。还显示，可通过导入mSall1和mSall4二者及T3F或T4F更加促进人iPS细胞的集落形成。

[0150]实施例24：人Sall4促进iPS细胞诱导的效应

根据Cell，131，pp.861-872，2007描述的方法制备人成年皮肤成纤维细胞(用慢病毒使其表达小鼠亲嗜性受体Slc7a1)(HDF-Slc7a1)，次日用逆转录病毒导入源于人的四种基因(Y4F:Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)或三种基因(Y3F:Oct3/4、Sox2和Klf4)和人Sall4(hSall4)。基因导入后第6天收集一次HDF，然后将调至5×10⁵的HDF接种于经丝裂霉素C处理的1.5×10 STO细胞上。次日后将细胞培养于用于培养灵长类ES细胞的培养基(ReproCELL)(含4ng/ml重组人bFGF(WAKO))中。感染后第32天和第40天的ES细胞样集落数的计数结果显示于图36。

[0151]在感染后第32天，当导入Y3F+模拟物(空载体)时的集落数是1，而当导入Y4F+模拟物时的集落数是34；而当同时导入Y3F或Y4F和hSall4时，在导入Y3F+hSall4的组观察到8个集落，而在导入Y4F+hSall4的组观察到52个集落。感染后第40天，当导入Y3F+模拟物时的集落数是5，而当导入Y4F+模拟物时的集落数是52；而当同时导入Y3F或Y4F和hSall4时，在导入Y3F+Sall4的组观察到32个集落，而在导入Y4F+mSall4的组观察到137个集落。结果显示，可通过同时将hSall4导入Y3F而以6-8倍效率得到人iPS细胞集落，且可通过同时导入Y4F和hSall4而以1.5-2.5倍效率得到人iPS细胞集落。

[0152]实施例25：L-Myc的效应

(A)测定通过导入四种基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc)进行的重编程

(1)对人iPS细胞诱导的影响

根据已报导的方法(Cell，131，pp.861-872，2007)制备成年皮肤衍生成纤维细胞(使其表达小鼠亲嗜性病毒受体Slc7a1基因)(aHDF-Slc7a1)。以3×10⁵/60mm皿的比例接种aHDF-Slc7a1，次日，根据本文上述方法用逆转录病毒导入源于人的四种基因(共4种基因，除三种基因Oct3/4、Klf4和Sox2外，L-Myc1(以下简称为“L-Myc”)、c-Myc或N-Myc基因)。病毒感染后6天时收集细胞，并重接种于MSTO细胞上(5×10⁵/100mm皿)。从次日开始，将细胞培养于补充有4ng/ml重组人bFGF(WAKO)的灵长类ES细胞培养基(ReproCELL)中。

[0153]对逆转录病毒感染后第37天形成的人iPS细胞集落数进行计数。对四次实验结果的总结显示于表13和图37(图37是表13的图像，且图像上的数值表示iPS细胞集落相对总集落数的比率)。通过使用L-Myc，诱导iPS细胞集落的效率成为使用c-Myc的6倍以上，且在使用L-Myc的情况下比使用c-Myc的情况，其iPS细胞集落数相对总集落数的比率升高约2倍。当使用N-Myc时，可观察到iPS细胞集落数比c-Myc的情况增加。对于诱导小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)衍生iPS细胞，有报导称使用c-Myc的情况和使用L-Myc的情况之间无差异(NatureBiotech.，26，pp.101-106，2008)，但已清楚，当使用人细胞时，在使用L-Myc时比使用c-Myc时诱导iPS细胞的效率更显著提高。

[0154]表13

hiPS集落数

[0155]

(2)体外分化诱导

将通过导入四种基因——Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc而建立的人iPS细胞(32R2，32R6)接种于低结合性皿中，并根据已报导的方法(Cell，131，pp.861-872，2007)形成胚状体(EB)(100mm皿)。培养2周后，使用抗α-胎蛋白(R&D Systems)(内胚层细胞的分化标记)、α-平滑肌肌动蛋白(Wako)(中胚层细胞的分化标记)和βIII-微管蛋白(Chemicon)(外胚层细胞的分化标记)的各抗体进行染色。结果显示于图38。通过染色，确认了各标记物的表达，并证实得到的人iPS细胞具有分化成三种胚层细胞的能力。

[0156]

(3)畸胎瘤形成能力

将通过导入四种基因——Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc而建立的人iPS细胞(32R6)培养于用于培养灵长类ES细胞的培养基(ReproCeLL)(含重组人bFGF(4ng/ml)和Rho激酶抑制剂Y-27632(10μM))中。1小时后，通过用胶原IV处理收集所述细胞，通过离心回收所述细胞，以将其悬浮于含Y-27632(10μM)的DMEM/F12中。将汇合细胞(100mm皿)量的1/4注射到SCID小鼠的睾丸中。2-3月后，切下肿瘤，用含4％多聚甲醛的PBS(-)固定。对石蜡包埋的组织进行切片，并用苏木精-伊红染色。结果显示于图39。因为肿瘤由多种细胞以组织学方式构成，因此观察到神经组织、肠道样组织、软骨组织、毛组织、脂肪组织和色素组织，确证了iPS细胞的多能性。

[0157]

(4)嵌合体小鼠对肿瘤发生的影响

MEF(MEF-Ng)分离自具有Nanog报告子的小鼠，所述Nanog报告子通过将EGFP和嘌呤霉素抗性基因并入Nanog座位而制成(Nature，448，pp.313-317，2007)。MEF(MEF-Fbx)也类似分离自具有Fbx15报告子的小鼠所述报告子通过将β-geo基因并入Fbx15座位而制成(Cell，126，pp.663-676，2006)。用逆转录病毒将四种基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc)导入这些MEF中，并通过用有关MEF-Ng的嘌呤霉素筛选建立iPS细胞，且通过用有关MEF-Fbx的G418筛选建立iPS细胞(分别称为Nanog-iPS和Fbx-iPS)。通过将这些iPS细胞移植到C57BL/6小鼠的胚泡中而产生嵌合体小鼠。研究了嵌合体小鼠和F1小鼠的肿瘤发生，结果此时小鼠分别存活如下天数，且未在任何活的小鼠中观察到肿瘤发生。

[0158]

嵌合体小鼠Fbx-iPS：19/19动物存活349天

嵌合体小鼠Nanog-iPS：15/16动物存活363天

F1Nanog-iPS：1/1动物存活255天

F1Nanog-iPS：3/3动物存活181天

F1Nanog-iPS：1/1动物存活132天

嵌合体小鼠Nanog-iPS：30/30动物存活63天

嵌合体小鼠Nanog-iPS：12/14动物存活62天

当使用四种基因(Oct3/4、Klf4、Sox2和L-Myc)重编程iPS细胞时，出生后100天内37只嵌合体小鼠中的6只死于肿瘤(Nature Biotech.，26，pp.101-106，2008)，但通过使用L-Myc替换c-Myc，存活率显著提高，且清楚地显示肿瘤发生显著降低。

[0159]

(B)测定通过导入三种基因(Oct3/4、Klf4、L-Myc)进行的核重编程

(1)有无iPS细胞集落形成

根据已报导方法(Nature Biotech.，26，pp.101-106，2008)检查通过导入三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)的iPS建立。将(A)(1)-(4)中所述MEF-Ng以1.3×10⁵/孔的比例接种于包被明胶的6孔培养板上，并在24小时后，通过使用逆转录病毒导入源于小鼠的三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)。病毒感染后4天时收集细胞，并重接种于MSTO细胞(1.5×10⁵/6孔平板)上。从次日开始使用添加了LIF的用于培养ES细胞的培养基(添加了15％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100μM非必需氨基酸(Invitrogen)、100μM 2-巯基乙醇(Invitrogen)、50U/ml青霉素(Invitrogen)和50mg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM)培养细胞。病毒感染后第46天挑选GFP阳性集落(iPS-MEF-Ng-443-3克隆)。经挑选的16个细胞的照片显示于图40。所有细胞都是表现出GFP阳性的iPS细胞集落。

[0160]对三个GFP阳性集落衍生的克隆进行RT-PCR和基因组PCR，以分析基因表达。结果显示于图41。所有克隆都表达Nanog、Rex1和ECAT1(ES细胞的标记基因)。此外，在所有iPS细胞集落中，导入的三种基因(Oct3/4、Klf4和L-Myc)均整合到基因组中。另一方面，未在一些克隆中检测到mRNA的表达，被认为其发生沉默。

[0161]

(2)体外分化诱导

将在上述(1)中建立的四种克隆(iPS-MEF-Ng-443-3-3、iPS-MEF-Ng-443-3-6、iPS-MEF-Ng-443-3-12和iPS-MEF-Ng-443-3-13)接种于低结合性皿(2×10⁶/6孔平板)中，以形成胚状体(EB)。在用于培养ES细胞的培养基中培养2天后，使用抗α-胎蛋白(R&D Systems)(内胚层细胞的分化标记)、α-平滑肌肌动蛋白(Dako)(中胚层细胞的分化标记)和βIII-微管蛋白(Chemicon)(外胚层细胞的分化标记)的各抗体进行染色。结果显示于图42。通过染色证实了这些标记物的表达，并证实得到的小鼠iPS细胞具有分化成三种胚层细胞的能力。

[0162]

(3)畸胎瘤形成能力

将在上述(1)中建立的四种克隆(iPS-MEF-Ng-443-3-3、iPS-MEF-Ng-443-3-6、iPS-MEF-Ng-443-3-12和iPS-MEF-Ng-443-3-13)分别皮下注射给裸鼠。四周后在所有实施例中证实了畸胎瘤形成。因为肿瘤由多种细胞以组织学方式构成，因此观察到神经组织、肠道样组织、肌肉组织、上皮组织和软骨组织(图43)，确证了iPS细胞的多能性。

[0163]实施例26：L-Myc和Lin28在诱导人iPS细胞中的效应

根据已报导方法(Cell，131，pp.861-872，2007)制备成年皮肤成纤维细胞(使其表达小鼠亲嗜性病毒受体Slc7a1基因)(aHDF-Slc7a1)。以3×10⁵/60mm皿的比例接种aHDF-Slc7a1，次日根据上文已报导方法使用逆转录病毒导入源于人的下列三种、四种或五种基因。

·Sox2、Oct3/4和Klf4

·Sox2、Oct3/4、Klf4和c-Myc

·Sox2、Oct3/4、Klf4和L-Myc

·Sox2、Oct3/4、Klf4和Lin28

·Sox2、Oct3/4、Klf4、c-Myc和Lin28

·Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28

[0164]病毒感染后6天时收集所述细胞，并重接种于MSTO细胞(5×10⁵/100mm皿)上。从次日后，将所述细胞培养于补充有4ng/ml重组人bFGF(Wako)的灵长类ES细胞培养基(ReproCELL)中。逆转录病毒感染后，对第37天形成的总集落数和hiPS集落数进行计数。结果显示于表14和图44(图44是表14的图像)。

[0165]表14

[0166]通过向四种基因——Sox2、Oct3/4、Klf4和L-Myc添加Lin28，使iPS细胞集落数显著增加。iPS细胞集落数显著多于向四种基因——Sox2、Oct3/4、Klf4和c-Myc添加Lin28的情况。此外Lin28对c-Myc的作用表现出协同效应，且还对L-Myc的作用表现出强协同效应(表14)。有关iPS细胞集落数相对总集落数的比率，当使用五种基因——Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28时，达到极高的比率(84.7％)。以上结果清晰显示，为提高诱导人iPS细胞的效率，五种基因——Sox2、Oct3/4、Klf4、L-Myc和Lin28的组合将极其有效。

[0167]实施例27：Myc嵌合基因和突变基因在人iPS细胞诱导中的效应

如下构建图45中所示多种嵌合基因(Ms-cL-Myc、Ms-Lc-Myc、Ms-cLc-Myc、Ms-LcL-Myc、Ms-ccL-Myc、Ms-cLL-Myc、Ms-LLc-Myc、Ms-Lcc-Myc)和Myc点突变基因(c-MycW135E、c-MycV394D、c-MycL420P、L-MycW96E、L-MycV325D、L-MycL351P)：首先，将小鼠c-Myc(Ms-c-Myc)和L-Myc(Ms-L-Myc)分别插入pENTR-D-TOPO(Invitrogen)中，以制备pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc和pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc。其次，基于小鼠c-Myc(NCBI Acc.No.NM_010849)和L-Myc(NCBI Acc.No.NM_008506)的序列信息，制备图45中所示用于引入点突变的引物，并通过用pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc和pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc作为模板进行PCR。通过测序确认各突变后，通过LR反应将其亚克隆于pMX逆转录病毒载体中。有关图45中所示嵌合Myc，通过PCR扩增各片段，根据各组合使用混合物作为模板进行PCR，并如上所述将其亚克隆于pMX逆转录病毒载体中。

[0168]将得到的以上各逆转录病毒载体和在实施例25中使用的Sox2、Oct3/4和Klf4的各逆转录病毒载体如同实施例25导入成年皮肤衍生成纤维细胞(aHDF-Slc7a1)中，并在逆转录病毒感染后，对第31天形成的总集落数和hiPS集落数进行计数。结果显示于图46和表15(图46是表15的图像)。

[0169]表15

[0170]人和小鼠的c-Myc和L-Myc在氨基酸水平上的同一性接近100％。因为如图46和表15中所示，用人基因(c-Myc和L-Myc)产生的人iPS细胞集落，也在使用小鼠基因(Ms-c-Myc和Ms-L-Myc)时如此，证实小鼠c-Myc和L-Myc与人c-Myc和L-Myc具有基本上相同的功能。

[0171]比较多种Myc嵌合基因和点突变基因与野生型基因的结果的结果，当使用Ms-cL-Myc和Ms-cLc-Myc时，所述iPS细胞集落数相比野生型L-Myc(L-Myc)增加，且尤其当使用Ms-cL-Myc时得到最佳结果。此外，点突变基因的结果清晰显示，位于C-末端的一个氨基酸(c-Myc420P和L-MycL351P)对c-Myc和L-Myc均非常重要。以上结果提示，在人iPS细胞建立中Myc的重要的功能区域是c-Myc的N-末端的1/3部分、L-Myc的中段和c/L-Myc的C-末端部分。

工业实用性

[0172]本发明提供了产生安全的诱导性多能干细胞的方法及更有效产生诱导性多能干细胞的方法。

序列表

<110>Kyoto University

<120>核重编程方法

<130>A81342M

<150>61/001,108

<151>2007-10-31

<150>60/996,289

<151>2007-11-9

<150>12/213,035

<151>2008-06-13

<160>184

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOct3/4-S1165的引物

<400>1

gacaggggga ggggaggagc tagg 24

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOct3/4-AS1283的引物

<400>2

cttccctcca accagttgcc ccaaac 26

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSox2-S1430的引物

<400>3

gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSox2-AS1555的引物

<400>4

ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4(Nanog)-macaca-968S的引物

<400>5

cagccccgat tcttccacca gtccc 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS的引物

<400>6

cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-U的引物

<400>7

cagatcctaa acagctcgca gaat 24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-L的引物

<400>8

gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-U的引物

<400>9

ctacaacgcc tacgagtcct aca 23

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-L的引物

<400>10

gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-S243的引物

<400>11

cttatgctac gtaaaggagc tggg 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-AS850的引物

<400>12

gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-S532的引物

<400>13

ggagccgcct gccctggaaa attc 24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-AS916的引物

<400>14

tttttcctga tattctattc ccat 24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-S85的引物

<400>15

ccgtccccgc aatctccttc catc 24

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-AS667的引物

<400>16

atgatgccaa catggctccc ggtg 24

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-S40的引物

<400>17

atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-AS259的引物

<100>18

actcagccat ggactggagc atcc 24

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-S3234的引物

<400>19

cctgctcaag ctgactcgac accgtg 26

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-AS3713的引物

<400>20

ggaaaagctg gccctggggt ggagc 25

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3PDH-F的引物

<400>21

accacagtcc atgccatcac 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3PDH-R的引物

<400>22

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOct3/4-S1165的引物

<400>23

gacaggggga ggggaggagc tagg 24

<210>24

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOct3/4-AS1283的引物

<400>24

cttccctcca accagttgcc ccaaac 26

<210>25

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSox2-S1430的引物

<400>25

gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSox2-AS1555的引物

<400>26

ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4(Nanog)-macaca-968S的引物

<400>27

cagccccgat tcttccacca gtccc 25

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS的引物

<400>28

cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25

<210>29

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-U的引物

<400>29

cagatcctaa acagctcgca gaat 24

<210>30

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-L的引物

<400>30

gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23

<210>31

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-U的引物

<400>31

ctacaacgcc tacgagtcct aca 23

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-L的引物

<400>32

gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24

<210>33

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-S243的引物

<400>33

cttatgctac gtaaaggagc tggg 24

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-AS850的引物

<400>34

gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24

<210>35

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-S532的引物

<400>35

ggagccgcct gccctggaaa attc 24

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-AS916的引物

<400>36

tttttcctga tattctattc ccat 24

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-S85的引物

<400>37

ccgtccccgc aatctccttc catc 24

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-AS667的引物

<400>38

atgatgccaa catggctccc ggtg 24

<210>39

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-S40的引物

<400>39

atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-AS259的引物

<400>40

actcagccat ggactggagc atcc 24

<210>41

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-S3234的引物

<400>41

cctgctcaag ctgactcgac accgtg 26

<210>42

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-AS3713的引物

<400>42

ggaaaagctg gccctggggt ggagc 25

<210>43

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3PDH-F的引物

<400>43

accacagtcc atgccatcac 20

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3PDH-R的引物

<400>44

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-S944的引物

<400>45

ccccagggcc ccattttggt acc 23

<210>46

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX2-S691的引物

<400>46

ggcacccctg gcatggctct tggctc 26

<210>47

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hKLF4-S1128的引物

<400>47

acgatcgtgg ccccggaaaa ggacc 25

<210>48

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-S1011的引物

<400>48

caacaaccga aaatgcacca gccccag 27

<210>49

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pMXs-AS3200的引物

<400>49

ttatcgtcga ccactgtgct gctg 24

<210>50

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pMXs-L3205的引物

<400>50

ccctttttct ggagactaaa taaa 24

<210>51

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-S1165的引物

<400>51

gacaggggga ggggaggagc tagg 24

<210>52

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-AS1283的引物

<400>52

cttccctcca accagttgcc ccaaac 26

<210>53

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX2-S1430的引物

<400>53

gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26

<210>54

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX2-AS1555的引物

<400>54

ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26

<210>55

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4-macaca-968S的引物

<400>55

cagccccgat tcttccacca gtccc 25

<210>56

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ECAT4-macaca-1334AS的引物

<400>56

cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25

<210>57

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-S243的引物

<400>57

cttatgctac gtaaaggagc tggg 24

<210>58

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGDF3-AS850的引物

<400>58

gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24

<210>59

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-U的引物

<400>59

cagatcctaa acagctcgca gaat 24

<210>60

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXI-RT-L的引物

<400>60

gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23

<210>61

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-U的引物

<400>61

ctacaacgcc tacgagtcct aca 23

<210>62

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFGF4-RT-L的引物

<400>62

gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24

<210>63

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-S40的引物

<400>63

atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24

<210>64

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hpH34-AS259的引物

<400>64

actcagccat ggactggagc atcc 24

<210>65

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-S532的引物

<400>65

ggagccgcct gccctggaaa attc 24

<210>66

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-1-AS916的引物

<400>66

tttttcctga tattctattc ccat 24

<210>67

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-S85的引物

<400>67

ccgtccccgc aatctccttc catc 24

<210>68

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hECAT15-2-AS667的引物

<400>68

atgatgccaa catggctccc ggtg 24

<210>69

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-S3234的引物

<400>69

cctgctcaag ctgactcgac accgtg 26

<210>70

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTERT-AS3713的引物

<400>70

ggaaaagctg gccctggggt ggagc 25

<210>71

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hKLF4-AS1826的引物

<400>71

tgattgtagt gctttctggc tgggctcc 28

<210>71

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-S253的引物

<400>72

gcgtcctggg aagggagatc cggagc 26

<210>73

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-AS555的引物

<400>73

ttgaggggca tcgtcgcggg aggctg 26

<210>74

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMSX1-S665的引物

<400>74

cgagaggacc ccgtggatgc agag 24

<210>75

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMSX1-AS938的引物

<400>75

ggcggccatc ttcagcttct ccag 24

<210>76

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hBRACHYURY-S1292的引物

<400>76

gccctctccc tcccctccac gcacag 26

<210>77

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hBRACHYURY-AS1540的引物

<400>77

cggcgccgtt gctcacagac cacagg 26

<210>78

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGFAP-S1040的引物

<400>78

ggcccgccac ttgcaggagt accagg 26

<210>79

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hGFAP-AS1342的引物

<400>79

cttctgctcg ggcccctcat gagacg 26

<210>80

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPAX6-S1206的引物

<400>80

acccattatc cagatgtgtt tgcccgag 28

<210>81

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hPAX6-AS1497的引物

<400>81

atggtgaagc tgggcatagg cggcag 26

<210>82

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFOXA2-S208的引物

<400>82

tgggagcggt gaagatggaa gggcac 26

<210>83

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hFOXA2-AS398的引物

<400>83

tcatgccagc gcccacgtac gacgac 26

<210>84

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX17-S423的引物

<400>84

cgctttcatg gtgtgggcta aggacg 26

<210>85

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX17-AS583的引物

<400>85

tagttggggt ggtcctgcat gtgctg 26

<210>86

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hAADC-S1378的引物

<400>86

cgccaggatc cccgctttga aatctg 26

<210>87

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hAADC-AS1594的引物

<400>87

tcggccgcca gctctttgat gtgttc 26

<210>88

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hChAT-S1360的引物

<400>88

ggaggcgtgg agctcagcga cacc 24

<210>89

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hChAT-AS1592的引物

<400>89

cggggagctc gctgacggag tctg 24

<210>90

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMAP2-S5401的引物

<400>90

caggtggcgg acgtgtgaaa attgagagtg 30

<210>91

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMAP2-AS5587的引物

<400>91

cacgctggat ctgcctgggg actgtg 26

<210>92

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hDAT-S 1935的引物

<400>92

acagagggga ggtgcgccag ttcacg 26

<210>93

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hDAT-AS2207的引物

<400>93

acggggtgga cctcgctgca cagatc 26

<210>94

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hLMX1B-S770的引物

<400>94

ggcaccagca gcagcaggag cagcag 26

<210>95

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hLMXIB-AS1020的引物

<400>95

ccacgtctga ggagccgagg aagcag 26

<210>96

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYL2A-S258的引物

<400>96

gggccccatc aacttcaccg tcttcc 26

<210>97

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYL2A-AS468的引物

<400>97

tgtagtcgat gttccccgcc aggtcc 26

<210>98

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTnTc-S524的引物

<400>98

atgagcggga gaaggagcgg cagaac 26

<210>99

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hTnTc-AS730的引物

<400>99

tcaatggcca gcaccttcct cctctc 26

<210>100

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMEF2C-S1407的引物

<400>100

tttaacaccg ccagcgctct tcaccttg 28

<210>101

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMEF2C-AS1618的引物

<400>101

tcgtggcgcg tgtgttgtgg gtatctcg 28

<210>102

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYHCB-S5582的引物

<400>102

ctggaggccg agcagaagcg caacg 25

<210>103

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYHCB-AS5815的引物

<400>103

gtccgcccgc tcctctgcct catcc 25

<210>104

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>dT20的引物

<400>104

tttttttttt tttttttttt 20

<210>105

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-S857的引物

<400>105

gccacagcaa acctcctcac agcccac 27

<210>106

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-AS1246的引物

<400>106

ctcgtcgttt ccgcaacaag tcctcttc 28

<210>107

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-S的引物

<400>107

caccatggcg ggacacctgg cttcag 26

<210>108

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-AS的引物

<400>108

acctcagttt gaatgcatgg gagagc 26

<210>109

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX2-S的引物

<400>109

caccatgtac aacatgatgg agacggagct g 31

<210>110

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hSOX2-AS的引物

<400>110

tcacatgtgt gagaggggca gtgtgc 26

<210>111

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hKLF4-S的引物

<400>111

caccatggct gtcagtgacg cgctgctccc 30

<210>112

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hKLF4-AS的引物

<400>112

ttaaaaatgt ctcttcatgt gtaaggcgag 30

<210>113

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-S的引物

<400>113

caccatgccc ctcaacgtta gcttcaccaa 30

<210>114

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hMYC-AS的引物

<400>114

tcacgcacaa gagttccgta gctgttcaag 30

<210>115

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Slc7a1-S的引物

<400>115

caccatgggc tgcaaaaacc tgctcgg 27

<210>116

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Slc7a1-AS的引物

<400>116

tcatttgcac tggtccaagt tgctgtc 27

<210>117

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREX1-pro5K-S的引物

<400>117

attgtcgacg gggatttggc agggtcacag gac 33

<210>118

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hREXx1-pro5K-AS的引物

<400>118

cccagatctc caatgccacc tcctcccaaa cg 32

<210>119

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-pro5K-S的引物

<400>119

cactcgaggt ggaggagctg agggcactgt gg 32

<210>120

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hOCT3/4-pro5K-AS的引物

<400>120

cacagatctg aaatgagggc ttgcgaaggg ac 32

<210>121

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehREX1-F1-S的引物

<400>121

ggtttaaaag ggtaaatgtg attatattta 30

<210>122

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehREX1-F1-AS的引物

<400>122

caaactacaa ccacccatca ac 22

<210>123

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehOCT3/4F2-S的引物

<400>123

gaggttggag tagaaggatt gttttggttt 30

<210>124

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehOCT3/4F2-AS的引物

<400>124

cccccctaac ccatcacctc caccacctaa 30

<210>125

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehNANOG-FI-S的引物

<400>125

tggttaggtt ggttttaaat ttttg 25

<210>126

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>mehNANOG-FI-AS的引物

<400>126

aacccaccct tataaattct caatta 26

<210>127

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox1的引物

<400>127

caccatgtac agcatgatga tggagaccga cct 33

<210>128

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox1的引物

<400>128

ctagatatgc gtcaggggca ccgtgc 26

<210>129

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox3的引物

<400>129

caccatgtac agcctgctgg agactgaact caag 34

<210>130

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox3的引物

<400>130

tcagatgtgg gtcagcggca ccgttccatt 30

<210>131

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox7的引物

<400>131

cacctcggcc atggcctcgc tgctggg 27

<210>132

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox7的引物

<400>132

ctccattcct ccagctctat gacacac 27

<210>133

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox15的引物

<400>133

caccatggcg ctgaccagct cctcacaa 28

<210>134

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox15的引物

<400>134

ttaaaggtgg gttactggca tggg 24

<210>135

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox17的引物

<400>135

caccagagcc atgagcagcc cggatg 26

<210>136

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox17的引物

<400>136

cgtcaaatgt cggggtagtt gcaata 26

<210>137

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox18的引物

<400>137

caccatgcag agatcgccgc ccggctacg 29

<210>138

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sox18的引物

<400>138

ctagcctgag atgcaagcac tgtaatagac 30

<210>139

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct1的引物

<400>139

caccatgaat aatccatcag aaaccaat 28

<210>140

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct1的引物

<400>140

gctctgcact cagctcactg tgcc 24

<210>141

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct6的引物

<400>141

caccatggcc accaccgcgc agtatctg 28

<210>142

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Oct6的引物

<400>142

ggaacccagt ccgcagggtc actg 24

<210>143

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf1的引物

<400>143

caccatgagg cagaagagag agaggaggc 29

<210>144

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf1的引物

<400>144

tcagaggtga cgcttcatgt gcagagctaa 30

<210>145

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf2的引物

<400>145

caccatggcg ctcagcgagc ctatcttgcc 30

<210>146

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf2的引物

<400>146

ctacatatgt cgcttcatgt gcaaggccag 30

<210>147

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf5的引物

<400>147

caccatgccc acgcgggtgc tgaccatg 28

<210>148

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Klf5的引物

<400>148

tcgctcagtt ctggtggcgc ttca 24

<210>149

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>L-MycWT的引物

<400>149

caccatggac ttcgactcgt atcagcacta tttc 34

<210>150

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>L-MycWT的引物

<400>150

ttagtagcca ctgaggtacg cgattctctt 30

<210>151

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>N-MycWT的引物

<400>151

caccatgccc agctgcaccg cgtccaccat 30

<210>152

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>N-MycWT的引物

<400>152

ttagcaagtc cgagcgtgtt cgatct 26

<210>153

<211>1320

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1320)

<223>

<400>153

atg ccc ctc aac gtg aac ttc acc aac agg aac tat gac ctc gac tac 48

Met Pro Leu Asn Val Asn Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr

1 5 10 15

gac tcc gta cag ccc tat ttc atc tgc gac gag gaa gag aat ttc tat 96

Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Ile Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr

20 25 30

cac cag caa cag cag agc gag ctg cag ccg ccc gcg ccc agt gag gat 144

His Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp

35 40 45

atc tgg aag aaa ttc gag ctg ctt ccc acc ccg ccc ctg tcc ccg agc 192

Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser

50 55 60

cgc cgc tcc ggg ctc tgc tct cca tcc tat gtt gcg gtc gct acg tcc 240

Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Ala Thr Ser

65 70 75 80

ttc tcc cca agg gaa gac gat gac ggc ggc ggt ggc aac ttc tcc acc 288

Phe Ser Pro Arg Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr

85 90 95

gcc gat cag ctg gag atg atg acc gag tta ctt gga gga gac atg gtg 336

Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val

100 105 110

aac cag agc ttc atc tgc gat cct gac gac gag acc ttc atc aag aac 384

Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn

115 120 125

atc atc atc cag gac tgt atg tgg agc ggt ttc tca gcc gct gcc aag 432

Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys

130 135 140

ctg gtc tcg gag aag ctg gcc tcc tac cag gct gcg cgc aaa gac agc 480

Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser

145 150 155 160

acc agc ctg agc ccc gcc cgc ggg cac agc gtc tgc tcc acc tcc agc 528

Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser

165 170 175

ctg tac ctg cag gac ctc acc gcc gcc gcg tcc gag tgc att gac ccc 576

Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro

180 185 190

tca gtg gtc ttt ccc tac ccg ctc aac gac agc agc tcg ccc aaa tcc 624

Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser

195 200 205

tgt acc tcg tcc gat tcc acg gcc ttc tct cct tcc tcg gac tcg ctg 672

Cys Thr Ser Ser Asp Ser Thr Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu

210 215 220

ctg tcc tcc gag tcc tcc cca cgg gcc agc cct gag ccc cta gtg ctg 720

Leu Ser Ser Glu Ser Ser Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu

225 230 235 240

cat gag gag aca ccg ccc acc acc agc agc gac tct gaa gaa gag caa 768

His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln

245 250 255

gaa gat gag gaa gaa att gat gtg gtg tct gtg gag aag agg caa acc 816

Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Thr

260 265 270

cct gcc aag agg tcg gag tcg ggc tca tct cca tcc cga ggc cac agc 864

Pro Ala Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Ser Pro Ser Arg Gly His Ser

275 280 285

aaa cct ccg cac agc cca ctg gtc ctc aag agg tgc cac gtc tcc act 912

Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr

290 295 300

cac cag cac aac tac gcc gca ccc ccc tcc aca agg aag gac tat cca 960

His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro

305 310 315 320

gct gcc aag agg gcc aag ttg gac agt ggc agg gtc ctg aag cag atc 1008

Ala Ala Lys Arg Ala Lys Leu Asp Ser Gly Arg Val Leu Lys Gln Ile

325 330 335

agc aac aac cgc aag tgc tcc agc ccc agg tcc tca gac acg gag gaa 1056

Ser Asn Asn Arg Lys Cys Ser Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu

340 345 350

aac gac aag agg cgg aca cac aac gtc ttg gaa cgt cag agg agg aac 1104

Asn Asp Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn

355 360 365

gag ctg aag cgc agc ttt ttt gcc ctg cgt gac cag atc cct gaa ttg 1152

Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu

370 375 380

gaa aac aac gaa aag gcc ccc aag gta gtg atc ctc aaa aaa gcc acc 1200

Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr

385 390 395 400

gcc tac atc ctg tcc att caa gca gac gag cac aag ctc acc tct gaa 1248

Ala Tyr Ile Leu Ser Ile Gln Ala Asp Glu His Lys Leu Thr Ser Glu

405 410 415

aag gac tta ttg agg aaa cga cga gaa cag ttg aaa cac aaa ctc gaa 1296

Lys Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu

420 425 430

cag ctt cga aac tct ggt gca taa 1320

Gln Leu Arg Asn Ser Gly Ala

435

<210>154

<211>439

<212>PRT

<213>小鼠

<400>154

Met Pro Leu Asn Val Asn Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Ile Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr

20 25 30

His Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp

35 40 45

Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser

50 55 60

Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Ala Thr Ser

65 70 75 80

Phe Ser Pro Arg Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr

85 90 95

Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val

100 105 110

Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn

115 120 125

Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys

130 135 140

Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser

145 150 155 160

Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser

165 170 175

Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro

180 185 190

Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser

195 200 205

Cys Thr Ser Ser Asp Ser Thr Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu

210 215 220

Leu Ser Ser Glu Ser Ser Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu

225 230 235 240

His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln

245 250 255

Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Thr

260 265 270

Pro Ala Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Ser Pro Ser Arg Gly His Ser

275 280 285

Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr

290 295 300

His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro

305 310 315 320

Ala Ala Lys Arg Ala Lys Leu Asp Ser Gly Arg Val Leu Lys Gln Ile

325 330 335

Ser Asn Asn Arg Lys Cys Ser Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu

340 345 350

Asn Asp Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn

355 360 365

Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu

370 375 380

Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr

385 390 395 400

Ala Tyr Ile Leu Ser Ile Gln Ala Asp Glu His Lys Leu Thr Ser Glu

405 410 415

Lys Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu

420 425 430

Gln Leu Arg Asn Ser Gly Ala

435

<210>155

<211>1107

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1107)

<223>

<400>155

atg gac ttc gac tcg tat cag cac tat ttc tac gac tat gac tgc gga 48

Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly

1 5 10 15

gag gat ttc tac cgc tcc acg gcg ccc agc gag gac atc tgg aag aaa 96

Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys

20 25 30

ttc gag ctg gtg ccg tcg ccc ccc acg tcg ccg ccc tgg ggc tcc ggt 144

Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly

35 40 45

ccc ggc gcc gtg gac cca gcc tct ggg att aat ccc ggg gag ccg tgg 192

Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp

50 55 60

cct gga ggg ggt gcc ggg gac gag gcg gaa tct cgg ggc cat tcg aaa 240

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys

65 70 75 80

gcc tgg ggc agg aat tat gct tcc atc att cgc cgt gac tgc atg tgg 288

Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp

85 90 95

agc ggc ttc tcc gcc cga gaa cgg ctg gag aga gtg gtg agc gac agg 336

Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg

100 105 110

ctg gcc cca ggc gcg ccc cgg ggg aac ccg ccc aaa gcg ccc gct acc 384

Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr

115 120 125

ccg gac ggc act cct agt ctg gaa gcc agt aac ccg gcg ccc gcc acc 432

Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr

130 135 140

caa tgt cag ctg ggc gag ccc aag act cag gcc tgc tcc ggg tcc gag 480

Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu

145 150 155 160

agc ccc agc gat tct gaa ggt gaa gag att gac gtg gtg acc gtg gag 528

Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu

165 170 175

aag agg cga tct ctg gac atc cga aag cca gtc acc atc acg gtg cga 576

Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg

180 185 190

gca gac ccc ctg gac ccc tgc atg aag cac ttc cat atc tct atc cac 624

Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His

195 200 205

caa cag cag cat aac tat gct gcc cgt ttt cct cca gaa agt tgc tct 672

Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser

210 215 220

caa gag ggg gat cct gag cca ggt ccc cag gaa gag gct ccg gag ata 720

Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile

225 230 235 240

gaa gct ccc aag gag aaa gag gag gag gaa gag gaa gag gag gaa gaa 768

Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

245 250 255

gag att gtg agc ccc cca cct gtc gga agt gag gct ccc cag tcc tgc 816

Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys

260 265 270

cac ccc aaa cct gtc agt tct gac act gag gac gtg acc aag agg aag 864

His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys

275 280 285

aac cat aac ttc ttg gaa cga aaa agg agg aat gac ctc cgc tcc cgg 912

Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg

290 295 300

ttc cta gcc ctg cgg gac cag gtt ccc acc ctg gcc agc tgc tct aag 960

Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys

305 310 315 320

gcc ccc aaa gtc gtg atc ctc agc aag gcg tta gaa tac ttg cag gct 1008

Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala

325 330 335

ttg gtg ggg gct gaa aag aaa atg gct aca gag aaa agg cag ctc cgg 1056

Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg

340 345 350

tgt cgg caa cag caa ctg caa aag aga atc gcg tac ctc agt ggc tac 1104

Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr

355 360 365

taa 1107

<210>156

<211>368

<212>PRT

<213>小鼠

<400>156

Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly

1 5 10 15

Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys

20 25 30

Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly

35 40 45

Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp

50 55 60

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys

65 70 75 80

Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp

85 90 95

Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg

100 105 110

Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr

115 120 125

Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr

130 135 140

Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu

145 150 155 160

Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu

165 170 175

Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg

180 185 190

Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His

195 200 205

Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser

210 215 220

Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile

225 230 235 240

Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

245 250 255

Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys

260 265 270

His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys

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275 280 285

aac cat aac ttc ttg gaa cga aaa agg agg aat gac ctc cgc tcc cgg 912

Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg

290 295 300

ttc cta gcc ctg cgg gac cag gtt ccc acc ctg gcc agc tgc tct aag 960

Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys

305 310 315 320

gcc ccc aaa gtc gac atc ctc agc aag gcg tta gaa tac ttg cag gct 1008

Ala Pro Lys Val Asp Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala

325 330 335

ttg gtg ggg gct gaa aag aaa atg gct aca gag aaa agg cag ctc cgg 1056

Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg

340 345 350

tgt cgg caa cag caa ctg caa aag aga atc gcg tac ctc agt ggc tac 1104

Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr

355 360 365

taa 1107

<210>182

<211>368

<212>PRT

<213>小鼠

<400>182

Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly

1 5 10 15

Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys

20 25 30

Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly

35 40 45

Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp

50 55 60

Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys

65 70 75 80

Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp

85 90 95

Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg

100 105 110

Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr

115 120 125

Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr

130 135 140

Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu

145 150 155 160

Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu

165 170 175

Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg

180 185 190

Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His

195 200 205

Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser

210 215 220

Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile

225 230 235 240

Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

245 250 255

Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys

260 265 270

His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys

275 280 285

Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg

290 295 300

Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys

305 310 315 320

Ala Pro Lys Val Asp Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala

325 330 335

Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg

340 345 350

Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr

355 360 365

<210>183

<211>1107

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1107)

<223>

<400>183

atg gac ttc gac tcg tat cag cac tat ttc tac gac tat gac tgc gga 48

Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly

1 5 10 15

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Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys

20 25 30

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Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly

35 40 45

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Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp

50 55 60

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Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys

65 70 75 80

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Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp

85 90 95

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Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg

100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr

355 360 365

taa 1107

<210>184

<211>368

<212>PRT

<213>小鼠

<400>184

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1 5 10 15

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20 25 30

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180 185 190

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210 215 220

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340 345 350

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355 360 365

Claims

1.由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将Oct家族基因、Klf家族基因和Sox家族基因这三种基因这三种基因导入体细胞的步骤。

2.权利要求1的方法，包括下述步骤：在将Oct家族基因、Klf家族基因这三种基因和Sox家族基因导入体细胞后，培养所述细胞足够长的时间，从而使所述细胞获得多能性并增殖。

3.权利要求1的方法，包括将Oct3/4、Klf4和Sox2这三种基因导入体细胞的步骤。

4.权利要求1-3中任一项的方法，包括分别用含有Oct家族基因的病毒载体、含有Klf家族基因的病毒载体和含有Sox家族基因的病毒载体转染各自的包装细胞，并培养所述细胞，以获得三种培养上清液的步骤；及制备通过上述步骤得到的三种培养上清液的混合物，并使用所述混合物重编程体细胞的步骤。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述诱导性多能干细胞通过无药物筛选而产生。

6.由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将Oct家族基因和Sox家族基因这两种基因的组合或Oct家族基因和Klf家族基因这两种基因的组合，及选自L-Myc、Sall1和Sall4这三种基因中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

7.权利要求6的方法，包括将Oct3/4和Sox2这两种基因的组合或Oct3/4和Klf4这两种基因的组合，及选自L-Myc、Sall1和Sall4这三种基因中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

8.由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将Oc t家族基因、Sox家族基因和Klf家族基因这三种基因的组合，及选自L-Myc、Sall1和Sall4这三种基因中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

9.权利要求8的方法，包括将Oct3/4、Sox2和Klf4这三种基因的组合，及选自L-Myc、Sall1和Sall4这三种基因中的至少一种基因导入体细胞的步骤。

10.权利要求6-9中任一项的方法，包括除上述基因外，将下列基因：Lin28和/或Nanog导入体细胞的步骤。

11.权利要求10的方法，包括将Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和Lin28导入体细胞的步骤。

12.产生诱导性多能干细胞的方法，其中分化诱导后所得细胞或组织中的肿瘤发展基本被降低或消除，包括在权利要求1-11中任一项之中定义的步骤。

13.由体细胞产生诱导性多能干细胞的方法，包括将Oct家族基因、Klf家族基因、Sox家族基因、Myc家族基因、Lin28和Nanog这六种基因导入体细胞的步骤。

14.权利要求13的方法，包括将Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28和Nanog这六种基因导入体细胞的步骤。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述体细胞是哺乳动物体细胞，所述哺乳动物包括人。

16.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述体细胞是人体细胞。

17.由权利要求1-16中任一项定义的方法可得到的诱导性多能干细胞。

18.从权利要求17的诱导性多能干细胞经分化诱导而得的体细胞。

19.组织、器官、体液或个体，它们是权利要求18的体细胞的群体。