JP5349294B2 - 核初期化方法 - Google Patents

Description

本発明は分化した体細胞を初期化して人工多能性幹細胞を製造する方法に関するものである。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）はヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま長期にわたって培養することができるという特徴を有している。この性質を利用してヒトＥＳ細胞はパーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法の資源として期待されている。しかしながら、ＥＳ細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。

患者自身の分化体細胞を利用して脱分化を誘導し、ＥＳ細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（この細胞を本明細書において「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」と呼ぶが、この細胞は「誘導多能性幹細胞」、「胚性幹細胞様細胞」、又は「ＥＳ様細胞」と呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待される。最近、このｉＰＳ細胞をマウス及びヒトの体細胞から製造できることが報告され、極めて大きな反響を呼んでいる（国際公開ＷＯ２００７／６９６６６；Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）。

上記の方法は複数の特定因子（Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６ではＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの４因子が用いられている）を体細胞に導入して初期化を行う工程を含んでおり、因子の導入にはレトロウイルスベクターが用いられている。しかしながら、ｃ−Ｍｙｃはがん関連転写因子であり、ｃ−Ｍｙｃを含む上記の４因子を体細胞に導入して初期化を行った場合には、得られた人工多能性幹細胞から分化誘導した細胞や組織が腫瘍化する可能性も否定できない。レトロウイルスベクターを用いてＥＳ細胞に遺伝子を導入すると遺伝子がサイレンシングを受けることが知られており、レトロウイルスベクターを用いて作製された上記のｉＰＳ細胞においても導入した遺伝子がサイレンシングを受けていることが確認されているが（国際公開ＷＯ２００７／６９６６６の実施例７）、導入した外因性のｃ−Ｍｙｃが子孫の個体においても発現しない保障はない。ｃ−Ｍｙｃを用いずにＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇの４因子で核初期化を行う方法がトムソンらにより提案されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７；国際公開ＷＯ２００８／１１８８２０）。しかしながらｉＰＳ細胞の研究開発は、世界的に見ても、依然としてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの４因子主体で進められているのが現状である。

なお、上記国際公開ＷＯ２００７／６９６６６にはＭｙｃファミリー遺伝子を用いずにサイトカインで置き換えることができることが教示されており、上記公報の実施例５には、ｃ−Ｍｙｃに換えて塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を用いることにより核初期化が可能になることが具体的に示されている。また、上記の国際公開には初期化因子の候補として選択された２４種類の遺伝子のなかにＳａｌｌ４が含まれることが示されているものの（表４のＮｏ．１３）、Ｓａｌｌ４が核初期化活性を有することは示されていない。また、Ｍｙｃファミリー遺伝子の一つであるＬ−Ｍｙｃ又はＮ−ＭｙｃをＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４と組合わせることによりｃ−Ｍｙｃと同程度の効率でｉＰＳ細胞を樹立できることが示されている（実施例の例６）。
国際公開ＷＯ２００７／６９６６６ 国際公開ＷＯ２００８／１１８８２０ Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６ Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７

本発明の課題は、安全な人工多能性幹細胞を製造する方法を提供することにある。より具体的には、人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる細胞や組織において腫瘍化の懸念のない安全な人工多能性幹細胞を提供することが本発明の課題である。
また、本発明の別の課題は、人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法を提供することにある。
本発明の特に好ましい課題は、上記の安全な人工多能性幹細胞を効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ｃ−Ｍｙｃを用いることなく安全な人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。
また、本発明者らは、ｃ−Ｍｙｃを用いることなく、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、又はＳａｌｌ４を用いて核初期化を行うことにより、分化誘導して得られる細胞や組織において腫瘍化の懸念のない安全な人工多能性幹細胞を提供できること、及びこの方法により極めて効率的に安全な人工多能性幹細胞を製造できることを見出した。
本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明により、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。

この方法の好ましい態様によれば、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含む方法が提供される。
この方法の別の好ましい態様によれば、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２を体細胞に導入する工程を含む方法；及び下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含む方法が提供される。

また、この方法のさらに別の好ましい態様によれば、Ｏｃｔファミリー遺伝子を含むウイルスイベクター、Ｋｌｆファミリー遺伝子を含むウイルスベクター、及びＳｏｘファミリー遺伝子を含むウイルスベクターをそれぞれ別のパッケージング細胞にトランスフェクトして該細胞を培養することにより３種類の培養上清を得る工程、及び上記工程により得られた３種類の培養上清の混合物を調製し、該混合物を用いて体細胞の初期化を行う工程を含む上記の方法が提供される。
さらに、この方法の別の好ましい態様により、薬剤選択を行わずに体細胞の初期化を行う工程を含む上記の方法が提供される。

上記の方法において、上記の遺伝子導入を必要に応じてサイトカインの非存在下又は存在下に行うことができ、好ましくはサイトカインの非存在下に行うことができる。また、上記の培養を必要に応じてサイトカインの非存在下又は存在下に行うことができ、好ましくはサイトカインの非存在下に行うことができる。

この発明により提供される人工多能性幹細胞は、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除されている。従って、さらに本発明により、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子、好ましくはＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。

別の観点からは、本発明により、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ又は下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせと、下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４とを体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。

上記の発明の好ましい態様によれば、下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２の組み合わせ又は下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４及びＫｌｆ４の組み合わせと、下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４とを体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。上記の遺伝子に加えて下記の遺伝子：Ｌｉｎ２８及び／又はＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含む方法も好ましい態様であり、Ｌｉｎ２８を体細胞に導入する工程を含む方法がより好ましい態様である。上記の方法において、所望によりｃ−Ｍｙｃを適宜組合わせて用いることも可能である。

上記の発明のさらに好ましい態様によれば、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、好ましくはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４の組み合わせと、下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４とを体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。

より具体的には、下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の５種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の５種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ４、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含む上記の方法；下記の５種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程を含む上記の方法；及び下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。
Ｌ−Ｍｙｃを用いる場合には、体細胞がヒト体細胞であることが好ましい。
上記のいずれかの方法において、さらにＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程を含む方法も本発明により提供され、好ましい態様としてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程を含む上記の方法が提供される。

この発明により提供される人工多能性幹細胞は、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除されている。従って、さらに本発明により、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生が実質的に低減ないし排除された人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子、好ましくはＯｃｔ３／４及びＳｏｘ２と、下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４とを体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。この方法において、さらにＫｌｆファミリー遺伝子、例えばＫｌｆ４を体細胞に導入する工程を含む方法も好ましい態様であり、さらにＫｌｆファミリー遺伝子とともに又はＫｌｆファミリー遺伝子に換えてＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程を含む方法も好ましい態様である。

さらに別の観点からは、本発明により、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇ、好ましくは下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。この方法において、ｃ−Ｍｙｃに換えて下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を用いることができ、この方法も好ましい態様である。

上記の各方法において、体細胞への上記遺伝子の導入を組換えベクターにより行うことができ、上記の各方法において定義される遺伝子の組み合わせから選ばれる少なくとも１種以上を含む組換えベクターを用いて体細胞に該遺伝子を導入することが好ましい。ベクターとしてはウイルスベクター又は非ウイルスベクターのいずれを用いてもよい。

さらに、上記の各発明において定義される遺伝子の組み合わせを含む核初期化因子が本発明により提供される。上記の組み合わせにさらにＴＥＲＴ遺伝子及び／又はＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子を組合わせることも好ましい。

また、上記の各発明において定義される遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子も本発明により提供され、上記の各発明において定義される遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含む核初期化因子を体細胞に接触させる工程を含む方法も本発明により提供される。好ましい態様として、体細胞の培養物中に上記の核初期化因子を添加する工程を含む上記の方法も提供される。

上記の各発明において、体細胞がヒトを含む哺乳類動物、好ましくは霊長類の体細胞、より好ましくはヒトの体細胞である上記の方法；体細胞がヒト胎児細胞又は成人ヒト由来の体細胞である上記の方法；体細胞が患者から採取した体細胞である上記の方法が提供される。

別の観点からは、上記の方法により得ることができる人工多能性幹細胞が本発明により提供される。また、上記の方法により得ることができる人工多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。分化誘導された体細胞の集団である組織、臓器、体液、及び個体も本発明により提供される。

さらに本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離採取した体細胞を用いて上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導し、得られた体細胞又はその集団である組織、臓器、若しくは体液を該患者に移植する工程を含む療法が提供される。
さらに本発明により、上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。

図１はヒト成人皮膚線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）から誘導されたｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色結果を示した図である。マウスレトロウイルス受容体（Ｓｌｃ７ａ１）をレンチウイルス感染により発現させたａｄｕｌｔ ＨＤＦ（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）に、左段に示した遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。「−」は、「Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ」の４遺伝子を導入したＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１細胞での染色結果を示す。写真の最右段及び右から第二段目は、遺伝子導入から１０日後に位相差で観察されたアルカリフォスファターゼ染色結果を示す。 図２は新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ）から誘導されたｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色結果を示した図である。マウスレトロウイルス受容体（Ｓｌｃ７ａ１）をレンチウイルス感染により発現させたＢＪ（ＢＪ−Ｓｌｃ７ａ１）に対して左段に示した遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。写真の右から第二段目は、遺伝子導入から１０日後に位相差で観察されたアルカリフォスファターゼ染色結果を示す。 図３はａｄｕｌｔ ＨＤＦ由来のｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ６）のＡＢＣＧ−２、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４の発現に関する免疫染色解析の結果、及び陰性対照としての２次抗体のみ（マウスＩｇＧ又はラットＩｇＭ）の染色結果を示した図である。写真は位相差像及びローダミン・フィルターを介した位相差像（それぞれ対物×１０）を示す。 図４はａｄｕｌｔ ＨＤＦ由来のｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ３、４、及び１２）及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するａｄｕｌｔ ＨＤＦ（ＨＤＦａ）のＡＢＣＧ−２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４の発現についての免疫染色の結果を示した図である。写真は位相差像及びローダミン・フィルターを介した位相差像（それぞれ対物×１０）を示す。 図５はａｄｕｌｔ ＨＤＦ由来のｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ１〜８、１１及び１２）、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１ヒト胚癌細胞（ＮＴＥＲＡ２）、及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するａｄｕｌｔ ＨＤＦ（ＨＤＦ）から単離されたＲＮＡを基に得られたｃＤＮＡにおける、ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＧＤＦ３、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ２、ＥＳＧ１、ｈＴＥＲＴ、及びＧ３ＰＤＨの各領域のＰＣＲ増幅結果を示した図である。 図６はＢＪ由来のｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＢＪＳｌｃ−９７Ｇ３、Ｇ５、Ｈ３、Ｈ５、Ｅ１〜１０、Ｅ１１、及びＥ１２）、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１ヒト胚癌細胞（ＮＴＥＲＡ２）、及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するＢＪ（ＢＪ−Ｓｌｃ７ａ１）から単離されたＲＮＡを基に得られたｃＤＮＡにおけるＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＧＤＦ３、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、ＥＳＧ１、ｈＴＥＲＴ、及びＧ３ＰＤＨの各領域のＰＣＲ増幅結果を示した図である。 図７はクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ１２を皮下注射し、５週間後のマウス及び該マウスから摘出された腫瘍を示した図（Ａ）、並びにクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ３（Ｂ）、クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ６（Ｃ）、及びクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ１２（Ｄ）のそれぞれを皮下注射したマウスから摘出された奇形腫由来組織のヘマトキシリン・エオジン染色結果を示した図である。 図８はヒトｉＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を示した免疫染色の図である。ヒトｉＰＳ様細胞をＨＥＭＡコートプレート上で７日間培養し、さらにゼラチンでコートしたディッシュ上で７日間培養した後に、細胞を集めて固定液（１０％フォルマリン含ＰＢＳ）で固定した。細胞に抗−α−平滑筋アクチン抗体（ａ−ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）、抗−βＩＩＩ−チューブリン抗体（ｂＩＩＩ−ｔｕｂｕｌｉｎ）、及び抗−α−フェトプロテイン抗体（ａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）を１次抗体として反応させ、さらに２次抗体を用いて免疫染色した。 図９はヒトＨＤＦへのレトロウイルスの遺伝子導入効率の改善結果を示した図である。ＨＤＦ又はマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現しているＨＤＦ（ＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１）にＧＦＰ ｃＤＮＡを含むｅｃｏｔｒｏｐｉｃ（Ｅｃｏ）又はａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ（Ａｍｐｈｏ）レトロウイルスを導入した。図の上部の写真は蛍光顕微鏡観察結果を示し（バーは１００μｍである）、図の下部のグラフはフローサイトメトリー結果を示す。 図１０はａｄｕｌｔ ＨＤＦからのｉＰＳ細胞の誘導結果を示した図である。ＡはｉＰＳ細胞樹立のタイムチャートを示す。ＢはＨＤＦの細胞形態画像、Ｃは非ＥＳ細胞様コロニーの典型的画像、ＤはヒトＥＳ細胞様コロニーの典型的画像、Ｅは樹立されたｉＰＳ細胞株の継代数６（クローン２０１Ｂ７）の細胞形態、Ｆは高い拡大率でのｉＰＳ細胞の画像、ＧはヒトｉＰＳ細胞コロニーの中心部の自発的に分化した細胞画像をそれぞれ示す。Ｈ〜Ｎは、それぞれＳＳＥＡ−１（Ｈ）、ＳＳＥＡ−３（Ｉ）、ＳＳＥＡ−４（Ｊ）、ＴＲＡ−１−６０（Ｋ）、ＴＲＡ−１−８１（Ｌ）、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ（Ｍ）、及びＮａｎｏｇ（Ｎ）の免疫組織染色による分析結果を示す。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）により染色された。各画像におけるバーは、２００μｍ（Ｂ〜Ｅ、Ｇ）、２０μｍ（Ｆ）、及び１００μｍ（Ｈ〜Ｎ）を示す。 図１１はヒトｉＰＳ細胞のフィーダー細胞依存性を示した図である。Ａはゼラチンコートされたプレート上に撒いたｉＰＳ細胞の画像を示す。Ｂはマトリゲルコートされたプレート上のＭＥＦ用の調整培地（ＭＥＦ−ＣＣＭ）中で培養したｉＰＳ細胞の画像を示す。Ｃはマトリゲルコートされたプレート上のヒトＥＳ用の非調整培地で培養したｉＰＳ細胞の画像を示す。 図１２はヒトｉＰＳ細胞におけるヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現について、ＥＳ細胞マーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示した図である。ＲＮＡを単離した細胞は、ｉＰＳ細胞クローン２０１Ｂ、ＥＳ細胞、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１ヒト胚癌細胞（ＮＴＥＲＡ２）、及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するａｄｕｌｔ ＨＤＦ（ＨＤＦ）である。 図１３はヒトｉＰＳ細胞におけるヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現について、ＥＳ細胞マーカー遺伝子のウェスタンブロット分析（Ａ）及びレトロウイルス導入遺伝子の発現の定量的ＰＣＲ結果（Ｂ）を示した図である。Ｂは３回の試験の平均値を示し、バーは標準偏差を示す。 図１４はヒトｉＰＳ細胞におけるヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現について、Ｏｃｔ３／４，ＲＥＸ１及びＮａｎｏｇのプロモーター領域のバイサルファイトゲノミックシークエンスの結果（Ａ）及びルシフェラーゼアッセイの結果（Ｂ）を示した図である。Ａにおいて、白丸及び黒丸は、非メチル化及びメチル化ＣｐＧｓを示す。Ｂは４回の試験の平均値を示し、バーは標準偏差を示す。 図１５は高レベルのテロメラーゼ活性及びヒトｉＰＳ細胞の指数関数的増殖を示した図である。Ａは熱処理により非活性化された（＋）サンプルを陰性対照として使用したＴＲＡＰ法によるテロメラーゼ活性の検出結果を示す（ＩＣは内部対照）。ＢはｉＰＳ細胞の増殖曲線を示し、４回の試験の平均値及び標準偏差を示した。 図１６はヒトｉＰＳ細胞の遺伝子分析結果を示した図である。Ａは全てのクローンの染色体中に４種全てのレトロウイルスが組み込まれている結果を示すゲノムＰＣＲの結果である。Ｂはｃ−Ｍｙｃ ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析の結果を示す。図中の星印は内因性ｃ−Ｍｙｃ対立遺伝子（２．７ｋｂ）を示し、矢印はＳＮＬフィーダー細胞に由来するマウスｃ−Ｍｙｃ対立遺伝子（９．８ｋｂ）を示す。 図１７はヒトｉＰＳ細胞の胚様体を介した分化を示した図である。Ａは８日目におけるｉＰＳ細胞の浮遊培養画像を示す。Ｂ〜Ｅは１６日目の分化した細胞（Ｂ）、ニューロン様細胞（Ｃ）、上皮細胞（Ｄ）、及び敷石様細胞（Ｅ）の画像をそれぞれ示す。Ｆ〜Ｋは、α−フェトプロテイン（Ｆ）、ビメンチン（Ｇ）、α−平滑筋アクチン（Ｈ）、デスミン（Ｉ）、βＩＩＩチューブリン（Ｊ）、及びＧＦＡＰ（Ｋ）の免疫組織化学分析の結果をそれぞれ示す。図中のバーは、２００μｍ（Ａ、Ｂ）及び１００μｍ（Ｃ〜Ｋ）を示す。Ｆ〜Ｋにおいて、核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）により染色した。Ｌは、３種の胚葉の様々な分化マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。 図１８はヒトｉＰＳ細胞の方向付けされた分化を示した図である。Ａは、ＰＡ６細胞上で１８日間培養した後の分化したｉＰＳ細胞の位相差画像である。Ｂは、βＩＩＩチューブリン（赤）及びチロシンヒドロキシダーゼ（緑）抗体によるＡに示した細胞の免疫組織化学分析の結果を示す。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（青）により染色した。Ｃは、ドーパミン作用性ニューロンマーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。Ｄは心筋細胞へ分化したｉＰＳ細胞の位相差画像である。Ｅは心筋細胞マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す。Ａ、Ｂ、及びＤの画像におけるバーは２００μｍ（Ａ、Ｄ）及び１００μｍ（Ｂ）である。 図１９はヒトｉＰＳ細胞から誘導された奇形腫を示した図である。ｉＰＳ細胞から誘導された奇形腫由来組織のヘマトキシリン・エオジン染色画像を示す（クローン２０１Ｂ７を使用）。 図２０は成人線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ、クローン２４３Ｈ１）及び新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ、クローン２４６Ｇ１）から樹立されたヒトｉＰＳ細胞の位相差画像である。各画像において、バーは２００μｍを示す。 図２１はＨＦＬＳ及びＢＪに由来するｉＰＳ細胞中のＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現を示した図である。 図２２はＨＦＬＳ及びＢＪから樹立されたｉＰＳ細胞から胚様体を介して分化した細胞を示す図である。α−平滑筋アクチン、βＩＩＩチューブリン、α−フェトプロテインの発現を免疫染色により確認した。 図２３はＮａｎｏｇレポーターマウス由来ＭＥＦからのｉＰＳ細胞の誘導におけるファミリー遺伝子及びｃ−Ｍｙｃを除外した場合の効果を示す図である。Ａは、ファミリー遺伝子を用いたＮａｎｏｇ選択によるＭＥＦからのｉＰＳ細胞の誘導結果を示す。グラフはＧＦＰ陽性コロニー数を示す。３回の独立した実験結果を異なる色（白、灰、及び黒）で示した。「４ｆａｃｔｏｒｓ」は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの組み合わせを示す。ＢはｉＰＳ細胞誘導におけるピューロマイシン選択のタイミングの影響を示しており、４遺伝子又はｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子の導入の２８日後に観察されたＧＦＰ陽性コロニーを示す。Ｃは全コロニーに対するＧＦＰ陽性コロニーの百分率に対するピューロマイシン選択のタイミングの影響を示す。 図２４はＭｙｃ、Ｋｌｆ、Ｓｏｘのファミリータンパク質を用いてＦｂｘ１５−レポーターマウス由来ＭＥＦから誘導されたｉＰＳ細胞に由来する奇形腫の組織像を示す図である。 図２５はｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）をレトロウイルスによりＮａｎｏｇ−レポーターマウス由来ＭＥＦに導入し樹立したｉＰＳ細胞の特徴を示す図である。ＥＳ細胞マーカー遺伝子及び４遺伝子の発現レベルを示すＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。特異的なプライマーセットを用いることにより、全転写産物、内在性遺伝子からの転写産物（ｅｎｄｏ）、及びレトロウイルスからの転写産物（Ｔｇ）を４遺伝子について区別した。 図２６はｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）をレトロウイルスによりＦｂｘ１５レポーターマウス由来ＭＥＦに導入し樹立したｉＰＳ細胞を誘導した結果、並びに導入したＧＦＰの発現結果を示す図である。Ａは、ｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）導入により樹立したｉＰＳ細胞の形態を示す。写真下のバーは５００μｍを示す。ＢはＥＳ、ＭＥＦ、及びｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）導入により樹立したｉＰＳ細胞におけるＥＳマーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる分析結果を示す。 図２７はｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）導入により樹立したｉＰＳ細胞（クローン１４２Ｂ−６及び１４２Ｂ−１２）に由来するキメラマウスを示す図である。 図２８は薬剤選択なしでｉＰＳ細胞を効率的に単離した結果を示す図である。ＡはＮａｎｏｇ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ^ｒレポーターを有するアダルトマウス由来のＴＴＦから誘導したｉＰＳ細胞の形態画像である。細胞にＤｓＲｅｄとともに４遺伝子又はｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子のいずれかを導入し、薬剤選択なしで３０日間培養した。Ｎａｎｏｇレポーター（Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ）及びＤｓＲｅｄレトロウイルス（Ｔｇ−ＤｓＲｅｄ）の発現は、蛍光顕微鏡によって確認した。バーは５００μｍを示す。Ｂは実際に活性なプロモーター（ＡＣＴＢ、β−アクチン遺伝子）により調節されるＤｓＲｅｄ導入遺伝子を含むが、Ｎａｎｏｇ又はＦｂｘ１５選択カセットを欠いているアダルトマウス由来ＴＴＦから誘導したｉＰＳ細胞の形態画像を示す。細胞はＧＦＰとともに４遺伝子又はｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子のいずれかを導入し、薬剤選択なしで３０日間培養した。ＧＦＰレトロウイルス（Ｔｇ−ＧＦＰ）の発現は、蛍光顕微鏡によって確認した。バーは５００μｍを示す。Ｃは薬剤選択なしでＴＴＦから誘導したｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞におけるＥＳマーカー遺伝子のＲＴ−ＰＣＲによる分析結果を示す。Ｄは薬剤選択又はｃ−Ｍｙｃレトロウイルスを用いずにアダルトのＴＴＦから誘導したｉＰＳ細胞に由来するキメラマウス画像である。 図２９はｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）導入によりヒトｉＰＳ細胞を誘導した結果を示す図である。Ａは樹立されたヒトｉＰＳ細胞（クローン２５３Ｇ及び２４６Ｈ）がヒトＥＳ細胞様形態を呈することを示す画像である。Ｂはｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）導入により樹立したｉＰＳ細胞（２５３Ｇ）、又はｃ−Ｍｙｃを含む４つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ）導入により樹立したｉＰＳ細胞（２５３Ｆ）を用いて樹立されたＨＤＦに由来するヒトｉＰＳ細胞におけるＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現結果を示す。 図３０はｃ−Ｍｙｃ以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４）を成人線維芽細胞（ＨＤＬ；２５３Ｇ）及び新生児包皮由来繊維芽細胞（ＢＪ；２４６Ｇ）導入により樹立されたヒトｉＰＳ細胞から胚様体を介して分化を誘導させた図である。α−平滑筋アクチン、βＩＩＩチューブリン、α−フェトプロテインの発現を免疫染色により確認した。 図３１は２９３ＦＴ細胞に６遺伝子（Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）、又は４遺伝子の２つの異なる組み合わせ（Ｙ４Ｆで表されるＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２；並びにＴ４Ｆで表されるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）を導入した後確認されるコロニーの数をグラフで示した図である。“ＥＳ−ｌｉｋｅ”はＥＳ細胞のコロニーと形態的に類似したコロニーの数を示し、“ｔｏｔａｌ”はＥＳ様コロニーと非ＥＳ様コロニーの数の総数を示す。Ｅｘｐ＃１、Ｅｘｐ＃２、Ｅｘｐ＃３、及びＥｘｐ＃４は、それぞれ個別に実験を行った結果を示す。縦軸はコロニー数を示す。 図３２はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて行った実験結果を示す。Ａは実験のタイムチャートを示す。Ｎａｎｏｇ ＧＦＰ^ｔｇ／−Ｆｂｘ１５^−／−マウスから得られた１．０ｘ１０^５個のＭＥＦ細胞を、ゼラチンコートした６ウェルプレートに撒いた。翌日、４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＳａｌｌ４；ＯＳＫＡ）又は３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２；ＯＳＫ）をＭＥＦにレトロウイルスを用いて導入した。感染から４日後に細胞をマイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞で被覆した６ウェルプレート上に１：２又は１：６の割合で再び撒いた。薬剤選択は１４日目又は２１日目に開始した。２８日目にＧＦＰ陽性細胞をカウントし、細胞をアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）及びクリスタルバイオレット（ＣＶ）で染色した。Ｂは３つの独立した実験（＃１、２、及び３）におけるＧＦＰ陽性コロニー数の総数を示す。Ｃは３つの独立した実験（＃１、２、及び３）におけるＧＦＰ陽性コロニーの百分率を示す。 図３３はヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）を用いて行った実験結果を示す。マウスレトロウイルス受容体ｓｌｃ７ａを発現する１．０ｘ１０^５個のａｄｕｌｔ ＨＤＦ細胞を６ウェルプレートに撒いた。翌日、図に示す各種遺伝子の組み合わせをレトロウイルスベクターにより細胞に導入した。感染の６日後に細胞を５．０ｘ１０^５個に調整し、この細胞を１．５ｘ１０^６個のマイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞で被覆した１００ｍｍプレート上に再び播いた。７日後に培地を４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充した霊長類用ＥＳ細胞培地に交換した。図は感染から３０日後のコロニー数を示す。 図３４はマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）にヒト由来の４遺伝子（Ｙ４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又は３遺伝子（Ｙ３Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４）と、マウスＳａｌｌ４（ｍＳａｌｌ４）若しくはマウスＳａｌｌ１（ｍＳａｌｌ１）又はその両方についてレトロウイルスベクターを用いて導入し、感染後３２日目（左側のバー）及び４０日目（右側のバー）に確認されたコロニーの数を示した図である。「＋Ｍｏｃｋ」は、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆに換えて空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「＋ｍＳａｌｌ４」はＹ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にＳａｌｌ４を導入した群、「＋ｍＳａｌｌ１」はＹ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ１を導入した群、「＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１」はＹ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４及びｍＳａｌｌ１の両方を同時に導入した群を示す。縦軸は１０ｃｍシャーレ上に確認されたヒトｉＰＳ細胞のコロニー数を示す。同じ実験を３回繰り返してグラフのバー上に各実験のコロニー数の総数を示した。 図３５はマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）にヒト由来の４遺伝子（Ｔ４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）又は３遺伝子（Ｔ３Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇ）と、マウスＳａｌｌ４（ｍＳａｌｌ４）若しくはマウスＳａｌｌ１（ｍＳａｌｌ１）又はその両方をレトロウイルスベクターを用いて導入し、感染後３２日目（左側のバー）及び４０日目（右側のバー）に確認されたコロニーの数を示した図である。「＋Ｍｏｃｋ」はＴ３Ｆ又はＴ４Ｆに換えて空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「＋ｍＳａｌｌ４」はＴ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４を導入した群、「＋ｍＳａｌｌ１」はＴ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ１を導入した群、「＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１」はＴ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４及びｍＳａｌｌ１の両方を同時に導入した群を示す。縦軸は１０ｃｍシャーレ上に確認されたヒトｉＰＳ細胞のコロニー数を示す。同じ実験を２回繰り返してグラフのバー上に各実験のコロニー数の総数を示した。 図３６はマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦ）にヒト由来の４遺伝子（Ｙ４Ｆ）又は３遺伝子（Ｙ３Ｆ）とヒトＳａｌｌ４（ｈＳａｌｌ４）とをレトロウイルスベクターを用いて導入し、感染性３２日目（左側のバー）及び４０日目（右側のバー）に確認されたコロニーの数を示した図である。「＋Ｍｏｃｋ」は、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆに換えて空ベクターであるレトロウイルスを感染させた群、「＋ｈＳａｌｌ４」はＹ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にｈＳａｌｌ４を導入した群を示す。縦軸は１０ｃｍシャーレ上に確認されたヒトｉＰＳ細胞のコロニー数を示す。同じ実験を２回又は３回繰り返してグラフのバー上に各実験のコロニー数の総数を示した。 図３７はＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２の３遺伝子に、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、又はＮ−Ｍｙｃ遺伝子を加えた計４遺伝子をレンチウイルスベクターを用いてマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）に導入し、樹立したヒトｉＰＳ細胞のコロニー数をカウントした結果を示したグラフである。各グラフ上の数値はコロニーの総数に対するｉＰＳ細胞のコロニー数の割合を示す。 図３８は４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４，Ｌ−Ｍｙｃ）をレンチウイルスベクターを用いてマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）に導入して樹立したヒトｉＰＳ細胞（３２Ｒ２，３２Ｒ６）が、三胚葉系への分化能を有することをα−平滑筋アクチン、αフェトプロテイン、及びβＩＩＩ−チューブリン抗体を用いた免疫染色により確認した結果を示す写真である。 図３９は４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）を導入して樹立したヒトｉＰＳ細胞（３２Ｒ６）をＳＣＩＤマウスの精巣内に注射して得られた奇形腫の組織染色像（ヘマトキシリン・エオジン染色）である。上段は左から神経組織、腸管様組織、及び軟骨組織の組織像を示す。下段は左から毛髪組織、脂肪組織、及び色素組織の組織像を示す。 図４０は３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）をレトロウイルスベクターを用いてＮａｎｏｇレポーターマウス由来ＭＥＦ（ＭＥＦ−Ｎｇ）に導入して得られたＧＦＰ陽性コロニー（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３）の形態を示す写真である。上段はＧＦＰ陽性コロニー像、下段は位相差像である。 図４１は図４０で示したＧＦＰ陽性コロニー（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３）由来のクローンについてＲＴ−ＰＣＲ及びＧｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲを行った結果を示した写真である。図中、「Ｔｏｔａｌ」は内在性及びレトロウイルス由来の遺伝子発現を示し、「Ｔｇ」はレトロウイルス由来の遺伝子発現を示し、「Ｇｅｎｏｍｅ」はゲノムＤＮＡ中に挿入されたレトロウイルス由来の遺伝子の存在を各遺伝子に特異的なプライマーで検出した結果を示す。写真右側の数字はＰＣＲのサイクル数を示す。図中、「ＲＦ８」はコントロールであるＥＳ細胞、「２０Ｄ１７」はＭＥＦ−Ｎｇに４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２）を導入して得られたｉＰＳ細胞（Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞；Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−３１７，２００７）、「１４２Ｅ−９」はＭＥＦ−Ｆｂｘに４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２）を導入して得られたｉＰＳ細胞（Ｆｂｘ−ｉＰＳ）を示し、これらの細胞について同様の実験を行った結果を示す。図中、「Ｐｌａｓｍｉｄ」は各遺伝子を含むプラスミド（ｐＭＸｓ−Ｓｏｘ２、ｐＭＸｓ−Ｏｃｔ３／４、ｐＭＸｓ−Ｋｌｆ４、ｐＭＸｓ−ｃ−Ｍｙｃ、及びｐＭＸｓ−Ｌ−Ｍｙｃ）を用いた結果を示す。 図４２は３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）を導入して樹立したマウスｉＰＳ細胞（４４３−３−３、４４３−３−６、４４３−３−１２、及び４４３−３−１３）が三胚葉系への分化能を有することを抗α−平滑筋アクチン抗体、抗α−フェトプロテイン抗体、及び抗βＩＩＩ−チューブリン抗体抗体を用いた染色により確認した結果を示した写真である。ＲＦ８はコントロールのマウスＥＳ細胞である。 図４３は３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）を導入して樹立したマウスｉＰＳ細胞（４４３−３−３、４４３−３−６、４４３−３−１２、及び４４３−３−１３）をヌードマウスの皮下に注射して得られた奇形腫の組織染色像（ヘマトキシリン・エオジン染色）である。上から神経組織、腸管様組織、筋肉組織、表皮組織、及び軟骨組織の組織像を示す。 図４４はＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２の３遺伝子にｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、及び／又はＬｉｎ２８遺伝子をレンチウイルスベクターーを用いてマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）に導入して樹立したヒトｉＰＳ細胞のコロニー数をカウントした結果を示したグラフである。黒棒は全コロニー数を示し、白棒はｉＰＳ細胞コロニー数を示す。 図４５は各種Ｍｙｃキメラ遺伝子及び変異遺伝子の構造を模式的に示した図である。Ｍｓ−ｃ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１５３及び１５４に示し、Ｍｓ−Ｌ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１５５及び１５６に示し、Ｍｓ−ｃＬ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１５７及び１５８に示し、Ｍｓ−Ｌｃ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１５９及び１６０に示し、Ｍｓ−ｃＬｃ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１６１及び１６２に示し、Ｍｓ−ＬｃＬ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１６３及び１６４に示し、Ｍｓ−ｃｃＬ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１６５及び１６６に示し、Ｍｓ−ｃＬＬ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１６７及び１６８に示し、Ｍｓ−ＬＬｃ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１６９及び１７０に示し、Ｍｓ−Ｌｃｃ−Ｍｙｃの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１７１及び１７２に示し、ｃ−ＭｙｃＷ１３５Ｅの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１７３及び１７４に示し、ｃ−ＭｙｃＶ３９４Ｄの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１７５及び１７６に示し、ｃ−ＭｙｃＬ４２０Ｐの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１７７及び１７８に示し、Ｌ−ＭｙｃＷ９６Ｅの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１７９及び１８０に示し、Ｌ−ＭｙｃＶ３２５Ｄの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１８１及び１８２に示し、Ｌ−ＭｙｃＬ３５１Ｐの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１８３及び１８４に示す。 図４６は各種Ｍｙｃキメラ遺伝子及び変異遺伝子をレンチウイルスベクターを用いてマウスレトロウイルス受容体Ｓｌｃ７ａを発現したヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）に導入して樹立したヒトｉＰＳ細胞のコロニー数をカウントした結果を示したグラフである。上から、ｉＰＳ細胞コロニー数、全コロニー数、及びｉＰＳ細胞コロニー数の全コロニー数に対する割合（％）をそれぞれ示す。

第一の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含むことを特徴としており、上記方法の好ましい態様では、下記の３種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり該細胞を培養する工程を含んでいる。

Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、及びＳｏｘファミリー遺伝子については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６にファミリー遺伝子の具体例が示されている。Ｏｃｔファミリー遺伝子としてはＯｃｔ３／４が好ましく、Ｋｌｆファミリー遺伝子としてはＫｌｆ４が好ましく、Ｓｏｘファミリー遺伝子としてはＳｏｘ２が好ましい。これらの遺伝子としては、野生型の遺伝子のほか、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子や、ファミリー遺伝子の適宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能、又は改善された機能を有する遺伝子なども利用可能である。

第二の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ又は下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせと、下記の３種の遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子：Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４とを体細胞に導入する工程を含むことを特徴としている。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４からなる群から選ばれる遺伝子は核初期化の効率を高める作用を有する核初期化因子であり、核初期化のために不可欠な核初期化因子（例えばＯｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、又はＯｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせなど）と組合わせて用いることにより、核初期化の効率を顕著に改善することができる。

より具体的には、上記の方法は、
（ａ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程；
（ｂ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｃ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｄ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｅ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｆ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ１及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｇ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＳｏｘファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；

（ｈ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程；
（ｉ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｊ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｋ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｌ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｍ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＳａｌｌ１及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；又は
（ｏ）下記の２種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子及びＫｌｆファミリー遺伝子の組み合わせ、並びにＬ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
を含んでいる。

また、上記の（ａ）ないし（ｇ）のいずれかの態様において、さらにＫｌｆファミリー遺伝子を体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。さらに上記の（ａ）ないし（ｏ）のいずれかの態様、または上記の（ａ）ないし（ｇ）のいずれかの態様にＫｌｆファミリー遺伝子を加えた態様において、Ｌｉｎファミリー遺伝子及び／又はＮａｎｏｇ、好ましくはＬｉｎ２８及び／又はＮａｎｏｇ、より好ましくはＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。さらに、所望によりｃ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。

Ｏｃｔファミリー遺伝子としてはＯｃｔ３／４が好ましく、Ｓｏｘファミリー遺伝子としてはＳｏｘ２が好ましく、Ｋｌｆファミリー遺伝子としてはＫｌｆ４が好ましい。またＬｉｎファミリー遺伝子としてはＬｉｎ２８およびＬｉｎ２８ｂが知られているが、Ｌｉｎ２８が好ましい。Ｌ−Ｍｙｃについては国際公開ＷＯ２００７／６９６６６の表１に記載されており、Ｓａｌｌ４については同国際公開の表４及び表５に記載されている。Ｓａｌｌ１はＥＳ細胞特異的発現遺伝子であり、かつｚｉｎｃフィンガー蛋白の一つとして知られており、腎臓の発生に関与していると考えられている。Ｓａｌｌ１のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿０２１３９０（マウス）及びＮＭ＿００２９６８（ヒト）である。またＬｉｎ２８のＮＣＢＩアクセッション番号はＮＭ＿１４５８３３（マウス）及びＮＭ＿０２４６７４（ヒト）である。

これらの遺伝子としては、野生型の遺伝子のほか、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子や、ファミリー遺伝子の適宜の組み合わせにより得られるキメラ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様の機能、又は改善された機能を有する遺伝子なども利用可能である。

例えば、Ｌ−Ｍｙｃ又はｃ−Ｍｙｃとしては野生型の遺伝子のほか、数個（例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）の塩基が置換、挿入、及び／又は欠失した変異遺伝子、又はキメラＭｙｃ遺伝子であって、野生型の遺伝子と同様か、又は改善された機能を有する遺伝子も利用可能である。Ｍｙｃ遺伝子について各種のＭｙｃキメラ遺伝子及びＭｙｃ点変異遺伝子の機能を具体的に解析する手法及び結果が明細書の実施例に具体的に示されているので、この解析手法を用いることにより、所望の改善された機能を有する変異ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、変異Ｌ−Ｍｙｃ遺伝子、又はキメラＭｙｃ遺伝子などを容易に選択して使用することができる。当該キメラＭｙｃ遺伝子の好ましい例としては、Ｍｓ−ｃＬ−Ｍｙｃ（配列番号：１５７及び１５８）及びＭｓ−ｃＬｃ−Ｍｙｃ（配列番号：１６１及び１６２）が挙げられ、より好ましくはＭｓ−ｃＬ−Ｍｙｃが挙げられる。

この方法の好ましい態様としては、上記の方法において
（ａ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程；
（ａ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程；
（ｂ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｂ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｃ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｃ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｄ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｄ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｅ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｅ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｆ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｆ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｇ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｇ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；

（ｈ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程；
（ｉ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｊ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｋ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ１を体細胞に導入する工程；
（ｌ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；
（ｍ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程；又は
（ｏ−１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＳａｌｌ４を体細胞に導入する工程
を含む方法を挙げることができる。

さらに、上記の方法において
（ａ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ａ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｂ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｂ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｃ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｃ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｄ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｄ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｅ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｅ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｆ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｆ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｇ−３）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｇ−４）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；

（ｈ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｉ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｊ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｋ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｌ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；
（ｍ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程；又は
（ｏ−２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＬｉｎ２８を体細胞に導入する工程
を含む方法も好ましい。

上記の各方法において、Ｌｉｎ２８とともに、又はＬｉｎ２８に換えてＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含む方法も好ましい。例えば、上記（ａ−４）の態様において、Ｌｉｎ２８とともにＮａｎｏｇを用いる態様、すなわちＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含む方法などが例示される。
また、上記の各方法において、Ｌ−Ｍｙｃとともに、又はＬ−Ｍｙｃに換えてＮ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含んでいてもよい。
さらに、上記の各方法において、必要に応じてｃ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含んでいてもよいが、分化誘導後に得られる細胞や組織において腫瘍の発生を実質的に低減ないし排除するためにはｃ−Ｍｙｃを体細胞に導入する工程を含まないほうが好ましい場合がある。

Ｌ−Ｍｙｃを含む態様については、核初期化すべき体細胞としてヒト体細胞を用いることが好ましい。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４の組み合わせ、又はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ（又はＬ−Ｍｙｃに換えてｃ−Ｍｙｃ）の組み合わせを含む場合には、Ｓａｌｌ４をさらに組合わせる場合、又はＳａｌｌ１及びＳａｌｌ４の両方をさらに組合わせる場合が好ましい。さらに、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の組み合わせを含む場合には、Ｓａｌｌ１をさらに組合わせる場合、又はＳａｌｌ１及びＳａｌｌ４の両方をさらに組合わせる場合が好ましい。これらの場合についても核初期化すべき体細胞としてヒト体細胞を用いることが好ましい。

第三の観点から提供される本発明の方法は、体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含むことを特徴としており、好ましくは下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇを体細胞に導入する工程を含んでいる。

上記の第一ないし第三の観点から提供される本発明の各方法において、「人工多能性幹細胞」とはＥＳ細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、未分化細胞であって多能性及び増殖能を有する細胞を包含するが、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。核初期化因子を用いて人工多能性幹細胞を調製する方法については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６及びＣｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７に具体的に説明されており、人工多能性幹細胞の分離手段についても上記公報に具体的に説明されている。

本発明の方法により初期化すべき「体細胞」とは、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞を除く全ての細胞を意味し、その種類は特に限定されない。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。好ましくはヒトを含む哺乳類動物由来の体細胞が用いられ、より好ましくはマウス由来の体細胞や霊長類由来の体細胞が用いられる。特に好ましくはヒト由来の体細胞を用いることができる。体細胞としては、具体的には（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、又は（３）リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞等の分化した細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、患者自身から分離した体細胞や、ＨＬＡ抗原の型が同一である他人から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。

上記遺伝子を体細胞に導入する方法は特に限定されないが、例えば、上記遺伝子を発現可能なベクターを用いることが一般的である。ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が国際公開ＷＯ２００７／６９６６６、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６及びＣｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７に開示されており、ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合についてはＳｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７に開示がある。また、非ウイルスベクターであるプラスミドを用いる場合については沖田らの論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ：Ｏｃｔｏｂｅｒ ９，２００８；１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６４２７０）に記載されているので、当業者はこれらのなかから適宜の手段を選択して採用することができる。ベクターを用いる場合には、ベクターに上記の遺伝子から選ばれる２種以上の遺伝子を組み込んでもよいが、１種類の遺伝子を組み込んだベクターを数種類用いてもよい。初期化すべき体細胞において上記の遺伝子のうちの１種又は２種がすでに発現している場合には、導入すべき上記の遺伝子の組み合わせから発現している１種又は２種の遺伝子を除くこともできるが、このような態様が本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。

上記遺伝子を体細胞に導入する手段としてウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターを用いる場合には、導入すべきそれぞれの遺伝子を含むウイルスベクターを調製した後、各ウイルスベクターを別々のパッケージング細胞にトランスフェクトして該細胞を培養することにより各ウイルスを含む培養上清をそれぞれ独立に調製し、それらの培養上清の混合物を調製して遺伝子を含むウイルスを感染させることによる遺伝子導入に用いることが好ましい。この手段を採用することにより、遺伝子導入効率を顕著に高めることができる場合があり、特にｃ−Ｍｙｃを用いずに核初期化を行う場合に好ましい場合がある。もっとも、複数のウイルスベクターを単一のパッケージング細胞にトランスフェクトし、複数のウイルスベクターを含む培養上清を調製して遺伝子導入に用いることも可能である。

遺伝子を体細胞に導入する場合には、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して発現ベクターの導入を行ってもよいが、フィーダー細胞を使用することなく体細胞に発現ベクター導入を行ってもよい。発現ベクターの導入効率を高めるために後者の方法が適している場合がある。フィーダー細胞としては胚性幹細胞の培養に用いられるフィーダー細胞を適宜使用することができるが、例えば、マウス１４〜１５日胚の線維芽細胞初代培養細胞や線維芽細胞由来細胞株であるＳＴＯ細胞等をマイトマイシンＣなどの薬剤で処理した細胞や放射線処理した細胞などを用いることができる。遺伝子導入後の体細胞の培養はフィーダー細胞上で行うことが好ましい。また、遺伝子導入後、数日ないし３０日程度の間にピューロマイシンなどを用いて薬剤選択を付加することもできる。もっとも、薬剤選択を行わずにｉＰＳ細胞を誘導できる手法も知られており（国際公開ＷＯ２００７／６９６６６の例９など）、薬剤選択を行わずにｉＰＳ細胞を誘導することも好ましい。

核初期化因子を導入した体細胞を適宜の条件下で培養することにより自律的に核初期化が進行し、体細胞から人工多能性幹細胞を製造することができる。遺伝子を体細胞に導入した後、該細胞が多能性を獲得して増殖するのに十分な時間にわたり細胞を培養することが好ましい。ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合には、発現ベクター導入後の細胞の培養密度を通常の動物細胞培養の場合よりも低く設定することが望ましい。例えば、細胞培養用ディッシュあたり１〜１０万個、好ましくは５万個程度の細胞密度で培養を継続することが好ましい。

通常は体細胞の動物種に適した培地、例えば胚性幹細胞（ＥＳ細胞）用の培地（例えばヒト体細胞に遺伝子導入する場合には霊長類ＥＳ細胞用、好ましくはヒトＥＳ細胞用の培地）を用いて、例えば２５日以上培養することにより人工多能性幹細胞を得ることができる。第一の観点から提供される方法では、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｓａｌｌ１、又はＳａｌｌ４の１種又は２種以上を含む組み合わせを用いて核初期化を行う場合に比べて、核初期化の効率が低下する場合があり、一般的には長期間の培養が必要になることが多い。例えば、この方法においては、好ましくは２８日以上、より好ましくは３０日以上、さらに好ましくは３３日以上、特に好ましくは３５日以上培養を継続する必要がある。特にヒト体細胞に遺伝子導入する場合には４０日以上、さらには４５日以上の培養日数が至適な培養日数になる場合もある。もっとも、第一の観点から提供される方法によれば、バックグラウンドとなる夾雑細胞の混入を排除して、より純粋な細胞集団としての人工多能性幹細胞コロニーを取得することができ、遺伝子発現や分化能などの点で極めて高品質な人工多能性幹細胞を得ることが可能になる。一方、第二の観点及び第三の観点から提供される本発明の方法では、一般的には人工多能性幹細胞の生成効率が十分に高いことから、より短い培養日数、例えば１５日ないし３０日間、好ましくは２０日程度の培養期間で所望の個数の人工多能性幹細胞を取得できる場合がある。

遺伝子導入した細胞が多能性を獲得したことは、例えば未分化細胞に特有の各種マーカー、例えばアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＡＢＣＧ−２、及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎなどを検出することにより容易に判定することができる。マーカーの種類や判定手段については上記刊行物（例えばＣｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６、Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７など）に具体的かつ詳細に説明されている。ＥＳ細胞特異的発現遺伝子のプロモーター下流にＧＦＰなどのマーカー遺伝子を組み込んだ遺伝子を有する体細胞を用いて核初期化を行った場合は、マーカー（ＧＦＰ）陽性を指標として人工多能性幹細胞を特定することが可能である。
また、増殖については一般的にはコロニー形成により判定することができるが、コロニー（通常は約５００個〜１，０００個程度の人工多能性幹細胞からなる細胞集団である）の形状は動物種により特徴的な外観を呈することが知られているので、人工多能性幹細胞が増殖して形成したコロニーを容易に特定することができる。

例えば、マウス人工多能性幹細胞は盛り上がったコロニーを形成するのに対して、ヒト人工多能性幹細胞は扁平なコロニーを形成することが知られており、これらのコロニー形状はそれぞれマウスＥＳ細胞及びヒトＥＳ細胞のコロニーと極めて類似しているので、当業者は生成した人工多能性幹細胞のコロニーを検出することにより人工多能性幹細胞の増殖程度を確認することができる。ＥＳ細胞の未分化性及び多能性を維持可能な培地又はその性質を維持することができない培地は当業界で種々知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、人工多能性幹細胞を効率よく分離することができる。分離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能はＥＳ細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。

上記の方法において、必要に応じて遺伝子導入をサイトカインの非存在下又は存在下に行うことができ、好ましくはサイトカインの非存在下に行うことができる。また、上記の方法において、必要に応じて遺伝子導入後の体細胞の培養をサイトカインの非存在下又は存在下に行うことができる。サイトカインとしては典型的にはｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）などが挙げられるが、これらに限定されることはなく、当業界でサイトカインとして分類されている生理活性物質の存在下又は非存在下で遺伝子導入及び／又は培養を行うことができる。サイトカインを発現するように改変したフィーダー細胞上で遺伝子導入後の体細胞を培養することもできる。

上記の方法において、上記遺伝子に換えて上記遺伝子がコードする遺伝子産物を用いて核初期化を行うこともできる。遺伝子産物である核初期化因子を用いて上記の方法を行う場合には、体細胞及び人工多能性幹細胞が増殖可能な環境において核初期化因子と体細胞とを接触させればよい。より具体的には、例えば、上記の遺伝子産物を培地中に添加するなどの手段を採用することができる。これらの遺伝子の遺伝子産物のうちの１種又は２種を融合タンパク質や核内へのマイクロインジェクションなどの手法により核内に導入し、残りの１種又は２種の遺伝子を適宜の遺伝子導入方法、例えば組換えベクターを用いる方法などによって導入することもできる。

該遺伝子産物としては、例えば上記遺伝子から産生されるタンパク質自体のほか、該タンパク質とその他のタンパク質又はペプチドなどとの融合遺伝子産物の形態であってもよい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質やヒスチジンタグなどのペプチドとの融合遺伝子産物を用いることもできる。また、ＨＩＶウイルスに由来するＴＡＴペプチドとの融合タンパク質を調製して用いることにより、細胞膜からの核初期化因子の細胞内取り込みを促進させることができ、遺伝子導入などの煩雑な操作を回避して、融合タンパク質を培地に添加するだけで初期化を誘導することが可能になる。このような融合遺伝子産物の調製方法は当業者によく知られているので、当業者は目的に応じて適宜の融合遺伝子産物を容易に設計して調製することが可能である。

上記の各方法において、１種又は２種以上の遺伝子の体細胞への導入を体細胞への低分子化合物の接触で置き換えることができる場合もある。このような低分子化合物としては、例えばＯｃｔファミリー遺伝子、Ｋｌｆファミリー遺伝子、Ｓｏｘファミリー遺伝子、Ｍｙｃファミリー遺伝子、Ｌｉｎファミリー遺伝子、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の発現を促進する作用を有する低分子化合物を用いることができるが、このような低分子化合物は各遺伝子の発現量を指標として当業者が容易にスクリーニングすることができる。

上記の方法において、定義された各遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開ＷＯ２００７／６９６６６に開示されているように、例えば、ＴＥＲＴ遺伝子、及び下記の遺伝子：ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、及びＢｍｉｌからなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。さらに、上記の遺伝子に加えて、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、及びβ−ｃａｔｅｎｉｎからなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を組み合わせてもよく、及び／又はＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、及びＧｒｂ２からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについては国際公開ＷＯ２００７／６９６６６に具体的に説明されている。もっとも、本発明の方法において使用可能な遺伝子は上記に具体的に説明した遺伝子に限定されることはない。

本発明の方法においては、核初期化因子として機能することができる他の遺伝子のほか、分化、発生、又は増殖などに関係する因子あるいはその他の生理活性を有する因子をコードする遺伝子の１種又は２種以上含むことができ、そのような態様も本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。例えば、核初期化因子を確認する手段としては国際公開ＷＯ２００５／８０５９８に記載された核初期化因子のスクリーニング方法や国際公開ＷＯ２００７／６９６６６に記載された具体的な核初期化因子の特定方法を利用することができる。国際公開ＷＯ２００５／８０５９８及び国際公開ＷＯ２００７／６９６６６の全ての開示を参照により本明細書の開示に含める。当業者はこれらの刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、本発明の方法のために利用することができる。また、上記のスクリーニング方法に適宜の修飾ないし改変を加えた方法を用いて核初期化因子を確認することもできる。上記の方法に用いられる遺伝子の組み合わせが核初期化因子として作用することも上記の刊行物に記載された方法により当業者が容易に確認することができる。

本発明の方法において、人工多能性幹細胞の樹立効率を向上させるために、種々の樹立効率改善剤の導入及び／又は添加を行うこともできる。ｉＰＳ細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７），ｐｐ．７９５−７９７，２００８）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３やＭ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ））などの核酸性発現阻害剤など］、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２，ｐｐ．５２５−５２８，２００８）等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例えば、Ｇ９ａ ｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））などの核酸系発現阻害剤など］などが挙げられるが、これらに限定されることはない。核酸系発現阻害剤はｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態であってもよい。

本発明の方法により製造される人工多能性幹細胞の用途は特に限定されず、ＥＳ細胞を利用して行われているあらゆる試験・研究やＥＳ細胞を用いた疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた人工多能性幹細胞をレチノイン酸、ＥＧＦなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など）を誘導することができ、適宜の組織を形成させることができる。分化誘導方法については国際公開ＷＯ２００７／６９６６６などに具体的に説明されている。このようにして得られた分化細胞や組織を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。例えば、患者自身の体細胞から安全性の高い人工多能性幹細胞を効率的に作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞など）を心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多様な疾患に対する幹細胞移植療法において安全に利用することができる。

また、例えば、ヒト体細胞から本発明の方法により人工多能性幹細胞を調製した後、この人工多能性幹細胞を分化誘導して体細胞、組織、又は臓器などを調製し、この体細胞、組織、又は臓器などに対しての化合物、医薬、毒物などの生理作用や毒性を評価することもできる。あるいは、特定の疾患の患者の体細胞から本発明の方法により人工多能性幹細胞を調製した後、この人工多能性幹細胞を分化誘導して体細胞、組織、又は臓器などを調製し、この体細胞、組織、又は臓器などに対して医薬候補化合物を作用させて治療及び／又は予防効果を判定することにより、医薬候補化合物のスクリーニングを行うこともできる。もっとも、本発明の人工多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：マウスＥＳ細胞培地におけるａｄｕｌｔ ＨＤＦからのｉＰＳ細胞の樹立
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）又はヒト新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ）にレンチウイルスでＳｌｃ７ａ１（マウスレトロウイルス受容体）遺伝子を導入し（それぞれ、「ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１」、「ＢＪ−Ｓｌｃ７ａ１」とする）、ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１又はＢＪ−Ｓｌｃ７ａ１は８００，０００個に調製した後、フィーダー細胞（マイトマイシン処理ＳＴＯ細胞）上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスベクターにより遺伝子を導入した。
１．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ｈＴＥＲＴ，Ｂｍｉｌ
２．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７
３．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ７
４．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ
５．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６
６．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ
図中で示す「−」は、上記の組み合わせの「６．Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ」を示す。
（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴはヒト由来、Ｂｍｉ１はマウス由来）

マウスＥＳ細胞の培養条件下で薬剤選択無しで培養を続けたところ、４の組み合わせで遺伝子を導入したディッシュにおいて、ウイルス感染８日後においてｉＰＳ細胞と思われるコロニーが出現した。他の組み合わせ（１から３および５）においても、１の組み合わせの場合ほどは明瞭ではないが、ｉＰＳ細胞様のコロニーが出現した。４遺伝子（６）のみを導入しても、全くコロニーは出現しなかったが、上記条件下で４遺伝子のみが導入された細胞はアルカリフォスファターゼ染色に対して明らかに陽性を呈していた（図１）。

同様に、マウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するヒト新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ）を８０，０００個に調製後、フィーダー細胞（マイトマイシン処理ＳＴＯ細胞）上にまき、以下の組み合わせでレトロウイルスベクターにより遺伝子を導入した。
１．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ
２．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ，Ｂｍｉｌ
３．ｈＴＥＲＴ，ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ
４．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６
５．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ７
６．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ，ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７
７．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ），ｈＴＥＲＴ
８．４ｓ（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ）
９．ＤｓＲｅｄ
（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，ｃ−Ｍｙｃ，ＴＥＲＴはヒト由来、Ｂｍｉ１はマウス由来）
マウスＥＳ細胞の培養条件下で２週間培養を続けたところ、４遺伝子（８）のみが導入された細胞はアルカリフォスファターゼ染色に対して陽性を呈した（図２）。

例２：ｉＰＳ細胞によるＥＣＡＴ発現（１）
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）から樹立されたヒトｉＰＳ細胞が、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群であるＥＣＡＴ（ＥＳ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を発現するか否かを調べた。
ａｄｕｌｔ ＨＤＦに由来するｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ６）を６ウェルプレートにあらかじめ培養していたフィーダー細胞（マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞）上に、各ウェルあたり５×１０^４個の割合で撒き、４日間培養した。細胞を１０％ホルマリンを含ＰＢＳで固定し、固定液を除去後、ＰＢＳで洗浄し、さらに室温で４５分間３％ＢＳＡ含ＰＢＳを加え静置した。一次抗体（抗ヒトＡＢＣＧ−２抗体（マウスＩｇＧ）、抗ＳＳＥＡ−３抗体（ラットＩｇＭ）、及び抗ＳＳＥＡ−４抗体（マウスＩｇＧ））を３％ＢＳＡ含ＰＢＳで１：１００に希釈し、４℃で一晩反応させた後、細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：３００に希釈した二次抗体を用いて室温で１時間、遮光下で反応させた。二次抗体としてＣｙ−３で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＢＣＧ−２及びＳＳＥＡ−４に対する抗体；ケミコン）及び抗ラットＩｇＭ抗体（ＳＳＥＡ−３に対する抗体；ジャクソン・イムノリサーチ）を使用した。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで顕微鏡下で観察及び撮影した（図３）。この結果、ａｄｕｌｔ ＨＤＦに由来するｉＰＳ細胞がＡＢＣＧ−２、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４を発現していることが観察された。

例３：ｉＰＳ細胞によるＥＣＡＴ発現（２）
ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）に由来するｉＰＳ細胞（クローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ３、８７Ｅ４、及び８７Ｅ１２）をあらかじめ６ウェルプレートに播いておいたフィーダー細胞（マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞）上に各ウェルあたり５×１０^４個の割合で撒き、５日間培養した。コントロールとして上記ｉＰＳ細胞の由来細胞であるＨＤＦを上記６ウェルプレート上に撒き、２日間維持した。細胞を１０％ホルマリンを含むＰＢＳで固定した。固定液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞を室温で４５分間ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ含ＰＢＳ）を加え静置した。一次抗体（抗ＡＢＣＧ−２抗体（マウスＩｇＧ；ブロッキングバッファーで１：８０に希釈）、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（マウスＩｇＧ；；ブロッキングバッファーで１：８０に希釈）、抗ＳＳＥＡ−３抗体（ラットＩｇＭ；ブロッキングバッファーで１：２５０に希釈）、抗ＳＳＥＡ−４抗体（マウスＩｇＧ；ブロッキングバッファーで１：２５０に希釈））と４℃で一晩反応させた後、細胞をブロッキングバッファーで洗浄した。洗浄後、さらに細胞を二次抗体を用いて室温で１時間反応させた。二次抗体は、ブロッキングバッファーで１：３００に希釈したＣｙ−３で標識した抗マウスＩｇＧ抗体（ＡＢＣＧ−２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、及びＳＳＥＡ−４に対する抗体）及び抗ラットＩｇＭ抗体（ＳＳＥＡ−３に対する抗体）を用いた。２次抗体反応後抗体溶液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞に５０％グリセロールを含むＰＢＳを加えて観察した（図４）。

ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）に由来するｉＰＳ細胞はＥＳ細胞の表面マーカーであるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＡＢＣＧ−２、及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎを発現していた。これに対して、ｉＰＳ細胞の由来細胞であるＨＤＦａはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＡＢＣＧ−２、及びＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎのいずれも発現していなかった。

例４：ｉＰＳ細胞によるＥＣＡＴ発現（３）
全ＲＮＡを、ヒトｉＰＳ細胞クローン（ｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ８７Ｅ−１〜８、１１及び１２）、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１ヒト胚癌細胞（継代数３５）、及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するａｄｕｌｔ ＨＤＦ（継代数６）から単離した。第１鎖ｃＤＮＡはｏｌｉｇｏ−ｄＴ２０プライマー及びＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ−α−ｋｉｔ（東洋紡）を製造業者のプロトコルに従って使用して合成した。ＰＣＲはプライマーを用いて以下の通りに行った。内在性ＯＣＴ３／４に対してｈＯｃｔ３／４−Ｓ１１６５及びｈＯｃｔ３／４−ＡＳ１２８３；内在性Ｓｏｘ２に対してｈＳｏｘ２−Ｓ１４３０及びｈＳｏｘ２−ＡＳ１５５５；Ｎａｎｏｇに対してＥＣＡＴ４−ｍａｃａｃａ−９６８Ｓ及びＥＣＡＴ４−ｍａｃａｃａ−１３３４ＡＳ；ＲＥＸ１に対してｈＲｅｘ１−ＲＴ−Ｕ及びｈＲｅｘ１−ＲＴ−Ｌ；ＦＧＦ４に対してｈＦＧＦ４−ＲＴ−Ｕ及びｈＦＧＦ４−ＲＴ−Ｌ；ＧＤＦ３に対してｈＧＤＦ３−Ｓ２４３及びｈＧＤＦ３−ＡＳ８５０：ＥＣＡＴ１５−１に対してｈＥＣＡＴ１５−Ｓ５３２及びｈＥＣＡＴ１５−ＡＳ９１６；ＥＣＡＴ１５−２に対してｈＥＣＡＴ１５−２−Ｓ８５及びｈＥＣＡＴ１５−２−ＡＳ６６７；ＥＳＧ１に対してｈｐＨ３４−Ｓ４０及びｈｐＨ３４−ＡＳ２５９；ｈＴＥＲＴに対してｈＴＥＲＴ−Ｓ３５５６及びｈＴＥＲＴ−ＡＳ３７１３；並びにＧ３ＰＤＨに対してＧ３ＰＤＨ−Ｆ及びＧ３ＰＤＨ−Ｒを使用した（表１：配列表の配列番号１から２２）。
この結果、多数のヒトｉＰＳ細胞クローン（ｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ８７Ｅ−１〜８、１１及び１２）がＥＣＡＴを発現しており、特に８７Ｅ６クローンは種々のＥＣＡＴを発現していた（図５）。

例５：ｉＰＳ細胞によるＥＣＡＴ発現（４）
ヒト新生児包皮由来繊維芽細胞（ＢＪ線維芽細胞）に由来するヒトｉＰＳ細胞がＥＣＡＴを発現するか否かを確認した。
全ＲＮＡをヒトｉＰＳ細胞（ｉＰＳ−ＢＪＳｌｃ−９７Ｅ−１、２、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、−９７Ｇ−３、５、−９７Ｈ−３、及び５）、ＮＴＥＲＡ２クローンＤ１ヒト胚性癌細胞（継代数３５）、及びマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現する新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ）（継代数６）から単離した。第１鎖ｃＤＮＡはｏｌｉｇｏ−ｄＴ２０プライマー及びＲｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ−α−ｋｉｔ（東洋紡）を用いて製造業者のプロトコルに従って合成した。ＰＣＲはプライマーを用いて以下の通りに行った。内在性ＯＣＴ３／４に対してｈＯｃｔ３／４−Ｓ１１６５及びｈＯｃｔ３／４−ＡＳ１２８３；内在性Ｓｏｘ２に対してｈＳｏｘ２−Ｓ１４３０及びｈＳｏｘ２−ＡＳ１５５５；Ｎａｎｏｇに対してＥＣＡＴ４−ｍａｃａｃａ−９６８Ｓ及びＥＣＡＴ４−ｍａｃａｃａ−１３３４ＡＳ；ＲＥＸ１に対してｈＲｅｘ１−ＲＴ−Ｕ及びｈＲｅｘ１−ＲＴ−Ｌ；ＦＧＦ４に対してｈＦＧＦ４−ＲＴ−Ｕ及びｈＦＧＦ４−ＲＴ−Ｌ；ＧＤＦ３に対してｈＧＤＦ３−Ｓ２４３及びｈＧＤＦ３−ＡＳ８５０；ＥＣＡＴ１５−１に対してｈＥＣＡＴ１５−Ｓ５３２及びｈＥＣＡＴ１５−ＡＳ９１６；ＥＣＡＴ１５−２に対してｈＥＣＡＴ１５−２−８８５及びｈＥＣＡＴ１５−２−ＡＳ６６７；ＥＳＧ１に対してｈｐＨ３４−Ｓ４０及びｈｐＨ３４−ＡＳ２５９；ｈＴＥＲＴに対してｈＴＥＲＴ−Ｓ３５５６及びｈＴＥＲＴ−ＡＳ３７１３；並びにＧ３ＰＤＨに対してＧ３ＰＤＨ−Ｆ及びＧ３ＰＤＨ−Ｒを使用した（表２：配列表の配列番号２３から４４）。

この結果、多数のヒトｉＰＳ細胞クローン（ｉＰＳ−ＢＪＳｌｃ−９７Ｅ−１、２、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、−９７Ｇ−３、５、−９７Ｈ−３、及び５）がＥＣＡＴを発現していた（図６）。

例６：ヒトｉＰＳ細胞による奇形腫形成
例６：ヒトｉＰＳ細胞による奇形腫形成
５．０×１０^６個のヒトｉＰＳ細胞を、ＳＣＩＤマウス（雌、５週齢）の背側面に皮下注射した。注射の５週間後に大きな腫瘍が観察された。腫瘍を切除して重量を計測し、外観を撮影した。この腫瘍を１０％ホルマリンを含むＰＢＳで固定した。パラフィン包理した腫瘍を４．５μｍ切片にスライスした薄切片をスライドガラス上に載せ風乾した後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。図７のＡは、ｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ１２クローンを皮下注射したマウス及びその奇形腫を示す。図７のＢはクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ３、同ＣはクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ６、同ＤはクローンｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−８７Ｅ１２を皮下注射したマウスから切除された奇形腫由来の組織像をそれぞれ示す。

例７：ヒトｉＰＳ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化
浮遊培養を行うことにより胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢｓ）を形成させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトｉＰＳ細胞の分化能を評価した。ヒトｉＰＳ細胞（ｉＰＳ−ＨＤＦａＳｌｃ−１２７Ｆ２、Ｅ３）を７日間浮遊培養し、胚様体を形成させた。その後、胚様体をゼラチンコートしたプレートに移し、さらに８日間培養を継続し、その後免疫組織化学分析を行った。使用した一次抗体は以下の通りである。抗α−平滑筋アクチン抗体（ダコ）、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体（ケミコン）、抗−α−フェトプロテイン抗体（ダコ）、正常マウスＩｇＧ（２ｍｇ／ｍｌ、ケミコン）、及び正常ウサギＩｇＧ（２ｍｇ／ｍｌ、ケミコン）は、それぞれ３％ＢＳＡ含ＰＢＳで１：１００で希釈し、一次抗体として使用した。一次抗体を室温で１時間反応させた後に細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体（３％ＢＳＡ含ＰＢＳで１：３００に希釈）を反応させた。なお、核はＤＡＰＩにより染色した。その結果、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、中胚葉マーカー）、βＩＩＩチューブリン（外胚葉マーカー）、α−フェトプロテイン（内胚葉マーカー）が陽性を示したことにより、ヒトｉＰＳ細胞は胚様体形成を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで分化することを確認した（図８）。

例８：ヒトｉＰＳ細胞の作製のためのレトロウイルスによる遺伝子導入の最適化
マウス線維芽細胞からのｉＰＳ細胞の誘導には高い遺伝子導入効率を有するレトロウイルスが有効であると考えられている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６）。そこで、ヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）における遺伝子導入方法を最適化した。最初にＰＬＡＴ−Ａパッケージング細胞において作製した両種性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスを用いてａｄｕｌｔ ＨＤＦに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を導入した。対照として、ＰＬＡＴ−Ｅパッケージング細胞（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，ｐｐ．１０６３−６６，２０００）において作製した同種指向性（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルスを用いてマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＧＦＰを導入した。ＭＥＦにおいては、８０％以上の細胞がＧＦＰを発現した（図９）。一方、２０％未満のａｄｕｌｔ ＨＤＦはＭＥＦの場合より明らかにＧＦＰの発現強度が低く、ＧＦＰ発現率は２０％未満であった。

遺伝子導入効率を改善するために、マウスレトロウイルスのレセプターＳｌｃ７ａ１（Ｖｅｒｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．，４４７，ｐｐ．５３２−５４２，２００４）（ｍＣＡＴ１としても知られている）をレンチウイルスを用いてａｄｕｌｔ ＨＤＦに導入した。次に同種指向性レトロウイルスを用いてＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１にＧＦＰを導入した。この方法により６０％の遺伝子導入効率が達成された（図９）。

例９：霊長類ＥＳ細胞培地を用いたａｄｕｌｔ ＨＤＦからのｉＰＳ細胞の作製
ヒトｉＰＳ細胞を誘導するためのプロトコルを図１０Ａに概略を示した。ヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−ＭｙｃをレトロウイルスベクターにてをＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１に導入した（図１０Ｂ、８ｘ１０^５細胞／１００ｍｍディッシュ）。
遺伝子導入の６日後、細胞をトリプシン処理により回収し、５ｘ１０^４又は５ｘ１０^５細胞／１００ｍｍディッシュに調整した後、マイトマイシンＣ処理ＳＮＬフィーダー細胞（ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６２，ｐｐ．１０７３−８５，１９９０）上に撒いた。翌日、培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を４ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）に交換した。約２週間後、細胞形態がヒトＥＳ細胞とは類似しない幾つかの粒状コロニーが現れた（図１０Ｃ）。２５日目頃、平らでヒトＥＳ細胞コロニーに類似した別のタイプのコロニーが観察された（図１０Ｄ）。５ｘ１０^４個の線維芽細胞から、約１０個のヒトＥＳ細胞様コロニー及び約１００個の粒状コロニーが観察された（６回の独立した実験において、７／１２２、８／８４、８／１７１、５／７３、６／１２２、及び１１／２１３個を観察した。結果を表３にまとめた）。

３０日目に、ヒトＥＳ細胞様コロニーを取り、酵素消化を行うことなく小さな塊に機械的にばらばらにした。５ｘ１０^５個の線維芽細胞から始めた場合、ディッシュは３００個を超える粒状コロニーによりほぼ覆われた。幾つかのヒトＥＳ細胞様コロニーが粒状コロニーの間に観察される場合もあったが、粒状コロニーが高密度であったため、ヒトＥＳ細胞様コロニーを単離することは困難であった。

ヒトｉＰＳ細胞をｂＦＧＦを含む霊長類ＥＳ細胞様培地を用いてＳＮＬフィーダー細胞上で増殖させたところ、細胞は固く密集した平らなコロニーを形成した（図１０Ｅ）。それぞれの細胞は、大きな核小体とわずかな細胞質を特徴とするヒトＥＳ細胞と同様の細胞形態を示した（図１０Ｆ）。ヒトＥＳ細胞の場合と同様に、コロニーの中心に自発性分化が観察される場合があった（図１０Ｇ）。また、これらの細胞はヒトＥＳ細胞と類似してフィーダー細胞依存性を示し、ゼラチンコートした組織培養プレートには接着しなかった。一方、これらの細胞はマトリゲルコートされたプレート上のＭＥＦ調整霊長類ＥＳ細胞用培地（ＭＥＦ−ＣＭ）中では未分化状態を維持したが、非調整霊長類ＥＳ細胞用培地中では未分化状態を維持しなかった（図１１）。樹立されたヒトｉＰＳ細胞のクローンを表４にまとめた。

例１０：ヒトｉＰＳ細胞によるヒトＥＳ細胞マーカーの発現
免疫染色解析により、ヒトｉＰＳ細胞はＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１、及びＴＲＡ−２−４９／６Ｅ（アルカリフォスファターゼ）を含むヒトＥＳ細胞特異的表面抗原（Ａｄｅｗｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５，ｐｐ．８０３−８１６，２００７）、並びにＮａｎｏｇ蛋白の発現を示した（図１０のＩ〜Ｎ）。

ＲＴ−ＰＣＲにより、ヒトｉＰＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞の多数の遺伝子マーカー（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸ１、ＦＧＦ４、ＥＳＧ１、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、及び（ｈＴＥＲＴ）など）をヒト胚性癌細胞株ＮＴＥＲＡ−２の場合と同等以上のレベルで発現していることが示された（図１２）。ウェスタンブロットの結果からは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、及びｈＴＥＲＴの蛋白質レベルは、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞において同等であった（図１３Ａ）。ヒトｉＰＳ細胞においては、染色体に組み込まれたレトロウイルスからの導入遺伝子の発現は効率的にサイレンシングされていたことから、これらの遺伝子の内因性発現に依存していることが示唆された（図１３Ｂ）。

例１１：ヒトｉＰＳ細胞内におけるＥＳ細胞特異的遺伝子プロモーターの活性
バイサルファイトゲノミックシークエンス法により、Ｏｃｔ３／４、ＲＥＸ１及びＮａｎｏｇなどの多能性に関連する遺伝子のプロモーター領域におけるシトシングアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）のメチル化の状態を評価した結果、その領域のＣｐＧジヌクレオチドは由来源の親ＨＤＦ（ＨＤＦ）においては高度にメチル化されているのに対して、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ２，２０１Ｂ６，２０１Ｂ７）では高度に脱メチル化されていることが判明した（図１４Ａ）。これらの知見から、これらのプロモーターがヒトｉＰＳ細胞において活性化されていることが示唆された。

ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいても、ヒトＯｃｔ３／４及びＲＥＸ１プロモーターは、ヒトｉＰＳ細胞においては高レベルの転写活性を有したが、ＨＤＦでは有さないことが示された。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）などの普遍的に発現する遺伝子のプロモーター活性はヒトｉＰＳ細胞及びＨＤＦの両方において同等の活性を示した（図１４Ｂ）。

例１２：ヒトｉＰＳ細胞の高テロメラーゼ活性及び指数関数的増殖
ｈＴＥＲＴの高い発現レベルから推測される通り、ヒトｉＰＳ細胞は高いテロメラーゼ活性を示した（図１５Ａ）。ヒトｉＰＳ細胞は、少なくとも４ヶ月間は指数関数的に増殖した（図１５Ｂ）。ヒトｉＰＳ細胞の計算上の倍増時間は、４６．９±１２．４（クローン２０１Ｂ２）、４７．８±６．６（２０１Ｂ６）、及び４３．２±１１．５（２０１Ｂ７）時間であった（図１５Ｂ）。これらの時間は、既報のヒトＥＳ細胞の倍増時間と同等であった（Ｃｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５０，ｐｐ．１３５３−５６，２００４）。

例１３：ＨＤＦ由来ヒトｉＰＳ細胞の交差汚染（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）評価
ヒトｉＰＳ細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、全クローンが４種全てのレトロウイルスの組み込みを有することが示された（図１６Ａ）。ｃ−Ｍｙｃ ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析により、それぞれのクローンがレトロウイルス組み込み部位の特有のパターンを有することが判明した（図１６Ｂ）。また、１６のショートタンデムリピートのパターンは、ヒトｉＰＳクローンと親のＨＤＦとの間で完全に一致した。ＨＤＦ由来ｉＰＳ細胞のＳＴＲ解析の結果を表５に示す。

これらのパターンは、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｎｉｈｒｅｓｅａｒｃｈ／ｓｃｕｎｉｔ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ．ｈｔｍ）で報告されている樹立されたヒトＥＳ細胞株の何れとも異なっていた。また、染色体のＧ横縞分析により、ヒトｉＰＳ細胞が正常な４６ＸＸ核型を有することが示された。従って、ヒトｉＰＳクローンはＨＤＦに由来するものであり、ＥＳ細胞のコンタミネーションによるものではないと結論された。

例１４：ヒトｉＰＳ細胞の胚様体を介した分化
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトｉＰＳ細胞の分化能を決定するために、浮遊培養を使用して胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢｓ）を形成させた。浮遊培養の８日目後、ｉＰＳ細胞はボール状の構造を形成した（図１７Ａ）。これらのＥｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ様構造をゼラチンコートしたプレートに移し、さらに８日間培養を継続した。付着した細胞は、神経様細胞、敷石様細胞、及び上皮細胞などの様々な細胞形態を示した（図１７Ｂ−Ｅ）。免疫組織化学分析により、βＩＩＩチューブリン（外胚葉マーカー）、グリア原線維酸性蛋白（ＧＦＡＰ、外胚葉）、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ、中胚葉）、デスミン（中胚葉）、α−フェトプロテイン（内胚葉）、及びビメンチン（中胚葉及び体壁の内胚葉）に対して陽性の細胞が検出された（図１７Ｆ−Ｋ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果から、これらの分化した細胞においてＦＯＸＡ２（内胚葉マーカー）、ＡＦＰ（内胚葉）、サイトケラチン８及び１８（内胚葉）、ＳＯＸ１７（内胚葉）、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ（中胚葉）、ＭＳＸ１（中胚葉）、ＭＡＰ２（外胚葉）、及びＰＡＸ６（外胚葉）が発現していることが確認された（図１７Ｌ）。一方、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇの発現は明らかに低減していた。これらの結果より、ｉＰＳ細胞が３胚葉系にインビトロで分化できることが示された。

例１５：ヒトｉＰＳ細胞の神経細胞への分化
ヒトｉＰＳ細胞からの分化をヒトＥＳ細胞についての既報の方法により誘導できるか否かを検討した。ＰＡ６フィーダー細胞層の上にヒトｉＰＳ細胞を撒き、分化条件下で２週維持・培養間した（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，２８，ｐｐ．３１−４０，２０００）。細胞は大きく広がり、いくつかの神経構造が観察された（図１８Ａ）。免疫組織化学分析により、培養物中にチロシンヒドロキシナーゼ及びβＩＩＩチューブリン陽性細胞が検出された（図１８Ｂ）。ＰＣＲ分析の結果から、ＡＡＤＣ、ＣｈＡＴ、、ＤＡＴ、及びＬＭＸ１Ｂなどのドーパミン作用性神経マーカー、並びに他の神経マーカーであるＭＡＰ２の発現が確認された（図１８Ｃ）。また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇの発現は低減した（図１８Ｃ）。これらの結果から、ｉＰＳ細胞がＰＡ６細胞との共培養によりドーパミン作用性ニューロンを含む神経細胞に分化できることが示された。

例１６：ヒトｉＰＳ細胞の心臓細胞への方向付けした分化
アクチビンＡ及び骨形成因子（ＢＭＰ）４を利用した心臓細胞への分化に関する文献（Ｌａｆｌａｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５，ｐｐ．１０１５−２４，２００７）を用いてヒトｉＰＳ細胞の心臓への分化を検討した。分化誘導から１２日後、細胞塊は鼓動を始めた（図１８Ｄ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果から、これらの細胞がＴｎＴｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＫＸ２．５、ＭＹＬ２Ａ、及びＭＹＨＣＢなどの心筋細胞マーカーを発現していることが示された（図１８Ｅ）。一方、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇの発現は著しく低減していた。これらの結果から、ヒトｉＰＳ細胞がインビトロで心筋細胞へと分化できることが示された。

例１７：ヒトｉＰＳ細胞からの奇形腫形成
インビボでの多能性を試験するため、ヒトｉＰＳ細胞（クローン２０１Ｂ７）を免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの背側の側腹部へ皮下移植した。９週間後に腫瘍形成が観察された。組織学的観察により、原腸管様上皮組織（外胚葉）、横紋筋（中胚葉）、軟骨（筋肉）、神経組織（内胚葉）、及びケラチン含有扁平組織（内胚葉）を含む様々な組織（図１９）が腫瘍に含まれていることが示された。

例１８：他のヒト体細胞からのｉＰＳ細胞の作製
ＨＤＦに加えて、成人男性の滑膜組織の初代ヒト由来線維芽細胞様滑膜細胞（ＨＦＬＳ）及び新生児の包皮由来の線維芽細胞から樹立された細胞株（ＢＪ細胞）新生児の包皮由来の線維芽細胞から樹立された細胞株を使用した（表３）。ＨＦＬＳ（５ｘ１０^４細胞／１００ｍｍディッシュ）からｉＰＳ細胞の作成を試みた結果、６００個以上の粒状コロニー及び１７個のヒトＥＳ細胞様コロニーを得た。これらの１７個のコロニーのうち６コロニーを試験に供したところ、それらのうちの２コロニーのみが増殖可能であった（図２０）。５ｘ１０^５のＨＦＬＳを撒いたディッシュは粒状コロニーで覆われており、ヒトＥＳ細胞様コロニーは確認できなかった。一方、ＢＪ細胞からｉＰＳ細胞の作成を試みた結果、５ｘ１０^４／１００ｍｍディッシュからの場合、僅かな粒状コロニーも認められたものの７〜１３個のヒトＥＳ細胞様コロニー及び５ｘ１０^５／１００ｍｍディッシュからの場合は１００個のヒトＥＳ細胞様コロニーを得た（表３）。そのうち６個のヒトＥＳ細胞様コロニーを取り、５個のコロニーからｉＰＳ細胞を確認した（図２０）。ＨＦＬＳ及びＢＪに由来するヒトｉＰＳ細胞は、ヒトＥＳ細胞の場合と同等以上のレベルでヒトＥＳ細胞マーカー遺伝子を発現していた（図２１）。これらのヒトｉＰＳ細胞は、ＥＢｓを介して３胚葉系に分化した（図２２）。ＳＴＲ分析により、ｉＰＳ−ＨＦＬＳ細胞及びｉＰＳ−ＢＪ細胞はそれぞれＨＦＬＳ及びＢＪ細胞に由来することが確認された。表６はＨＦＬＳ由来ｉＰＳ細胞のＳＴＲ解析の結果を示し、表７はＢＪ由来ｉＰＳ細胞のＳＴＲ解析の結果を示す。

以上の結果から、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃのレトロウイルスによる遺伝子導入により、ａｄｕｌｔ ＨＤＦ及び他の体細胞からｉＰＳ細胞を作製できることが示された。樹立されたヒトｉＰＳ細胞は、細胞形態、増殖、フィーダー細胞依存性、表面マーカーの発現パターン、遺伝子発現、プロモーター活性、テロメラーゼ活性、インビトロでの分化能、及び奇形腫形成能を含む多くの点でヒトＥＳ細胞と類似していた。また、４種のレトロウイルスはヒトｉＰＳ細胞内でほぼ完全にサイレンシングされていた。このことから、これらの細胞は完全に初期化されており、自己再生については導入遺伝子の継続的な発現に依存しないことが示された。

例８〜１８における実験材料及び方法は以下の通りである。
１．細胞培養
３６歳のカフカス人女性の顔の皮膚から得たＨＤＦｓ及び６９歳のカフカス人男性の滑膜組織から得たＨＦＬｓはセルアプリケーション社から購入した。新生児の包皮から得たＢＪ線維芽細胞及びＮＴＥＲＡ−２クローンＤ１ヒト胚性癌細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。ヒト線維芽細胞ＮＴＥＲＡ−２、ＰＬＡＴ−Ｅ、及びＰＬＡＴ−Ａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、並びに０．５％ペニシリン及びストレプトマイシン（インビトロジェン）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ナカライテスク）で維持した。２９３ＦＴ細胞は１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬグルタミン（インビトロジェン）、１ｘ１０^−４Ｍ非必須アミノ酸（インビトロジェン）、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（シグマ）、並びに０．５％ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭで維持した。ＰＡ６間質細胞（理研バイオリソースセンター）は、１０％ＦＢＳ及び０．５％ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭで維持した。ｉＰＳ細胞は４ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、和光純薬）を補充した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）で樹立及び維持した。継代においては、ヒトｉＰＳ細胞は、ＰＢＳで一回洗浄し、その後３７℃で１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（インビトロジェン）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２でインキュベートした。ディッシュの縁にあるコロニーが底面から分離し始めた時に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２／コラゲナーゼを除去し、ヒトＥＳ細胞培地で洗浄した。細胞をかきとり、１５ｍｌの円錐形チューブに回収した。適量の培地を添加し、ＳＮＬフィーダー細胞上に新しいディッシュに移した。分割比は常に１：３とした。ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞を含まない状態で培養するためには、プレートは４℃で一晩０．３ｍｇ／ｍｌマトリゲル（、ＢＤバイオサイエンシス）でコートした。プレートは使用前に室温に加温した。未結合のマトリゲルは吸引除去し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄した。ｉＰＳ細胞は、マトリゲルコートされたプレート上に、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充したＭＥＦ−調整霊長類ＥＳ細胞用培地（ＭＥＦ−ＣＭ）又はＭＥＦ−非調整霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル）を用いて撒いた。培地は毎日交換した。ＭＥＦ−ＣＭの調製のために、ＩＣＲマウスの受精後１３．５日目の胚を回収し得たＭＥＦｓを１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍでプレートにまき一晩培養した。翌日、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、１０ｍｌの霊長類ＥＳ細胞用培地で培養した。２４時間培養後、ＭＥＦ培養の培養上清液を回収し、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過し、使用するまで−２０℃で保存した。

２．プラスミド構築
ヒトＯｃｔ３／４のオープンリーディングフレームをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。ｐＣＲ２．１−ｈＯｃｔ３／４のＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＭＸｓレトロウイルスベクターのＥｃｏＲＩ部位に導入した。それぞれの実験を区別するために、Ｎ_２０バーコードと命名した２０−ｂｐのランダム配列をＯｃｔ３／４発現ベクターのＮｏｔＩ／ＳａｌＩ部位へ導入した。実験間でのコンタミネーションを防ぐため、各実験において特有のバーコードを使用した。ヒトＳｏｘ２，Ｋｌｆ４及びｃ−ＭｙｃのオープンリーディングフレームもＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）へサブクローニングした。ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯへサブクローニングした全遺伝子を、ゲイトウェイクローニングシステム（インビトロジェン）を取扱説明書に従って用いてｐＭＸｓレトロウイルスベクターに導入した。マウスＳｌｃ７ａ１オープンリーディングフレームも増幅し、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯにサブクローニングし、ゲイトウェイシステムによりｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（インビトロジェン）に導入した。ヒトＯｃｔ３／４遺伝子及びＲＥＸ１遺伝子の調節領域を、ＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲＸＬ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にサブクローニングした。ＰｈＯＣＴ４−Ｌｕｃ及びｐｈＲＥＸ１−Ｌｕｃのために、ｐＣＲＸＬベクターからＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ消化により除去したフラグメントをｐＧＶ−ＢＭ２のＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングした。ｐＰｏｌＩＩ−Ｌｕｃのために、ｐＱＢＩ−ｐｏｌＩＩのＡａｔＩＩ（平滑末端）／ＮｈｅＩフラグメントをｐＧＶ−ＢＭ２のＫｐｎＩ（平滑末端）／ＮｈｅＩ部位に挿入した。全てのフラグメントをシークエンスにより確認した。プライマー配列を表８（配列表の配列番号４５から１２６）に示す。

３．レンチウイルス作製及び感染
６ｘ１０^６細胞の２９３ＦＴ細胞（インビトロジェン）を１００ｍｍディッシュに播き、一晩培養した。リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を取扱説明書に従って用いて２９３ＦＴ細胞に９μｇのビラパワーパッケージングミックス（Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｍｉｘ）と一緒に３μｇのｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ−Ｓｌｃ７ａをトランスフェクションした。トランスフェクションの翌日培地交換をおこなった。さらに２４時間後、上清を回収し、孔径０．４５μｍのセルロースアセテートフィルター（ワットマン）により濾過した。遺伝子導入の１日前にヒト線維芽細胞を８ｘ１０^５細胞／１００ｍｍディッシュで撒いた。培地を４μｇ／ｍｌポリブレン（ナカライテスク）を補充したウイルス含有上清液を用いて置換して２４時間培養した。

４．レトロウイルス感染及びｉＰＳ細胞の作出
ＰＬＡＴ−Ｅパッケージング細胞を８ｘ１０^６細胞／１００ｍｍディッシュでプレートに撒き、一晩培養した。翌日、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞にＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（ロッシュ）を用いてｐＭＸｓベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、新しい培地と交換し、、さらに２４時間後に培養上清をウイルス含有液として回収した。遺伝子導入の一日前にマウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現しているヒト線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）を８ｘ１０^５細胞／１００ｍｍディッシュに調整し播いておいた。ウイルス含有液を孔径０．４５μｍフィルターにより濾過し、４μｇ／ｍｌポリブレンを補充した。４種のレトロウイルスをそれぞれ含有する等量の上清液を混合し、ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１のディッシュに移して、一晩感染させた。２４時間後、ウイルスを含む上清を除去し、新しい培地と交換した。６日後、ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１細胞をトリプシン処理により採取し、ＳＮＬフィーダー細胞層の上に５ｘ１０^４細胞／１００ｍｍディッシュに調整し再度播いた。その翌日、培地を４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補填した霊長類ＥＳ細胞用培地に交換した。培地は一日おきに交換した。遺伝子導入の３０日後、コロニーを採取し、０．２ｍｌの霊長類ＥＳ細胞培地に移した。コロニーを弱いピペッティングにより小さな塊に機械的に分離した。この細胞懸濁液をＳＮＬフィーダー細胞をあらかじめ播いておいた２４ウェルプレート上に移した。この段階を継代数１とした。

５．ＲＮＡ単離及び逆転写
全ＲＮＡをトライゾール試薬（インビトロジェン）により抽出し、ゲノムＤＮＡの混在を除去するためにターボＤＮＡフリーキット（アンビオン）により処理した。１μｇの全ＲＮＡを用いて、Ｒｅｖｅｒ Ｔｒａ Ａｃｅ−α（東洋紡）及びｄＴ_２０プライマーを取扱説明書に従って用いて逆転写反応を行った。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（タカラ）で行った。定量的ＰＣＲはプラチナＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲスーパーミックスＵＤＧ（インビトロジェン）を用いて行い、７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム）により分析した。プライマー配列を表８に示す。

６．アルカリフォスファターゼ染色及び免疫組織化学分析
アルカリフォスファターゼ染色は、白血球アルカリフォスファターゼキット（シグマ）を用いて行った。免疫組織化学分析のために、細胞を室温で１０分間４％のパラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳにより固定した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を室温で４５分間、５％正常ヤギ又はロバ血清（ケミコン）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ナカライテスク）、及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳにより処理した。一次抗体としてＳＳＥＡ１（１：１００に希釈、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマバンク）、ＳＳＥＡ３（１：１０に希釈、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓから寄贈）、ＳＳＥＡ４（１：１００に希釈、デベロップスタディーハイブリドーマバンク）、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ（１：２０に希釈、デベロップメンタルスタディーズハイブリドーマバンク），ＴＲＡ−１−６０（１：５０に希釈、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓから寄贈）、ＴＲＡ−１−８１（１：５０に希釈、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｗ．Ａｎｄｒｅｗｓから寄贈）、Ｎａｎｏｇ（１：２０に希釈、ＡＦ１９９７、Ｒ＆Ｄシステム）、βＩＩＩチューブリン（１：１００に希釈、ＣＢ４１２、ケミコン）、グリア原繊維酸性蛋白（１：５００に希釈、Ｚ０３３４、ダコ）、α平滑筋アクチン（希釈済み、Ｎ１５８４、ダコ）、デスミン（１：１００に希釈ラブビジョン）、ビメンチン（１：１００に希釈、ＳＣ−６２６０、サンタクルズ）、α−フェトプロテイン（１：１００に希釈、ＭＡＢ１３６８、Ｒ＆Ｄシステム）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：１００に希釈、ＡＢ１５２、ケミコン）を使用した。二次抗体は、ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）結合ヤギ抗ラットＩｇＭ（１：５００期尺、ジャクソン・イムノリサーチ）、Ａｌｅｘａ５４６結合ヤギ抗マウスＩｇＭ（１：５００に希釈、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００に希釈、インビトロジェン）、Ａｌｅｘａ４８８結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：５００に希釈、インビトロジェン）、Ｃｙ３結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００に希釈、ケミコン）、及びＡｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００に希釈、インビトロジェン）を使用した。核は１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（インビトロジェン）により染色した。

７．インビトロでの分化
ヒトｉＰＳ細胞をコラゲナーゼＩＶにより処理した後、ｈｙｄｒｏｘｙｒｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅでコートしたディッシュ上に移し２０％ＫＳＲ（インビトロジェン）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｘ１０^−４Ｍ非必須アミノ酸、１ｘ１０^−４Ｍ ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン）及び０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用し、浮遊培養を行い胚様体（ＥＢｓ）を形成した。培地は一日おきに交換した。浮遊培養の８日後、ＥＢｓをゼラチンコートしたプレートに移し、同じ培地中でさらに８日間培養した。
ドーパミン作用性ニューロンへの分化のために、まず、ＰＡ６フィーダー細胞をゼラチンコートされた６ウェルプレート上に撒き、コンフルエントになるまで４日間インキュベートした。ＥＢｓを介して培養したｉＰＳ細胞の小さな塊をＰＡ６フィーダー細胞層上に加え、１０％ＫＳＲ（インビトロジェン）、１ｘ１０^−４Ｍ非必須アミノ酸、及び１ｘ１０^−４Ｍ ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン）、並びに０．５％ペニシリン及びストレプトマイシンを含むグラスゴー最小必須培地（インビトロジェン）を用いて培養した。
心筋細胞への分化のためには、ｉＰＳ細胞をマトリゲルコートされたプレート上で４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＭＥＦ−ＣＭ中に６日間維持した。その後、ＲＰＭＩ１６４０にＢ２７サプリメント（インビトロジェン）を補充した培地（ＲＰＭＩ／Ｂ２７）に１００ｎｇ／ｍｌヒト組換えアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステム）を添加した培地を用いて２４時間培養し、続いて１０ｎｇ／ｍｌヒト組換え骨形成因子４（ＢＭＰ４、Ｒ＆Ｄシステム）を補充してさらに４日間置いた。サイトカインによる刺激後、細胞はサイトカイン無しでＲＰＭＩ／Ｂ２７中に維持した。培地は一日おきに交換した。

８．バイサルファイトシークエンス法
ゲノムＤＮＡ（１μｇ）を、ＣｐゲノムＤＮＡ修飾キット（ケミコン）を用いて製造業者が推奨する方法に従って処理した。処理したＤＮＡをＱＩＡクイックカラム（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。ヒトＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１遺伝子のプロモーター領域をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにサブクローニングした。それぞれのサンプルの１０クローンをＭ１３ユニバーサルプライマーを用いてシークエンシングした。ＰＣＲ増幅に使用したプライマー配列を表８に示した。

９．ルシフェラーゼアッセイ
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むそれぞれのレポータープラズミド（１μｇ）を５０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ（プロメガ）を用いてヒトｉＰＳ細胞又はＨＤＦに導入した。遺伝子導入の４８時間後、細胞を１ｘＰａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ）により溶解し、室温で１５分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）及びＣｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０検出システム（バーソルド）を用いて製造業者のプロトコルに従って測定した。

１０．奇形腫形成
細胞をコラゲナーゼＩＶ処理により採取し、チューブに回収して遠心し、ペレットをＤＭＥＭ／Ｆ１２に懸濁した。コンフルエントな１００ｍｍディッシュから取った細胞の４分の１をＳＣＩＤマウス（日本クレア）の背側の側腹部へ皮下注入した。９週間後に腫瘍を切除して重量を測定し、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳにより固定した。パラフィン包理した組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。

１１．ウェスタンブロット
セミコンフルエント状態にある細胞をプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロッシュ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、１％デオキシコール酸ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ）により溶解した。ＭＥＬ−１ヒトＥＳ細胞株の細胞溶解物をアブカムから購入した。細胞溶解物（２０μｇ）を８％又は１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ミリポア）に移した。膜は１％スキムミルクを含むＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１３６ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロッキングし、その後、一晩４℃で一次抗体を反応させた。ＴＢＳＴによる洗浄後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体とともに室温で一時間反応させた。シグナルをイモビロンウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（ミリポア）及びＬＡＳ３０００画像化システム（富士フィルム）により検出した。１次抗体としては、抗Ｏｃｔ３／４（１：６００に希釈、ＳＣ−５２７９、サンタクルズ）、抗Ｓｏｘ２（１：２０００に希釈、ＡＢ５６０３、ケミコン）、抗Ｎａｎｏｇ（１：２００に希釈、Ｒ＆Ｄシステム）、抗Ｋｌｆ４（１：２００に希釈、ＳＣ−２０６９１、サンタクルズ）、抗ｃ−Ｍｙｃ（１：２００に希釈、ＳＣ−７６４、サンタクルズ）、抗Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（１：１０００に希釈、６１０１８２、ＢＤバイオサイエンス）、抗Ｄｐｐａ４（１：５００に希釈、ａｂ３１６４８、アブカム）、抗ＦｏｘＤ３（１：２００に希釈、ＡＢ５６８７、ケミコン）、抗テロメラーゼ（１：１０００に希釈、ａｂ２３６９９、アブカム）、抗Ｓａｌｌ４（１：４００に希釈、ａｂ２９１１２、アブカム）、抗Ｌｉｎ２８（１：５００に希釈、ＡＦ３７５７、Ｒ＆Ｄシステム）、抗βアクチン（１：５０００に希釈、Ａ５４４１、シグマ）、２次抗体としては抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：３０００に希釈、＃７０７６、セルシグナリング）、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２０００に希釈、＃７０７４、セルシグナリング）、及び抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：３０００に希釈、ＳＣ−２０５６、サンタクルズ）を使用した。

１２．サザンブロット
ゲノムＤＮＡ（５μｇ）を、ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ、及びＮｃｏＩにより一晩消化した。消化したＤＮＡフラグメントを０．８％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜（アマシャム）に移した。膜をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識したＤＮＡプローブと共にＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ緩衝液（ロッシュ）中で一定の振盪下に４２℃で一晩反応させた。洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体（１：１００００に希釈、ロッシュ）を膜に添加した。シグナルはＣＤＰスター（ロッシュ）により増強させ、ＬＡＳ３０００画像化システムにより検出した。

１３．ショートタンデムリピート分析及び核型分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）
ゲノムＤＮＡを用いて、パワープレックス１６システム（プロメガ）によりＰＣＲを行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ及びＧｅｎｅ Ｍａｐｐｅｒ ｖ３．５（アプライドバイオシステム）により分析した。染色体Ｇバンド分析は日本遺伝子研究所（日本）で行った。

１４．テロメラーゼ活性の検出
テロメラーゼ活性はＴＲＡＰＥＺＥテロメラーゼ検出キット（ケミコン）により取扱説明書に従って検出した。サンプルはＴＢＥをベースにした１０％アクリルアミド非変性ゲル電気泳動により分離した。ゲルはＳＹＢＲゴールド（１：１００００に希釈、インビトロジェン）により染色した。

１５．クロマチン免疫沈降アッセイ
約１ｘ１０^７個の細胞を室温下で１％ホルムアルデヒドで５分間架橋し、グリシン添加により反応を停止した。細胞ライセートを超音波処理することにより、クロマチン−ＤＮＡ複合体を切断した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（インビトロジェン）結合抗トリメチルＬｙｓ４ヒストンＨ３（０７−４７３，Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗トリメチルＬｙｓ２７ヒストンＨ３（０７−４４９，Ｕｐｓｔａｔｅ）、又は正常ウサギＩｇＧ抗体を用いて免疫沈降を行った。溶出液を定量的ＰＣＲの鋳型として用いた。

１６．ＤＮＡマイクロアレイ
ＨＤＦ及びｈｉＰＳ細胞（クローン２０１Ｂ）からの全ＲＮＡをＣｙ３により標識した。サンプルを全ヒトゲノムマイクロアレイ４ｘ４４Ｋ（Ｇ４１１２Ｆ、アジレント）とハイブリダイズさせた。各サンプルは１つのカラープロトコールと１回ハイブリダイズさせた。アレイをＧ２５６５ＢＡマイクロアレイスキャナーシステム（アジレント）を用いてスキャンし、データをＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇＧＸ７．３．１ソフトウェアを用いて分析した。２種の標準化手法を適用した。先ず、０．０１未満のシグナル強度を０．０１と設定した。次いで、各チップを、そのチップから取得した測定の５０番目の百分位数に標準化した。ｈＥＳ Ｈ９細胞のマイクロアレイデータ（Ｔｅｓａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．１９６−１９９，２００７）をＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓ（ＧＳＭ１９４３９０，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｄｓ＆ｃｍｄ＝ｓｅａｒｃｈ＆ｔｅｒｍ＝ＧＳＥ７９０２）から回収した。３つの全てのサンプルにおいて″ｐｒｅｓｅｎｔ″フラグ値を有する遺伝子を分析に用いた（３２，２６６遺伝子）。ＨＤＦ及びｈｉＰＳ細胞のマイクロアレイデータをＧＥＯ ＤａｔａＳｅｔｓにアクセッション番号ＧＳＥ９５６１として登録した。

例１９：ｃ−Ｍｙｃを用いないｉＰＳ細胞の樹立
Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃをマウス線維芽細胞にレトロウイルスを用いて導入することにより得られるマウスｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−７６，２００６）のｉＰＳクローンは各遺伝子について数個のレトロウイルスの組み込みを含んでいる。各クローンは全部で２０を超えるレトロウイルスの組み込み部位を有しており、腫瘍形成の危険を増大させる可能性がある。マウスｉＰＳ細胞の場合、ｉＰＳ細胞に由来するキメラマウス及びその子孫の〜２０％において腫瘍が発生することが分かっており（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−１７，２００７）、ｃ−Ｍｙｃレトロウイルスの再活性化は、ｉＰＳ細胞を用いて作製したキメラマウス及びその子孫マウスにおいて腫瘍形成発生率を増加させる可能性がある。そこでｃ−Ｍｙｃを用いずにｉＰＳ細胞を樹立する方法を検討した。

また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの４種の遺伝子のファミリー遺伝子を用いてｉＰＳ細胞を樹立できるか否かを検討した。この目的のためにＮａｎｏｇ遺伝子調節エレメントよって調節される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ^ｒ導入遺伝子を含むマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−３１７，２００７）。ＮａｎｏｇはマウスＥＳ細胞及び着床前胚細胞において特異的に発現しているため（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３，ｐｐ．６４３−６５５，２００３；Ｍｉｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１３，ｐｐ．６３１−６４２，２００３）、ｉＰＳ細胞誘導における選択マーカーとして有用である。初期化誘導されればＧＦＰが発現し、これがｉＰＳ細胞であるとの指標になる。Ｎａｎｏｇで選択したｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と区別ができず、生殖系列に寄与する（ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）キメラマウスを作製することが示されている（Ｗｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１８−３２４，２００７；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−３１７，２００７；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１，ｐｐ．５５−７０，２００７）。

Ｏｃｔ３／４はＰＯＵドメインを含むＯｃｔファミリー転写因子に属する（Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １１：１２０７−２５，１９９７）。Ｏｃｔ３／４に最も近いホモログはＯｃｔ１及びＯｃｔ６である。Ｏｃｔ３／４、Ｏｃｔ１又はＯｃｔ６を残りの３遺伝子とともにレトロウイルスによりＮａｎｏｇレポーターＭＥＦに導入した。Ｏｃｔ３／４を用いた場合、多くのＧＦＰ陽性コロニーが観察された（図２３ａ）。

Ｓｏｘ２は高移動度群（ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ；ＨＭＧ）ドメインの存在によって特徴づけられるＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）転写因子に属する（Ｓｃｈｅｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，３，ｐｐ．１６７−１７０，２００２）。Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、及びＳｏｘ１８について試験を行い、Ｓｏｘ１を用いた場合にＧＦＰ陽性コロニーが得られた。また、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、及びＳｏｘ１８を用いた場合も少数のＧＦＰ陽性コロニーが得られた（図２３ａ）。

Ｋｌｆ４はショウジョウバエ胚パターンレギュレーターＫｒｕｐｐｅｌのアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を含む亜鉛フィンガータンパク質であるＫｒｕｐｐｅｌ様因子（Ｋｌｆｓ）に属する（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３２，ｐｐ．１１０３−１１２１，２０００）。Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、及びＫｌｆ５について試験を行い、Ｋｌｆ２を用いた場合にＧＦＰ発現コロニーが得られた（図２３ａ）。Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５を用いた場合もｉＰＳ細胞を誘導することができた。

ｃ−Ｍｙｃには２種の関連する遺伝子（Ｎ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ）が存在する（Ａｄｈｉｋａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．６３５−６４５，２００５）。Ｎ−Ｍｙｃ又はＬ−Ｍｙｃを用いることによりＧＦＰ陽性コロニーが出現した（図２３ａ）。従って、４遺伝子のファミリー遺伝子を用いることによってｉＰＳ細胞を誘導することができることが示された。

ファミリー遺伝子についてβｇｅｏがＦｂｘ１５遺伝子座にノックインされたＭＥＦ（Ｔｏｋｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２３，ｐｐ．２６９９−２７０８，２００３）からｉＰＳ細胞を誘導することができるかどうかを検討したところ、Ｎａｎｏｇに基づいた選択で得られた結果と類似した結果が得られた。すなわち、Ｓｏｘ２はＳｏｘ１又はＳｏｘ３で置き換えることができ、Ｋｌｆ４はＫｌｆ２で置き換えることができ、またｃ−ＭｙｃはＮ−Ｍｙｃ又はＬ−Ｍｙｃで置き換えることができた。ファミリー遺伝子を用いて作製された細胞は増殖可能であり、ＥＳ細胞と区別ができない形態を呈し、かつヌードマウスにおいて奇形腫を形成した（図２４）。従って、これらのファミリー遺伝子がＮａｎｏｇレポーターＭＥＦ及びＦｂｘ１５レポーターＭＥＦの両方からｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。

ＮａｎｏｇレポーターＭＥＦから数個のＥＳ細胞様ＧＦＰ陽性コロニーがｃ−Ｍｙｃを用いることなく得られた（図２３ａ）。先に沖田らはＧＦＰ陽性コロニーがｃ−Ｍｙｃなしでは得られないことを報告しているが（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−１７，２００７）、この刊行物で報告されている方法と上記の方法との相違点の一つは薬剤選択のタイミングにある。上記刊行物に記載された方法ではピューロマイシン選択を遺伝子導入の７日後に開始しているが、今回の方法では薬剤選択を１４日目に開始した。ＮａｎｏｇレポーターＭＥＦに４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又はｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子のいずれかを導入し、遺伝子導入の７日後、１４日後、又は２１日後にピューロマイシン選択を開始した（図２３ｂ）。４遺伝子を用いた場合にはＧＦＰ陽性コロニーがすべての条件において観察され、ピューロマイシン選択を遅らせた場合にコロニー数は顕著に増加した。ｃ−Ｍｙｃを用いない場合は、選択を遺伝子導入の７日後に開始した場合にはＧＦＰ陽性コロニーは観察されなかったが、選択を遺伝子導入の１４日後又は２１日後に開始した場合にＧＦＰ陽性コロニーが出現した。コロニー数は各条件において４遺伝子を用いる場合よりも３遺伝子を用いる場合の方が少なかった。ｃ−Ｍｙｃレトロウイルス以外の３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４）を導入することで得られたＮａｎｏｇで選択したｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞マーカー遺伝子をＥＳ細胞の場合のレベルに匹敵するレベルで発現しており（図２５）、胚盤胞に移植した場合にアダルトのキメラマウスを作出することができた（表９）。

もう一つの相違点は、ｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子を用いてｉＰＳ細胞を誘導した場合には、ＧＦＰ陰性コロニー及びバックグラウンド細胞の数が４遺伝子を導入した場合よりも少ないということである（図２３ｃ）。従って、ｃ−Ｍｙｃを用いずにｉＰＳ細胞を誘導する方法はｃ−Ｍｙｃを用いるｉＰＳ細胞誘導に比べて遅く、かつ効率は低下するものの、ｉＰＳ細胞誘導の特異性は向上するという利点がある。

βｇｅｏがＦｂｘ１５遺伝子座にノックインされたＭＥＦ（Ｔｏｋｕｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２３，ｐｐ．２６９９−２７０８，２００３）からｃ−Ｍｙｃを用いずに数個のｉＰＳ細胞を生成することができた（図２６Ａ）。先に高橋らはｉＰＳ細胞はｃ−Ｍｙｃなしでは得られなかったことを報告しているが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６）、この刊行物で報告されている方法と上記の方法において、Ｇ４１８選択は同じタイミング、すなわち遺伝子導入の３日後に開始している。しかしながら、上記刊行物で報告されている方法ではコロニーを遺伝子導入の１４〜２１日後に選択しているのに対して、今回の実験では約３０日後にコロニー選択を行っている。また、今回の実験においては４遺伝子（又は３遺伝子）を含むレトロウイルスをそれぞれ独立したＰＬＡＴ−Ｅ細胞（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，ｐｐ．１０６３−１０６６，２０００）を用いて別々に調製している。この操作によりレトロウイルスのトランスフェクション効率が改善しており、４遺伝子の全てを単一のＰｌａｔ−Ｅ細胞で調製した既報の方法に比べてｉＰＳ細胞コロニー数の顕著な増加が観察された。

４遺伝子を用いて作製したＦｂｘ１５選択によるｉＰＳ細胞ではＥＳ細胞マーカー遺伝子の発現レベルはＥＳ細胞に比べて低レベルである（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６）。このｉＰＳ細胞は胚盤胞へマイクロインジェクションした場合にアダルトのキメラマウスを作出することができないが、ｃ−Ｍｙｃを用いずに作製したｉＰＳ細胞は、Ｆｂｘ１５選択を用いた場合においてもＥＳ細胞に匹敵するレベルでＥＳ細胞マーカー遺伝子を発現していた（図２６Ｂ）。また、ｃ−Ｍｙｃを用いずに作製したｉＰＳ細胞からはアダルトのキメラマウスが高いｉＰＳ細胞寄与率で得られた（図２７、表９）。腫瘍形成の発生率の増加はこれらのキメラマウスにおいては観察されなかった。すなわち、４遺伝子により樹立したｉＰＳ細胞由来のキメラマウスは、生後１００日以内に３７匹中６匹のキメラマウスが腫瘍が原因で死亡したが、ｃ−Ｍｙｃの無い３遺伝子により樹立したｉＰＳ細胞由来のキメラマウスは、２６匹のキメラ全てが観察期間内（４か月弱）生存していたことから、ｃ−Ｍｙｃを用いないことにより、腫瘍形成性のリスクが減少することが明らかとなった。

ｃ−Ｍｙｃを用いずに、かつ薬剤選択なしでｉＰＳ細胞を効率的に単離できるか否かを調べた。４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又はｃ−Ｍｙｃを除く３遺伝子をＮａｎｏｇレポーターを含むアダルトの尻尾線維芽細胞（ｔａｉｌ ｔｉｐ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ＴＴＦ）に導入し、ピューロマイシン選択を適用せずに培養を継続した。遺伝子導入された細胞を視覚化するために、ＤｓＲｅｄレトロウイルスを４遺伝子又は３遺伝子とともに導入した。。レトロウイルス導入の３０日後には、４遺伝子を用いて遺伝子導入したディッシュは多数のＧＦＰ陰性コロニー及びバックグラウンド細胞で覆われた（図２８Ａ、表１０：Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰレポーターＴＴＦ＋薬剤選択なし）。表中の括弧内の数値は、ＧＦＰ陽性コロニー又はクローンの数を示す。レトロウイルス（Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，Ｋｌｆ４，（ｃ−Ｍｙｃ），及びＤｓＲｅｄ）の割合は、Ｎｏ．２５６において１：１：１：（１）：４、Ｎｏ．２７２及び３０９において１：１：１：（１）：１であった。Ｎｏ．２２０においてはＤｓＲｅｄを導入しなかった。

蛍光顕微鏡下でこれらのコロニーのなかにＧＦＰ陽性コロニーが観察された（３回の独立した実験において４個、１３２個、及び４２４個のコロニー）。ＧＦＰ陽性コロニーはＤｓＲｅｄ陰性であり、この結果はＮａｎｏｇで選択したｉＰＳ細胞において観察されたレトロウイルスのサイレンシングの結果と一致していた（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−１７，２００７）。ｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子を用いた場合には、コロニーのなかでバックグラウンド細胞をほとんど持たないコロニーとして観察された（３回の独立した実験において７個、２１個、及び４３個）。これらのコロニーの約半分はパッチ状態（ｐａｔｃｈｙ ｍａｎｎｅｒ）でＧＦＰを発現していた。ＤｓＲｅｄは少数のコロニーにおいてのみ検出され、ＤｓＲｅｄは大部分がサイレンシングされていることが示された。ＧＦＰ及びＤｓＲｅｄの間でオーバーラップは観察されなかった。これらのコロニーのほとんどは増殖可能であり、継代数２においてもＧＦＰ陽性であり、かつＤｓＲｅｄ陰性であった。従って、薬剤選択を行わない場合においてもｃ−Ｍｙｃを用いることなくｉＰＳ細胞を作製でき、ｉＰＳ細胞作製の特異性が向上することが示された。このｉＰＳ細胞においてはＮａｎｏｇ−ＧＦＰは活性化され、かつレトロウイルスはサイレンシングされていた。

選択マーカーを有さないが、構成的に活性なプロモーターによって調節されるＤｓＲｅｄ組換え遺伝子（Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，４０，ｐｐ．２４１−２４６，２００４）を有するアダルトＴＴＦから、ｉＰＳ細胞の作製を試みた。４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又はｃ−Ｍｙｃを除く３遺伝子を細胞に導入した。さらにＧＦＰレトロウイルスを導入してサイレンシングをモニターした。４遺伝子を導入した０．５×１０^５個の細胞から薬剤選択なしで３０日後に約１，０００個のコロニーが出現した。これらの大部分はＧＦＰ陽性であり、これらの細胞ではレトロウイルスのサイレンシングが生じていないことが示された。一方、ｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子を導入した３．５×１０^５個の細胞から１６個のコロニーが出現した（図２８Ｂ）。これらのコロニーの大部分はＧＦＰを発現しておらず、残りのコロニーはわずかにＧＦＰを発現していた。これらのコロニーは全て増殖可能であり、継代数２においてもｉＰＳ細胞の形態（ＥＳ細胞様形態）を示した。また、これらの細胞は全てＧＦＰ陰性であり、レトロウイルスのサイレンシングが生じていることが示された。ＲＴ−ＰＣＲにより、これらの細胞ではＥＳ細胞に匹敵するレベルでＥＳ細胞マーカー遺伝子が発現していることが示された（図２８Ｃ）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲにより３遺伝子を用いて作製されたｉＰＳ細胞においてＫｌｆ４のレトロウイルスのサイレンシング及びｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子の不存在が確認され、これらのｉＰＳ細胞を胚盤胞に移植した場合にはキメラマウスが得られた（図２８Ｄ及び表９）。以上の結果から、ｃ−Ｍｙｃを用いることなく優れた特性を有するｉＰＳ細胞を得ることができ、薬剤選択を用いることなくアダルトＴＴＦからｉＰＳ細胞を効率的に作製できることが示された。

次に、Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４に対するレトロウイルスをヒト新生児包皮由来線維芽細胞（ＢＪ）（クローン２４６Ｈ）又はヒト成人皮膚由来繊維芽細胞ＨＤＦ（２５３Ｇ）に導入した。３０日後、数個のヒトｉＰＳ細胞コロニーが出現した。これらの細胞はヒトＥＳ細胞様のコロニー形態を示し、かつ増殖することができた（図２９Ａ）。ｃ−Ｍｙｃ以外の３遺伝子を導入した場合（２５３Ｇ）、又はｃ−Ｍｙｃに３遺伝子を加えて同時に導入した場合（２５３Ｆ）に、ＨＤＦに由来するヒトｉＰＳ細胞がＥＳ細胞マーカー遺伝子を発現することが確認された（図２９Ｂ）。また、ｃ−Ｍｙｃレトロウイルスを用いずに誘導されたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を介した分化が確認された（図３０）。

例１９における実験材料及び方法は以下の通りである。
１．プラスミドの構築
ファミリー遺伝子のコード領域を表１１（配列表の配列番号１２７から１５２）にリストしたプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ｐＤＯＮＲ２０１又はｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）にサブクローニングし、ＬＲ反応（インビトロジェン）によりｐＭＸｓ−ｇｗに連結した。

２．レトロウイルスの形質導入
Ｆｕｇｅｎｅ６試薬（ロッシュ）を製造業者の指示に従って用いてｐＭＸｓに基づいたレトロウイルスベクターをＰＬＡＴ−Ｅ細胞（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，ｐｐ．１０６３−１０６６，２０００）へトランスフェクションした。２４時間後に培地を交換し、さらに２４時間後にウイルス含有上清を採取し、レトロウイルス感染による遺伝子導入を行った。「混合」プロトコルでは４遺伝子をそれぞれ含むベクターの混合物を用いてＰＬＡＴ−Ｅ細胞の単一ディッシュに遺伝子導入した。「個別」方法では、各ベクターをＰＬＡＴ−Ｅ細胞を含む個別のディッシュに遺伝子導入した。ウイルス含有上清は遺伝子導入の前に混合した。「個別」方法において有意に高い遺伝子導入効率が観察された。

３．薬剤選択を用いたｉＰＳ細胞の誘導
ｉＰＳ細胞の誘導は既報の方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−１７，２００７）を修正して行った。Ｎａｎｏｇ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒレポーター又はＦｂｘ１５−βｇｅｏレポーターのいずれか又は両方を含むＭＥＦをＳＮＬフィーダー細胞（ＭｃＭａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６２，ｐｐ．１０７３−１０８５，１９９０）をあらかじめ播いておいた６ウェルプレート及び１００ｍｍディッシュに１．３×１０^５細胞／ウェル（６ウェルプレート）及び８．０×１０^５細胞／ウェル（１００ｍｍディッシュ）の割合で撒いた。遺伝子を導入した細胞をＬＩＦ（Ｍｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３，ｐｐ．１４０４１−１４０４６，１９９６）を含むＥＳ細胞用培地で培養した。Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）又はピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ）による選択は既報の方法の通り開始した。遺伝子導入の２５日から３日後にコロニー数を測定した。コロニーの一部を選択して継代させた。

４．薬剤選択を用いないｉＰＳ細胞誘導
ＴＴＦをアダルトＮａｎｏｇレポーターマウス又はアダルトＤｓＲｅｄトランスジェニックマウスから単離した（Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ，４０，ｐｐ．２４１−２４６，２００４）。レトロウイルス含有上清は「個別」方法で調製した。４遺伝子の導入のためにＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＤｓＲｅｄのレトロウイルス含有上清を１：１：１：１：４の比率で混合した。３遺伝子を導入する場合は、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｍｏｃｋ（空ベクター）、及びＤｓＲｅｄのレトロウイルス含有上清を、１：１：１：１：４の比率で混合した。ＤｓＲｅｄトランスジェニックマウスについては、ＧＦＰレトロウイルスをＤｓＲｅｄの代わりに使用した。トランスフェクションのためにＴＴＦをフィーダー細胞層を有しない１００ｍｍディッシュに１ディッシュあたり８．０×１０^５細胞の割合で撒いた。ＴＴＦにウイルス／ポリブレン含有上清を添加し、２４時間感染させた。遺伝子導入の４日後に３遺伝子を導入したＴＴＦをＳＮＬフィーダー細胞層を有する１００ｍｍディッシュに１ディッシュあたり３．５×１０^５細胞の割合で再び撒き、ＥＳ細胞用培地で培養した。４遺伝子を導入したＴＴＦはＳＮＬフィーダー細胞層を有する１００ｍｍディッシュに１ディッシュあたり０．５×１０^５細胞の割合で再度撒いた。遺伝子導入の３０日から４０日後にコロニー数を測定した。コロニーの一部を選択して継代した。
５．ｉＰＳ細胞の評価
ＲＴ−ＰＣＲ及び奇形腫形成を既報の方法の通り行った。キメラ実験については１５から２０個のｉＰＳ細胞をＢＤＦ１由来胚盤胞に注入し、これを偽妊娠マウスの子宮に移植した。

例２０：６遺伝子を用いた上皮細胞からのヒトｉＰＳ細胞の樹立
下記遺伝子：Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿１４５８３３（マウス）又はＮＭ＿０２４６７４（ヒト））の組み合わせ、又はその組み合わせから１又は２以上の遺伝子を除いた組み合わせを用いてｉＰＳ細胞の誘導を行った。

６ｘ１０^６個の２９３ＦＴ細胞を１０ｃｍシャーレに播いて一晩培養し、このシャーレに３μｇのｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ−Ｓｌｃ７ａ１レンチウイルスベクターを９μｇのＶｉｒａｐｏｗｅｒ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｍｉｘと一緒にリポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションした。２４時間後、培地を新しい培地に交換した。さらに２０時間後、培養上清を採取し、孔径０．４５−μｍのセルロースアセテートフィルター（ワットマン）で濾過した。５ｘ１０^５個の上皮細胞を前日に用意した。培養上清を取り除いた上皮細胞のシャーレに上記の濾過した培養上清に４μｇ／ｍｌのポリブレン（ナカライタスク）を添加したものを加え、細胞を２４時間培養した。

６ｃｍのシャーレに１．０×１０^６個のＰＬＡＴ−Ｅ細胞を播いて培養した。その翌日、細胞にＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８を含むｐＭＸを基礎としたレトロウイルスベクター９．０μｇを２７μｌのＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（ロシュ）を用いてトランスフェクションした。２４時間後、培地を新しい培地に交換した。さらに次の日、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞の上清を回収し、孔径０．４５−μｍのセルロースアセテート・フィルター（ワットマン）で濾過した。レンチウイルス感染の７日後に、上皮細胞を３．０×１０^５／６ｃｍディッシュに播き直し、レトロウイルスとポリブレンを含む上記の培養上清を添加した。

結果を表１２に示す。表中の“６Ｆ”は６遺伝子（Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）を示し、“Ｌ”はＬｉｎ２８、“Ｎ”はＮａｎｏｇ、“Ｍ”はｃ−Ｍｙｃ、“Ｏ”はＯｃｔ３／４、“Ｓ”はＳｏｘ２、“Ｋ”はＫｌｆ４をそれぞれ示す。文字の前の“−”は“−”に続く文字が示す遺伝子を上記６遺伝子から除いた場合を意味しており、例えば“−Ｌ”は６遺伝子からｌｎ−２８を除いた残りの５遺伝子を意味し、“−ＫＳ”は６遺伝子からＫｌｆ４及びＳｏｘ２を除いた４遺伝子を意味する。表中の数値はコロニー数を示し、“ｎｏｎ−ＥＳ ｌｉｋｅ”は非ＥＳ様形態を有するコロニーを示し、“ＥＳ ｌｉｋｅ”はＥＳ様細胞形態を有するコロニーを示す。

表１２には２回の実験結果を示した。１回目の実験結果は、遺伝子導入後２３日又は２９日目に各遺伝子の組み合わせを導入して誘導した細胞のコロニー数を示し、２回目の実験結果（右欄のＤａｙ２３）は“６Ｆ”、“−ＫＭ”、及び“−ＮＬ”の場合のコロニー数を示す。″−Ｌ″のようにＬｉｎ−２８を導入しない細胞のコロニー数の方がＬｉｎ−２８を導入した場合のコロニー数よりも少なかったことから、Ｌｉｎ２８がｉＰＳ細胞の樹立効率を向上させるのに重要な役割を担っていることが示された。

さらに、６遺伝子（Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）、及び４遺伝子の２つの異なる組み合わせ（図３１においてＹ４Ｆで示されるＫｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２、並びに図３１においてＴ４Ｆで示されるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）を用いてｉＰＳ細胞誘導を行った。Ｔ４ＦはＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７に開示されているものと同じ組み合わせである。図３１において“ＥＳ−ｌｉｋｅ”はＥＳ細胞のコロニーと形態的に類似したコロニーの数を示し、“ｔｏｔａｌ”はＥＳ様コロニーと非ＥＳ様コロニーの数の総数を示す。Ｅｘｐ＃１、Ｅｘｐ＃２、Ｅｘｐ＃３、及びＥｘｐ＃４はそれぞれ個別に実験を行った結果を示す。これらの実験において、６遺伝子及びＹ４Ｆの４遺伝子の組み合わせを用いることによってＥＳ様細胞コロニーと類似した形態を有するｉＰＳ細胞コロニーが得られた。しかしながら、Ｔ４Ｆの組み合わせでは、ＥＳ様細胞コロニーと類似した形態を有するコロニーの生成は認められなかった。

例２１：Ｓａｌｌ４を用いた効率的なｉＰＳ細胞の生成
マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）及びヒト成人皮膚由来繊維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）を用いて実験を行った結果、３遺伝子（Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、及びＳｏｘ２）を用いたｉＰＳ細胞誘導は、Ｓａｌｌ４をこの組み合わせに加えた場合、即ちＫｌｆ４，Ｏｃｔ３／４，Ｓｏｘ２，及びＳａｌｌ４を用いた場合にｉＰＳ細胞の作製効率を上昇させることが判明した（図３２及び３３）。Ｓａｌｌ４を４遺伝子（Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びｃ−Ｍｙｃ）に加えた場合、より多数のｉＰＳ細胞コロニーが観察された。これらの実験から、核初期化因子にＳａｌｌ４を追加することによってｉＰＳ細胞の誘導効率を改善できることが示された。

例２２：マウスＳａｌｌ４及び／又はマウスＳａｌｌ１のｉＰＳ細胞誘導促進効果
既報の方法（Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピックレセプターＳｌｃ７ａ遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞（ａｄｕｌｔ ＨＤＦ）に、ヒト由来の４遺伝子（Ｙ４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又は３遺伝子（Ｙ３Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４）と、マウスＳａｌｌ４（ｍＳａｌｌ４）遺伝子又はマウスＳａｌｌ１（ｍＳａｌｌ１）遺伝子とをレトロウイルスを用いて導入した。

導入後６日目に一旦ＨＤＦを回収し、その後５ｘ１０^５個に調整したＨＤＦを１．５ｘ１０^６個のマイトマイシンＣで処理したＳＴＯ細胞上に播種した。翌日以降は、４ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトｂＦＧＦ（ＷＡＫＯ）を含んだ霊長類ＥＳ細胞培養用培地（リプロセル）で培養した。感染後３２日目及び４０日目にＥＳ細胞様コロニー数をカウントした結果を図３４に示す。感染後３２日目においては、Ｙ３Ｆ＋Ｍｏｃｋ（空ベクター）を導入した場合のコロニー数は１個、Ｙ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は３７個であったのに対して、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にＳａｌｌ４を導入した場合にはＹ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で２２個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で７３個のコロニーが認められた。Ｙ３Ｆ又はＹ４ＦにｍＳａｌｌ１を導入した場合には、Ｙ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で２個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で４３個のコロニーが認められ、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆのみを導入した場合と比べてコロニー数の差は大きくなかった。さらにＹ３Ｆ又はＹ４ＦにｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入した場合のコロニー数は、Ｙ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で３４個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で７９個であった。

感染後４０日目においては、Ｙ３Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は８個、Ｙ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は５７個であったのに対して、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４を導入した場合にはＹ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で６２個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で１６７個のコロニーが認められた。Ｙ３Ｆ又はＹ４ＦにｍＳａｌｌ１を導入した場合には、Ｙ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で１４個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で１０３個のコロニーが認められた。さらにＹ３Ｆ又はＹ４ＦにｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入した場合のコロニー数はＹ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で９８個、Ｙ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で１９３個であった。以上の結果から、Ｙ３ＦにｍＳａｌｌ４を導入することにより、又はｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入することによって２０ないし１００倍の効率でヒトｉＰＳ細胞を誘導できることが示された。また、Ｙ４ＦにｍＳａｌｌ４を導入することにより、又はｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入することによって２ないし４倍の効率でヒトｉＰＳ細胞を誘導できることも示された。

例２３：マウスＳａｌｌ４及び／又はマウスＳａｌｌ１のｉＰＳ細胞誘導促進効果（２）
既報の方法（Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピック受容体Ｓｌｃ７ａを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）にヒト由来の４遺伝子（Ｔ４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８）又は３遺伝子（Ｔ３Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＮａｎｏｇ）とともに、マウスＳａｌｌ４（ｍＳａｌｌ４）又はマウスＳａｌｌ１（ｍＳａｌｌ１）あるいはその両方をレトロウイルスを用いて導入した。

導入後６日目に一旦ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１を回収し、その後５ｘ１０^５個に調整したＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１を１．５ｘ１０^６個のマイトマイシンＣで処理したＳＴＯ細胞の上に播種した。さらに７日間培養した後、リコンビナントヒト４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（和光純薬）を含んだ霊長類ＥＳ細胞培養用培地（リプロセル）で培養した。感染後３２日目及び４０日目にＥＳ細胞様コロニー数をカウントした結果を図３５に示す。感染後３２日目においては、Ｔ３Ｆ＋Ｍｏｃｋ及びＴ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は０個であったのに対して、Ｔ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４を導入した場合にはＴ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で２個のコロニーが認められた。Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群ではヒトＥＳ細胞様コロニーは確認できなかった。

Ｔ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ１を導入した場合にはＴ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で３個、Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群では６個のコロニーが認められた。さらにＴ３Ｆ又はＴ４ＦとともにｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入した場合には、Ｔ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で３個のコロニーが認められた。Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群ではヒトＥＳ様コロニーは確認できなかった。感染後４０日目においては、Ｔ３Ｆ＋Ｍｏｃｋ及びＴ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は０個であったのに対して、Ｔ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ４を導入した場合にはＴ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で６個のコロニーが認められ、Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４導入群で２個のコロニーが認められた。

Ｔ３Ｆ又はＴ４Ｆと同時にｍＳａｌｌ１を導入した場合にはＴ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で１３個、Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ１導入群で２２個のコロニーが認められた。さらにＴ３Ｆ又はＴ４ＦにｍＳａｌｌ４とｍＳａｌｌ１とを同時に導入した場合には、Ｔ３Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群で１７個のコロニーが認められ、Ｔ４Ｆ＋ｍＳａｌｌ４＋ｍＳａｌｌ１導入群では１１個のコロニーが認められた。Ｔ３Ｆ及びＴ４Ｆの導入によるｉＰＳ細胞樹立においては、ｍＳａｌｌ４を追加することでｉＰＳ細胞コロニー形成における促進効果が認められ、ｍＳａｌｌ１のほうがより効率的にヒトｉＰＳ細胞コロニーの形成を誘導した。さらにｍＳａｌｌ１とｍＳａｌｌ４の両方をＴ３Ｆ又はＴ４Ｆとともに導入することによってヒトｉＰＳ細胞のコロニー形成をより促進できることが分かった。

例２４：ヒトＳａｌｌ４のｉＰＳ細胞誘導促進効果
Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７に記載の方法に従い、レンチウイルスを用いてマウスエコトロピック受容体Ｓｌｃ７ａを発現させたヒト成人皮膚由来線維芽細胞（ＨＤＦａ−Ｓｌｃ７ａ１）を用意し、翌日、ヒト由来の４遺伝子（Ｙ４Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）又は３遺伝子（Ｙ３Ｆ：Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）とヒトＳａｌｌ４（ｈＳａｌｌ４）とをレトロウイルスを用いて導入した。導入後６日目に一旦ＨＤＦを回収し、その後５ｘ１０^５個に調整したＨＤＦを１．５ｘ１０^６個のマイトマイシンＣで処理したＳＴＯ細胞の上に播種した。翌日以降は４ｎｇ／ｍｌリコンビナントヒトｂＦＧＦ（和光純薬）を含んだ霊長類ＥＳ細胞培養用培地（リプロセル）で培養した。感染後３２日目及び４０日目にＥＳ細胞様コロニー数をカウントした結果を図３６に示す。

感染後３２日目においては、Ｙ３Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は１個、Ｙ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は３４個であったのに対して、Ｙ３Ｆ又はＹ４Ｆと同時にｈＳａｌｌ４を導入した場合にはＹ３Ｆ＋ｈＳａｌｌ４導入群で８個、Ｙ４Ｆ＋ｈＳａｌｌ４導入群で５２個のコロニーが認められた。感染後４０日目においては、Ｙ３Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は５個、Ｙ４Ｆ＋Ｍｏｃｋを導入した場合のコロニー数は５２個であったのに対して、Ｙ３Ｆ及びＹ４Ｆと同時にｈＳａｌｌ４を導入した場合にはＹ３Ｆ＋ｈＳａｌｌ４導入群で３２個、Ｙ４Ｆ＋ｈＳａｌｌ４導入群で１３７個のコロニーが認められた。この結果、Ｙ３ＦにｈＳａｌｌ４を同時に導入することにより６ないし８倍の効率でヒトｉＰＳ細胞コロニーを得ることができ、Ｙ４Ｆと同時にｈＳａｌｌ４を導入することによって１．５ないし２．５倍の効率でヒトｉＰＳ細胞コロニーを得ることができることが示された。

例２５：Ｌ−Ｍｙｃの効果
（Ａ）４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＬ−Ｍｙｃ）導入による核初期化の検討
（１）ヒトｉＰＳ細胞誘導に対する効果
マウスエコトロピックウイルスレセプターＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞（ａＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１）を既報の方法（Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）に従って作製した。このａＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１を３ｘ１０^５個／６０ｍｍディッシュの割合で蒔き、その翌日、上記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２の３遺伝子にＬ−Ｍｙｃ１（以下、単に「Ｌ−Ｍｙｃ」と称する）、ｃ−Ｍｙｃ、又はＮ−Ｍｙｃ遺伝子を加えた合計４遺伝子）をレトロウイルスで導入した。ウイルス感染から６日後に細胞を回収し、ＭＳＴＯ細胞上への蒔き直しを行った（５ｘ１０^５個／１００ｍｍディッシュ）。その翌日から霊長類ＥＳ細胞培養用培地（リプロセル）に４ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトｂＦＧＦ（和光純薬）を加えた培地で培養を行った。

レトロウイルス感染後、３７日目に出現したヒトｉＰＳ細胞コロニー数をカウントした。４回の実験結果をまとめて表１３及び図３７に示す（図３７は表１３をグラフ化したものであり、グラフ上の数値はトータルコロニー数に対するｉＰＳ細胞コロニー数の割合を示す）。Ｌ−Ｍｙｃを用いることにより、ｉＰＳ細胞コロニーの誘導効率がｃ−Ｍｙｃに比べて６倍も高くなり、トータルコロニー数に対するｉＰＳ細胞コロニー数の割合についてもｃ−Ｍｙｃの場合に比べてＬ−Ｍｙｃを用いた場合のほうが約２倍増加していた。Ｎ−Ｍｙｃを用いた場合にもｃ−Ｍｙｃの場合に比べてｉＰＳ細胞コロニー数の増加が認められた。マウス線維芽細胞（ＭＥＦ）由来のｉＰＳ細胞誘導においては、ｃ−Ｍｙｃを用いた場合とＬ−Ｍｙｃを用いた場合との間に差が無いことが報告されているが（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６，ｐｐ．１０１−１０６，２００８）、ヒト細胞を用いる場合には、ｃ−ＭｙｃよりもＬ−Ｍｙｃを用いたほうがｉＰＳ細胞の誘導効率が顕著に向上することが明らかとなった。

（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化誘導
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＬ−Ｍｙｃの４遺伝子導入により樹立されたヒトｉＰＳ細胞（３２Ｒ２，３２Ｒ６）をｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｉｓｈに播き、既報の方法（Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）に従って胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させた（１００ｍｍディッシュ）。２週間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα−フェトプロテイン（Ｒ＆Ｄシステムズ）、中胚葉系細胞の分化マーカーであるα−平滑筋アクチン（和光純薬）、及び外胚葉系の分化マーカーであるβＩＩＩ−チューブリン（ケミコン）の各抗体を用いた染色を行った。結果を図３８に示す。上記染色により各マーカーの発現が確認され、得られたヒトｉＰＳ細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。

（３）奇形腫形成能
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＬ−Ｍｙｃの４遺伝子導入により樹立されたヒトｉＰＳ細胞（３２Ｒ６）を、リコンビナントヒトｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）及びＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含有する霊長類ＥＳ細胞培養用培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）中で培養した。１時間後、ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶで処理して細胞を採取後、遠心して細胞を回収し、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中に浮遊させた。コンフルエントになった細胞（１００ｍｍディッシュ）の１／４量をＳＣＩＤマウスの精巣内に注射した。２〜３ヶ月後、腫瘍を切り刻んで４％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ（−）で固定した。パラフィン包埋組織をスライスし、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。この結果を図３９に示す。組織学的に腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経組織、腸管様組織、軟骨組織、毛髪組織、脂肪細胞、及び色素組織が認められたことから、ｉＰＳ細胞の多能性が証明された。

（４）キメラマウスの腫瘍形成に対する影響
Ｎａｎｏｇ遺伝子座にＥＧＦＰとピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んで作製したＮａｎｏｇレポーターを有するマウス（Ｎａｔｕｒｅ，４４８，ｐｐ．３１３−３１７，２００７）よりＭＥＦを単離した（ＭＥＦ−Ｎｇ）。同様にＦｂｘ１５遺伝子座にβ−ｇｅｏ遺伝子を組み込んで作製したＦｂｘ１５レポーターを有するマウス（Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６）よりＭＥＦを単離した（ＭＥＦ−Ｆｂｘ）。これらのＭＥＦに４遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＬ−Ｍｙｃ）をレトロウイルスを用いて導入し、ＭＥＦ−Ｎｇについてはピューロマイシンで選択し、ＭＥＦ−ＦｂｘについてはＧ４１８で選択することによりｉＰＳ細胞を樹立した（それぞれＮａｎｏｇ−ｉＰＳ及びＦｂｘ−ｉＰＳと称する）。これらのｉＰＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に移植することによりキメラマウスを作出した。キメラマウス及びＦ１マウスにおける腫瘍形成を検討した結果、現時点でそれぞれ以下の日数生存しており、また生存しているいずれのマウスにおいても腫瘍の発生は認められなかった。

キメラマウスＦｂｘ−ｉＰＳ：１９／１９匹 ３４９日生存中
キメラマウスＮａｎｏｇ−ｉＰＳ：１５／１６匹 ３６３日生存中
Ｆ１ Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ：１／１匹 ２５５日生存中
Ｆ１ Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ：３／３匹 １８１日生存中
Ｆ１ Ｎａｎｏｇ−ｉＰＳ：１／１匹 １３２日生存中
キメラマウスＮａｎｏｇ−ｉＰＳ：３０／３０匹 ６３日生存中
キメラマウスＮａｎｏｇ−ｉＰＳ：１２／１４匹 ６２日生存中
Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−Ｍｙｃの４遺伝子により初期化を行ったｉＰＳ細胞を用いた場合には、生後１００日以内に３７匹中６匹のキメラマウスが腫瘍が原因で死亡したが（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６，ｐｐ．１０１−１０６，２００８）、ｃ−Ｍｙｃに代えてＬ−Ｍｙｃを用いることにより生存日数に顕著な改善が認められ、かつ腫瘍発生が劇的に減少することが明らかとなった。

（Ｂ）３遺伝子（Ｏｃｔ３／４，Ｋｌｆ４，Ｌ−Ｍｙｃ）導入による核初期化の検討
（１）ｉＰＳ細胞コロニー形成の有無
既報の方法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６，ｐｐ．１０１−１０６，２００８）に従い３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）導入によるｉＰＳの樹立を試みた。上記（Ａ）（１）ないし（４）に記載したＭＥＦ−Ｎｇをゼラチンコートした６ウェル培養プレートに１．３ｘ１０^５個／ウェルの割合で蒔き、２４時間後にマウス由来の３遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）をレトロウイルスを用いて導入した。ウイルス感染から４日後に細胞を回収し、ＭＳＴＯ細胞上への蒔き直しを行った（１．５ｘ１０^５個／６ウェルプレート）。翌日から細胞をＬＩＦを加えたＥＳ細胞培養用培地（ＤＭＥＭ（ナカライタスク）に１５％牛胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（インビトロジェン）、１００μＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン）、１００μＭ ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン（インビトロジェン）と５０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（インビトロジェン）を加えたもの）を用いて培養した。ウイルス感染から４６日目にＧＦＰ陽性コロニーをピックアップした（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３クローン）。ピックアップした１６個の細胞の写真を図４０に示す。いずれの細胞もＧＦＰ陽性を示すｉＰＳ細胞コロニーであった。

これらのＧＦＰ陽性コロニー由来のクローンついて、遺伝子発現を検討するためにＲＴ−ＰＣＲ及びＧｅｎｏｍｉｃ−ＰＣＲを行った。結果を図４１に示す。いずれのクローンもＥＳ細胞のマーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、及びＥＣＡＴ１を発現していた。また、全てのｉＰＳ細胞コロニーにおいて導入した３種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ）がゲノム中に組み込まれていた。一方、ｍＲＮＡの発現が検出されないクローンもあったが、これはサイレンシングを受けているためと考えられる。

（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化誘導
前記（１）で樹立した４つのクローン（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−３、ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−６、ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−１２、及びｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−１３）をｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｉｓｈに播き（２ｘ１０^６個／６ウェルプレート）、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させた。ＥＳ細胞培養用培地で２週間培養後、内胚葉系細胞の分化マーカーであるα−フェトプロテイン（Ｒ＆Ｄシステムズ），中胚葉系細胞の分化マーカーであるα−平滑筋誘導に（ダコ），外胚葉系の分化マーカーであるβＩＩＩ−チューブリン（ケミコン）の各抗体を用いた染色を行った。結果を図４２に示す。染色によりこれらのマーカーの発現が確認され、得られたマウスｉＰＳ細胞は三胚葉系への分化能を有することが確認された。

（３）奇形腫形成能
前記（１）で樹立した４つのクローン（ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−３、ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−６、ｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−１２、及びｉＰＳ−ＭＥＦ−Ｎｇ−４４３−３−１３）をそれぞれヌードマウスの皮下に注射した。４週間後に全例で奇形腫の形成が確認された。組織学的に腫瘍は複数の種類の細胞から構成されており、神経組織、腸管様組織、筋肉組織、表皮組織、及び軟骨組織が認められたことから（図４３）、ｉＰＳ細胞の多能性が証明された。

例２６：ヒトｉＰＳ細胞誘導におけるＬ−Ｍｙｃ及びＬｉｎ２８の効果
マウスエコトロピックウイルスレセプターＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞（ａＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１）を既報の方法（Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７）に記載の方法に従い作製した。このａＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１を３ｘ１０^５個／６０ｍｍディッシュの割合で蒔き、その翌日、上記刊行物に記載された方法に従ってヒト由来の以下の３遺伝子、４遺伝子、又は５遺伝子をレトロウイルスで導入した。
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、及びＫｌｆ４
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃ
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬｉｎ２８
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８
・Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８

ウイルス感染から６日後に細胞を回収しＭＳＴＯ細胞上への蒔き直しを行った（５ｘ１０^５個／１００ｍｍディッシュ）。その翌日から霊長類ＥＳ細胞培養用培地（リプロセル）に４ｎｇ／ｍｌのリコンビナントヒトｂＦＧＦ（和光純薬）を加えた培地で培養を行った。レトロウイルス感染後、３７日目に出現した全コロニー（Ｔｏｔａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）及びヒトｉＰＳ細胞コロニー数（ｈｉＰＳ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）をカウントした。結果を表１４及び図４４に示す（図４４は表１４をグラフ化したものである）。

Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＬ−Ｍｙｃの４遺伝子にＬｉｎ２８を加えることにより、ｉＰＳ細胞コロニー数が顕著に増加した。このｉＰＳ細胞コロニー数は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃの４遺伝子にＬｉｎ２８を加えた場合よりも顕著に多かった。また、Ｌｉｎ２８はｃ−Ｍｙｃの作用に対して相乗効果を示したが、Ｌ−Ｍｙｃの作用に対してはさらに強い相乗効果を示した（表１４）。トータルコロニー数に対するｉＰＳ細胞コロニーの割合についてもＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８の５遺伝子を用いた場合は極めて高い割合（８４．７％）を与えた。以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞の誘導効率を改善するためには、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８の５遺伝子の組み合わせが極めて有効であることが明らかとなった。

例２７：ヒトｉＰＳ細胞誘導におけるＭｙｃキメラ遺伝子及び変異遺伝子の効果
図４５に示す各種Ｍｙｃキメラ遺伝子（Ｍｓ−ｃＬ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−Ｌｃ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−ｃＬｃ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−ＬｃＬ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−ｃｃＬ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−ｃＬＬ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−ＬＬｃ−Ｍｙｃ、Ｍｓ−Ｌｃｃ−Ｍｙｃ）、及びＭｙｃ点変異遺伝子（ｃ−ＭｙｃＷ１３５Ｅ、ｃ−ＭｙｃＶ３９４Ｄ、ｃ−ＭｙｃＬ４２０Ｐ、Ｌ−ＭｙｃＷ９６Ｅ、Ｌ−ＭｙｃＶ３２５Ｄ、Ｌ−ＭｙｃＬ３５１Ｐ）を以下のとおり構築した。まず、マウスｃ−Ｍｙｃ（Ｍｓ−ｃ−Ｍｙｃ）及びＬ−Ｍｙｃ（Ｍｓ−Ｌ−Ｍｙｃ）をそれぞれｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｍｓ−ｃ−Ｍｙｃ及びｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｍｓ−Ｌ−Ｍｙｃを作製した。次に、マウスｃ−Ｍｙｃ（ＮＣＢＩ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０１０８４９）及びＬ−Ｍｙｃ（ＮＣＢＩ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００８５０６）の配列情報に基づいて、図４５に示した点変異を導入するためのプライマーを作製し、これを用いてｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｍｓ−ｃ−Ｍｙｃ及びｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ−Ｍｓ−Ｌ−Ｍｙｃを鋳型としてＰＣＲを行った。各変異についてシークエンスで確認後、ＬＲ反応にてレトロウイルスベクターのｐＭＸｓにサブクローニングした。図４５に示したキメラＭｙｃについては、各フラグメントをＰＣＲにて増幅し、それぞれの組み合わせに応じて混合したものを鋳型としてＰＣＲを行い、先と同様にレトロウイルスベクターのｐＭＸｓにサブクローニングした。

得られた各レトロウイルスベクターと例２５で用いたＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、及びＫｌｆ４の各レトロウイルスベクターとを例２５と同様にして成人皮膚由来線維芽細胞（ａＨＤＦ−Ｓｌｃ７ａ１）に導入し、レトロウイルス感染後、３１日目に出現した全コロニー（Ｔｏｔａｌ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）及びヒトｉＰＳ細胞コロニー（ｈｉＰＳ ｃｏｌｏｎｉｅｓ）の数をカウントした。結果を図４６及び表１５に示す（図４６は表１５をグラフ化したものである）。

ｃ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃは、いずれもヒトとマウスにおいてアミノ酸レベルで１００％近い同一性を有している。図４６及び表１５に示されるように、マウス遺伝子（Ｍｓ−ｃ−Ｍｙｃ及びＭｓ−Ｌ−Ｍｙｃ）を用いた場合にもヒト遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ）と同様にヒトｉＰＳ細胞コロニーが生じたことから、マウスのｃ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃはヒトのｃ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃと実質的に同一の機能を持つことが確認された。

各種のＭｙｃキメラ遺伝子及び点変異遺伝子での結果を野生型と比較した結果、Ｍｓ−ｃＬ−Ｍｙｃ及びＭｓ−ｃＬｃ−Ｍｙｃを用いた場合に、野生型Ｌ−Ｍｙｃ（Ｌ−Ｍｙｃ）と比べてｉＰＳ細胞コロニー数が増加しており、特にＭｓ−ｃＬ−Ｍｙｃを用いた場合に最も良好な結果が得られた。また、点変異遺伝子での結果から、ｃ−Ｍｙｃ及びＬ−Ｍｙｃ共にＣ末端の１つのアミノ酸（ｃ−ＭｙｃＬ４２０Ｐ及びＬ−ＭｙｃＬ３５１Ｐ）が非常に重要なことも明らかとなった。以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞樹立におけるＭｙｃの重要な機能領域は、ｃ−ＭｙｃのＮ末端側１／３の部分、Ｌ−Ｍｙｃの中央部分、及びｃ／Ｌ−ＭｙｃのＣ末端部分であることが示唆された。

本発明により安全な人工多能性幹細胞の製造方法及び効率的な人工多能性幹細胞の製造方法が提供される。
［配列表］

Claims (5)

1. 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法であって、Ｎａｎｏｇを含有しない下記の５種の遺伝子：
   （１）Ｏｃｔ３／４、
   （２）Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７及びＳｏｘ１８から選択される遺伝子、
   （３）Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５から選択される遺伝子、
   （４）Ｌ−Ｍｙｃ、並びに
   （５）Ｌｉｎ２８
   を体細胞に導入する工程を含む方法。
2. 前記５種の遺伝子が、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ−Ｍｙｃ、及びＬｉｎ２８である、請求項１に記載の方法。
3. 体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞である請求項１ないし２のいずれか１項に記載の方法。
4. 体細胞がヒトの体細胞である請求項１ないし２のいずれか１項に記載の方法。
5. 下記の工程（１）及び（２）：
   （１）請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法により人工多能性幹細胞を得る工程、及び
   （２）上記工程（１）で得られた人工多能性幹細胞を分化誘導する工程、
   を含む、体細胞の製造方法。