ES2843833T3 - Método de reprogramación nuclear - Google Patents

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ES2843833T3 ES08832782T ES08832782T ES2843833T3 ES 2843833 T3 ES2843833 T3 ES 2843833T3 ES 08832782 T ES08832782 T ES 08832782T ES 08832782 T ES08832782 T ES 08832782T ES 2843833 T3 ES2843833 T3 ES 2843833T3
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Shinya Yamanaka
Kazutoshi Takahashi
Masato Nakagawa
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Kyoto University
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Kyoto University
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Abstract

Un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de reprogramación nuclear
Campo técnico
La presente invención se refiere a un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas mediante la reprogramación de células somáticas diferenciadas.
Antecedentes de la técnica
La célula madre embrionaria (célula ES), que se obtiene de embriones tempranos humanos o de ratón, tiene la capacidad de proliferar indefinidamente mientras mantiene la pluripotencia y la capacidad de diferenciarse en todas las células que existen en un cuerpo vivo. Al usar estas propiedades, se espera que las células ES sean fuentes de terapias de trasplante de células para muchas enfermedades tales como la enfermedad de Parkinson, diabetes juvenil y leucemia. Sin embargo, existe el problema de que el trasplante de células ES lleva al rechazo de tejido después del trasplante en los pacientes. Además, hay muchas opiniones contrarias con respecto al uso de células ES humanas establecidas mediante la destrucción de embriones humanos desde un punto de vista ético.
Si las propias células somáticas diferenciadas de los pacientes se pueden utilizar para inducir la desdiferenciación y establecer células que tengan la pluripotencia y la capacidad de proliferar como las células ES (en la presente memoria descriptiva, esta célula se denomina "célula madre pluripotente artificial" o "célula iPS", y también se conoce como "célula madre pluripotente inducida", "célula de tipo célula madre embrionaria" o "célula tipo ES"), se espera que permitan el uso como célula pluripotente ideal sin reacción de rechazo ni problema ético. Recientemente, se ha documentado que esta célula iPS se puede generar a partir de células somáticas humanas y de ratón, y esto ha provocado una respuesta extremadamente masiva (Publicación internacional WO2007/69666; Cell, 126, págs.663-676, 2006; Cell, 131, págs.861-872, 2007).
El método anterior comprende la etapa de reprogramación mediante la introducción de una pluralidad de factores especificados (cuatro factores de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc se utilizan tal como se describe en Cell, 126, págs.663-676, 2006) en células somáticas, y se utilizan vectores retrovíricos para introducir los factores. Sin embargo, dado que c-Myc es un factor de transcripción asociado al cáncer, cuando los cuatro factores que comprenden c-Myc se introducen en las células somáticas para su reprogramación, no se puede negar la posibilidad de que las células o tejidos inducidos por diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas obtenidas tengan tumorigenicidad. Se sabe que los genes introducidos en células ES mediante el uso de vectores retrovíricos tienen función de silenciamiento y se ha confirmado que las células iPS generadas mediante el uso de vectores retrovíricos también tienen función de silenciamiento (véase el Ejemplo 7 de la Publicación Internacional WO2007/69666). Sin embargo, no hay garantía de que el c-Myc exógeno introducido no se exprese en su descendencia. Un método de reprogramación nuclear con los cuatro factores de Oct3/4, Sox2, Lin28 y Nanog sin usar c-Myc ha sido propuesto por Thomson et al. (Science, 318, págs.1917-1920, 2007; Publicación Internacional WO2008/118820). Sin embargo, la investigación y el desarrollo de las células iPS están progresando actualmente al seguir utilizando los cuatro factores de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en todo el mundo.
Además, la Publicación Internacional WO2007/69666 enseña que el gen de la familia Myc se puede reemplazar con citocinas, y el Ejemplo 5 de la memoria descriptiva anterior muestra que la reprogramación nuclear se puede lograr usando factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en lugar de c-Myc. Además, la Publicación Internacional anterior muestra que 24 genes seleccionados como candidatos del factor de reprogramación incluyen sall4 (Tabla 4 N.° 13). Sin embargo, no indica que Sall4 tenga la actividad de programación nuclear. Además, muestra que las células iPS se pueden establecer de manera eficaz combinando L-Myc o N-Myc, que es uno de los genes de la familia Myc, con Oct3/4, Sox2 y Klf4 en comparación con los generados mediante c-Myc (Ejemplo 6).
Publicación de patente 1: Publicación Internacional WO2007/69666
Publicación de patente 2: Publicación Internacional WO2008/118820
Publicación no de patente 1: Cell, 126, págs.663-676, 2006
Publicación no de patente 2: Cell, 131, págs.861-872, 2007
Publicación no de patente 3: Science, 318, págs.1917-1920, 2007
Divulgación de la invención
Problemas a resolver por la invención
Un problema de la presente invención es proporcionar un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas seguras. Concretamente descrito, un problema de la presente invención es proporcionar células madre pluripotentes inducidas seguras sin temor a la tumorigénesis en las células o tejidos obtenidos por inducción de diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas.
Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para generar eficazmente células madre pluripotentes inducidas.
Un objeto particularmente preferido de la presente invención es proporcionar un proceso para generar eficazmente las células madre pluripotentes inducidas seguras.
Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores estudiaron intensamente para resolver los problemas antes mencionados y, como resultado, descubrieron que se puede generar una célula madre pluripotente inducida segura sin usar c-Myc.
Además, los presentes inventores descubrieron que se pueden proporcionar células madre pluripotentes inducidas seguras sin temor a la tumorigénesis en las células o tejidos obtenidos mediante la inducción de la diferenciación realizando una reprogramación nuclear usando L-Myc, Salll o Sall4 sin usar c-Myc, y las células pluripotentes inducidas seguras se pueden generar de manera extremadamente eficaz al realizar este proceso.
La presente invención se completó basándose en los hallazgos anteriores.
Es decir, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
Según un aspecto preferible de este proceso, se proporciona el proceso que comprende las etapas de, después de la introducción de los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox, L-Myc y Lin28 en células somáticas, cultivar las células durante un tiempo suficiente para que las células adquieran pluripotencia y proliferen.
De acuerdo con otro aspecto preferible de este proceso, se proporciona el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y el proceso que comprende la etapa de, después de la introducción de los siguientes genes: Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc y Lin28 en células somáticas, cultivar las células durante un tiempo suficiente para que las células adquieran pluripotencia y proliferen.
Además, de acuerdo con otro aspecto adicional preferible de este proceso, se proporciona el proceso que comprende la etapa de transfectar vectores de virus que contienen el gen de la familia Oct, vectores de virus que contienen el gen de la familia Klf y vectores de virus que contienen el gen de la familia Sox en células de empaquetamiento separadas, respectivamente, y cultivar las células para obtener tres sobrenadantes de cultivo, y la etapa de preparar una mezcla de tres sobrenadantes de cultivo obtenidos mediante la etapa anterior, y reprogramar las células somáticas usando la mezcla.
Además, de acuerdo con otro aspecto preferible de este proceso, se proporciona el proceso que comprende la etapa de reprogramar las células somáticas sin utilizar la selección de fármacos.
En lo desvelado anteriormente, la introducción del gen se puede realizar opcionalmente en ausencia o presencia de citocinas, preferentemente en ausencia de citocinas. Además, el cultivo se puede realizar opcionalmente en ausencia o presencia de citocinas, preferentemente en ausencia de citocinas.
En las células madre pluripotentes inducidas proporcionadas por la presente divulgación, el desarrollo del tumor se reduce o elimina sustancialmente en las células o tejidos obtenidos después de la inducción de la diferenciación. Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona adicionalmente un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas en el que el desarrollo del tumor se reduce o elimina sustancialmente en las células o tejidos obtenidos después de la inducción de la diferenciación, que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf y gen de la familia Sox, preferentemente, el gen de la familia Oct3/4, gen Klf4 y gen Sox2 y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
Desde otro punto de vista, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende
I)
a) la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y
b) la etapa de introducir una combinación de los siguientes dos genes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y un gen L-Myc, en células somáticas, o una combinación de los siguientes dos genes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y un gen L-Myc en células somáticas; o
II)
a) la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y
b) la etapa de introducir una combinación de los siguientes tres genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Sox y gen Klf, y al menos uno de los genes seleccionados de los siguientes dos genes: Sall1 y en células somáticas.
De acuerdo con un aspecto preferible de la invención, se proporciona el proceso que comprende la etapa de introducir una combinación de los siguientes dos genes: Oct3/4 y Sox2 o una combinación de los siguientes dos genes: Oct3/4 y Klf4, y al menos un tipo de genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas. Un proceso que comprende la etapa de introducir el siguiente gen: Nanog además de los genes anteriores en células somáticas también es un aspecto preferible. En el proceso desvelado anteriormente, también es posible utilizar c-Myc opcionalmente mediante una combinación apropiada.
De acuerdo con otro aspecto preferible de la divulgación, se proporciona el proceso que comprende la etapa de introducir una combinación de los siguientes tres genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Sox y gen Klf, preferentemente una combinación de Oct3/4, Sox2 y Klf4, y al menos un tipo de genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas.
Más concretamente, se proporciona el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cuatro genes: Oct3/4, Sox2, Klf4 y Salll en células somáticas; el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cuatro genes: Oct3/4, Sox2, Klf4 y Sall4 en células somáticas, el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cuatro genes: Oct3/4, Sox2, Klf4 y L-Myc en células somáticas; el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cinco genes: Oct3/4, Sox2, Klf4, Salll y L-Myc en células somáticas; el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cinco genes: Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall4 y L-Myc en células somáticas; el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes cinco genes: Oct3/4, Sox2, Klf4, Salll y Sall4; y el proceso que comprende la etapa de introducir los siguientes seis genes: Oct3/4, Sox2, Klf4, Salll, Sall4 y L-Myc en células somáticas.
Si se utiliza L-Myc, preferentemente, la célula somática es una célula somática humana.
En cualquiera de los procesos anteriores, también se proporciona un proceso que comprende la etapa de introducir adicionalmente Lin28 en células somáticas de acuerdo con la presente invención y, como aspecto preferible, se proporciona el proceso que comprende la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc y Lin28 en células somáticas. En una célula madre pluripotente inducida proporcionada de acuerdo con la presente divulgación, el desarrollo del tumor se reduce o elimina sustancialmente en las células o tejidos obtenidos después de la inducción de la diferenciación. Por lo tanto, además, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas en el que el desarrollo del tumor se reduce o elimina sustancialmente en células o tejidos obtenidos después de la inducción de la diferenciación, que comprende la etapa de introducir los siguientes dos genes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, preferentemente, el gen de la familia Oct3/4 y el gen Sox2, y al menos un tipo de genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Salll y en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas. Un proceso que comprende la etapa de introducir además el gen de la familia Klf, por ejemplo, Klf4 en células somáticas en este proceso también es un aspecto preferible, y también es un aspecto preferible un proceso que comprende la etapa de introducir Lin28 junto con el gen de la familia Klf o en lugar del gen de la familia Klf en células somáticas.
Además, desde otro punto de vista, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende la etapa de introducir los siguientes seis genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox, gen de la familia Myc, Lin28 y Nanog, preferentemente los siguientes seis genes: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y Nanog en células somáticas. En este proceso, al menos un tipo de genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Salll y se puede utilizar en lugar de c-Myc, y este proceso también es un aspecto preferible.
En cada uno de los procesos anteriores, la introducción de los genes en células somáticas se puede realizar con un vector recombinante, y preferentemente con un vector recombinante que incluya al menos un tipo seleccionado de una combinación de genes tal como se define en cada uno de los procesos, que los genes se introducen en las células somáticas. Como vector, se puede usar cualquiera de un vector vírico y un vector no vírico.
Además, los factores de programación nuclear que comprenden una combinación de genes tal como se define en cada una de las invenciones anteriores se proporcionan de acuerdo con la presente divulgación. También es preferible combinar además el gen TERT y/o el gen del antígeno T grande del SV40 con la combinación mencionada anteriormente.
Además, también se proporcionan, de acuerdo con la presente divulgación, los factores de reprogramación nuclear que comprenden una combinación de productos génicos de genes tal como se define en cada una de las invenciones anteriores, y también se proporciona, de acuerdo con la presente divulgación, un proceso que comprende la etapa de poner en contacto los factores de reprogramación nuclear que comprende una combinación de productos génicos de genes tal como se define en cada una de las invenciones anteriores con células somáticas. Como aspecto preferible, también se proporciona el proceso que comprende la etapa de añadir el factor de reprogramación nuclear a un cultivo de células somáticas.
En cada una de las invenciones anteriores, se proporciona el proceso en el que la célula somática es una célula somática del mamífero que comprende un ser humano. Se proporciona el proceso desvelado en el presente documento, en el que la célula somática es preferentemente una célula somática de primates, más preferentemente una célula somática humana; el proceso en el que la célula somática es una célula fetal humana o células somáticas obtenidas de un ser humano adulto; el proceso en el que la célula somática es de células somáticas recolectadas de un paciente.
Desde otro punto de vista, se proporciona una célula madre pluripotente inducida que se puede obtener mediante los procesos mencionados anteriormente de acuerdo con la presente invención. Además, la célula somática que se induce por diferenciación a partir de una célula madre pluripotente inducida que se puede obtener mediante los procesos anteriores también se proporciona de acuerdo con la presente invención. También se proporcionan según la presente invención un tejido, un órgano, un fluido corporal y un individuo que es una población de una célula somática inducida por diferenciación.
Además, se proporciona, de acuerdo con la presente divulgación, una terapia con células madre que comprende la etapa de inducir la diferenciación de una célula madre pluripotente inducida obtenida de acuerdo con el proceso anterior usando células somáticas recuperadas y recolectadas de un paciente, y trasplantar la célula somática resultante o un tejido, un órgano o un líquido corporal que es una población de la célula al paciente.
Además, se proporciona un método para ensayar la actividad fisiológica o la toxicidad de un compuesto, un fármaco o una toxina utilizando diversas células obtenidas de células madre pluripotentes inducidas que inducen la diferenciación obtenidas según los procesos anteriores según la presente divulgación.
Breve descripción de los dibujos
[Fig.1] La Fig.1 es una vista que muestra los resultados de la tinción con fosfatasa alcalina de células iPS inducidas a partir de fibroblasto de piel de adulto humano (HDF de adulto). A1HDF adulto (HDFa-Slc7a1), que se obtuvo expresando el receptor de retrovirus de ratón (Slc7a1) con infección por lentivirus, se le introdujeron los genes que se muestran en la columna de la izquierda utilizando vectores retrovíricos. Se muestran los resultados de la tinción en células HDFa-Slc7al en las que se introdujeron los cuatro genes de "Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc". Una columna de más a la derecha y una segunda columna a la derecha de una fotografía muestran los resultados de la tinción con fosfatasa alcalina observados con contraste de fase 10 días después de la introducción del gen.
[Fig.2] La Fig.2 es una vista que muestra los resultados de la tinción con fosfatasa alcalina de células iPS inducidas a partir de fibroblastos neonatales derivados de prepucio (BJ). Al BJ (BJ-Slc7a1) obtenido mediante la expresión de receptores de retrovirus de ratón (Slc7al) con infección por lentivirus, se le introdujeron los genes que se muestran en la columna de la izquierda utilizando vectores retrovíricos. Una segunda columna a la derecha de la fotografía muestra los resultados de la tinción con fosfatasa alcalina observados con contraste de fase 10 días después de la introducción del gen.
[Fig.3] La Fig.3 es una vista que muestra los resultados del análisis de inmunotinción para la expresión de ABCG-2, SSEA-3 y SSEA-4 en células iPS derivadas de HDF adulto (clon iPS-HDFaSlc-87E6) y los resultados de la tinción de sólo un anticuerpo secundario (IgG de ratón o IgM de rata) como control negativo. Una fotografía indica imágenes de contraste de fase y una imagen de contraste de fase a través de un filtro de rodamina (objetivo X 10, respectivamente).
[Fig.4] La Fig.4 es una vista que muestra los resultados de la inmunotinción para la expresión de ABCG-2, cadherina E, SSEA-3 y SSEA-4 en células iPS derivadas de HDF adulto (clon iPS-HDFaSlc-87E3, 4 y 12) y HDF adulto que expresa el gen Slc7a1 de ratón (HDFa). Una fotografía muestra imágenes de contraste de fase e imágenes de contraste de fase a través de un filtro de rodamina (objetivo X 10, respectivamente).
[Fig.5] La Fig.5 es una vista que muestra los resultados de la amplificación por pCr de cada región para OCT4, Sox2, Nanog, REX1, FGF4, GDF3, DPPA4, DPPA2, ESG1, hTERT y G3PDH, en ADNc obtenido a partir de ARN aislado de células iPS derivadas de HDF adultos (clon iPS-HDFaSlc-87E1 a 8, 11 y 12), NTERA2 clon D1 de células cancerosas embrionarias humanas (NTERA2) y HDF adulto que expresa el gen Slc7a de ratón (HDF). [Fig.6] La Fig.6 es una vista que muestra los resultados de la amplificación por PCR de cada región para OCT4, Sox2, Nanog, REX1, FGF4, GDF3, ECAT15-1, ECAT15-2, ESG1, hTERT y G3 en ADNc obtenido a partir de ARN aislado de células iPS derivadas de BJ (clon iPS-BJSlc-97G3, G5, H3, H5, E1-10, E11 y E12), una célula cancerosa embrionaria humana NTERA2 clon D1 (NTERA2), y BJ que expresa el gen Slc7a1 de ratón (BJSlc7a1).
[Fig.7] La Fig.7 es una vista que muestra un ratón (A) después de cinco semanas, que se inyectó por vía subcutánea con el clon iPS-HDFaSlc-87E12, y el tumor se aisló del ratón (A), así como una vista que muestra los resultados de la tinción con hematoxilina-eosina de tejidos derivados del teratoma aislados de ratones inyectados por vía subcutánea con el clon iPS-HDFaSlc-87E3 (B), el clon iPS-HDFaSlc-87E6 (C) y el clon iPS-HDFaSlc-87E12 (D), respectivamente.
[Fig.8] La Fig.8 es una vista de inmunotinción que muestra la diferenciación in vitro de células iPS humanas. Se cultivaron células de tipo iPS humanas en placas recubiertas con HEMA durante 7 días y se cultivaron adicionalmente en una placa recubierta de gelatina durante 7 días, y luego se recolectaron las células para fijarlas con solución de fijación (PBS que contiene formalina al 10 %). Las células reaccionaron con anticuerpo anti-a-actina del músculo liso (a-actina del músculo liso), anticuerpo anti-tubulina pIII (tubulina bIII) y anticuerpo anti-a-fetoproteína (a-fetoproteína) como anticuerpo primario, e inmunotinción con los anticuerpos secundarios.
[Fig. 9] La Fig.9 es una vista que muestra los resultados de la mejora en la eficacia de la introducción de genes con retrovirus en HDF humanos. Se introdujo retrovirus ecotrópico (Eco) o anfotrópico (Anfo) que contenía ADNc de GFP en HDF o HDF (HDF-Slc7a1) que expresaba el gen Slc7a1 de ratón. Las fotografías de la parte superior de la figura muestran los resultados observados con un microscopio fluorescente (la barra es de 100 pm) y los gráficos de la parte inferior de la figura muestran los resultados de la citometría de flujo.
[Fig. 10] La Fig.10 es una vista que muestra los resultados de la inducción de células iPS de HDF adultos. A muestra el cronograma de generación de células iPS. B muestra la imagen de la morfología celular de HDF, C muestra una imagen típica de una colonia no de tipo células ES, D muestra una imagen típica de colonias humanas de tipo células ES, E muestra la morfología celular de la línea celular iPS establecida en el pasaje número 6 (clon 201B7), F muestra una imagen de células iPS con gran aumento, y G muestra una imagen de células diferenciadas espontáneamente en la parte central de las colonias de células iPS humanas, respectivamente. H a N muestran los resultados del análisis de inmunocitoquímica para SSEA-1 (H), SSEA-3 (I), SSEA-4 (J), TRA-1-60 (K), TRA-1-81 (L), TRA-2-49/6E (M) y Nanog (N), respectivamente. Los núcleos se tiñeron con Hoechst33342 (azul). Las barras de cada imagen muestran 200 pm (B a E, G), 20 pm (F) y 100 pm (H a N).
[Fig.11] La Fig.11 es una vista que muestra la dependencia de la célula alimentadora de la célula iPS humana. A muestra una imagen de células iPS sembradas en una placa recubierta de gelatina. B muestra una imagen de células iPS cultivadas en medio acondicionado con MEF (MEF-CM) en una placa recubierta con matrigel. C muestra una imagen de células iPS cultivadas en medio no acondicionado para ES humana en una placa recubierta con matrigel.
[Fig.12] La Fig.12 es una vista que muestra los resultados del análisis por RT-PCR de genes marcadores de células ES para la expresión de genes marcadores de células ES humanas en células iPS humanas. Las células, cuyo ARN ha sido aislado, son el clon 201B de células iPS, células ES, NTERA2 clon D1 de células cancerosas embrionarias humanas (NTERA2) y HDF adulto que expresa el gen Slc7a1 de ratón.
[Fig.13] La Fig.13 es una vista que muestra el análisis por transferencia de Western de genes marcadores de células ES (A) y los resultados de la PCR cuantitativa para la expresión del gen (B) introducido por retrovirus, para la expresión de genes marcadores de células ES humanas en células iPS humanas. B muestra los promedios de tres experimentos independientes y una barra muestra la desviación típica.
[Fig.14] La Fig.14 es una vista que muestra los resultados de la secuenciación genómica con bisulfito de las regiones promotoras de Oct3/4, REX1 y Nanog (A) y los resultados de los ensayos de luciferasa (B), para la expresión de genes marcadores de células ES humanas en células iPS humanas. En A, los círculos abiertos y cerrados indican CpG no metilados y metilados. B muestra el promedio del resultado de cuatro ensayos y las barras indican la desviación típica.
[Fig.15] La Fig.15 es una vista que muestra altos niveles de actividad telomerasa y la proliferación exponencial de células iPS humanas. A muestra los resultados de la detección de las actividades telomerasa mediante el método TRAP. Se usaron muestras inactivadas por calor (+) como controles negativos (CI es control interno). B muestra la curva de proliferación de las células iPS y los promedios y las desviaciones típicas por cuadruplicado.
[Fig.16] La Fig.16 es una vista que muestra los resultados del análisis de genes de células iPS humanas. A son los resultados de la PCR genómica que muestran los resultados de la integración de los cuatro retrovirus en los cromosomas de todos los clones. B muestra los resultados del análisis por transferencia de Southern utilizando una sonda de ADNc de c-Myc. Los asteriscos de la figura muestran el alelo c-Myc endógeno (2,7 kb) y las flechas muestran el alelo c-Myc de ratón (9,8 kb) derivado de las células alimentadoras SNL.
[Fig.17] La Fig.17 es una vista que muestra la diferenciación mediada por cuerpos embrioides de células iPS humanas. A muestra una imagen de cultivo por flotación de células iPS el día 8. B a E muestran imágenes de células diferenciadas en el día 16 (B), células de tipo neuronas (C), células epiteliales (D) y células de tipo adoquín (E), respectivamente. F a K muestran resultados de inmunocitoquímica de a-fetoproteína (F), vimentina (G), a-actina del músculo liso (H), desmina (I), tubulina pIII (J) y GFAP (K), respectivamente. Las barras de la figura muestran 200 pm (A, B) y 100 pm (C-K). En F-K, los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul). L muestra los resultados de los análisis de RT-PCR de varios marcadores de diferenciación para tres capas germinales.
[Fig.18] La Fig.18 es una vista que muestra la diferenciación dirigida de células iPS humanas. A son imágenes de contraste de fase de células iPS diferenciadas después de 18 días de cultivo en células PA6. B muestra los resultados de la inmunocitoquímica de las células que se muestran en A con anticuerpos de tubulina pIII (rojo) y tirosina hidroxilasa (verde). los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (azul). C representa los resultados de los análisis de RT-PCR de marcadores neuronales dopaminérgicos. D es la imagen de contraste de fase de las células iPS diferenciadas en células cardiomióticas. E muestra los resultados de los análisis de RT-PCR de marcadores de células cardiomióticas. Las barras en las imágenes de A, B y D son 200 |jm (A, D) y 100 |jm (B).
[Fig.19] La Fig.19 es una vista que muestra un teratoma derivado de células iPS humanas. Se muestra una imagen de tinción con hematoxilina y eosina del teratoma derivado de células iPS (se usa el clon 201B7).
[Fig.20] La Fig.20 son imágenes de contraste de fase de células iPS humanas derivadas de sinoviocitos similares a fibroblastos adultos (HFLS, clon 243H1) y fibroblastos neonatales derivados de prepucio (BJ, clon 246G1). En cada imagen, una barra muestra 200 jim.
[Fig.21] La Fig.21 es una vista que muestra la expresión de genes marcadores de células ES en células iPS derivadas de HFLS y BJ.
[Fig.22] La Fig.22 es una vista que muestra células diferenciadas mediadas por cuerpos embrioides de células iPS derivadas de HFLS y BJ. Las expresiones de a-actina del músculo liso, tubulina pIII y la a-fetoproteína se confirmaron mediante inmunotinción.
[Fig.23] La Fig.23 es una vista que muestra el efecto del gen familiar y la omisión de c-Myc en la generación de células iPS a partir de ratones MEF reporteros de Nanog. A muestra los resultados de la generación de células iPS con el gen de la familia a partir de MEF mediante la selección de Nanog. Un gráfico muestra el número de colonias positivas para GFP. Los resultados de tres experimentos independientes se muestran con diferentes colores (blanco, gris y negro). "4 factores" muestra la combinación de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. B muestra el efecto del tiempo de selección de puromicina sobre la generación de células iPS, y las colonias positivas para GFP observadas 28 días después de la transducción de los cuatro genes o los tres genes desprovistos de c-Myc. C muestra el efecto del tiempo de selección de puromicina sobre el porcentaje de colonias positivas para GFP por todas las colonias.
[Fig.24] La Fig.24 es una vista que muestra imágenes histológicas de teratoma derivadas de células iPS, que fueron inducidas a partir de MEF derivado de ratones reporteros de Fbx15 con proteínas de la familia Myc, Klf y Sox.
[Fig.25] La Fig.25 es una vista que muestra la caracterización de células iPS generadas induciendo tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) desprovisto de c-Myc en MEF derivado de ratones reporteros de Nanog con retrovirus. Se muestran los resultados de la RT-PCR que muestran los niveles de expresión de los genes marcadores de células ES y los cuatro genes. Mediante el uso de conjuntos de cebadores específicos, los transcritos totales, los transcritos de los genes endógenos (endo) y los transcritos de los retrovirus (Tg) se distinguieron para los cuatro genes.
[Fig.26] La Fig.26 es una vista que muestra los resultados de la inducción de células iPS generadas por la inducción de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) desprovisto de c-Myc en MEF derivado de ratones reporteros de Fbx15 con retrovirus, así como los resultados de la expresión de GFP inducida. A muestra la morfología de las células iPS generadas por la introducción de los tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) sin c-Myc. La barra de la fotografía muestra 500 jm. B muestra los resultados de los análisis de RT-PCR de genes marcadores de células ES en células ES, MEF e iPS generadas por la introducción de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) sin c-Myc.
[Fig.27] La Fig.27 es una vista que muestra ratones quiméricos derivados de células iPS (clon 142B-6 y 142B-12) generados mediante la introducción de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) sin c-Myc.
[Fig.28] La Fig.28 es una vista que muestra los resultados del aislamiento eficaz de células iPS sin selección de fármacos. A son imágenes de la morfología de las células iPS inducidas a partir de TTF derivadas de ratones adultos que contienen el reportero Nanog-GFP-IRES-Puror. Las células se transdujeron con los cuatro genes o con los tres genes desprovistos de c-Myc, junto con DsRed, y luego se cultivaron durante 30 días sin selección de fármaco. La expresión del reportero Nanog (Nanog-GFP) y el retrovirus DsRed (Tg-DsRed) se examinó mediante microscopía de fluorescencia. La barra indica 500 jm. B muestra imágenes de morfología de células iPS inducidas a partir de TTF derivadas de ratones adultos, que contenía un transgén DsRed dirigido por un promotor constitutivamente activo (ACTB, gen de la p-actina) pero carecía de los casetes de selección Nanog o Fbx15. Las células fueron transducidas con los cuatro genes o con los tres genes desprovistos de c-Myc, junto con GFP, y luego se cultivaron durante 30 días sin selección de fármaco. La expresión del retrovirus con GFP (Tg-GFP) se examinó mediante microscopía de fluorescencia. La barra indica 500 jm . C muestra los resultados de los análisis de RT-PCR de genes marcadores de ES en células ES y en células iPS generadas a partir de TTF sin selección de fármacos. D es una imagen de ratones quiméricos derivados de células iPS, que se generaron a partir de TTF adultos sin selección de fármaco o el retrovirus c-Myc.
[Fig.29] La Fig.29 es una vista que muestra los resultados de la inducción de células iPS generadas induciendo tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) sin c-Myc. A son imágenes que muestran que las células iPS humanas establecidas (clon 253G y 246H) presentan una morfología similar a la de las células ES humanas. B muestra los resultados de la expresión de genes marcadores de células ES en células iPS humanas derivadas de HDF establecidas usando células iPS (253G) generadas por la introducción de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) desprovisto de c-Myc, o células iPS (253F) generadas por la introducción de cuatro genes (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) incluido c-Myc.
[Fig.30] La Fig.30 es una vista de la inducción de la diferenciación mediada por el cuerpo embrioide a partir de células iPS humanas generadas por la introducción de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) desprovisto de c-Myc en fibroblastos adultos (HDL; 253G) y fibroblastos neonatales derivados de prepucio (BJ; 246G). La expresión de aactina del músculo liso, la tubulina pIII y la a-fetoproteína se examinó mediante inmunotinción.
[Fig.31] La Fig.31 es una vista que muestra un gráfico del número de colonias, que se contaron después de la introducción de seis genes (Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28), o dos combinaciones diferentes de cuatro genes (Klf4, c-Myc, Oct3/4 y Sox2 se muestran en Y4F; y Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28 se muestran en T4F) en células 293FT. "De tipo ES" indica el número de colonias que son morfológicamente similares a las colonias de células ES, y "total" indica el número total de colonias similares a ES y colonias no similares a ES. Exp n.° 1, Exp n.° 2, Exp n.° 3 y Exp n.° 4 muestran resultados de experimentos independientes. La escala vertical indica el número de colonias.
[Fig.32] La Fig.32 muestra los resultados experimentales realizados utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). A indica el cronograma del experimento. 1,0 * 105 células MEF, que se obtuvieron de ratones Nanog GFPtg/- Fbx15-/-, se sembraron en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina. Al día siguiente, cuatro genes (Oct3/4, Klf4, Sox2 y Sall4; OSKA) o tres genes (Oct3/4, Klf4 y Sox2; OSK) se introdujeron en MEF con retrovirus. 4 días después de la infección, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos cubiertos con células STO tratadas con mitomicina C en una proporción de 1:2 o 1:6. La selección del fármaco se inició 14 o 21 días después de la infección. El día 28, se contaron las células positivas para GFP y se tiñeron con fosfatasa alcalina (AP) y cristal violeta (CV). B indica el número total de colonias positivas para GFP en tres experimentos independientes (n.° 1, 2 y 3). C indica los porcentajes de colonias positivas para GFP en tres experimentos independientes (n.° 1, 2 y 3).
[Fig.33] La Fig.33 muestra resultados experimentales que se realizaron utilizando fibroblastos derivados de piel de adultos humanos (HDF de adultos). Se sembraron 1,0x105 células HDF adultas que expresan el receptor de retrovirus de ratón slc7a en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, se introdujo una combinación de varios genes mostrados en la figura en las células con vectores retrovíricos. 6 días después de la infección, el número de células se ajustó a 5,0x105, y las células se sembraron nuevamente en una placa de 100 mm cubierta con 1,5x106 células STO tratadas con mitomicina C. Después de 7 días, el medio se intercambió por medio de células ES de primates suplementado con 4 ng/ml de bFGF. La figura muestra el número de colonias 30 días después de la infección.
[Fig.34] La Fig.34 es una vista que muestra el número de colonias contadas 32 días (barra izquierda) y 40 días (barra derecha) después de la infección mediante la introducción de cuatro genes de origen humano (Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres genes (Y3F: Oct3/4, Sox2 y Klf4), y Sall4 de ratón (mSall4) o Salll de ratón (mSall1) o ambos en fibroblastos humanos adultos (HDF) derivados de la piel que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a con vectores retrovíricos. "+Simulador" indica un grupo infectado con retrovirus que fueron reemplazados con un vector vacío desprovisto de Y3F o Y4F, "+mSall4" indica un grupo introducido con Sall4 junto con Y3F o Y4F, "+mSalll" indica un grupo introducido con mSall1 junto con Y3F o Y4F, y "+mSall4+mSall1" indica un grupo en el que tanto mSall4 como mSalll se introdujeron junto con Y3F o Y4F. La escala vertical indica el número de colonias de células iPS humanas confirmadas en placas de Petri de 10 cm. El mismo experimento se repitió dos veces, y el número total de colonias se mostró en la parte superior de los gráficos por cada experimento.
[Fig.35] La Fig.35 es una vista que muestra el número de colonias contadas 32 días (barra izquierda) y 40 días (barra derecha) después de la infección mediante la introducción de cuatro genes de origen humano (T4F: Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28) o tres genes (T3F: Oct3/4, Sox2 y Nanog), y Sall4 de ratón (mSall4) o Salll de ratón (mSall1) o ambos en fibroblastos humanos adultos (HDF) derivados de la piel que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a mediante el uso de vectores retrovíricos. "+Simulador" indica un grupo infectado con retrovirus que son vectores vacíos desprovistos de T3F o T4F, "+mSall4" indica un grupo introducido con mSall4 junto con T3F o T4F, "+mSall1" indica un grupo introducido con mSall1 junto con T3F o T4F, y "+mSall4+mSall1" indica un grupo en el que tanto mSall4 como mSall1 se introdujeron junto con T3F o T4F. La escala vertical indica el número de colonias de células iPS humanas contadas en placas de Petri de 10 cm. El mismo experimento se repitió dos veces, y el número total de colonias de cada experimento se muestra en la parte superior de la barra en el gráfico.
[Fig.36] La Fig.36 es una vista que muestra el número de colonias contadas a los 32 días (barra izquierda) y 40 días (barra derecha) después de la infección mediante la introducción de cuatro genes de origen humano (Y4F) o tres genes (Y3F) y Sall4 humano (hSall4) en fibroblastos adultos humanos derivados de piel (HDF) que expresan el receptor de retrovirus Slc7a de ratón con vectores retrovíricos. "+Simulador" indica un grupo infectado con retrovirus que son vectores vacíos desprovistos de Y3F o Y4F, y "+hSall4" indica un grupo introducido con hSall4 junto con Y3F o Y4F. La escala vertical indica el número de colonias de células iPS humanas contadas en placas de Petri de 10 cm. El mismo experimento se repitió dos o tres veces, y el número total de colonias en cada experimento se mostró en la barra del gráfico.
[Fig.37] La Fig.37 es un gráfico que muestra los resultados del recuento del número de colonias de células iPS humanas generadas al introducir el total de cuatro genes de tres genes de Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc, L-Myc, o gen N-Myc, en fibroblastos humanos adultos derivados de la piel (HDFa-Slc7a1) que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a con vectores lentivíricos. El valor de cada gráfico indica la proporción entre el número de colonias de células iPS y el número total de colonias.
[Fig. 38] La Fig.38 es una fotografía que muestra los resultados confirmados de que las células iPS humanas (32R2, 32R6) generadas mediante la introducción de cuatro genes (Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc) en fibroblastos humanos adultos derivados de la piel (HDFa-Slc7a1) que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a con vectores de lentivirus tienen la capacidad de diferenciarse en tres líneas de células germinales, por inmunotinción con anticuerpo de a-actina del músculo liso, a-fetoproteína y tubulina pIII.
[Fig.39] La Fig.39 son imágenes de tinción histológica (tinción con hematoxilina-eosina) del teratoma obtenidas inyectando células iPS humanas (32R6) generadas por la introducción de cuatro genes (Oct3/4, Sox2, Klf4 y L-Myc) en los testículos del ratón SCID. Las columnas superiores indican imágenes histológicas del tejido nervioso, tejido similar al tracto intestinal y tejido cartilaginoso, desde el lado izquierdo. Las columnas inferiores indican imágenes histológicas del tejido capilar, tejido adiposo y tejido pigmentario, desde el lado izquierdo.
[Fig.40] La Fig.40 son fotografías que muestran la morfología de colonias positivas para g Fp (iPS-MEF-Ng-443-3) obtenidas mediante la introducción de tres genes (Oct3/4, Klf4 y L-Myc) en MEF derivado de ratones reporteros de Nanog (MEF-Ng) con vectores retrovíricos. Las columnas superiores son las imágenes de colonias positivas para GFP y las columnas inferiores son imágenes de contraste de fase.
[Fig.41] La Fig.41 es una fotografía que muestra los resultados de RT-PCR y PCR genómica para clones derivados de colonias positivas para GFP (iPS-MEF-Ng-443-3) mostrados en la Fig.40. En la figura, "Total" muestra la expresión de genes endógenos y derivados de retrovirus, "Tg" muestra la expresión de genes derivados de retrovirus y "Genoma" muestra los resultados de detección de la presencia de genes derivados de retrovirus, que se integraron en el ADN del genoma, utilizando los cebadores específicos de los genes. El número del lado derecho en la fotografía indica el número de ciclo de PCR. En la figura, "RF8" indica células madre embrionarias como control, "20D17" indica células iPS (célula Nanog-iPS; Nature, 448, págs.313-317, 2007), que se obtuvieron mediante la introducción de cuatro genes (Oct3/4, Klf4, L-Myc y Sox2) en MEF-Ng, y "142E-9" indica células iPS (Fbx-iPS), que se obtuvieron mediante la introducción de cuatro genes (Oct3/4, Klf4, L-Myc y Sox2) en MEF-Fbx, y se muestran los resultados del mismo experimento en estas células. En la figura, "Plásmido" muestra los resultados del uso de plásmidos que contienen cada gen (pMXs-Sox2, pMXs-Oct3/4, pMXs-Klf4, pMXs-c-Myc y pMXs-L-Myc).
[Fig.42] La Fig.42 es una fotografía que muestra los resultados de la confirmación de que las células iPS de ratón (443-3-3, 443-3-6, 443-3-12 y 443-3-13) generadas por la introducción de tres genes (Oct3/4, Klf4 y L-Myc) tienen la capacidad de diferenciarse en tres líneas celulares de capa germinal, mediante tinción con anticuerpo anti-a-actina del músculo liso, anticuerpo anti-a-fetoproteína y anticuerpo anti-tubulina pIII. RF8 es una célula Es de ratón como control.
[Fig.43] La Fig.43 son imágenes de tinción histológica (tinción con hematoxilina-eosina) del teratoma obtenidas mediante la inyección subcutánea de células iPS de ratón (443-3-3, 443-3-6, 443-3-12 y 443 -3-13) generado por la introducción de tres genes (Oct3/4, Klf4 y L-Myc). Se muestran imágenes histológicas del tejido nervioso, tejido similar al tracto intestinal, tejido muscular, tejido epitelial y tejido cartilaginoso, desde la parte superior.
[Fig.44] La Fig.44 es un gráfico que muestra los resultados del recuento de la cantidad de colonias de células iPS humanas generadas al introducir los genes c-Myc, L-Myc y/o Lin28 además de tres genes de Oct3/4, Klf4 y Sox2 en fibroblastos humanos adultos derivados de la piel (HDFa-Slc7a1) que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a con vectores lentivirus. La barra negra indica el número total de colonias y la barra blanca indica el número de colonias de células iPS.
[Fig.45] La Fig.45 es una vista que muestra esquemáticamente las estructuras de varios genes de quimera Myc y genes mutantes. Una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-c-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 153 y 154 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-L-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 155 y 156 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-cL-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 157 y 158 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-Lc-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 159 y 160 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-cLc-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 161 y 162 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-LcL-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 163 y 164 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-ccL-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 165 y 166 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-cLL-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 167 y 168 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-LLc-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 169 y 170 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de Ms-Lcc-Myc se muestran en las SEQ ID NO: 171 y 172 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de c-MycW135E se muestran en las SEQ ID NO: 173 y 174, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de c-MycV394D se muestran en las s Eq ID NO: 175 y 176 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de c-MycL420P se muestran en las SEQ ID NO: 177 y 178 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de L-MycW96E se muestran en las SEQ ID NO: 179 y 180 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de L-MycV325D se muestran en las SEQ ID NO: 181 y 182 del Listado de Secuencias, una secuencia de nucleótidos y una secuencia de aminoácidos de LMycL351P se muestran en las SEQ ID NO: 183 y 184.
[Fig.46] La Fig.46 es un gráfico que muestra los resultados del recuento del número de colonias de una célula iPS humana establecida mediante la introducción de varios genes quimera Myc y genes mutantes en fibroblastos derivados de la piel de adultos humanos (HDFa-Slc7a1) que expresan el receptor de retrovirus de ratón Slc7a con vectores lentivíricos. El número de colonias de células iPS, número total de colonias y la proporción (%) del número de colonias de células iPS frente al número total de colonias, desde la parte superior, respectivamente.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
El proceso de la presente invención proporcionado desde el primer punto de vista es un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, y comprende la etapa de introducir los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas, y un aspecto preferible del proceso comprende la etapa de, después de la introducción de los siguientes tres genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf y gen de la familia Sox en células somáticas, cultivar la célula durante un tiempo suficiente para que las células adquieran pluripotencia y proliferen.
Para el gen de la familia Oct, el gen de la familia Klf y el gen de la familia Sox, en la publicación internacional WO2007/69666 se muestran ejemplos de genes de la familia. Como gen de la familia Oct, se prefiere Oct3/4, como el gen de la familia Klf, se prefiere Klf4 y, como el gen de la familia Sox se prefiere Sox2. Como estos genes, también se pueden utilizar, además de los genes de tipo silvestre, los genes mutantes, en los que varios (por ejemplo, 1 a 30, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 5 y, en particular, preferentemente 1 o 2) nucleótidos son genes sustituidos, insertados y/o delecionados y quimeras, que se obtienen apropiadamente en combinación de los genes de familia, que tienen una función similar a la de los genes de tipo silvestre, o que tienen la función mejorada.
El proceso de la presente invención proporcionado desde el segundo punto de vista es un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, y comprende a) la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y b) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y al menos uno de los genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Sall 1 y Sall4 en células somáticas, o una combinación de los siguientes dos genes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y al menos uno de los genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas. Sin estar ligado a una teoría específica, el gen seleccionado del grupo que consiste en L-Myc, Salll y Sall4 es un factor de reprogramación nuclear que tiene la actividad de mejorar la eficacia de la reprogramación nuclear y, mediante el uso de una combinación con factores de reprogramación nuclear esenciales para la reprogramación nuclear (por ejemplo, una combinación del gen de la familia Oct y el gen de la familia Sox, o una combinación del gen de la familia Oct y el gen de la familia Klf), se puede mejorar notablemente una eficacia de la reprogramación nuclear.
Tal como se describe más concretamente, el proceso comprende:
(a) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y L-Myc en células somáticas;
(b) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y Salll en células somáticas;
(c) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y Sall4 en células somáticas;
(d) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y L-Myc y Salll en células somáticas;
(e) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y L-Myc y Sall4 en células somáticas;
(f) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y Salll y Sall4 en células somáticas;
(g) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas.
(h) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y L-Myc en células somáticas;
(i) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y Salll en células somáticas;
(j) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y Sall4 en células somáticas;
(k) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y L-Myc y Salll en células somáticas;
(l) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y L-Myc y Sall4 en células somáticas;
(m) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y Salll y Sall4 en células somáticas;
(o) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y L-Myc, Salll y en células somáticas; en donde en cualquiera de (a) a (o) el proceso comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
Como alternativa, en cualquier aspecto de (a) a (g), la etapa de introducir el gen de la familia Klf en células somáticas puede estar comprendida adicionalmente. Además, en un aspecto de cualquiera de (a) a (o), o en un aspecto de la adición del gen de la familia Klf a cualquier aspecto de (a) a (g), puede estar comprendida la etapa de introducir el gen de la familia Lin y/o Nanog, preferentemente en células somáticas. Además, de acuerdo con la presente divulgación, si se desea, puede estar comprendida la etapa de introducir c-Myc en células somáticas.
Como gen de la familia Oct, se prefiere Oct3/4, como el gen de la familia Sox, se prefiere Sox2 y, como gen de la familia Klf, se prefiere Klf4. Además, como el gen de la familia Lin, se conocen Lin28 y Lin28b, y se prefiere Lin28. L-Myc se describe en la Tabla 1 de la Publicación Internacional WO2007/69666, y Sall4 se describe en la Tabla 4 y la Tabla 5 de la Publicación Internacional anterior. Salll es el gen de expresión específico de las células ES y se conoce como una de las proteínas de dedo de zinc, y se espera que participe en el desarrollo del riñón. El número de registro del NCBI de Salll es NM_021390 (ratón) y NM_002968 (humano). Además, el número de registro del NCBI de Lin28 es NM_145833 (ratón) y NM_024674 (humano).
Como estos genes, también se pueden utilizar, además de los genes de tipo silvestre, los genes mutantes, en los que varios (por ejemplo, 1 a 30, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 5 y, en particular, preferentemente 1 o 2) nucleótidos son genes sustituidos, insertados y/o delecionados y quimeras, obtenidos por la combinación arbitraria del gen de familia, que tiene una función similar a la de los genes de tipo silvestre, o la función mejorada.
Por ejemplo, como L-Myc o c-Myc, también se pueden utilizar, además de los genes de tipo silvestre, los genes mutantes, en los que varios (por ejemplo, 1 a 30, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, más preferentemente de 1 a 5 y, en particular, preferentemente 1 o 2) nucleótidos son genes sustituidos, insertados y/o delecionados o genes Myc quimera que tienen función similar a la de los genes de tipo silvestre, o la función mejorada. Para el gen Myc, medios y resultados para analizar concretamente la función de varios genes Myc quimera y genes de mutación puntual Myc. Por lo tanto, utilizando este medio de análisis, se pueden seleccionar y usar fácilmente los genes c-Myc mutantes, los genes L-Myc mutantes, o los genes Myc quimera que tienen la función mejorada deseada. Los ejemplos preferidos del gen Myc quimera incluyen Ms-cL-Myc (las SEQ ID NO. 157 y 158) y Ms-cLc-Mys (las SEQ ID NO.: 161 y 162), más preferentemente Ms-cL-Myc.
Los ejemplos de un aspecto preferible de este proceso incluyen procesos que comprenden:
(a-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2 y L-Myc en células somáticas;
(a-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4 y L-Myc en células somáticas;
(b-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2 y Salll en células somáticas;
(b-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4 y Salll en células somáticas;
(c-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2 y Sall4 en células somáticas;
(c-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4 y Sall4 en células somáticas;
(d-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc y Salll en células somáticas;
(d-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc y Salll en células somáticas;
(e-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc y Sall4 en células somáticas;
(e-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc y Sall4 en células somáticas;
(f-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Salll y Sall4 en células somáticas;
(f-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, Salll y Sall4 en células somáticas;
(g-1) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas;
(g-2) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas;
(h-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4 y L-Myc en células somáticas;
(i-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4 y Salll en células somáticas;
(j-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4 y Sall4 en células somáticas;
(k-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4, L-Myc y Salll en células somáticas;
(l-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4, L-Myc y Sall4 en células somáticas;
(m-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4, Salll y Sall4 en células somáticas; o
(o-1) la etapa de introducir Otc3/4, Klf4, L-Myc, Salll y Sall4 en células somáticas, en el proceso anterior; en donde los anteriores (a-1) a (o-1) comprenden además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
Además, un proceso que comprende:
(a-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc y Lin28 en células somáticas;
(a-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc y Lin28 en células somáticas;
(b-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Sall1 y Lin28 en células somáticas;
(b-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1 y Lin28 en células somáticas;
(c-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(c-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(d-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall1 y Lin28 en células somáticas;
(d-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Salll y Lin28 en células somáticas;
(e-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(e-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(f-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Sall1, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(f-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(g-3) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall1, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(g-4) la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Salll, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(h-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, L-Myc y Lin28 en células somáticas;
(i-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, Sall1 y Lin28 en células somáticas;
(j-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4 y Lin28 en células somáticas;
(k-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall1 y Lin28 en células somáticas;
(1-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall4 y Lin28 en células somáticas;
(m-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, Sall1 Sall4 y Lin28 en células somáticas; o
(o-2) la etapa de introducir Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall1, Sall4 y Lin28 en células somáticas, en el proceso anterior también se prefiere.
En cada uno de los procesos anteriores, También se prefiere un proceso que comprende la etapa de introducir Nanog junto con Lin28. Por ejemplo, en un aspecto de (a-4), se ejemplifica un aspecto del uso de Nanog junto con Lin28m, es decir, un proceso que comprende la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28 y Nanog en células somáticas, etc.
Como alternativa, en cada uno de los procesos anteriores, puede incluirse la etapa de introducir L-Myc junto con N-Myc en células somáticas.
Además, en cada uno de los procesos desvelados anteriormente, se puede incluir opcionalmente la etapa de introducir c-Myc en células somáticas, pero para reducir sustancialmente o eliminar el desarrollo de tumores en las células o tejidos obtenidos después de la inducción de diferenciación, se prefiere que la etapa de introducir c-Myc en células somáticas no esté incluida en el proceso desvelado anteriormente.
Para un aspecto que comprende L-Myc, se prefiere usar células somáticas humanas como células somáticas para reprogramación nuclear. Además, si se incluye una combinación de Oct3/4, Sox2 y Klf4, o una combinación de Oct3/4, Sox2, Klf4 y L-Myc (o c-Myc en lugar de L-Myc), se prefiere el caso en el que se combina adicionalmente, o el caso en el que tanto Sall1 como Sall4 se combinan adicionalmente. Además, si se incluye una combinación de Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28, se prefiere el caso en el que SaIII se combina adicionalmente, o el caso en el que tanto Sall1 como se combinan adicionalmente. También para estos casos, se prefiere usar células somáticas humanas como células somáticas para reprogramación nuclear.
El proceso de la presente divulgación proporcionado desde el tercer punto de vista es un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, e incluye la etapa de introducir los siguientes seis genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox, gen de la familia Myc, Lin28 y Nanog en células somáticas, preferentemente incluye la etapa de introducir los siguientes seis genes: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 y Nanog en células somáticas.
En cada proceso proporcionado desde el primer al tercer punto de vista, la "célula madre pluripotente inducida" es una célula que tiene una caracterización similar a la de la célula ES, de manera más específica, incluye células indiferenciadas que tienen pluripotencia y capacidad de proliferación, y este término no debe interpretarse de forma limitada en ningún sentido, y debe interpretarse de manera más amplia. Un método para preparar células madre pluripotentes inducidas mediante el uso de factores de reprogramación nuclear se describe específicamente en la publicación internacional WO2007/69666, Cell, 126, págs.663-676, 2006 y Cell, 131, págs.861-872, 2007, y un medio para separar células madre pluripotentes inducidas también se describe específicamente en la Gaceta anterior.
La "célula somática" que se reprogramará mediante el proceso de la presente divulgación significa todas las células, pero no limitado a las células, desprovistas de células pluripotentes tales como células ES o similares. Por ejemplo, además de las células somáticas en etapa embrionaria, se pueden utilizar células somáticas maduras. Preferentemente, se utilizan células somáticas obtenidas de mamíferos que comprenden humanos, más preferentemente, se utilizan células somáticas obtenidas de ratón y células somáticas obtenidas de primates. De forma particularmente preferente, se pueden usar células somáticas obtenidas de seres humanos. Ejemplos de células somáticas incluyen específicamente (1) células madre de tejido (células madre somáticas) tales como células somáticas nerviosas, célula madre hematopoyética, célula madre mesenquimal, células madre de la pulpa dental y similares, (2) células precursoras de tejido y (3) células diferenciadas como linfocito, célula epitelial, célula muscular, fibroblasto (células de la piel, etc.), célula del pelo, célula del hígado, célula del estómago y célula de la mucosa. Si las células madre pluripotentes inducidas se utilizan para tratar la enfermedad, se desea utilizar células somáticas separadas del propio paciente, o células somáticas separadas de otra persona que tenga el mismo tipo de antígeno HLA y, por ejemplo, se pueden utilizar células somáticas implicadas en la enfermedad y células somáticas implicadas en la terapia de la enfermedad.
Un método para introducir los genes anteriores en células somáticas no está particularmente limitado, pero, por ejemplo, es general el uso de vectores que pueden expresar los genes anteriores. Un medio específico para usar vectores de retrovirus como vectores se describe en la publicación internacional WO2007/69666, Cell, 126, págs.663-676, 2006 y Cell, 131, págs.861-872, 2007, y el caso en el que se utilizan vectores lentivíricos como vectores se describe en Science, 318, págs.1917-1920, 2007. Además, ya que el caso en el que se utilizan plásmidos que no son vectores de virus se describe en un artículo de Okita et al. (Ciencia, publicado en línea: 9 de octubre de 2008; 10.1126/Science.1164270), un experto en la materia puede seleccionar y adoptar un medio apropiado entre ellos. Si se usa el vector, se pueden integrar en el vector dos o más genes seleccionados de los genes antes mencionados, y se pueden usar varios tipos de vectores que integran un gen. Cuando uno o dos tipos de los genes antes mencionados ya están expresados en células somáticas para ser reprogramados, se pueden eliminar uno o dos tipos de genes expresados de una combinación de los genes mencionados anteriormente que se va a introducir.
Cuando se utiliza un vector de virus, por ejemplo, un vector de retrovirus como medio para introducir los genes en las células somáticas, se prefiere que el sobrenadante del cultivo que contiene cada virus se prepare de forma independiente mediante la preparación de vectores de virus que contengan cada gen que se va a introducir, posteriormente, transfectar células de empaquetamiento separadas con cada vector de virus y cultivar las células, se prepara una mezcla de esos sobrenadantes de cultivo y se usa en la introducción de genes mediante la infección con un virus que contiene el gen. Al adoptar este medio, la eficiencia de la introducción de genes se puede mejorar notablemente en algunos casos, y este medio se prefiere en algunos casos, particularmente cuando la reprogramación nuclear se realiza sin c-Myc. En efecto, también es posible transfectar una sola célula de empaquetamiento con una pluralidad de vectores de virus, preparar sobrenadante de cultivo que contenga una pluralidad de vectores de virus y utilizarlo en la introducción de genes.
Si el gen se introduce en células somáticas, los vectores de expresión pueden introducirse en células somáticas cultivadas en células alimentadoras, o los vectores de expresión pueden introducirse en células somáticas sin células alimentadoras. Para mejorar la eficiencia de introducción de vectores de expresión, el último método es adecuado para algunos casos. Como célula alimentadora, las células alimentadoras que se usan en el cultivo de células madre embrionarias se pueden usar apropiadamente y, por ejemplo, células, células tales como células de cultivo primario de fibroblastos de embriones de ratón a los 14-15 días después de la fertilización o células STO que son la línea celular derivada de fibroblastos se trata con un fármaco como mitomicina C o se puede usar radiación. Se prefiere que el cultivo de células somáticas después de la introducción de genes se realice en células alimentadoras. Como alternativa, durante aproximadamente varios a 30 días después de la introducción del gen, se puede agregar la selección de fármacos con puromicina. En efecto, también se conoce un procedimiento que puede inducir células iPS sin selección de fármaco (Ejemplo 9 de la publicación internacional WO2007/69666), y también se prefiere inducir células iPS sin selección de fármaco.
Mediante el cultivo de células somáticas con factores de reprogramación nuclear introducidos en ellas en condiciones adecuadas, la reprogramación nuclear procede de forma autónoma, y las células madre pluripotentes inducidas se pueden generar a partir de células somáticas. Se prefiere que después de que los genes se introduzcan en las células somáticas, las células se cultiven durante un tiempo suficiente para que las células adquieran pluripotencia y proliferen. Cuando se generan células madre pluripotentes inducidas por humanos, es deseable que la densidad de cultivo de las células después de la introducción de los vectores de expresión sea menor que en el caso del cultivo de células animales. Por ejemplo, se prefiere continuar cultivando a una densidad celular de 1-100 mil, preferentemente alrededor de 50 mil por placa para cultivo celular.
Normalmente, se pueden obtener las células madre pluripotentes inducidas, por ejemplo, mediante el cultivo durante 25 días o más utilizando un medio adecuado para especias animales de células somáticas, por ejemplo, medio para células madre embrionarias (células ES) (por ejemplo, cuando el gen se introduce en células somáticas humanas, medio para células ES de primates, preferentemente células ES humanas). En el proceso proporcionado desde el primer punto de vista, la eficiencia de la reprogramación nuclear se reduce en comparación con el caso en el que la reprogramación nuclear se realiza utilizando una combinación que contiene uno o dos tipos o más de c-Myc, L-Myc, N-Myc, Salll y Sall4 en algunos casos y, generalmente, el cultivo a largo plazo es necesario en muchos casos. Por ejemplo, en este proceso, es necesario seguir cultivando preferentemente durante 28 días o más, más preferentemente 30 días o más, más preferentemente 33 días o más, y particularmente preferentemente 35 días o más. Específicamente, si el gen se introduce en células somáticas humanas, el cultivo durante 40 días o más y el cultivo adicional durante 45 días o más se convierten en días de cultivo óptimos en algunos casos. En efecto, según el proceso proporcionado desde el primer punto de vista, se elimina la contaminación de los restos de células que pasan a segundo plano y, en consecuencia, se pueden obtener colonias de células madre pluripotentes inducidas como población de células puras, y es posible obtener células madre pluripotentes inducidas que tienen una calidad extremadamente alta para la expresión génica y la capacidad de diferenciación. Por otro lado, en el proceso de la presente invención proporcionado desde el segundo punto de vista, dado que la eficiencia de producción de células madre pluripotentes inducidas es generalmente suficientemente alta, el número deseado de células madre pluripotentes inducidas se puede obtener para días de cultivo más cortos, por ejemplo, para 15 a 30 días, preferentemente alrededor de 20 días, en algunos casos.
Si las células con genes introducidos obtienen pluripotencia se puede determinar fácilmente mediante la detección, por ejemplo, de diversos marcadores específicos para células indiferenciadas, tales como la fosfatasa alcalina (ALP), SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 y cadherina E. Los tipos de marcadores y ensayos se describen concreta y específicamente en la publicación (por ejemplo, Cell, 126, págs.663-676, 2006 y Cell, 131, págs.861-872, 2007, etc.). Si la reprogramación nuclear se realiza utilizando células somáticas que tienen genes en los que se integran genes marcadores como GFP aguas abajo de los promotores del gen de expresión específico de células ES, es posible identificar las células madre pluripotentes inducidas utilizando un marcador (GFP) positivo como indicador.
Además, la proliferación se puede determinar generalmente por la formación de colonias, y dado que se sabe que la forma de la colonia (generalmente, una población celular compuesta por aproximadamente 500-1.000 células madre pluripotentes inducidas) presenta un aspecto característico dependiendo de la especie animal, se puede identificar fácilmente una colonia formada por la proliferación de células madre pluripotentes inducidas.
Por ejemplo, se sabe que mientras que las células madre pluripotentes inducidas por ratón forman colonias elevadas, las células madre pluripotentes inducidas por humanos forman colonias planas, y dado que las formas de estas colonias son extremadamente similares a las de las células ES de ratón y las células ES humanas, un experto en la materia puede confirmar un grado de proliferación de las células madre pluripotentes inducidas detectando las colonias de las células madre pluripotentes inducidas generadas. El medio que puede mantener la propiedad indiferenciada y la pluripotencia de las células ES, o el medio que no puede mantener las propiedades, se conoce de diversas formas en la técnica y, mediante el uso de una combinación de medios apropiados, se pueden separar eficazmente las células madre pluripotentes inducidas. La capacidad de diferenciación y proliferación de las células madre pluripotentes inducidas separadas puede ser fácilmente confirmada por un experto en la técnica utilizando medios de confirmación que se utilizan generalmente para células ES.
En el proceso anterior, la introducción de genes se puede realizar opcionalmente en ausencia o presencia de citocinas, preferentemente en ausencia de citocinas. Además, en el proceso anterior, las células somáticas después de la introducción del gen se pueden cultivar opcionalmente en ausencia o presencia de citocinas. Los ejemplos de citocinas típicamente incluyen, pero sin limitación, el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), el factor de células madre (SCF), el factor inhibidor de la leucemia (LIF) y similares, y la introducción y/o el cultivo de genes se pueden realizar en presencia o ausencia de sustancias activas fisiológicas que se clasifican como citocinas en la técnica. Las células somáticas después de la introducción del gen se pueden cultivar en células alimentadoras modificadas para que puedan expresar las citocinas.
En el proceso anterior, la reprogramación nuclear se puede realizar utilizando productos génicos codificados por los genes desprovistos de genes. Si el proceso anterior se realiza utilizando factores de reprogramación nuclear que son productos génicos, los factores de reprogramación nuclear y las células somáticas pueden ponerse en contacto en la atmósfera donde pueden proliferar las células somáticas y las células madre pluripotentes inducidas. De manera más específica, por ejemplo, se puede utilizar un medio para añadir los productos génicos al medio. Uno o dos tipos de productos génicos de estos genes se pueden introducir en los núcleos mediante un procedimiento como la microinyección en una proteína fusionada o un núcleo, y un tipo o dos tipos restantes de genes pueden introducirse mediante un método apropiado de introducción de genes, por ejemplo, un método que utiliza un vector recombinante.
El producto génico puede ser una proteína producida por sí misma a partir del gen, o puede estar en forma del producto génico fusionado de la proteína y otra proteína o péptido. Por ejemplo, también se puede usar una proteína de fusión con una proteína verde fluorescente (GFP) o un producto génico fusionado con un péptido como una etiqueta de histidina. Además, preparando y usando una proteína de fusión con péptido TAT derivado del virus del VIH, se puede promover la captación de factor de reprogramación nuclear de la membrana plasmática en una célula, y es posible inducir la reprogramación solo añadiendo proteínas de fusión al medio, evitando operaciones complicadas tales como la introducción de genes. Dado que un experto en la técnica conoce bien dicho método de preparación del producto génico fusionado, un experto en la técnica puede diseñar y preparar fácilmente un producto génico fusionado apropiado dependiendo del propósito.
En cada uno de los procesos anteriores, La introducción de un tipo o dos tipos o más de genes en células somáticas se puede reemplazar con el contacto de compuestos de bajo peso molecular con células somáticas en algunos casos. Como tales compuestos de bajo peso molecular, por ejemplo, se pueden utilizar los compuestos de bajo peso molecular que tienen la acción de promover la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en el gen de la familia Oct, el gen de la familia Klf, el gen de la familia Sox, el gen de la familia Myc, el gen de la familia Lin y los genes Salll, Sall4 y Nanog, y tales compuestos de bajo peso molecular se pueden seleccionar fácilmente por un experto en la técnica utilizando una cantidad de expresión de cada gen como indicador.
En los procesos anteriores, además de definir cada gen, los genes que codifican factores que inducen células inmortalizadas se pueden combinar adicionalmente. Tal como se desvela en la publicación internacional WO2007/69666, por ejemplo, el gen TERT, y uno o más genes seleccionados del grupo que consta de los siguientes genes: antígeno T grande del SV40, HPV16 E6, HPV16 E7 y Bmil se pueden usar solos o en una combinación apropiada. Además, además de los genes anteriores, se pueden combinar uno o más seleccionados del grupo que consiste en Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tell y p-catenina, y/o también se pueden combinar uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en ECATl, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Rexl, UTF1, Stella, Stat3 y Grb2. Estas combinaciones se describen específicamente en la publicación internacional WO2007/69666. En efecto, se puede usar un gen en el proceso de la presente invención que no se limita a los genes descritos específicamente como anteriormente.
En el proceso de la presente divulgación, además de otros genes que pueden funcionar como factores de reprogramación nuclear, se puede incluir un tipo o dos o más tipos de genes que codifican factores implicados en la diferenciación, el desarrollo o la proliferación, u otros factores que tengan actividad fisiológica. Por ejemplo, como medio para confirmar los factores de reprogramación nuclear, se puede utilizar un método de cribado de factores de reprogramación nuclear descrito en la publicación internacional WO2005/80598, y un método para especificar factores de reprogramación nuclear específicos descritos en la publicación internacional WO2007/69666. Un experto en la técnica puede seleccionar factores de reprogramación nuclear y utilizarlos para el proceso de la presente invención haciendo referencia a estas publicaciones. Como alternativa, se puede utilizar un método de modificación o variación apropiada del método de detección para confirmar los factores de reprogramación nuclear. Un experto en la técnica puede confirmar fácilmente mediante el método descrito en las Publicaciones que una combinación de genes usados en el proceso anterior actúa como factores de reprogramación nuclear.
En el proceso de la presente divulgación, para mejorar la eficacia de la generación de células madre pluripotentes inducidas, se puede realizar la introducción y/o adición de diversos agentes de mejora de la eficacia de generación. Los ejemplos de una sustancia para mejorar la eficacia de generación de células iPS incluyen, pero sin limitación, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC) [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular tales como el ácido valproico (VPA) (Nat. Biotechnol., 26 (7), págs. 795-797, 2008), tricostatina A, lactato de sodio, MC 1293 y M344, e inhibidores de la expresión de ácidos nucleicos tales como ARNipd y ARNhc para HDAC (por ejemplo, ARNip HDAC1 Smarpool (marca registrada, Millipore), construcciones de ARNhc de 29meros de HuSH contra HDAC1 (OriGene)), etc.] e inhibidores de metiltransferasa de histona G9a [por ejemplo, inhibidores de bajo peso molecular como BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2, págs.525-528, 2008), etc., e inhibidores de la expresión del sistema de ácido nucleico tales como ARNip y ARNhc para G9a (por ejemplo, ARNip de G9a (humano) (Santa Cruz Biotechnology)) etc.]. El inhibidor de la expresión del sistema de ácido nucleico puede estar en forma de vectores de expresión que contienen ADN que codifica ARNip o ARNhc.
El uso de las células madre pluripotentes inducidas generadas por el proceso de la presente invención no está particularmente limitado, pero las células se pueden usar como en todas las pruebas/estudios que se realizan usando células ES y en la terapia de enfermedades usando células ES. Por ejemplo, tratando las células madre pluripotentes inducidas obtenidas por el proceso de la presente invención con ácido retinoico, factor de crecimiento tal como EGF o glucocorticoide, se puede inducir la célula diferenciada deseada (por ejemplo, célula nerviosa, célula cardiomiótica, células de hemocitos, etc.), es decir, se pueden formar tejidos apropiados. Un método de inducción diferenciado se describe específicamente en la publicación internacional WO2007/69666. Al devolver estas células o tejidos de diferenciación obtenidos a un paciente, se puede lograr la terapia con células madre mediante autocitotrasplante. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas con alta seguridad se pueden producir eficazmente a partir de las células somáticas del propio paciente, y las células obtenidas al hacer que estas células (por ejemplo, células cardiomióticas, células productoras de insulina o células nerviosas) se desvíen pueden utilizarse de forma segura en la terapia de trasplante de células madre para una variedad de enfermedades como insuficiencia cardíaca, diabetes insulinodependiente, enfermedad de Parkinson y daño de la médula espinal.
Como alternativa, por ejemplo, después de que las células madre pluripotentes inducidas se generen a partir de células somáticas humanas mediante el proceso de la presente invención, estas células madre pluripotentes inducidas son inducidas por diferenciación para preparar células somáticas, tejidos u órganos, y la actividad fisiológica o toxicidad de un compuesto, un medicamento, una toxina y similares para las células somáticas, los tejidos o los órganos también se puede evaluar. Como alternativa, después de que se generen células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas de un paciente de una enfermedad específica, estas células madre pluripotentes inducidas son inducidas por diferenciación para preparar células somáticas, tejidos u órganos, y los compuestos candidatos a fármacos actúan sobre las células somáticas, los tejidos u órganos para determinar el efecto terapéutico y/o preventivo y, en consecuencia, los compuestos candidatos a fármacos pueden seleccionarse. En efecto, el uso de las células madre pluripotentes inducidas de la presente invención no se limita a los aspectos especificados mencionados anteriormente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran más específicamente la presente invención y divulgación, pero la presente invención y divulgación no están limitadas por los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1: Establecimiento de células iPS de HDF adultos en medio de células ES de ratón
Se introdujo un gen Slc7a1 (receptor de retrovirus de ratón) en fibroblastos humanos adultos derivados de la piel (HDF adulto) o fibroblastos humanos de recién nacidos derivados del prepucio (BJ) con lentivirus (denominados "HDFa-Slc7al" y "BJ-Slc7a1", respectivamente), se ajustó HDFa-Slc7a1 o BJ-Slc7a1 a 800.000, y luego se sembró en células alimentadoras (célula STO tratada con mitomicina), y se introdujeron genes en vectores retrovíricos mediante las siguientes combinaciones.
1. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, Bmil
2. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6, HPV16 E7
3. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E7
4. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, antígeno T grande de SV40
5. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6
6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc
que se muestra en la figura indica la combinación de "6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc" (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc y TERT provienen del ser humano y Bmil proviene del ratón).
Cuando se continuó el cultivo sin selección de fármaco en las condiciones de cultivo de células ES de ratón, en una placa en la que los genes habían sido introducidos por la combinación 4, una colonia considerada como células iPS emergió 8 días después de la infección por el virus. Asimismo, en otras combinaciones (1 a 3 y 5), surgieron colonias de tipo células iPS aunque no claras en comparación con el caso de la combinación 4. Incluso cuando solo se introdujeron cuatro genes (6), no surgió ninguna colonia, pero las células en las que sólo se habían introducido cuatro genes en la condición mencionada anteriormente mostraron claramente un resultado positivo para la tinción con fosfatasa alcalina (Figura 1).
De manera similar, los fibroblastos derivados de prepucio (BJ) de recién nacidos humanos que expresan el gen Slc7a1 de ratón se ajustaron a 80.000, y luego se sembraron en células alimentadoras (células STO tratadas con mitomicina C) y los genes se introdujeron en vectores retrovíricos mediante las siguientes combinaciones.
1. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, antígeno T grande de SV40
2. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, Bmil
3. hTERT, antígeno T grande de SV40
4. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E6
5. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E7
6. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E6, HPV16 E7
7. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT
8. 4s (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)
9. DsRed
(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc y TERT provienen del ser humano y Bmil proviene del ratón).
Cuando continuó el cultivo durante dos semanas en condiciones de cultivo de células ES de ratón, las células en las que sólo se habían introducido cuatro genes (8) mostraron tinción positiva con fosfatasa alcalina (Figura 2).
Ejemplo 2: Expresión de ECAT en células iPS (1)
Se investigó si las células iPS humanas establecidas a partir de fibroblastos derivados de la piel de adultos humanos (HDF de adultos) expresan ECAT (transcrito asociado a células ES), que es un grupo de genes expresados específicamente en células ES o no.
Se sembraron células iPS (clon iPS-HDFaSlc-87E6) derivadas de HDF adulta en células alimentadoras (células STO tratadas con mitomicina C) que se habían cultivado en placas de 6 pocillos de antemano, en una proporción de 5x104 por cada pocillo y se cultivaron durante 4 días. La célula se fijó con PBS que contenía formalina al 10 %, se eliminó una solución fijadora, esto se lavó con PBS y, además, se añadió PBS al 3 % que contenía BSA, seguido de dejar reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Un anticuerpo primario (anticuerpo anti-ABCG-2 humano (IgG de ratón), anticuerpo anti-SSEA-3 (IgM de rata) y anticuerpo anti-SSEA-4 (IgG de ratón)) se diluyeron a 1:100 con PBS que contenía BSA al 3 %, se hicieron reaccionar a 4 °C durante la noche, las células se lavaron con PBS que contenía BSA al 1 % tres veces, y se usó un anticuerpo secundario que se había diluido a 1:300 con PBS que contenía BSA al 1 % para reaccionar con protección contra la luz a temperatura ambiente durante 1 hora. Como anticuerpo secundario, los anticuerpos anti-IgG de ratón (anticuerpo contra ABCG-2 y SSEA-4; Chemicon) marcados con Cy-3 y los anticuerpos anti-IgM de rata (anticuerpo contra SSEA-3; Jackson ImmunoResearch). La célula se lavó con PBS y, después, se observó y se fotografió con un microscopio (Fig.3). Como resultado, se observó que las células ípS adultas derivadas de h Df expresan ABCG-2, SSEA-3 y Ss Ea -4.
Ejemplo 3: Expresión de ECAT en células iPS (2)
Se sembraron células iPS (clon iPS-HDFaSlc-87E3, 87E4 y 87E12) derivadas de fibroblastos humanos adultos derivados de la piel (HDF adulto) en células alimentadoras (células STO tratadas con mitomicina C) que se habían sembrado previamente en placas de 6 pocillos, en una proporción de 5x104 por cada pocillo y se cultivaron durante 5 días. Como control, se sembraron HDF que son células derivadas de las células iPS en la placa de 6 pocillos y se mantuvieron durante 2 días. Las células se fijaron con PBS que contenía formalina al 10 %. Después de eliminar la solución de fijación y lavar las células con PBS, se añadió tampón de bloqueo (PBS al 3 % que contiene BSA) a las células y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Después de reaccionar con un anticuerpo primario (anticuerpo anti-ABCG-2 humano (IgG de ratón; diluido a 1:80 con tampón de bloqueo), anti-cadherina E (IgG de ratón; diluido a 1:80 con tampón de bloqueo), anticuerpo anti-SSEA-3 (IgM de rata; diluido a 1:250 con tampón de bloqueo) y anticuerpo anti-SSEA-4 (IgG de ratón; diluido a 1:250 con tampón de bloqueo)) a 4 °C durante la noche, las células se lavaron con el tampón de bloqueo. Tras el lavado, se hizo reaccionar a las células adicionalmente con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 hora. Como anticuerpos secundarios, se usó un anticuerpo anti-IgG de ratón (anticuerpo contra ABCG-2, cadherina E y SSEA-4) marcado con Cy-3, que se había diluido a 1:300 con el tampón de bloqueo, y un anticuerpo anti-IgM de rata (anticuerpo contra SSEA-3). Después de la reacción con el anticuerpo secundario, se eliminó la solución de anticuerpo, esto se lavó con PBS, se añadió a la célula PBS que contenía glicerol al 50 % y esto se observó (Figura 4).
Las células iPS derivadas de fibroblastos derivados de la piel de adultos humanos (HDF de adultos) que expresan SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 y cadherina E, que son marcadores de superficie de las células ES. De lo contrario, HDFa que son células derivadas de células iPS no expresaron ninguno de SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 y cadherina E.
Ejemplo 4: Expresión de ECAT en células iPS (3)
El ARN total se aisló de clones de células iPS humanas (iPS-HDFaSlc87E-1 a 8, 11 y 12), célula cancerosa embrionaria humana de clon D1 de NTERA2 (pasaje número 35) y HDF adulto (pasaje número 6) que expresan el gen Slc7a1 de ratón. El ADNc de la primera hebra se sintetizó con el cebador oligo-dT20 y el kit Rever Tra Ace-a (Toyobo) de acuerdo con un protocolo de un fabricante. La PCR se realizó con cebadores como sigue. Para OCT3/4 endógeno, se utilizaron hOct3/4-S1165 y hOct3/4-AS1283; para Sox2 endógeno, se utilizaron hSox2-S1430 y hSox2-AS1555; para Nanog, se utilizaron ECAT4-macaca-968S y ECAT4-macaca-1334AS; para REX1, se utilizaron hRex1-RT-U y hRex1-RT-L; para FGF4, se utilizaron hFGF4-RT-U y hFGF4-RT-L; para Gd F3, se utilizaron hGDF3-S243 y hGDF3-AS850; para ECAT15-1, se utilizaron hECAT15-S532 y hECAT15-AS916; para ECAT15-2, se utilizaron hECAT15-2-S85 y hECAT15-2-AS667; para ESG1, se utilizaron hpH34-S40 y hpH34-AS259; para hTERT, se utilizaron hTERT-S3556 y hTERT-AS3713; así como, para G3PDH, se utilizaron g 3p Dh-F y G3PDH-R (Tabla 1; las SEQ ID NO.: 1 a 22 del listado de secuencias)
Como resultado, muchos clones de células iPS humanas (iPS-HDFaS1c87E-1 a 8, 11 y 12) expresaron ECAT y, en particular, el clon 87E6 expresó diversas ECAT (Figura 5).
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Ejemplo 5: Expresión de ECAT en células iPS (4)
Se confirmó si las células iPS humanas derivadas de fibroblastos derivados de prepucio de recién nacidos humanos (fibroblasto BJ) expresan ECAT o no.
El ARN total se aisló de células iPS humanas (iPS-BJSlc-97E-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, -97G-3, 5, -97H-3 y 5), célula cancerosa embrionaria humana de clon D1 de NTERA2 (número de paso 35) y fibroblasto derivado de prepucio (BJ) del recién nacido (número de paso 6) que expresan el gen Slc7a1 de ratón. El ADNc de la primera hebra se sintetizó con el cebador oligo-dT20 y el kit Rever Tra Ace-a (Toyobo) de acuerdo con un protocolo de un fabricante. La PCR se realizó con cebadores como sigue. Para OCT3/4 endógeno, se utilizaron hOct3/4-S1165 y hOct3/4-AS1283; para Sox2 endógeno, se utilizaron hSox2-S1430 y hSox2-AS1555; para Nanog, se utilizaron ECAT4-macaca-968S y ECAT4-macaca-1334AS; para REX1, se utilizaron hRex1-RT-U y hRex1-RT-L; para FGF4, se utilizaron hFGF4-RT-U y hFGF4-RT-L; para GDF3, se utilizaron hGDF3-S243 y hGDF3-AS850; para ECAT15-1, se utilizaron hECAT15-S532 y hECAT15-AS916; para ECAT15-2, se utilizaron hECAT15-2-S85 y hECAT15-2-AS667; para ESG1, se utilizaron hpH34-S40 y hpH34-AS259; para hTERT, se utilizaron hTERT-S3556 y hTERT-AS3713; así como para G3PDH, se utilizaron G3pDH-F y G3p Dh-R (Tabla 2: las SEQ ID NO.: 23 a 44 del Listado de secuencias).
Como resultado, muchos clones de células iPS humanas (iPS-BJSlc-97E-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, -97G-3, 5, -97H-3 y 5) expresaron ECAT (Fig.6).
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Ejemplo 6: Formación de teratoma por células iPS humanas
Se inyectaron 5,0X106 células iPS humanas por vía subcutánea en el reverso de un ratón SCID (hembra, 5 semanas de vida). Cinco semanas después de la inyección, se observó un gran tumor. El tumor fue extirpado, se midió el peso y se fotografió su aspecto. Este tumor se fijó con PBS que contenía formalina al 10 %. El tumor embebido en parafina se cortó en secciones de 4,5 |jm y las secciones delgadas resultantes se colocaron en un portaobjetos de vidrio, se secaron al aire y luego se tiñeron con hematoxilinosina. La Fig.7 A indica un ratón inyectado por vía subcutánea con clones de iPS-HDFaSlc-87E12 y teratoma de los mismos. La Fig.7 B indica la imagen histológica obtenida del teratoma extirpado de un ratón inyectado por vía subcutánea con el clon iPS-HDFaSlc-87E3, La Fig.7C indica que con un clon iPS-HDFaSlc-87E6, y la Fig. 7D indica eso con un clon iPS-HDFaSlc-87E12.
Ejemplo 7: Diferenciación in vitro de células iPS humanas
Al realizar cultivo por flotación, se formaron cuerpos embrioides (EB) y se evaluó la capacidad de diferenciación in vitro de las células iPS humanas. Las células iPS humanas (iPS-HDFaSlc-127F2, E3) se cultivaron por flotación durante 7 días para formar cuerpos embrioides. Posteriormente, los cuerpos embrioides se transfirieron a placas recubiertas de gelatina, el cultivo continuó durante 8 días y, posteriormente, se realizó un análisis inmunocitoquímico. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes. El Anticuerpo anti-a-actina del músculo liso (Dako), el anticuerpo anti-tubulina pIII (Chemicon), el anticuerpo anti-a-fetoproteína (Dako), la IgG normal de ratón (2 mg/ml, Chemicon) y la IgG normal de conejo (2 mg/ml, Chemicon) se diluyeron a 1:100 con PBS que contenía BSA al 3 %, respectivamente, y estos se utilizaron como anticuerpos primarios. Después de que el anticuerpo primario reaccionara a temperatura ambiente durante 1 hora, las células se lavaron con PBS y se hicieron reaccionar con anticuerpos secundarios (diluidos a 1:300 con PBS que contenía BSA al 3 %). Además, los núcleos se tiñeron con DAPI. Como resultado, la a-actina del músculo liso (a-SMA, marcador del mesodermo), la tubulina pIII (marcador de ectodermo) y la a-fetoproteína (marcador de endodermo) muestran resultados positivos y, en consecuencia, se confirmó que las células iPS humanas se diferencian in vitro a través de la formación de cuerpos embrioides (Fig.8).
Ejemplo 8: Optimización para la introducción de genes con retrovirus para generar células iPS humanas Para inducir células iPS de fibroblastos de ratón, se considera eficaz un retrovirus que tiene una alta eficacia de introducción de genes (Takahashi et al., Cell, 126, págs.663, -676-2006). En consecuencia, se optimizó el método de introducción de genes de fibroblastos derivados de la piel de adultos humanos (HDF de adultos). En primer lugar, se introdujo una proteína verde fluorescente (GFP) en h Df adulto con un retrovirus anfotrópico preparado en células de empaquetamiento PLAT-A. Como control, mediante el uso de un retrovirus ecotrópico preparado en células de empaquetamiento PLAT-E (Morita et al., Gene Ther., 7, págs.1063-1066, 2000), se introdujo GFP en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). En los MEF, el 80 % o más de las células expresaron GFP (Fig.9). Por otro lado, menos del 20% de los HDF de adultos fueron claramente menores en la intensidad de expresión de GFP que en el caso de MEF, y la tasa de expresión de GFP fue menor del 20 %.
Para mejorar la eficacia de la introducción de genes, el receptor Slc7a1 (Verrey et al., Pflugers Arch., 447, págs.532-542, 2004) (también conocido como mCAT1) de retrovirus de ratón se introdujo en los HDF de adultos con un lentivirus. A continuación, se introdujo GFP en HDFa-Slc7a1 con un retrovirus ecotrópico. Mediante este método, se alcanzó una eficacia de introducción de genes del 60 % (Fig.9).
Ejemplo 9: Preparación de células iPS de HDF adultos mediante el uso de medio de células ES de primates En la Fig.10A se muestra un esquema de un protocolo para inducir células iPS humanas. Los Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc humanos se introdujeron en HDF-Slc7a1 con un vector de retrovirus (Figura 10B, 8x105 células/placa de 100 mm).
6 días después de la introducción del gen, las células se recolectaron mediante tratamiento con tripsina, se ajustaron a 5*104 o 5x105 células/placa de 100 mm, y luego se sembraron en células alimentadoras SNL tratadas con mitomicina C (McMahon et al., Cell, 62, págs.1073-85, 1990). Al día siguiente, el medio (DMEM que contiene FBS al 10 %) se reemplazó con medio de células ES de primates para células ES de primates (Reprocell Inc.) suplementado con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). Después de unas dos semanas, se vieron varias colonias granuladas que no son similares a las células madre embrionarias humanas en la morfología de las células emergidas (figura 10C). Alrededor de 25 días, se observó otro tipo de colonia plana similar a la colonia de células ES humanas (Fig.10D). A partir de 5x104 fibroblastos, se observaron aproximadamente 10 colonias de tipo células ES humanas y aproximadamente 100 colonias granuladas (En seis experimentos independientes, se observaron 7/122, 8/84, 8/171, 5/73, 6/122 y 11/213. Los resultados se resumen en la Tabla 3).
T l 1
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continuación
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día, se recogieron colonias de tipo células ES humanas y se desagregaron mecánicamente en pequeñas abrazaderas sin digestión enzimática. Cuando comenzó con 5x105 fibroblastos, una placa estaba casi cubierta con más de 300 colonias granuladas. En algunos casos, se observaron varias colonias humanas de tipo células ES entre colonias granuladas, pero como la colonia granulada tenía una alta densidad, fue difícil aislar colonias humanas de tipo células ES.
Cuando las células iPS humanas proliferaron en células alimentadoras SNL en un medio de tipo células ES de primates que contenía bFGF, las células formaron colonias planas que estaban densamente agregadas (Fig.10E). Cada célula mostró la misma morfología celular que la característica de la célula ES humana en un nucleolino más grande y un citoplasma más pequeño (Fig.10F). Como el caso de las células ES humanas, en algunos casos se observó diferenciación espontánea en el centro de las colonias (Fig. 10G). Además, tal como se observa en las células ES humanas, estas células exhibieron dependencia de células alimentadoras y no se adhirieron a la placa de cultivo de tejido recubierta con gelatina. Por otro lado, estas células mantuvieron el estado indiferenciado en el medio para células ES de primates acondicionadas con MEF (MEF-CM) en una placa recubierta de matrigel, pero no mantuvieron el estado indiferenciado en el medio para células ES de primates no acondicionadas (Fig.11). Los clones de células iPS humanas establecidas se resumen en la Tabla 4.
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continuación
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Ejemplo 10: Expresión de marcadores de células ES humanas por células iPS humanas
Por análisis de inmunotinción, las células iPS humanas mostraron expresión de antígenos de superficie específicos de células ES humanas (Adewumi et al., Nat. Biotechnol., 25, 803-816, 2007), que comprende SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 y TRA-2-49/6E (fosfatasa alcalina), así como la proteína Nanog (Fig.10I a N).
Se demostró mediante RT-PCR que las células iPS humanas expresan muchos marcadores genéticos (por ejemplo, Oct3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, Dp Pa 4 y (hTERT) etc.) de células madre embrionarias indiferenciadas a un nivel igual o superior a un nivel en el caso de la línea celular de cáncer embrionario humano NTERA-2 (Fig.12). De los resultados del análisis por transferencia de Western, un nivel de proteína de Oct3/4, Sox2, Nanog, Sall4, CADHERINA E y hTERT fue igual en células iPS humanas y células ES humanas (Fig.13A). Dado que la expresión del gen introducido de un retrovirus incorporado en un cromosoma en una célula iPS humana se silenció eficazmente, se sugirió que el nivel depende de la expresión endógena de estos genes (Fig.13B).
Ejemplo 11: Actividad del promotor de genes específicos de células ES en células iPS humanas Mediante un método de secuenciación genómica con bisulfito, se analizó el estado de metilación del dinucleótido de citosina guanina (CpG) en una región promotora de los genes asociados con la pluripotencia de Oct3/4, REX1 y Nanog y, como resultado, se descubrió que los dinucleótidos CpG de esa región estaban altamente metilados en el HDF parental original (HDF), mientras que estaba altamente desmetilado en células iPS humanas (201B2, 201B6, 201B7) (Fig.14A). A partir de estos hallazgos, se sugirió que estos promotores se activan en células iPS humanas. Asimismo, en el ensayo indicador de luciferasa, se demostró que los promotores humanos Oct3/4 y REX1 tienen un alto nivel de actividad de transcripción en células iPS humanas, pero no lo tiene en HDF. La actividad promotora del gen que se expresa de forma ubicua, como la ARN polimerasa II humana (PolII), presentó una actividad equivalente tanto en células iPS humanas como en HDF (Fig.14B).
Ejemplo 12: Alta actividad de telomerasa y proliferación exponencial de células iPS humanas
Como sugiere el alto nivel de expresión de hTERT, las células iPS humanas presentaron una alta actividad de telomerasa (Fig.15A). Las células iPS humanas proliferaron de manera exponencial durante al menos 4 meses (Fig.15B). El tiempo de duplicación en el cálculo de las células iPS humanas fue 46,9 ± 12,4 (clon 201B2), 47,8±6,6 (201B6) y 43,2±1l,5 (201B7) horas (Fig.15B). Estos tiempos fueron equivalentes al tiempo de duplicación ya documentado de las células ES humanas (Cowan et al., N. Engl. J. Med., 350, págs. 1353-56, 2004).
Ejemplo 13: Ensayo de contaminación cruzada en células iPS humanas derivadas de HDF
La PCR para el ADN del genoma de las células iPS humanas mostró que todos los clones tienen incorporación de los cuatro tipos de retrovirus (Fig.16A). Mediante análisis por transferencia de Southern con sonda de ADNc de c-Myc, se descubrió que cada clon tiene patrones específicos de sitio de incorporación del retrovirus (Fig.16B). Además, los patrones de 16 repeticiones cortas en tándem fueron completamente consistentes entre los clones de iPS humanos y HDF parental. Los resultados del análisis STR de células iPS derivadas de HDF se muestran en la Tabla 5.
T l
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Estos patrones eran diferentes de los de las líneas celulares ES humanas establecidos documentados en el sitio web del Instituto Nacional de Salud (http://stemcells.nih.gov/research/scunit/genotyping.htm). Además, mediante el análisis de bandas horizontales G del cromosoma, se demostró que las células iPS humanas tienen cariotipos 46XX normales. Por lo tanto, se concluyó que los clones de iPS humanos provienen de HDF y no se deben a la contaminación de las células ES.
Ejemplo 14: Diferenciación a través de cuerpos embrioides de células iPS humanas
Para determinar la capacidad de diferenciación in vitro de las células iPS humanas, se utilizó cultivo por flotación para formar cuerpos embrioides (EB). 8 días después del cultivo por flotación, Las células iPS formaron estructuras en forma de bola (Fig.17A). Estas estructuras de tipo cuerpos embrioides se transfirieron a placas recubiertas de gelatina y el cultivo continuó durante 8 días. Las células adheridas mostraron varias morfologías celulares, como células de tipo nervioso, células de tipo adoquín y células epiteliales (Fig.17B a E). Mediante análisis inmunocitoquímico, se detectaron las células positivas para la tubulina pIII (marcador de ectodermo), la proteína ácida de la fibrilla de la glía (GFAP, ectodermo), a-actina del músculo liso (a-SMA, mesodermo), desmina (mesodermo), a-fetoproteína (endodermo) y vimentina (mesodermo y endodermo de la pared corporal) (Fig.17F a K). De los resultados de RT-PCR, se confirmó que FOXA2 (marcador de endodermo), a Fp (endodermo), citoqueratina 8 y 18 (endodermo), SOX 17 (endodermo), BRACHYURY (mesodermo), MSX1 (mesodermo), MAP2 (ectodermo) y PAX6 (ectodermo) se expresan en estas células diferenciadas (Fig.17L). Por otro lado, las expresiones de Oct3/4, Sox2 y Nanog se redujeron claramente. A partir de estos resultados, se demostró que las células iPS se pueden diferenciar en tres células de la capa germinal in vitro.
Ejemplo 15: Diferenciación de células iPS humanas en células nerviosas
Se determinó si la diferenciación de las células iPS humanas se puede inducir mediante el método ya documentado para las células ES humanas. Se sembraron células iPS humanas en una capa de células alimentadoras PA6 y se mantuvieron/cultivaron durante 2 semanas (Kawasaki et al., Neuron, 28, págs.3l-40, 2000). Las células estaban muy ampliadas y se observaron algunas estructuras nerviosas (Fig.18A). Por análisis inmunocitoquímico, se detectaron células positivas a la tirosina hidroxinasa y tubulina pIII en el cultivo (Fig.18B). A partir de los resultados del análisis de PCR, se confirmó la expresión de marcadores nerviosos dopaminérgicos tales como AADC, ChAT, DAT y LMX1B, así como MAP2, que es otro marcador nervioso (Fig.18C). Además, la expresión de Oct3/4, Sox2 y Nanog se redujo (Fig.18C). A partir de estos resultados, se demostró que las células iPS se pueden diferenciar en células nerviosas que contienen neuronas dopaminérgicas mediante el cocultivo con células pA6.
Ejemplo 16: Diferenciación dirigida de células iPS humanas en células cardíacas.
Según la referencia para la diferenciación en células cardíacas mediante el uso de activina A y factor morfogenético óseo (BMP) 4 (Laflamme et al., Nat. Biotechnol., 25, págs.1015-24, 2007), se determinó la diferenciación de células iPS humanas en corazón. 12 días después de la inducción de la diferenciación, una agregación celular comienza a latir (Fig.18D). De los resultados de RT-PCR, se demostró que estas células expresan marcadores de células cardiomióticas tales como TnTc, MEF2C, NKX2.5, MYL2A y MYHCB (Fig.18E). Por otro lado, la expresión de Oct3/4, Sox2 y Nanog se redujo notablemente. A partir de estos resultados, se demostró que las células iPS humanas se pueden diferenciar en células cardiomióticas in vitro.
Ejemplo 17: Formación de teratoma a partir de células iPS humanas
Para determinar la pluripotencia in vivo, se trasplantaron por vía subcutánea células iPS humanas (clon 201B7) en el flanco dorsal de un ratón inmunodeficiente (SCID). Después de 9 semanas, se observó tumorigénesis. Mediante observación histológica, se demostró que varios tejidos que comprenden tejido epitelial arquentérico similar a un canal (ectodermo), músculo estriado (mesodermo), cartílago (músculo), tejido nervioso (endodermo) y tejido plano que contiene queratina (endodermo) (Fig.19) están contenidos en tumores.
Ejemplo 18: Preparación de células iPS a partir de otras células somáticas humanas
Además de HDF, se usaron las líneas celulares (HFLS) establecidas a partir de células sinoviales primarias de tipo fibroblasto derivadas de humanos de tejido sinovial humano adulto y líneas celulares (células BJ) establecidas a partir de fibroblastos derivados de prepucio de neonato (Tabla 3). Se examinó la preparación de células iPS a partir de HFLS (5x104 células/placa de 100 mm) y, como resultado, se obtuvieron 600 o más colonias granuladas y 17 colonias de tipo células ES humanas. Cuando se sometieron a la determinación 6 colonias de estas 17 colonias, solo dos colonias de ellas pudieron proliferar (Fig.20). Una placa sembrada con 5x105 HFLS se cubrió con colonias granuladas y no se pudieron confirmar las colonias de tipo células ES humanas. Por otro lado, se examinó la preparación de células iPS a partir de células BJ y, como resultado, en el caso de 5x 104 células/placa de 100 mm, se reconocieron de 7 a 13 colonias humanas de tipo células ES y colonias leves granuladas, pero en el caso de 5x105/placa de 100 mm, se obtuvieron 100 colonias de tipo células ES humanas (Tabla 3). Se recogieron seis colonias de tipo células ES humanas de ellas, y se confirmaron 5 colonias como células iPS (Fig.20). Las células iPS humanas derivadas de HFLS y BJ expresaron genes marcadores de células ES humanas a un nivel igual o superior a un nivel en el caso de células ES humanas (Fig.21). Estas células iPS humanas se diferenciaron en 3 células de la capa germinal mediante EB (Fig.22). Por análisis STR, se confirmó que las células iPS-HFLS y las células iPS-BJ se obtuvieron de células HFLS y células BJ, respectivamente. La Tabla 6 muestra los resultados del análisis STR de células iPS derivadas de HFLS, y la Tabla 7 muestra los resultados del análisis STR de células iPS derivadas de BJ.
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continuación
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De los resultados anteriores, se demostró que mediante la introducción genética de cuatro genes: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc con un retrovirus, se pueden preparar células iPS a partir de HDF adultos y otras células somáticas. Las células iPS humanas establecidas eran similares a las células ES humanas en muchos puntos que comprenden la morfología celular, la proliferación, la dependencia de la célula alimentadora, un patrón de expresión de marcadores de superficie, la expresión génica, la actividad promotora, la actividad de la telomerasa, la capacidad de diferenciación in vitro y la capacidad de formación de teratoma. Además, cuatro retrovirus fueron silenciados casi por completo en células iPS humanas. De la descripción anterior, se demostró que estas células están completamente reprogramadas y la autorregeneración no depende de la expresión continua de los transgenes.
Los materiales y métodos experimentales de los Ejemplos 8 a 18 son los siguientes.
1. Cultivo celular
Los HDF obtenidos de la piel facial de una mujer caucásica de 36 años y los HFL obtenidos del tejido sinovial de un varón caucásico de 69 años se adquirieron de Cell Applications, Inc. Los fibroblastos BJ del prepucio de neonato y las células cancerosas embrionarias humanas de clon D1 de NTERA-2 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células PLAT-E y PLAT-A de fibroblastos humanos se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Nacalai Tesque) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS), así como penicilina y estreptomicina al 0,5 % (Invitrogen). Las células 293FT se mantuvieron en DMEM que contenía FBS al 10 %, glutamina 2 mM (Invitrogen), aminoácido no esencial 1x104 M (Invitrogen) y piruvato de sodio 1 mM (Sigma), así como penicilina y estreptomicina al 0,5 %. Se mantuvieron células estromales PA6 (Riken BioResource Center) en a-MEM que contenía FBS al 10 % y penicilina y estreptomicina al 0,5 %. Las células iPS se establecieron y se mantuvieron en el medio para células ES de primates (ReproCeLL) suplementadas con 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico humano recombinante (bFGF, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). En el pasaje, las células iPS humanas se lavaron con PBS una vez y, posteriormente, se incubaron en DMEM/F12 que contenía 1 mg/ml de Colagenasa IV (Invitrogen) a 37 °C. Cuando las colonias en el borde de la placa comenzaron a disociarse del fondo, se eliminó el DMEM/F12/Colagenasa y se lavó con medio de células ES humanas. Las células se descartaron y se recogieron en un tubo cónico de 15 ml. Se añadió un volumen apropiado del medio y el contenido se transfirió a células alimentadoras SNL recolectadas en una nueva placa. La proporción de división se estableció de forma rutinaria en 1:3. Para cultivar células iPS en condiciones en las que no estén contenidas las células alimentadoras, las placas se recubrieron con 0,3 mg/ml de matrigel (BD Biosciences) a 4 °C durante la noche. La placa se calentó a temperatura ambiente antes de su uso. El matrigel no unido se aspiró y se lavó con DMEM/F12. Las células iPS se sembraron en una placa recubierta con Matrigel en medio de células ES de primates acondicionadas con MEF (MEF-CM) o no acondicionadas (ReproCELL), ambos suplementados con 4 ng/ml de bFGF. El medio se cambió a diario. Para la preparación de MEF-CM, los MEF derivados del grupo de embriones de ratones ICR del día embrionario 13,5 se sembraron en placas a 1 x 106 células/placa de 100 mm y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron una vez con PBS y se cultivaron en 10 ml de medio de células ES de primates. Después de cultivar durante 24 horas, se recogió un sobrenadante de cultivo de cultivo de MEF, se filtró a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 pm y se almacenó a -20 °C hasta su uso.
2. Construcción de plásmido
El marco de lectura abierto de Oct3/4 humano se amplificó mediante RT-PCR y se clonó en pCR2.1-TOPO. Se subclonó un fragmento de EcoRI en pCR2.1-hOct3/4 en el sitio EcoRI del vector de retrovirus pMXs. Para distinguir cada experimento, el código de barras de una secuencia aleatoria de 20 pb llamada N20 se insertó en el sitio NotI/Sall en el vector de expresión Oct3/4. Para evitar la contaminación interexperimental, en cada experimento se utilizó una secuencia de código de barras única. Los marcos de lectura abiertos de los Sox2, Klf4 y c-Myc humanos también se amplificaron mediante RT-PCR y se subclonaron en pENTR-D-TOPO (Invitrogen). Se insertó un gen completo subclonado en pENTR-D-TOPO en el vector de retrovirus pMXs utilizando Gateway Cloning System (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. El marco de lectura abierto del ratón Slc7a1 también se amplificó, se subclonó en pENTR-D-TOPO, y se insertó en pLenti6/UbC/V5-DEST (Invitrogen) por Gateway System. Las regiones de regulación del gen humano Oct3/4 y el gen REX1 se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en pCRXL-TOPO (Invitrogen). Para PhOCT4-Luc y phREX1-Luc, los fragmentos KpnI/BglII se eliminaron mediante digestión con KpnI/BglII del vector pCRXL y se subclonaron en el sitio KpnI/BglII en pGV-BM2. Para pPolII-Luc, se insertó un fragmento AatII (extremo romo)/NheI de pQBI-polII en el sitio KpnI (extremo romo)/NheI de pGV-BM2. Todos los fragmentos se verificaron mediante secuenciación. Las secuencias del cebador se muestran en la Tabla 8 (SEQ ID NO: 45 a 126 del Listado de secuencias).
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(continuación)
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(continuación)
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3. Preparación e infección de lentivirus
Se sembraron células 293FT (Invitrogen) a 6x106 células por placa de 100 mm y se incubaron durante la noche. Se transfectaron células 293FT con 3 |jg de pLenti6/UbC-Slc7a1 junto con 9 |jg de mezcla de empaquetado Virapower usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante. Al día siguiente de la transfección, se realizó el cambio de medio. Además, después de 24 horas, se recogió el sobrenadante de transfectante y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 jm (Whatman). Un día antes de la introducción del gen, se sembraron fibroblastos humanos a 8x105 células/placa de 100 mm. El medio se reemplazó con sobrenadante que contenía virus suplementado con 4 jg/ml de polibreno (Nacalai Tesque) y se incubó durante 24 horas.
4. Infección por retrovirus y producción de células iPS
Las células de empaquetamiento PLAT-E se sembraron a 8 x 106 células/placa de 100 mm y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, se transfectaron células PLAT-E con vectores pMXs con reactivo de transfección Fugene 6 (Roche). 24 horas después de la transfección, se reemplazó el medio por un nuevo medio y, además, después de 24 horas, el sobrenadante del cultivo se recogió como sobrenadante que contenía virus. Un día antes de la introducción del gen, los fibroblastos humanos (HDFa-Slc7a1) que expresan Slc7a1 de ratón se ajustaron a 8x105 células/placa de 100 mm, y se sembraron. Los sobrenadantes que contienen virus se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 jm y se suplementaron con 4 jm/ml de polibreno. Se mezclaron cantidades equivalentes de sobrenadantes que contenían cada uno de los cuatro retrovirus, se transfirieron a la placa de HDFa-Slc7a1 y se incubaron durante la noche. Después de 24 horas, se eliminó el sobrenadante que contenía virus y se reemplazó el medio por un medio nuevo. Después de 6 días, las células HDFa-Slc7a1 se recolectaron mediante tripsinización y se volvieron a sembrar a 5x1034 células/placa de 100 mm en una capa de alimentadoras SNL. Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio de células ES de primates suplementado con 4 ng/ml de bFGF. El medio se cambió cada dos días. 30 días después de la introducción del gen, se recolectaron las colonias y se transfirieron a 0,2 ml de medio de células ES de primates. Las colonias se disociaron mecánicamente en pequeñas pinzas pipeteando suavemente. La suspensión celular se transfirió a una SNL alimentadora en placas de 24 pocillos. Esta etapa fue considerada como el pasaje número 1.
5. Aislamiento de ARN y transcripción inversa
El ARN total se purificó con reactivo Trizol (Invitrogen) y se trató con el kit Turbo DNA Free (Ambion) para eliminar la contaminación del ADN genómico. Se utilizó 1 |jg de ARN total para la reacción de transcripción inversa con Rever Tra Ace-a (Toyobo) y cebador dT20, según las instrucciones del fabricante. La PCR se realizó con ExTaq (Takara). La PCR cuantitativa se realizó con Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen) y se analizó con el 7300 Realtime PCR System (Applied Biosystems). La secuencia del cebador se muestra en la Tabla 8.
6. Tinción de fosfatasa alcalina y análisis inmunocitoquímico
La tinción con fosfatasa alcalina se realizó usando el kit de fosfatasa alcalina de leucocitos (Sigma). Para el análisis inmunocitoquímico, las células se fijaron con PBS que contenía paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado con PBS, las células se trataron con PBS que contenía suero normal de cabra o burro al 5 % (Chemicon), albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Nacalai Tesque) y Triton X-100 al 0,1 % a temperatura ambiente durante 45 minutos. Como anticuerpo primario, se usaron SSEA1 (diluido a 1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank), SSEA3 (diluido a 1:10, regalo del Dr. Peter W. Andrews), SSEA4 (diluido a 1:100, Developmental Studies Hybridoma Bank), TRA-2-49/6E (diluido a 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank), TRA-1-60 (diluido a 1:50, regalo del Dr. Peter W. Andrews), TRA-1-81 (diluido a 1:50, regalo del Dr. Peter W. Andrews), Nanog (diluido a 1:20, AF1997, R&D Systems), Tubulina pIII (diluido a 1:100, CB412, Chemicon), proteína ácida de la fibrilla de la glia (diluida a 1:500, Z0334, Dako), a-actina del músculo liso (diluida, N1584, Dako), desmina (diluida a 1:100, Lab Vision), vimentina (diluida a 1:100, SC-6260, Santa Cruz), a-fetoproteína (diluida a 1:100, MAB1368, R&D Systems) y tirosina hidroxilasa (diluida a 1:100, AB152, Chemicon). Como anticuerpo secundario, se usaron anti-IgM de rata en cabra conjugado con cianina3 (Cy3) (diluido a 1:500, Jackson ImmunoResearch), anti-IgM de ratón en cabra conjugado con Alexa 546 (diluido a 1:500, Invitrogen), anti-IgG de conejo en cabra conjugado con Alexa 488 (diluido a 1:500, Invitrogen), anti-IgG de cabra en burro conjugado con Alexa 488 (diluido a 1:500, Invitrogen), anti-IgG de ratón en cabra conjugado con Cy3 (diluido a 1:500, Chemicon) y anti-IgM de ratón en cabra conjugado con Alexa 488 (diluido a 1:500, Invitrogen). Los núcleos se tiñeron con 1 jg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen).
7. Diferenciación in vitro
Las células iPS humanas se trataron con colagenasa IV, se transfirieron a la placa recubierta con metacrilato de hidroxietilo y se sometieron a cultivo por flotación utilizando un medio DMEM/F12 que contiene KSR al 20 % (Invitrogen), L-glutamina 2 mM, aminoácido no esencial 1x10-4 M, 2-mercaptoetanol 1x10-4 M (Invitrogen) y penicilina y estreptomicina al 0,5 %, para formar cuerpos embrioides (EB). El medio se cambió cada dos días. Después de 8 días como cultivo por flotación, los EB se transfirieron a una placa recubierta de gelatina y se cultivaron en el mismo medio durante otros 8 días.
Para la diferenciación en neurona dopaminérgica, en primer lugar, las células alimentadoras PA6 se sembraron en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina y se incubaron durante 4 días para alcanzar la confluencia. Se sembraron pequeños grupos de células iPS en una capa alimentadora de PA6 en medio esencial mínimo de Glasgow (Invitrogen) que contenía KSR al 10 % (Invitrogen), aminoácido no esencial 1x10-4 M y 2-mercaptoetanol 1X10-4 M (Invitrogen), así como penicilina y estreptomicina al 0,5 %.
Para la diferenciación en una célula cardiomiótica, las células iPS se mantuvieron en una placa recubierta con Matrigel en MEF-CM suplementado con 4 ng/ml de bFGF durante 6 días. Posteriormente, el medio se reemplazó con RPMI1640 más medio de suplemento B27 (Invitrogen) (RPMI/B27), suplementado con 100 ng/ml de Activina A humana recombinante (R&D Systems) durante 24 horas, seguido de 10 ng/ml de proteína morfogenética ósea recombinante humana 4 (BMP4, R&D Systems) durante 4 días. Después de la estimulación con citocina, las células se mantuvieron en RPMI/B27 sin citocinas. El medio se cambió cada dos días.
8. Método de secuenciación de bisulfito
Se trató ADN genómico (1 jg ) con el kit de modificación de ADN genómico Cp (Chemicon) de acuerdo con el método recomendado por un fabricante. El ADN tratado se purificó con la columna QIA Quick Column (QIAGEN). Las regiones promotoras de los genes humanos Oct3/4, Nanog y Rex1 se amplificaron mediante PCR. Los productos de PCR se subclonaron en pCR2.1-TOPO. Se sometieron a velificación diez clones de cada muestra mediante secuenciación con el cebador universal M13. Las secuencias de cebadores utilizadas para la amplificación por PCR se muestran en la Tabla 8.
9. Ensayo de luciferasa
Cada plásmido indicador (1 jg ) que contenía el gen de luciferasa de luciérnaga se introdujo en células iPS humanas o HDF con 50 ng de pRL-TK (Promega). 48 horas después de la introducción del gen, las células se lisaron con tampón de lisis pasivo a 1x (Promega) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las actividades de luciferasa se midieron con el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega) y el sistema de detección Centro LB960 (Barthold) de acuerdo con el protocolo de un fabricante.
10. Formación de teratoma
La célula se recolectó mediante tratamiento con colagenasa IV, se recogió en tubos, se centrifugaron y los sedimentos se suspendieron en DMEM/F12. Se inyectó por vía subcutánea una cuarta parte de las células de una placa confluente de 100 mm en el flanco dorsal de un ratón SCID (Clea Japan). Después de 9 semanas, los tumores fueron diseccionados, pesados y fijados con PBS que contiene paraformaldehído al 4 %. El tejido embebido en parafina se cortó en láminas y se tiñó con hematoxilina-eosina.
11. Análisis por transferencia de Western
Las células en estado semiconfluente se lisaron con tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Nonidet P-40 al 1 % (NP-40), desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,1 %) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche). El lisado celular de la línea celular ES humana MEL-1 se adquirió de Abcam. Los lisados celulares (20 |jg) se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 8 % o al 12 % y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinildeno (Millipore). La membrana se bloqueó con TBST (Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, NaCl 136 mM y Tween-20 al 0,1 %) que contiene leche desnatada al 1 % y, posteriormente, se incubó con solución de anticuerpo primario a 4 °C durante la noche. Tras el lavado con TBST, la membrana se incubó con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se detectaron con un sustrato HRP quimioluminiscente Immobilon Western (Millipore) y el sistema de obtención de imágenes LAS3000 (Fuji Film). Como anticuerpo primario, se usaron anti-Oct3/4 (diluido a 1:600, SC-5279, Santa Cruz), anti-Sox2 (diluido a 1:2000, AB5603, Chemicon), anti-Nanog (diluido a 1:200, R&D Systems), anti-Klf4 (diluido a 1:200, SC-20691, Santa Cruz), anti-c-Myc (diluido 1:200, SC-764, Santa Cruz), anti-cadherina E (diluido a 1:1000, 610182, BS Bioscience), anti-Dppa4 (diluido a 1:500, ab31648 Abcam), anti-FoxD3 (diluido a 1:200, AB5687, Chemicon), anti-telomerasa (diluido a 1:1000, ab23699, Abcam), anti-Sall4 (diluido a 1:400, ab29112, Abcam), anti-Lin28 (diluido a 1:500, AF3757, R&D Systems) y anti-actina p (diluido a 1:5000, A5441, Sigma) y, como anticuerpo secundario, se utilizaron anti-IgG de ratón-HRP (diluido a 1:3000, n.° 7076, Cell Signaling), anti-IgG de conejo-HRp (diluido a 1:2000, n.° 7074, Cell Signaling), y anti-IgG de cabra-HRP (diluido a 1:3000, SC-2056, Santa Cruz).
12. Análisis por transferencia de Southern
El ADN genómico (5 jg ) se digirió con BgllI, EcoRI y Ncol durante la noche. Los fragmentos de ADN digeridos se separaron en gel de agarosa al 0,8 % y se transfirieron a una membrana de nailon (Amersham). La membrana se hizo reaccionar con sonda de ADN marcada con digoxigenina (DIG) en tampón DIG Easy Hyb (Roche) a 42 °C durante la noche con agitación constante. Tras el lavado, se añadió a la membrana anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina (diluido a 1:10000, Roche). Las señales fueron generadas por CDP-star (Roche) y detectadas por el sistema de obtención de imágenes LAS3000.
13. Análisis de repetición en tándem corto y cariotipo
Se utilizó ADN genómico para PCR con Powerplex 16 System (Promega) y se analizó mediante ABIPRISM 3100 (analizador genético y Gene Mapper v3.5) (Applied Bio Systems). Los análisis de bandas cromosómicas G se realizaron en Nihon Gene Research Laboratories Inc. (Japón).
14. Detección de la actividad de la telomerasa
La actividad de la telomerasa se detectó con un kit de detección de telomerasa TRAPEZE (Chemicon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se separaron mediante electroforesis en gel no desnaturalizante de acrilamida al 10 % basada en TBE. El gel se tiñó con SYBR Gold (diluido a 1:10000, Invitrogen).
15. Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina
Aproximadamente 1 x107 células se reticularon con formaldehído al 1 % durante 5 minutos a temperatura ambiente y la reacción se detuvo mediante la adición de glicina. El lisado celular se sometió a ultrasonidos para compartir el complejo cromatina-ADN. La inmunoprecipitación se realizó con anti-trimetil Lys4 histona H3 (07-473, Upstate) unido a Proteína G de Dynabeads (Invitrogen), anti-trimetil Lys27 histona H3 (07-449, Upstate), o anticuerpo IgG de conejo normal. Los eludidos se utilizaron para PCR cuantitativa como moldes.
16. Micromatriz de ADN
El ARN total de células HDF y hiPS (clon 201B) se marcó con Cy3. Las muestras se hibridaron con micromatrices de genoma humano completo 4x44K (G4112F, Agilent). Cada muestra se hibridó una vez con el protocolo de un color. Las matrices se escanearon con el sistema de escáner de micromatrices G2565BA (Agilent) y los datos se analizaron utilizando el programa informático GeneSpringGX 7.3.1. Se aplicaron dos procedimientos de normalización. En primer lugar, las intensidades de señal inferiores a 0,01 se establecieron en 0,01. Después, cada microplaca se normalizó al percentil 50 de medidas tomadas de la microplaca. Los datos de micromatrices (Tesar et al., Nature, 448, págs.196-199, 2007) de la célula hES H9 se recuperaron de conjuntos de datos GEO (GSM194390, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gds&cmd=search& term = GSE7902). En las tres muestras, para los análisis se utilizaron genes con valor de bandera "presente" (32.266 genes). Los datos de micromatrices de las células HDF y hiPS se han depositado en conjuntos de datos GEO con el número de registro GSE9561.
Ejemplo 19: Establecimiento de células iPS sin c-Myc
Los clones iPS de células iPS de ratón (Takahashi et al., Cell, 126, págs. 663-76, 2006) obtenidos al introducir Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en fibroblastos de ratón con retrovirus contienen la incorporación de algunos retrovirus en cada gen. Cada clon tiene un total de más de 20 sitios de incorporación de retrovirus y existe la posibilidad de que aumente el riesgo de tumorigénesis. En el caso de las células iPS de ratón, se sabe que la tumorigénesis ocurre en ~ 20 % de un ratón quimera derivado de células iPS y su progenie (Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007), y existe la posibilidad de que la reactivación del retrovirus c-Myc aumente la tasa de aparición de tumorigénicos en el ratón quimera generado mediante el uso de células iPS y su ratón de progenie. En consecuencia, se estudió un método para establecer células iPS sin c-Myc.
Además, se determinó si las células iPS se pueden establecer mediante el uso de genes familiares de cuatro genes de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Para este fin, se usaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que contienen un transgén de proteína verde fluorescente (GFP) -IRES-Puror dirigido por elementos reguladores del gen Nanog (Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007). Nanog se expresa específicamente en células madre embrionarias de ratón y embriones de preimplantación (Chambers et al., Cell, 113, págs.643-655, 2003; Mitsui et al., Cell, 113, págs.631-642, 2003) y puede servir como marcador de selección durante la inducción de células iPS. Cuando se induce la reprogramación, se expresa GFP, y esto se convierte en un índice de ser una célula iPS. Se muestra que las células iPS seleccionadas por Nanog son indistinguibles de las células madre embrionarias y dan lugar a ratones quimeras competentes en la línea germinal (Wernig et al., Nature, 448, págs.318-324, 2007; Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007; Maherali et al., Cell Stem Cell, 1, págs.55-70, 2007).
Oct3/4 pertenece a la familia Oct de factores de transcripción, que contienen el dominio POU (Ryan et al., Genes Dev 11: 1207-25, 1997). Un homólogo que es más cercano a Oct3/4 es Oct1 y Oct6. Oct3/4, Oct1 u Oct6 junto con los 3 genes restantes se introdujeron en el Nanog reportero MEF con un retrovirus. Si se utilizaba Oct3/4, se observaron muchas colonias positivas para GFP (Fig.23a).
Sox2 pertenece a los factores de transcripción Sox (HMG box asociada a SRY), que se caracteriza por la presencia de un dominio de grupo de alta movilidad (HMG) (Schepers et al., Dev. Cell, 3, págs.167-170, 2002). Se probaron Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17 y Sox18 y, cuando se usó Sox1, se obtuvieron colonias positivas para GFP. Además, si se utilizan Sox3, Sox15 y Sox18, se obtuvieron algunas colonias positivas para GFP (Fig.23a).
Klf4 pertenece al factor tipo Kruppel (Klfs), proteína de dedo de zinc que contiene secuencias de aminoácidos similares a las del regulador de patrón embrionario de drosophila Kruppel (Dang et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 32, págs.1103-1121, 2000). Se probaron Klfl, Klf2 y Klf5 y, si se utiliza Klf2, se obtuvieron colonias que expresan GFP (Fig.23a). Además, si se utilizan Klfl y Klf5, se podrían inducir células iPS.
c-Myc tiene dos genes relacionados (N-Myc y L-Myc) (Adhikary et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, págs.635-645, 2005). Al usar N-Myc o L-Myc, surgieron colonias positivas para GFP (Fig.23a). Por lo tanto, se demostró que las células iPS pueden ser inducidas por genes familiares de cuatro genes.
Si las células iPS se pueden inducir a partir de MEF en el que pgeo se inactiva en el locus del gen Fbx15 (Tokuzawa et al., Mol. Cell Biol., 23, págs.2699-2708, 2003) para los genes familiares, y se obtuvieron resultados similares a los obtenidos por selección basada en Nanog. Es decir, Sox2 podría ser reemplazado por Sox1 o Sox3, Klf4 podría ser reemplazado por Klf2, y c-Myc podría ser reemplazado por N-Myc y L-Myc. La célula generada por los genes de la familia pudo proliferar y mostró una morfología indistinguible de la de las células ES y causó teratomas en ratones desnudos (Fig.24). Por lo tanto, se demostró que estos genes de la familia pueden inducir células iPS tanto de MEF reporteros de Nanog como de MEF reporteros de Fbx15.
Se obtuvieron algunas colonias positivas para GFP de tipo células ES del MEF reportero de Nanog sin usar c-Myc (Fig.23a). Aunque Okita et al. documentó anteriormente que las colonias positivas para GFP no se obtienen sin c-Myc (Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007), una diferencia entre el método documentado en esta publicación y el método mencionado anteriormente es el momento de la selección del fármaco. En el método descrito en la publicación, la selección de puromicina se inició 7 días después de la introducción del gen, pero la selección de fármacos se inició el 14° día en este método. Cualquiera de los cuatro genes de Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc o tres genes desprovistos de c-Myc se introdujeron en los MEF reporteros de Nanog, y la selección de puromicina se inició 7 días, 14 días o 21 días después de la introducción del gen (Fig.23b). Cuando se usaron cuatro genes, se observaron colonias positivas para GFP en todas las condiciones y, cuando se retrasó la selección de puromicina, el número de colonias aumentó notablemente. En el caso de uso sin c-Myc, cuando la selección se inició 7 días después de la introducción del gen, no se observaron colonias positivas para GFP, pero cuando la selección se inició 14 o 21 días después de la introducción del gen, surgieron colonias positivas para GFP. El número de colonias fue menor en el caso de usar tres genes que en el caso de usar cuatro genes, en cada condición. Células iPS seleccionadas por Nanog generadas mediante el uso de tres genes (Oct3/4, Sox2, Klf4) sin los genes Myc marcadores de células ES expresados por el retrovirus similares a los de las células ES (Fig.25) y, dio lugar a ratones quimera adultos cuando se trasplantaron a blastocistos (Tabla 9).
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Otra diferencia es que, cuando se inducen células iPS utilizando tres genes sin utilizar c-Myc, se observaron menos colonias negativas para GFP y células de fondo más bajas (Fig.23c). Por lo tanto, el método para inducir células iPS sin usar c-Myc tiene la ventaja de que la inducción es lenta y la eficacia se reduce en comparación con la inducción de células iPS junto con c-Myc, pero se mejora la especificidad de la inducción de células iPS.
Se pudieron producir algunas células iPS a partir de MEF en las que pgeo se inactivó en el locus Fbx15 (Tokuzawa et al., Mol. Cell Biol., 23, págs.2699-2708, 2003) sin utilizar c-Myc (Fig.26A). Takahashi et al. documentó anteriormente que las células iPS no se podrían obtener sin c-Myc (Takahashi et al., Cell, 126, págs.663-676, 2006) y, en el método documentado en esta publicación y el método antes mencionado, la selección de G418 se inicia al mismo tiempo, es decir, 3 días después de la introducción del gen. Sin embargo, las colonias se seleccionan entre 14 y 21 días después de la introducción del gen en el método documentado en la publicación, mientras que la selección de colonias se realiza aproximadamente 30 días después en este experimento. Además, en este experimento, los retrovirus que contienen cuatro genes (o tres genes) se prepararon por separado utilizando células PLAT-E independientes separadas (Morita et al., Gene Ther., 7, págs.1063-1066, 2000). Mediante esta operación, se mejoró una eficacia de transfección de retrovirus y se observó un aumento notable en el número de colonias de células iPS en comparación con el método ya descrito de preparar los cuatro genes en una sola célula PLAT-E.
Un nivel de expresión de genes marcadores de células ES es menor en las células iPS seleccionadas por Fbx15 al introducir cuatro genes en comparación con las células ES (Takahashi et al., Cell, 126, págs.663, -676-2006). Esta célula iPS no pudo producir a un ratón quimera adulto cuando se microinyecta en blastocistos, pero las células iPS preparadas sin usar c-Myc expresaron genes marcadores de células ES a un nivel comparable con un nivel de células ES también cuando se realizó la selección con Fbx15 (Fig.26B). Además, se obtuvieron ratones quimera adultos a una tasa de contribución de células iPS alta a partir de células iPS preparadas sin usar c-Myc (Fig.27, Tabla 9). No se observó un aumento en la tasa de aparición de tumorigénesis en estos ratones quimera. Es decir, en ratones quimera obtenidos de células iPS establecidas con cuatro genes, 6 de 37 ratones quimera murieron de tumor dentro de los 100 días posteriores al nacimiento, pero en ratones quimera obtenidos de células iPS establecidas con tres genes sin c-Myc, dado que las 26 quimeras sobrevivieron dentro de un período de observación (menos de 4 meses), quedó claro que el riesgo de tumorigénesis se reduce sin usar c-Myc.
Se investigó si las células iPS se pueden aislar eficazmente sin usar c-Myc y sin selección de fármacos. Se introdujeron cuatro genes (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres genes sin usar c-Myc en fibroblastos adultos de la punta de la cola (TTF) que contenían el indicador Nanog, y se continuó el cultivo sin selección de puromicina. Para visualizar las células con genes introducidos en ellas, se introdujeron retrovirus DsRed junto con cuatro genes o tres genes. 30 días después de la introducción retrovírica, las placas con células introducidas con los cuatro genes se cubrieron con muchas colonias negativas de GFP y células de fondo (Fig.28A, Tabla 10: Reportero de Nanog-GFP TTF sin selección de fármaco). Un valor numérico del paréntesis en la Tabla indica el número de colonias o clones positivos para GFP. Una proporción de retrovirus (Oct3/4, Sox2, Klf4, (c-Myc) y DsRed) fue 1:1:1: (1):4 en el n.° 256 y 1:1:1: (1): 4 en los n.° 272 y 309. En el n.°220, no se introdujo DsRed.
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Usando microscopio fluorescente, se observaron colonias positivas para GFP entre las colonias (4, 132, 424 colonias en tres experimentos independientes). Las colonias positivas para GFP fueron negativas para DsRed, que fue similar al silenciamiento retrovírico observado en células iPS seleccionadas con Nanog (Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007). Cuando se usaron tres genes sin usar c-Myc, las colonias se observaron como colonias que tenían pocas células de fondo entre las colonias (7, 21 y 43 en tres experimentos independientes). Aproximadamente la mitad de estas colonias expresaron GFP de manera irregular. DsRed se detectó en solo una pequeña porción de algunas colonias, lo que indica que fue silenciado en gran medida. No se observó superposición entre GFP y DsRed. La mayoría de estas colonias eran expandibles y consisten en células iPS, que se volvieron positivas para GFP y negativas para DsRed en el número de pasaje 2. Por lo tanto, se demostró que la generación específica de células iPS podría mejorarse en el caso de sin selección de fármacos y sin utilizar c-Myc. Nanog-GFP se activa y los retrovirus se silencian en las células iPS.
Se probó la preparación de células iPS a partir de TTF adultos que no tenían marcadores de selección pero que tenían el transgén DsRed promovido por un promotor constitutivamente activo (Vintersten et al., Genesis, 40, págs.241-246, 2004). Los cuatro genes (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres genes sin usar c-Myc se introdujeron en las células. Además, se introdujo un retrovirus con GFP para controlar el silenciamiento. Después de 30 días sin selección de medicamentos, alrededor de 1000 colonias emergieron a partir de 0,5x105 células introducidas con los cuatro genes. La mayoría de ellas eran positivas para GFP, lo que indica que el silenciamiento retrovírico no tuvo lugar en estas células. Por otro lado, a partir de 3,5x105 células con tres genes sin utilizar c-Myc introducidos en ellas, surgieron 16 colonias (Fig.28B). La mayoría de estas colonias no expresaron GFP y las colonias restantes expresaron GFP ligeramente. Todas estas colonias podrían proliferar y, incluso en un pasaje número 2, mostraron la morfología de una célula iPS (morfología de tipo célula ES). Además, se demostró que todas estas células son negativas para GFP y se genera silenciamiento retrovírico. Por RT-PCR, se demostró que en estas células, los genes marcadores de células ES se expresan a un nivel comparable al de las células ES (Fig.28C). Además, en células iPS preparadas utilizando los tres genes, el silenciamiento retrovírico de Klf4 y la ausencia del transgén c-Myc fueron confirmados por RT-PCR y, cuando estas células iPS fueron trasplantadas a blastocistos, se generó un ratón quimera (Fig.28D y Tabla 9). A partir de los resultados anteriores, se demostró que se pueden obtener células iPS que tienen propiedades excelentes sin usar c-Myc, y que se pueden preparar células iPS de manera eficaz a partir de TTF adulto sin usar la selección de fármacos.
A continuación, los retrovirus para Oct3/4, Sox2 y Klf4 se introdujeron en fibroblastos derivados de prepucio (BJ) de recién nacidos humanos (clon 246H) o fibroblastos derivados de piel de adultos humanos HDF (253g ). Después de 30 días, surgieron algunas colonias de células iPS humanas. Estas células mostraban una morfología de colonia similar a la de células ES humanas y podían proliferar (Fig.29A). Cuando se introdujeron tres genes sin usar c-Myc (253G), o cuando se introdujeron c-Myc además de los tres genes al mismo tiempo (253F), se confirmó que las células iPS humanas que provienen de HDF expresan genes marcadores de células ES (Fig.29B). Además, se confirmó la diferenciación de células iPS humanas inducidas sin usar retrovirus de c-Myc a través de cuerpos embrioides (Fig.30).
Los materiales y métodos experimentales del Ejemplo 19 son los siguientes.
1. Construcción de plásmido
Las regiones codificantes de los genes de la familia se amplificaron mediante RT-PCR con los cebadores enumerados en la Tabla 11 (SEQ ID NO.: 127 a 152 del Listado de Secuencias), se subclonaron en pDONR201 o pENTR-D-TOPO (Invitrogen), y se recombinaron en pMXs-gw mediante la reacción LR (Invitrogen).
________ ________________ [Tabla 111_________________________
Genes Secuencias
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2. Transducción de retrovirus
Los vectores de retrovirus basados en pMX se transfectaron en células PLAT-E (Morita et al., Gene Ther., 7, págs.1063-1066, 2000) utilizando un reactivo Fugene6 (Roche) de acuerdo con las instrucciones de un fabricante. Después de 24 horas, se reemplazó el medio, además, después de 24 horas, se tomó el sobrenadante que contenía el virus y se realizó la introducción del gen mediante infección por retrovirus. En un protocolo "mixto", la mezcla de plásmidos para los cuatro genes se transfectó en una sola placa de células PLAT-E. En un método "separado", cada plásmido se transfectó en placas separadas de células PLAT-E. El sobrenadante que contiene el virus se mezcló antes de la introducción del gen. En el método separado, se observó una eficacia de introducción de genes significativamente alta.
3. Inducción de células iPS con selección de fármacos.
La inducción de células iPS se realizó mediante la modificación del método ya documentado (Takahashi et al., Cell., 126, págs.663-676, 2006; Okita et al., Nature, 448, págs.313-17, 2007). Las MEF, que contenían el reportero Nanog-GFP-IRES-Puror o el reportero Fbx15-pgeo, o ambos, se sembraron en una proporción de 1,3x105 células/pocillo (placa de 6 pocillos) y 8,5x105 células/pocillo (placa de 100 mm) en placas de 6 pocillos recolectadas con células alimentadoras SNL y placa de 100 mm, respectivamente, con (McMahon et al., Cell., 62, págs. 1073-1085, 1990). Las células con genes introducidos en ellas se cultivaron con medio de células ES que contenía LIF (Meiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 93, págs. 14041-14046, 1996). Se inició la selección con G418 (300 pg/ml) o puromicina (1,5 pg/ml) como en el método ya documentado. 25 a 30 días después de la introducción del gen, se contó el número de colonias. Se seleccionaron algunas colonias para expansión.
4. Inducción de células iPS sin utilizar la selección de fármacos
Los TTF se aislaron de ratones reporteros de Nanog adultos o ratones transgénicos DsRed adultos (Vintersten et al., Genesis, 40, págs.241-246, 2004). El sobrenadante que contenía retrovirus se preparó en el método separado. Para introducir los cuatro genes, los sobrenadantes de Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2 y DsRed que contienen retrovirus se mezclaron en una proporción de 1:1:1:1:4. Cuando se introdujeron los tres genes, el retrovirus que contiene sobrenadantes de Klf4, Oct3/4, Sox2, simulador (vector vacío) y DsRed se mezcló en una proporción de 1:1:1:1:4. Con el ratón transgénico DsRed, se utilizó el retrovirus con GFP en lugar de DsRed. Para la transfección, los TTF se sembraron en una proporción de 8,0X105 células por placa de 100 mm, que no tenía células alimentadoras. Los TTF se incubaron en el sobrenadante que contenía virus/polibreno durante 24 horas. 4 días después de la introducción del gen, los TTF con tres genes introducidos en ellos se resembraron en una proporción de 3,5X105 células por placa de 100 mm con células alimentadoras SNL y se cultivaron con medio de células ES. Los TTF con cuatro genes introducidos en ellos se volvieron a sembrar en una proporción de 0,5X105 células por placa de 100 mm con células alimentadoras SNL. 30 a 40 días después de la introducción del gen, se contó el número de colonias. Se seleccionaron algunas colonias para expansión.
5. Evaluación de células iPS
La RT-PCR y la formación de teratomas se realizaron de acuerdo con el método ya documentado. Para experimentos de quimera, se inyectaron de 15 a 20 células iPS en blastocistos derivados de BDF1, que luego se trasplantaron al útero de ratonas pseudoembarazadas.
Ejemplo 20: Generación de células iPS humanas a partir de células epiteliales utilizando seis genes.
Se indujeron células iPS usando una combinación de los siguientes genes: Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28 (número de registro del NCBI NM_145833 (ratón) o NM_024674 (humano)), o una combinación desprovista de uno o dos o más genes de la combinación.
Se sembraron 6x106 células 293 FT en placas de Petri de 10 cm y se cultivaron durante la noche, y estas placas de Petri se transfectaron con 3 pg de un vector de lentivirus pLenti6/UbC-Slc7al usando 9 pg de mezcla de empaquetamiento Virapower junto con lipofectoamina 2000 (Invitrogen). Después de 24 horas, el medio fue reemplazado por un medio nuevo. Además, después de 20 horas, se tomó el sobrenadante del cultivo y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 pm (Whatman). El día anterior se prepararon 5x105 células epiteliales. A las placas de Petri de la célula epitelial de la que se extrajo el sobrenadante del cultivo, se les añadió el sobrenadante del cultivo filtrado con 4 pg/ml de polibreno (Nacalai Tesque) y se cultivaron las células durante 24 horas.
Se sembraron 1,0X106 células PLAT-E en placas de Petri de 6 cm y se cultivaron. Al día siguiente, se transfectaron las células con 9,0 pg de un vector de retrovirus basado en pMX que contiene Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28 con 27 pl de un reactivo de transfección Fugene6 (Roche). Después de 24 horas, el medio fue reemplazado por un medio nuevo. Además, al día siguiente, se recogió el sobrenadante de la célula PLAT-E y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa con un tamaño de poro de 0,45 pm (Whatman). 7 días después de la infección por lentivirus, las células epiteliales se resembraron a 3,0X105/placa de 6 cm, y se añadió a la misma el sobrenadante de cultivo mencionado anteriormente que contiene el retrovirus y polibreno.
Los resultados se muestran en la Tabla 12. En la Tabla, "6F" indica 6 genes (Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28), "L" indica Lin28, "N" indica Nanog, "M" indica c-Myc, "O" indica Oct3/4, "S" indica Sox2 y "K" indica Klf4, respectivamente, antes de una letra significa el caso en el que un gen indicado por una letra posterior a se elimina de los seis genes y, por ejemplo, "-L" significa los cinco genes restantes obtenidos al eliminar Lin-28 de seis genes, y "-KS" significa cuatro genes desprovistos de Klf4 y Sox2 de seis genes. Un valor numérico en la Tabla indica el número de colonia, "no de tipo ES" indica un número de colonia que tiene una morfología no de tipo ES, y "tipo ES" indica un número de colonia que tiene una morfología celular de tipo ES.
T l 12
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La Tabla 12 muestra los resultados de dos experimentos. Los resultados del primer experimento muestran el número de colonias de las células inducidas mediante la introducción de una combinación de cada gen el 23° día o el 29° día después de la introducción del gen, y los resultados del segundo experimento (día 23 de la columna de la derecha) indican el número de colonia en el caso de "6F", "-KM" y "-NL". Dado que el número de colonias de células sin la introducción de Lin-28 como "-L" era menor que el número de colonias cuando se introdujo Lin-28, se demostró que Lin28 es responsable de un papel importante para mejorar la eficacia de generación de células iPS.
Además, la inducción de células iPS se realizó utilizando seis genes (Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28) y dos combinaciones diferentes de cuatro genes (Klf4, c-Myc, Oct3/4, y Sox2 representado por Y4F en la Fig.31, y Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28 representados por T4F en la Fig.31). T4F es la misma combinación que se desvela en Yu et al., Science, 318, págs.1917-1920, 2007. En la Fig.31, "tipo ES" indica el número de colonias morfológicamente similares al de colonias de células ES, y "total" indica un total del número de colonias de tipo ES y el número de colonias no de tipo ES. Exp n.° 1, Exp n.° 2, Exp n.° 3 y Exp n.° 4 indican resultados de experimentos separados. En estos experimentos, se obtuvieron colonias de células iPS que tenían una morfología similar a las de las colonias de células de tipo ES utilizando seis genes y una combinación de cuatro genes de Y4F. Sin embargo, en una combinación de T4F, no se reconoció la formación de colonias que tuvieran una morfología similar a la de las colonias de células de tipo ES.
Ejemplo 21: Producción eficaz de células iPS usando Sall4
Se realizó un experimento utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y fibroblastos dérmicos adultos humanos (HDF adulto) y, como resultado, se descubrió que la inducción de células iPS mediante el uso de tres genes (Klf4, Oct3/4 y Sox2) aumenta la eficacia de generación de células iPS cuando se añade Sall4 a esta combinación, es decir, cuando se utilizan Klf4, Oct3/4, Sox2 y Sall4 (Fig. 32 y 33). Cuando se añadió Sall4 a los cuatro genes (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc), se observaron más colonias de células iPS. De estos experimentos, se demostró que la eficacia de la inducción de células iPS se puede mejorar añadiendo Sall4 a los factores de reprogramación nuclear.
Ejemplo 22: Efecto de promover la inducción de células iPS de ratón Sall4 y/o ratón Sall1
Según el método ya documentado (Cell, 131, págs.861-872, 2007), y usando un retrovirus, cuatro genes de origen humano (Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres genes (Y3F: Oct3/4, Sox2 y Klf4), y el gen Sall4 (mSall4) del ratón o el gen Salll (mSalll) del ratón se introdujeron en fibroblastos dérmicos adultos (HDF adulto), que se hizo para expresar el gen Slc7a del receptor ecotrópico de ratón con un lentivirus.
El 6° día después de la introducción, una vez se recogió HDF y, posteriormente, e1HDF ajustado a 5x105 se sembró en 1,5x106 células STO tratadas con mitomicina C. Después del día siguiente, las células se cultivaron en un medio para cultivar células ES de primates (ReproCELL) que contenía 4 ng/ml de bFGF humano recombinante (WAKO). El 32° día y el 40° día después de la infección, los resultados del recuento del número de colonias de tipo células ES se muestran en la Fig.34. El 32° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujo Y3F Simulador (vector vacío) era 1, y el número de colonias cuando se introdujo Y4F Simulador era 37, mientras que cuando Y3F o Y4F y Sall4 se introdujeron al mismo tiempo, se reconocieron 22 colonias en un grupo introducido con Y3F mSall4 y 73 colonias en un grupo introducido con Y4F mSall4. Cuando mSalll se introdujo en Y3F o Y4F, se reconocieron 2 colonias en un grupo introducido con Y3F mSalll y 43 colonias en un grupo introducido con Y4F mSalll, y una diferencia en el número de colonias no fue significativa en comparación con el caso en el que solo se introdujo Y3F o Y4F. Además, cuando mSall4 y mSalll se introdujeron en Y3F o Y4F al mismo tiempo, el número de colonias era 34 en un grupo introducido en Y3F mSall4 mSalll, y 79 en un grupo introducido en Y4F mSall4 mSalll.
En el 40° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujo Y3F Simulador era 8, y el número de colonias cuando se introdujo Y4F Simulador era 57, mientras que cuando Y3F o Y4F y mSall4 se introdujeron al mismo tiempo, se reconocieron 62 colonias en un grupo introducido en Y3F mSall4, y se reconocieron 167 colonias en un grupo introducido en Y4F mSall4. Cuando mSalll se introdujo en Y3F o Y4F, se reconocieron 14 colonias en un grupo introducido en Y3F mSalll, y se reconocieron 103 colonias en un grupo introducido en Y4F mSalll. Además, cuando mSall4 y mSall1 se introdujeron en Y3F o Y4F al mismo tiempo, el número de colonias era 98 en un grupo introducido en y 3f + mSall4 mSall1, y 193 en un grupo introducido en Y4F mSall4 mSall1. A partir de los resultados anteriores, se demostró que al introducir mSall4 en Y3F, o al introducir mSall4 y mSall1 al mismo tiempo, las células iPS humanas se pueden introducir con una eficacia de 20 a 100 veces mayor. Además, se demostró que al introducir mSall4 en Y4F, o al introducir mSall4 y mSall1 al mismo tiempo, Las células iPS humanas se pueden introducir con una eficacia de 2 a 4 veces.
Ejemplo 23: Efecto de promover la inducción de células iPS de ratón Sall4 y/o ratón Salll (2)
Según el método ya documentado (Cell, 131, págs.861-872, 2007), ratón Sall4 (mSall4) o ratón Sall1 (mSall1) o ambos junto con cuatro genes de origen humano (T4F: Oct3/4, Sox2, Nanog y Lin28) o tres genes (T3F: Oct3/4, Sox2 y Nanog) se introdujeron en fibroblastos dérmicos adultos humanos (HDFa-Slc7a1) que se hizo para expresar el receptor ecotrópico de ratón Slc7a con un lentivirus.
El 6° día después de la introducción, se recogió HDF-Slc7a1 una vez y, posteriormente, los HDF-Slc7a1 ajustados a 5x105 se sembraron en 1,5x106 células STO tratadas con mitomicina C. Además, después de cultivar durante 7 días, las células se cultivaron en un medio para cultivar células ES de primates (ReproCELL) que contenía 4 ng/ml de bFGF humano recombinante (WAKO). El 32° día y el 40° día después de la infección, los resultados del recuento del número de colonias de tipo células ES se muestran en la Fig.35. El 32° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujeron T3F Simulador y T4F Simulador era 0, mientras que cuando T3F o T4F y mSall4 se introdujeron al mismo tiempo, se detectaron dos colonias en un grupo introducido con T3F mSall4. En un grupo inducido con T4F mSall4, no se pudo confirmar una colonia de tipo células ES humanas.
Cuando se introdujeron T3F o T4F y mSall1 al mismo tiempo, se reconocieron 3 colonias en un grupo introducido en T3F mSall1, y se reconocieron 6 colonias en un grupo introducido en T4F mSall1. Además, cuando se introdujeron mSall4 y mSall1 junto con T3F o T4F al mismo tiempo, se reconocieron 3 colonias en un grupo introducido con T3F mSall4 mSall1. En un grupo introducido con T4F mSall4 mSall1, no se pudieron confirmar colonias humanas de tipo ES. En el 40° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujeron T3F Simulador y T4F Simulador era 0, mientras que cuando T3F o T4F y mSall4 se introdujeron al mismo tiempo, se reconocieron 6 colonias en un grupo introducido en T3F mSall4, y se reconocieron 2 colonias en un grupo introducido en T4F mSall4.
Cuando se introdujeron T3F o T4F y mSall1 al mismo tiempo, se reconocieron 13 colonias en un grupo introducido con T3F mSall1, y se reconocieron 22 colonias en un grupo introducido con T4F mSall1. Además, cuando mSall4 y mSall1 se introdujeron en T3F o T4F al mismo tiempo, se reconocieron 17 colonias en un grupo introducido con T3F mSall4 mSall1, y se reconocieron 11 colonias en un grupo introducido con T4F mSall4 mSall1. En la generación de células iPS mediante la introducción de T3F y T4F, se reconoció el efecto promotor en la formación de colonias de células iPS añadiendo mSall4, y mSall1 indujo de manera más eficaz la formación de colonias de células iPS humanas. Además, se vio que la formación de colonias de células iPS humanas se puede promover más introduciendo tanto mSall1 como mSall4 junto con T3F o T4F.
Ejemplo 24: Efecto de la promoción de la inducción de células iPS de Sall4 humano
Según el método descrito en Cell, 131, págs.861-872, 2007, se prepararon fibroblastos dérmicos humanos adultos que se hicieron para expresar el receptor ecotrópico de ratón Slc7a1 con un lentivirus (HDF-Slc7a1) y, al día siguiente, cuatro genes de origen humano (Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres genes (Y3F: Oct3/4, Sox2 y Klf4) y Sall4 humano (hSall4) se introdujeron con un retrovirus. El 6° día después de la introducción, se recogió HDF una vez y, posteriormente, se sembró HDF ajustado a 5x105 en 1,5x10 células STO tratadas con mitomicina C. Después del día siguiente, las células se cultivaron en un medio para cultivar células ES de primates (ReproCELL) que contenía 4 ng/ml de bFGF humano recombinante (WAKO). El 32° día y el 40° día después de la infección, los resultados del recuento del número de colonias de tipo células ES se muestran en la Fig.36.
El 32° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujo Y3F Simulador era 1, y el número de colonias cuando se introdujo Y4F Simulador era 34, mientras que cuando Y3F o Y4F y hSall4 se introdujeron al mismo tiempo, Se observaron 8 colonias en un grupo introducido con Y3F hSall4, y se reconocieron 52 colonias en un grupo introducido con Y4F hSall4. En el 40° día después de la infección, el número de colonias cuando se introdujo Y3F Simulador era 5, y el número de colonias cuando se introdujo Y4F Simulador era 52, mientras que cuando Y3F, Y4F y hSall4 se introdujeron al mismo tiempo, se reconocieron 32 colonias en un grupo introducido con Y3F Sall4 y 137 colonias en un grupo introducido con Y4F hSall4. Como resultado, se demostró que se puede obtener una colonia de células iPS humanas con una eficacia de 6 a 8 veces al introducir hSall4 en Y3F al mismo tiempo, y que se puede obtener una colonia de células iPS humanas con una eficacia de 1,5 a 2,5 veces al introducir Y4F y hSall4 al mismo tiempo.
Ejemplo 25: Efecto de L-Myc
(A) Determinación de la reprogramación nuclear mediante la introducción de los cuatro genes (Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc)
(1) Efecto sobre la inducción de células iPS humanas
Se prepararon fibroblastos adultos derivados de la piel que se hicieron para expresar el gen Slc7a1 del receptor del virus ecotrópico de ratón (aHDF-Slc7a1) de acuerdo con el método ya documentado (Cell, 131, págs.861-872, 2007). Se sembraron aHDF-Slc7a1 en una proporción de 3x105/placa de 60 mm y, al día siguiente, cuatro genes de origen humano (un total de 4 genes de L-Mycl (en adelante, simplemente denominado "L-Myc"), c-Myc, o gen N-Myc además de tres genes de Oct3/4, Klf4 y Sox2) se introdujeron con un retrovirus según el método descrito en la publicación mencionada anteriormente. 6 días después de la infección por el virus, se recolectaron células y se resembraron en células MSTO (5x105/placa de 100 mm). A partir del día siguiente, las células se cultivaron en un medio de células ES de primates (ReproCELL) suplementado con 4 ng/ml de bFGF humano recombinante (WAKO). Se contó el número de colonias de células iPS humanas que surgieron en el 37° día después de la infección por retrovirus. En la Tabla 13 y la Figura 37 se muestra un resumen de cuatro veces los resultados experimentales (la Figura 37 es un gráfico de la Tabla 13, y un valor numérico en el gráfico indica una proporción de las colonias de células iPS en relación con el número total de colonias). Al usar L-Myc, la eficacia de la inducción de colonias de células iPS se volvió 6 veces mayor en comparación con c-Myc, y la proporción del número de colonias de células iPS en relación con el número de colonias totales también aumentó aproximadamente 2 veces en el caso de usar L-Myc en comparación con el de c-Myc. Además, cuando se utilizó N-Myc, se reconoció un aumento en el número de colonias de células iPS en comparación con el caso de c-Myc. En la inducción de células iPS derivadas de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), se documentó que no existe diferencia entre el caso de usar c-Myc y el caso de usar L-Myc (Nature Biotech., 26, págs.101-106, 2008), pero quedó claro que cuando se usa una célula humana, la eficacia de la inducción de células iPS se mejora más notablemente con el uso de L-Myc que con el uso de c-Myc.
T l 11
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(2) Inducción de diferenciación in vitro
Las células iPS humanas (32R2, 32R6) establecidas mediante la introducción de los cuatro genes de Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc se sembraron en una placa de baja unión y se formaron cuerpos embrioides (EB) (placa de 100 mm) de acuerdo con el método ya documentado (Cell, 131, págs.861-872, 2007). Después del cultivo durante 2 semanas, la tinción se realizó usando cada anticuerpo para a-fetoproteína (R&D Systems) que es un marcador de diferenciación de una célula del endodermo, a-actina del músculo liso (Wako), que es un marcador de diferenciación de una célula del mesodermo, y tubulina pIII (Chemicon), que es un marcador de diferenciación de una célula del ectodermo. Los resultados se muestran en la Fig.38. Por la tinción, se confirmó la expresión de cada marcador y se confirmó que la célula iPS humana resultante tenía la capacidad de diferenciarse en tres células de la capa dérmica. (3) Capacidad de formación de teratoma
Las células iPS humanas (32R6) establecidas mediante la introducción de los cuatro genes de Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc se cultivaron en un medio para cultivar células ES de primates (ReproCeLL) que contenía bFGF humano recombinante (4 ng/ml) e inhibidor de la quinasa Rho Y-27632 (10 pM). Tras 1 hora, las células se recolectaron mediante tratamiento con colagenasa IV, y las células se recuperaron mediante centrifugación para suspenderlas en DMEM/F12 que contenía Y-27632 (10 pM). Se inyectó 1/4 de cantidad de células confluentes (placa de 100 mm) en los testículos de un ratón SCID. Después de 2 a 3 meses, el tumor se cortó y se fijó con PBS (-) que contenía formaldehído al 4 %. Se cortó en láminas un tejido embebido en parafina y se tiñó con hematoxilinosina. Este resultado se muestra en la Fig.39. Dado que el tumor está construido histológicamente a partir de una pluralidad de tipos de células y tejido nervioso, tejido similar al tracto intestinal, tejido cartilaginoso, tejido capilar, se reconocieron células grasas y tejido pigmentario, se certificó la pluripotencia de las células iPS.
(4) Influencia del ratón quimera en la tumorigénesis
Los MEF se aislaron (MEF-Ng) de ratones que tenían un reportero de Nanog, que se preparó mediante la incorporación de EGFP y el gen resistente a puromicina en el locus Nanog (Nature, 448, págs.313-317, 2007). De manera similar, Se aisló MEF (MEF-Fbx) de un ratón que tenía el indicador Fbx15, que se preparó incorporando el gen p-geo en el locus Fbx15 (Cell, 126, págs.663, -676-2006). Cuatro genes (Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc) se introdujeron en estos MEF con un retrovirus y las células iPS se establecieron seleccionando con puromicina con respecto a MEF-Ng, y las células iPS se establecieron seleccionando con G418 con respecto a MEF-Fbx (denominado Nanog-iPS y Fbx-iPS, respectivamente). Al trasplantar estas células iPS en blastocistos de ratón C57BL/6, se generaron ratones quimera. Se estudió la tumorigénesis en ratones quimera y ratones F1 y, como resultado, en este momento, los ratones que sobrevivieron durante los días siguientes, respectivamente, y no se reconoció la aparición del tumor en ninguno de los ratones vivos.
Ratón quimera Fbx-iPS: 19/19 animales que viven durante 349 días Ratón quimera Nanog-iPS: 15/16 animales que viven durante 363 días F1 Nanog-iPS: 1/1 animal viviendo durante 255 días F1 Nanog-iPS: 3/3 animales que viven durante 181 días F1 Nanog-iPS: 1/1 animal viviendo durante 132 días Ratón quimera Nanog-iPS: 30/30 animales que viven durante 63 días Ratón quimera Nanog-iPS: 12/14 animales viviendo durante 62 días
Cuando se usaron las células iPS reprogramadas por los cuatro genes Oct3/4, Klf4, Sox2 y L-Myc, 6 de 37 ratones quimera murieron de tumor dentro de los 100 días posteriores al nacimiento (Nature Biotech., 26, págs.101-106, 2008), sin embargo, se confirmó una mejora notable en los días de supervivencia utilizando L-Myc en lugar de c-Myc, y se dejó claro que la aparición de tumores se reduce drásticamente.
(B) Determinación de la reprogramación nuclear por la introducción de tres genes (Oct3/4, Klf4, L-Myc)
(1) Presencia o ausencia de formación de colonias de células iPS
El establecimiento de iPS mediante la introducción de los tres genes (Oct3/4, Klf4 y L-Myc) se examinó de acuerdo con el método ya documentado (Nature Biotech., 26, págs.101-106, 2008). El MEF-Ng descrito en (A) (1) a (4) se sembró en una placa de cultivo de 6 pocillos recubierta con gelatina en una proporción de 1,3x105/pocillo y, después de 24 horas, tres genes derivados del ratón (Oct3/4, Klf4 y L-Myc) se introdujeron utilizando un retrovirus. 4 días después de la infección por el virus, las células se recolectaron y se volvieron a sembrar en células MSTO (1,5x105/placa de 6 pocillos). A partir del día siguiente, las células se cultivaron usando un medio para cultivar células ES con LIF añadido al mismo (DMEM (Nacalai-Tesque) con suero fetal bovino al 15 %, L-glutamina 2 mM (Invitrogen), aminoácidos no esenciales 100 pM (Invitrogen), 2-mercaptoetanol 100 pM (Invitrogen), 50 U/ml de penicilina (Invitrogen) y 50 mg/ml de estreptomicina (Invitrogen) añadidos al mismo). El 46° día después de la infección por el virus, se recolectaron colonias positivas para GFP (clon iPS-MEF-Ng-443-3). En la Fig.40 se muestran fotografías de 16 células recogidas. Todas las células eran colonias de células iPS que se mostraban como positivas para GFP.
Con respecto a estos clones derivados de colonias positivas para GPF, se realizaron RT-PCR y PCR genómica para analizar la expresión génica. Los resultados se muestran en la Fig.41. Cualquier clon expresó Nanog, Rex1 y ECAT1, que son genes marcadores de células ES. Además, en todas las colonias de células iPS, los tres genes introducidos (Oct3/4, Klf4 y L-Myc) se incorporaron a los genomas. Por otro lado, en algunos clones no se detectó expresión de ARNm, por lo que se considera que sufren silenciamiento.
(2) Inducción de diferenciación in vitro
Los cuatro clones (iPS-MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12 e iPS-MEF-Ng-443-3-13) establecidos en lo anterior (1) se sembraron en una placa de baja unión (2x106/placa de 6 pocillos) para formar cuerpos embrioides (EB). Después de cultivar en un medio para cultivar una célula ES durante 2 semanas, la tinción se realizó utilizando cada anticuerpo contra a-fetoproteína (R&D Systems) que es un marcador de diferenciación de la célula del endodermo, la inducción de músculo liso a (Dako), que es un marcador de diferenciación de la célula del mesodermo, y la tubulina pIII (Chemicon), que es un marcador de diferenciación de la célula del ectodermo. Los resultados se muestran en la Fig.42. Mediante tinción, se confirmó la expresión de estos marcadores y se confirmó que las células iPS de ratón resultantes tienen la capacidad de diferenciarse en tres células de la capa germinal. (3) Capacidad de formación de teratoma
Los cuatro clones establecidos en el anterior (1) (iPS-MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12 e iPS-MEF-Ng-443-3-13) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos, respectivamente. Después de cuatro semanas, la formación del teratoma se confirmó en todos los ejemplos. Dado que el tumor está construido histológicamente a partir de una pluralidad de células y el tejido nervioso, tejido similar al tracto intestinal, tejido muscular, tejido epidérmico y tejido cartilaginoso se reconocieron (Fig.43), se certificó la pluripotencia de las células iPS.
Ejemplo 26: Efecto de L-Myc y Lin28 en la inducción de células iPS humanas
Los fibroblastos dérmicos adultos, que se hicieron para expresar el gen Slc7a1 del receptor del virus ecotrópico de ratón (aHDF-Slc7a1), se prepararon de acuerdo con el método descrito en el método ya documentado (Cell, 131, págs.861-872, 2007). Se sembraron aHDF-Slc7a1 en una proporción de 3x105/placa de 6o mm y, al día siguiente, se introdujeron los siguientes tres genes, cuatro genes, o cinco genes de origen humano con un retrovirus según el método descrito en la publicación anterior.
Sox2, Oct3/4 y Klf4
Sox2, Oct3/4, Klf4 y c-Myc
Sox2, Oct3/4, Klf4 y L-Myc
Sox2, Oct3/4, Klf4 y Lin28
Sox2, Oct3/4, Klf4, c-Myc y Lin28
Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc y Lin28
6 días después de la infección por el virus, se recolectaron las células y se volvieron a sembrar en células MSTO (5x105/placa de 100 mm). A partir del día siguiente, las células se cultivaron en un medio de células ES de primates (ReproCELL) suplementado con 4 ng/ml de bFGF humano recombinante (Wako) en un medio de cultivo. Después de la infección por retrovirus, se contó el número total de colonias y el número de colonias hiPS que emergieron en el día 37°. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y la Fig.44 (la Fig.44 es un gráfico de la Tabla 14).
T l 141
Figure imgf000039_0001
Al añadir Lin28 a los cuatro genes de Sox2, Oct3/4, Klf4 y L-Myc, el número de colonias de células iPS aumentó notablemente. Este número de colonias de células iPS fue notablemente mayor que el caso en el que se añadió Lin28 a los cuatro genes de Sox2, Oct3/4, Klf4 y c-Myc. Además, Lin28 presentó el efecto sinérgico sobre la acción de c-Myc, y presentó un fuerte efecto sinérgico adicional sobre la acción de L-Myc (Tabla 14). Asimismo, con respecto a la proporción del número de colonias de células iPS en relación con el de colonias totales, se impartió una proporción extremadamente alta (84,7 %) cuando se usaron los cinco genes de Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc y Lin2 8. A partir de los resultados anteriores, quedó claro que, para mejorar la eficacia de la inducción de células iPS humanas, una combinación de los cinco genes de Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc y Lin28 es extremadamente eficaz.
Ejemplo 27: Efecto del gen de la quimera Myc y el gen muíante en la inducción de células iPS humanas Varios genes de quimera (Ms-cL-Myc, Ms-Lc-Myc, Ms-cLc-Myc, Ms-LcL-Myc, Ms-ccL-Myc, Ms-cLL-Myc, Ms-LLc-Myc, Ms-Lcc-Myc) y genes mutantes puntuales Myc (c-MycW135E, c-MycV394D, c-MycL420P, L-MycW96E, L-MycV325D, L-MycL351P) que se muestran en la Fig.45 se construyeron de la siguiente manera: En primer lugar, c-Myc de ratón (Ms-c-Myc) y L-Myc (Ms-L-Myc) se insertaron en pENTR-D-TOPO (Invitrogen), respectivamente, para preparar pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc y pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc. A continuación, basado en la información de secuencia de c-Myc de ratón (N.° de registro del NCBI NM_010849) y L-Myc (N.° de registro del NCBI NM_008506), se prepararon cebadores para introducir la mutación puntual que se muestra en la Fig.45, y se utilizaron para realizar la PCR utilizando pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc y pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc como molde. Después de que se confirmó cada mutación mediante secuenciación, esto se subclonó en pMX de vectores retrovíricos mediante la reacción LR. Con respecto a la quimera Myc que se muestra en la Fig.45, cada fragmento fue amplificado por PCR, la PCR se realizó usando una mezcla como molde dependiendo de cada combinación, y esta se subclonó en pMX de vectores retrovíricos tal como se describió anteriormente.
Cada vector de retrovirus anterior obtenido, y cada vector de retrovirus de Sox2, Oct3/4 y Klf4 usados en el Ejemplo 25 se introdujeron en fibroblastos derivados de la piel de adultos (aHDF-Slc7a1) de la misma manera que en el Ejemplo 25 y, después de la infección por retrovirus, se contó el número total de colonias y colonias hiPS que emergieron en el día 31°. Los resultados se muestran en la Fig.46 y la Tabla 15 (la Fig.46 es un gráfico de la Tabla 15)
[Tabla 15]
[ T a b l a 15 ]
Figure imgf000040_0001
Tanto c-Myc como L-Myc tienen una identidad cercana al 100 % a nivel de aminoácidos en un ser humano y un ratón. Como se muestra en la figura 46 y la Tabla 15, se generaron colonias de células iPS humanas con genes humanos (c-Myc y L-Myc) también cuando se utilizaron genes de ratón (Ms-c-Myc y Ms-L-Myc), se confirmó que c-Myc y L-Myc de ratón tienen sustancialmente las mismas funciones que las de c-Myc y L-Myc humanas.
Como resultado de comparar los resultados en diversos genes de quimera Myc y genes mutantes puntuales con los del tipo silvestre, cuando se utilizaron Ms-cL-Myc y Ms-cLc-Myc, el número de colonias de células iPS aumenta en comparación con el L-Myc de tipo silvestre (L-Myc) y, en particular, cuando se utilizó Ms-cL-Myc, se obtuvieron los mejores resultados. Además, a partir de los resultados de genes mutantes puntuales, también quedó claro que un aminoácido (c-Myc420P y L-MycL351P) en un extremo C-terminal es muy importante tanto en c-Myc como en L-Myc. De los resultados anteriores, se sugirió que una región funcional importante de Myc en el establecimiento de células iPS humanas es una parte que está 1/3 en el extremo N-terminal de c-Myc, la parte central de L-Myc y la parte C-terminal de c/L-Myc.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: gen de la familia Oct, gen de la familia Klf, gen de la familia Sox y L-Myc en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
2. El proceso según la reivindicación 1, que comprende la etapa de, después de la introducción de dichos genes en células somáticas, cultivar las células durante un tiempo suficiente para que las células adquieran pluripotencia y proliferen.
3. El proceso según la reivindicación 1, que comprende la etapa de introducir los siguientes genes: Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc y Lin28 en células somáticas.
4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de transfectar vectores de virus que contienen el gen de la familia Oct, vectores de virus que contienen el gen de la familia Klf y vectores de virus que contienen el gen de la familia Sox en células de empaquetamiento separadas, respectivamente, y cultivar las células para obtener los tres sobrenadantes de cultivo, y la etapa de preparar una mezcla de los tres sobrenadantes de cultivo obtenidos mediante la etapa anterior, y reprogramar las células somáticas usando la mezcla.
5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células madre pluripotentes inducidas se generan sin selección de fármacos.
6. Un proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas, que comprende I)a) la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y b) la etapa de introducir una combinación de los dos genes siguientes: gen de la familia Oct y gen de la familia Sox, y un gen L-Myc, en células somáticas, o una combinación de los siguientes dos genes: gen de la familia Oct y gen de la familia Klf, y un gen L-Myc en células somáticas; o II) a) la etapa de introducir Lin28 en células somáticas; y b) la etapa de introducir una combinación de los tres genes siguientes: gen de la familia Oct, gen de la familia Sox y gen Klf, y al menos uno de los genes seleccionados de los siguientes dos genes: Sall1 y Sall4 en células somáticas.
7. El proceso según la reivindicación 6, que comprende la etapa de introducir una combinación de los siguientes dos genes: Oct3/4 y Sox2 o una combinación de los siguientes dos genes: Oct3/4 y Klf4, y al menos uno de los genes seleccionados de los siguientes tres genes: L-Myc, Sall1 y Sall4 en células somáticas, que comprende además la etapa de introducir Lin28 en células somáticas.
8. El proceso según la reivindicación 6, que comprende la etapa de introducir Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc y Lin28 en células somáticas.
9. El proceso para generar células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas según la reivindicación 1, que comprende la etapa de introducir Nanog en células somáticas.
10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las células somáticas son células somáticas de mamíferos, incluido el ser humano.
11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las células somáticas son células somáticas humanas.
12. Una célula madre pluripotente inducida que se puede obtener mediante el proceso definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Un proceso para producir células somáticas, que comprende una etapa de producir células iPS según un proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y la etapa de inducir la diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas.
14. Un proceso para producir un tejido, un órgano, o un fluido corporal, que es una población de células somáticas que se puede obtener mediante el proceso tal como se define en la reivindicación 13.
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