KR20100075771A - 핵초기화 방법 - Google Patents

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Abstract

Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 체세포로부터 안전한 인공 다능성 줄기세포를 효율적으로 제조하는 방법, 또는 Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자를 조합하거나, 또는 Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자를 조합하여, L-Myc, Sall1, 및 Sall4의 최소한 1종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
인공 다능성 줄기세포, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자

Description

핵초기화 방법{Nuclear Reprogramming Method}
본 발명은 분화된 체세포(somatic cell)를 초기화하여 인공다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
배아 줄기세포(embryonic stem cell, ES 세포)는 사람이나 마우스의 초기 배아로부터 수립된 줄기세포로서, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다능성을 유지한 채 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 이러한 성질을 이용하여, 사람 ES 세포는 파킨슨병, 소아 당뇨병, 백혈병 등 많은 질환에 대한 세포이식요법(cell transplantation therapy)의 자원으로서 기대되고 있다. 그러나, ES 세포의 이식은 장기이식과 마찬가지로, 거절반응을 야기시키는 문제가 있다. 또한, 사람의 배아를 파괴하여 수립되는 ES 세포의 이용에 대해서는, 윤리적 견지에서 반대 의견도 많다.
환자 자신의 분화된 체세포를 이용하여 탈분화(dedifferentiation)를 유도하여, ES 세포에 가까운 다능성(pluripotency)이나 증식능(proliferating ability)을 가지는 세포(본 명세서에서는, 이 세포를 "인공 다능성 줄기세포" 또는 "iPS 세포" 라 하였으나, "유도 다능성 줄기세포", "배아 줄기세포양 세포(embryonic stem cell-like cell)" 또는 "ES양 세포(ES-like cell)"라고도 함)를 수립할 수 있다면, 거절반응이나 윤리적 문제가 없는 이상적인 다능성 세포로서 이용할 수 있는 것으로 기대된다. 최근, 이 iPS 세포를 마우스 및 사람의 체세포로부터 작제할 수 있음이 보고되어, 커다란 반향을 일으키고 있다(참조: 국제특허공개 WO2007/69666; Cell, pp. 663-676, 2006; Cell, 131, pp. 861-872, 2007).
상기 방법은 복제의 특정인자(참조: Cell, 126, pp. 663-676, 2006에서는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 4가지 인자가 이용되고 있음)를 체세포에 도입하여 초기화를 행하는 단계를 포함하며, 인자의 도입에는 레트로바이러스 벡터가 이용되고 있다. 그러나, c-Myc는 암관련 전이인자이며, c-Myc을 포함하는 상기 4가지 인자를 체세포에 도입하여 초기화를 행한 경우에는, 수득한 인공 다능성 줄기세포로부터 분화유도된 세포나 조직이 종양화될 가능성도 부정할 수 없다. 레트로바이러스 벡터를 이용하여 ES 세포에 유전자를 도입하면 유전자가 불활화됨이 알려져 있으며, 레트로바이러스 벡터를 이용하여 작제된 상기 iPS 세포에 있어서도 도입된 유전자가 불활화됨이 확인되고 있으나(참조: 국제특허공개 WO2007/69666의 실시예 7), 도입된 외인성의 c-Myc가 자손의 개체에 있어서도 발현되지 않을 보장은 없다. c-Myc를 이용하지 않고 Oct3/4, Sox2. Lin28, 및 Nanog의 4가지 인자로 핵초기화를 행하는 방법이 톰슨(Thomson) 등에 의해 제안되어 있다(참조: Science, 318, pp.1917-1920, 2007: 국제특허공개 WO2008/118820). 그러나, iPS 세포의 연구개발은 세계적으로 보더라도 여전히 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 4가지 인자 주체 로 진행되고 있는 것이 현 상황이다.
또한, 상기 국제특허공개 WO2007/69666에는 Myc 패밀리 유전자를 이용하지 않고 사이토카인으로 치환할 수 있음이 교시되어 있으며, 상기 공보의 실시예 5에는 c-Myc 대신에 염기성 선유아세포 증식인자(bFGF)를 이용함으로써 핵초기화가 가능해지는 것이 구체적으로 개시되어 있다. 또한, 상기 국제특허공개에는 초기화인자의 후보로서 선택된 24종류의 유전자 중에 Sall4가 포함되는 것이 개시되어 있기는 하지만(표 4의 No.13), Sall4가 핵초기화 활성을 가지는 것은 개시되어 있지 않다. 또한, Myc 패밀리 유전자의 하나인 L-Myc 또는 N-Myc를 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4와 조합함으로써 c-Myc와 동일 정도의 효율로 iPS 세포를 수립할 수 있음이 개시되어 있다(참조: 실시예 6).
특허문헌 1: 국제특허공개 WO 2007/69666
특허문헌 2: 국제특허공개 WO 2008/118820
비특허문헌 1: Cell, 126, pp.663-676, 2006
비특허문헌 2: Cell, 131, pp.861-872, 2007
비특허문헌 3: Science, 318, pp.1917-1920, 2007
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 과제는 안전한 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다. 좀 더 구체적으로, 인공 다능성 줄기세포를 분화유도하여 수득한 세포나 조직에 있어서 종양화의 우려가 없는 안전한 인공 다능성 줄기세포를 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
또한, 본 발명의 다른 과제는 인공 다능성 줄기세포를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 특히 바람직한 과제는 상기 안전한 인공 다능성 줄기세포를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여, 예의 연구를 행한 결과, c-Myc를 이용하지 않고 안전한 인공 다능성 줄기세포를 제조할 수 있음을 알아 내었다.
또한, 본 발명자들은 c-Myc를 이용하지 않고 L-Myc, Sall1, 또는 Sall4를 이용하여 핵초기화를 행함으로써 분화유도하여 수득한 세포나 조직에 있어서 종양화의 염려가 없는 안전한 인공 다능성 줄기세포를 제공할 수 있으며, 이 방법에 의해 극히 효율적으로 안전한 인공 다능성 줄기세포를 제조할 수 있음을 알아 내었다.
본 발명은 상술한 지견에 의거하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법으 로서, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
이러한 방법의 바람직한 실시태양에 의하면, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 체세포에 도입한 후, 이 세포가 다능성을 획득하여 증식하는데 충분한 시간동안 이 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
이러한 방법의 다른 바람직한 실시태양에 의하면, 하기 3종류의 유전자: Oct3/4, Klf4, 및 Sox2를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법; 및 하기 3종류의 유전자: Oct3/4, Klf4, 및 Sox2를 체세포에 도입한 후, 이 세포가 다능성을 획득하여 증식하는데 충분한 시간동안 이 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또한, 이 방법의 또 다른 바람직한 실시태양에 의하면, Oct 패밀리 유전자를 포함하는 바이러스 벡터, Klf 패밀리 유전자를 포함하는 바이러스 벡터, 및 Sox 패밀리 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 각각 다른 패키징 세포에 형질전이시켜 이 세포를 배양함으로써 3종류의 배양 상등액을 수득하는 단계, 및 상기 단계에 의해 수득한 3종류의 배양 상등액의 혼합물을 제조하고, 이 혼합물을 이용하여 체세포의 초기화를 행하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
또한, 이 방법은 다른 바람직한 실시태양에 의해, 약제에 의한 선별을 행하지 않고 체세포의 초기화를 행하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 유전자 도입을 필요에 따라 사이토카인의 부재 또 는 존재하에 행할 수 있으며, 바람직하게는 사이토카인의 부재하에 행할 수 있다. 또한, 상기 배양을 필요에 따라 사이토카인의 부재 또는 존재하에 행할 수 있으며, 바람직하게는 사이토카인의 부재하에 행할 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 인공 다능성 줄기세포는 분화유도 후에 수득한 세포나 조직에 있어서 종양의 발생이 실질적으로 저감 내지 배제되어 있다. 따라서, 본 발명에 의해 분화유도후에 수득한 세포나 조직에 있어서 종양의 발생이 실질적으로 저감 내지 배제된 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자, 바람직하게는 Oct3/4개의 유전자, Klf4개의 유전자 및 Sox2유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 관점에 따르면, 본 발명에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합 또는 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합과, 하기 3종류의 유전자로부터 선택된 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
상기 발명의 바람직한 실시태양에 의하면, 하기 2종류의 유전자: Oct3/4 및 Sox2의 조합 또는 하기의 2종류의 유전자: Oct3/4 및 Klf4의 조합과, 하기 3종류의 유전자로부터 선택된 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다. 상기 유전자이외에도, 하기 유전자: Lin28 및/또는 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 바람직하 며, Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 보다 바람직하다. 상기 방법에 있어서 희망에 따라 c-Myc를 적절히 조합하여 이용하는 것도 가능하다.
상기 발명의 더 바람직한 실시태양에 의하면, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Sox패밀리 유전자, 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 바람직하게는 Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 조합과, 하기 3종류의 유전자로부터 선택되는 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
보다 구체적으로는, 하기 4종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 하기 4종류의 유전자 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 하기 4종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 하기 5종류의 유전자; Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 하기 5종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall4, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 하기 5종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법; 및 하기 6종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4 , Sall1, Sall4 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
L-Myc를 이용하는 경우에는 체세포가 인간체세포인 것이 바람직하다.
상기 어느 것인가의 방법에 있어서, Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 본 발명에 의해 제공되며, 바람직한 실시태양으로서 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 상기 방법이 제공된다.
본 발명에 의해 제공되는 인공 다능성 줄기세포는 분화유도 후에 수득한 세포나 조직에 있어서 종양의 발생이 실질적으로 저감 내지 배제되어 있다. 따라서, 본 발명에 의해 분화유도 후에 수득한 세포나 조직에 있어서 종양 발생이 실질적으로 저감 내지 배제된 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자, 바람직하게는 Oct3/4 및 Sox2와, 하기 3종류의 유전자로부터 선택되는 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명에 있어서, Klf 패밀리 유전자, 예를 들어, Klf4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 바람직하며, 또한, Klf 패밀리 유전자와 함께 또는 Klf 패밀리 유전자 대신에 Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 바람직하다.
또 다른 관점으로부터는, 본 발명에 의해 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 6종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin28, 및 Nanog, 바람직하게는 하기 6종류의 유전자: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이 방법에 있어서 c-Myc 대신에 하기 3종류의 유전자로부터 선택되는 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 이용할 수 있으며, 이 방법도 바람직하다.
상기 각 방법에 있어서, 체세포로의 상기 유전자의 도입을 재조합 벡터에 의 해 행할 수 있으며, 상기 각 방법에 있어서 정의되는 유전자의 조합으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상을 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 체세포에 이 유전자를 도입하는 것이 바람직하다. 벡터로서는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터의 어느 것을 이용해도 좋다.
또한, 상기 각 발명에 있어서 정의되는 유전자의 조합을 포함하는 핵초기화 인자가 본 발명에 의해 제공된다. 상기 조합에 TERT 유전자 및/또는 SV40 Large T antigen 유전자를 추가로 조합하는 것도 바람직하다.
또한, 상기 각 발명에 있어서 정의되는 유전자의 유전자 산물의 조합을 포함하는 핵초기화 인자도 본 발명에 의해 제공되며, 상기 각 발명에 있어서 정의되는 유전자의 유전자 산물의 조합을 포함하는 핵초기화 인자를 체세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다. 바람직한 실시태양으로서, 체세포의 배양물 중에 상기 핵초기화 인자를 첨가하는 단계를 포함하는 상기 방법도 제공된다.
상기 각 발명에 있어서, 체세포가 인간을 포함하는 포유류동물, 바람직한 영장류의 체세포, 보다 바람직하게는 사람의 체세포인 상기 방법; 체세포가 사람의 태아세포 혹은 성인 유래의 체세포인 상기 방법; 체세포가 환자로부터 채취한 체세포인 상기 방법이 제공된다.
다른 관점으로부터는, 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 인공 다능성 줄기세포가 본 발명에 의해 제공된다. 또한, 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 인공 다능성 줄기세포로부터 분화유도된 체세포도 본 발명에 의해 제공된다. 분화유도된 체세 포의 집단인 조직, 장기, 체액 및 개체도 본 발명에 의해 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 줄기세포 요법으로서, 환자로부터 분리 채취한 체세포를 이용하여 상기 방법에 의해 수득한 인공 다능성 줄기세포를 분화유도하여, 수득한 체세포 또는 그 집단인 조직, 장기 혹은 체액을 이 환자에게 이식하는 단계를 포함하는 요법이 제공된다.
또한, 본 발명에 의해, 상기 방법에 의해 수득한 인공 다능성 줄기세포를 분화유도하여 수득한 각종 세포를 이용하여 화합물, 약제, 독물 등의 생리작용이나 독성을 평가하는 방법이 제공된다.
도 1은 성인의 피부 선유아세포("성체 HDF")로부터 유도된 iPS 세포를 알칼리 인산가수분해효소로 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 마우스 레트로바이러스 수용체(Slc7a1)를 렌티바이러스 감염에 의해 발현시킨 성체 HDF(HDFa-Slc7al)에, 좌단에 표시한 유전자를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하였다. "-"는 "Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc"의 4개의 유전자를 도입한 HDFa-Slc7a1 세포의 염색결과를 나타낸다. 사진의 맨 우단 및 우로부터 제 2단째는 유전자 도입으로부터 10일 후에 위상차(phase-contrast)로 관찰한 알칼리 인산가수분해효소 염색한 결과를 나타낸다.
도 2는 신생아 포피유래(preputium-derived) 선유아세포(BJ)로부터 유도된 iPS 세포를 알칼리 인산가수분해효소로 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 마우스 레트로바이러스 수용체(Slc7a1)를 렌티바이러스 감염에 의해 발현시킨 BJ(BJ-Slc7a1)에 대해서 좌단에 표시한 유전자를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하였다. 사진의 우로부터 제 2단째는 유전자 도입으로부터 10일 후에 위상차로 관찰한 알칼리 인산가수분해효소 염색결과를 나타낸다.
도 3은 성체 HDF 유래의 iPS 세포(클론 iPS-HDFaSlc-87E6)의 ABCG-2, SSEA-3, 및 SSEA-4의 발현에 관한 면역염색 분석결과, 및 음성 대조로서의 2차 항체만(마우스 IgG 또는 랫트 IgM)의 염색한 결과를 나타낸 사진이다. 사진은 위상차 이미지 및 로다민 필터를 통한 위상차 이미지(각각 대물 x 10)를 나타낸다.
도 4는 성체 HDF 유래의 iPS 세포(클론 iPS-HDFaSlc-87E3, 4, 및 12) 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 성체 HDF(HDFa)의 ABCG-2, E-cadherin, SSEA-3, 및 SSEA-4의 발현에 대한 면역염색의 결과를 나타낸 사진이다. 사진은 위상차 이미지 및 로다민 필터를 통해 위상차 이미지(각각 대물 x 10)를 나타낸다.
도 5는 성체 HDF 유래의 iPS 세포(클론 iPS-HDFaSlc-87E1 내지 8, 11 및 12), NTERA2 클론 D1 사람의 배아 암세포(NTERA2), 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 성체 HDF(HDF)로부터 단리된 RNA를 기초로 수득한 cDNA에 있어서의 OCT4, Sox2, Nanog, REX1, FGF4, GDF3, DPPA4, DPPA2, ESG1, hTERT, 및 G3PDH의 각 영역 의 PCR 증폭결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 BJ 유래의 iPS 세포(클론 iPS-BJSlc-97G3, G5, H3, H5, E1 내지 10, E11 및 E12), NTERA2 클론 D1 사람의 배아 암세포(human embryonic cancer cell)(NTERA2), 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 BJ(BJ-Slc7a1)로부터 단리된 RNA를 기초로 수득한 cDNA에 있어서의 OCT4, Sox2, Nanog, REX1, FGF4, GDF3, ECAT15-1, ECAT15-2, ESG1, hTERT, 및 G3PDH의 각 영역의 PCR 증폭결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 클론 iPS-HDFaSlc-87E12를 피하주사하여, 5주간 후에 마우스 및 이 마우스로부터 적출된 종양을 나타낸 사진(A), 및 클론 iPS-HDFaSlc-87E3(B), 클론 iPS-HDFaSlc-87E6(C), 및 클론 iPS-HDFaSlc-87E12(D)의 각각을 피하주사한 마우스로부터 적출된 기형종 유래 조직의 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 사람의 iPS 세포의 실험실 조건에서 분화를 나타낸 면역염색의 사진이다. 사람의 iPS양 세포를 HEMA 코팅 플레이트 상에서 7일간 배양하고, 젤라틴으로 코팅한 디쉬 상에서 7일간 배양한 후에 세포를 수집하여 고정액(10% 포르말린함유 PBS)으로 고정하였다. 세포에 항-α-평활근 액틴(a-smooth muscle actin) 항체, 항-βⅢ-튜블린(βⅢ-tublin) 항체, 및 항-α-페토프로테인(α-fetoprotein) 항체를 1차 항체로 반응시키고, 2차 항원을 이용하여 추가로 면역염색하였다.
도 9는 인간 HDF에의 레트로바이러스의 유전자 도입효율을 개선한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다. HDF 또는 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하고 있는 HDF(HDF-Slc7a1)에 GFP cDNA를 포함하는 동종 지향성(ecotropic, Eco) 또는 양생( amphotropic, Ampho) 레트로바이러스를 도입하였다. 상부의 사진은 형광현미경 관찰결과를 나타내며(바는 100μm이다), 하부의 그래프는 흐름 세포측정(flow cytometry) 결과를 나타낸다.
도 10은 성체 HDF로부터 iPS 세포를 유도한 결과를 나타낸 사진이다. A는 iPS 세포 수립의 타임차트(time schedule)를 나타내며, B는 HDF의 세포형태 이미지, C는 비-ES 세포양 콜로니의 통상적 이미지, D는 사람의 ES 세포양 콜로니의 통상적 이미지, E는 수립된 iPS 세포주의 계대수(passage number) 6(클론 201B7)의 세포형태, F는 고배율에서의 iPS 세포의 이미지, G는 사람의 iPS 세포 콜로니의 중심부의 자발적으로 분화된(spontaneously differentiated) 세포 이미지를 각각 나타낸다. H 내지 N은 각각 SSEA-1(H), SSEA-3(I), SSEA-4(J), TRA-1-60(K), TRA-1-81(L), TRA-2-49/6E(M), 및 Nanog(N)의 면역조직 염색에 의한 분석결과를 나타낸다. 핵은 Hoechst 33342(푸른색)로 염색되었다. 각 이미지에 있어서, 바는 200μm(B 내지 E, G), 20μm(F), 및 100μm(H 내지 N)을 나타낸다.
도 11은 사람의 iPS 세포의 공급세포(feeder cell) 의존성을 나타낸 사진이다. A는 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 접종한 iPS 세포의 이미지를 나타내며, B는 메트리겔(matrigel) 코팅된 플레이트 상의 MEF-조정배지(MEF-CCM) 중에서 배양한 iPS 세포의 이미지를, C는 메트리겔 코팅된 플레이트 상의 사람의 ES용 비-조정배지(non-conditioned medium)에서 배양한 iPS 세포의 이미지를 각각 나타낸다.
도 12는 사람의 iPS 세포에 있어서의 사람의 ES 세포 마커 유전자의 발현에 대해서, ES 세포 마커 유전자의 RT-PCR 분석결과를 나타낸 사진이다. RNA를 단리한 세포는 iPS 세포 클론 201B, ES 세포, NTERA2 클론 D1 사람의 배아 암세포(NTERA2), 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 성체 HDF(HDF)이다.
도 13은 사람의 iPS 세포에 있어서의 사람의 ES 세포 마커 유전자의 발현에 대해서, ES 세포 마커 유전자의 웨스턴블롯분석(A) 및 레트로바이러스 도입 유전자의 발현의 정량적 PCR 결과(B)를 나타낸 사진 및 그래프이다. B는 3회의 시험의 평균값을 나타내며, 바는 표준편차를 나타낸다.
도 14는 사람의 iPS 세포에 있어서의 사람의 ES 세포 마커 유전자의 발현에 대해서, Oct3/4, REX1 및 Nanog의 프로모터 영역의 바이설파이트 유전체 서열결정(bisulfite genomic sequencing)의 결과(A) 및 루시퍼라제 분석결과(B)를 나타낸 사진 및 그래프이다. A에서, 흰 원 및 검은 원은 비메틸화(unmethylated) 및 메틸 화(methylated)(CpGs)를 나타낸다. B는 4회의 시험의 평균값을 나타내며, 바는 표준편차를 나타낸다.
도 15는 고수준의 텔로머라제 활성 및 사람의 iPS 세포의 지수함수적 증식(exponential proliferation)을 나타낸 사진이다. A는 열처리에 의해 비활성화된(+) 시료를 음성 대조로서 사용한 TRAP법에 의한 텔로머라제 활성의 검출결과를 나타낸다(IC는 내부 대조(internal control)). B는 iPS 세포의 증식곡선을 나타내며, 4회에 걸친 시험의 평균값 및 표준편차를 나타낸다.
도 16은 사람의 iPS 세포의 유전자 분석결과를 나타낸 사진이다. A는 모든 클론의 염색체 중에 4종류 모두의 레트로바이스러스가 함입(integration)되어 있는 결과를 나타낸 게놈 PCR의 결과이다. B는 c-Myc cDNA 프로브를 이용한 서던블롯(southern blot) 분석결과를 나타낸다. 별표는 내인성(endogeneous) c-Myc 대립유전자(2.7kb)를 나타내며, 화살표는 SNL 공급세포로부터 유래된 마우스 c-Myc 대립유전자(9.8kb)를 나타낸다.
도 17은 사람의 iPS 세포의 배상체(embryoid body)를 통한 분화를 나타낸 사진이다. A는 8일째에 있어서의 iPS 세포의 부유배양(floating culture) 이미지를 나타낸다. B 내지 E는 16일째의 분화된 세포(B), 뉴런양(neuron-like) 세포(C), 상피세포(D), 및 포석양(cobblestone-like) 세포(E)의 이미지를 각각 나타낸다. F 내지 K는 α-페토프로테인(F), 비멘틴(vimentin)(G), α-평활근 액틴(H), 데스민(desmin)(I), βⅢ-튜블린(J), 및 GFAP(K)의 면역조직 화학분석(immunocytochemistry)의 결과를 각각 나타낸다. 바는 200μm(A,B) 및 100μm(C-K)를 나타낸다. F 내지 K에 있어서 핵은 Hoechst 33342(푸른색)로 염색하였다. L은 3종류의 배엽(germ layer)의 각종 분화 마커의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다.
도 18은 사람의 iPS 세포의 방향이 부여된 분화(directed differentiation)를 나타낸 사진이다. A는 PA6 세포상에서 18일간 배양한 후의 분화된 iPS 세포의 위상차 이미지이다. B는 βⅢ-튜블린(붉은색) 및 티로신 히드록실라제(녹색) 항체에 의한 A에 나타낸 세포의 면역조직 화학분석결과를 나타낸다. 핵은 Hoechst 33342(푸른색)로 염색하였다. C는 도파민 작용성 뉴런 마커의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다. D는 심근세포(cardiomyotic cell)로 분화한 iPS 세포의 위상차 이미지이다. E는 심근세포 마커의 RT-PCR 분석결과를 나타낸다. A, B 및 D의 이미지에 있어서, 바는 200μm(A,D) 및 100μm(B)이다.
도 19는 사람의 iPS 세포로부터 유도된 기형종(teratoma)을 나타낸 사진이다. iPS 세포로부터 유도된 기형종 유래 조직의 헤마톡실린-에오신 염색 이미지를 나타낸다(클론 201B7을 사용).
도 20은 성인의 선유아세포양 골막세포(fibroblast-like synoviocyte)(HFLS, 클론 243H1) 및 신생아 포피유래 선유아세포(BJ, 클론 246G1)로부터 수립된 사람의 iPS 세포의 위상차 이미지이다. 각 이미지에 있어서, 바는 200μm를 나타낸다.
도 21은 HFLS 및 BJ로부터 유래된 iPS 세포 중의 ES 세포 마커 유전자의 발현을 나타낸 사진이다.
도 22는 HFLS 및 BJ로부터 수립된 iPS 세포로부터 배상체(embryoid body)를 통해 분화된 세포를 나타낸 사진이다. α-평활근 액틴, βⅢ-튜블린, α-페토프로테인의 발현을 면역염색에 의해 확인하였다.
도 23은 Nanog 리포터 마우스 유래 MEF로부터의 iPS 세포의 유도에 있어서의 패밀리 유전자 및 c-Myc를 제외한 경우의 효과를 나타낸 그래프이다. A는 패밀리 유전자를 이용한 Nanog 선별(Nanog selection)에 의한 MEF로부터의 iPS 세포의 유도 결과를 나타낸다. 그래프는 GFP 양성 콜로니수를 나타낸다. 3회의 독립된 실험결과를 다른 색(흰색, 회색 및 검정색)으로 나타내었다. "4개의 인자(4 factors)"는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 조합을 나타낸다. B는 iPS 세포 유도에 있어서의 퓨로마이신 선별시기의 영향을 나타내고 있으며, 4개의 유전자 또는 c-Myc를 제외한 3개의 유전자 도입의 28일 후에 관찰된 GFP 양성 콜로니를 나타낸다. C는 모든 콜로니에 대한 GFP 양성 콜로니의 백분율에 대한 퓨로마이신 선별 시기의 영향을 나타낸다.
도 24는 Myc, Klf, Sox의 패밀리 단백질을 이용하여 Fbx 15-리포터 마우스 유래 MEF로부터 유도된 iPS 세포로부터 유래된 기형종의 조직상(histological image)을 나타낸 사진이다.
도 25는 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4)를 레트로바이러스에 의해 Nanog-리포터 마우스 유래 MEF에 도입하여 수립한 iPS 세포의 특징을 나타낸 사진이다. ES 세포 마커 유전자 및 4개의 유전자의 발현수준을 나타낸 RT-PCR의 결과를 나타낸다. 특이적인 프라이머 세트를 이용하여, 전체 전사산물, 내재성 유전자로부터의 전사산물(endo), 및 레트로바이러스로부터의 전사산물(Tg)을 4개의 유전자에 대해서 구별하였다.
도 26은 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4)를 레트로바이러스에 의해 Fbx15 리포터 마우스 유래 MEF에 도입하여 수립한 iPS 세포를 유도한 결과, 및 도입한 GFP의 발현결과를 나타낸 사진이다. A는 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4) 도입에 의해 수립한 iPS 세포의 형태를 나타낸다. 사진 아래의 바는 500μm를 나타낸다. B는 ES, MEF 및 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4) 도입에 의해 수립한 iPS 세포에 있어서의 ES 마커 유전자의 RT-PCR에 의한 분석결과를 나타낸다.
도 27은 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4) 도입에 의해 수립한 iPS 세포(클론 142B-6 및 142B-12)로부터 유래된 키메라 마우스를 나타낸 사진이다.
도 28은 약제에 의한 선별없이 iPS 세포를 효율적으로 단리한 결과를 나타낸 사진이다. A는 Nanog-GFP-IRES-Puror 리포터를 가지는 성체 마우스 유래의 TTF로부터 유도한 iPS 세포형태 이미지이다. 세포에 DsRed와 함께 4개의 유전자 또는 c-Myc를 제외한 3가지 유전자의 어느 한가지를 도입하여, 약제에 의한 선별없이 30일간 배양하였다. Nanog 리포터(Nanog-GFP) 및 DsRed 레트로바이러스(Tg-DsRed)의 발현은 형광현미경에 의해 확인하였다. 바는 500μm를 나타낸다. B는 실제로 활성의 프로모터(ACTB, β-액틴 유전자)에 의해 조절되는 DsRed 도입유전자를 포함하는데, Nanog 또는 Fbx15 선택 카세트가 결여된 성체 마우스 유래 TTF로부터 유도된 iPS 세포의 형태 이미지를 나타낸다. 세포는 GFP와 함께 4개의 유전자 또는 c-Myc를 제외한 3개의 유전자의 어느 한가지를 도입하여, 약제에 의한 선별없이 30일간 배양하였다. GFP 레트로바이러스(Tg-GFP)의 발현은 형광현미경에 의해 확인하였다. 바는 500μm를 나타낸다. C는 약제에 의한 선별없이 TTF로부터 유도한 iPS 세포 및 ES 세포에 있어서의 ES마커 유전자의 RT-PCR에 의한 분석결과를 나타낸다. D는 약제에 의한 선별 또는 c-Myc 레트로바이러스를 이용하지 않고, 성체의 TTF로 부터 유도한 iPS 세포로부터 유래된 키메라 마우스 이미지이다.
도 29는 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4) 도입에 의해 사람의 iPS 세포를 유도한 결과를 나타낸 사진이다. A는 수립된 사람의 iPS 세포(클론 253G 및 246H)가 사람의 ES 세포양 형태를 이루는 것을 나타내는 이미지이다. B는 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4) 도입에 의해 수립한 iPS 세포(253G), 또는 c-Myc를 포함하는 4가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) 도입에 의해 수립한 iPS 세포(253F)를 이용하여 수립된 HDF로부터 유래된 사람의 iPS 세포에 있어서의 ES 세포 마커 유전자의 발현결과를 나타낸다.
도 30은 c-Myc 이외의 3가지 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4)를 성인의 선유아세포(HDL;253G) 및 신생아 포피유래 선유아세포(BJ;246G) 도입에 의해 수립된 사람의 iPS 세포로부터 배상체를 통해 분화를 유도시킨 사진이다. α-평활근 액틴, βⅢ-튜블린, α-페토프로테인의 발현을 면역염색에 의해 확인하였다.
도 31은 293FT 세포에 6개의 유전자(Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28), 또는 4개의 유전자의 2가지의 다른 조합(Y4F로 나타낸 Klf4, c-Myc, Oct3/4, 및 Sox2; T4F로 나타낸 Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28)을 도입한 후 확인되는 콜로니의 수를 나태낸 그래프이다. "ES-like"는 ES 세포의 콜로니와 형태적으로 유사한 콜로니수를 나타내며, "total"은 ES양 콜로니와 비-ES양 콜로니의 수의 총수를 나타낸다. Exp#1, Exp#2, Exp#3, 및 Exp#4는 각각 개별로 실험을 행한 결과를 나타낸다. 세로축은 콜로니수를 나타낸다.
도 32는 마우스 배아성 선유아세포(MEF)를 이용하여 행한 실험결과를 나타낸다. A는 실험의 타임차트를 나타낸다. Nanog GFPtg/-Fbx15-/-마우스로부터 수득한 1.0 x 105개의 MEF 세포를, 젤라틴 코팅한 6웰 플레이트에 접종하였다. 다음날 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 Sall4; OSKA) 또는 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 Sox2; OSK)를 MEF에 레트로바이러스를 이용하여 도입하였다. 감염 4일 후에 세포를 마이토마이신 C-처리 STO 세포로 피복한 6웰 플레이트 상에 1:2 또는 1:6의 비율로 재차 접종하였다. 약제에 의한 선별은 14일째 또는 21일째에 개시하였다. 28일째에 GFP 양성세포를 계수하여, 세포를 알칼리 인산가수분해효소(AP) 및 크리스탈 바이올렛(CV)으로 염색하였다. B는 3개의 독립된 실험(#1, 2 및 3)에 있어서의 GFP 양성 콜로니수의 총수를 나타낸다. C는 3개의 독립된 실험(#1, 2 및 3)에 있어서의 GFP 양성 콜로니의 백분율을 나타낸다.
도 33은 성인의 피부유래 선유아세포(성체 HDF)를 이용하여 행한 실험결과를 나타낸다. 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현하는 1.0 x 105개의 성체 HDF세포를 6웰 플레이트에 접종한 다음날, 각종 유전자의 조합을 레트로바이러스에 의해 세포에 도입하였다. 감염 6일 후에 세포를 5.0 x 105개로 조정하여, 이 세포를 1.5 x 105개의 마이토마이신 C-처리 STO 세포로 피복한 100mm 플레이트 상에 재차 접종하였다. 7일 후에 배지를 4ng/ml bFGF를 보충한 영장류용 ES 세포 배지로 교환하였다, 도 33은 감염 30일 후의 콜로니수를 나타낸다.
도 34는 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDF)에 사람 유래의 4개의 유전자(Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc) 또는 3개의 유전자(Y3F: Oct3/4, Sox2, 및 Klf4)와, 마우스 Sall4("mSall4") 혹은 마우스 Sall1("mSall1") 또는 그 양쪽에 대해서 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하고, 감염 후 32일째(좌측의 바) 및 40일째(우측의 바)에 확인된 콜로니의 수를 나타낸 그래프이다. "+Mock"는 Y3F 또는 Y4F 대신에 빈 벡터(empty vector)인 레트로바이러스를 감염시킨 군, "+mSall4"는 Y3F 또는 Y4F와 동시에 Sall4를 도입한 군, "+mSall1"는 Y3F 또는 Y4F와 동시에 mSall1을 도입한 군, "+mSall4+mSall1"는Y3F 또는 Y4F와 동시에 mSall4 및 mSall1을 동시에 도입한 군을 나타낸다. 세로축은 10cm 샬레 상에 확인된 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 나타낸다. 동일 실험을 3회 반복하여 그래프의 바 상에 각 실험의 콜로니수의 총수를 나타내었다.
도 35는 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDF)에 사람 유래의 4개의 유전자(T4F: Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28) 또는 3개의 유전자(T3F: Oct3/4, Sox2, 및 Nanog)와, 마우스 Sall4("mSall4") 혹은 마우스 Sall1("mSall1") 또는 그 양쪽을 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하여, 감염 후 32일째(좌측의 바) 및 40일째(우측의 바)에 확인된 콜로니의 수를 나타낸 그래프이다. "+Mock"은 T3F 또는 T4F 대신에 빈 벡터인 레트로바이러스를 감염시킨 군, "+mSall4"은 T3F 또는 T4F와 동시에 mSall4를 도입한 군, "+mSall1"은 T3F 또는 T4F와 동시에 mSall1을 도입한 군, "+mSall4+mSall1"은 T3F 또는 T4F와 동시에 mSall4 및 mSall1의 양쪽을 동시에 도입한 군을 나타낸다. 세로축은 10cm 샬레 상에 확인된 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 나타낸다. 동일 실험을 2회 반복하여 그래프의 바 상에 각 실험의 콜로니수의 총수를 나타내었다.
도 36은 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDF)에 사람 유래의 4개의 유전자(Y4F) 또는 3개의 유전자(Y3F)와 인간 Sall4(hSall4)를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 도입하여, 감염성 32일째(좌측의 바) 및 40일째(우측의 바)에 확인된 콜로니의 수를 나타낸 그래프이다. "+Mock"은Y3F 또는 Y4F 대신에 빈 벡터인 레트로바이러스를 감염시킨 군, "+hSall4"은 Y3F 또는 Y4F와 동시에 hSall4를 도입한 군을 나타낸다. 세로축은 10cm 샬레 상에 확인된 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 나타낸다. 동일 실험을 2회 또는 3회 반복하여 그래프의 바 상에 각 실험의 콜로니수의 총수를 나타내었다.
도 37은 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2의 3개의 유전자에 c-Myc, L-Myc, 또는 N-Myc 유전자를 더한 합계 4개의 유전자를 렌티바이러스 벡터를 이용하여 마우스 레트로 바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)에 도입하여 수립한 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다. 각 그래프 상의 수치는 콜로니의 총수에 대한 iPS 세포의 콜로니수의 비율을 나타낸다.
도 38은 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc)를 렌티바이러스 벡터를 이용하여 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)에 도입하여 수립한 사람의 iPS 세포(32R2, 32R6)가 삼배엽계(three germ cell line)로의 분화능을 가지는 것을 α-평활근 액틴, α-페토프로테인, 및 βⅢ-튜블린 항체를 이용한 면역염색에 의해 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 39는 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc)를 도입하여 수립한 사람의 iPS 세포(32R6)를 SCID 마우스의 정소(testis) 내에 주사하여 수득한 기형종의 조직염색상(헤마톡실린-에오신 염색)이다. 상단은 좌로부터 신경조직, 장관양(intestinal tract-like) 조직, 및 연골조직의 조직상을 나타낸다. 하단은 좌로부터 모발조직, 지방조직, 및 색소조직의 조직상을 나타낸다.
도 40은 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc)를 레트로바이러스 벡터를 이용하여 Nanog 리포터 마우스 유래 MEF(MEF-Ng)에 도입하여 얻은 GFP 양성 콜로 니(iPS-MEF-Ng-443-3)의 형태를 나타낸 사진이다. 상단은 GFP 양성 콜로니상, 하단은 위상차 이미지이다.
도 41은 도 40에서 나타낸 GFP 양성 콜로니(iPS-MEF-Ng-443-3) 유래의 클론에 대해서 RT-PCR 및 Genomic PCR을 행한 결과를 나타낸 사진이다. "Total"은 내재성 및 레트로바이러스 유래의 유전자 발현을 나타내며, "Tg"는 레트로바이러스 유래의 유전자 발현을 나타내며, "Genome"은 게놈 DNA 중에 삽입된 레트로바이러스 유래의 유전자의 내재를 각 유전자에 특이적인 프라이머로 검출한 결과는 나타낸다. 사진 우측의 숫자는 PCR의 사이클수를 나타낸다. "RF8"은 대조군인 ES 세포, "20D17"은 MEF-Ng에 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, L-Myc, 및 Sox2)를 도입하여 수득한 iPS 세포(Nanog-iPS 세포; Nature, 448, pp.313-317, 2007), "142E-9"는 MEF-Fbx에 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, L-Myc, 및 Sox2)를 도입하여 수득한 iPS 세포(Fbx-iPS)를 나타내며, 이들 세포에 대해서 마찬가지의 실험을 행한 결과를 나타낸다. "Plasmid"는 각 유전자를 포함하는 플라스미드(pMXs-Sox2, pMXs-Oct3/4, pMXs-Klf4, pMXs-c-Myc, 및 pMXs-L-Myc)를 이용한 결과를 나타낸다.
도 42는 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc)를 도입하여 수립한 마우스 iPS 세포(443-3-3, 443-3-6, 443-3-12, 및 443-3-13)가 삼배엽계로의 분화능을 가지는 것을 항 α-평활근 액틴 항체, 항 α-페토프로테인 항체, 및 항 βⅢ-튜블린 항체를 이용한 염색에 의해 확인한 결과를 나타낸 사진이다. RF8은 대조군의 마우 스 ES 세포이다.
도 43은 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc)를 도입하여 수립한 마우스 iPS 세포(443-3-3, 443-3-6, 443-3-12, 및 443-3-13)를 누드 마우스의 피하에 주사하여 수득한 기형종의 조직염색상(헤마톡실린-에오신 염색)이다. 위로부터 신경조직, 장관양 조직, 근육조직, 표피조직 및 연골조직의 조직상을 나타낸다.
도 44는 Oct3/4, Klf4, 및 Sox2의 3개의 유전자에 c-Myc, L-Myc, 및/또는 Lin28 유전자를 렌티바이러스 벡터를 이용하여 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)에 도입하여 수립한 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다. 검정 막대는 모든 콜로니수를 나타내며, 하얀 막대는 iPS 세포 콜로니수를 나타낸다.
도 45는 각종 Myc 키메라 유전자 및 특이 유전자의 구조를 모식적으로 나타낸 그림이다. Ms-c-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 153 및 154로 나타내고, Ms-L-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 155 및 156으로 나타내고, Ms-cL-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 157 및 158로 나타내고, Ms-Lc-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 159 및 160으로 나타내고, Ms-cLc-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 161 및 162로 나타내고, Ms-LcL-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 163 및 164로 나타내고, Ms-ccL-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 165 및 166으로 나타내고, Ms-cLL-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 167 및 168로 나타내고, Ms-LLc-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 169 및 170으로 나타내고, Ms-Lcc-Myc의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 171 및 172로 나타내고, c-MycW135E의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 173 및 174로 나타내고, c-MycV394D의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 175 및 176으로 나타내고, c-MycL420P의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 177 및 178로 나타내고, L-MycW96E의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 179 및 180으로 나타내고, L-MycV325D의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 181 및 182로 나타내고, L-MycL351P의 염기 및 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 183 및 184로 나타낸다.
도 46은 각종 Myc 키메라 유전자 및 변이 유전자를 렌티바이러스 벡터를 이용하여 마우스 레트로바이러스 수용체 Slc7a를 발현한 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)에 도입하여 수립한 사람의 iPS 세포의 콜로니수를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다. 위로부터 iPS 세포 콜로니수, 모든 콜로니수, 및 iPS 세포 콜로니수의 모든 콜로니수에 대한 비율(%)을 각각 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
제 1의 관점으로부터 제공되는 본 발명의 방법은, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법으로서, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 하기 3종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자를 체세포에 도입한 후, 이 세포가 다능성을 획득하여 증식하는데 충분한 시간동안 이 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자에 대해서는, 국제특허공개 WO2007/69666에 패밀리 유전자의 구체적인 예가 개시되어 있다. Oct 패밀리 유전자로서는 Oct3/4가 바람직하며, Klf 패밀리 유전자로서는 Klf4가 바람직하며, Sox 패밀리 유전자로서는 Sox2가 바람직하다. 이들 유전자로서는 야생형의 유전자 이외에, 수개(예를 들어, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 또는 2개)의 염기가 치환, 삽입 및/또는 결실된 변이 유전자나 패밀리 유전자의 적절한 조합에 의해 수득한 키메라 유전자로서, 야생형의 유전자와 마찬가지의 기능, 또는 개선된 기능을 가지는 유전자 등도 이용가능하다.
제 2의 관점에서 제공되는 본 발명의 방법은, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합 또는 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합과, 하기 3종류의 유전자로부터 선택되는 적어도 1종류의 유전자: L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 어떤 특정 이론에 구애되지는 않지만, L-Myc, Sall1, 및 Sall4로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자는 핵초기화의 효율을 높이는 작용을 가지는 핵초기화 인자이며, 핵초기화를 위하여, 불가결한 핵초기화 인자(예를 들어, Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 또는 Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합 등)와 조합하여 이용함으로써 핵초기화의 효율을 현저히 개선할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 방법은,
(a) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계;
(b) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(c) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(d) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(e) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(f) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall1 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(g) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(h) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계;
(i) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(j) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(k) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(l) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(m) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 Sall1 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계; 또는
(o) 하기 2종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자의 조합, 및 L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 (a) 내지 (g) 중 하나의 실시태양에 있어서, Klf 패밀리 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하여도 무방하다. 또한, 상기 (a) 내지 (o) 중 하나의 실시태양, 또는 상기 (a) 내지 (g) 중 하나의 실시태양에 Klf 패밀리 유전자를 추가한 실시태양에 있어서, Lin 패밀리 유전자 및/또는 Nanog, 바람직하게는 Lin28 및/또는 Nanog, 보다 바람직하게는 Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하여도 무방하다. 또한, 희망에 따라 c-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하여도 무방하다.
Oct 패밀리 유전자로서는 Oct3/4가 바람직하며, Sox 패밀리 유전자로서는 Sox2가 바람직하며, Klf 패밀리 유전자로서는 Klf4가 바람직하다. 또한, Lin 패밀리 유전자로서는 Lin28 및 Lin28b가 알려져 있으나, Lin28이 바람직하다. L-Myc에 대해서는 국제특허공개 WO2007/69666의 표 1에 기재되어 있으며, Sall4에 대해서는 동 국제특허공개의 표 4 및 표 5에 기재되어 있다. Sall1은 ES 세포 특이적 발현유전자이며, 또한, zinc 핑거 단백질의 하나로서 알려져 있고, 신장(kidney)의 발생에 관여한다고 여겨지고 있다. Sall1의 NCBI 등록번호(accession number)는 NM_021390(마우스) 및 NM_002968(사람)이다. 또한, Lin28의 NCBI 등록번호는 NM_145833(마우스) 및 NM_024674(사람)이다.
이들 유전자로서는 야생형의 유전자 이외에, 수개(예를 들어, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 또는 2개)의 염기가 치환, 삽입 및/또는 결실된 변이 유전자나, 패밀리 유전자의 적절한 조합에 의해 수득한 키메라 유전자로서, 야생형의 유전자와 마찬가지의 기능, 또는 개선된 기능을 가지는 유전자 등도 이용가능하다.
예를 들어, L-Myc 또는 c-Myc로서는 야생형의 유전자 이외에, 수개(예를 들어, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 또는 2개)의 염기가 치환, 삽입 및/또는 결실된 변이 유전자, 또는 키메라 Myc 유전자로서, 야생형의 유전자와 동일하거나 또는 개선된 기능을 가지는 유전자도 이용 가능하다. Myc 유전자에 대해서 각종 Myc 키메라 유전자 및 Myc 점돌연변이 유전자의 기능을 구체적으로 분석하는 방법 및 결과가 명세서의 실시예에 구체적으로 기재되어 있으므로, 이러한 분석방법을 이용함으로써 원하는 개선된 기능을 가지는 변이 c-Myc 유전자, 변이 L-Myc 유전자, 또는 키메라 Myc 유전자 등을 용이하게 선택하여 사용할 수 있다. 상기 키메라 Myc 유전자의 바람직한 예로서는, Ms-cL-Myc(서열번호: 157 및 158) 및 Ms-cLc-Myc(서열번호: 161 및 162)를 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 Ms-cL-Myc를 들 수 있다.
이러한 방법의 바람직한 실시태양으로서는 상기 방법에 있어서,
(a-1) Oct3/4, Sox2, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계;
(a-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계;
(b-1)Oct3/4, Sox2, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(b-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(c-1) Oct3/4, Sox2, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(c-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(d-1) Oct3/4, Sox2, L-Myc, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(d-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(e-1) Oct3/4, Sox2, L-Myc, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(e-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(f-1) Oct3/4, Sox2, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(f-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(g-1) Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(g-2) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(h-1) Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc를 체세포에 도입하는 단계;
(i-1) Oct3/4, Klf4, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(j-1)Oct3/4, Klf4, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(k-1) Oct3/4, Klf4, L-Myc, 및 Sall1을 체세포에 도입하는 단계;
(l-1) Oct3/4, Klf4, L-Myc, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계;
(m-1) Oct3/4, Klf4, Sall1, 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계; 또는
(o-1) Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall1 및 Sall4를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법을 들 수 있다.
또한, 상기 방법에 있어서,
(a-3) Oct3/4, Sox2, L-Myc, Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(a-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(b-3) Oct3/4, Sox2, Sall1, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(b-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(c-3) Oct3/4, Sox2, Sall4, Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(c-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(d-3) Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall1, Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(d-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall1, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(e-3) Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(e-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(f-3) Oct3/4, Sox2, Sall1, Sall4, Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(f-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, Sall1, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(g-3) Oct3/4, Sox2, L-Myc, Sall1, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(g-4) Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Sall1, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(h-2) Oct3/4, Klf4, L-Myc, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(i-2) Oct3/4, Klf4, Sall1, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(j-2) Oct3/4, Klf4, Sall4 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(k-2) Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall1, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(l-2) Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계;
(m-2) Oct3/4, Klf4, Sall1, Sall4, Lin28을 체세포에 도입하는 단계; 또는
(o-2) Oct3/4, Klf4, L-Myc, Sall1, Sall4, 및 Lin28을 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 바람직하다.
상기 각 방법에 있어서, Lin28과 함께, 또는 Lin28 대신에 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법도 바람직하다. 예를 들어, 상기 (a-4)의 실시태양에 있어서, Lin28과 함께 Nanog를 이용하는 실시태양, 즉 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28, 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법 등이 예시된다.
또한, 상기 각 방법에 있어서, L-Myc와 함께, 또는 L-Myc 대신에 N-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하여도 무방하다.
아울러, 상기 각 방법에 있어서, 필요에 따라 c-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하여도 무방하나, 분화유도 후에 수득한 세포나 조직에 있어서 종양의 발생을 실질적으로 저감 내지 배제하기 위해서는 c-Myc를 체세포에 도입하는 단계를 포함하지 않는 편이 바람직한 경우가 있다.
L-Myc를 포함하는 실시태양에 대해서는, 핵초기화해야 할 체세포로서 사람의 체세포를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 조합, 또는 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc(또는 L-Myc 대신에 c-Myc)의 조합을 포함하는 경우에는 Sall4를 추가로 조합하거나, 또는 Sall1 및 Sall4의 양쪽을 추가로 조합하는 것이 바람직하다. 또한, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28의 조합을 포함하는 경우에는 Sall1을 추가로 조합하거나, 또는 Sall1 및 Sall4의 양쪽을 추가로 조합하는 것이 바람직하다. 이들 경우에 대해서도 핵초기화해야 할 체세포로서 사람의 체세포를 이용하는 것이 바람직하다.
제 3의 관점으로부터 제공되는 본 발명은 방법은, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 있어서, 하기 6종류의 유전자: Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 28, 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 하기 6종류의 유전자: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28, 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함한다.
상기 제 1 내지 제3의 관점으로부터 제공되는 본 발명의 각 방법에 있어서, "인공다능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell)"라 함은 ES 세포에 가까운 성질을 가지는 세포이며, 보다 구체적으로는 미분화세포로서 다능성(pluripotency) 및 증식능(proliferating ability)을 가지는 세포를 포함하는데, 상기 용어는 어떤 의미에서도 제한적으로 해석해서는 않되며, 가장 넓은 의미로 해석되어야 한다. 핵초기화 인자를 이용하여 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 대해서는, 국제특허공개 WO2007/69666, Cell, 126, pp.663-676, 2006 및 Cell, 131, pp.861-872, 2007에 구체적으로 기술되어 있으며, 인공 다능성 줄기세포의 분리수단에 대해서도 상기 공보에 구체적으로 기술되어 있다.
본 발명의 방법에 의해, 초기화(reprogramming)해야 할 "체세포(somatic cell)"란 ES 세포 등의 분화 전능성 세포(pluripotent cell)를 제외한 모든 세포를 의미하며, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 태아기의 체세포 이외에, 성숙된 체세포를 이용해도 된다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류 동물 유래의 체세포가 이용되며, 보다 바람직하게는 마우스 유래의 체세포나 영장류 유래의 체세포가 이용된다. 특히 바람직하게는, 사람 유래의 체세포를 이용할 수 있다. 체세포로서는 구체적으로, (1) 신경줄기세포(nerve somatic cell), 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cell), 치수 줄기세포(dental pulp stem cell) 등의 조직줄기세포(tissue stem cell), 체성 줄기세포(somatic stem cell), (2) 조직 전구세포(tissue precursor cell), 또는 (3) 임파구, 상피세포, 근육세포, 선유아세포(피부세포 등), 모세포, 간장세포, 위점막세포 등의 분화된 세포를 들 수 있다. 인공 다능성 줄기세포를 질병치료에 이용할 경우에는, 환자 자신으로부터 분리한 체포나, HLA 항원의 타입이 동일한 타인으로부터 분리한 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다.
상기 유전자를 체세포에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 상기 유전자를 발현가능한 벡터를 이용하는 것이 일반적이다. 벡터로서 레트로바이러스 벡터를 이용하는 구체적 수단이, 국제특허공개 WO2007/69666, Cell, 126, pp.663-676, 2006 및 Cell, 131, pp.861-872, 2007에 개시되어 있으며, 벡터로서 렌티바이러스 벡터를 이용하는 경우에 대해서는 Science, 318, pp.1917-1920, 2007에 개시되어 있다. 또한, 비바이러스 벡터인 플라스미드를 이용하는 경우에 대해서는, 오키타(Okita) 등의 논문(Science, Published online: October 9, 2008; 10. 1126/science, 1164270)에 기재되어 있으므로, 당업자는 이들 중에서 적절한 수단을 선택하여 채용할 수 있다. 벡터를 이용하는 경우에는 벡터에 상기 유전자로부터 선택된 2종류 이상의 유전자를 함입해도 되지만, 1종류의 유전자를 도입한 벡터를 여러 종류 이용해도 무방하다. 초기화해야 할 체세포에 있어서 상기 유전자 중 1종류 또는 2종류가 이미 발현되어 있을 경우에는, 도입해야 할 상기 유전자의 조합으로부터 발현되어 있는 1종류 또는 2종류의 유전자를 제외하는 것도 가능하지만, 이러한 실시태양이 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 유전자를 체세포에 도입하는 수단으로서, 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 이용하는 경우에는, 도입해야 할 각각의 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제조한 후, 각 바이러스 벡터를 따로 따로의 패키징 세포에 형질전이시켜 이 세포를 배양함으로써 각 바이러스를 포함하는 배양 상등액을 각각 독립적으로 제조하고, 그들의 배양 상등액의 혼합물을 제조하여 유전자를 포함하는 바이러스를 감염시키는 것에 의한 유전자 도입에 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 수단을 채용함으로써 유전자 도입효율을 현저히 높일 수 있는 경우가 있으며, 특히, c-Myc를 이용하지 않고 핵초기화를 행할 경우에 바람직한 경우가 있다. 특히, 복수의 바이러스 벡터를 단일 패키징 세포에 형질전이시키고, 복수의 바이러스 벡터를 포함하는 배양 상등액을 제조하여 유전자 도입에 이용하는 것도 가능하다.
유전자를 체세포에 도입할 경우에는 공급세포(feeder cell) 상에 배양된 체세포에 대해서 발현벡터의 도입을 행하여도 무방하지만, 공급세포를 사용하지 않고 체세포에 발현벡터 도입을 행해도 무방하다. 발현벡터의 도입효율을 높이기 위하여, 후자의 방법이 적합한 경우가 있다. 공급세포로서는 배아 줄기세포의 배양에 이용되는 공급세포를 적절히 사용할 수 있지만, 예를 들어, 마우스 14 내지 15일 배아의 선유아세포 초대(primary) 배양세포나 선유아세포 유래 세포주인 STO 세포 등을 마이토마이신 C 등의 약제로 처리한 세포나 방사선 처리한 세포 등을 이용할 수 있다. 유전자 도입 후의 체세포의 배양은 공급세포 상에서 행하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자 도입 후 수일 내지 30일 정도 동안에 퓨로마이신 등을 이용하여 약제에 의한 선별을 부가하는 것도 가능하다. 특히, 약제에 의한 선별을 행하지 않고 iPS 세포를 유도할 수 있는 방법도 알려져 있으며(국제특허공개 WO2007/69666의 실시예 9 등), 약제에 의한 선별을 행하지 않고 iPS 세포를 유도하는 것도 바람직하다.
핵초기화 인자를 도입한 체세포를 적절한 조건 하에서 배양함으로써 자율적으로 핵초기화가 진행되며, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조할 수 있다. 유전자를 체세포에 도입한 후, 이 세포가 다능성을 획득하여 증식하는데 충분한 시간동안 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 사람의 인공 다능성 줄기세포를 제조할 경우에는, 발현벡터 도입 후의 세포의 배양 밀도를 통상의 동물세포,배양의 경우보다도 낮게 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 세포배양용 디쉬당 1 내지 10만개, 바람직하게는 5만개 정도의 세포밀도로 배양을 계속하는 것이 바람직하다.
통상은 체세포의 동물종에 적합한 배지, 예를 들어, 배아 줄기세포(ES 세포)용 배지(예를 들어, 사람의 체세포에 유전자 도입할 경우에는 영장류 ES 세포용, 바람직하게는 사람의 ES 세포용 배지)를 이용하여 예를 들어, 25일 이상 배양함으로써 인공 다능성 줄기세포를 얻을 수 있다. 제 1의 관점으로부터 제공되는 방법에서는, c-Myc, L-Myc, N-Myc, Sall1, 또는 Sall4의 1종류 또는 2종류 이상을 포함하는 조합을 이용하여 핵초기화를 행하는 경우에 비해 핵초기화의 효율이 저하되는 경우가 있으며, 일반적으로는 장기간의 배양이 필요해지는 일이 많다. 예를 들어, 이 방법에 있어서는, 바람직하게는 28일 이상, 보다 바람직하게는 30일 이상, 더 바람직하게는 33일 이상, 특히 바람직하게는 35일 이상 배양을 계속할 필요가 있다. 특히, 사람의 체세포에 유전자 도입할 경우에는, 40일 이상, 더욱이는 45일 이상의 배양일수가 가장 적합한 배양일수가 되는 경우도 있다. 특히, 제 1의 관점으로부터 제공되는 방법에 의하면, 백그라운드가 되는 협잡세포(debris cell)의 혼입을 배제하여 보다 순수한 세포집단으로서의 인공 다능성 줄기세포 콜로니를 수득할 수 있으며, 유전자 발현이나 분화능 등의 점에서 극히 고품질의 인공 다능성 줄기세포를 수득하는 것이 가능해진다. 한편, 제 2의 관점 및 제3의 관점에서 제공되는 본 발명의 방법에서는, 일반적으로는 인공 다능성 줄기세포의 생성효율이 충분히 높기 때문에, 보다 짧은 배양일수, 예를 들어, 15일 내지 30일간, 바람직하게는 20일 정도의 배양기간으로 원하는 개수의 인공 다능성 줄기세포를 수득할 수 있는 경우가 있다.
유전자 도입한 세포가 다능성을 획득한 것은, 예를 들어, 미분화 세포에 특유의 각종 마커, 예를 들어, 알칼리 인산가수분해효소(ALP), SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2, 및 E-cadherin 등을 검촐함으로써 용이하게 판정할 수 있다. 마커의 종류나 판정수단에 대해서는 상기 간행물(예를 들어, Cell, 126, pp.663-676, 2006, Cell, 131, pp.861-872, 2007 등)에 구체적이면서 상세하게 기술되어 있다. ES 세포 특이적 발현 유전자의 프로모터 하류에 GFP 등의 마커 유전자를 도입한 유전자를 가지는 체세포를 이용하여 핵초기화를 행한 경우에는 마커(GFP) 양성을 지표로서 인공 다능성 줄기세포를 특정하는 것이 가능하다.
또한, 증식에 대해서는 일반적으로는 콜로니 형성에 의해 판정할 수 있으나, 콜로니(통상은 약 500개 내지 1,000개 정도의 인공 다능성 줄기세포로 이루어진 세포집단임)의 형상은 동물종에 의해 특징적인 외관을 이루는 것이 알려져 있으므로, 인공 다능성 줄기세포가 증식하여 형성된 콜로니를 용이하게 특정할 수 있다.
예를 들어, 마우스 인공 다능성 줄기세포는 부풀어 오른 콜로니를 형성하는 것에 대해서, 사람의 인공 다능성 줄기세포는 편평한 콜로니를 형성하는 것이 알려져 있으며, 이들 콜로니 형상은 각각 마우스 ES 세포 및 사람의 ES 세포의 콜로니와 극히 유사하므로, 당업자는 생성된 인공 다능성 줄기세포의 콜로니를 검출함으로써 인공 다능성 줄기세포의 증식 정도를 확인할 수 있다. ES 세포의 미분화성 및 다능성을 유지 가능한 배지 또는 그 성질을 유지할 수 없는 배지는 당업계에서 각종 알려져 있으며, 적절한 배지를 조합하여 이용함으로써 인공 다능성 줄기세포를 효율적으로 분리할 수 있다. 분리된 인공 다능성 줄기세포의 분화능 및 증식능은 ES 세포에 대해서 범용되고 있는 확인수단을 이용함으로써 당업자가 용이하게 확인 가능하다.
상기 방법에 있어서, 필요에 따라 유전자 도입을 사이토카인의 부재 또는 존재하에 행할 수 있으며, 바람직하게는 사이토카인의 부재하에 행할 수 있다. 또한, 상기 방법에 있어서 필요에 따라 유전자 도입 후의 체세포 배양을 사이토카인의 부재 또는 존재하에 행할 수 있다. 사이토카인으로서는 통상적으로는 basic fibroblast growth factor(bFGF), stem cell factor(SCF), leukemia inhibitory factor(LIF) 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것이 아니며, 당업계에서 사이토카인으로 분류되어 있는 생리활성 물질의 존재하 또는 부재하에서 유전자 도입 및/또는 배양을 행할 수 있다. 사이토카인을 발현하도록 개변한 공급세포 상에서 유전자 도입 후의 체세포를 배양할 수도 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 유전자 대신에 상기 유전자가 암호화하는 유전자 산물을 이용하여 핵초기화를 행하는 것도 가능하다. 유전자 산물인 핵초기화 인자를 이용하여 상기 방법을 행하는 경우에는, 체세포 및 인공 다능성 줄기세포가 증식가능한 환경에서 핵초기화 인자와 체세포를 접촉시키면 된다. 보다 구체적으로는 예를 들어, 상기 유전자 산물을 배지 중에 첨가하는 등의 수단을 채용할 수 있다. 이들 유전자의 유전자 산물 중 1종류 또는 2종류를 융합 단백질이나 핵내로의 미세주입(microinjection) 등의 방법에 의해 핵 내로 도입하고, 나머지 1종류 또는 2종류의 유전자를 적절한 유전자 도입방법, 예를 들어, 재조합 벡터를 이용하는 방법 등에 의해 도입할 수도 있다.
이 유전자 산물로서는, 예를 들어, 상기 유전자로부터 생산된 단백질 자체 이외에, 이 단백질과 기타 단백질 또는 펩티드 등과의 융합 유전자 산물의 형태라도 무방하다. 예를 들어, 녹색형광 단백질(GFP)과의 융합 단백질이나 히스티딘 태그 등의 펩티드와의 융합 유전자 산물을 이용하는 것도 가능하다. 또한, HIV 바이러스로부터 유래된 TAT 펩티드와의 융합 단백질을 제조하여 이용함으로써 세포막으로부터의 핵초기화 인자의 세포 내 취입(uptake)을 촉진할 수 있으며, 유전자 도입 등의 번잡한 조작을 회피하여 융합 단백질을 배지에 첨가하는 것만으로 초기화를 유도하는 것이 가능해진다. 이러한 융합 유전자 산물의 제조방법은 당업자에게 잘 알려져 있으므로, 당업자는 목적에 따라 적절한 융합 유전자 산물을 용이하게 설계하여 제조하는 것이 가능하다.
상기 각 방법에 있어서, 1종류 또는 2종류 이상의 유전자의 체세포에의 도입을 체세포에의 저분자 화합물의 접촉으로 치환할 수 있는 경우도 있다. 이러한 저분자 화합물로서는, 예를 들어, Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin 패밀리 유전자, Sall1, Sall4 및 Nanog 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종류 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 가지는 저분자 화합물을 이용할 수 있으나, 이러한 저분자 화합물은 각 유전자의 발현량을 지표로서 당업자가 용이하게 스크리닝할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 정의된 각 유전자이외에도, 세포의 불멸화를 유도하는 인자를 암호화하는 유전자를 추가로 조합하여도 무방하다. 국제특허공개 WO2007/69666에 개시되어 있는 바와 같이, 예를 들어, TERT 유전자 및 하기의 유전자: SV40 Large T antigen, HPV16 E6, HPV16 E7, 및 Bmil로 구성된 군에서 선택된 1종류 이상의 유전자를 단독으로, 혹은 적절히 조합하여 이용할 수 있다. 또한, 상기 유전자이외에도, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 및 β-catenin으로 구성된 군에서 선택된 1종류 이상의 유전자를 조합하여도 무방하며, 및/또는 ECAT1, Esg1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, 및 Grb2로 구성된 군에서 선택된 1종류 이상의 유전자를 조합할 수도 있다. 이들 조합에 대해서는 국제특허공개 WO2007/69666에 구체적으로 기술되어 있다. 특히, 본 발명의 방법에 있어서 사용가능한 유전자는, 상기 구체적으로 설명한 유전자에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 방법에 있어서는, 핵초기화 인자로서 기능할 수 있는 다른 유전자 이외에, 분화, 발생 또는 증식 등에 관계하는 인자 혹은 기타 생리활성을 가지는 인자를 암호화하는 유전자의 1종류 또는 2종류 이상 포함할 수 있으며, 그러한 실시태양도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 핵초기화 인자를 확인하는 수단으로서는 국제특허공개 WO2005/80598에 기재된 핵초기화 인자의 스크리닝 방법이나 국제특허공개 WO2007/69666에 기재된 구체적인 핵초기화 인자의 특정방법을 이용할 수 있다. 국제특허공개 WO2005/80598 및 WO2007/69666의 모든 개시를 참조문헌으로 본 명세서의 개시에 포함시킨다. 당업자는 이들 간행물을 참조함으로써 핵초기화 인자를 스크리닝하여, 본 발명의 방법을 위하여, 이용할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법에 적절한 수식 내지 개변한 방법을 이용하여 핵초기화 인자를 확인하는 것도 가능하다. 상기 방법에 이용되는 유전자의 조합이 핵초기화 인자로서 작용하는 것도 상기 간행물에 기재된 방법에 의해 당업자가 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 인공 다능성 줄기세포의 수립 효율을 향상시키기 위하여, 각종 수립효율 개선제의 도입 및/또는 첨가를 행하는 것도 가능하다. iPS 세포의 수립 효율 개선물질로서는 예를 들어, 히스톤 탈아세틸라제(HDAC)저해제[예를 들어, Valproate(VPA)(참조: Nat. Biotechnol., 26(7), pp. 795-797, 2008), 트리코스타틴(trichostaton) A, sodium butyrate, MC 1293이나 M344 등의 저분자 저해제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA(예를 들어, HDAC1 siRNA Smartpool(등록상표, Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1(OriGene)) 등의 핵산성 발현저해제 등], G9a 히스톤메틸 전이효소 저해제[예를 들어, BIX-01294(참조: Cell Stem Cell, 2,pp.525-528, 2008) 등의 저분자 저해제, G9a에 대한 siRNA 및 shRNA(예를 들어, G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)) 등의 핵산계 발현 저해제 등] 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 핵산계 발현 저해제는 siRNA 또는 shRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 발현벡터의 형태라도 무방하다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 인공 다능성 줄기세포의 용도는 특별히 한정되지 않으며, ES 세포를 이용하여 행해지고 있는 여러 시험, 연구나 ES 세포를 이용한 질병의 치료 등에 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 수득한 인공 다능성 줄기세포를 레티노인산, EFG 등의 증식인자, 또는 글루코코르티코이드 등으로 처리함으로써 원하는 분화세포(예를 들어, 신경세포, 심근세포, 혈구세포 등)을 유도할 수 있으며, 적절한 조직을 형성시킬 수 있다. 분화유도 방법에 대해서는 국제특허공개 WO2007/69666 등에 구체적으로 기술되어 있다. 이와 같이 하여 수득한 분화세포나 조직을 환자에게 되돌림으로써, 자가세포 이식에 의한 줄기세포 요법을 달성할 수 있다. 예를 들어, 환자 자신의 체세포로부터 안전성이 높은 인공 다능성 줄기세포를 효율적으로 작제할 수 있으며, 이 세포를 분화시킴으로써 수득한 세포(예를 들어, 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등)을 심부전, 인슐린 의존성 당뇨병, 파킨스병이나 척수 손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 있어서 안전하게 이용할 수 있다.
또한, 예를 들어, 사람의 체세포로부터 본 발명의 방법에 의해 인공 다능성 줄기세포를 제조한 후, 이 인공 다능성 줄기세포를 분화유도하여 체세포, 조직 또는 장기 등을 제조하여, 이 체세포, 조직, 또는 장기 등에 대한 화합물, 의약, 독물 등의 생리작용이나 독성을 평가하는 것도 가능하다. 혹은 특정 질환의 환자의 체세포로부터 본 발명의 방법에 의해 인공 다능성 줄기세포를 제조한 후, 이 인공 다능성 줄기세포를 분화유도하여 체세포, 조직, 또는 장기 등을 제조하며, 이 체세포, 조직, 또는 장기 등에 대해서 의약후보 화합물을 작용시켜 치료 및/또는 예방 효과를 판정함으로써 의약후보 화합물의 스크리닝을 행하는 것도 가능하다. 특히, 본 발명의 인공 다능성 줄기세포의 용도는 상기 특정 실시태양에 한정되는 것은 아니다.
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하겠다. 본 발명의 범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 마우스 ES 세포 배지에서의 성체 HDF로부터 iPS 세포의 수립
성인의 피부유래(skin-derived) 선유아세포(adult HDF) 또는 인간 신생아 포피유래(preputium-derived) 선유아세포(BJ)에 렌티바이러스로 Slc7a1(마우스 레트로바이러스 수용체) 유전자를 도입하고(각각 "HDFa-Slc7a1" 및 "BJ-Slc7a1"라 함), HDFa-Slc7a1 또는 BJ-Slc7a1를 800,000개로 조정한 후 공급세포(마이토마이신-처리 STO 세포) 상에 접종하고, 이하의 조합으로 레트로바이러스 벡터에 의해 유전자를 도입하였다.
1. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, Bmil
2. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6, HPV16 E7
3. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E7
4. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, SV40 Large T antigen
5. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, hTERT, HPV16 E6
6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc
도면에 나타낸 "-"는 상기 조합의 "6. Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc"를 나타낸다(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 TERT는 사람 유래, Bmil은 마우스 유래).
마우스 ES 세포의 배양조건하에서 약제에 의한 선별없이 배양을 계속하였는 바, 상기 4의 조합으로 유전자를 조합한 디쉬에 있어서, 바이러스 감염 8일 후에 있어서 iPS 세포라 여겨지는 콜로니가 출현하였다. 다른 조합(1 내지 3 및 5)에 있어서도 1의 조합의 경우만큼 명료하지는 않지만, iPS 세포양 콜로니가 출현하였다. 4개의 유전자(6) 만을 도입해도 전혀 콜로니는 출현하지 않았으나, 상기 조건하에서 4개의 유전자만이 도입된 세포는 알칼리 인산가수분해효소 염색에 대해서 명백하게 양성을 나타내었다(참조: 도 1).
마찬가지로, 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 인간 신생아 포피유래 선유아세포(BJ)를 80,000개로 조정한 후, 공급세포(마이토마이신-처리 STO 세포) 상에 접종하고, 이하의 조합으로 레트로바이러스 벡터에 의해 유전자를 도입하였다.
1. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, SV40 Large T antigen
2. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, Bmil
3. hTERT, SV40 Large T antigen
4. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E6
5. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E7
6. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT, HPV16 E6, HPV16 E7
7. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc), hTERT
8. 4s(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)
9. DsRed
(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, TERT는 사람 유래, Bmil은 마우스 유래).
마우스 ES 세포의 배양조건하에서 2주간 배양을 계속하였는 바, 4개의 유전자(8) 만이 도입된 세포는 알칼리 인산가수분해효소 염색에 대해서 양성을 나타내었다(참조: 도 2).
실시예 2: iPS 세포에 의한 ECAT 발현(1)
성인의 피부유래 선유아세포(성체 HDF)로부터 수립된 사람의 iPS 세포가, ES 세포에서 특이적으로 발현하는 유전자군인 ECAT(ES cell associated transcript)를 발현하는지의 여부를 조사하였다.
성체 HDF로부터 유래된 iPS 세포(클론 iPS-HDFaSlc-87E6)를 6웰 플레이트에 미리 배양한 공급세포(마이토마이신 C-처리 STO 세포) 상에, 각 웰당 5 x 104개의 비율로 접종하여 4일간 배양하였다. 세포를 10% 포르말린을 함유하는 PBS로 고정하고, 고정액을 제거하고 PBS로 세정하여, 실온에서 45분간 3% BSA 함유 PBS를 가하여 정치하였다. 1차 항체(항 인간 ABCG-2 항체(마우스 IgG), 항 SSEA-3 항체(랫트 IgG) 및 항 SSEA-4 항체(마우스 IgG)를 3% BSA 함유 PBS로 1:100으로 희석하여 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 세포를 1% BSA를 함유하는 PBS로 3회 세정하고, 1% BSA를 포함하는 PBS로 1:300으로 희석한 2차 항체를 이용하여 실온에서 1시간, 차 광 하에 반응시켰다. 2차 항체로서 Cy-3으로 표지한 항마우스 IgG 항체(ABCG-2 및 SSEA-4에 대한 항체: Chemicon) 및 항랫트 IgM 항체(SSEA-3에 대한 항체: Jackson Immuno Research)를 사용하였다. 세포를 PBS로 세정하고, 이어서 현미경하에서 관찰 및 촬영하였다(참조: 도 3). 그 결과, 성체 HDF로부터 유래된 iPS 세포가 ABCG-2, SSEA-3 및 SSEA-4를 발현하고 있음이 관찰되었다.
실시예 3: iPS 세포에 의한 ECAT 발현(2)
성인의 피부유래 선유아세포(adult HDF)로부터 유래된 iPS 세포(클론 iPS-HDFaSlc-87E3, 87E4, 및 87E12)를 미리 6웰 플레이트에 접종한 공급세포(마이토마이신 C-처리 STO 세포) 상에, 각 웰당 5 x 104개의 비율로 접종하여 5일간 배양하였다. 대조군로서 상기 iPS 세포의 유래세포인 HDF를 상기 6웰 플레이트 상에 접종하고, 2일간 유지하였다. 세포를 10% 포르말린을 함유하는 PBS로 고정하였다. 고정액을 제거하고 세포를 PBS로 세정한 후, 세포를 실온에서 45분간 차단용 완충용액(3% BSA 함유 PBS)를 가하여 정치하였다. 1차 항체(항 ABCG-2 항체(마우스 IgG: 차단용 완충용액으로 1:80으로 희석), 항 E-cadherin(마우스 IgG: 차단용 완충용액으로 1:80으로 희석), 항 SSEA-3 항체(랫트 IgM: 차단용 완충용액으로 1:250으로 희석), 항 SSEA-4 항체(마우스 IgG: 차단용 완충용액으로 1:250으로 희석)와 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후, 세포를 차단용 완충용액으로 세정하였다. 그런 다음, 세 포를 2차 항원을 이용하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체는 차단용 완충용액으로 1:300으로 희석한 Cy-3으로 표지한 항마우스 IgG 항체(ABCG-2, E-cadherin 및 SSEA-4에 대한 항체) 및 항랫트 IgM 항체(SSEA-3에 대한 항체)를 이용하였다. 2차 항체 반응후 항체 용액을 제거하고 PBS로 세정한 후, 세포에 50% 글리세롤을 포함하는 PBS를 가하여 관찰하였다(참조: 도 4).
성인의 피부유래 선유아세포(성체 HDF)로부터 유래된 iPS 세포는 ES 세포의 표면마커(surface marker)인 SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 및 E-cadherin을 발현하였다. 이에 반해서, iPS 세포로부터 유래된 세포인 HDFa는 SSEA-3, SSEA-4, ABCG-2 및 E-cadherin의 어느 것도 발현하지 않았다.
실시예 4: iPS 세포에 의한 ECAT 발현(3)
전세포 RNA를 사람의 iPS 세포클론(iPS-HDFaSlc87E-1 내지 8, 11 및 12), NTERA2 클론 D1 사람의 배아 암세포(계대수 35), 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 성체 HDF(계대수 6)로부터 단리하였다. 제 1쇄 cDNA는 oligo-dT20 프라이머 및 Rever Tra Ace-α-kit(東洋紡)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 합성하였다. PCR은 프라이머를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 내재성 OCT3/4에 대해서 Oct3/4-S1165 및 hOct3/4-AS1283; 내재성 Sox2에 대해서 hSox2-S1430 및 hSox2-AS1555; Nanog에 대해서 ECAT4-macaca-968S 및 ECAT4-macaca-1334AS; REX1에 대해서 hRex1-RT-U 및 hRex1-RT-L; FGF4에 대해서 hFGF4-RT-U 및 hFGF4-RT-L; GDF3에 대해서 hGDF3-S243 및 hGDF3-AS850: ECAT15-1에 대해서 hECAT15-S532 및 hECAT15-AS916; ECAT15-2에 대해서 hECAT15-2-S85 및 hECAT15-2-AS667; ESG1에 대해서 hpH34-S40 및 hpH34-AS259; hTERT에 대해서 hTERT-S3556 및 hTERT-AS3713; 및 G3PDH에 대해서 G3PDH-F 및 G3PDH-R을 사용하였다(표 1: 서열목록의 서열번호 1 내지 22).
그 결과, 다수의 사람의 iPS 세포클론(iPS-HDFaSlc87E-1 내지 8, 11 및 12)이 ECAT를 발현하였으며, 특히, 87E6 클론은 각종 ECAT를 발현하였다(참조: 도 5).
프라이머 염기서열(5' -> 3') 응 용
hOct3/4-S1165 GAC AGG GGG AGG GGA GGA GCT AGG Endo Oct3/4 RT-PCR
hOct3/4-AS1283 CTT CCC TCC AAC CAG TTG CCC CAA AC
hSox2-S1430 GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA AGA GG Endo Sox2 RT-PCR
hSox2-AS1555 TTG CGT GAG TGT GGA TGG GAT TGG TG
ECAT4(Nanog)-macaca- 968S CAG CCC CGA TTC TTC CAC CAG TCC C
Nanog RT-PCR
ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS CGG AAG ATT CCC AGT CGG GTT CAC C
hREXI-RT-U CAG ATC CTA AAC AGC TCG CAG AAT REX1 RT-PCR
hREXI-RT-L GCG TAC GCA AAT TAA AGT CCA GA
hFGF4-RT-U CTA CAA CGC CTA CGA GTC CTA CA FGF4 RT-PCR
hFGF4-RT-L GTT GCA CCA GAA AAG TCA GAG TTG
hGDF3-S243 CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG GDF3 RT-PCR
hGDF3-AS850 GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
hECAT15-1-S532 GGA GCC GCC TGC CCT GGA AAA TTC DPPA4 RT-PCR
hECAT15-1-AS916 TTT TTC CTG ATA TTC TAT TCC CAT
hECAT15-2-S85 CCG TCC CCG CAA TCT CCT TCC ATC DPPA2 RT-PCR
hECATl5-2-AS667 ATG ATG CCA ACA TGG CTC CCG GTG
hpH34-S40 ATA TCC CGC CGT GGG TGA AAG TTC ESGl RT-PCR
hpH34-AS259 ACT CAG CCA TGG ACT GGA GCA TCC
hTERT-S3234 CCT GCT CAA GCT GAC TCG ACA CCG TG hTERT RT-PCR
hTERT-AS3713 GGA AAA GCT GGC CCT GGG GTG GAG C
G3PDH-F ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC G3PDH PCR
G3PDH-R TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
실시예 5: iPS 세포에 의한 ECAT 발현(4)
인간 신생아 포피유래 선유아세포(BJ 선유아세포)로부터 유래된 사람의 iPS 세포가 ECAT를 발현하는지의 여부를 확인하였다.
총세포 RNA를 사람의 iPS 세포(iPS-BJSlc-97E-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12,-97G-3, 5,-97H-3 및 5), NTERA2 클론 D1 사람의 배아 암세포(계대수 35), 및 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하는 신생아 포피유래 선유아세포(BJ)(계대수 6)로부터 단리하였다. 제 1쇄 cDNA는 oligo-dT20 프라이머 및 Rever Tra Ace-α-kit(東洋紡)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 합성하였다. PCR은 프라이머를 이용하여 이하와 같이 행하였다. 내재성 OCT3/4에 대해서 hOct3/4-S1165 및 hOct3/4-AS1283; 내재성 Sox2에 대해서 hSox2-S1430 및 hSox2-AS1555; Nanog에 대해서 ECAT4-macaca-968S 및 ECAT4-macaca-1334AS; REX1에 대해서 hRex1-RT-U 및 hRex1-RT-L; FGF4에 대해서 hFGF4-RT-U 및 hFGF4-RT-L; GDF3에 대해서 hGDF3-S243 및 hGDF3-AS850: ECAT15-1에 대해서 hECAT15-S532 및 hECAT15-AS916; ECAT15-2에 대해서 hECAT15-2-S85 및 hECAT15-2-AS667; ESG1에 대해서 hpH34-S40 및 hpH34-AS259; hTERT에 대해서 hTERT-S3556 및 hTERT-AS3713; 및 G3PDH에 대해서 G3PDH-F 및 G3PDH-R을 사용하였다(표 2: 서열목록의 서열번호 23 내지 44).
그 결과, 다수의 사람의 iPS 세포클론(iPS-BJSlc-97E-1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12,-97G-3, 5,-97H-3 및 5)이 ECAT를 발현하였다(참조: 도 6).
프라이머 염기서열(5' -> 3') 응 용
hOct3/4-S1165 GAC AGG GGG AGG GGA GGA GCT AGG Endo Oct3/4 RT-PCR
hOct3/4-AS1283 CTT CCC TCC AAC CAG TTG CCC CAA AC
hSox2-S1430 GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA AGA GG Endo Sox2 RT-PCR
hSox2-AS1555 TTG CGT GAG TGT GGA TGG GAT TGG TG
ECAT4(Nanog)-macaca-968S CAG CCC CGA TTC TTC CAC CAG TCC C
Nanog RT-PCR
ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS CGG AAG ATT CCC AGT CGG GTT CAC C
hREXI-RT-U CAG ATC CTA AAC AGC TCG CAG AAT REX1 RT-PCR
hREXI-RT-L GCG TAC GCA AAT TAA AGT CCA GA
hFGF4-RT-U CTA CAA CGC CTA CGA GTC CTA CA FGF4 RT-PCR
hFGF4-RT-L GTT GCA CCA GAA AAG TCA GAG TTG
hGDF3-S243 CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG GDF3 RT-PCR
hGDF3-AS850 GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
hECAT15-1-S532 GGA GCC GCC TGC CCT GGA AAA TTC DPPA4 RT-PCR
hECAT15-1-AS916 TTT TTC CTG ATA TTC TAT TCC CAT
hECAT15-2-S85 CCG TCC CCG CAA TCT CCT TCC ATC DPPA2 RT-PCR
hECATl5-2-AS667 ATG ATG CCA ACA TGG CTC CCG GTG
hpH34-S40 ATA TCC CGC CGT GGG TGA AAG TTC ESGl RT-PCR
hpH34-AS259 ACT CAG CCA TGG ACT GGA GCA TCC
hTERT-S3234 CCT GCT CAA GCT GAC TCG ACA CCG TG hTERT RT-PCR
hTERT-AS3713 GGA AAA GCT GGC CCT GGG GTG GAG C
G3PDH-F ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC G3PDH PCR
G3PDH-R TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA
실시예 6: 사람의 iPS 세포에 의한 기형종 형성
5.0 x 106개의 사람의 iPS 세포를 SCID 마우스(암컷, 5주령)의 등측면에 피하주사하였다. 주사의 5주간 후에 큰 종양이 관찰되었다. 종양을 절제하여 중량을 계측하고 외관을 촬영하였다. 이 종양을 10% 포르말린을 함유하는 PBS로 고정하였다. 파라핀 포매된(embedded) 종양을 4.5μm 절편으로 세절한 박절편을 슬라이드글래스 상에 놓고 바람으로 건조시킨 후, 헤마톡실린-에오신 염색을 행하였다. 도 7의 A는 iPS-HDFaSlc-87E12 클론을 피하주사한 마우스 및 그 기형종을 나타낸다. 도 7의 B는 클론 iPS-HDFaSlc-87E3, 동 C는 클론 iPS-HDFaSlc-87E6, 동 D는 클론 iPS-HDFaSlc-87E12를 피하주사한 마우스로부터 절제된 기형종 유래의 조직상을 각각 나타낸다.
실시예 7: 사람의 iPS 세포의 실험실 조건에서의 분화
부유배양(floating culture)을 행함으로써 배상체(embryoid body: EBs)를 형성시켜 실험실 조건에서 사람의 iPS 세포의 분화능을 평가하였다. 사람의 iPS 세포(iPS-HDFaSlc-127F2, E3)를 7일간 부유배양하여 배상체를 형성시켰다. 이어, 배양체를 젤라틴 코팅한 플레이트로 옮겨 8일간 배양을 더 계속한 다음, 면역조직 화학분석을 행하였다. 사용한 1차 항체(Chemicon), 항-α-평활근 액틴항체(Dako), 항βⅢ-튜블린 항체(Chemicon), 항-α-페토프로테인(Dako), 정상 마우스 IgG(2mg/ml, Chemicon), 및 정상 토끼 IgG(2mg/ml, Chemicon)는 각각 3% BSA 함유 PBS로 1:100으로 희석하여 1차 항원으로서 사용하였다. 1차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후에 세포를 PBS로 세정하고, 2차 항체(3% BSA 함유 PBS로 1:300으로 희석)를 반응시켰다. 또한, 핵은 DAPI로 염색하였다. 그 결과 α-평활근 액틴(α-SMA, 중배엽 마커), βⅢ-튜블린(외배엽 마커), α-페토프로테인(내배엽 마커)이 양성을 나타냄으로써, 사람의 iPS 세포가 배상체 형성을 통해 실험실 조건에서 분화하는 것을 확인하였다(참조: 도 8).
실시예 8: 사람의 iPS 세포의 작제를 위한 레트로바이러스에 의한 유전자 도입의 최적화
마우스 선유아세포로부터의 iPS 세포의 유도에는 높은 유전자 도입효율을 가지는 레트로바이러스가 유효하다고 여겨지고 있다(참조: Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-676, 2006). 이에, 성인의 피부유래 선유아세포(성체 HDF)에 있어서의 유전자 도입방법을 최적화하였다. 최초로 PLAT-A 패키징 세포에 있어서 작제한 양종성(amphotropic) 레트로바이러스를 이용하여, 성체 HDF에 녹색형광 단백질(GFP)를 도입하였다. 대조로서 PLAT-E 패키징 세포(참조: Morita et al, Gene Ther., 7, pp.1063-66, 2000)에서 작제한 동종 지향성(ecotropic) 레트로바이러스를 이용하여, 마우스 태아 선유아세포(MEF)에 GFP를 도입하였다. MEF에 있어서는 80% 이상의 세포가 GFP를 발현하였다(참조: 도 9). 한편, 20% 미만의 성체 HDF의 경우보다 명백히 GFP의 의 발현강도가 낮아, GFP 발현율은 20% 미만이었다.
유전자 도입효율을 개선하기 위하여, 마우스 레트로바이러스의 리셉터 Slc7a1(참조: Verrey et al., Pflugers Arch., 447, pp.532-542, 2004)(mCAT1으로도 알려져 있음)을 레트로바이러스를 이용하여 성체 HDF에 도입하였다. 그런 다음, 동종지향성 레트로바이러스를 이용하여 HDFa-Slc7a1에 GFP를 도입하였다. 이 방법에 의하여 60%의 유전자 도입효율이 달성되었다(참조: 도 9).
실시예 9: 영장류 ES 세포 배지를 이용한 성체 HDF로부터의 iPS 세포의 작제
사람의 iPS 세포를 유도하기 위한 프로토콜을 도 10A에 개략적으로 나타내었다. 사람의 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 레트로바이러스 벡터로 HDF-Slc7a1에 도입하였다(참조: 도 10B, 8 x 105세포/100mm 디쉬).
유전자 도입의 6일 후 세포를 트립신 처리에 의해 회수하고, 5 x 104 또는 5 x 105세포/100mm 디쉬에 조정한 후, 마이토마이신 C-처리 SNL 공급세포(참조: McMahon et al,, Cell, 62, pp.1073-85, 1990) 상에 접종하였다. 다음 날, 배지(100% FBS를 함유하는 DMEM)를 4ng/ml의 염기성 선유아세포 성장인자(bFGF)를 보충한 영장류 ES 세포용 배지(Reprocell, Inc.)로 교환하였다. 약 2주간 후 세포형태가 사람의 ES 세포와는 유사하지 않은 몇 개인가의 입자상 콜로니가 나타났다(참조: 도 10C). 25일째 무렵 평평하고 사람의 ES 세포 콜로니와 유사한 다른 타입의 콜로니가 관찰되었다(참조: 도 10D). 5 x 104개의 선유아세포로부터 약 10개의 사람의 ES 세포양 콜로니 및 약 100개의 입자상 콜로니가 관찰되었다(6회의 독립된 실험에 있어서, 7/122, 8/84, 8/171, 5/73, 6/122, 및 11/213개를 관찰하였으며, 그 결과를 표 3에 정리하였다).
실험번호 친세포 유전자 도입후 6일째에 접종한 세포수
201B HDF 50000 7 129 7 5
243H HFLS
 500000 0 >1000
50000 17 679 6 2

246B
HDF
 500000 0 420
500000 2 508
50000 8 92 6 6

246G
BJ
 50000 7 10 6 5
500000 86 98
500000 106 108

249D
HDF
 500000 0 320
500000 0 467
50000 8 179 6 4

253F
HDF

 50000 5 78 3 2
50000 6 128 3 3
500000 10 531
500000 3 738
282C HDF 50000 11 224 3 1
282H BJ 50000 13 15 3 2
282R HFLS 5000 31 98 6 2
30일째에 사람의 ES 세포양 콜로니를 취하여, 효소처리를 행하지 않고 작은 덩어리로 기계적으로 흐트렸다. 5 x 105개의 선유아세포로부터 시작한 경우 디쉬는 300개를 넘는 입자상 콜로니에 의해 거의 덮였다. 몇 개의 사람 ES 세포양 콜로니가 입자상 콜로니 사이에 관찰되는 경우도 있었으나, 입자상 콜로니가 고밀도였으므로 사람의 ES 세포양 콜로니를 단리하는 것은 곤란하였다.
사람의 iPS 세포를 bFGF를 포함하는 영장류 ES 세포양 배지를 이용하여 SNL 공급세포 상에서 증식시켰는 바, 세포는 강하게 밀집된 평평한 콜로니를 형성하였다(참조: 도 10E). 각각의 세포는 큰 핵소체(nucleolinus)와 약간의 세포질(cytoplasm)을 특징으로 하는 사람의 ES 세포와 동일한 세포형태를 나타내었다(참조: 도 10F). 사람의 ES 세포의 경우와 마찬가지로, 콜로니의 중심에 자발성 분화(spontaneous differentiation)가 관찰되는 경우가 있었다(참조: 도 10G). 또한, 이들 세포는 사람의 ES 세포와 유사하여 공급세포 의존성을 나타내며, 젤라틴 코팅한 조직배양 플레이트에는 접착되지 않았다. 한편, 이들 세포는 메트리겔 코팅된 플레이스 상의 MEF조정 영장류 ES 세포용 배지(MEF-CM) 중에서는 미분화 상태를 유지하였으나, 비조정 영장류 ES 세포용 배지 중에서는 미분화 상태를 유지하지 않았다(참조: 도 11). 수립된 사람의 iPS 세포의 클론을 표 4에 정리하였다.
클론
 기원
 마커의 발현 다 능 성
RT-PCR IC EB PA6 심근세포 기형종
201B1
201B2
201B3
201B6
201B7

HDF

 √
√ √ √ √ √
√
√ √ √ √ √ √
√ √ √ √ √ √
243H1
243H7		 HFLS
 √ √
√ √ √ √
246B1
246B2
246B3
246B4
246B5
246B6


HDF

 √
√
√
√
√
√
246G1
246G3
246G4
246G5
246G6

BJ

 √ √ √ √
√ √ √
√
√ √
√
253F1
253F2
253F3
253F4
253F5

HDF

 √
√
√
√
√
IC: 면역조직화학(immunocytochemistry), EB: 배상체(embryoid body)
실시예 10: 사람 iPS 세포에 의한 사람 ES 세포 마커의 발현
면역염색 분석에 의해 사람의 iPS 세포는 SSEA-3, SSEA-4, TERA-1-60, TRA-1-81, 및 TRA-2-49/6E(알칼리 인산가수분해효소)를 함유하는 사람의 ES 세포 특이적 표면항원(참조: Adewumi et al., Nat. Biotechnol., 5, pp.803-816, 2007) 및 Nanog 단백의 발현을 나타내었다(참조: 도 10의 I 내지 N).
RT-PCR에 의해 사람의 iPS 세포는 미분화 ES 세포의 다수의 유전자 마커(예를 들어, Oct3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4 및 (hTERT) 등)을 사람 배아 암세포주 NTERA-2의 경우와 동등 이상의 수준으로 발현하고 있는 것으로 나타났다(참조: 도 12). 웨스턴 블롯의 결과로부터는 Oct3/4, Sox2, Nanog, Sall4, E-CADHERIN, 및 hTERT의 단백질 수준은 사람의 iPS 세포 및 사람의 ES 세포에 있어서 동등하였다(참조: 도 13A). 사람의 iPS 세포에 있어서의 염색체에 도입된 레트로바이러스로부터의 도입유전자의 발현은 효율적으로 불활화되어 있었으므로, 이들 유전자의 내인성 발현에 의존하고 있음이 시사되었다(참조: 도 13B).
실시예 11: 사람의 iPS 세포내에 있어서의 ES 세포 특이적 유전자 프로모터의 활성
바이설파이트 유전체 서열결정법에 의해 Oct3/4, REX1 및 Nanog 등의 다능성에 관여하는 유전자의 프로모터 영역에 있어서의 시토신 구아닌 뉴클레오티드(CpG)의 메틸화의 상태를 평가한 결과, 그 영역의 CpG 디뉴클레오티드는 유래원의 친(original parent) HDF(HDF)에 있어서는 고도로 메틸화되어 있음에 비해서, 사람의 iPS 세포(201B2, 201B6, 201B7)에서는 고도로 탈메틸화되어 있음이 판명되었다(참조: 도 14A). 이들 지견으로부터, 이들 프로모터가 사람의 iPS 세포에 있어서 활성화되어 있음이 시사되었다.
루시퍼라제 리포터 분석에 있어서도 사람의 Oct3/4 및 REX1 프로모터는 사람의 iPS 세포에 있어서는 고수준의 전사활성을 가졌으나, HDF에서는 가지지 않는 것으로 나타났다. 사람의 RNA 폴리머라제 Ⅱ(PolⅡ) 등의 보편적으로 발현하는 유전자의 프로모터 활성은 사람의 iPS 세포 및 HDF의 양쪽에서 동등한 활성을 나타내었다(참조: 도 14B).
실시예 12: 사람의 iPS 세포의 고텔로머라제 활성 및 지수함수적 증식
hTERT의 높은 발현수준으로부터 추측되는 바와 같이, 사람의 iPS 세포는 높은 텔로머라제 활성을 나타내었다(참조: 도 15A). 사람의 iPS 세포는 적어도 4개월간은 지수함수적으로 증식하였다(참조: 도 15B). 사람의 iPS 세포의 계산상의 배증시간(doubling time)은 46.9±12.4(클론 201B2), 47.8±6.6(201B6), 및 43.2±11.5(201B7)시간이었다(참조: 도 15B). 이들 시간은 이미 보고된 사람의 ES 세포의 배증시간(doubling time)과 동등하였다(참조: Cowan et al., N. Engl. J. Med., 350, pp. 1353-56, 2004).
실시예 13: HDF 유래 사람 iPS 세포의 교차오염(cross-contamination) 평가
사람 iPS 세포 게놈 DNA의 PCR에 의해 전 클론이 4종류 모든 레트로바이러스가 함입되는 것으로 나타났다(참조: 도 16A). c-Myc cDNA 프로브를 이용한 서던블롯 분석에 의해 각각의 클론이 레트로바이러스 함입 부위의 특유의 패턴을 가지는 것이 판명되었다(참조: 도 16B). 또한, 16의 쇼트 탠덤 리피트(short tendom repeat)의 패턴은 사람의 iPS 클론과 친(parent) HDF 사이에서 완전히 일치하였다. HDF 유래 iPS 세포의 STR 분석결과를 표 5에 나타내었다.
좌위/
클론		 201B1 201B2 201B3 201B6 201B7 NTERA-2 HDF
D3S1358 15 17 15 17 15 17 15 17 15 17 15 15 17
TH01 5 5 5 5 5 9 5
D21S11 28 28 28 28 28 29 30 28
D18S51 14 14 14 14 14 13 14
Penta_E 7 19 7 19 7 19 7 19 7 19 5 14 7 19
D5S818 11 11 11 11 11 8 11 11
D13S317 10 14 10 14 10 14 10 14 10 14 14 10 14
D7S820 9 10 9 10 9 10 9 10 9 10 12 9 10
D16S539 11 13 11 13 11 13 11 13 11 13 11 16 11 13
CSF1P0 10 10 10 10 10 9 11 10
Penta_D 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 11 12 8 10
AMEL X X X X X X Y X
vWA 15 18 15 18 15 18 15 18 15 18 19 15 18
D8S1179 8 10 8 10 8 10 8 10 8 10 13 15 8 10
TP0X 8 9 8 9 8 9 8 9 8 9 8 9 8 9
FGA 20 22 20 22 20 22 20 22 20 22 23 20 22
이들 패턴은 미국립보건원(National Institute of Health)의 웹사이트(http://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/genotyping.htm)에 게재되어 있는 수립된 사람의 iPS 세포주의 어느 것과도 달랐다. 또한, 염색체의 G횡무늬 분석에 의해 사람의 iPS 세포가 정상인 46XX 핵형(karyotype)을 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 사람의 iPS 클론은 HDF로부터 유래된 것이지, ES 세포의 오염(contamination)에 의한 것은 아니라고 결론내렸다.
실시예 14: 사람의 iPS 세포의 배양체를 통한 분화
실험실 조건에서의 사람 iPS 세포의 분화능을 결정하기 위하여, 부유배양을 이용하여 배상체(embryoid body: Eb)를 형성시켰다. 부유배양의 8일째 후 iPS 세포는 볼-모양(ball-like)의 구조를 형성하였다(참조: 도 17A). 이들 배상체양(embryoid body-like) 구조를 젤라틴 코팅한 플레이트에 옮겨, 8일간 더 배양하였다. 부착된 세포는 신경양 세포, 포석(paving stone)양 세포, 및 상피세포 등의 각종 세포형태를 나타내었다(참조: 도 17B-E). 면역조직 화학분석에 의해 βⅢ-튜블린(외배엽 마커), 글리아원선유 산성단백(GFAP, glia fibril acidic protein, 외배엽), α-평활근 액틴(α-SMA, 중배엽), 데스민(desmin, 중배엽), α-페토프로테인(내배엽), 및 비멘틴(vimentin, 중배엽 및 체벽(body wall)의 내배엽)에 대해서 양성의 세포가 검출되었다(참조: 도 17F-K). RT-PCR의 결과로부터, 이들 분화된 세포에 있어서 FOXA2(내배엽 마커), AFP(내배엽), 사이토케라틴 8 및 18(내배엽), SOX17(내배엽), BRACHYURY(중배엽), MSX1(중배엽), MAP2(외배엽), 및 PAX6(외배엽)이 발현되어 있음이 확인되었다(참조: 도 17L). 한편, Oct3/4, Sox2, 및 Nanog의 발현은 명백히 저감되어 있었다. 이들 결과로부터, iPS 세포가 3배엽계로 실험실 조건에서 분화할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 15: 사람의 iPS 세포의 신경세포로의 분화
사람의 iPS 세포로부터의 분화를 사람의 ES 세포에 대한 이미 보고된 방법에 의해 유도할 수 있는지의 여부를 검토하였다. PA6 공급세포층 위에 사람의 iPS 세포를 접종하고, 분화 조건하에서 3주동안 유지·배양하였다(참조: Kawasaki et al., Neuron, 28, pp.31-40, 2000). 세포는 크게 퍼져, 얼마간의 신경구조가 관찰되었다(참조: 도 18A). 면역조직 화학분석에 의해 배양물 중에 티로신히드록시나제 및 βⅢ-튜블린 양성세포가 검출되었다(참조: 도 18B). PCR 분석결과로부터, AADC, ChAT, DAT, 및 LMX1B 등의 도파민 작용성 신경마커, 및 다른 신경마커인 MAP2의 발현이 확인되었다(참조: 도 18C). 또한, Oct3/4, Sox2, 및 Nanog의 발현은 저감되었다(참조: 도 18C). 이들 결과로부터, iPS 세포가 PA6 세포와의 공배양(coculture)에 의해 도파민 작용성 뉴런을 포함하는 신경세포로 분화할 수 있음이 확인되었다.
실시예 16: 사람 iPS 세포의 심장세포로의 지향성 분화(directed differentiation)
액티빈 A 및 골형성인자(BMP) 4를 이용한 심장세포로의 분화에 관한 문헌(참조: Laflamme et al., Nat. Biotechnol., 25, pp.1015-24, 2007)을 이용하여, 사람의 iPS 세포의 심장으로의 분화를 검토하였다. 분화유도로부터 12일 후 세포덩어리는 고동(beating)을 시작하였다(참조: 도 18D). RT-PCR의 결과로부터, 이들 세포가 TnTc, MEF2C, NKX2.5, MYL2A, 및 MYHCB 등의 심근세포 마커를 발현하고 있는 것으로 나타났다(참조: 도 18E). 한편, Oct3/4, Sox2, 및 Nanog의 발현은 현저히 저감되어 있었다. 이들 결과로부터, 사람의 iPS 세포가 실험실 조건에서 심근세포로 분화할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 17: 사람의 iPS 세포로부터의 기형종 형성
생체조건에서의 다능성을 시험하기 위하여, 사람의 iPS 세포(클론 201B7)을 면역 부전(SCID) 마우스의 등쪽의 측복부에 피하 이식하였다. 9주간 후에 종양 형성이 관찰되었다. 조직학적 관찰에 의해 원장관양(archenteric canal-like) 상피조직(외배엽), 횡문근(striated muscle, 중배엽), 연골(근육), 신경조직(내배엽), 및 케라틴 함유 편평조직(내배엽)을 포함하는 각종 조직(참조: 도 19)이 종양에 포함되어 있는 것으로 나타났다.
실시예 18: 다른 사람의 체세포로부터의 iPS 세포의 작제
HDF이외에도, 성인 남성의 골막조직의 초대 사람(primary human) 유래의 선유아세포양 골막세포(HFLS) 및 신생아의 포피유래의 선유아세포로부터 수립된 세포주(BJ 세포) 신생아의 포피(neonate perputium) 유래의 선유아세포로부터 수립된 세포주를 사용하였다(참조: 표 3). HFLS(5 x 104 세포/100mm 디쉬)로부터 iPS 세포의 작제를 시도한 결과, 600개 이상의 입자상 콜로니 및 17개의 사람 ES 세포양 콜로니를 얻었다. 이들 17개의 콜로니 중 6 콜로니를 시험하였는 바, 그중 2 콜로니만이 증식가능하였다(참조: 도 20). 5 x 105의 HFLS를 접종한 디쉬는 입자상 콜로니로 덮여 있으며, 사람의 ES 세포양 콜로니는 확인할 수 없었다. 한편, BJ 세포로부터 iPS 세포의 작제를 시도한 결과, 5 x 104세포/100mm 디쉬로부터의 경우, 약간의 입자상 콜로니가 인정되었지만, 7 내지 13개의 사람의 ES 세포양 콜로니 및 5 x 105세포/100mm 디쉬의 경우에는 100개의 사람 ES 세포양 콜로니를 얻었다(표 3). 그 중, 6개의 사람의 ES 세포양 콜로니를 취하여, 5개의 콜로니로부터 iPS 세포를 확인하였다(참조: 도 20). HFLS 및 BJ로부터 유래된 사람의 iPS 세포는 사람의 ES 세포의 경우와 동등 이상의 수준으로, 사람의 ES 세포 마커 유전자를 발현하였다(참조: 도 21). 이들 사람의 iPS 세포는 EBs를 통해 삼배엽계로 분화하였다(참조: 도 22). STR 분석에 의해, iPS-HFLS 세포 및 iPS-BJ 세포는 각각 HFLS 및 BJ 세포에 유래함이 확인되었다. 표 6은 HFLS 유래 iPS 세포의 STR 분석결과를, 표 7은 BJ 유래 iPS 세포의 STR 분석결과를 각각 나타낸다.
좌위/
클론		 243H1 243H7 HFLS
D3S1358 16 17 16 17 16 17
TH01 5 9 5 9 5 9
D21S11 28 30 28 30 28 30
D18S51 14 17 14 17 14 17
Penta_E 5 12 5 12 5 12
D5S818 10 12 10 12 10 12
D13S317 13 13 13
D7S820 9 12 9 12 8 12
D16S539 11 13 11 13 11 13
CSF1P0 10 11 10 11 10 11
Penta_D 9 11 9 11 9 11
AMEL X X Y X Y
vWA 17 19 17 19 17 19
D8S1179 13 13 13
TP0X 8 11 8 11 8 11
FGA 21 22 21 22 21 22
좌위/
클론		 246G1 246G3 246G4 246G5 246G6 BJ
D3S1358 13 15 13 15 13 15 13 15 13 15 13 15
TH01 6 7 6 7 6 7 6 7 6 7 6 7
D21S11 28 28 28 28 28 28
D18S51 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18
Penta_E 7 17 7 17 7 17 7 17 7 17 7 17
D5S818 11 11 11 11 11 11
D13S317 9 10 9 10 9 10 9 10 9 10 9 10
D7S820 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12
D16S539 9 13 9 13 9 13 9 13 9 13 9 13
CSF1P0 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11
Penta_D 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12 11 12
AMEL X Y X Y X Y X Y X Y X Y
vWA 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18 16 18
D8S1179 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11 9 11
TP0X 10 11 10 11 10 11 10 11 10 11 10 11
FGA 22 23 22 23 22 23 22 23 22 23 22 23
이상의 결과로부터, 4종류의 유전자: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c/Myc의 레트로바이러스에 의한 유전자 도입에 의해 성체 HDF 및 다른 체세포로부터 iPS 세포를 작제할 수 있는 것으로 나타났다. 수립된 사람의 iPS 세포는 세포형태(cell morphology), 증식(proliferation), 공급세포 의존성(feeder cell dependency), 표면마커의 발현패턴(expression pattern of surface marker), 유전자 발현(gene expression), 프로모터 활성(promoter activity), 텔로머라제 활성(telomerase activity), 실험실 조건에서의 분화능(in vitro differentiation ability), 및 기형종 형성능(teratoma forming ability)을 포함한 여러 측면에서 사람의 ES 세포와 유사하였다. 또한, 4종류의 레트로바이러스는 사람의 iPS 세포 내에서 거의 완전히 불활화되었다. 이로부터, 이들 세포는 완전히 초기화되었으며(reprogrammed), 자기재생(self regeneration)에 의해 도입 유전자의 계속적인 발현에 의존하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 8 내지 18에 있어서의 실험재료 및 방법은 이하와 같다.
1. 세포배양
36세의 코카서스인(Caucasian) 여성의 얼굴 피부로부터 얻은 HDF 및 69세의 코카서스인 남성의 골막조직으로부터 얻은 HFL를 각각 셀어플리케이션사(Cell Applications, Inc.)로부터 입수하였다. 신생아의 포피로부터 얻은 BJ 선유아세포 및 NTERA-2 클론 D1 배아 암세포는 미합중국 종균협회(ATCC)로부터 입수하였다. 사람의 선유아세포 NTERA-2, PLAT-E, 및 PLAT-A 세포는 10% 우태아 혈청(FBS), 및 0.5% 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 둘베코의 개변 이글배지(DMEM, Nacalai Tesque)로 유지하였다. 293FT 세포는 10% FBS, 2mM L-글루타민(Invitrogen), 1 x 10-4 M 비필수 아미노산(Invitrogen), 및 1mM 피루빈산나트륨(Sigma), 및 0.5% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM으로 유지하였다. PA6 간질세포(Riken BioResource Center)는 10% FBS 및 0.5% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM으로 유지하였다. iPS 세포는 4ng/ml 재조합 사람의 염기성 선유아세포 성장인자(bFGF, Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)를 보충한 영장류 ES 세포용 배지(Reprocell, Inc.)로 수립 및 유지하였다. 계대(passage)에 있어서는, 사람의 iPS 세포는 PBS로 1회 세정하고, 그 후 37℃에서 1mg/ml 콜라게나제 Ⅳ(Invitrogen)을 포함하는 DMEM/F12에서 배양하였다. 디쉬의 테두리에 있는 콜로니가 저면으로부터 분리되기 시작했을 때, DMEM/F12/콜라게나제를 제거하고 사람의 ES 세포배지로 세정하였다. 세포를 긁어모아 15ml의 원추형 튜브에 회수하였다. 적당량의 배지를 첨가하고 SNL 공급세포 상에 새로운 디쉬에 옮겼다. 분할비(split ratio)는 항상 1:3으로 하였다. iPS 세포를 공급세포를 포함하지 않은 상태로 배양하기 위해서, 플레이트를 4℃에서 하룻밤 0.3mg/ml 매트리겔(BD Bioscience)로 코팅하였다. 플레이트는 사용 전에 실온으로 가온하였다. 미결합 매트리겔을 흡인 제거하여 DMEM/F12로 세정하였다. iPS 세포는 매트리겔 코팅된 플레이트 상에 4ng/ml의 bFGF를 보충한 MEF-조정 영장류 ES 세포용 배지(MEF-CM) 또는 MEF-비조정 영장류 ES 세포용 배지(Reprocell, Inc.)를 이용하여 접종하였다. 배지는 매일 교환하였다. MEF-CM의 제조를 위하여, ICR 마우스의 수정 후 13.5일째의 배아를 회수하여 얻은 MEF를, 1 x 106세포/100mm로 플레이트에 접종하여 하룻밤 배양하였다. 다음날 세포를 PBS로 1회 세정하고, 10ml의 영장류 ES 세포용 배지로 배양하였다. 24시간 배양 후 MEF 배양의 배양 상등액을 회수하여, 구멍직경 0.22μm의 필터로 여과하여 사용할 때까지 -20℃에서 보존하였다.
2. 플라스미드 구축
사람의 Oct3/4의 개방 해독틀을 RT-PCR에 의해 증폭하고, pCR2.1-TOPO에 클로닝하였다. pCR2.1-hOct3/4의 EcoRⅠ 절편을 pMXs 레트로바이러스 벡터의 EcoRⅠ 부위에 도입하였다. 각각의 실험을 구별하기 위하여, N20 바코드라고 명명한 20-bp의 랜덤서열을 Oct3/4 발현벡터의 NotⅠ/SalⅠ 부위에 도입하였다. 실험 중 오염을 방지하기 위하여, 각 실험에 있어서 특유의 바코드를 사용하였다. 사람의 Sox2, Klf4 및 c-Myc의 개방 해독틀도 RT-PCT에 의해 증폭하고, pENTR-D-TOPO(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. pENTR-D-TOPO에 서브클로닝한 전체 유전자를 게이트웨이 클로닝 시스템(Gateway Cloning System, Invitrogen)을 취급설명서에 따라 이용하여 pMXs 레트로바이러스 벡터에 도입하였다. 마우스 Slc7a1 개방 해독틀도 증폭하고, pENTR-D-TOPO에 서브클로닝하여 게이트웨이 클로닝시스템에 의해 pLenti6/UbC/V5-DEST(Invitrogen)에 도입하였다. 사람의 Oct3/4 유전자 및 REX1 유전자의 조절영역을 PCR에 의해 증폭하고, pCRXL-TOPO(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. PhOCT4-Luc 및 phREX1-Luc를 위하여, pCRXL 벡터로부터 KpnⅠ/BglⅡ 처리에 의해 제거한 절편을 pGV-BM2의 KpnⅠ/BglⅡ 부위에 서브클로닝하였다. pPolⅡ-Luc를 위하여, pQBⅠ-PolⅡ의 AatⅡ(평활 말단)/NheⅠ절편을 pGV-BM2의 KpnⅠ(평활 말단)/NheⅠ부위에 삽입하였다. 모든 절편을 서열결정에 의해 확인하였다. 프라이머 서열을 표 8(서열목록의 서열번호 45 내지 126)에 나타내었다.
프라이머 서열(5' -> 3' ) 응 용
hOct3/4-S944 CCC CAG GGC CCC ATT TTG GTA CC Oct3/4 Tg PCR
hSox2-S691 GGC ACC CCT GGC ATG GCT CTT GGC TC Sox2 Tg PCR
hKlf4-S1128 ACG ATC GTG GCC CCG GAA AAG GAC C Klf4 endo and Tg PCR
hMYC-S1011 CAA CAA CCG AAA ATG CAC CAG CCC CAG c-Myc Tg PCR
pMXs-AS3200 TTA TCG TCG ACC ACT GTG CTG CTG Tg PCR
pMXs-L3205 CCC TTT TTC TGG AGA CTA AAT AAA Tg PCR
hOct3/4-S1165 GAC AGG GGG AGG GGA GGA GCT AGG Endo Oct3/4
RT-PCR
hOct3/4-AS1283 CTT CCC TCC AAC CAG TTG CCC CAA AC
hSox2-S1430 GGG AAA TGG GAG GGG TGC AAA AGA GG Endo Sox2
RT-PCR
hSox2-AS1555 TTG CGT GAG TGT GGA TGG GAT TGG TG
ECAT4-macaca-968S CAG CCC CGA TTC TTC CAC CAG TCC C Nanog RT-PCR
ECAT4-macaca-1334s CGG AAG ATT CCC AGT CGG GTT CAC C
hGDF3-S243 CTT ATG CTA CGT AAA GGA GCT GGG GDF3 RT-PCR
hGDF3-AS850 GTG CCA ACC CAG GTC CCG GAA GTT
hREXI-RT-U CAG ATC CTA AAC AGC TCG CAG AAT REX1 RT-PCR
hREXI-RT-L GCG TAC GCA AAT TAA AGT CCA GA
hFGF4-RT-U CTA CAA CGC CTA CGA GTC CTA CA FGF4 RT-PCR
hFGF4-RT-L GTT GCA CCA GAA AAG TCA GAG TTG
hpH34-S40 ATA TCC CGC CGT GGG TGA AAG TTC ESGI RT-PCR
hpH34-AS259 ACT CAG CCA TGG ACT GGA GCA TCC
hECAT15-1-S532 GGA GCC GCC TGC CCT GGA AAA TTC DPPA4 RT-PCR
hECAT15-1-AS916 TTT TTC CTG ATA TTC TAT TCC CAT
hECAT15-2-S85 CCG TCC CCG CAA TCT CCT TCC ATC DPPA2 RT-PCR
hECAT15-2-AS667 ATG ATG CCA ACA TGG CTC CCG GTG
hTERT-S3234 CCT GCT CAA GCT GAC TCG ACA CCG TG hTERT RT-PCR
hTERT-AS3713 GGA AAA GCT GGC CCT GGG GTG GAG C
hKlf4-AS1826 TGA TTG TAG TGC TTT CTG GCT GGG CTC C Endo Klf4
RT-PCR
hMYC-S253 GCG TCC TGG GAA GGG AGA TCC GGA GC Endo c-Myc
RT-PCR
hMYC-AS555 TTG AGG GGC ATC GTC GCG GGA GGC TG
hMSX1-S665 CGA GAG GAC CCC GTG GAT GCA GAG MSXl RT-PCR
hMSX1-AS938 GGC GGC CAT CTT CAG CTT CTC CAG
hBRACHYURY-S1292 GCC CTC TCC CTC CCC TCC ACG CAC AG BRACHYURY/T
RT-PCR
hBRACHYURY-AS1540 CGG CGC CGT TGC TCA CAG ACC ACA GG
hGFAP-S1040 GGC CCG CCA CTT GCA GGA GTA CCA GG GFAP RT-PCR
hGFAP-AS1342 CTT CTG CTC GGG CCC CTC ATG AGA CG
hPAX6-S1206 ACC CAT TAT CCA GAT GTG TTT GCC CGA G PAX6 RT-PCR
hPAX6-AS1497 ATG GTG AAG CTG GGC ATA GGC GGC AG
hFOXA2-S208 TGG GAG CGG TGA AGA TGG AAG GGC AC FOXA2 RT-PCR
hFOXA2-AS398 TCA TGC CAG CGC CCA CGT ACG ACG AC
hSOX17-S423 CGC TTT CAT GGT GTG GGC TAA GGA CG SOX17 RT-PCR
hSOX17-AS583 TAG TTG GGG TGG TCC TGC ATG TGC TG
hAADC-S1378 CGC CAG GAT CCC CGC TTT GAA ATC TG AADC RT-PCR
hAADC-AS1594 TCG GCC GCC AGC TCT TTG ATG TGT TC
hChAT-S1360 GGA GGC GTG GAG CTC AGC GAC ACC ChAT RT-PCR
hChAT-AS1592 CGG GGA GCT CGC TGA CGG AGT CTG
hMAP2-S5401 CAG GTG GCG GAC GTG TGA AAA TTG AGA
GTG
MAP2 RT-PCR
hMAP2-AS5587 CAC GCT GGA TCT GCC TGG GGA CTG TG
hDAT-S 1935 ACA GAG GGG AGG TGC GCC AGT TCA CG SLC6A3/DAT
RT-PCR
hDAT-AS2207 ACG GGG TGG ACC TCG CTG CAC AGA TC
hLMX1B-S770 GGC ACC AGC AGC AGC AGG AGC AGC AG LMXlB RT-PCR
hLMXIB-AS1020 CCA CGT CTG AGG AGC CGA GGA AGC AG
hMYL2A-S258 GGG CCC CAT CAA CTT CAC CGT CTT CC MYL2A RT-PCR
hMYL2A-AS468 TGT ACT CGA TGT TCC CCG CCA GGT CC
hTnTc-S524 ATG AGC GGG AGA AGG AGC GGC AGA AC TnTc RT-PCR
hTnTc-AS730 TCA ATG GCC AGC ACC TTC CTC CTC TC
hMEF2C-S1407 TTT AAC ACC GCC AGC GCT CTT CAC CTT G MEF2C RT-PCR
hMEF2C-AS1618 TCG TGG CGC GTG TGT TGT GGG TAT CTC G
hMYHCB-S5582 CTG GAG GCC GAG CAG AAG CGC AAC G MYHCB RT-PCR
hMYHCB-AS5815 GTC CGC CCG CTC CTC TGC CTC ATC C
dT20 TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT Reverse
transcription
hMYC-S857 GCC ACA GCA AAC CTC CTC ACA GCC CAC Southern blot
probe
hMYC-AS1246 CTC GTC GTT TCC GCA ACA AGT CCT CTT C
hOct3/4-S CAC CAT GGC GGG ACA CCT GGC TTC AG Oct3/4 cloning
hOct3/4-AS ACC TCA GTT TGA ATG CAT GGG AGA GC
hSox2-S CAC CAT GTA CAA CAT GAT GGA GAC GGA
GCT G
Sox2 cloning
hSox2-AS TCA CAT GTG TGA GAG GGG CAG TGT GC
hKlf4-S CAC CAT GGC TGT CAG TGA CGC GCT GCT
CCC
Klf4 cloning
hKlf4-AS TTA AAA ATG TCT CTT CAT GTG TAA GGC
GAG
hMYC-S CAC CAT GCC CCT CAA CGT TAG CTT CAC
CAA
c-Myc cloning
hMYC-AS TCA CGC ACA AGA GTT CCG TAG CTG TTC
AAG
Slc7al-S CAC CAT GGG CTG CAA AAA CCT GCT CGG Mouse Slc7al
cloning
Slc7al-AS TCA TTT GCA CTG GTC CAA GTT GCT GTC
hREX1-pro5K-S ATT GTC GAC GGG GAT TTG GCA GGG TCA
CAG GAC


Promoter cloning
hREXxl-pro5K-AS CCC AGA TCT CCA ATG CCA CCT CCT CCC
AAA CG
hOct3/4-pro5K-S CACTCG AGG TGG AGG AGC TGA GGG CAC
TGT GG
hOct3/4-pro5K-AS CAC AGA TCT GAA ATG AGG GCT TGC GAA
GGG AC
mehREX1-F1-S GGT TTA AAA GGG TAA ATG TGA TTA TAT
TTA
Bisulfite
sequencing




mehREX1-F1-AS CAA ACT ACA ACC ACC CAT CAA C
mehOct3/4 F2-S GAG GTT GGA GTA GAA GGA TTG TTT TGG
TTT
mehOct3/4 F2-AS CCC CCC TAA CCC ATC ACC TCC ACC ACC
TAA
mehNanog-FI-S TGG TTA GGT TGG TTT TAA ATT TTT G
mehNanog-FI-AS AAC CCA CCC TTA TAA ATT CTC AAT TA
3. 렌티바이러스 작제 및 감염
6 x 106세포의 293FT 세포(Invitrogen)을 100mm 디쉬에 접종하여 하룻밤 배양하였다. 리포펙트아민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 취급설명서에 따라, 293FT 세포에 9μg의 비라파워 패키징 믹스(Virapower packaging mix)와 함께 3μg의 pLenti6/UbC-Slc7a를 형질전이시켰다. 형질전이한 다음 날, 배지를 교환하였다. 또한, 24시간 후 상등액을 회수하여 구멍직경 0.45μm의 셀룰로스아세테이트 필터(Whatman)에 의해 여과하였다. 유전자 도입 1일 전에 사람의 선유아세포를 8 x 105세포/100mm 디쉬로 접종하였다. 배지를 4μg/ml 폴리브렌(Nacalai Tesque)를 보충한 바이러스 함유 상등액을 이용하여 치환하여 24시간 배양하였다.
4. 렌티바이러스 감염 및 iPS 세포의 작제
PLAT-E 패키징 세포를 8 x 106세포/100mm 디쉬에 접종하여 하롯밤 배양하였다. 다음날 PLAT-E 세포에 Fugene6 형질전이 시약(Roche)을 이용하여 pMXs 벡터를 형질전이시켰다. 형질전이 24시간 후 새로운 배지와 교환하고, 24시간 후에 배양 상등액을 바이러스 함유액으로서 회수하였다. 유전자 도입 하루 전, 마우스 Slc7a1 유전자를 발현하고 있는 사람의 선유아세포(HDFa-Slc7a1)를 8 x 105세포/100mm 디쉬로 조정하여 접종하였다. 바이러스 함유액을 구멍직경 0.45μm 필터에 의해 여과하고, 4μg/ml 폴리브렌(polybrene)을 보충하였다. 4종류의 레트로바이러스를 각각 함유하는 동량의 상등액을 혼합하여, HDFa-Slc7a1의 디쉬에 옮겨 하룻밤 감염시켰다. 24시간 후 바이러스를 함유하는 상등액을 제거하고, 새로운 배지와 교환하였다. 6일 후 HDFa-Slc7a1 세포를 트립신 처리에 의해 채취하고, SNL 공급세포층 위에 5 x 104세포/100mm 디쉬로 조정하여 재차 접종하였다. 그 다음날, 배지를 4ng/ml bFGF를 보충한 영장류 ES 세포용 배지로 교환하였다. 배지는 하루걸러 교환하였다. 유전자 도입 30일 후 콜로니를 채취하여 0.2ml의 영장류 ES 세포배지로 옮겼다. 콜로니를 약한 피펫팅에 의해 작은 덩어리로 기계적으로 분리하였다. 이 세포현탁액을 SNL 공급세포를 미리 접종한 24 웰플레이트 상으로 옮겼다. 이 단계를 계대수(passage number) 1로 하였다.
5. RNA 단리 및 역전사
총세포 RNA를 트라이졸(Triazol) 시약(Invitrogen)에 의해 추출하고, 게놈 DNA의 혼재를 제거하기 위하여, 터보 DNA 프리키트(Turbo DNA Frr Kit, Ambion)로 처리하였다. 1μg의 총세포 RNA를 이용하여 Rever Tra Ace-α(東洋紡) 및 dT20 프라이머를 취급설명서에 따라, 역전사 반응을 행하였다. PCR은 ExTaq(Takara)로 행하였다. 정량적 PCR은 플래티넘 SYBR 그린 qPCR 수퍼믹스 UDG(Invitrogen)를 이용하여, 7300 리얼타임 PCR 시스템(Applied Biosystems, Inc.)에 의해 분석하였다. 프라이머 서열을 표 8에 나타내었다.
6. 알칼리 인산가수분해효소 염색 및 면역조직 화학분석
알칼리 인산가수분해효소 염색은 백혈구 알칼리 인산가수분해효소 키트(Sigma)를 이용하여 알칼리 인산가수분해효소 염색을 행하였다. 면역조직 화학분석을 위하여, 세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 의해 고정하였다. PBS로 세정 후, 세포를 실온에서 45분간, 5% 정상 염소 또는 당나귀 혈청(Chemicon), 1% 소혈청 알부민(BSA, Nacalai Tesque), 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 처리하였다. 1차 항체로서 SSEA1(1:100으로 희석, Developmental Studies Hybridoma Bank), SSEA3(1:10으로 희석, Dr. Peter W. Andrews로부터 기증), SSEA4(1:100으로 희석, Developmental Studies Hybridoma Bank), TRA-2-49/6E(1:20으로 희석, Developmental Studies Hybridoma Bank), TRA-1-60(1:50으로 희석, Dr. Peter W. Andrews로부터 기증), TRA-1-81(1:50으로 희석, Dr. Peter W. Andrews로부터 기증), Nanog(1:20으로 희석, AF1997, R&D Systems), βⅢ-튜블린(1:100으로 희석, CB412, Chemicon), 글리아 원선유 산성단백(1:500으로 희석, Z0334, Dako), α-평활근 액틴(희석완료, N1584, Dako), 데스민(1:100으로 희석, Lab Vision), 비멘틴(1:100으로 희석, SC-6260, Santa Cruz), α-페토프로테인(1:100으로 희석, MAB1368, R&D Systems), 티로신하이드록시라제(1:100으로 희석, AB152, Chemicon)을 사용하였다. 2차 항원은 시아닌3(cyanine3: Cy3) 결합 염소 항랫트 IgM(1:500 희석, Jacson Immno Research), Alexa546 결합 염소 항마우스 IgM(1:500 희석, Invitrogen), Alexa488 결합 염소 항토끼 IgG(1:500 희석, Invitrogen), Alexa488 결합 당나귀 항염소 IgG(1:500 희석, Invitrogen), Cy3 결합 염소 항마우스 IgG(1:500으로 희석, Chemicon), 및 Alexa488 결합 염소 항마우스 IgG(1:500 희석, Invitrogen)을 사용하였다. 핵은 1μg/ml의 Hoechst 33342(Invitrogen)로 염색하였다.
7. 실험실 조건에서의 분화
사람의 iPS 세포를 콜라게나제 Ⅳ로 처리한 후, 히드록시에틸 메타클릴레이트(hydroxyethyl methacrylate)로 코팅한 디쉬로 옮겨, 20% KSR(Invitrogen), 2mM L-글루타민, 1 x 10-4 M 비필수 아미노산, 1 x 10-4 M 2-머캡토에탄올(Invitrogen) 및 0.5%의 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12 배지로 부유배양하여 배상체(EBs)를 형성하였다. 배지는 하루 걸러 교환하였다. 부유배양의 8일 후 EBs를 젤라틴 코팅한 플레이트로 옮겨 동일 배지 중에서 8일간 더 배양하였다.
도파민 작용성 뉴런(dopaminergic neuron)으로의 분화를 위해, 우선 PA6 공급세포를 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트 상에 접종하여, 컨플루언트(confluent)가 될 때까지 4일간 배양하였다. EBs를 통해 배양된 iPS 세포의 작은 덩어리를 PA6 공급세포층 상에 가하여, 10% KSR(Invitrogen), 1 x 10-4 M 비필수 아미노산, 및 1 x 10-4 M 2-머캡토에탄올(Invitrogen) 및 0.5%의 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 글래스고우 최소필수배지(Glasgow Minimum Essential medium, Invitrogen)를 이용하여 배양하였다.
심근세포로의 분화를 위해서는, iPS 세포를 매트리겔 코팅된 플레이트 상에서 4ng/ml bFGF를 보충한 MEF-CM 중에 6일간 유지하였다. 그 후 RPMI1640에 B27 서플리멘트(Invitrogen)를 보충한 배지(RPMⅠ/B27)에 100ng/ml 사람 재조합 액티빈A(R&D Systems)를 첨가한 배지를 이용하여 24시간 배양하고, 이어서 10ng/ml 사람 재조합 골형성인자 4(BMP4, R&D Systems)을 보충하여 4일간 더 두었다. 사이토카인에 의한 자극 후, 세포는 사이토카인 없이 RPMⅠ/B27 중에 유지하였다. 배지는 하루 걸러 교환하였다.
8. 바이설파이트 서열결정법
게놈 DNA(1μg)를 Cp게놈 DNA 수식키트(Chemicon)를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 처리하였다. 처리한 DNA를 QIA 퀵 컬럼(QIAGEN)에 의해 정제하였다. 사람의 Oct3/4, Nanog, 및 Rex1유전자의 프로모터 영역을 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 산물을 pCR2.1-TOPO에 서브클로닝하였다. 각각의 시료의 10클론을 M13 유니버설 프라이머를 이용하여 서열을 결정하였다. PCR 증폭에 사용한 프라이머 서열을 표 8에 나타내었다.
9. 루시퍼라제 분석
반딧불 루시퍼라제 유전자를 포함하는 각각의 리포터 플라스미드(1μg)를 50ng의 pRL-TK(Promega)를 이용하여 사람의 iPS 세포 또는 HDF에 도입하였다. 유전자 도입의 48시간 후, 세포를 1 x Passive lysis buffer(Promega)에 의해 용해하고, 실온에서 15분간 배양하였다. 루시퍼라제 활성을 Dual 루시퍼라제 리포터 분석 시스템(Promega) 및 Centro LB 960 검출시스템(Barthold)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다.
10. 기형종 형성
세포를 콜라게나제 Ⅳ 처리에 의해 채취하고, 튜브로 회수하고 원심분리하여 펠렛을 DMEM/F12로 현탁하였다. 컨플루언트한 100mm 디쉬로부터 수득한 세포의 4분의 1을 SCID 마우스(Clea Japan)의 등측의 측복부에 피하주사하였다. 9주간 후에 종양을 절제하여 중량을 측정하고, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS에 의해 고정하였다. 파라핀 포매한 조직을 세절하여 헤마톡실린-에오신 염색을 행하였다.
11. 웨스턴블롯
세미콘플루언트(semiconfluent) 상태에 있는 세포를 프로테아제 저해제 칵테일(Roche)을 보충한 RIPA 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40(NP-40), 1% 데옥시콜산나트륨 및 0.1% SDS)에 의해 용해하였다. MEL-1 사람의 ES 세포주의 세포용해물을 애브캄사(Abcam)로부터 입수하였다. 세포용해물(20μg)을 8% 또는 12% SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오리드막(Millipore)으로 옮겼다. 막은 1% 스킴밀크를 포함하는 TBST(20mM Tris-HCl, pH 7.6, 136 mM NaCl, 및 0.1% Tween-20)를 차단시키고, 하룻밤 4℃로 1차 항체를 반응시켰다. TBST에 의한 세정 후, 막을 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 결합 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 반응시켰다. 시그날을 임모빌론 웨스턴(Immobilon Western) 화학발광 HRP 기질(Millipore) 및 LAS3000 이미지화 시스템(Fuji Film)에 의해 검출하였다. 1차 항체로서는 항 Oct3/4(1:600으로 희석, SC-5279, Santa Cruz), 항 Sox2(1:2000으로 희석, AB5603, Chemicon), 항 Nanog(1:200으로 희석, R&D Systems), 항 Klf4(1:200으로 희석, SC-20691, Santa Cruz), 항 c-Myc(1:200으로 희석, SC-764, Santa Cruz), 항 E-cadherin(1:1000으로 희석, 610182, BD Bioscience), 항 Dppa4(1:500으로 희석, ab31648, Abcam), 항 FoxD3(1:200으로 희석, AB5687, Chemicon), 항 텔로머라제(1:1000으로 희석, ab23699, Abcam), 항 Sall4(1:400으로 희석, ab29112, Abcam), 항 Lin28(1:500으로 희석, AF3757, R&D Systems), 항 β액틴(1:5000으로 희석, A5441, Sigma), 2차 항체로서는 항마우스 IgG-HRP(1:3000 희석, #7076, Cell Signaling), 항토끼 IgG-HRP(1:2000으로 희석, #7074, Cell Signaling), 및 항염소 IgG-HRP(1:3000으로 희석, SC-2056, Santa Cruz)를 사용하였다.
12. 서던 블롯
게놈 DNA(5μg)을 BglⅡ, EcoRⅠ, 및 NcoⅠ로 하룻밤 처리하고, DNA 절편을 0.8% 아가로스겔로 분리하여, 나일론막(Amersham)으로 옮겼다. 막을 디곡시게닌(DIG, digoxigenin)으로 표지한 DNA 프로브와 함께 DIG Easy Hyb 완충액(Roche) 중에서 일정 진탕하에 42℃로 하룻밤 반응시켰다. 세정 후 알칼리 인산가수분해효소 결합 항 DIG 항체(1:10000으로 희석, Roche)를 막에 첨가하였다. 시그널은 CDP스타(Roche)에 의해 증강시켜, LAS3000 이미지화 시스템에 의해 검출하였다.
13. 쇼트 탠덤 리피트 분석 및 핵형 분석(karyotyping)
게놈 DNA를 이용하여 파워플렉스 16 시스템(Promega)에 의해 PCR을 행하여, ABI PRISM 3100 Genetic analyzer 및 Gene Mapper v3.5(Applied Biosystems, Inc.)에 의해 분석하였다. 염색체 G 밴드 분석은 일본유전자연구소(일본)에서 행하였다.
14. 텔로머라제 활성의 검출
텔로머라제 활성은 TRAPEZE 텔로머라제 검출키트(Chemicon)로 취급설명서에 따라 검출하였다. 시료는 TBE를 베이스로 한 10% 아크릴아미드 비변성겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔은 SYBR 골드(1:10000으로 희석, Invitrogen)로 염색하였다.
15. 크로마틴(Chromatin) 면역 침강 분석
약 1 x 107개의 세포를 실온하에서 1% 포름알데히드로 5분간 가교하고, 글리신 첨가에 의해 반응을 정지하였다. 세포 용혈물을 초음파 처리함으로써 크로마틴-DNA 복합체를 절단하였다. Dynabeads Protein G(Invitrogen) 결합 항트리메틸 Lys4 히스톤 H3(07-473, Upstate), 항트리메틸 Lys27 히스톤 H3(07-449, Upstate), 또는 정상 토끼 IgG항체를 이용하여 면역 침강을 행하였다. 용출액을 정량적 PCR의 주형으로 이용하였다.
16. DNA 마이크로어레이
HDF 및 hiPS 세포(클론 201B)로부터의 총세포 RNA를 Cy3에 의해 표지하였다. 시료를 전체 사람 게놈 마이크로어레이 4x44K(G4112F, Agilent)와 혼성화시켰다. 각 시료는 하나의 칼라 프로토콜과 1회 혼성화시켰다, 어레이를 G2565BA 마이크로어레이 스캐너 시스템(Agilent)을 이용하여 스캔하고, 데이터를 GeneSpringGX 7.3.1 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 2종의 표준화 방법을 적용하였다. 우선, 0.01 미만의 시그널 강도를 0.01로 설정하고, 이어 각 칩을 그 칩으로부터 수득한 측정의 50번째의 백분위수로 표준화하였다. hES H9세포의 마이크로어레이데이터(참조: Tesar et al., Nature, 448, pp.196-199, 2007)을 GEO DataSets(GSM194390,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez db=gds&cmd=search&term=GSE7902)로부터 회수하였다. 3가지의 모든 시료에 있어서 "Present”플랙값(flag value)를 가지는 유전자를 분석에 이용하였다(32,266개의 유전자). HDF 및 hiPS 세포의 마이크로어레이 데이터를 GEO DataSets에 등록번호 GSE9561로서 등록하였다.
실시예 19: c-Myc를 이용하지 않은 iPS 세포의 수립
Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc를 마우스 선유아세포에 레트로바이러스를 이용하여 도입함으로써 수득한 마우스 iPS 세포(참조: Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-76, 2006)의 iPS 클론은 각 유전자에 대해서 수개의 레트로바이러스의 함입을 포함한다. 각 클론은 모두 20을 넘는 레트로바이러스의 도입부위를 가지고 있으며, 종양 형성의 위험을 증대시킬 가능성이 있다. 마우스 iPS 세포의 경우, iPS 세포로부터 유래된 키메라 마우스 및 그 자손의 내지 20%에 있어서 종양이 발생하는 것이 공지되어 있으며(참조; Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007), c-Myc 레트로바이러스의 재활성화는 iPS 세포를 이용하여 작제한 키메라 마우스 및 그 자손 마우스에 있어서 종양 형성 발생율을 증가시킬 가능성이 있다. 따라서, c-Myc를 이용하지 않고 iPS 세포를 수립하는 방법을 검토하였다.
또한, Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 4종류의 유전자의 패밀리 유전자를 이용하여 iPS 세포를 수립할 수 있는지의 여부를 검토하였다. 이 목적을 위하여, Nanog 유전자 조절요소에 의해 조절되는 녹색형광 단백질(GFP)-IRES-Puror 도입유전자를 포함하는 마우스 배아성 선유아세포(MEF)를 사용하였다(참조: Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007). Nanog는 마우스 ES 세포 및 착상전(preimplantation) 태아세포에 있어서 특이적으로 발현하므로(참조; Chambers et at., Cell, 113, pp.643-655, 2003; Mitsui et al., Cell,113, pp.631-642, 2003), iPS 세포 유도에 있어서의 선택 마커로서 유용하다. 초기화 유도되면 GFP가 발현되고, 이것이 iPS 세포라는 지표가 된다. Nanog로 선택한 iPS 세포는 ES 세포와 구별할 수 없으며, 생식계열에 기여하는(germline-competent) 키메라 마우스를 작제하는 것으로 나타났다(참조: Werning et al., Nature, 448, pp.318-324, 2007; Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007; Maherali et al., Cell Stem Cell, 1, pp. 55-70, 2007).
Oct3/4는 POU 도메인을 포함하는 Oct 패밀리 전사인자에 속한다(참조: Ryan et al.,Genes Dev 11: 1207-25, 1997). Oct3/4에 가장 가까운 동족체(homologue)는 Oct1 및 Oct6이다. Oct3/4, Oct1 또는 Oct6을 나머지 3개의 유전자와 함께 레트로바이러스에 의해 Nanog 리포터 MEF에 도입하였다. Oct3/4를 이용한 경우, 많은 GFP 양성 콜로니가 관찰되었다(참조: 도 23a).
Sox2는 고이동군(high-mobility group: HMG) 도메인의 존재에 의해 특징지워지는 Sox(SRY 관련 HMG 박스) 전사인자에 속한다(참조: Schepers et al., Dev. Cell, 3, pp.167-170, 2002). Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, 및 Sox18에 대해서 시험을 행하고, Sox1을 이용한 경우에 GFP 양성 콜로니가 얻어졌다. 또한, Sox3, Sox15, 및 Sox18를 이용한 경우도 소수의 GFP 양성 콜로니가 얻어졌다(참조: 도 23a).
Klf4는 손가락 모양(digitate) 파리 배아 패턴 조절인자 Kruppel의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아연 핑거 단백질인 Kruppel양 인자(Klf, Kruppel-like factor)에 속한다(참조: Dang et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 32, pp.1103-1121, 2000). Klf1, Klf2, 및 Klf5에 대해서 시험을 행하고, Klf2를 이용한 경우에 GFP 발현 콜로니가 얻어졌다(참조: 도 23a). Klf1 및 Klf5를 이용한 경우에도 iPS 세포를 유도할 수 있었다.
c-Myc에는 2종류의 관련하는 유전자(N-Myc 및 L-Myc)가 존재하는(참조: Adhikary et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 6, pp.635-645, 2005). N-Myc 또는 L-Myc를 이용함으로써 GFP 양성 콜로니가 출현하였다(참조: 도 23a). 따라서, 4개의 유전자의 패밀리 유전자를 이용함으로써, iPS 세포를 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
패밀리 유전자에 대해서 β geo가 Fbx15개의 유전자좌에 넉인된 MEF(참조: Tokuzawa et al., Mol. Cell Biol., 23, pp.2699-2708, 2003)로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는지의 여부를 검토한 바, Nanog에 따른 선택에서 수득한 결과와 유사한 결과가 얻어졌다. 즉 Sox2는 Sox1 또는 Sox3으로 치환할 수 있으며, Klf4는 Klf2로 치환할 수 있으며, 또한, c-Myc는 N-Myc 또는 L-Myc로 치환할 수 있었다. 패밀리 유전자를 이용하여 작제된 세포는 증식가능하며, ES 세포와 구별이 불가능한 형태를 나타냄과 동시에, 누드마우스에 있어서 기형종을 형성하였다(참조: 도 24). 따라서, 이들 패밀리 유전자가 Nanog 리포터 MEF 및 Fbx15 리포터 MEF의 양쪽으로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
Nanog 리포터 MEF로부터 수개의 ES 세포양 GFP 양성 콜로니가 c-Myc를 이용하지 않고 얻어졌다(참조: 도 23a). 이전에 오키다(Okita) 등은 GFP 양성 콜로니가 c-Myc 없이는 얻어지지 않음을 보고하였으나(참조: Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007), 이 간행물에 보고된 방법과 상기 방법과의 차이점의 하나는 약제에 의한 선별시기에 있다. 상기 간행물에 기재된 방법에서는 퓨로마이신 선별을 유전자 도입의 7일 후에 개시하고 있으나, 금번 방법에서는 약제에 의한 선별을 14일째에 개시하였다. Nanog 리포터 MEF에 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 또는 c-Myc를 제외한 3개의 유전자의 어느 한가지를 도입하여 유전자 도입의 7일 후, 14일 후, 또는 21일 후에 퓨로마이신 선별을 개시하였다(참조: 도 23b). 4개의 유전자를 이용한 경우에는, GFP 양성 콜로니가 모든 조건에서 관찰되며, 퓨로마이신 선별을 지연시킨 경우에는, 콜로니수가 현저히 증가하였다. c-Myc를 이용하지 않는 경우, 선택을 유전자 도입의 7일 후에 개시한 경우에는 GFP 양성 콜로니는 관찰되지 않았으나, 선택을 유전자 도입의 14일 후 또는 21일 후에 개시한 경우에는 GFP 양성 콜로니가 출현하였다. 콜로니수는 각 조건에 있어서 4개의 유전자를 이용하는 경우보다도 3개의 유전자를 이용하는 경우의 쪽이 적었다. c-Myc 레트로바이러스 이외의 3개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4)를 도입함으로써 수득한 Nanog로 선택한 iPS 세포는 ES 세포 마커 유전자를 ES 세포의 경우의 수준에 필적하는 수준으로 발현하며(참조: 도 25), 배반포(blastocyst)로 이식한 경우에 성체의 키메라 마우스를 작제할 수 있었다(표 9).
iPS 콜로니 유래의 유전자형 선 택 주입된 배반포 탄생 마우스 키메라 마우스
142B-6 MEF-FB/GFP
 G418 39 7 3
142B-12 46 12 5
178B-1 MEF-Ng


 Puro


 156 50 5
178B-2 142 43 17
178B-5 60 20 5
178B-6 28 10 4
256H-4 TTF-ACTB-DsRed

 No

 72 6 5
256H-13 96 8 5
256H-18 90 17 11
iPS 클론은 전부 MEF 또는 TTF로 부터 MYC를 제외한 3가지 유전자로 유도하였다.
*FB: Fbx15-βgeo 리포터;
Ng: Nanog-GFP-IRES-Puror 리포터;
GFP: CAG-EGFP
또 다른 차이점은 c-Myc를 제외한 3개의 유전자를 이용하여 iPS 세포를 유도한 경우에는, GPF 양성 콜로니 및 백그라운드 세포(background cell)의 수가 4개의 유전자를 도입한 경우보다도 적다는 것이다(참조: 도 23c). 따라서, c-Myc를 이용하지 않고 iPS 세포를 유도하는 방법은, c-Myc를 이용하는 iPS 세포유도에 비해 늦음과 동시에 효율이 저하되지만, iPS 세포유도의 특이성은 향상된다는 이점이 있다.
β geo가 Fbx15개의 유전자좌에 넉인된 MEF(참조: Tokuzawa et al., Mol. Cell Biol., 23, pp.2699-2708, 2003)로부터 c-Myc를 이용하지 않고 수개의 iPS 세포를 생성할 수 있었다(참조: 도 26A). 이전에 다카하시(Takahashi) 등은 iPS 세포는 c-Myc 없이는 얻어지지 않음을 보고하였으나(참조: Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-676, 2006), 이 간행물에서 보고된 방법과 상기 방법에 있어서 G418선택은 동일한 타이밍, 즉 유전자 도입의 3일 후에 개시한다. 그러나, 상기 간행물에서 보고된 방법에서는 콜로니를 유전자 도입의 14-21일 후에 선택하고 있음에 비해서, 금번 실험에서는 약 30일 후에 콜로니 선택을 행하였다. 또한, 금번 실험에 있어서는, 4개의 유전자(또는 3개의 유전자)를 포함하는 레트로바이러스를 각각 독립하여 PLAT-E 세포(참조: Morita et al., Gene Ther., 7, pp.1063-1066, 2000)을 이용하여 따로 따로 제조하였다. 이러한 조작에 의해 레트로바이러스의 형질전이 효율이 개선되고 있으며, 4개의 유전자의 모두를 단일 Plat-E 세포로 제조한 이미 보고된 방법에 비해 iPS 세포 콜로니수의 현저한 증가가 관찰되었다.
4개의 유전자를 이용하여 작제한 Fbx15 선택에 의한 iPS 세포에서는 ES 세포 마커 유전자의 발현수준은 ES 세포에 비해 저수준이다(참조: Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-676, 2006). 이 iPS 세포는 배반포에 미세주입한 경우에 성체의 키메라 마우스를 작출할 수 없으나, c-Myc를 이용하지 않고 작제한 iPS 세포는 Fbx15 선택을 이용한 경우에 있어서도 ES 세포에 필적하는 수준으로 ES 세포 마커 유전자를 발현하였다(참조: 도 26B). 또한, c-Myc를 이용하지 않고 작제한 iPS 세포로부터는 성체의 키메라 마우스가 높은 iPS 세포 기여율(cell contribution rate)로 얻어졌다(참조: 도 27, 표 9). 종양 형성의 발생율 증가는 이들 키메라 마우스에 있어서는 관찰되지 않았다. 즉, 4개의 유전자에 의해 수립한 iPS 세포 유래의 키메라 마우스는 생후 100일 이내에 37마리 중 6마리의 키메라 마우스가 종양이 원인이 되어 사망하였으나, c-Myc가 없는 3개의 유전자에 의해 수립한 iPS 세포 유래의 키메라 마우스는 26마리의 키메라 모두가 관찰 기간내(4개월보다 짧은 기간) 생존하였으므로, c-Myc를 이용하지 않음으로써 종양형성(tumorigenesis)의 위험성이 감소됨이 명백해졌다.
c-Myc를 이용하지 않음과 동시에, 약제에 의한 선별없이 iPS 세포를 효율적으로 단리할 수 있는지의 여부를 조사하였다. 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 또는 c-Myc를 제외한 3개의 유전자를 Nanog 리포터를 포함하는 성체의 테일팁 선유아세포(tail tip fibroblasts, TTF)에 도입하여, 퓨로마이신 선별을 적용하지 않고 배양을 계속하였다. 유전자 도입된 세포를 시각화하기 위하여, DsRed 레트로바이러스를 4개의 유전자 또는 3개의 유전자와 함께 도입하였다. 레트로바이러스 도입의 30일 후, 4개의 유전자를 이용하여 유전자 도입한 디쉬는 다수의 GFP 음성 콜로니 및 백그라운드 세포로 덮였다(참조: 도 28A, 표 10: Nanog-GFP 리포터 TTF+약제에 의한 선별 무). 표 중의 괄호 내의 수치는 GFP 양성 콜로니 또는 클론의 수를 나타낸다. 레트로바이러스(Oct3/4, Sox2, Klf4,(c-Myc), 및 DsRed)의 비율은, No.256에 있어서 1;1:1:(1):4, No.272 및 309에 있어서 1:1:1:(1):1이었다. No.220에 있어서는 DsRed를 도입하지 않았다.
실험번호 유전자 접종
세포수		 콜로니
합계		 픽업
콜로니수		 수립된 콜로니수
220 4 5 x 104 many (107) 26(24) 25(22)
256
 4 5 x 104 many (4)
3 3.5 x 105 7 (4) 7(4) 6(5)
272
 4 5.4x104 many (132) 6(6) 5(4)
3 3.1x105 21 (8) 4(4) 2(2)
309
 4 2.3 x 104 many (424)
3 9.6x105 43 (24)
형광현미경하에서 이들 콜로니 중에 GFP 양성 콜로니가 관찰되었다(3회의 독립된 실험에서 4개, 132개, 및 424개의 콜로니). GFP 양성 콜로니는 DsRed 음성이며, 이 결과는 Nanog로 선택한 iPS 세포에서 관찰된 레트로바이러스의 불활화의 결과와 일치되어 있었다(참조: Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007). C-Myc를 제외한 3개의 유전자를 이용한 경우에는, 콜로니 중에서 백그라운드,세포를 거의 가지지 않은 콜로니로서 관찰되었다(3회의 독립된 실험에서 7개, 21개, 및 43개). 이들 콜로니의 약 절반은 패치상태(patchy manner)로 GFP를 발현하였다. DsRed는 소수의 콜로니에 있어서만 검출되고, DsRed는 대부분이 불활화된 것으로 나타났다. GFP 및 DsRed 사이에서 오버랩은 관찰되지 않았다. 이들 콜로니의 대부분은 증식가능하며, 계대수 2에 있어서도 GFP 양성이고, 또한, DsRed 음성이었다. 따라서, 약제에 의한 선별을 행하지 않는 경우에도 c-Myc를 이용하지 않고 iPS 세포를 작제할 수 있으며, iPS 세포 작제의 특이성이 향상되는 것으로 나타났다. 이 iPS 세포에 있어서는 Nanog-GFP는 활성화되고, 또한, 레트로바이러스는 불활화되었다.
선택 마커를 가지지 않지만, 구성적으로 활성(constitutively active)인 프로모터에 의해 조절되는 DsRed 재조합 유전자(참조: Vintersten et al., Genesis, 40, pp.241-246, 2004)를 가지는 성체 TTF로부터 iPS 세포의 작제를 시도하였다. 4개의 유전자(Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 또는 c-Myc를 제외한 3개의 유전자를 세포에 도입하였다. 또한, GFP 레트로바이러스를 도입하여 불활화를 관찰하였다. 4개의 유전자를 도입한 0.5 x 105개의 세포로부터 약제에 의한 선별없이 30일 후에 약 1,000개의 콜로니가 출현하였다. 이들 대부분은 GFP 양성이며, 이들의 세포에서는 레트로바이러스의 불활화되지 않는 것으로 나타났다. 한편, c-Myc를 제외한 3개의 유전자를 도입한 3.5 x 105개의 세포로부터 16개의 콜로니가 출현하였다(참조: 도 28B). 이들 콜로니의 대부분은 GFP를 발현하고 있지 않으며, 나머지 콜로니는 약간 GFP를 발현하였다. 이들 콜로니는 모두 증식가능하며, 계대수 2에 있어서도 iPS 세포의 형태(ES 세포양 형태)를 나타내었다. 또한, 이들 세포는 모두 GFP 음성이며, 레트로바이러스의 불활화이 생기고 있는 것으로 나타났다. RT-PCT에 의해 이들 세포에서는 ES 세포에 필적하는 수준으로 ES 세포 마커 유전자가 발현되어 있음이 보여졌다(참조: 도 28C). 또한, RT-PCR에 의해 3개의 유전자를 이용하여 작제된 iPS 세포에 있어서 Klf4의 레트로바이러스의 불활화 및 c-Myc 도입유전자의 부존재가 확인되며, 이들 iPS 세포를 배반포에 이식한 경우에는 키메라 마우스가 얻어졌다(참조: 도 28D 및 표 9). 이상의 결과로부터, c-Myc를 이용하지 않고 우수한 특성을 가지는 iPS 세포를 얻을 수 있으며, 약제에 의한 선별을 이용하지 않고 성체 TTF로부터 iPS 세포를 효율적으로 작제할 수 있는 것으로 나타났다.
다음에, Oct3/4, Sox2 및 Klf4에 대한 레트로바이러스를 인간 신생아 포피유래 선유아세포(BJ)(클론 246H) 또는 성인의 피부유래 선유아세포 HDF(253G)에 도입하였다. 30일 후 수개의 사람의 iPS 세포 콜로니가 출현하였다. 이들 세포는 사람의 ES 세포양의 콜로니 형태를 나타냄과 동시에 증식할 수 있었다(참조: 도 29A). c-Myc 이외의 3개의 유전자를 도입한 경우(253G), 또는 c-Myc에 3개의 유전자를 더하여 동시에 도입한 경우(253F)에, HDF로부터 유래된 사람의 iPS 세포가 ES 세포 마커 유전자를 발현하는 것이 확인되었다(참조: 도 29B). 또한, c-Myc 레트로바이러스르 이용하지 않고 유도된 사람 iPS 세포의 배상체를 통한 분화가 확인되었다(참조: 도 30).
실시예 19에 있어서의 실험재료 및 방법은 이하와 같다.
1. 플라스미드의 구축
패밀리 유전자의 암호화 영역을 표 11(서열목록의 서열번호 127 내지 152)에 개시한 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 증폭시키고, pDONR201 또는 pENTR-D-TOPO(Invitrogen)에 서브클로닝하여, LR 반응(Invitrogen)에 의해 pMXs-gw에 연결하였다.
유전자 서 열
SOX1
 CAC CAT GTA CAG CAT GAT GAT GGA GAC CGA CCT
CTA GAT ATG CGT CAG GGG CAC CGT GC
sox3
 CAC CAT GTA CAG CCT GCT GGA GAC TGA ACT CAA G
TCA GAT GTG GGT CAG CGG CAC CGT TCC ATT
sox7
CAC CTC GGC CAT GGC CTC GCT GCT GGG
CTC CAT TCC TCC AGC TCT ATG ACA-CAC
Sox15
CAC CAT GGC GCT GAC CAG CTC CTC ACA A
TTA AAG GTG GGT TAC TGG CAT GGG
sox17
 CAC CAG AGC CAT GAG CAG CCC GGA TG
CGT CAA ATG TCG GGG TAG TTG CAA TA
Sox18
CAC CAT GCA GAG ATC GCC GCC CGG CTA CG
CTA GCC TGA GAT GCA AGC ACT GTA ATA GAC
0ct1
CAC CAT GAA TAA TCC ATC AGA AAC CAA T
GCT CTG CAC TCA GCT CAC TGT GCC
Oct6
CAC CAT GGC CAC CAC CGC GCA GTA TCT G
GGA ACC CAG TCC GCA GGG TCA CTG
Klf1
CAC CAT GAG GCA GAA GAG AGA GAG GAG GC
TCA GAG GTG ACG CTT CAT GTG CAG AGC TAA
Klf2
CAC CAT GGC GCT CAG CGA GCC TAT CTT GCC
CTA CAT ATG TCG CTT CAT GTG CAA GGC CAG
Klf5
 CAC CAT GCC CAC GCG GGT GCT GAC CAT G
TCG CTC AGT TCT GGT GGC GCT TCA
L-MycWT
CAC CAT GGA CTT CGA CTC CTA TCA GCA CTA TTT C
TTA GTA GCC ACT GAG GTA CGC GAT TCT CTT
N-MycWT
 CAC CAT GCC CAG CTG CAC CGC GTC CAC CAT
TTA GCA AGT CCG AGC GTG TTC GAT CT
2. 레트로바이러스의 형질도입
Fugene 6 시약(Roche)을 제조자의 지시에 따라, pMXs에 따른 레트로바이러스 벡터를 PLAT-E 세포(참조: Morita et al., Gene Ther., 7, pp.1063-1066, 2000)에 형질전이시켰다. 24시간 후에 배지를 교환하고, 24시간 후에 바이러스 함유 상등액을 취하여 레트로바이러스 감염에 의한 유전자 도입을 행하였다. "혼합(mixed)" 프로토콜에서는, 4개의 유전자를 각각 포함하는 벡터의 혼합물을 이용하여 PLAT-E 세포의 단일 디쉬에 유전자 도입하였다. "개별(separate)" 방법에서는, 각 벡터를 PLAT-E 세포를 포함하는 개별의 디쉬로 유전자 도입하였다. 바이러스 함유 상등액은 유전자 도입 이전에 혼합하였다. 개별방법에 있어서 유의적으로 높은 유전자 도입효율이 관찰되었다.
3. 약제에 의한 선별을 이용한 iPS 세포의 유도
이미 보고된 방법(참조: Takahashi et al., Cell, 126, pp.663-676, 2006; Okita et al., Nature, 448, pp.313-17, 2007)을 수정하여 iPS 세포를 유도하였다. Nanog-GFP-IRES-Puror 리포터 또는 Fbx15-βgeo 리포터의 어느 하나 또는 양쪽을 포함하는 MEF를 SNL 공급세포(참조: McMahon et al., Cell, 62, pp.1073-1085, 1990)를 미리 접종한 6웰 플레이트 및 100mm 디쉬에 1.3 x 105세포/웰(6웰 플레이트) 및 8.0 x 105세포/웰(100mm 디쉬)의 비율로 접종하였다. 유전자를 도입한 세포를 LIF(참조: Meiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 93, pp.14041-14046, 1996)를 포함하는 ES 세포용 배지에서 배양하였다. 이미 보고된 방법대로, G418(300μg/ml) 또는 퓨로마이신(1.5μg/ml)에 의한 선택을 개시하였다. 유전자 도입후 25일로부터 30일 후에 콜로니수를 측정하였다. 콜로니의 일부를 선택하여 계대시켰다.
4. 약제에 의한 선별을 이용하지 않은 iPS 세포 유도
TTF를 성체 Nanog 리포터 마우스 또는 성체 DsRed 형질전환 마우스로부터 단리하였다(참조: Vintersten et al., Genesis, 40, pp.241-246, 2004). 레트로바이러스 함유 상등액은 "개별" 방법으로 제조하였다. 4개의 유전자의 도입을 위하여, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, 및 DsRed의 레트로바이러스 함유 상등액을 1:1:1:1:4의 비율로 혼합하였다. 3개의 유전자를 도입하는 경우에는 Klf4, Oct3/4, Sox2, Mock(빈 벡터), 및 DsRed의 레트로바이러스 함유 상등액을 1:1:1:1:4의 비율로 혼합하였다. DsRed 형질전환 마우스에 대해서는, GFP 레트로바이러스를 DsRed 대신에 사용하였다. 형질전이를 위하여, TTF를 공급세포층을 가지지 않는 100mm 디쉬에 1디쉬당 8.0 x 105세포의 비율로 접종하였다. TTF에 바이러스/폴리브렌 함유 상등액을 가하여 24시간 감염시켰다. 유전자 도입의 4일 후에 3개의 유전자를 도입한 TTF를 SNL 공급세포층을 가지는 100mm 디쉬에 1디쉬당 3.5 x 105세포의 비율로 재차 접종하여 ES 세포용 배지로 배양하였다. 4개의 유전자를 도입한 TTF는 SNL 공급세포층을 가지는 100mm 디쉬에 1디쉬당 0.5 x 105세포의 비율로 재차 접종하였다. 유전자 도입의 30일부터 40일 후에 콜로니수를 측정하였다. 콜로니의 일부를 선택하여 계대하였다.
5. iPS 세포의 평가
이미 보고된 방법대로 RT-PCR 및 기형종 형성을 행하였다. 키메라 실험을 위해서는, 15 내지 20개의 iPS 세포를 BDF1 유래 배반포에 주입하여 이를 가임신 마우스의 자궁에 이식하였다.
실시예 20: 6개의 유전자를 이용한 상피세포로부터의 사람 iPS 세포의 수립
하기 유전자: Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28(NCBⅠ accession number NM_145833(마우스) 또는 NM_024674(사람)의 조합, 또는 그 조합으로부터 1 또는 2 이상의 유전자를 제외한 조합을 이용하여 iPS 세포의 유도를 행하였다.
6 x 106개의 293FT 세포를 10cm 샬레에 접종하여 하룻밤 배양하고, 이 샬레에 3μg의 pLenti6/UbC-Slc7a1 렌티바이러스 벡터를 9μg의 Virapower packaging mix와 함께 리포펙트아민 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질전이시켰다. 24시간 후 배지를 새로운 배지로 교환하였다. 또한, 20시간 후 배양 상등액을 취하여 구멍직경 0.45-μm의 셀룰로스아세테이트 필터(Whatman)로 여과하였다. 5 x 105개의 상피세포를 전일에 준비하였다. 배양 상등액을 제외한 상피제포의 샬레에 상기 여과된 배양 상등액에 4μg/ml의 폴리브렌(Nacalai Tesque)을 첨가한 것을 가하여 세포를 24시간 배양하였다.
6cm의 샬레에 1.0 x 106개의 PLAT-E 세포를 접종하여 배양하였다. 그 다음날, 세포에 Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28을 포함하는 pMX를 기초로 한 레트로바이러스 벡터 9.0μg을 27μ의 Fugene6 형질전이 시약(Roche)을 이용하여 형질전이시켰다. 24시간 후 배지를 새로운 배지로 교환하였다. 또한, 다음 날 PLAT-E 세포의 상등액을 회수하여 구멍직경 0.45-μm의 셀룰로스아세테이트 필터(Whatman)로 여과하였다. 렌티바이러스 감염의 7일 후에 상피세포를 3.0 x 105/6cm 디쉬에 다시 접종하여, 레트로바이러스와 폴리브렌을 포함하는 상기 배양 상등액을 첨가하였다.
결과를 표 12에 나타내었다. 표 중의 "6F"은 6개의 유전자(Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28)을 나타내고, "L"은 Lin28, "N"은 Nanog, "M"은 c-Myc, "O"은 Oct3/4, "S"은 Sox2, "K"은 Klf4를 각각 나타낸다. 문자 앞의 "-"는 "-"에 이어지는 문자가 나타내는 유전자를 상기 6개의 유전자로부터 제외한 경우를 의미하며, 예를 들어, "-L"은 6개의 유전자로부터 ln-28을 제외한 나머지 5개의 유전자를 의미하며, "-KS"은 6개의 유전자로부터 Klf4 및 Sox2를 제외한 4개의 유전자를 의미한다. 표 중의 숫자는 콜로니수를 나타내며, "non-ES like"는 비-ES양 형태를 가지는 콜로니를 의미하며, "ES like"는 ES양 세포형태를 가지는 콜로니를 나타낸다.
Day 23 Day 29 Day 23
비-ES양 ES양 비-ES양 ES양 비-ES양 ES양
6F 59 39 167 42 16 27
-L 49 5 53 14 - -
-N 220 11 216 47 - -
-M 2 0 15 0 - -
-O 0 0 0 0 - -
-S 491 0 489 0 - -
-K 61 0 51 0 - -
-KS 1206 0 1305 0 - -
-KO 0 0 0 0 - -
-KM 0 0 0 0 0 0
-KN 51 0 57 0 - -
-KL 28 0 41 0 - -
-SO 0 0 0 0 - -
-SM 0 0 0 0 - -
-SN 188 0 171 0 - -
-SL 112 0 136 0 - -
-OM 0 0 0 0 - -
-ON 0 0 0 0 - -
-OL 0 0 0 0 - -
-MN 3 0 8 0 - -
-ML 0 0 0 0 - -
-NL 98 1 119 9 17 6
GFP 0 0 0 0 - -
KO 0 0 0 0 - -
KS 0 0 0 0 - -
표 12에는 2회의 실험결과를 나타내었다. 1회째의 실험결과는 유전자 도입 후 23일 또는 29일째에 각 유전자의 조합을 도입하여 유도한 세포의 콜로니수를 나타내며, 2회째의 실험결과(우측 란의 Day23)는 "6F", "-KM" 및 "-NL"은 경우의 콜로니수를 나타낸다. "-L"와 같이 Lin-28을 도입하지 않은 콜로니수의 쪽이 Lin-28을 도입한 경우의 콜로니수보다도 적었으므로, Lin28이 iPS 세포의 수립효율을 향상시키는데 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 나타났다.
또한, 6개의 유전자(Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28), 및 4개의 유전자의 2개의 다른 조합(도 31에 있어서, Y4F로 나타낸 Klf4, c-Myc, Oct3/4, 및 Sox2, 및 도 31에 있어서 T4F로 나타낸 Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28)을 이용하여 iPS 세포를 유도하였다. T4F는 [Yu et al., Science, 318, pp.1917-1920, 2007]에 개시되어 있는 것과 동일한 조합이다. 도 31에 있어서 "ES-like"는 ES 세포의 콜로니와 형태적으로 유사한 콜로니의 수를 나타내며, "Total"은 ES양 콜로니와 비-ES양 콜로니의 수의 총수를 나타낸다. Exp#1, Exp#2, Exp#3, 및 Exp#4는 각각 개별로 실험을 행한 결과를 나타낸다. 이들 실험에 있어서, 6개의 유전자 및 Y4F의 4개의 유전자외 조합을 이용함으로써, ES양 세포 콜로니와 유사한 형태를 가지는 iPS 세포 콜로니가 얻어졌다. 그러나, T4F의 조합에서는 ES양 세포 콜로니와 유사한 형태를 가지는 콜로니의 생성은 인정되지 않았다.
실시예 21: Sall4를 이용한 효율적인 iPS 세포의 생성
마우스 태아 선유아세포(MEF) 및 성인의 피부유래 선유아세포(성체 HDF)를 이용하여 실험한 결과, 3개의 유전자(Klf4, Oct3/4, Sox2)를 이용한 iPS 세포의 유도는 Sall4를 그 조합에 가한 경우, 즉 Klf4, Oct3/4, Sox2, 및 Sall4를 이용한 경우에 iPS 세포의 작제효율(generation efficiency)을 상승시키는 것으로 판명되었다(참조: 도 32 및 도 33). Sall4를 4개의 유전자(Klf4, Oct3/4, Sox2, 및 c-Myc)에 가한 경우, 보다 다수의 iPS 세포 콜로니가 관찰되었다. 이들 실험으로부터, 핵초기화 인자에 Sall4를 추가함으로써, iPS 세포의 유도효율을 개선할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 22: 마우스 Sall4 및/또는 마우스 Sall1의 iPS 세포 유도촉진 효과
공지된 방법(참조: Cell, 131, pp.861-872, 2007)에 따라, 렌티바이러스를 이용하여 마우스 동종숙주역(ecotropic) 리셉터 Slc7a 유전자를 발현시킨 성인 피부유래 선유아세포(성체 HDF)에, 사람 유래의 4개의 유전자(Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 또는 3개의 유전자(Y3F: Oct3/4, Sox2 및 Klf4)와, 마우스 Sall4(mSall4) 유전자 또는 마우스 Sall1(mSall1) 유전자를 레트로바이러스를 이용하여 도입하였다.
도입후 6일째에 일단 HDF를 회수하고, 그 후 5 x 105개로 조정한 HDF를 1.5 x 106개의 마이토마이신 C로 처리한 STO 세포에 파종하였다. 다음날 이후에는 4ng/ml의 재조합 사람의 bFGF(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)를 포함한 영장류 ES 세포 배양용 배지(Reprocell, Inc.)로 배양하였다. 감염후 32일째 및 40일째에 ES 세포양 콜로니수를 계수한 결과를 도 34에 도시하였다. 감염후 32일째에 있어서는, Y3F+Mock(빈 벡터)를 도입한 경우의 콜로니수는 1개, Y4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 37개였음에 비해서, Y3F 또는 Y4F와 동시에 Sall4를 도입한 경우에는 Y3F+mSall4 도입군에서 22개, Y4F+mSall4 도입군에서 73개의 콜로니가 인정되었다. Y3F 또는 Y4F에 mSall1을 도입한 경우에는, Y3F+mSall1 도입군에서 2개, Y4F+mSall1 도입군에서 43개의 콜로니가 인정되었으며, Y3F 또는 Y4F만을 도입한 경우에 비해 콜로니수의 차는 크지 않았다. 또한, Y3F 또는 Y4F에 mSall4와 mSall1을 동시에 도입한 경우의 콜로니수는 Y3F+mSall4+mSall1 도입군에서 34개, Y4F+mSall4+mSall1 도입군에서 79개였다.
감염 후 40일째에 있어서는 Y3F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 8개, Y4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 57개였음에 비해서, Y3F 또는 Y4F와 동시에 mSall4를 도입한 경우에는 Y3F+mSall4 도입군에서 62개, Y4F+mSall4 도입군에서 167개의 콜로니가 인정되었다. Y3F 또는 Y4F에 mSall1을 도입한 경우에는, Y3F+mSall1 도입군에서 14개, Y4F+mSall1 도입군에서 103개의 콜로니가 인정되었다. 또한, Y3F 또는 Y4F에 mSall4와 mSall1을 동시에 도입한 경우의 콜로니수는, Y3F+mSall4+mSall1 도입군에서 98개, Y4F+mSall4+mSall1 도입군에서 193였다. 이상의 결과로부터, Y3F에 mSall4를 도입함으로써, 또는 mSall4와 mSall1을 동시에 도입함으로써 20 내지 100배의 효율로 사람의 iPS 세포를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, Y4F에 mSall4를 도입함으로써, 또는 mSall4와 mSall1을 동시에 도입함으로써, 2 내지 4배의 효율로 사람의 iPS 세포를 유도할 수 있는 것으로도 나타났다.
실시예 23: 마우스 Sall4 및/또는 마우스 Sall1의 iPS 세포 유도촉진 효과(2)
공지된 방법(참조: Cell, 131, pp.861-872, 2007)에 따라, 렌티바이러스를 이용하여 마우스 동종숙주역(ecotropic) 수용체 Slc7a 유전자를 발현시킨 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)에 사람 유래의 4개의 유전자(T4F: Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28) 또는 3개의 유전자(T3F: Oct3/4, Sox2 및 Nanog)와 함께, 마우스 Sall4(mSall4) 또는 마우스 Sall1(mSall1) 혹은 이들 모두를 레트로바이러스를 이용하여 도입하였다.
도입후 6일째에 일단 HDFa-Slc7a1을 회수하고, 그 후 5 x 105개로 조정한 HDFa-Slc7a1을 1.5 x 106개의 마이토마이신 C로 처리한 STO 세포 상에 접종하였다. 7일간 더 배양한 후, 재조합 인간 4ng/ml bFGF(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)를 포함한 영장류 ES 세포 배양용 배지(Reprocell, Inc.)로 배양하였다. 감염후 32일째 및 40일째에 ES 세포양 콜로니수를 계수한 결과를 도 35에 나타내었다. 감염후 32일째에 있어서는, T3F+Mock 및 T4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 0개였음에 비해서, T3F 또는 T4F와 동시에 mSall4를 도입한 경우에는 T3F+mSall4 도입군에서 2개의 콜로니가 인정되었다. T4F+mSall4 도입군에서는 사람의 ES 세포양 콜로니는 확인할 수 없었다.
T3F 또는 T4F와 동시에 mSall1을 도입한 경우에는, T3F+mSall1 도입군에서 3개, T4F+mSall1 도입군에서 6개의 콜로니가 인정되었다. 또한, T3F 또는 T4F와 함께 mSall4와 mSall1을 동시에 도입한 경우에는, T3F+mSall4+mSall1 도입군에서 3개의 콜로니가 인정되었다. T4F+mSall4+mSall1 도입군에서는 인간 ES양 콜로니는 확인할 수 없었다. 감염 후 40일째에 있어서는 T3F+Mock 및 T4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 10개였음에 비해서, T3F 또는 T4F와 동시에 Sall4를 도입한 경우에는 T3F+mSall4 도입군에서 6개의 콜로니가 인정되고, T4F+mSall4 도입군에서는 2개의 콜로니가 인정되었다.
T3F 또는 T4F와 동시에 mSall1을 도입한 경우에는, T3F+mSall1 도입군에서 13개, T4F+mSall1 도입군에서 22개의 콜로니가 인정되었다. 또한, T3F 또는 T4F에 mSall4와 mSall1을 동시에 도입한 경우에는, T3F+mSall4+mSall1 도입군에서 17개의 콜로니가 인정되고, T4F+mSall4+mSall1 도입군에서는 11개의 콜로니가 인정되었다. T3F 및 T4F의 도입에 의한 iPS 세포 수립에 있어서는 mSall4를 추가함으로써 iPS 세포 콜로니 형성에 있어서의 촉진효과가 인정되며, mSall1의 편이 보다 효율적으로 사람의 iPS 세포 콜로니의 형성을 유도하였다. 또한, mSall1과 mSall4의 양쪽을 T3F와 T4F와 함께 도입함으로써, 사람의 iPS 세포의 콜로니 형성을 보다 촉진할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 24: 인간 Sall4의 iPS 세포 유도촉진 효과
[Cell, 131, pp.861-872, 2007]에 기재된 방법에 따라, 렌티바이러스를 이용하여 마우스 동종숙주역(ecotropic) 수용체 Slc7a 유전자를 발현시킨 성인의 피부유래 선유아세포(HDFa-Slc7a1)를 준비하고, 다음날 사람 유래의 4개의 유전자(Y4F: Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc) 또는 3개의 유전자(Y3F: Oct3/4, Sox2 및 Klf4)와 인간 Sall4(hSall4)를 레트로바이러스를 이용하여 도입하였다. 도입 후 6일째에 일단 HDF를 회수하고, 그 후 5 x 105개로 조정한 HDF를 1.5 x 106개의 마이토마이신 C로 처리한 STO 세포 상에 접종하였다. 다음 날 이후에는 4ng/ml 재조합 사람의 bFGF(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)를 포함한 영장류 ES 세포 배양용 배지(Reprocell, Inc.)로 배양하였다. 감염후 32일째 및 40일째에 ES 세포양 콜로니수를 계수한 결과를 도 36에 나타내었다.
감염 후 32일째에 있어서는 Y3F+Mock 및 T4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 1개, Y4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 34개였음에 비해서, Y3F 또는 Y4F와 동시에 hSall4를 도입한 경우에는 Y3F+hSall4 도입군에서 8개, Y4F+hSall4 도입군에서 52개의 콜로니가 인정되었다. 감염 후 40일째에 있어서는 Y3F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 5개, Y4F+Mock를 도입한 경우의 콜로니수는 52개였음에 비해서, Y3F 및 Y4F와 동시에 hSall4를 도입한 경우에는 Y3F+hSall4 도입군에서 32개, Y4F+hSall4 도입군에서 137개의 콜로니가 인정되었다. 그 결과, Y3F에 hSall4를 동시에 도입함으로써 6 내지 8배의 효율로 사람의 iPS 세포 콜로니를 얻을 수 있으며, Y4F와 동시에 hSall4를 도입함으로써 1.5 내지 2.5배의 효율로 사람의 iPS 세포 콜로니를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 25: L-Myc의 효과
(A) 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 L-Myc) 도입에 의한 핵초기화의 검토
(1) 사람의 iPS 세포 유도에 대한 효과
마우스 동종숙주역(ecotropic) 수용체 Slc7a 유전자를 발현시킨 성인 피부유래 선유아세포(aHDF-Slc7a1)를 공지된 방법에 따라 작제하였다(참조: Cell, 131, pp.861-872, 2007). 이 aHDF-Slc7a1를 3 x 105개/60mm 디쉬의 비율로 접종하고, 그 다음날 상기 간행물에 기재된 방법에 따라 사람 유래의 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 Sox2의 3개의 유전자에 L-Myc1(이하에서는, 간략히 "L-Myc"라 함), c-Myc, 또는 N-Myc 유전자를 더한 합계 4개의 유전자)를 레트로바이러스로 도입하였다. 바이러스 감염 6일 후에 세포를 회수하여, MSTO 세포상에 재접종하였다(5 x 105개/100mm 디쉬). 그 다음 날로부터 영장류 ES 세포 배양용 배지(Reprocell, Inc.)에 4ng/ml의 재조합 사람의 bFGF(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)를 추가한 배지에서 배양하였다.
레트로바이러스 감염 후 37일째에 출현한 사람의 iPS 세포 콜로니수를 계수하였다. 4회의 실험결과를 정리하여 표 13 및 도 37에 도시하였다(참조: 도 37은 표 13을 그래프화한 것이며, 그래프 상의 수치는 전체 콜로니수에 대한 iPS 세포 콜로니수의 비율을 나타낸다). L-Myc를 이용함으로써 iPS 세포 콜로니의 유도효율이 c-Myc에 비해 6배나 높아지고, 전체 콜로니수에 대한 iPS 세포 콜로니수의 비율에 대해서도 c-Myc의 경우에 비해 L-Myc를 이용한 경우의 편이 약 2배 증가하였다. N-Myc를 이용한 경우에도 c-Myc의 경우에 비해 iPS 세포 콜로니수의 증가가 인정되었다. 마우스 선유아세포(MEF) 유래의 iPS 세포 유도에 있어서는 c-Myc를 이용한 경우와 L-Myc를 이용한 경우 간에 차가 없음이 보고되어 있으나(참조: Nature Biotech., 26, pp.101-106, 2008), 인간 세포를 이용하는 경우에는 c-Myc보다도 L-Myc를 이용하는 편이 iPS 세포의 유도효율이 현저히 향상됨이 명확해졌다.
<hiPS 콜로니의 수>
ES양 전체 %

h32
Figure 112009018783268-PCT00001
 c-MYC 3 38 7.89
L-MYC 18 35 51.4
N-MYC 32 431 7.42

h44
Figure 112009018783268-PCT00002
 c-MYC 11 14 78.6
L-MYC 82 100 82.0
N-MYC 31 63 49.2

h51
Figure 112009018783268-PCT00003
 c-MYC 7 69 10.1
L-MYC 62 124 50.0
N-MYC 25 225 11.1

h58
Figure 112009018783268-PCT00004
 c-MYC 14 55 25.5
L-MYC 53 70 75.7
N-MYC 52 298 17.4
(2) 실험실 조건에서의 분화유도
Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 L-Myc의 4개의 유전자 도입에 의해 수립된 사람의 iPS 세포(32R2, 32R6)를 저결합 디쉬(low-binding dish)에 접종하고, 이미 보고된 방법(참조: Cell, 131, pp.861-872, 2007)에 따라 배상체(embryoid body: EB)를 형성시켰다(100mm 디쉬). 2주간 배양 후 내배엽계 세포의 분화 마커인 α-페토프로테인(R&D Systems), 중배엽계 세포의 분화마커인 α-평활근 액틴(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.), 및 외배엽계의 분화마커인 βⅢ-튜블린(Chemicon)의 각 항체를 이용한 염색을 행하였다. 결과를 도 38에 도시하였다. 상기 염색에 의해 각 마커의 발현이 확인되고, 수득한 사람의 iPS 세포는 삼배엽계로의 분화능을 가짐이 확인되었다.
(3) 기형종 형성능
Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 L-Myc의 4개의 유전자 도입에 의해 수립된 사람의 iPS 세포(32R6)를 재조합 사람의 bFGF(4ng/ml) 및 Rho 키나제 저해제 Y-27632(10μΜ)를 함유하는 영장류 ES 세포 배양용 배지(ReproCell) 중에서 배양하였다. 1시간 후 콜라겐 IV(collagen Ⅳ)로 처리하여 세포를 채취 후 원심분리하여 세포를 회수하고, Y-27632(10μM)를 함유하는 DMEM/F12 중에 부유시켰다. 컨플루언트가 된 세포(100mm 디쉬)의 1/4량을 SCID 마우스의 정소 내에 주사하였다. 2-3개월 후 종양을 잘라서 4% 포름알데히드를 함유하는 PBS(-)로 고정하였다. 파라핀 포매 조직을 세절하여 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다. 이 결과를 도 39에 도시하였다. 조직학적으로 종양은 복수의 종류의 세포로 구성되어 있으며, 신경조직, 장관양 조직, 연골조직, 모발조직, 지방조직 및 색소조직이 인정된 점으로부터 iPS 세포의 다능성이 증명되었다.
(4) 키메라 마우스의 종양 형성에 대한 영향
Nanog 유전자좌에 EGFP와 퓨로마이신 내성 유전자를 도입하여 작제한 Nanog 리포터를 가지는 마우스(참조: Nature, 448, pp.313-317, 2007)로부터 MEF를 단리하였다(MEF-Ng). 마찬가지로, Fbx15 유전자좌에 β-geo 유전자를 도입하여 작제한 Fbx15 리포터를 가지는 마우스(참조: Cell, 126, pp.663-676, 2006)로부터 MEF를 단리하였다(MEF-Fbx). 이들 MEF에 4개의 유전자(Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 L-Myc)를 레트로바이러스를 이용하여 도입하고, MEF-Ng에 대해서는 퓨로마이신으로 선택하며, MEF-Fbx에 대해서 G418로 선택함으로써 iPS 세포를 수립하였다(각각 "Nanog-iPS" 및 Fbx-iPS라 함). 이들 iPS 세포를 C57BL/6 마우스의 배반포에 이식함으로써 키메라 마우스를 작출하였다. 키메라 마우스 및 F1마우스에 있어서의 종양 형성을 검토한 결과, 현 시점에서 각각 이하의 일수 생존하며, 또한, 생존하고 있는 어느 마우스에 있어서나 종양의 발생은 인정되지 않았다.
키메라 마우스 Fbx-iPS: 19/19마리 349일 생존 중
키메라 마우스 Nanog-iPS: 15/16마리 363일 생존 중
F1 Nanog-iPS: 1/1마리 255일 생존 중
F1 Nanog-iPS: 3/3마리 181일 생존 중
F1 Nanog-iPS: 1/1마리 132일 생존 중
키메라 마우스 Nanog-iPS: 30/30마리 63일 생존 중
키메라 마우스 Nanog-iPS: 12/14마리 62일 생존 중
Oct3/4, Klf4, Sox2, 및 c-Myc의 4개의 유전자에 의해 초기화를 행한 iPS 세포를 이용한 경우에는, 생후 100일 이내에 37마리 중 6마리의 키메라 마우스가 종양이 원인이 되어 사망하였으나(참조: Nature Biotech., 26, pp.101-106,2008), c-Myc 대신에 L-Myc를 이용함으로써 생존일수에 현저한 개선이 인정됨과 동시에, 종양 발생이 극적으로 감소하는 것이 명백해졌다.
(B) 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, L-Myc) 도입에 의한 핵초기화의 검토
(1) iPS 세포 콜로니 형성의 유무
공지된 방법(참조: Nature Biotech., 26, pp.101-106, 2008)에 따라, 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc) 도입에 따른 iPS의 수립을 시도하였다. 상기 (A)(1) 내지 (4)에 기재된 MEF-Ng를 젤라틴 코팅한 6웰 플레이트에 1.3 x 105개/웰 비율로 접종하고, 24시간 후에 마우스 유래의 3개의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc)를 레트로바이러스를 이용하여 도입하였다. 바이러스 감염 4일 후에 세포를 회수하여, MSTO 세포 상으로 다시 접종하였다(1.5 x 105개/6웰 플레이트). 다음날부터 세포를 LIF를 부가한 ES 세포 배양용 배지(DMEM(Nacalai Tesque)에 15% 우태아혈청, 2mM L-글루타민(Invitrogen), 100μM 비필수 아미노산(Invitrogen), 100μM 2-머캡토에탄올(Invitrogen), 50U/mL 페니실린(Invitrogen)과 50mg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen)을 부가한 것)을 이용하여 배양하였다. 바이러스 감염 46일째에 GFP 양성 콜로니를 픽업하였다(iPS-MEF-Ng-443-3클론). 픽업한 16개의 세포의 사진을 도 40에 나타내었다. 어느 세포나 GFP 양성을 나타내는 iPS 세포 클로니였다.
이들 GFP 양성 콜로니 유래의 클론에 대해서, 유전자 발현을 검토하기 위하여, RT-PCR 및 Genomic-PCR을 행하였다. 결과를 도 41에 나타내었다. 어느 클론이나 ES 세포의 마커 유전자인 Nanog, Rex1, 및 ECAT1를 발현하였다. 또한, 모든 iPS 세포 콜로니에 있어서 도입한 3종류의 유전자(Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc)가 게놈 중에 함입되어 있었다. 한편, mRNA의 발현이 검출되지 않는 클론도 있었으나, 이는 불활화되었기 때문이라 여겨진다.
(2) 실험실 조건에서의 분화유도
상기 (1)에서 수립한 4개의 클론(iPS-MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12, 및 iPS-MEF-Ng-443-3-13)을 저졀합 디쉬(low-binding dish)에 접종하고(2 x 106개/6웰 플레이트), 배상체(embryoid body: EB)를 형성시켰다. ES 세포 배양용 배지로 2시간 배양 후, 내배엽계 세포의 분화마커인 α-페토프로테인(R&D Systems), 중배엽계 세포의 분화마커인 α-평활근 액틴(Dako), 외배엽계의 분화마커인 βⅢ-튜블린(Chemicon)의 각 항체를 이용한 염색을 행하였다. 결과를 도 42에 도시하였다. 염색에 의해 이들 마커의 발현이 확인되고, 수득한 마우스 iPS 세포는 삼배엽계로의 분화능을 가짐이 확인되었다.
(3) 기형종 형성능
상기 (1)에서 수립한 4개의 클론(iPS-MEF-Ng-443-3-3, iPS-MEF-Ng-443-3-6, iPS-MEF-Ng-443-3-12, 및 iPS-MEF-Ng-443-3-13)을 각각 누드마우스의 피하에 주사하였다. 4주간 후에 모든 예에서 기형종의 형성이 확인되었다. 조직학적으로 종양은 복수 종류의 세포로 구성되어 있으며, 신경조직, 장관양 조직, 근육조직, 표피조직, 및 연골조직이 인정된 점으로부터(참조: 도 43), iPS 세포의 다능성이 증명되었다.
실시예 26: 사람 iPS 세포 유도에 있어서의 L-Myc 및 Lin28의 효과
마우스 동종숙주역(ecotropic) 수용체 Slc7a1 유전자를 발현시킨 성인 피부유래 선유아세포(aHDF-Slc7a1)를 공지된 방법(참조: Cell, 131, pp.861-872, 2007)에 기재된 방법에 따라 작제하였다. 이 aHDF-Slc7a1를 3 x 105개/60mm 디쉬의 비율로 접종하고, 그 다음날 상기 간행물에 기재된 방법에 따라, 사람 유래의 이하의 3개의 유전자, 4개의 유전자, 또는 5개의 유전자를 레트로바이러스에 도입하였다.
· Sox2, Oct3/4, 및 Klf4
· Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc
· Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc
· Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 Lin28
· Sox2, Oct3/4, Klf4, c-Myc 및 Lin28
· Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc 및 Lin28
바이러스 감염 6일 후에 세포를 회수하여 MSTO 세포상으로의 다시 접종하였다(5 x 105개/100mm 디쉬). 그 다음날부터 영장류 ES 세포 배양용 배지(Reprocell, Inc.)에 4ng/ml의 재조합 사람의 bFGF(Wako Pure Chemical Ind., Ltd.)을 부가한 배지에서 배양하였다. 레트로바이러스 감염 후 37일째에 출현한 전체 콜로니(total colony) 및 사람의 iPS 세포 콜로니(hiPS colony)의 수를 계수하고, 그 결과를 표 14 및 도 44에 나타내었다(도 44는 표 14를 그래프화한 것이다).
hiPS
콜로니		 전체
콜로니		 hiPS
(%)
1 Mock DsRed Mock Mock Mock A 0 0 0
2 SOX2 OCT4 KLF4 Mock Mock D 3 5 60.0
3 SOX2 OCT4 KLF4 c-MYC Mock B 38 103 36.9
4 SOX2 OCT4 KLF4 L-MYC Mock C 156 211 73.9
5 SOX2 OCT4 KLF4 Mock LIN28 G 90 97 92.8
6 SOX2 OCT4 KLF4 c-MYC LIN28 E 98 154 63.6
7 SOX2 OCT4 KLF4 L-MYC LIN28 F 366 432 84.7
Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 L-Myc의 4개의 유전자에 Lin28을 부가함으로써, iPS 세포 콜로니수가 현저히 증가하였다. 이 iPS 세포 콜로니수는 Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc의 4개의 유전자에 Lin28을 부가한 경우보다도 현저히 많았다. 또한, Lin28은 c-Myc의 작용에 대해서 상승효과를 나타냈으나, L-Myc의 작용에 대해서는 더 강한 상승효과를 나타내었다(참조: 표 14). 전체 콜로니수에 대한 iPS 세포 콜로니의 비율에 대해서도 Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc 및 Lin28의 5개의 유전자를 이용한 경우에는, 극히 높은 비율(84.7%)을 부여하였다. 이상의 결과로부터, 사람 iPS 세포의 유도효율을 개선하기 위해서는, Sox2, Oct3/4, Klf4, L-Myc 및 Lin28의 5가지 유전자의 조합이 극히 유효함이 명백해졌다.
실시예 27: 사람 iPS 세포 유도에 있어서의 Myc 키메라 유전자 및 특이유전자의 효과
도 45에 나타낸 각종 Myc 키메라 유전자(Ms-cL-Myc, Ms-Lc-Myc, Ms-cLc-Myc, Ms-LcL-Myc, Ms-ccL-Myc, Ms-cLL-Myc, Ms-LLc-Myc, Ms-Lcc-Myc), 및 Myc 점돌연변이 유전자(c-MycW135E, c-MycV394D, c-MycL420P, L-MycW96E, L-MycV325D, L-MycL351P)를 다음과 같이 구축하였다. 우선, 마우스 c-Myc(Ms-c-Myc) 및 L-Myc(Ms-L-Myc)를 각각 pENTR-D-TOPO(Invitrogen)에 도입하고, pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc 및 pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc를 작제하였다. 그런 다음, 마우스 c-Myc(NCBI Acc. No. NM_010849) 및 L-Myc(NCBI Acc. No. NM_008506)의 서열정보에 따라, 도 45에 도시한 점돌연변이를 도입하기 위한 프라이머를 작제하고, 이를 이용하여 pENTR-D-TOPO-Ms-c-Myc 및 pENTR-D-TOPO-Ms-L-Myc를 주형으로 해서 PCR을 행하였다. 각 변이를 서열로 확인한 후, LR 반응으로 레트로바이러스 벡터의 pMXs에 서브클로닝하였다. 도 45에 도시한 키메라 Myc에 대해서는 각 절편을 PCR로 증폭하고, 각각의 조합에 따라 혼합한 것을 주형으로 하여 PCR을 행하고, 이전과 마찬가지로 레트로바이러스 벡터의 pMXs로 서브클로닝하였다.
수득한 각 레트로바이러스 벡터와 실시예 25에서 이용한 Sox2, Oct3/4, 및 Klf4의 각 레트로바이러스 벡터를 실시예 25와 동일하게 성인 피부유래 선유아세포(aHDF-Slc7a1)에 도입하여, 레트로바이러스 감염 후 31일째에 출현한 전체 콜로니 및 사람의 iPS 세포 콜로니의 수를 계수하고, 그 결과를 도 46 및 표 15에 나타내었다(도 46은 표 15를 그래프화한 것이다).
hiPS
콜로니		 전체
콜로니		 hiPS
(%)
1 Mock DsRed Mock Mock A 0 0 0
2 SOX2 OCT4 KLF4 -MYC B 2 5 40
3 SOX2 OCT4 KLF4 c-MYC C 70 162 43.2
4 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-c-Myc D 106 228 46.5
5 SOX2 OCT4 KLF4 L-MYC E 212 358 59.2
6 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-L-Myc F 164 292 56.2
13 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-cL-Myc M 330 446 74.0
14 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-Lc-Myc N 98 192 51.0
15 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-cLc-Myc O 282 410 68.8
16 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-LcL-Myc P 216 318 67.9
17 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-ccL-Myc Q 209 394 53.0
18 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-cLL-Myc R 208 359 57.9
19 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-LLc-Myc S 150 240 62.5
20 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-Lcc-Myc T 81 170 47.6
7 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-c-Myc-W135E G 112 280 40.0
8 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-c-MyC-V304D H 194 308 63.0
9 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-c-Myc-L420D I 0 0 0.0
10 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-L-Myc-W96E J 6 6 100.0
11 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-L-Myc-V325D K 144 216 66.7
12 SOX2 OCT4 KLF4 Ms-L-Myc-L351P L 1 6 16.7
c-Myc 및 L-Myc는 어느 것이나 인간과 마우스에 있어서 아미노산 수준에서 100% 가까운 동일성(identity)을 가지고 있다. 도 46 및 표 15에 나타낸 바와 같이, 마우스 유전자(Ms-c-Myc 및 Ms-L-Myc)를 이용한 경우에도 사람 유전자(c-Myc 및 L-Myc)와 마찬가지로 사람의 iPS 세포 콜로니가 생긴 점으로부터, 마우스의 c-Myc 및 L-Myc는 인간의 c-Myc 및 L-Myc와 실질적으로 동일한 기능을 가지는 것이 확인되었다.
각종 Myc 키메라 유전자 및 점돌연변이 유전자(point mutant gene)에서의 결과를 야생형과 비교한 결과, Ms-cL-Myc 및 Ms-cLc-Myc를 이용한 경우에 야생형 L-Myc(L-Myc)와 비교하여 iPS 세포 콜로니수가 증가되어 있으며, 특히, Ms-cL-Myc를 이용한 경우에 가장 양호한 결과가 얻어졌다. 또한, 점돌연변이 유전자에서의 결과로부터, c-Myc 및 L-Myc 모두 C-말단의 하나의 아미노산(c-MycL420P 및 L-MycL351P)이 대단히 중요한 것도 명백해졌다. 이상의 결과로부터, 사람의 iPS 세포 수립에 있어서의 Myc의 중요한 기능영역은 c-Myc의 N-말단측 1/3의 부분, L-Myc의 중앙부분, 및 c/L-Myc의 C-말단부분인 것이 시사되었다.
본 발명에 의해 안전한 인공 다능성 줄기세포의 제조방법 및 효율적인 인공 다능성 줄기세포의 제조방법이 제공된다.
<110> Kyoto University <120> Nuclear reprogramming method <150> US61/001,108 <151> 2007-10-31 <150> US60/996,289 <151> 2007-11-09 <150> US12/213,035 <151> 2008-06-13 <160> 184 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOct3/4-S1165 <400> 1 gacaggggga ggggaggagc tagg 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOct3/4-AS1283 <400> 2 cttccctcca accagttgcc ccaaac 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSox2-S1430 <400> 3 gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSox2-AS1555 <400> 4 ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4(Nanog)-macaca-968S <400> 5 cagccccgat tcttccacca gtccc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS <400> 6 cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-U <400> 7 cagatcctaa acagctcgca gaat 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-L <400> 8 gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-U <400> 9 ctacaacgcc tacgagtcct aca 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-L <400> 10 gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-S243 <400> 11 cttatgctac gtaaaggagc tggg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-AS850 <400> 12 gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-S532 <400> 13 ggagccgcct gccctggaaa attc 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-AS916 <400> 14 tttttcctga tattctattc ccat 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-S85 <400> 15 ccgtccccgc aatctccttc catc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-AS667 <400> 16 atgatgccaa catggctccc ggtg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-S40 <400> 17 atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-AS259 <400> 18 actcagccat ggactggagc atcc 24 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTERT-S3234 <400> 19 cctgctcaag ctgactcgac accgtg 26 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTERT-AS3713 <400> 20 ggaaaagctg gccctggggt ggagc 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for G3PDH-F <400> 21 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for G3PDH-R <400> 22 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOct3/4-S1165 <400> 23 gacaggggga ggggaggagc tagg 24 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOct3/4-AS1283 <400> 24 cttccctcca accagttgcc ccaaac 26 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSox2-S1430 <400> 25 gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSox2-AS1555 <400> 26 ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4(Nanog)-macaca-968S <400> 27 cagccccgat tcttccacca gtccc 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4(Nanog)-macaca-1334AS <400> 28 cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-U <400> 29 cagatcctaa acagctcgca gaat 24 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-L <400> 30 gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-U <400> 31 ctacaacgcc tacgagtcct aca 23 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-L <400> 32 gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-S243 <400> 33 cttatgctac gtaaaggagc tggg 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-AS850 <400> 34 gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-S532 <400> 35 ggagccgcct gccctggaaa attc 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-AS916 <400> 36 tttttcctga tattctattc ccat 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-S85 <400> 37 ccgtccccgc aatctccttc catc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-AS667 <400> 38 atgatgccaa catggctccc ggtg 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-S40 <400> 39 atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-AS259 <400> 40 actcagccat ggactggagc atcc 24 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTERT-S3234. <400> 41 cctgctcaag ctgactcgac accgtg 26 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTERT-AS3713 <400> 42 ggaaaagctg gccctggggt ggagc 25 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for G3PDH-F <400> 43 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for G3PDH-R <400> 44 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOCT3/4-S944 <400> 45 ccccagggcc 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hSOX2-S1430 <400> 53 gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSOX2-AS1555 <400> 54 ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4-macaca-968S <400> 55 cagccccgat tcttccacca gtccc 25 <210> 56 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for ECAT4-macaca-1334AS. <400> 56 cggaagattc ccagtcgggt tcacc 25 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-S243 <400> 57 cttatgctac gtaaaggagc tggg 24 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGDF3-AS850 <400> 58 gtgccaaccc aggtcccgga agtt 24 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-U <400> 59 cagatcctaa acagctcgca gaat 24 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXI-RT-L <400> 60 gcgtacgcaa attaaagtcc aga 23 <210> 61 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-U <400> 61 ctacaacgcc tacgagtcct aca 23 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFGF4-RT-L <400> 62 gttgcaccag aaaagtcaga gttg 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-S40 <400> 63 atatcccgcc gtgggtgaaa gttc 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hpH34-AS259 <400> 64 actcagccat ggactggagc atcc 24 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-S532 <400> 65 ggagccgcct gccctggaaa attc 24 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-1-AS916 <400> 66 tttttcctga tattctattc ccat 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-S85 <400> 67 ccgtccccgc aatctccttc catc 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hECAT15-2-AS667 <400> 68 atgatgccaa catggctccc ggtg 24 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<400> 76 gccctctccc tcccctccac gcacag 26 <210> 77 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hBRACHYURY-AS1540 <400> 77 cggcgccgtt gctcacagac cacagg 26 <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGFAP-S1040 <400> 78 ggcccgccac ttgcaggagt accagg 26 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hGFAP-AS1342 <400> 79 cttctgctcg ggcccctcat gagacg 26 <210> 80 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hPAX6-S1206 <400> 80 acccattatc cagatgtgtt tgcccgag 28 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hPAX6-AS1497 <400> 81 atggtgaagc tgggcatagg cggcag 26 <210> 82 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFOXA2-S208 <400> 82 tgggagcggt gaagatggaa gggcac 26 <210> 83 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hFOXA2-AS398 <400> 83 tcatgccagc gcccacgtac gacgac 26 <210> 84 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSOX17-S423 <400> 84 cgctttcatg gtgtgggcta aggacg 26 <210> 85 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSOX17-AS583 <400> 85 tagttggggt ggtcctgcat gtgctg 26 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hAADC-S1378 <400> 86 cgccaggatc cccgctttga aatctg 26 <210> 87 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hAADC-AS1594 <400> 87 tcggccgcca gctctttgat gtgttc 26 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hChAT-S1360 <400> 88 ggaggcgtgg agctcagcga cacc 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hChAT-AS1592 <400> 89 cggggagctc gctgacggag tctg 24 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMAP2-S5401 <400> 90 caggtggcgg acgtgtgaaa attgagagtg 30 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMAP2-AS5587 <400> 91 cacgctggat ctgcctgggg actgtg 26 <210> 92 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hDAT-S 1935 <400> 92 acagagggga ggtgcgccag ttcacg 26 <210> 93 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hDAT-AS2207 <400> 93 acggggtgga cctcgctgca cagatc 26 <210> 94 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hLMX1B-S770 <400> 94 ggcaccagca gcagcaggag cagcag 26 <210> 95 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hLMXIB-AS1020 <400> 95 ccacgtctga ggagccgagg aagcag 26 <210> 96 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYL2A-S258 <400> 96 gggccccatc aacttcaccg tcttcc 26 <210> 97 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYL2A-AS468 <400> 97 tgtagtcgat gttccccgcc aggtcc 26 <210> 98 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTnTc-S524 <400> 98 atgagcggga gaaggagcgg cagaac 26 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hTnTc-AS730 <400> 99 tcaatggcca gcaccttcct cctctc 26 <210> 100 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMEF2C-S1407 <400> 100 tttaacaccg ccagcgctct tcaccttg 28 <210> 101 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMEF2C-AS1618 <400> 101 tcgtggcgcg tgtgttgtgg gtatctcg 28 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYHCB-S5582 <400> 102 ctggaggccg agcagaagcg caacg 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYHCB-AS5815 <400> 103 gtccgcccgc tcctctgcct catcc 25 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for dT20 <400> 104 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 105 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYC-S857 <400> 105 gccacagcaa acctcctcac agcccac 27 <210> 106 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYC-AS1246 <400> 106 ctcgtcgttt ccgcaacaag tcctcttc 28 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOCT3/4-S <400> 107 caccatggcg ggacacctgg cttcag 26 <210> 108 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOCT3/4-AS <400> 108 acctcagttt gaatgcatgg gagagc 26 <210> 109 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSOX2-S <400> 109 caccatgtac aacatgatgg agacggagct g 31 <210> 110 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hSOX2-AS <400> 110 tcacatgtgt gagaggggca gtgtgc 26 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hKLF4-S <400> 111 caccatggct gtcagtgacg cgctgctccc 30 <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hKLF4-AS <400> 112 ttaaaaatgt ctcttcatgt gtaaggcgag 30 <210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYC-S <400> 113 caccatgccc ctcaacgtta gcttcaccaa 30 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hMYC-AS <400> 114 tcacgcacaa gagttccgta gctgttcaag 30 <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Slc7al-S <400> 115 caccatgggc tgcaaaaacc tgctcgg 27 <210> 116 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Slc7al-AS <400> 116 tcatttgcac tggtccaagt tgctgtc 27 <210> 117 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREX1-pro5K-S <400> 117 attgtcgacg gggatttggc agggtcacag gac 33 <210> 118 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hREXx1-pro5K-AS <400> 118 cccagatctc caatgccacc tcctcccaaa cg 32 <210> 119 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOCT3/4-pro5K-S <400> 119 cactcgaggt ggaggagctg agggcactgt gg 32 <210> 120 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for hOCT3/4-pro5K-AS <400> 120 cacagatctg aaatgagggc ttgcgaaggg ac 32 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehREXl-F1-S <400> 121 ggtttaaaag ggtaaatgtg attatattta 30 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehREXl-F1-AS <400> 122 caaactacaa ccacccatca ac 22 <210> 123 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehOCT3/4 F2-S <400> 123 gaggttggag tagaaggatt gttttggttt 30 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehOCT3/4 F2-AS <400> 124 cccccctaac ccatcacctc caccacctaa 30 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehNANOG-FI-S <400> 125 tggttaggtt ggttttaaat ttttg 25 <210> 126 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for mehNANOG-FI-AS <400> 126 aacccaccct tataaattct caatta 26 <210> 127 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox1 <400> 127 caccatgtac agcatgatga tggagaccga cct 33 <210> 128 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox1 <400> 128 ctagatatgc gtcaggggca ccgtgc 26 <210> 129 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox3 <400> 129 caccatgtac agcctgctgg agactgaact caag 34 <210> 130 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox3 <400> 130 tcagatgtgg gtcagcggca ccgttccatt 30 <210> 131 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox7 <400> 131 cacctcggcc atggcctcgc tgctggg 27 <210> 132 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox7 <400> 132 ctccattcct ccagctctat gacacac 27 <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox15 <400> 133 caccatggcg ctgaccagct cctcacaa 28 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox15 <400> 134 ttaaaggtgg gttactggca tggg 24 <210> 135 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox17 <400> 135 caccagagcc atgagcagcc cggatg 26 <210> 136 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox17 <400> 136 cgtcaaatgt cggggtagtt gcaata 26 <210> 137 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox18 <400> 137 caccatgcag agatcgccgc ccggctacg 29 <210> 138 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Sox18 <400> 138 ctagcctgag atgcaagcac tgtaatagac 30 <210> 139 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Oct1 <400> 139 caccatgaat aatccatcag aaaccaat 28 <210> 140 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Oct1 <400> 140 gctctgcact cagctcactg tgcc 24 <210> 141 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Oct6 <400> 141 caccatggcc accaccgcgc agtatctg 28 <210> 142 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Oct6 <400> 142 ggaacccagt ccgcagggtc actg 24 <210> 143 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klf1 <400> 143 caccatgagg cagaagagag agaggaggc 29 <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klfl <400> 144 tcagaggtga cgcttcatgt gcagagctaa 30 <210> 145 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klf2 <400> 145 caccatggcg ctcagcgagc ctatcttgcc 30 <210> 146 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klf2 <400> 146 ctacatatgt cgcttcatgt gcaaggccag 30 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klf5 <400> 147 caccatgccc acgcgggtgc tgaccatg 28 <210> 148 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for Klf5 <400> 148 tcgctcagtt ctggtggcgc ttca 24 <210> 149 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for L-MycWT <400> 149 caccatggac ttcgactcgt atcagcacta tttc 34 <210> 150 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for L-MycWT <400> 150 ttagtagcca ctgaggtacg cgattctctt 30 <210> 151 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for N-MycWT <400> 151 caccatgccc agctgcaccg cgtccaccat 30 <210> 152 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for N-MycWT <400> 152 ttagcaagtc cgagcgtgtt cgatct 26 <210> 153 <211> 1320 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (1)..(1317) <400> 153 atg ccc ctc aac gtg aac ttc acc aac agg aac tat gac ctc gac tac 48 Met Pro Leu Asn Val Asn Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 15 gac tcc gta cag ccc tat ttc atc tgc gac gag gaa gag aat ttc tat 96 Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Ile Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr 20 25 30 cac cag caa cag cag agc gag ctg cag ccg ccc gcg ccc agt gag gat 144 His Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp 35 40 45 atc tgg aag aaa ttc gag ctg ctt ccc acc ccg ccc ctg tcc ccg agc 192 Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser 50 55 60 cgc cgc tcc ggg ctc tgc tct cca tcc tat gtt gcg gtc gct acg tcc 240 Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Ala Thr Ser 65 70 75 80 ttc tcc cca agg gaa gac gat gac ggc ggc ggt ggc aac ttc tcc acc 288 Phe Ser Pro Arg Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr 85 90 95 gcc gat cag ctg gag atg atg acc gag tta ctt gga gga gac atg gtg 336 Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val 100 105 110 aac cag agc ttc atc tgc gat cct gac gac gag acc ttc atc aag aac 384 Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn 115 120 125 atc atc atc cag gac tgt atg tgg agc ggt ttc tca gcc gct gcc aag 432 Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys 130 135 140 ctg gtc tcg gag aag ctg gcc tcc tac cag gct gcg cgc aaa gac agc 480 Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser 145 150 155 160 acc agc ctg agc ccc gcc cgc ggg cac agc gtc tgc tcc acc tcc agc 528 Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser 165 170 175 ctg tac ctg cag gac ctc acc gcc gcc gcg tcc gag tgc att gac ccc 576 Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro 180 185 190 tca gtg gtc ttt ccc tac ccg ctc aac gac agc agc tcg ccc aaa tcc 624 Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser 195 200 205 tgt acc tcg tcc gat tcc acg gcc ttc tct cct tcc tcg gac tcg ctg 672 Cys Thr Ser Ser Asp Ser Thr Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu 210 215 220 ctg tcc tcc gag tcc tcc cca cgg gcc agc cct gag ccc cta gtg ctg 720 Leu Ser Ser Glu Ser Ser Pro Arg Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu 225 230 235 240 cat gag gag aca ccg ccc acc acc agc agc gac tct gaa gaa gag caa 768 His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln 245 250 255 gaa gat gag gaa gaa att gat gtg gtg tct gtg gag aag agg caa acc 816 Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Thr 260 265 270 cct gcc aag agg tcg gag tcg ggc tca tct cca tcc cga ggc cac agc 864 Pro Ala Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Ser Pro Ser Arg Gly His Ser 275 280 285 aaa cct ccg cac agc cca ctg gtc ctc aag agg tgc cac gtc tcc act 912 Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr 290 295 300 cac cag cac aac tac gcc gca ccc ccc tcc aca agg aag gac tat cca 960 His Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro 305 310 315 320 gct gcc aag agg gcc aag ttg gac agt ggc agg gtc ctg aag cag atc 1008 Ala Ala Lys Arg Ala Lys Leu Asp Ser Gly Arg Val Leu Lys Gln Ile 325 330 335 agc aac aac cgc aag tgc tcc agc ccc agg tcc tca gac acg gag gaa 1056 Ser Asn Asn Arg Lys Cys Ser Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu 340 345 350 aac gac aag agg cgg aca cac aac gtc ttg gaa cgt cag agg agg aac 1104 Asn Asp Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn 355 360 365 gag ctg aag cgc agc ttt ttt gcc ctg cgt gac cag atc cct gaa ttg 1152 Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu 370 375 380 gaa aac aac gaa aag gcc ccc aag gta gtg atc ctc aaa aaa gcc acc 1200 Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr 385 390 395 400 gcc tac atc ctg tcc att caa gca gac gag cac aag ctc acc tct gaa 1248 Ala Tyr Ile Leu Ser Ile Gln Ala Asp Glu His Lys Leu Thr Ser Glu 405 410 415 aag gac tta ttg agg aaa cga cga gaa cag ttg aaa cac aaa ctc gaa 1296 Lys Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu 420 425 430 cag ctt cga aac tct ggt gca taa 1320 Gln Leu Arg Asn Ser Gly Ala 435 <210> 154 <211> 439 <212> PRT <213> Mouse <400> 154 Met Pro Leu Asn Val Asn Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Ile Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr 20 25 30 His Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Ala Thr Ser 65 70 75 80 Phe Ser Pro Arg Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr 85 90 95 Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val 100 105 110 Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn 115 120 125 Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys 130 135 140 Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser 145 150 155 160 Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser 165 170 175 Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp 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Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser 165 170 175 ctg tac ctg cag gac ctc acc gcc gcc gcg tcc gag tgc att gac ccc 576 Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro 180 185 190 tca gtg gtc ttt ccc tac ccg ctc aac gac agc agc tcg ccc aaa tcc 624 Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser 195 200 205 tgt acc tcg tcc gat tcc acg gcc ttc tct agc gat tct gaa ggt gaa 672 Cys Thr Ser Ser Asp Ser Thr Ala Phe Ser Ser Asp Ser Glu Gly Glu 210 215 220 gag att gac gtg gtg acc gtg gag aag agg cga tct ctg gac atc cga 720 Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg 225 230 235 240 aag cca gtc acc atc acg gtg cga gca gac ccc ctg gac ccc tgc atg 768 Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met 245 250 255 aag cac ttc cat atc tct atc cac caa cag cag cat aac tat gct gcc 816 Lys His Phe His Ile Ser Ile His Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala 260 265 270 cgt ttt cct cca gaa agt tgc tct caa gag ggg gat cct gag cca ggt 864 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Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr 85 90 95 Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val 100 105 110 Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn 115 120 125 Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys 130 135 140 Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly 145 150 155 160 Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu 165 170 175 Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys 180 185 190 Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu 195 200 205 Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg 210 215 220 Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met 225 230 235 240 Lys His Phe His Ile Ser Ile His Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala 245 250 255 Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly 260 265 270 Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu 275 280 285 Glu Glu Glu Glu Glu Glu 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Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 ccc ggc gcc gtg gac cca gcc tct ggg att aat ccc ggg gag ccg tgg 192 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 cct gga ggg ggt gcc ggg gac gag gcg gaa tct cgg ggc cat tcg aaa 240 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 gcc tgg ggc agg aat tat gct tcc atc att cgc cgt gac tgc atg tgg 288 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp 85 90 95 agc ggc ttc tcc gcc cga gaa cgg ctg gtc tcg gag aag ctg gcc tcc 336 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser 100 105 110 tac cag gct gcg cgc aaa gac agc acc agc ctg agc ccc gcc cgc ggg 384 Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly 115 120 125 cac agc gtc tgc tcc acc tcc agc ctg tac ctg cag gac ctc acc gcc 432 His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala 130 135 140 gcc gcg tcc gag tgc att gac ccc tca gtg gtc ttt ccc tac ccg ctc 480 Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu 145 150 155 160 aac gac agc agc tcg ccc aaa tcc tgt acc tcg tcc gat tcc acg gcc 528 Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Thr Ser Ser Asp Ser Thr Ala 165 170 175 ttc tct cct tcc tcg gac tcg ctg ctg tcc tcc gag tcc tcc cca cgg 576 Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser Ser Glu Ser Ser Pro Arg 180 185 190 gcc agc cct gag ccc cta gtg ctg cat gag gag aca ccg ccc acc acc 624 Ala Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr 195 200 205 agc agc gac tct gaa gaa gag caa gaa gat gag gaa gaa att gat gtg 672 Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val 210 215 220 gtg tct gtg gag aag agg caa acc cct gcc aag agg tcg gag tcg ggc 720 Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Ser Glu Ser Gly 225 230 235 240 tca tct cca tcc cga ggc cac agc aaa cct ccg cac agc cca ctg gtc 768 Ser Ser Pro Ser Arg Gly His Ser Lys Pro Pro His Ser Pro Leu Val 245 250 255 ctc aag agg tgc cac gtc tcc act cac cag cac aac tac 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Gln Leu Arg Asn Ser Gly Ala 435 <210> 174 <211> 439 <212> PRT <213> Mouse <400> 174 Met Pro Leu Asn Val Asn Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe Ile Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr 20 25 30 His Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Ala Thr Ser 65 70 75 80 Phe Ser Pro Arg Glu Asp Asp Asp Gly Gly Gly Gly Asn Phe Ser Thr 85 90 95 Ala Asp Gln Leu Glu Met Met Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val 100 105 110 Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn 115 120 125 Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Glu Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys 130 135 140 Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser 145 150 155 160 Thr Ser Leu Ser Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser 165 170 175 Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Thr Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro 180 185 190 Ser Val Val 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Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 agc ccc agc gat tct gaa ggt gaa gag att gac gtg gtg acc gtg gag 528 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 aag agg cga tct ctg gac atc cga aag cca gtc acc atc acg gtg cga 576 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 gca gac ccc ctg gac ccc tgc atg aag cac ttc cat atc tct atc cac 624 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 caa cag cag cat aac tat gct gcc cgt ttt cct cca gaa agt tgc tct 672 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 caa gag ggg gat cct gag cca ggt ccc cag gaa gag gct ccg gag ata 720 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 gaa gct ccc aag gag aaa gag gag gag gaa gag gaa gag gag gaa gaa 768 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 gag att gtg agc ccc cca cct gtc gga agt gag gct ccc cag tcc tgc 816 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 cac ccc aaa cct gtc agt tct gac act gag gac gtg acc aag agg aag 864 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 aac cat aac ttc ttg gaa cga aaa agg agg aat gac ctc cgc tcc cgg 912 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 ttc cta gcc ctg cgg gac cag gtt ccc acc ctg gcc agc tgc tct aag 960 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 gcc ccc aaa gtc gtg atc ctc agc aag gcg tta gaa tac ttg cag gct 1008 Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 ttg gtg ggg gct gaa aag aaa atg gct aca gag aaa agg cag ctc cgg 1056 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg 340 345 350 tgt cgg caa cag caa ctg caa aag aga atc gcg tac ctc agt ggc tac 1104 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365 taa 1107 <210> 180 <211> 368 <212> PRT <213> Mouse <400> 180 Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly 1 5 10 15 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Glu 85 90 95 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg 100 105 110 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr 115 120 125 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr 130 135 140 Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg 340 345 350 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365 <210> 181 <211> 1107 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (1)..(1104) <400> 181 atg gac ttc gac tcg tat cag cac tat ttc tac gac tat gac tgc gga 48 Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly 1 5 10 15 gag gat ttc tac cgc tcc acg gcg ccc agc gag gac atc tgg aag aaa 96 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 ttc gag ctg gtg ccg tcg ccc ccc acg tcg ccg ccc tgg ggc tcc ggt 144 Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 ccc ggc gcc gtg gac cca gcc tct ggg att aat ccc ggg gag ccg tgg 192 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 cct gga ggg ggt gcc ggg gac gag gcg gaa tct cgg ggc cat tcg aaa 240 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 gcc tgg ggc agg aat tat gct tcc atc att cgc cgt gac tgc atg tgg 288 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp 85 90 95 agc ggc ttc tcc gcc cga gaa cgg ctg gag aga gtg gtg agc gac agg 336 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg 100 105 110 ctg gcc cca ggc gcg ccc cgg ggg aac ccg ccc aaa gcg ccc gct acc 384 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr 115 120 125 ccg gac ggc act cct agt ctg gaa gcc agt aac ccg gcg ccc gcc acc 432 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr 130 135 140 caa tgt cag ctg ggc gag ccc aag act cag gcc tgc tcc ggg tcc gag 480 Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 agc ccc agc gat tct gaa ggt gaa gag att gac gtg gtg acc gtg gag 528 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 aag agg cga tct ctg gac atc cga aag cca gtc acc atc acg gtg cga 576 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 gca gac ccc ctg gac ccc tgc atg aag cac ttc cat atc tct atc cac 624 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 caa cag cag cat aac tat gct gcc cgt ttt cct cca gaa agt tgc tct 672 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 caa gag ggg gat cct gag cca ggt ccc cag gaa gag gct ccg gag ata 720 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 gaa gct ccc aag gag aaa gag gag gag gaa gag gaa gag gag gaa gaa 768 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 gag att gtg agc ccc cca cct gtc gga agt gag gct ccc cag tcc tgc 816 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 cac ccc aaa cct gtc agt tct gac act gag gac gtg acc aag agg aag 864 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 aac cat aac ttc ttg gaa cga aaa agg agg aat gac ctc cgc tcc cgg 912 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 ttc cta gcc ctg cgg gac cag gtt ccc acc ctg gcc agc tgc tct aag 960 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 gcc ccc aaa gtc gac atc ctc agc aag gcg tta gaa tac ttg cag gct 1008 Ala Pro Lys Val Asp Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 ttg gtg ggg gct gaa aag aaa atg gct aca gag aaa agg cag ctc cgg 1056 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg 340 345 350 tgt cgg caa cag caa ctg caa aag aga atc gcg tac ctc agt ggc tac 1104 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365 taa 1107 <210> 182 <211> 368 <212> PRT <213> Mouse <400> 182 Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly 1 5 10 15 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp 85 90 95 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg 100 105 110 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr 115 120 125 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr 130 135 140 Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 Ala Pro Lys Val Asp Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Leu Arg 340 345 350 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365 <210> 183 <211> 1107 <212> DNA <213> Mouse <220> <221> CDS <222> (1)..(1104) <400> 183 atg gac ttc gac tcg tat cag cac tat ttc tac gac tat gac tgc gga 48 Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly 1 5 10 15 gag gat ttc tac cgc tcc acg gcg ccc agc gag gac atc tgg aag aaa 96 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 ttc gag ctg gtg ccg tcg ccc ccc acg tcg ccg ccc tgg ggc tcc ggt 144 Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 ccc ggc gcc gtg gac cca gcc tct ggg att aat ccc ggg gag ccg tgg 192 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 cct gga ggg ggt gcc ggg gac gag gcg gaa tct cgg ggc cat tcg aaa 240 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 gcc tgg ggc agg aat tat gct tcc atc att cgc cgt gac tgc atg tgg 288 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp 85 90 95 agc ggc ttc tcc gcc cga gaa cgg ctg gag aga gtg gtg agc gac agg 336 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg 100 105 110 ctg gcc cca ggc gcg ccc cgg ggg aac ccg ccc aaa gcg ccc gct acc 384 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr 115 120 125 ccg gac ggc act cct agt ctg gaa gcc agt aac ccg gcg ccc gcc acc 432 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr 130 135 140 caa tgt cag ctg ggc gag ccc aag act cag gcc tgc tcc ggg tcc gag 480 Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 agc ccc agc gat tct gaa ggt gaa gag att gac gtg gtg acc gtg gag 528 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 aag agg cga tct ctg gac atc cga aag cca gtc acc atc acg gtg cga 576 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 gca gac ccc ctg gac ccc tgc atg aag cac ttc cat atc tct atc cac 624 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 caa cag cag cat aac tat gct gcc cgt ttt cct cca gaa agt tgc tct 672 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 caa gag ggg gat cct gag cca ggt ccc cag gaa gag gct ccg gag ata 720 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 gaa gct ccc aag gag aaa gag gag gag gaa gag gaa gag gag gaa gaa 768 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 gag att gtg agc ccc cca cct gtc gga agt gag gct ccc cag tcc tgc 816 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 cac ccc aaa cct gtc agt tct gac act gag gac gtg acc aag agg aag 864 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 aac cat aac ttc ttg gaa cga aaa agg agg aat gac ctc cgc tcc cgg 912 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 ttc cta gcc ctg cgg gac cag gtt ccc acc ctg gcc agc tgc tct aag 960 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 gcc ccc aaa gtc gtg atc ctc agc aag gcg tta gaa tac ttg cag gct 1008 Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 ttg gtg ggg gct gaa aag aaa atg gct aca gag aaa agg cag ccc cgg 1056 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Pro Arg 340 345 350 tgt cgg caa cag caa ctg caa aag aga atc gcg tac ctc agt ggc tac 1104 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365 taa 1107 <210> 184 <211> 368 <212> PRT <213> Mouse <400> 184 Met Asp Phe Asp Ser Tyr Gln His Tyr Phe Tyr Asp Tyr Asp Cys Gly 1 5 10 15 Glu Asp Phe Tyr Arg Ser Thr Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys 20 25 30 Phe Glu Leu Val Pro Ser Pro Pro Thr Ser Pro Pro Trp Gly Ser Gly 35 40 45 Pro Gly Ala Val Asp Pro Ala Ser Gly Ile Asn Pro Gly Glu Pro Trp 50 55 60 Pro Gly Gly Gly Ala Gly Asp Glu Ala Glu Ser Arg Gly His Ser Lys 65 70 75 80 Ala Trp Gly Arg Asn Tyr Ala Ser Ile Ile Arg Arg Asp Cys Met Trp 85 90 95 Ser Gly Phe Ser Ala Arg Glu Arg Leu Glu Arg Val Val Ser Asp Arg 100 105 110 Leu Ala Pro Gly Ala Pro Arg Gly Asn Pro Pro Lys Ala Pro Ala Thr 115 120 125 Pro Asp Gly Thr Pro Ser Leu Glu Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Thr 130 135 140 Gln Cys Gln Leu Gly Glu Pro Lys Thr Gln Ala Cys Ser Gly Ser Glu 145 150 155 160 Ser Pro Ser Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Asp Val Val Thr Val Glu 165 170 175 Lys Arg Arg Ser Leu Asp Ile Arg Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Arg 180 185 190 Ala Asp Pro Leu Asp Pro Cys Met Lys His Phe His Ile Ser Ile His 195 200 205 Gln Gln Gln His Asn Tyr Ala Ala Arg Phe Pro Pro Glu Ser Cys Ser 210 215 220 Gln Glu Gly Asp Pro Glu Pro Gly Pro Gln Glu Glu Ala Pro Glu Ile 225 230 235 240 Glu Ala Pro Lys Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 245 250 255 Glu Ile Val Ser Pro Pro Pro Val Gly Ser Glu Ala Pro Gln Ser Cys 260 265 270 His Pro Lys Pro Val Ser Ser Asp Thr Glu Asp Val Thr Lys Arg Lys 275 280 285 Asn His Asn Phe Leu Glu Arg Lys Arg Arg Asn Asp Leu Arg Ser Arg 290 295 300 Phe Leu Ala Leu Arg Asp Gln Val Pro Thr Leu Ala Ser Cys Ser Lys 305 310 315 320 Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Ser Lys Ala Leu Glu Tyr Leu Gln Ala 325 330 335 Leu Val Gly Ala Glu Lys Lys Met Ala Thr Glu Lys Arg Gln Pro Arg 340 345 350 Cys Arg Gln Gln Gln Leu Gln Lys Arg Ile Ala Tyr Leu Ser Gly Tyr 355 360 365

Claims (19)

  1. Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자의 3종의 유전자를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, 및 Sox 패밀리 유전자의 3종의 유전자를 세포에 도입한 후, 상기 세포가 다능성을 획득하여 증식하기에 충분한 시간동안 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    Oct3/4, Kif4, 및 Sox2의 3종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
    Oct 패밀리 유전자를 함유하는 바이러스 벡터, Klf 패밀리 유전자를 함유하는 바이러스 벡터, 및 Sox 패밀리 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 각각 별도의 패키징 세포에 형질도입하고 상기 세포를 배양하여 3종류의 배양 상등액을 수득하는 단계, 및 상기 단계에 의해 수득한 3종류의 배양 상등액의 혼합물을 제조하여, 상기 혼합물을 이용하여 체세포의 초기화를 행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서,
    약제선택을 행하지 않고 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  6. Oct 패밀리 유전자 및 Sox 패밀리 유전자를 조합하거나, Oct 패밀리 유전자 및 Klf 패밀리 유전자를 조합하여, L-Myc, Sall1, 및 Sall4의 최소한 1종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    Oct3/4 및 Sox2를 조합하거나, 또는 Oct3/4 및 Klf4을 조합하여, L-Myc, Sall1, 및 Sall4의 최소한 1종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  8. Oct 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, 및 Klf 패밀리 유전자를 조합하여, L-Myc, Sall1, 및 Sall4의 최소한 1종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    Oct3/4, Sox2, 및 Klf4의 3종의 유전자를 조합하여, L-Myc, Sall1, 및 Sall4의 최소한 1종의 유전자를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  10. 제 6항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서,
    Lin28 및/또는 Nanog의 유전자를 체세포에 추가로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 기재된 단계를 포함하며, 분화유도후 수득할 수 있는 세포나 조직에 있어서 종양의 발생이 실질적으로 저감 내지 배제된 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  13. Oct 패밀리 유전자, Klf 패밀리 유전자, Sox 패밀리 유전자, Myc 패밀리 유전자, Lin28 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는, 체세포로부터 인공 다능성 줄기세포를 제조하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc, Lin28 및 Nanog를 체세포에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  15. 제 1항 내지 14항의 어느 한 항에 있어서,
    체세포가 사람을 포함하는 포유동물의 체세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  16. 제 1항 내지 14항의 어느 한 항에 있어서,
    체세포가 사람의 체세포인 것을 특징으로 하는
    방법.
  17. 제 1항 내지 16항의 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 수득할 수 있는 인공 다능성 줄기세포.
  18. 제 17항에 기재된 인공 다능성 줄기세포로부터 분화유도된 체세포.
  19. 제 18항에 기재된 체세포 집단인 조직, 장기, 체액 또는 개체.
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