KR102066761B1

KR102066761B1 - 효율적 인공 다능성 간세포 수립 방법

Info

Publication number: KR102066761B1
Application number: KR1020147036011A
Authority: KR
Inventors: 신야 야마나카; 게이스케 오키타
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2020-01-15
Also published as: JP6381442B2; EP2853592A1; EP2853592A4; KR20150014512A; HK1208492A1; WO2013176233A1; AU2013264708A1; CN104471060A; CA2874259C; JPWO2013176233A1; CN104471060B; EP2853592B1; AU2013264708B2; CA2874259A1; US10519425B2; US20150175973A1; SG11201407917PA; ES2725827T3

Abstract

본 발명은 (1) 핵초기화 인자를 지닌 에피소말 벡터; 및 (2) 상기 에피소말 벡터(1)와는 다른 EBNA-1을 지닌 에피소말 벡터를 체세포에 도입하는 공정을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법 및 iPS 세포의 수립 효율을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 또한, EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 포함하는, iPS 세포 수립 효율 개선제; 및 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 함유하는 iPS 세포를 제조하기 위한 키트가 제공된다.

Description

효율적 인공 다능성 간세포 수립 방법{HIGHLY EFFICIENT METHOD FOR ESTABLISHING INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL}

본 발명은, 효율적인 인공 다능성 간(이하, iPS라고 한다)세포의 수립 방법 및 그것을 위한 약제 등에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, (1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터; 및 (2) (1)과는 다른, EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터, 추가로 원하는 경우 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 체세포에 도입하는 공정을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 포함하는, iPS 세포 수립 효율 개선제 등에 관한 것이다.

최근, 마우스 및 사람의 iPS 세포가 연달아 수립되었다. Yamanaka 등은, 마우스 및 사람 유래의 선유아세포에, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자를 도입해 강제 발현시키는 것에 의해, iPS 세포를 유도했다(특허문헌 1 및 비특허문헌 1 및 2). 한편으로는, Thomson 등의 그룹은, Klf4와 c-Myc 대신에 Nanog와 Lin28를 사용해 사람 iPS 세포를 제작했다(특허문헌 2 및 비특허문헌 3).

iPS 세포의 수립 효율을 높이기 위해서 여러가지 시도가 되고 있다. 그 중 하나는 초기화 인자의 조합의 최적화이다. 본 발명자들은, 초기화 인자로서 Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28의 5 인자의 조합을 이용해 RNAi 기술에 의해 p53의 발현을 녹다운 함으로써, iPS 세포의 수립 효율을 현저하게 개선시킬 수 있음을 보고했다(특허문헌 3 및 비특허문헌 4). 그러나, 암억제 유전자인 p53를 억제하는 것을 피하는 것이 바람직하며, 심지어 일시적인 경우, 특히 사람 iPS 세포의 재생 의료에 대한 응용을 고려하면, 종양화 리스크를 최소한으로 하는 것이 바람직하다는 견해도 있다. 한편으로는, Maekawa 등은, Glis1를 Oct3/4, Sox2 및 Klf4(OSK) 과 함께 체세포에 도입함으로써, OSK의 3 인자를 사용한 경우보다 현저하게 iPS 세포 수립 효율을 개선시킬 수 있음을 보고하고 있다(특허문헌 4 및 비특허문헌 5). 게다가 Maekawa 등은, Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc 및 Lin28(OSKUL)의 5 인자에 p53 shRNA를 조합하는 것 보다, Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28 및 Glis1(OSKULG)의 6 인자를 사용하는 편이, 약 2배의 효율로 사람 iPS 세포가 수립되는 것으로 보고하고 있다(미국가출원 제61/521,153호).

레트로바이러스나 렌티바이러스 등의 바이러스성 벡터는, 비바이러스성 벡터에 비해 유전자 도입 효율이 높고, 그 때문에 iPS 세포를 용이하게 제작할 수 있다는 점에서 우수한 벡터이다. 그러나, 레트로바이러스나 렌티바이러스는 염색체중에 편입되기 때문에, iPS 세포의 임상 응용을 고려 하면 안전면에서 문제가 있다. 그 때문에, 아데노바이러스 벡터나 플라스미드 등의 비바이러스성 벡터를 이용하는 염색체에 대한 편성이 없는 iPS 세포가 보고되고 있지만(비특허문헌 6-8), 레트로바이러스나 렌티바이러스에 비하면 수립 효율은 낮다. 또한, iPS 세포의 선택하에서는 초기화 인자의 지속적인 고발현이 요구되기 때문에, 일반적으로 편성이 일어나기 어렵다고 여겨지는 에피소말 벡터를 이용해도, 특정 빈도로 초기화 인자가 염색체에 짜넣어진 안정 발현주가 얻어지는 경우가 있다 (비특허문헌 7 및 9).

한편으로는, 염색체 외에서 안정적으로 자율 복제 가능한 에피소말 벡터를 사용하는 방법에서는, 상기한 iPS 세포 수립 효율의 낮음에 더해 약제 선택의 중지에 의한 벡터의 자연 소실 효율도 저빈도로, 또한 긴 시간을 필요로 하기 때문에 (비특허문헌 8), iPS 세포의 수립 효율의 개선과 함께, 단시간에 효율적으로 벡터를 제거할 방법이 요구된다. 이것에 관해서 본 발명자들은, 신속하게 세포로부터 탈락하는 조기 자기 소실형 벡터를 찾아내, 이미 보고하고 있다 (특허문헌 3, 비특허문헌 4 및 미국가출원 제61/521,153호).

그러나, 에피소말 벡터를 사용하는 방법에 있어서는, 다른 벡터를 사용하는 방법과 비교해, 특정의 세포, 예를 들어 혈액 세포로부터의 iPS 세포 수립 효율이 매우 낮다는 문제가 존재한다. 혈액 세포는 iPS 세포 뱅크를 구축하는데 있어서 매우 유용한 체세포 소스의 하나인 것으로부터, 에피소말 벡터법에 있어서, 세포의 종류에 관계없이, 효율적으로 iPS 세포를 수립할 수 있는 방법이 또한 요구되고 있다.

[선행 기술 문헌]

[특허문헌]

특허문헌 1 : WO 2007/069666

특허문헌 2 : WO 2008/118820

특허문헌 3 : WO 2011/016588

특허문헌 4 : WO 2011/102531

[비특허문헌]

비특허문헌 1 : Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)

비특허문헌 2 : Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)

비특허문헌 3 : Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)

비특허문헌 4 : Okita, K. et al., Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)

비특허문헌 5 : Maekawa, M. et al., Nature, 474: 225-229 (2011)

비특허문헌 6 : Stadtfeld, M. et al., Science, 322: 945-949 (2008)

비특허문헌 7 : Okita, K. et al., Science, 322: 949-953 (2008)

비특허문헌 8 : Yu, J. et al., Science, 324: 797-801 (2009)

비특허문헌 9 : Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009)

상기 서술한 실정을 감안하여, 본 발명은, 임상 응용에 적절한 안전한 사람 iPS 세포를 효율적으로 수립하는 것을 목적으로 한다. 따라서, 본 발명의 제일의 과제는, iPS 세포, 특히 사람 iPS 세포의 수립 효율을 개선하는 수단을 제공하는 것이며, 그것을 사용한 효율적인 iPS 세포의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 제2의 과제는, 재생 의료 응용을 향한 비침습적인 체세포 소스의 취득을 가능하게 하기 위해서, 혈액 세포로부터 iPS 세포를 수립하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기의 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 실시한 결과, iPS 세포의 수립 공정에 있어서, 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터와 함께, 그 벡터와는 별개의 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터(이하, "Extra EBNA-1 벡터"로서 지칭함)를 사용하는 것으로, iPS 세포의 수립 효율을 비약적으로 높일 수 있는 것을 처음으로 알아냈다. 또한, 본 발명자들은, 종래의 방법에서는 iPS 세포의 수립이 매우 곤란한 혈액 세포로부터의 수립이 당해 방법을 사용하는 것에 따라 효율적으로 실시할 수 있는 것을 처음으로 알아냈다. 본 발명은, 그러한 발견에 기초하여 완성에 이른 것이다.

즉, 본 발명은, 이하를 포함한다.

[1] 이하의 (1) 및 (2)를 체세포에 도입하는 공정을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법:

(1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 하나 이상의 에피소말 벡터; 및

(2) 상기 (1)과는 다른 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터.

[2] p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 에피소말 벡터의 형태로 도입하는 것을 또한 포함하는, [1]에 기재된 방법.

[3] 상기 p53의 기능 저해 물질이, p53 shRNA 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체인, [2]에 기재된 방법.

[4] 상기 p53의 도미넌트 네거티브 변이체가 p53DD인, [3]에 기재된 방법.

[5] 상기 핵초기화 인자가, 하나 이상의, Oct 패밀리, Klf 패밀리, Sox 패밀리, Myc 패밀리, Lin 패밀리 및 Glis 패밀리의 멤버로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] 상기 핵초기화 인자가, Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc 및 Lin28인, [5]에 기재된 방법.

[7] 상기 핵초기화 인자가, Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28 및 Glis1인, [6]에 기재된 방법.

[8] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산이, 2개 또는 3개의 에피소말 벡터로 나누어져 탑재되고 있는, [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G인, [1]에 기재된 방법.

[10] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, [1]에 기재된 방법.

[11] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, [2]에 기재된 방법.

[12] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말플라스미드 벡터가, pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK 및 pCE-hUL인, [2]에 기재된 방법.

[13] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말플라스미드 벡터가, pCE-hOCT3/4, pCE-hSK 및 pCE-hUL이며, 상기 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가 pCE-mp53DD인, [2]에 기재된 방법.

[14] 상기 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 플라스미드 벡터가, pCXWB-EBNA1인, [9]~[11] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[15] 상기 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 플라스미드 벡터가, pCXB-EBNA1인, [12] 또는 [13]에 기재된 방법.

[16] 상기 체세포가, 사람 선유아세포(HDF) 또는 혈액 세포에서 선택되는, [1]~[15] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[17] 상기 혈액 세포가, 말초혈단핵구세포(PMNC)인, [16]에 기재된 방법.

[18] 상기 말초혈단핵구세포(PMNC)가, T세포인, [17]에 기재된 방법.

[19] iPS 세포의 수립 효율 개선법으로서, 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 하나 이상의 에피소말 벡터를 체세포에 도입하는 공정에 있어서, 그 벡터와 함께, EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 다른 에피소말 벡터를 체세포에 도입하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[20] p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 에피소말 벡터의 형태로 도입하는 것을 추가로 포함하는, [19]에 기재된 방법.

[21] 상기 p53의 기능 저해 물질이, p53 shRNA 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체인, [20]에 기재된 방법.

[22] 상기 p53의 도미넌트 네거티브 변이체가 p53DD인, [21]에 기재된 방법.

[23] EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 포함하는, iPS 세포 수립 효율 개선제.

[24] iPS 세포를 제조하기 위한 키트로서, 이하의 (1) 및 (2)를 포함하는 키트:

(1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터; 및

[25] p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산 A를, 에피소말 벡터의 형태로 포함하는 것을 추가로 포함하는, [24]에 기재된 키트.

[26] 상기 p53의 기능 저해 물질이, p53 shRNA 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체인, [25]에 기재된 키트.

[27] 상기 p53의 도미넌트 네거티브 변이체가 p53DD인, [26]에 기재된 키트.

[28] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G인, [24]에 기재된 키트.

[29] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, [24]에 기재된 키트.

[30] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, [25]에 기재된 키트.

[31] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말플라스미드 벡터가, pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK 및 pCE-hUL인, [25]에 기재된 키트.

[32] 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 플라스미드 벡터가, pCE-hOCT3/4, pCE-hSK 및 pCE-hUL이며, 상기 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가 pCE-mp53DD인, [25]에 기재된 키트.

[33] 상기 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 플라스미드 벡터가, pCXWB-EBNA1인, [28]~[30] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[34] 상기 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 플라스미드 벡터가, pCXB-EBNA1인, [31] 또는 [32]에 기재된 키트.

[35] [1]~[18] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어지는 iPS 세포에 분화 처리를 실시해, 체세포에 분화시키는 것을 포함하는, 체세포의 제조 방법.

체세포의 핵초기화 공정에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터의 사용은, iPS 세포의 수립 효율을 비약적으로 높일 수가 있으므로, 보다 효율 좋게 사람 iPS 세포를 제공하는 것이 가능해진다. 또한, Extra EBNA-1 벡터를 사용하는 것으로, 종래의 방법에서는 iPS 세포의 수립이 매우 곤란한 혈액 세포로부터의 수립을 효율적으로 실시할 수 있게 되어, 그 결과 비침습적인 형태에서의 체세포 소스의 취득이 가능해진다. 따라서, 본 발명은 사람 iPS 세포의 재생 의료에 대한 응용에 있어서 매우 유용하다.

[도 1] 도 1 A는 pCEB-hSK-O의 구조를 나타내고, 도 1 B는 pCEB-hUL-G의 구조를 나타낸다.
[도 2] 도 2A~E는, 각종 에피소말플라스미드(pCE-hOCT3/4, pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK, pCE-hUL 및 pCE-mp53DD)의 구조를 나타낸다.
[도 3] 도 3A는, Extra EBNA-1 벡터 플라스미드(pCXWB-EBNA-1)의 구조를 나타낸다. 도 3B는, Extra EBNA-1 벡터 플라스미드(pCXB-EBNA-1)의 구조를 나타낸다.
[도 4] 도 4는, 사람 선유아세포(HDF1419)로부터의 iPS 세포의 수립을 나타낸다. 플라스미드 의 편성인 2 vec. (pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G), 그리고 그것들과 pCXWB-EBNA1와의 조합을 이용해, 사람 선유아세포(HDF1419)로부터 iPS 세포의 수립을 실시했다. 피더 세포로서는, 마이트마이신 C처리를 한 MEF, 또는 마이트마이신 C처리를 한 SNL를 사용했다.
[도 5] 도 5는, 사람 선유아세포(HDF1388)로부터의 iPS 세포의 수립을 나타낸다. 플라스미드 의 편성 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL), 그리고 그것들과 pCXWB-EBNA1와의 조합을 이용해, 사람 선유아세포(HDF1388)로부터 iPS 세포의 수립을 실시했다. 피더 세포로서는, 마이트마이신 C처리를 한 MEF, 또는 마이트마이신 C처리를 한 SNL를 사용했다.
[도 6] 도 6은, 사람 말초혈단핵구세포(PMNC)로부터의 iPS 세포의 수립을 나타낸다. (A)： 플라스미드를 사용한 PMNC로부터의 iPS 세포 유도 프로토콜. (B) 및 (C)：플라스미드 의 편성 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL)를 이용해 수립된 iPS 세포 콜로니의 사진을 나타낸다. (D)：TRB 유전자자리에 있어서의 서든 블롯 해석의 결과를 나타낸다. 2명의 도너(#1 및 #3) 유래의 iPS 세포 클론(585 A1, 585 B1, 604 A1 및 604 B1)의 TRB 유전자자리에 있어서 V(D)J 재편성이 생기고 있었다. (E)~(G)：iPS 세포로부터의 테라토마 형성을 나타낸다.
[도 7] 도 7은, Extra EBNA-1 벡터 플라스미드에 의한 iPS 세포의 수립 촉진 효과를 나타낸다. (A) 및 (B)：플라스미드 의 편성 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL), 그리고 그것들과 pCXWB-EBNA1와의 조합을 이용해, PMNC로부터 iPS 세포의 수립을 실시한 결과를 나타낸다. 배지에는, T세포용 배지(A) 또는 비T세포용 배지(B)를 사용한다. (C)：수립된 iPS 세포중에 잔존하는 에피소말 벡터의 카피수를 나타낸다.

본 발명은, (1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 하나 이상의 에피소말 벡터; 및 (2) 상기 (1)과는 다른 EBNA-1을 탑재한 에피소말 벡터, 원하는 바에 따라 추가로, p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터(그 에피소말 벡터에 있어서, p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산은 단독으로 탑재되어 있거나, 상기 (1)의 에피소말 벡터의 어느 하나에, 핵초기화 인자를 코드하는 핵산과 함께 탑재되어 있음)를 체세포에 도입하는 공정을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 포함하는, iPS 세포 수립 효율 개선제 등을 제공한다.

(A) 체세포 소스

iPS 세포 제작을 위한 출발 재료로서 사용할 수 있는 체세포는, 포유 동물(예를 들어, 사람, 마우스, 원숭이, 돼지, 래트 등) 유래의 생식 세포 이외의 어떠한 세포도 사용될 수 있다. 예를 들어, 각질화하는 표피 세포(예, 각질화 표피 세포), 점막 표피 세포(예, 혀표층의 표피 세포), 외분비선상피 세포(예, 유선 세포), 호르몬 분비 세포(예, 부신골수질세포), 대사 또는 저장을 위한 세포(예, 간세포), 경계면을 구성하는 내강표피 세포(예, I형 폐포 세포), 안 사슬 관중강표피 세포(예, 혈관내 가죽 세포), 운반능을 가지는 섬모가 있는 세포(예, 기도 표피 세포), 세포외 매트릭스 분비용 세포(예, 선유아세포), 수축성 세포(예, 평활근 세포), 혈액과 면역계의 세포(예, T임파구), 감각에 관한 세포(예, 간세포), 자율 신경계 뉴런(예, 콜린 작동성 뉴런), 감각 기관과 말초 뉴런의 상피세포(예, 수반세포), 중추 신경계의 신경세포와 신경교 세포(예, 성장 신경교 세포), 색소세포(예, 망막 색소 표피 세포), 및 그들의 선구 세포(조직 선구 세포) 등을 들 수 있다. 세포의 분화의 정도나 세포를 채취하는 동물의 령 등에 특별히 제한은 없고, 미분화인 선구 세포 (체질 간세포도 포함) 로서도, 최종 분화한 성숙 세포로서도, 동일하게 본 발명에 있어서의 체세포의 기원으로서 사용할 수 있다. 여기서 미분화인 선구 세포로서는, 예를 들어 신경간세포, 조혈간세포, 간엽계간세포, 치수간세포 등의 조직간세포(체질 간세포)를 들 수 있다. 특히 혈액 세포(말초혈단핵구세포(T세포 및 비T세포(CD34 양성 세포 및 부모 줄기 세포를 포함하는)를 포함하는), 말초피임파구, 탯줄피세포 등)는, 입수가 용이하고 또한 침습을 수반하지 않기 때문에, 향후 iPS 세포 뱅크를 위한 체세포 소스로서의 이용이 기대된다. 또한, 치수간세포도, 지치나 치주병 등으로 뽑은 이빨로부터 단리, 조제할 수 있으며 입수가 용이하고, 동일하게 iPS 세포 뱅크를 위한 체세포 소스로서의 이용이 기대된다.

체세포로서 말초혈단핵구세포를 사용하는 경우, T세포 수용체(TCR) 유전자자리가 V(D)J 재편성을 일으키고 있어도 생기지 않아도 된다. 바람직한 말초혈단핵구세포는, T세포 수용체(TCR) 유전자자리가 V(D)J 재편성을 일으키고 있는 T세포이지만, 이것으로 한정되지 않는다.

체세포를 채취하는 소스가 되는 포유 동물 개체는 특별히 제한 되지 않지만, 얻어지는 iPS 세포가 사람의 재생 의료용도에 사용되는 경우에는, 거절반응이 일어나지 않는다는 관점에서, 환자 본인 또는 HLA의 형태가 동일 혹은 실질적으로 동일한 타인으로부터 체세포를 채취하는 것이 바람직하다. 여기서 HLA의 형태가 "실질적으로 동일"이란, 면역 억제제 등의 사용에 의해, 그 체세포 유래의 iPS 세포로부터 분화 유도 함으로써 얻어진 세포를 환자에게 이식했을 경우에 이식 세포가 생착 가능하도록 HLA의 형태가 일치하는 것을 말한다. 예를 들어 주된 HLA(예를 들어 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3 유전자자리, 한층 더 HLA-Cw를 포함하는 4 유전자자리)가 동일한 경우 등을 들 수 있다. 또한, 사람에 투여(이식) 하지 않는 경우, 예를 들어, 환자의 약제 감수성이나 부작용의 유무를 평가하기 위한 스크리닝용의 세포의 소스로서 iPS 세포를 사용하는 경우에는, 동일하게 환자 본인 또는 약제 감수성이나 부작용과 상관 하는 유전자다형이 동일한 타인으로부터 체세포를 채취하는 것이 바람직하다.

체세포를 채취하는 소스가 되는 포유 동물 개체가 사람의 경우, 그 해령은, 통상 20대~60대, 바람직하게는, 20대~40대이지만 이들로 한정되지 않는다.

포유 동물로부터 분리한 체세포는, 핵초기화 공정에 제공하는에 앞서, 세포의 종류에 따라 그 배양에 적절한 자체 공지된 배지로 전 배양할 수 있다. 그러한 배지로서는, 예를 들어, 약 5~20%의 소태아 혈청(FCS)을 포함하는 최소 필수 배지(MEM), 다르벡코 개변 이글 배지(DMEM), RPMI1640 배지, 199배지, F12 배지 등을 들 수 있으며, 그것들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 체세포로서 치수간세포를 사용하는 경우에는, Mesenchymal stem cells basal medium (Lonza사) 등의 간엽계간세포용 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 혈액 세포를 사용하는 경우에는, T세포를 농축해 사용하기 때문에, IL-2, 항CD3 항체 및 항CD28 항체를 배양액에 첨가해 사용해도 된다. 동일하게, 비T세포를 농축해 사용하기 위해, IL-3, IL-6, G-CSF 및 GM-CSF를 배양액에 첨가해 사용해도 된다. 또한, 세포의 농축은, 상기(1) 및 (2)의 본 발명의 에피소말 벡터(한층 더 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터를 포함하는 경우가 있는; 이하, "본 발명의 벡터 세트"로서 지칭함)를 도입전 로서도 도입 다음에 있어도 된다. 본 발명의 벡터 세트, 및, 필요에 따라 iPS 세포의 수립 효율 개선 물질과의 접촉에 즈음해, 예를 들어, 카치오닉크리포솜 등 도입 시약을 사용하는 경우에는, 도입 효율의 저하를 방지한다 모아 두어 무혈청 배지에 교환해 두는 것이 바람직한 경우가 있다.

사람 임상 응용에 적절한 완전 xeno-free의 사람 iPS 세포를 얻는 목적에 있어서는, FCS 등의 비사람 동물 유래 성분을 함유 하지 않는 배지를 사용하는 일이 보다 바람직하다. 기본 배지에 여러 가지의 체세포의 배양에 적절한 사람 유래 성분(특히, 증식 인자등의 재조합 사람 단백질)이나 비필수 아미노산, 비타민 류 등을 보충한 배지가 시판되고 있고, 당업자는 체세포 소스에 따라 적절한 xeno-free 배지를 선택할 수 있다. xeno-free 배지로 전 배양된 체세포는, 적당한 xeno-free의 세포 박리액을 이용해 배양 용기로부터 박리하고, 회수후, 본 발명의 벡터 세트와의 접촉에 제공된다.

(B) 핵초기화 인자 인자(단순히 "초기화 인자"로서 지칭함)

본 발명에 있어서 "핵초기화 인자"란, 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 단백성 인자(군)를 의미한다. 본 발명에 사용되는 핵초기화 인자는, 그것들을 코드하는 핵산을 체세포에 도입함으로써 iPS 세포를 유도할 수 있는 한, 어떠한 단백성 인자(군)로서, 예를 들어, Oct 패밀리, Klf 패밀리, Sox 패밀리, Myc 패밀리, Lin 패밀리 및 Glis 패밀리의 멤버로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백성 인자일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 핵초기화 인자는, 적어도 Oct3/4, Klf4 및 Sox2를 포함하고(단, Klf4 및/또는 Sox2는 그들의 기능을 대체 할 수 있는 것으로 보고되는 다른 인자로 치환할 수 있음), p53의 기능 저해 물질을 병용하지 않는 경우에는, 핵초기화 인자로서 한층 더 L-Myc 및 Lin28 혹은 Lin28b를 조합하다 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 사용되는 핵초기화 인자는, Nanog를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 핵초기화 인자로서 이하의 조합이 예시된다.

(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc(여기서, Sox2는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18로 치환가능하다. 또한, Klf4는 Klf1, Klf2 또는 Klf5로 치환가능하다.)

(2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 Large T antigen(이하, SV40LT)

(3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6

(4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7

(5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7

(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1

(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28

(8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, Glis1

(9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT

(10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT

(11) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT

(12) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb는 Esrrg로 치환가능)

(13) Oct3/4, Klf4, Sox2

(14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT

(15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6

(16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7

(17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7

(18) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil

(19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28

(20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT

(21) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT

(22) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT

(23) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb는 Esrrg로 치환가능).

상기에 있어서, Lin28 대신에 Lin28b를 사용할 수도 있다. 또한, Esrrb 혹은 Esrrg를 사용하는 경우(상기(12) 및 (23)), Klf4를 병용해도 된다.

또한, 상기(1)-(23)에는 해당 하지 않지만, 그들의 어느 하나에 있어서의 구성 요소를 모두 포함해, 또한 임의의 다른 물질을 한층 더 포함하는 조합도, 본 발명에 있어서의 "핵초기화 인자"의 범주에 포함될 수 있다. 또한, 핵초기화의 대상이 되는 체세포가 상기 (1)-(23)의 어느 하나에 있어서의 구성 요소의 일부를, 핵초기화를 위해서 충분한 레벨로 내재적으로 발현 하고 있는 조건하에 있어서는, 당해 구성 요소를 제외한 나머지의 구성 요소만의 편성도 또한, 본 발명에 있어서의 "핵초기화 인자"의 범주에 포함될 수 있다.

이들의 조합 중에서, Oct3/4("O"로서 가끔 지칭됨), Sox2("S"로서 가끔 지칭됨), Klf4("K"로서 가끔 지칭됨), Lin28("L"로서 가끔 지칭됨) 및 L-Myc("U"로서 가끔 지칭됨)의 5 인자, 그리고 Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28, L-Myc 및 Glis1("G"로서 가끔 지칭됨)의 6 인자가 바람직한 예로서 들 수 있다.

상기의 각 핵초기화 인자의 마우스 및 사람 cDNA 배열 정보는, WO 2007/069666에 기재된 NCBI accession numbers를 참조 함으로써 취득 할 수 있고(Nanog는 당해 공보중에서는 "ECAT4"라는 명칭으로 기재되어 있다. 또한, Lin28, Lin28b, Esrrb, Esrrg, L-Myc 및 Glis1의 마우스 및 사람 cDNA 배열 정보는, 각각 하기 NCBI accession numbers를 참조 함으로써 취득할 수 있음), 당업자는 용이하게 이들의 cDNA를 단리할 수 있다.

유전자명 마우스 사람

Lin28 NM_145833 NM_024674

Lin28b NM_001031772 NM_001004317

Esrrb NM_011934 NM_004452

Esrrg NM_011935 NM_001438

L-Myc NM_008506 NM_001033081

Glis1 NM_147221 NM_147193

(C) p53의 기능 저해 물질

본 발명은, 상기의 핵초기화 인자에 더해, p53의 기능 저해 물질을 체세포와 접촉 시키는 것이 보다 바람직하다. 본 명세서에 있어서 "p53의 기능 저해 물질"이란, a) p53 단백질의 기능 혹은 b) p53 유전자의 발현을 저해 할 수 있는 한, 어떠한 물질도 된다. 즉, p53 단백질에 직접 작용해 그 기능을 저해하는 물질이나, p53 유전자에 직접 작용해 그 발현을 저해하는 물질 뿐만 아니라, p53의 시그널 전달에 관여하는 인자에 작용함으로써, 결과적으로 p53 단백질의 기능이나 p53 유전자의 발현을 저해하는 물질도, 본 명세서에 있어서의 "p53의 기능 저해 물질"에 포함된다.

p53 단백질의 기능을 저해하는 물질로서는, 예를 들어, p53의 화학적 저해 물질, p53의 도미넌트 네거티브 변이체, 항p53 안타고니스트 항체, p53 응답 엘리먼트의 콘센서스 배열을 포함하는 디코이 핵산, p53 경로를 저해하는 물질 등을 들 수 있으며, 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, p53의 화학적 저해 물질, p53의 도미넌트 네거티브 변이체, p53 경로 저해 물질 를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 들 수 있다. 한편으로는, p53 유전자의 발현을 저해하는 물질로서는, 바람직하게는 p53에 대한 siRNA나 shRNA를 들 수 있다.

p53의 기능 저해 물질의 구체예, 그들의 취득 방법 및 체세포와의 접촉 방법에 대해서는, WO 2009/157593에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 있어서는, p53의 기능 저해 물질로서 p53 shRNA 혹은 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를, 그것을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터의 형태로 체세포에 도입함으로써, 체세포와 접촉시킨다.

본 발명에 있어서 특히 바람직한 p53의 도미넌트 네거티브 변이체는, 마우스 p53의14-301st(사람 p53에서는11-304위에 대응)의 아미노산을 결여되어 없어진 p53DD(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996))이다.

p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산은, 예를 들어, 이하의 수법에 의해 얻을 수 있다. 먼저, 마우스 또는 사람의 p53 cDNA 배열 정보에 기초하여 적당한 올리고 뉴클레오티드를 프로브 혹은 프라이머로서 합성해, 마우스 또는 사람의 세포 또는 조직 유래의 mRNA, cDNA 혹은 cDNA 도서관으로부터, 하이브리다이제이션법이나(RT-) PCR법을 이용해 마우스 또는 사람 p53 cDNA를 클로닝해, 적당한 플라스미드에 서브클로닝 한다. p53DD 와 같은 결여되어 없어진 변이체의 경우에는, 결여되어 없어진 부위의 외측에 프라이머를 설계해, 이것을 이용해 p53 cDNA를 삽입한 플라스미드를 주형으로 하는 인버스 PCR를 실시하는 것으로, 목적 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 cDNA를 취득한다.

단리된 cDNA는, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산의 경우와 마찬가지로, 후술의 에피소말 벡터에 삽입되어 체세포에 도입될 수 있다.

한편으로는, p53에 대한 shRNA는, 마우스 또는 사람의 p53 cDNA 배열 정보에 기초하여, 예를 들어, Elbashir 등(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))에 의해 제안된 규칙에 따라 설계할 수 있다. 당해 규칙 에 기초하여 선택된 표적 배열의 후보군에 대해, 표적 이외의 mRNA에 있어서 16-17 염기가 연속한 배열에 상동성이 있는지 없는지를, BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 등의 상동성 연구학 검색 소프트를 이용해 조사해 선택한 표적 배열의 특이성을 확인한다. 특이성이 확인된 표적 배열에 대해, 19-21 염기의 센스 사슬과 이것에 상보적인 안티센스 사슬로 이루어지는 2개 사슬 RNA를, 루프 구조를 형성할 수 있는 임의의 링커 배열(예를 들어, 8-25 염기정도)을 개재하여 연결함으로써 설계할 수 있다.

구체적으로는, 배열 5'-GACTCCAGTGGTAATCTACTGctcgagCAGTAGATTACCACTGGAGTC-3'(서열 번호 1; 밑줄친 부분이 p53의 타겟 배열, 대문자가 dsRNA를 형성하는 부분)을 갖는 사람 p53에 대한 shRNA등이, 본 발명에 있어서의 특히 바람직한 shRNA로서 사용될 수 있다.

shRNA를 코드하는 DNA를 발현하는 벡터에는, 프로모터로서 polII계 프로모터(예를 들어, CMV전 초기 프로모터)를 사용할 수도 있지만, 짧은 RNA의 전사를 정확하게 실시하게 하기 위해서, polIII계 프로모터를 사용하는 것이 일반적이다. polIII계 프로모터로서는, 마우스 및 사람의 U6-snRNA 프로모터, 사람 H1-RNase P RNA 프로모터, 사람 발린-tRNA 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 전사 종결 시그널로서 4개 이상 T잔기가 연속한 배열이 사용된다.

이와 같이 하여 구축한 shRNA 발현 카세트는, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산의 경우 와 마찬가지로, 후술의 에피소말 벡터에 삽입되어 체세포에 도입될 수 있다.

(D) 발현 카세트

상기의 핵초기화 인자를 코드하는 핵산(및 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산)은, 단독으로 혹은 임의의 조합으로 발현 카세트를 구성하는 일이 생겨 이들의 발현 카세트는 임의의 조합으로 에피소말 벡터에 탑재될 수 있다. 예를 들어, Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc를 초기화 인자로서 사용하는 경우, 이들의 초기화 인자를 코드하는 5개의 핵산은, 이하의 3개의 발현 카세트로서 에피소말 벡터에 탑재된다.

(a) Oct3/4를 코드하는 핵산(O)을 포함하는 발현 카세트;

(b) Sox2를 코드하는 핵산(S)과 Klf4를 코드하는 핵산(K)이 5'로부터 3'방향으로 이 순서(S-K)로 디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열을 개재하여 연결된 발현 카세트; 및

(c) L-Myc를 코드하는 핵산(U)과 Lin28를 코드하는 핵산(L)이 5'로부터 3'방향으로 이 순서(U-L)로 디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열을 개재하여 연결된 발현 카세트.

본 발명의 바람직한 양태에 있어서는, 상기 5개의 초기화 인자에 더해, 한층 더 Glis1가 초기화 인자로서 사용된다. 이 경우, 6개의 초기화 인자를 코드하는 핵산은, 상기(a)~(c)의 3개의 발현 카세트와 (d) Glis1를 코드하는 핵산(G)을 포함하는 발현 카세트와의 4개의 발현 카세트로서 에피소말 벡터에 탑재된다.

다른 양태에 있어서는, Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc의 5개의 초기화 인자를, p53 shRNA 혹은 p53DD와 조합하여 사용한다. 이 경우, 5개의 초기화 인자와 p53 shRNA 혹은 p53DD를 코드하는 6개의 핵산은, 이하의 4개의 발현 카세트로서 에피소말 벡터에 탑재된다.

(a) Oct3/4를 코드하는 핵산(O)을 포함하는 발현 카세트;

(b) Sox2를 코드하는 핵산(S)과 Klf4를 코드하는 핵산(K)이 5'로부터 3'방향으로 이 순서(S-K)로 디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열을 개재하여 연결된 발현 카세트;

(c) L-Myc를 코드하는 핵산(U)과 Lin28를 코드하는 핵산(L)이 5'로부터 3'방향으로 이 순서(U-L)로 디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열을 개재하여 연결된 발현 카세트; 및

(d') p53 shRNA 혹은(d") p53DD를 코드하는 핵산을 포함하는 발현 카세트.

여기서 "디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열"로서는, 예를 들어, 구제역 바이러스의 2A 배열(PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES 배열(미국 특허 제4,937,190호) 등, 바람직하게는 2A 배열을 사용할 수 있다. "발현 카세트"는 초기화 인자 및/또는 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산(O, S-K, U-L, G등)에 더해, 적어도 그 핵산에 기능 적으로 연결하는 프로모터를 포함한다. 그 프로모터로서는, 초기화 인자 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산의 경우, 예를 들어 EF1α 프로모터, CAG 프로모터, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(모로니마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(단순 헤르페스바이러스 티미딘키나아제) 프로모터 등이 사용되며, 그 중에서도, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터가 바람직하다. 또한, 그 발현 카세트는 basal인 프로모터 배열에 더해, 초기화 인자의 발현을 증강하기 위한 인핸서 배열(예를 들어, CMV전 초기 인핸서 등)을 포함하고 있어도 된다. 또한, p53 shRNA를 코드하는 핵산의 경우, 프로모터로서 상기 서술한 대로 U6 프로모터 등의 polIII계 프로모터가 사용되는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 발현 카세트는, 프로모터 외에, 초기화 인자 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산의 3'하류에 polyA 부가 시그널을 함유하는. 한편으로는, p53 shRNA를 코드하는 핵산의 경우에는, 그 핵산의 3'하류에 전사 종결 시그널로서 4개 이상 T잔기가 연속한 배열을 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 발현 카세트에는, 초기화 인자나 p53의 도미넌트 네거티브 변이체의 mRNA의 안정성을 향상시키는 목적으로, 예를 들어, 초기화 인자나 도미넌트 네거티브 변이체의 코딩 영역과 polyA 부가 시그널과의 사이에, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 엘리먼트(WPRE) 배열을 삽입 해도 된다.

(E) 에피소말 벡터

본 발명에 사용되는 에피소말 벡터로서는, 예를 들어, EBV, SV40 등에 유래하는, 포유 동물세포 내에서의 자율 복제에 필요한 배열을 벡터 요소로서 포함하는 벡터를 들 수 있다. 포유 동물세포 내에서의 자율 복제에 필요한 벡터 요소로서는, 구체적으로는, 포유 동물세포로 기능적인 복제 개시점과 그 복제 개시점에 결합해 복제를 제어하는 단백질을 코드하는 유전자이며, 예를 들어, EBV에 있어서는 복제 개시점 oriP와 EBNA-1 유전자, SV40에 있어서는 복제 개시점 ori와 SV40 large T antigen 유전자를 들 수 있다. 보다 바람직하게는 oriP와 EBNA-1 유전자가 사용된다.

또한, 에피소말 벡터는, 원하는 바에 따라, 대장균 등의 세균이나 효모에서의 대량 증폭을 가능하게 하기 위해서, 세균이나 효모의 복제 기점(예를 들어, pUC ori, ColE1 ori, 2μ ori 등)과 선택 마커 유전자(예를 들어, 암피실린 내성 유전자, 영양 요구 성상 보유전자) 등을 한층 더 함유할 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라, 포유 동물세포에서의 선택 마커 유전자로서 예를 들어, 디히드로 엽산환원 효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자등을 추가로 포함할 수 있다. 게다가 초기화 인자를 코드하는 핵산의 발현 카세트를 간편하게 삽입할 수 있도록, 에피소말 벡터는 멀티 클로닝 사이트를 포함할 수 있다. 일 실시양태에 있어서는, 상기 발현 카세트에 있어서의 프로모터, 인핸서, polyA 부가 시그널, WPRE 배열 등은, 미리 에피소말 벡터상에 포함되어 있어 프로모터와 polyA 부가 시그널(벡터가 WPRE 배열을 포함하는 경우에는 WPRE 배열)과의 사이에 초기화 인자를 코드하는 핵산을 삽입함으로써, 유전자 도입 벡터를 구축 할 수 있도록 에피소말 벡터를 디자인할 수도 있다. 그러한 경우, 에피소말 벡터는, 프로모터와 polyA 부가 시그널(벡터가 WPRE 배열을 포함하는 경우에는 WPRE 배열)과의 사이에, 멀티 클로닝 사이트를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터 세트는, 복수(바람직하게는, 2, 3 혹은 4개)의 에피소말 벡터에, 상기(a)~(c), 혹은(a)~(d), (d') 혹은 (d")의 발현 카세트를 각각 1 혹은 2개(살)씩 탑재함으로써 구축된다. 이 점에 관해서, 우리는 이전에, 복수의 발현 카세트의 편성 및 에피소말 벡터상에 있어서의 그들의 배치가 iPS 세포 수립 효율을 현저하게 변화시키는 것으로 나타냈다(미국가특허 출원 제61/521,153호).

본 발명에서는, Extra EBNA-1 벡터의 병용에 의해 현저하고 iPS 세포 수립 효율이 개선되므로, 본 발명의 벡터 세트는, 상기(a)~(c), 혹은(a)~(d), (d') 혹은(d")의 발현 카세트가 각각 1 혹은 2개씩, 2, 3 혹은 4개의 에피소말 벡터상에, 임의의 조합으로, 임의의 순서로, 임의의 위치에 탑재될 수 있다.

그러나, 바람직한 일 실시양태에 있어서는, 본 발명의 벡터 세트는, 상기(a)~(d)의 발현 카세트를 각각 2개씩, 이하의 규칙에 따라 2개의 에피소말 벡터에 탑재 함으로써 구축된다(미국가특허 출원 제61/521,153호).

포유 동물세포로 기능적인 복제 개시점에 결합해 그 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제를 제어하는 단백질(예를 들어, EBNA-1, SV40 large T antigen 등, 바람직하게는 EBNA-1)을 코드하는 유전자(센스 사슬)의 3'-측을 기점으로서(이하, 발현 카세트의 에피소말 벡터상에서의 위치를 나타내는 경우에는, 모두 이 기점을 사용함), 5'로부터 3'방향으로 [발현 카세트 A]- [발현 카세트 B]의 순서로 발현 카세트가 배치된다고 했을 경우,

1) 상기(a)의 발현 카세트(Oct3/4를 코드하는 핵산(O)을 포함함)은 발현 카세트 B의 위치에 배치되며; 바람직하게는,

2) 상기(b)의 발현 카세트(Sox2를 코드하는 핵산(S)과 Klf4를 코드하는 핵산(K)이 5'로부터 3'방향으로 이 순서(S-K)로 디시스트로닉인 발현을 가능하게 하는 개재 배열을 개재하여 연결되고 있음)는 발현 카세트 A의 위치에 배치된다.

여기서, 상기(a)의 발현 카세트와 상기(b)의 발현 카세트란, (i) 동일한 에피소말 벡터상에 탑재되거나 (제1의 에피소말 벡터상에 (b)-(a)의 순서로 배치됨), (ii) 상이한 에피소말 벡터상에 탑재될 수 있다(제1의 에피소말 벡터상에 (c) 혹은 (d)-(a)의 순서로 배치되어 제2의 에피소말 벡터상에 (b)-(d) 혹은 (c)의 순서로 배치됨). 즉, 상기 (i)의 경우에는, (ia) 제1의 에피소말 벡터：(b)-(a) (초기화 인자의 배치로서는 SK-O)와 제2의 발현 벡터：(c)-(d) (초기화 인자의 배치로서는 UL-G)와의 조합, 및 (ib) 제1의 에피소말 벡터：(b)-(a) (초기화 인자의 배치로서는 SK-O)와 제2의 발현 벡터：(d)-(c)(초기화 인자의 배치로서는 G-UL)와의 조합의 2방법의 조합이며, 상기 (ii)의 경우에는, (iia) 제1의 에피소말 벡터：(c)-(a)(초기화 인자의 배치로서는 UL-O)와 제2의 발현 벡터：(b)-(d) (초기화 인자의 배치로서는 SK-G)와의 조합, 및 (iib) 제1의 에피소말 벡터：(d)-(a)(초기화 인자의 배치로서는 G-O)와 제2의 발현 벡터：(b)-(c)(초기화 인자의 배치로서는 SK-UL)와의 조합의 2방법의 조합이다.

그 중에서도, 특히 바람직한 조합으로서 상기(ia)의 조합, 즉, 제1의 에피소말 벡터：(b)-(a)(초기화 인자의 배치로서는 SK-O)와 제2의 발현 벡터：(c)-(d) (초기화 인자의 배치로서는 UL-G)와의 조합을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 후술의 실시예 및 도 1에 나타나는 pCEB-hSK-O와 pCEB-hUL-G와의 조합을 들 수 있다.

상기의 발현 카세트의 배치에 있어서, 각 발현 카세트의 전사 방향은 특별히 제한 되지 않고, 2개의 발현 카세트가 동일 방향으로 전사 되도록 삽입될 수 있으며(head-to-tail), 반대 방향으로 전사 되도록 삽입될 수 있다(head-to-head 또는 tail-to-tail). 또한, 각 발현 카세트의 전사 방향은, 포유 동물세포로 기능적인 복제 개시점에 결합해 그 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제를 제어하는 단백질을 코드하는 유전자의 전사 방향과 동일 방향도 될 수 있고, 반대 방향도 될 수 있다. 바람직한 일 실시양태에 있어서는, 모든 발현 카세트가 그 유전자와 동일 방향으로 전사 되도록 벡터상에 탑재된다.

다른 바람직한 실시양태에 있어서는, 본 발명의 벡터 세트는, 상기(a)~(c)의 발현 카세트가 각각 1개씩, 3개의 에피소말 벡터 상에 탑재된 것이다. 보다 구체적으로는, 이와 같은 3개의 에피소말 벡터로서 pCXLE-hOCT3/4(Addgene#27076), pCXLE-hSK(Addgene#27078) 및 pCXLE-hUL(Addgene#27080)(Nat. Methods, 8(5): 409-412 (2011) 참조)나, 후술의 실시예 및 도 2에 나타나는 pCE-hOCT3/4, pCE-hSK 및 pCE-hUL가 예시된다.

그 벡터 세트가 p53의 기능 저해 물질의 발현 카세트(즉, 상기 (d') 혹은 (d")의 발현 카세트)을 추가로 포함하는 경우, 그 발현 카세트는, 단독으로 별개의 에피소말 벡터에 탑재될 수 있다(합계 4개의 에피소말 벡터). 구체예로서는, 후술의 실시예 및 도 2에 나타나는 pCE-mp53DD 등을 들 수 있다.

혹은, p53의 기능 저해 물질의 발현 카세트는, 상기 (a)~(c)의 발현 카세트가 각각 탑재된 3개의 에피소말 벡터의 어느 하나에 함께 탑재될 수 있다. 바람직하게는, 상기(a)의 발현 카세트 과 함께 에피소말 벡터에 탑재될 수 있지만, 거기에 한정되지 않는다. 초기화 인자를 코드하는 핵산과 함께 에피소말 벡터에 탑재되는 경우, 그 순서는 특별히 제한 되지 않지만, 예를 들어, p53의 기능 저해 물질의 발현 카세트-초기화 인자의 발현 카세트의 순서에 배치할 수 있다. 구체예로서는, pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene#27077)("pCXLE-hOCT3/4-shp53"라고도 지칭됨. Nat. Methods, 8(5): 409-412 (2011) 참조)나, 후술의 실시예 및 도 2에 나타나는 pCE-hOCT3/4-shp53-F("pCE-hOCT3/4-shp53"로서 지칭함)를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 에피소말 벡터는, 그 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소의 5'측 및 3'측에 loxP 배열을 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 그 벡터 요소의 5'측 및 3'측에 loxP 배열을 동방향으로 배치한 에피소말 벡터가 사용될 수 있다. 에피소말 벡터는 염색체외에서 자율 복제 가능하기 때문에, 게놈에 짜넣어지지 않아도 숙주 세포 내에서의 안정인 발현을 제공할 수 있지만, 일단 iPS 세포가 수립된 후는, 당해 벡터는 신속하게 제외해지는 것이 바람직하다. 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소를 2개의 loxP 배열로 사이에 두어, 이것에 Cre 리콤비나아제를 작용시켜 당해 벡터 요소를 자르는 것으로, 에피소말 벡터의 자율 복제능을 상실시킬 수가 있어 그 벡터를 조기에 iPS 세포로부터 탈락 시킬 수 있다.

본 발명으로 사용되는 loxP 배열로서는, bacteriophage P1 유래의 야생형 loxP 배열 이외에, 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소를 사이에 두는 위치에 동방향으로 배치되었을 경우에, 재조합을 일으켜 loxP 배열간의 배열을 결여되어 없앨 수 있는 임의의 변이 loxP 배열을 들 수 있다. 변이 loxP 배열로서는, 예를 들어, 5'측 반복 배열에 변이가 있는 lox71, 3'측 반복 배열에 변이가 있는 lox66, 스페이서-부분에 변이가 있는 lox2272나 lox511 등을 들 수 있다. 그 벡터 요소의 5'측 및 3'측에 배치되는 2개의 loxP 배열은, 동일하거나 상이할 수 있으며, 스페이서-부분에 변이가 있는 변이 loxP 배열의 경우에는 동일한 것(예, lox2272끼리, lox511끼리)이 사용된다. 바람직하게는, 5'측 반복 배열에 변이가 있는 변이 loxP 배열(예, lox71)과 3'측 반복 배열에 변이가 있는 변이 loxP 배열(예, lox66)과의 조합을 들 수 있다. 이 경우, 재조합의 결과 염색체 상에 남는 loxP 배열은 5'측 및 3'측의 반복 배열에 이중 변이를 가져 Cre 리콤비나아제에 인식되기 어렵고, 불필요한 재조합에 의해 염색체의 결손 변이를 일으키는 리스크가 저감된다. lox71와 lox66를 사용하는 경우, 상기 벡터 요소의 5'측 및 3'측에 어느 변이 loxP 배열을 배치 해도 된다가, 변이 부위가 loxP 배열의 외단에 배치되는 것 같은 방향으로 변이 loxP 배열을 삽입할 필요가 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 에피소말 벡터는 Cre 리콤비나아제를 작용시키지 않아도, 조기에 세포로부터 탈락하는 자기 소실형 벡터이지만, 예 외적으로 세포로부터의 탈락에 시간 이 가해지는 경우도 상정되므로, Cre 리콤비나아제 처리 에 의한 불필요한 재조합등의 리스크에 구비하여 loxP 배열을 설계해 두는 것이 바람직한 경우도 있다.

2개의 loxP 배열은, 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소(즉, 포유 동물세포로 기능적인 복제 개시점(예를 들어, EBV oriP, SV40 ori 등 , 바람직하게는 oriP), 또는 그 복제 개시점에 결합해 복제를 제어하는 단백질(예를 들어, EBNA-1, SV40 large T antigen 등 , 바람직하게는 EBNA-1)을 코드하는 유전자 배열)의 5'측 및 3'측에, 동방향으로 배치된다. loxP 배열이 사이에 두는 벡터 요소는, 복제 개시점, 또는 복제 개시점에 결합해 복제를 제어하는 단백질을 코드하는 유전자 배열의 어느 하나일 수 있고, 둘 다 일 수도 있다.

본 발명으로 사용되는 에피소말 벡터는, loxP 배열의 존재의 유무에 관계없이, 체세포에 도입했을 때에, 그 벡터를 구성하는 외래 핵산 인자(초기화 인자 또는 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 포함)가 일괄적으로도 세포의 게놈중에 짜넣어지지 않는 에피소말 벡터 본래의 효과 뿐만이 아니라, Cre 리콤비나아제 처리를 실시하는 무사히, 빠른 단계에서 에피솜으로서 존재하는 그 벡터가 iPS 세포로부터 탈락하는 예기치 못한 효과를 발휘한다는 것이다. 즉, 본 발명은 또한, iPS 세포의 수립에 충분한 초기화 인자 및 p53 기능 저해 물질의 발현을 제공한 후, 조기에 세포로부터 탈락하는 자기 소실형의 에피소말 벡터를 제공한다. 여기서 "탈락한다"란, WO 2011/016588 A1의 실시예 6 혹은 10 에 기재되는 PCR 분석 또는 실시예 11 에 기재되는 RT-PCR 분석에 있어서, 그 벡터의 존재 또는 그 벡터에 탑재된 초기화 인자 또는 p53 기능 저해 물질의 발현이 검출되지 않는 것을 의미한다. 이러한 벡터는, 그 도입에 의해 수립되는 iPS 세포 클론의 50%이상, 바람직하게는 60%이상, 보다 바람직하게는 70%이상의 클론에 있어서, 10계대까지 iPS 세포로부터 탈락하는 것을 특징으로 한다. 혹은, 그 자기 소실형 에피소말 벡터는, 도입 후 1주간 이내에 있어서의 1x10⁴ 세포 근처의 카피수가 10⁶개의 오더인데 대해, iPS 세포 수립시(예를 들어, 벡터 도입으로부터 약 4주일 후)에 있어서의 1x10⁴ 세포 근처의 카피수가 100개 이하, 바람직하게는 50개 이하, 보다 바람직하게는 30개 이하에까지 감쇠하는 정도로 세포 내에서 불안정하다는 것을 특징으로 한다.

구체적으로는, 본 발명의 조기 자기 소실형 벡터는 이하의 (i)~(vii) 중 적게는 1개, 바람직하게는 2개 이상, 보다 바람직하게는 3개 이상, 특히 바람직하게는 4개 이상의 구조적 특징을 갖는 것이다.

(i) 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소(예를 들어, EBNA-1 유전자나 SV40 Large T antigen 유전자, 바람직하게는 EBNA-1 유전자)의 5'측 및 3'측에 loxP 배열이 동방향으로 배치되고 있다.

(ii) 초기화 인자를 코드하는 핵산이 CAG 프로모터의 제어하에 있다.

(iii) 초기화 인자 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산이 CMV전 초기 인핸서의 제어하에 있다.

(iv) 초기화 인자 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산이 토끼 β-글로빈 polyA 부가 시그널의 제어하에 있다.

(v) 초기화 인자 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체를 코드하는 핵산과 polyA 부가 시그널과의 사이에 WPRE 배열을 포함한다.

(vi) p53 shRNA를 코드하는 핵산이 U6 프로모터의 제어하에 있다.

(vii) 세균으로 기능적인 복제 기점(예를 들어, pUC ori, ColE1 ori, 바람직하게는 pUC ori), 및 세균에서의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자(예를 들어, 암피실린 내성 유전자)를 포함한다.

(viii) 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소(예를 들어, EBNA-1 유전자나 SV40 Large T antigen 유전자, 바람직하게는 EBNA-1 유전자)와 벡터상에 탑재되는 각 초기화 인자 또는 p53 기능 저해 물질을 코드하는 핵산이, 동일 방향으로 전사된다.

또한, 미국가특허 출원 제61/521,153호의 실시예 6에 나타나는 대로, 4개의 발현 카세트를 1개의 에피소말 벡터상에 탑재한 유전자 도입 벡터를 체세포에 도입했을 경우에서도, iPS 세포를 수립할 수 있다. 이 경우에 대해도, 발현 카세트의 배치순서를 검토하는 것으로, 한층 더 수립 효율이 개선될 가능성이 있다.

(F) Extra EBNA-1 벡터 플라스미드

EBNA-1 (Epstein-Barr virus nuclear antigen 1) 단백질은, EBV(Epstein-Barr virus)가 세포내에 잠복 감염 즈음해, 그 에피솜의 복제, 유지, 나아가서는 바이러스 유전자군의 전사 발현에 매우 중요한 역할을 완수하는 단백질이며, 그러한 기능은, 당해 단백질이 EBV 게놈 DNA의 OriP 영역에 결합함으로써 달성되는 것으로 알려져 있다(Frappier, L., and O'Donnell, M. (1991) J. Biol. Chem. 266, 7819-7826). 본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 그러한 EBNA-1의 기능을 이용해 OriP 영역을 갖는 에피소말 벡터의 자율 복제를 가능하게 하는 것이다. 본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, EBNA-1단백질을 코드하는 유전자를 탑재 하고 있고, 포유 동물세포내에 있어서 EBNA-1단백질을 일과적 혹은 구성 적으로 발현할 수 있다.

본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 프로모터의 제어하에 EBNA-1 코드 영역이 삽입된 구조를 취해, EBNA-1 코드 영역의 발현을 가능하게 하는 구조를 갖는 플라스미드이면 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 프로모터 외에 원하는 바에 따라 인핸서, 폴리 A부가 시그널, 선택 마커 유전자 등을 함유할 수 있다. 선택 마커 유전자로서는, 예를 들어, 암피실린 내성 유전자, 디히드로 엽산환원 효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다. EBNA-1 코드 영역을 제어하는 프로모터로서는, 예를 들어, EF1α 프로모터, CAG 프로모터, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV(모로니마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK(단순 헤르페스바이러스 티미딘키나아제) 프로모터 등이 사용된다. 그 중에서도, CAG 프로모터, CMV 프로모터 등이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 예를 들어, pCX-EGFP(FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)를 이용해 하기의 순서에 의해 제작할 수 있다.

·pCX-EGFP의 pA배열의 5'측에 WPRE 배열을 삽입해, 제한 효소 BamHI 처리에 의해 SV40ori를 추가로 없앤다.

·이어서, 이 벡터의 EGFP 부분을 EcoRI로 없애고, 대신에 EBNA-1 코드 영역을 삽입한다.

이에 따라 수득된 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 본 명세서에 있어서 별명 "pCXWB-EBNA-1"으로 지칭한다.

다른 양태에 있어서, 본 발명에 있어서의 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 예를 들어, pCX-EGFP(FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)를 이용해 하기의 순서에 의해 제작할 수 있다.

·pCX-EGFP를 제한 효소 BamHI에 의해 처리해, 자가 라이게이션시킨다(pCXB-EGFP).

·이어서, 이 벡터를 제한 효소 EcoRI로 처리해, pCXWB-EBNA1의 EcoRI 프래그먼트(EBNA-1 코드 영역)를 삽입한다.

이에 따라 수득된 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 본 명세서에 있어서 별명 "pCXB-EBNA1"으로 지칭한다.

Extra EBNA-1 벡터 플라스미드의 사용 양태로서는, 예를 들어, iPS 세포의 수립 공정에 있어서 핵초기화 인자를 탑재한 에피소말 벡터와 동시에 세포에 접촉시킬 수 있다. 또 다른 양태에서는, Extra EBNA-1 벡터 플라스미드는, 핵초기화 인자를 탑재한 에피소말 벡터를 세포에 접촉 시키기 전에, 또는 접촉 시킨 후에, 당해 세포에 접촉 시킬 수 있다. 전자의 양태가 본 발명을 실시하는데 있어서 보다 바람직하다.

Extra EBNA-1 벡터 플라스미드에 의한 iPS 세포의 수립 효율 개선 효과의 메커니즘으로서는, 예를 들어, 종래의 방법에서는 oriP에 결합하는 EBNA-1의 양이 충분하지 않고, 그 결과, 핵초기화 인자를 탑재한 에피소말 벡터의 복제가 충분히 실시하지 못하고, 핵초기화 인자의 발현량이 불충분했는데, Extra EBNA-1 벡터 플라스미드에 의해 EBNA-1의 부족분을 보상할 수 있었던 것으로 생각되지만, 다른 메커니즘으로 iPS 세포의 수립 효율이 개선하고 있었다고 해도 본 발명에 영향을 주지 않음은 분명하다.

이하, 본 명세서에 있어서, 에피소말 벡터를 이용해 수립된 iPS 세포를 "epi-iPS cells" 또는 "epi-iPSCs"라고 지칭하기도 한다. 또한, 본 발명에 있어서의 도입 유전자의 조합을 "C1, T1, T2, Y3, Y3+EBNA1, Y4, Y4+EBNA1, Y5+EBNA1, Y6+EBNA1"라고 지칭하는 경우, 이들의 조합은 이하의 표 1에 나타내는 바와 같이이다.

[표 1]

(G) 벡터 세트의 체세포에 대한 도입 방법

상기의 에피소말 벡터의 조합으로 이루어지는 벡터 세트는, 예를 들어 리포페크션법, 리포솜법, 에레크트로포레이션법, 인산 칼슘 공침전법, DEAE 완성도 파업 런법, 현미경하주사법법, 유전자총법 등을 이용해 체세포에 도입할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 또는 Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011) 등에 기재되는 방법을 사용할 수 있다. iPS 세포로부터 에피소말 벡터의 포유 동물세포 내에서의 복제에 필요한 벡터 요소가 제거된 인지의 여부의 확인은, 그 벡터 요소 내부 및/또는(loxP 배열을 사용한 경우에는) loxP 배열 근방의 염기 배열을 포함하는 핵산을 프로브 또는 프라이머로서 이용해 그 iPS 세포로부터 단리 한 에피솜 획분을 주형으로서 서든 블롯 분석 또는 PCR 분석을 실시해, 밴드의 유무 또는 검출 밴드의 길이를 조사하는 것으로 실시할 수 있다(WO 2011/016588 A1, Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011) 참조). 에피솜 획분의 조제는 당해 분야에서 주지의 방법을 이용해 실시하면 되고, 예를 들어, Science, 324: 797-801 (2009), WO 2011/016588 A1 또는 Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011) 등에 기재되는 방법을 사용할 수 있다.

(H) iPS 세포의 수립 효율 개선 물질

공지된 iPS 세포 수립 효율 개선 물질을 체세포에 접촉 시킴으로써, iPS 세포의 수립 효율을 한층 더 높이는 것을 기대할 수 있다. 그러한 iPS 세포의 수립 효율 개선 물질로서는, 예를 들어, 히스톤데아세치라제(HDAC) 저해제 [예를 들어, 바르프로산 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)), 트리코스타틴 A, 부티르산 나트륨, MC 1293, M344등의 저분자 저해제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA(예, HDAC1 siRNA Smartpool(등록상표) (Millipore), HuSH 29 mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], G9a 히스톤메틸트란스페라제 저해제 [예를 들어, BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)) 등의 저분자 저해제, G9a에 대한 siRNA 및 shRNA(예, G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], L-calcium channel agonist (예를 들어 Bayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), 세포내 시그널 전달의 수식제 [예를 들어, Wnt Signaling 활성화제(예를 들어 가용성 Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), TGF-β 저해제, MEK 저해제, 2 i/LIF (2i는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 시그널링 및 글리코겐 신타아제 키나아제-3 의 저해제임, PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))], 다른 천연 혹은 합성 저분자 화합물(예, 5'-아자시티딘, 티아조비빈, 비타민 C 등), ES세포 특이적 miRNA(예를 들어, miR-302-367 클러스터 (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08, WO2009/075119), miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10), miR-291-3 p, miR-294 및 miR-295 (이상, Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))) 등을 들 수 있으나, 그것들로 한정되지 않는다. 상기에 있어서 핵산성의 발현 저해제는 siRNA 혹은 shRNA를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터의 형태로서도 된다.

이들 iPS 세포 수립 효율 개선 물질의 체세포에 대한 접촉은, 그 물질이 (a) 단백성 인자인 경우, (b) 그 단백성 인자를 코드하는 핵산인 경우, 혹은 (c) 저분자화합물인 경우에 따라, 각각 주지 관용의 방법에 의해 실시할 수 있다.

iPS 세포의 수립 효율 개선 물질은, 그 물질의 비존재하와 비교해 체세포로부터의 iPS 세포 수립 효율이 유의하게 개선되는 한, 본 발명의 벡터 세트와 동시에 체세포에 접촉시켜도 되며, 또한, 어느 쪽이든 먼저 접촉시켜도 된다.

(I) 배양 조건에 의한 수립 효율의 개선

체세포의 핵초기화 공정에 있어서 저산소 조건하에서 세포를 배양함으로써, iPS 세포의 수립 효율을 한층 더 개선할 수 있다. 본 명세서에 있어서 "저산소 조건"이란, 세포를 배양할 때의 분위기 중의 산소 농도가, 대기 중의 그것보다 유의하게 낮은 것을 의미한다. 구체적으로는, 통상적인 세포 배양으로 일반적으로 사용되는 5-10% CO₂/95-90% 대기의 분위기 중의 산소 농도보다 낮은 산소 농도의 조건을 들 수 있으며, 예를 들어 분위기 중의 산소 농도가 18% 이하의 조건이 해당 한다. 바람직하게는, 분위기 중의 산소 농도는 15% 이하(예, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하 등), 10% 이하(예, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하 등), 또는 5% 이하(예, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 등)이다. 또한, 분위기 중의 산소 농도는, 바람직하게는 0.1% 이상(예, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상 등), 0.5% 이상(예, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.95 이상 등), 또는1% 이상(예, 1.1% 이상, 1.2% 이상, 1.3% 이상, 1.4% 이상 등)이다.

세포의 환경에 있어서 저산소 상태를 창출하는 수법은 특별히 제한 되지 않지만, 산소 농도의 조절 가능한 CO₂ 인큐베이터 내에서 세포를 배양할 방법이 가장 용이하고, 바람직한 예로서 들 수 있다. 산소 농도의 조절 가능한 CO₂ 인큐베이터는, 여러 가지의 기기 제조자로부터 판매되고 있다(예를 들어, Thermo scientific, Ikemoto Scientific Technology, Juji Field, Wakenyaku 등의 제조사제 저산소 배양용 CO₂ 인큐베이터를 사용할 수 있다).

저산소 조건 하에서 세포 배양을 개시하는 시기는, iPS 세포의 수립 효율이 정상 산소 농도(20%)의 경우에 비교해 개선되는 것을 방해하지 않는 한 특별히 한정되지 않고, 체세포에 대한 본 발명 벡터 세트의 접촉 전, 접촉과 동시, 접촉 이후일 수 있는데, 예를 들어, 체세포에 그 벡터 세트를 접촉시킨 직후부터, 혹은 접촉 후 일정기간(예를 들어, 1 내지 10(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9)일 후에 저산소 조건 하에서 배양하는 것이 바람직하다.

저산소 조건하에서 세포를 배양하는 기간도, iPS 세포의 수립 효율이 정상 산소 농도(20%)의 경우에 비교해 개선되는 것을 방해하지 않는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 3일 이상, 5일 이상, 7일 이상 또는 10일 이상으로, 50일 이하, 40일 이하, 35일 이하 또는 30일 이하의 기간 등을 들 수 있으나, 그것들로 한정되지 않는다. 저산소 조건하에서의 바람직한 배양 기간은, 분위기 중의 산소 농도에 의해도 변하며, 당업자는 사용하는 산소 농도에 따라 적절히 당해 배양 기간을 조정할 수 있다. 또한, 일 실시양태에 있어서, iPS 세포의 후보 콜로니의 선택을, 약제 내성을 지표로 하여 실시하는 경우에는, 약제 선택을 개시하기 까지 저산소 조건으로부터 정상 산소 농도에 되돌리는 것이 바람직하다.

또한, 저산소 조건하에서 세포 배양을 개시하는 바람직한 시기 및 바람직한 배양 기간은, 정상 산소 농도 조건 하에서의 iPS 세포 수립 효율 등에 의해도 변동된다. 본 발명의 벡터 세트(또한 필요에 따라 iPS 세포의 수립 효율 개선 물질)를 접촉시킨 후, 세포를, 예를 들어 ES 세포의 배양에 적절한 조건하에서 배양할 수 있다. 마우스 세포의 경우, 통상적인 배지에 분화 억제 인자로서 Leukemia Inhibitory Factor(LIF)를 첨가해 배양을 실시한다. 한편으로는, 사람 세포의 경우에는, LIF 대신에 염기성 선유아세포 증식 인자(bFGF) 및/또는 간세포 인자(SCF)를 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 세포는, 피더 세포로서 방사선이나 항생 물질로 처리해 세포 분열을 정지시킨 마우스태아유래의 선유아세포의 공존하에서 배양되어도 되고, 이들의 피더 세포 대신에 세포외 매트릭스를 코트한 배양접시를 이용해 배양되어도 된다. 마우스태아유래의 선유아세포로서는, 통상 STO 세포주(ATCC CRL-1503) 등이 피더로서 사용되지만, iPS 세포의 유도에는, STO 세포에 네오마이신 내성 유전자와 LIF 유전자를 안정적으로 짜넣은 SNL 세포(SNL76/7 STO 세포; ECACC 07032801)(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) 등이 사용되고 있다. 또한, 마우스태아유래의 초대 선유아세포(MEF)도 사용할 수 있다. 마이트마이신 C-처리된 MEF는, Millipore and ReproCELL Incorporated사로부터 시판되고 있다. 이들의 피더 세포와의 공배양은, 본 발명의 벡터 세트의 접촉 전부터 개시될 수 있으며, 그 접촉 때부터, 혹은 그 접촉보다 후 (예를 들어 1-10일 후)부터 개시될 수 있다.

배양 배지는, Rho 키나아제(ROCK) 저해제를 포함하고 있어도 된다. 특히, 배양 공정이 사람 iPS 세포를 단일 세포에 분산시키는 공정을 포함하는 경우에는, 배지에 ROCK 저해제가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 피더 세포로서 MEF 세포나 SNL 세포가 사용되는 경우, 함께 사용되는 배지 안에 ROCK 저해제가 포함되어 있어도 포함되지 않아도 되는데, 포함되지 않은 것이 바람직하다. ROCK 저해제로서는, 예를 들어, Y-27632가 사용되지만, 이것으로 한정되지 않는다.

본 발명의 벡터 세트의 사용에 의해, 체세포에 대한 그 벡터 세트의 도입으로부터, iPS 세포를 수립하고, 추가로 iPS 세포로서 유지할 때까지, 비사람 동물 유래 성분을 일절 이용하지 않고 배양해(즉, 완전 xeno-free의 조건하에서), 사람 iPS 세포를 제작하는 것이 가능하다. xeno-free의 조건하에서 사람 iPS 세포를 유도하는 경우, 본 발명의 벡터 세트(또한 필요에 따라 iPS 세포의 수립 효율 개선 물질)를 접촉 시킨 후, 세포는, FCS나 다른 비사람 동물 유래 성분을 포함하지 않는 배지 안으로 배양된다. 분화 억제 인자로서 배지에 첨가되는 물질(예, bFGF, SCF 등)로서는, 사람 유래의 정제된 단백질, 바람직하게는 재조합 단백질이 사용된다. 피더 세포로서는, 사람 유래의 임의의 체세포를 사용할 수 있으며, 예를 들어 사람 피부 선유아세포(HDF)나 사람 치수간세포 등이 바람직하게 이용될 수 있다. 또한, 피더 세포를 사용하지 않고 사람 iPS 세포를 유도하는 것도 가능하다. 이 경우, 세포 용기의 코팅제로서 세포외 매트릭스를 사용할 수도 있다. 세포외 매트릭스란, 세포의 밖에 존재하는 초분자 구조체이며, 천연 유래이거나, 인공물(재조합체)일 수 있다. 예를 들어, 콜라겐, 프로테오그리칸, 피브로넥틴, 히알루론산, 테네이신, 엔타크틴, 에라스틴, 피브리린 및 라미닌과 같은 물질 또는 이들의 단편을 들 수 있다. 이들의 세포외 기질은, 조합하여 이용되어도 되고, 예를 들어, BD Matrigel(TM) 등의 세포로부터의 조제물로서도 된다. 그 밖에도 시판되는 xeno-free의 코팅제를 사용할 수 있다. 시판되는 xeno-free의 코팅제로서는, 예를 들어, CellStart, Coat1, VTN-N, Synthemax2, Retronectin를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

에피소말 벡터를 이용해, 말초혈단핵구세포(T세포 및 비T세포(CD34 양성 세포 및 줄기 부모 세포를 포함)로부터 iPS 세포를 수립하는 방법은, 예를 들어, 쿄토 대학 iPS 세포 배양 프로토콜(http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)에 상세히 서술 되고 있다.

iPS 세포의 후보 콜로니의 선택은, 약제 내성과 리포터 활성을 지표로 하는 방법과 육안으로 형태 관찰 에 의한 방법이 들 수 있다. 전자로서는, 예를 들어, 분화 다능성 세포에 있어서 특이적에 고발현하는 유전자(예를 들어, Fbx15, Nanog, Oct3/4 등, 바람직하게는 Nanog 또는 Oct3/4)의 유전자자리에, 약제 내성 유전자 및/또는 리포터 유전자를 타겟팅 한 재조합 체세포를 이용해 약제 내성 및/또는 리포터 활성 양성의 콜로니를 선택하는 것이다. 그러한 재조합 체세포로서는, 예를 들어 Fbx15 유전자자리에 βgeo(β-갈락토시다아제와 네오마이신포스포트란스페라제와의 융합 단백질을 코드함) 유전자를 노크인 한 마우스 유래의 MEF(Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)), 혹은 Nanog 유전자자리에 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자와 퓨로마이신 내성 유전자를 짜넣은 트랜스 적합 마우스 유래의 MEF(Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)) 등을 들 수 있다. 한편으로는, 육안으로 형태 관찰하여 후보 콜로니를 선택하는 방법으로서는, 예를 들어 Takahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)에 기재된 방법을 들 수 있다. 리포터 세포를 사용하는 방법은 간편해 효율적이지만, iPS 세포가 사람의 치료 용도를 목적으로 해 제작되는 경우, 안전성의 관점에서 육안으로 콜로니를 선택하는 것이 바람직하다.

선택된 콜로니의 세포가 iPS 세포인 것을 확인하는 것은, 상기한 Nanog(혹은 Oct3/4) 리포터 양성(퓨로마이신 내성, GFP 양성적인) 및 육안으로 ES세포모양 콜로니의 형성에 의해도 확인될 수 있지만, 보다 정확을 기하기 위해서, 알칼리 포스파타아제 염색이나, 각종 ES세포 특이적 유전자의 발현을 해석하거나 선택된 세포를 마우스에 이식해 테라토마 형성을 확인하는 등의 시험을 실시할 수도 있다.

이와 같이 하여 수립된 iPS 세포는, 여러 가지의 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들어, ES세포로 보고되고 있는 분화 유도법을 이용해, iPS 세포로부터 여러 가지의 세포(예, 심근 세포, 혈액 세포, 신경세포, 혈관내 가죽 세포, 인슐린 분비 세포 등)에 대한 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 환자 본인이나 HLA의 형태가 동일 혹은 실질적으로 동일한 타인으로부터 채취한 체세포를 이용해 iPS 세포를 유도하면, 그곳으로부터 원하는 세포(즉, 그 환자가 이환 장기의 세포나 질환에 대한 치료 효과를 발휘하는 세포 등)에 분화시켜 그 환자에게 이식하면, 자가 혹은 동종이계 이식에 의한 간세포 요법이 가능해진다. 게다가 iPS 세포로부터 분화시킨 기능 세포(예, 간세포)는, 대응하는 기존의 세포주보다 실제의 생체내에서의 그 기능 세포 상태를 보다 반영하는 것으로 생각되므로, 의약 후보 화합물의 약효나 독성의 in vitro 스크리닝등에도 바람직하게 사용할 수 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 그 실시예들로 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1：초기화에 사용하는 각종 에피소말플라스미드의 제작

pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL, 및 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F의 4종의 플라스미드는 이전에 제작한 것을 사용한(Okita et al., Nature Methods, 8(5), 409-412(2011), 국제 공보 WO2011/016588). 각 플라스미드의 구성의 개요는, 하기 와 같다.

1) pCXLE-hOCT3/4(Addgene#27076):

사람 Oct3/4의 번역 영역을 CAG 프로모터의 제어하에 배치한 발현 카세트(번역 영역의 하류에 WPRE 배열과 토끼 β-글로빈 polyA 부가 시그널을 포함함. 이하 동일)를, EBNA-1 유전자(센스 사슬)의 3'측을 기점으로 해(이하 동일), 5'로부터 3'방향으로 이 순서로 배치한 플라스미드.

2) pCXLE-hSK(Addgene#27078):

사람 Sox2 및 사람 Klf4의 각 번역 영역을 구제역 바이러스(FMV) 2 A배열 (PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007)을 끼워 연결한 콘스트라크트를, CAG 프로모터의 제어하에 배치한 발현 카세트를, EBNA-1 유전자(센스 사슬)의 3'측을 기점으로 해, 5'로부터 3'방향으로 이 순서로 배치한 플라스미드.

3) pCXLE-hUL(Addgene#27080):

사람 L-Myc 및 사람 Lin28의 각 번역 영역을 구제역 바이러스(FMV) 2 A배열을 끼워 연결한 콘스트라크트를, CAG 프로모터의 제어하에 배치한 발현 카세트를, EBNA-1 유전자(센스 사슬)의 3'측을 기점으로 해, 5'로부터 3'방향으로 이 순서로 배치한 플라스미드.

4) pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene#27077):

p53shRNA를 코드하는 핵산 영역과 사람 Oct3/4의 번역 영역을, 각각 U6 프로모터와 CAG 프로모터의 제어하에 배치한 발현 카세트를, 5'로부터 3'방향으로 이 순서로 배치한 플라스미드.

pCEB-hSK-O, pCEB-hUL-G, pCE-EGFP, pCXLE-hGLIS1, pCE-hOCT3/4, pCE-hOCT3/4-shp53-F, pCE-hSK, pCE-hUL 및 pCE-mp53DD에 대해서는, 하기대로 제작했다.

1) pCEB-hSK-O：

pCX-EGFP(Osaka University, Dr. Masaru OKABE로부터 공여됨, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)의 pA배열의 5'측에 WPRE 배열을 삽입하고, 또한 제한 효소 BamHI 처리에 의해 SV40ori를 없앴다. 이 벡터를 pCXWB로 했다. 이 벡터의 EGFP 부분을 EcoRI로 없애, 교체되는 pCXLE-hOCT3/4보다 동일하게 EcoRI로 자른 사람 유전자의 번역 영역을 삽입했다. 이것을 pCXWB-hOCT3/4라고 이름 붙였다. 이 벡터를 SalI로 처리해, 그곳에 동일하게 SalI 처리한 pCXLE-hSK를 삽입함으로써 pCEB-hSK-O를 제작했다(도 1 A).

2) pCXLE-hGLIS1：

pMXs-hGLIS1로부터 hGLIS1 부분을 PCR로 증폭해, pCR2.1에 삽입했다. 이어서, 제한 효소 EcoRI로 처리해 hGLIS1 프래그먼트를 잘라, 그것을 제한 효소 EcoRI로 처리해 둔 pCXLE-EGFP에 삽입했다.

3) pCEB-hUL-G：

pCXWB의 EGFP 부분을 EcoRI로 없애, 교체되는 pCXLE-hGLIS1보다 동일하게 EcoRI로 자른 사람 유전자의 번역 영역을 삽입했다. 이것을 pCXWB-hGLIS1라고 이름 붙였다. 이 벡터를 SalI로 처리해, 그곳에 동일하게 SalI 처리한 pCXLE-hUL를 삽입함으로써 pCEB-hUL-G를 제작했다(도 1 B).

4) pCE-EGFP:

pBluescriptII KS-를 제한 효소 BamHI/XhoI로 처리해, 그곳에 링커를 삽입해, pBS-XhoBam를 제작했다. 이어서, pBS-XhoBam를 제한 효소 SalI/MfeI로 처리해, 그곳에 pCEP4의 SalI/EcoRI 프래그먼트를 삽입해, pBS-CEPcassette를 제작했다. 이어서, pCX-EGFP를 제한 효소 BamHI로 처리해, 그곳에 pBS-CEPcassette의 BamHI/BglII 프래그먼트를 삽입함으로써, pCE-EGFP를 제작했다.

5) pCE-hOCT3/4(도 2 A):

상기 pCE-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, 그곳에 pCXLE-hOCT3/4의 EcoRI 프래그먼트를 삽입했다.

6) pCE-hOCT3/4-shp53-F(도 2 B):

상기 pCE-hOCT3/4를 제한 효소 BamHI로 처리해, 그곳에 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F의 BamHI 프래그먼트를 삽입했다.

7) pCE-hSK(도 2 C):

상기 pCE-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, 그곳에 pCXLE-hSK의 EcoRI 프래그먼트를 삽입했다.

8) pCE-hUL(도 2 D):

상기 pCE-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, 그곳에 pCXLE-hUL의 EcoRI 프래그먼트를 삽입했다.

9) pCE-mp53DD(도 2 E):

pENTR-p53DD로부터 mp53DD 부분을 PCR로 증폭해, pCR2.1에 삽입해, pTopo-mp53DD를 제작했다. 이어서, pCXLE-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, 그곳에 pTopo-mp53DD의 EcoRI 프래그먼트를 삽입해, pCXLE-mp53DD를 제작했다. 이어서, 상기 pCE-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, 그곳에 pCXLE-mp53DD의 EcoRI 프래그먼트를 삽입함으로써, pCE-mp53DD를 제작했다.

실시예 2：Extra EBNA-1 벡터 플라스미드의 제작

효율적으로 트랜스 진을 발현시키기 위해서, pCX-EGFP(Osaka University, Dr. Masaru OKABE로부터 공여됨, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)의 pA배열의 5'측에 WPRE 배열을 삽입하고, 또한 제한 효소 BamHI 처리에 의해 SV40ori를 없앴다. 이 벡터를 pCXWB로 했다. 이어서, pCXWB의 EGFP 부분을 EcoRI로 없애, 대신에 pCEP4(Invitrogen)로부터 PCR 증폭시킨 EBNA-1 코드 영역을 삽입했다. 이 벡터를 "pCXWB-EBNA1"라고 이름 붙여, 이하의 실험에 있어서 사용했다(도 3 A).

또한, 다른 Extra EBNA-1 벡터 플라스미드인 pCXB-EBNA1를 하기대로 제작했다. 최초로, pCX-EGFP를 제한 효소 BamHI에 의해 처리해, 자가 라이게이션시켰다. 이 벡터를 pCXB-EGFP로 했다. 이어서, pCXB-EGFP를 제한 효소 EcoRI로 처리해, pCXWB-EBNA1의 EcoRI 프래그먼트(EBNA-1 코드 영역)를 삽입함으로써, pCXB-EBNA1를 얻었다(도 3 B).

실시예 3：사람 선유아세포(HDF1419) 유래의 iPS 세포의 수립

플라스미드의 편성(pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G), 그리고 그것과 pCXWB-EBNA1의 조합을 이용해, 사람 선유아세포(HDF1419)로부터 iPS 세포의 수립을 실시했다.

사람 선유아세포(HDF1419)를, Cell Applications, Inc로부터 구입했다. 이 선유아세포를, 10% 소 태아 혈청(FCS, Invitrogen)을 보충한 DMEM (Nacalai Tesque, Japan)를 배양액으로서 사용해, 100 mm 배양 디쉬로 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양해, 유지했다. 플라스미드 도입시에는, 배지를 제외하고, PBS 5 mL를 더해 세포를 세정했다. PBS를 제외한 후, 0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen)를 더해, 37℃으로 5분간 정도 반응시켰다. 세포가 떠오르면 DMEM/10% FCS를 더해 현탁해, 6x10⁵ 세포를 15 mL 원심 튜브에 회수했다. 800 rpm로 5분간 원심해 상청을 제외했다. 각 플라스미드(1.5 ㎍, pCXLE-hSK-O 및 pCEB-hUL-G)를, Microporator(ARBROWN CO., LTD.)를 이용해 세포에 도입했다. 도입시의 조건은 100㎕ 칩을 이용해 1650 V, 10 ms, 3회의 펄스로 갔다. 도입 후의 세포는 미리 DMEM/10% FCS를 3 mL 넣어 둔 6 well 배양 플레이트 (Falcon)에 옮겨, 37℃, 5% CO₂의 조건으로 6일간 배양했다. 그 후 배지를 제외해, PBS 2 mL를 더해 세포를 세정했다. PBS를 제외한 후, 0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen)를 더해, 37℃으로 5분간 정도 반응시켰다. 세포가 떠오르면 DMEM/10% FCS를 더해 현탁해, 1x10⁵의 세포를, 미리 피더 세포를 뿌려 둔 100 mm dish에 뿌렸다. 피더 세포로서는, 마이트마이신 C-처리를 한 MEF, 또는 마이트마이신 C-처리를 한 SNL76/7을 사용했다. 다음날에 영장류 ES세포용 배지(ReproCELL Incorporated)에 4 ng/mL가 되는 것처럼 bFGF (Wako)를 더한 배지에 교환해, 이후 2일 간격으로 배지 교환을 계속했다. 플라스미드 도입으로부터 24일째에 ES 모양 콜로니 및 비ES 모양 콜로니의 수를 센 결과를 도 4에 나타낸다.

pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G를 pCXWB-EBNA1와 조합하여 사용하는 것으로, iPS 세포 수립 효율이 상승하는 것이 분명해졌다.

실시예 4：사람 선유아세포(HDF1388) 유래의 iPS 세포의 수립

실시예 3으로 동일한 방법에 의해, 플라스미드의 편성 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL), 그리고 그것과 pCXWB-EBNA1의 조합을 이용해, 사람 선유아세포(HDF1388)로부터 iPS 세포의 수립을 실시했다.

그 결과, Y4를 pCXWB-EBNA1와 조합하여 사용하는 것으로, iPS 세포 수립 효율이 상승하는 것이 분명해졌다(도 5).

실시예 5：사람 말초혈단핵구세포(PMNC) 유래의 iPS 세포의 수립

플라스미드 의 편성 T2(pEP4EO2SET2K 및 pEP4EO2SCK2MEN2L), Y3(pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL) 및 Y4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL), 그리고 그것들과 pCXWB-EBNA1의 조합을 이용해, 사람 말초혈단핵구세포(PMNC)로부터 iPS 세포의 수립을 실시했다.

혈액은, 치험심사 위원회(Institutional Review Board)의 지침에 근거해, 설명과 동의를 얻은 건강한 도너에서 채취한 것을 사용했다. 이 혈액으로부터, Ficoll-paque Plus (GE Healthcare) 또는 BD Vacutainer CPT (BD)를 이용해, 밀도 구배 원심법에서 PMNC를 회수했다. NucleofectorII(Lonza)를 이용해, 3 ㎍의 발현 플라스미드 혼합물을 3-5×10⁶ PMNC에 도입했다. 도입에는 Amaxa(R) Human T Cell Nucleofector(R) Kit를 사용한다. 도입 후의 세포를, 미리 MEF 피더 세포(마이트마이신 C-처리됨)를 파종해 둔 6 well 배양 플레이트 (Falcon)에 옮겨, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양했다. 배지에는, 30 U/ml IL-2 (PeproTech) 및 5 ㎕/well Dynabeads Human T-activator CD3/CD28를 첨가한 X-vivo10 배지(Lonza)(T세포로부터의 유도용) 또는 10% FCS, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6, 10 ng/ml G-CSF 및 10 ng/ml GM-CSF를 첨가한 αEM 배지 또는 StemSpan H3000 (StemCell Technologies)(비T세포로부터의 유도용)를 사용한다. 플라스미드 도입 2일째에, 배지를 교환하는 일 없이, 4 ng/mL bFGF 및 10 μM Y27632를 첨가한 등량의 영장류 ES세포용 배지(ReproCELL Incorporated)를 각 웰에 가세했다. 이어서, 플라스미드 도입 4일째에, 배양 배지를, 4 ng/mL bFGF 및 10μM Y27632를 첨가한 영장류 ES세포용 배지(ReproCELL Incorporated)에 교환했다. 플라스미드 도입 20~25일째에 ES 모양 콜로니(iPS 세포 콜로니) 수를 계측했다.

그 결과, Y3 및 Y4를 pCXWB-EBNA1와 조합하여 사용하는 것으로, iPS 세포 수립 효율이 상승하는 것이 분명해졌다(도 6 및 7, 표 2A 및 B). 동일하게, Y5(pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK 및 pCE-hUL) 및 Y6(pCE-hOCT3/4, pCE-hSK, pCE-hUL 및 pCE-mp53DD), 그리고 pCXB-EBNA1의 조합을 사용한 경우에도, PMNC로부터 iPS 세포를 수립하는 것에 성공하였으며(표 2B), 또 Y5 및 Y6를 pCXB-EBNA1와 조합하여 사용하는 것으로, iPS 세포 수립 효율이 상승하는 것이 분명해졌다. 또한, 이때, Y6 및 pCXB-EBNA1의 조합을 사용한 경우에 있어서, MEF 피더 세포 대신에 20 ㎍/ml RetroNectin(Takara)를 코트한 배양접시를 이용해 동일한 공정을 실시하는 것도, iPS 세포를 수립할 수 있는 것으로 확인되었다.

[표 2]

본 발명에 의해, iPS 세포의 수립 효율을 비약적으로 높일 수가 있으므로, 보다 효율 좋게 사람 iPS 세포를 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의해, 종래의 방법에서는 iPS 세포의 수립이 매우 곤란한 혈액 세포로부터의 수립을 효율적으로 실시할 수 있게 되었기 때문에, 본 발명은 사람 iPS 세포의 재생 의료에 대한 응용에 있어서 매우 유용하다.

본 발명을 바람직한 양태를 강조해 설명해 왔지만, 바람직한 양태가 변경될 수 있는 것은 당업자에게 있어 자명하다. 본 발명은, 본 발명이 본 명세서에 상세하게 기재된 이외 방법으로 실시될 수 있는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명은 첨부의 "청구의 범위"의 취지 및 범주에 포함되는 모든 변경을 포함하는 것이다.

여기서 기술된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 여기에 인용된 것에 의해, 그 모두가 명시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 혼입되어 있는 것이다.

본 출원은 미국에서 출원된 미국가특허 출원 제 61/650,694호(출원일：2012년 5월 23일)를 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

<110> Kyoto University <120> Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells <130> 092027 <150> US61/650,694 <151> 2012-05-23 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against p53 <400> 1 gactccagtg gtaatctact gctcgagcag tagattacca ctggagtc 48

Claims

하기의 (1) 및 (2) 를 체세포로 도입하는 공정을 포함하는, iPS 세포의 제조 방법:
(1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 하나 이상의 에피소말 벡터로서, 상기 에피소말 벡터는 oriP와 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재함; 및
(2) EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재하고 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재하지 않은 플라스미드 벡터로서, 상기 플라스미드 벡터는 포유동물 세포에서 기능적인 복제 개시점을 갖지 않음.
제 1 항에 있어서, p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 에피소말 벡터의 형태로 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 p53의 기능 저해 물질이, p53 shRNA 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체인, 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 p53의 도미넌트 네거티브 변이체가 p53DD인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자가, 하나 이상의, Oct 패밀리, Klf 패밀리, Sox 패밀리, Myc 패밀리, Lin 패밀리 및 Glis 패밀리의 멤버로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자가, Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc 및 Lin28를 포함하는 것인, 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자가, Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28 및 Glis1를 포함하는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산이, 2개 또는 3개의 에피소말 벡터로 나누어져 탑재되고 있는, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK 및 pCE-hUL인, 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCE-hOCT3/4, pCE-hSK 및 pCE-hUL이며, 상기 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가 pCE-mp53DD인, 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (2) 의 플라스미드 벡터가, pCXWB-EBNA1인, 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 상기 (2) 의 플라스미드 벡터가, pCXB-EBNA1인, 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 체세포가, 사람 선유아세포(HDF) 또는 혈액 세포에서 선택되는, 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 혈액 세포가, 말초혈단핵구세포(PMNC)인, 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 말초혈단핵구세포(PMNC)가 T세포인, 방법.
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iPS 세포를 제조하기 위한 키트로서, 이하의 (1) 및 (2) 를 포함하는 키트:
(1) 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 하나 이상의 에피소말 벡터로서, 상기 에피소말 벡터는 oriP와 EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재함; 및
(2) EBNA-1을 코드하는 핵산을 탑재하고 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재하지 않은 플라스미드 벡터로서, 상기 플라스미드 벡터는 포유동물 세포에서 기능적인 복제 개시점을 갖지 않음.
제 24 항에 있어서, p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을, 에피소말 벡터의 형태로 추가로 포함하는 키트.
제 25 항에 있어서, 상기 p53의 기능 저해 물질이, p53 shRNA 또는 p53의 도미넌트 네거티브 변이체인, 키트.
제 26 항에 있어서, 상기 p53의 도미넌트 네거티브 변이체가 p53DD인, 키트.
제 24 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCEB-hSK-O 및 pCEB-hUL-G인, 키트.
제 24 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, 키트.
제 25 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCXLE-hOCT3/4-shp53-F, pCXLE-hSK 및 pCXLE-hUL인, 키트.
제 25 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCE-hOCT3/4-shp53, pCE-hSK 및 pCE-hUL인, 키트.
제 25 항에 있어서, 상기 핵초기화 인자를 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가, pCE-hOCT3/4, pCE-hSK 및 pCE-hUL이며, 상기 p53의 기능 저해 물질을 코드하는 핵산을 탑재한 에피소말 벡터가 pCE-mp53DD인, 키트.
제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (2) 의 플라스미드 벡터가 pCXWB-EBNA1인, 키트.
제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 (2) 의 플라스미드 벡터가 pCXB-EBNA1인, 키트.
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