JP5827220B2 - 人工多能性幹細胞の樹立効率改善方法 - Google Patents
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Description
引用文献(下記文献は引用により本願の一部を構成する):
c-Mycは形質転換活性を有しており、一方L-Mycは形質転換活性がc-Mycに比べて非常に低い(c-Mycの1〜10%程度)ことが報告されている(Birrer et al. Molecular and Cellular Biology 8:2668-2673, 1988、Barrett et al. Molecular and Cellular Biology 12:3130-3137, 1992)(これらの文献は引用により本願の一部を構成する)。
[1] 以下の(1)および(2):
(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ
(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、
という特徴を有するMyc変異体または該変異体をコードする核酸を、核初期化工程において体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の樹立効率改善方法。
[2] 体細胞がヒト由来の体細胞である、[1]記載の方法。
[3] Myc変異体のNIH3T3細胞に対する形質転換活性がc-Mycに比して低下している、[1]または[2]記載の方法。
[4] Myc変異体がc-Myc変異体、N-Myc変異体またはL-Myc変異体のいずれかである、[1]〜[3]いずれか記載の方法。
[5] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位の全部または一部を欠失している、[4]記載の方法。
[6] c-Myc変異体が以下の(1)〜(4)のいずれかである、[5]記載の方法:
(1)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失した変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失した変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失した変異体、
(4)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、かつ第135位が変異した変異体。
[7] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第135位を変異している、[4]記載の方法。
[8] 配列番号:2の第135位の変異が置換または欠失である、[6]または[7]記載の方法。
[9] 配列番号:2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されている、[8]記載の方法。
[10] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第70位以降を少なくとも有している、[4]記載の方法。
[11] L-Myc変異体が以下の(1)または(2)のいずれかである、[10]記載の方法:
(1)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第45位以降を少なくとも有している変異体、
(2)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第22位以降を少なくとも有している変異体。
[12] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第321位を変異している、[4]記載の方法。
[13] 配列番号:6の第321位の変異が置換または欠失である、[12]記載の方法。
[14] 配列番号:6の第321位のValがAspに置換されている、[13]記載の方法。
[15] 以下の(1)および(2):
(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ
(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、
という特徴を有するMyc変異体または該変異体をコードする核酸を含有してなる、iPS細胞の樹立効率改善剤。
[16] Myc変異体のNIH3T3細胞に対する形質転換活性がc-Mycに比して低下している、[15]記載の剤。
[17] Myc変異体がc-Myc変異体、N-Myc変異体またはL-Myc変異体のいずれかである、[15]または[16]記載の剤。
[18] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位の全部または一部を欠失している、[17]記載の剤。
[19] c-Myc変異体が以下の(1)〜(4)のいずれかである、[18]記載の剤:
(1)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失した変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失した変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失した変異体、
(4)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、かつ第135位が変異した変異体。
[20] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第135位を変異している、[17]記載の剤。
[21] 配列番号:2の第135位の変異が置換または欠失である、[19]または[20]記載の剤。
[22] 配列番号:2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されている、[21]記載の剤。
[23] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第70位以降を少なくとも有している、[17]記載の剤。
[24] L-Myc変異体が以下の(1)または(2)のいずれかである、[23]記載の剤:
(1)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第45位以降を少なくとも有している変異体、
(2)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第22位以降を少なくとも有している変異体。
[25] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第321位を変異している、[17]記載の剤。
[26] 配列番号:6の第321位の変異が置換または欠失である、[25]記載の剤。
[27] 配列番号:6の第321位のValがAspに置換されている、[26]記載の剤。
[28]以下の(1)および(2):
(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ
(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、
という特徴を有するMyc変異体または該変異体をコードする核酸と核初期化物質とを体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
[29]体細胞がヒト由来の体細胞である、[28]記載の方法。
[30]形質転換活性がNIH3T3細胞に対する形質転換活性である、[28]または[29]記載の方法。
[31] Myc変異体がc-Myc変異体、N-Myc変異体またはL-Myc変異体のいずれかである、[28]〜[30]いずれか記載の方法。
[32] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位の全部または一部を欠失している、[31]記載の方法。
[33] c-Myc変異体が以下の(1)〜(4)のいずれかである、[32]記載の方法:
(1)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失した変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失した変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失した変異体、
(4)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、かつ第135位が変異した変異体。
[34] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第135位を変異している、[31]記載の方法。
[35] 配列番号:2の第135位の変異が置換または欠失である、[33]または[34]記載の方法。
[36] 配列番号:2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されている、[35]記載の方法。
[37] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第70位以降を少なくとも有している、[31]記載の方法。
[38] L-Myc変異体が以下の(1)または(2)のいずれかである、[37]記載の方法:
(1)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第45位以降を少なくとも有している変異体、
(2)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第22位以降を少なくとも有している変異体。
[39] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第321位を変異している、[31]記載の方法。
[40] 配列番号:6の第321位の変異が置換または欠失である、[39]記載の方法。
[41] 配列番号:6の第321位のValがAspに置換されている、[40]記載の方法。
[42] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klfファミリーのメンバー、Lin28ファミリーのメンバーおよびNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される一以上を含む、[28]〜[41]いずれか記載の方法。
[43] 核初期化物質が、Oct3/4、Sox2およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、[42]記載の方法。
[44] 以下の(1)および(2):
(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ
(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、
という特徴を有するMyc変異体または該変異体をコードする核酸と核初期化物質とを含有してなる、体細胞からのiPS細胞の誘導剤。
[45] 体細胞がヒト由来の体細胞である、[44]記載の剤。
[46] Myc変異体のNIH3T3細胞に対する形質転換活性がc-Mycに比して低下している、[44]または[45]記載の剤。
[47] Myc変異体がc-Myc変異体、N-Myc変異体またはL-Myc変異体のいずれかである、[44]〜[46]いずれか記載の剤。
[48] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位の全部または一部を欠失している、[47]記載の剤。
[49] c-Myc変異体が以下の(1)〜(4)のいずれかである、[48]記載の剤:
(1)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失した変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失した変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失した変異体、
(4)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、かつ第135位が変異した変異体。
[50] c-Myc変異体が、配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第135位を変異している、[47]記載の剤。
[51] 配列番号:2の第135位の変異が置換または欠失である、[49]または[50]記載の剤。
[52] 配列番号:2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されている、[51]記載の剤。
[53] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第70位以降を少なくとも有している、[47]記載の剤。
[54] L-Myc変異体が以下の(1)または(2)のいずれかである、[53]記載の剤:
(1)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第45位以降を少なくとも有している変異体、
(2)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第22位以降を少なくとも有している変異体。
[55] L-Myc変異体が、配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第321位を変異している、[47]記載の剤。
[56] 配列番号:6の第321位の変異が置換または欠失である、[55]記載の剤。
[57] 配列番号:6の第321位のValがAspに置換されている、[56]記載の剤。
[58] 核初期化物質が、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、Klfファミリーのメンバー、Lin28ファミリーのメンバーおよびNanog、並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される一以上を含む、[44]〜[57]いずれか記載の剤。
[59] 核初期化物質が、Oct3/4、Sox2およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、[58]記載の剤。
[60] 以下の(1)および(2):
(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ
(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、
という特徴を有するMyc変異体をコードする外来性核酸を含む、iPS細胞。
[61] Myc変異体をコードする外来性核酸がゲノムに組み込まれている、[60]記載のiPS細胞。
[62] [60]または[61]記載のiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
[63] 下記の工程:
(1) [28]〜[43]のいずれかに記載の方法によりiPS細胞を製造する工程、および
(2) 上記工程(1)で得られたiPS細胞に分化誘導処理を行い、体細胞に分化させる工程、
を含む、体細胞の製造方法。
本発明のMyc変異体は、(1)c-Mycと同等またはそれ以上のiPS細胞樹立効率改善効果を有し、かつ(2)c-Mycに比して形質転換活性が低減している、という特徴を有するものである。
(1)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失した変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失した変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失した変異体、
(4)配列番号:2に記載のヒトc-Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、かつ第135位が変異した変異体。
(1)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第45位以降を少なくとも有している変異体、
(2)配列番号:6に記載のヒトL-Mycのアミノ酸配列の第22位以降を少なくとも有している変異体。
本発明においてiPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物由来の生殖細胞以外の細胞である。哺乳動物としては、例えばヒト、マウス、サル、ウシ、ブタ、ラット、イヌ等が例示される。ヒト由来の体細胞が特に好ましい。具体的には、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞に導入することにより、あるいは本発明のMyc変異体またはMyc変異体をコードする核酸と共に体細胞に導入することにより、該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。タンパク性因子またはそれをコードする核酸である公知の核初期化物質としては、好ましくは以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載するが、該タンパク性因子をコードする核酸もまた好適に用いられる)。なお、以下のリストに記載の引用文献は引用により本願の一部を構成する。
(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A(活性型変異体), N-Myc, L-Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2(またはKlf5), c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照)
(15) Oct3/4, c-Myc(Nature 454:646-650 (2008)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog (WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28 (WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L-Myc
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4 (Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009)
(24) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT(Science, 324: 797-801 (2009)を参照)
従来報告されているiPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記本発明のMyc変異体に加え、iPS細胞の樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
本発明のMyc変異体と、核初期化物質および他のiPS細胞の樹立効率改善物質の組み合わせとを体細胞に接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および/または幹細胞因子(SCF)を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞(MEF)の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)(本文献は引用により本願の一部を構成する))等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、本発明のMyc変異体および核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後(例えば1-10日後)から開始してもよい。
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞などの多能性幹細胞で報告されている分化誘導法(例えば、神経幹細胞への分化誘導法としては、日本特開2002-291469、膵幹様細胞への分化誘導法としては、日本特開2004-121165、造血細胞への分化誘導法としては、国際公開公報WO99/064565に記載される方法などがそれぞれ例示される。この他にも、胚葉体の形成による分化誘導法としては、国際公開公報WO01/062899に記載の方法などが例示される。(これらの文献は引用により本願の一部を構成する)を利用して、iPS細胞から種々の細胞(例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等)への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞(即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など)に分化させて該患者に移植するという、自家移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞(例、肝細胞)は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
(c-Myc、L-Myc)
・ヒトc-MYC:c-MYC、またはc
・ヒトL-MYC:L-MYC、L-MYC1、またはL
・マウスc-Myc:c-Myc、またはMs-c
・マウスL-Myc:L-Myc、またはMs-L
・マウスc-Mycの第136位のTrpをGluに置換した点変異体:Ms-c-W136E、またはMs-c136
(ヒトc-Mycの第135位のTrpをGluに置換した点変異体:c-W135E、またはc135)
・マウスc-Mycの第394位のValをAspに置換した点変異体:Ms-c-V394D、またはMs-c394
・マウスc-Mycの第420位のLeuをProに置換した点変異体:Ms-c-L420P、またはMs-c420
・マウスL-Mycの第96位のTrpをGluに置換した点変異体:Ms-L-W96E、またはMs-L96
・マウスL-Mycの第325位のValをAspに置換した点変異体:Ms-L-V325D、またはMs-L325
・マウスL-Mycの第351位のLeuをProに置換した点変異体:Ms-L-L351P、またはMs-L351
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第14位以降を有する変異体:cdN1
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第42位以降を有する変異体:cdN2
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第65位以降を有する変異体:cdN3
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第83位以降を有する変異体:cdN4
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第108位以降を有する変異体:cdN5
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第128位以降を有する変異体:cdN6
・ヒトc-MYCアミノ酸配列の第141位以降を有する変異体:cdN7
これら欠失型変異体のN末端開始部位は図1に示したとおりである。
・ヒトc-W135EとcdN1との組み合わせ変異体:c135dN1
・ヒトc-W135EとcdN2との組み合わせ変異体:c135dN2
・ヒトc-W135EとcdN3との組み合わせ変異体:c135dN3
・ヒトc-W135EとcdN4との組み合わせ変異体:c135dN4
・ヒトc-W135EとcdN5との組み合わせ変異体:c135dN5
・ヒトc-W135EとcdN6との組み合わせ変異体:c135dN6
・ヒトL-MYCアミノ酸配列の第22位以降を有する変異体:LdN2
・ヒトL-MYCアミノ酸配列の第45位以降を有する変異体:LdN4
・ヒトL-MYCアミノ酸配列の第70位以降を有する変異体:LdN5
・ヒトL-MYCアミノ酸配列の第89位以降を有する変異体:LdN6
・ヒトL-MYCアミノ酸配列の第102位以降を有する変異体:LdN7
これら欠失型変異体のN末端開始部位は図1に示したとおりである。
・ヒト由来の3因子(OCT3/4, KLF4, SOX2)を「3F」と称する。
1)ヒトc-MYCのN末欠失型変異体をコードするレトロウイルスベクターの作製
ヒトc-MYCのN末欠失型変異体cdN1〜cdN7をコードするレトロウイルスベクターを作製した。まず、ヒトc-MYC cDNAを鋳型とし、以下のプライマーセットを用いて、PCRにて各フラグメントを増幅した。
dN1-s CACCATGCTCGACTACGACTCGGTGCAGCC(配列番号:11)
dN2-s CACCATGCCCCCGGCGCCCAGCGAGGATAT(配列番号:12)
dN3-s CACCATGCGCCGCTCCGGGCTCTGCTCGCC(配列番号:13)
dN4-s CACCATGCGGGGAGACAACGACGGCGGTGG(配列番号:14)
dN5-s CACCATGGGAGACATGGTGAACCAGAGTTT(配列番号:15)
dN6-s CACCATGATCATCATCCAGGACTGTATGTG(配列番号:16)
dN7-s CACCATGGCCGCCAAGCTCGTCTCAGAGAA(配列番号:17)
HsMyc-AS TCACGCACAAGAGTTCCGTAGCTGTTCAAG(配列番号:18)
Cell, 131:861-872 (2007)(本文献は引用により本願の一部を構成する)の記載に従い、Plat-E細胞(Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066)にレトロウイルスベクターpMXs-cdN1〜cdN7を個々に導入した。2日間培養後の各Plat-E細胞を1×SDSサンプルバッファーで処理し、その後10分間ボイルして、これを泳動用サンプルとした。一次抗体として抗c-Myc抗体(Santa Cruz社製)、また二次抗体としてHRP付加抗ウサギIgG抗体(CST製)を用いて、常法によりウエスタンブロッティングを行った。結果を図2に示す。各サンプルにおいて、内在性c-MYCのバンド(cdN1〜cdN7の各レーンにおける上側のバンド)の他、各変異体に相当する大きさのバンドが検出されたことから、各変異体の発現が確認された。
マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた成人皮膚由来線維芽細胞(aHDF-Slc7a1)を、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い作製した。このaHDF-Slc7a1を6ウエルプレートの1ウエルあたり1 x 105個の割合で蒔き、翌日、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載の方法に従い、ヒト由来の3遺伝子(OCT3/4, KLF4, SOX2)に、前記1)で作製した各N末欠失型変異体を加えた計4遺伝子をレトロウイルスで導入した (図3中、3F-cdN1〜3F-cdN7)。その際、前記ヒト由来の3遺伝子(OCT3/4, KLF4, SOX2)に、各種点変異体の遺伝子を加えた計4遺伝子のレトロウイルスによる導入も、併せて行った(図3中、3F-Ms-c136、3F-Ms-c394、3F-Ms-c420、3F-Ms-L96、3F-Ms-L325、3F-Ms-L351)。
1)ヒトc-W135EのN末欠失型変異体をコードするレトロウイルスベクターの作製
実施例1-1)で構築したpENTR-D-TOPO-cdN1〜cdN6を鋳型とし、プライマー(OLIGO1: CAGGACTGTATGGAGAGCGGTTTCT(配列番号:19)、OLIGO2: AGAAACCGCTCTCCATACAGTCCTG(配列番号:20))を用いたPCRを行うことにより、ヒトW135Eの点変異を導入した。シークエンスを行い点変異を確認した後、レトロウイルスベクターpMXs-gwとの間でLR反応を行うことにより、pMXs-c135dN1〜c135dN6を作製した。
実施例1-2)と同様にして、Plat-E細胞にレトロウイルスベクターpMXs-c135dN1〜c135dN6を個々に導入したPlat-E細胞の溶解物を用いて、常法によりウエスタンブロッティングを行った。結果を図4に示す。各サンプルにおいて、内在性c-MYCのバンド(c135dN1〜c135dN6の各レーンにおける上側のバンド)の他、各変異体に相当する大きさのバンドが検出されたことから、各変異体の発現が確認された。
実施例1と同様にしてヒト由来の3遺伝子(OCT3/4, KLF4, SOX2)に、前記1)で作製したc135dN1〜c135dN6のいずれかを加えた計4遺伝子をレトロウイルスで導入した。レトロウイルス感染後、30日目に出現したヒトiPSコロニー(ES-likeコロニー)の数をカウントした。結果を図5に示す。実施例1同様に3F-cdN1ではiPSコロニー数が極めて低かったのに対し、細胞の形質転換に関与することが推測されているc-MYCの135位点変異を導入することにより、iPSコロニー数は劇的に増加し、また全コロニー数に対するiPSコロニー数の割合も上昇していた(図5中の3F-c135dN1)。なお3F-c135dN2〜3F-c135dN6は、今回の実験では顕著なiPS誘導活性は認められなかった。
1)ヒトL-MYCのN末欠失型変異体をコードするレトロウイルスベクターの作製
ヒトL-MYCのN末欠失型変異体LdN2、LdN4、LdN5、LdN6およびLdN7をコードするレトロウイルスベクターを作製した(cdN1およびcdN3に対応するL-MYC変異体は無し、図1参照)。まず、ヒトL-MYC cDNAを鋳型とし、以下のプライマーセットを用いて、PCRにて各フラグメントを増幅した。
LMyc-dN2-s CACCATGTCCACGGCGCCCAGCGAGGACAT(配列番号:21)
LMyc-dN4-s CACCATGTGGGGCTTGGGTCCCGGCGCAGG(配列番号:22)
LMyc-dN5-s CACCATGGGAGACGAAGCGGAATCCCGGGG(配列番号:23)
LMyc-dN6-s CACCATGATCATACGCCGTGACTGCATGTG(配列番号:24)
LMyc-dN7-s CACCATGCGGGAACGGCTGGAGAGAGCTGT(配列番号:25)
Hu-L-Myc-as2 TTAGTAGCCAGTGAGGTATGCAATTC(配列番号:26)
実施例1と同様にしてヒト由来の3遺伝子(OCT3/4, KLF4, SOX2)に、前記1)で作製したLdN2、LdN4、LdN5、LdN6、LdN7を加えた計4遺伝子をレトロウイルスで導入した。レトロウイルス感染後、39日目に出現したヒトiPSコロニー(ES-likeコロニー)の数をカウントした。結果を図6に示す。L-MYC1のN末を削っていくことにより、iPSコロニー数が減少していくことが分かった。3F-LdN2および3F-LdN4は3Fcに比べてヒトiPSコロニー数が上昇(iPS誘導活性が上昇)しており、また全コロニー数に対するiPSコロニー数の割合も上昇していた。
c-Mycは形質転換活性を有しており、一方L-Mycは形質転換活性がc-Mycに比べて非常に低い(c-Mycの1〜10%程度)ことが報告されている(Birrer et al. Molecular and Cellular Biology 8:2668-2673, 1988、Barrett et al. Molecular and Cellular Biology 12:3130-3137, 1992)。またc-Mycの第136位は細胞の形質転換に関与することが推測されている(Brough et al. Molecular and Cellular Biology 15(3):1536-1544, 1995)。(本パラグラフに挙げた文献はいずれも引用により本願の一部を構成する)
Claims (5)
- Myc変異体または該変異体をコードする核酸と核初期化物質とを体細胞に導入する工程を含み、下記特徴を有するiPS細胞の製造方法:
核初期化物質は、Octファミリーのメンバー、Soxファミリーのメンバー、およびKlfファミリーのメンバー、またはそれらをコードする核酸を含む、
Octファミリーのメンバーは、Oct1A、Oct3/4またはOct6である、
Soxファミリーのメンバーは、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17またはSox18である、
Klfファミリーのメンバーは、Klf1、Klf2、Klf4またはKlf5である、
Myc変異体は、以下の(1)〜(4)のいずれかである:
(1)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失し、かつ第65位以降を有しているc−Myc変異体、
(2)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失し、かつ第127位以降を有しているc−Myc変異体、
(3)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、第14位以降を有しており、かつ第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されているc−Myc変異体、および
(4)配列番号:6に記載のヒトL−Mycのアミノ酸配列の第1〜第21位を欠失し、かつ第45位以降を有しているL−Myc変異体。 - Myc変異体が、以下の(a)〜(f)のいずれかである請求項1記載の方法:
(a)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第41位を欠失し、かつ第42位以降を有しているc−Myc変異体、
(b)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第64位を欠失し、かつ第65位以降を有しているc−Myc変異体、
(c)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第107位を欠失し、かつ第108位以降を有しているc−Myc変異体、
(d)配列番号:2に記載のヒトc−Mycのアミノ酸配列の第1位〜第13位を欠失し、第14位以降を有しており、かつ第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されているc−Myc変異体、
(e)配列番号:6に記載のヒトL−Mycのアミノ酸配列の第1〜第21位を欠失し、かつ第22位以降を有しているL−Myc変異体、および
(f)配列番号:6に記載のヒトL−Mycのアミノ酸配列の第1〜第44位を欠失し、かつ第45位以降を有しているL−Myc変異体。 - Myc変異体が請求項1の(1)または(2)いずれかの変異に加えて配列番号2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されているc−Myc変異体である、請求項1または2記載の方法。
- Myc変異体が請求項2の(a)、(b)および(c)のいずれかの変異に加えて配列番号2の第135位のTrpがGluまたはGlyに置換されているc−Myc変異体である、請求項3記載の方法。
- 核初期化物質が、Oct3/4、Sox2およびKlf4、またはそれらをコードする核酸を含む、請求項1〜4いずれかに記載の方法。
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