KR20240011831A - 만능 줄기 세포에서 유전자의 신속한 사일런싱을 방지하기 위한 방법 - Google Patents

만능 줄기 세포에서 유전자의 신속한 사일런싱을 방지하기 위한 방법 Download PDF

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사라 버톤
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Abstract

본원에서는 CpG 모티프의 제거에 의해 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는 세포주를 생산하는 방법이 제공된다. 추가의 방법에서, 신규 프로모터에 의해 발현을 구동시키거나 내인성 유전자를 태깅함에 의해 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는 세포주에 대한 방법이 제공된다.

Description

만능 줄기 세포에서 유전자의 신속한 사일런싱을 방지하기 위한 방법
우선권 주장
[0001] 본 출원은 2021년 5월 26일자로 출원된 미국 가출원 번호 제63/193,472호에 대한 우선권의 이득을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다.
서열 목록의 도입
[0002] “CDINP0103WO_ST25.TXT” 파일명으로 포함된 서열목록은 크기가 34,000 바이트 (Microsoft Windows®로 측정시)이고 2022년 5월 26일자로 작성되었고 전자 제출에 의해 출원되었으며 본원에 참조로 인용된다.
1. 분야
[0003] 본원의 개시내용은 일반적으로 줄기 세포 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 이는 유전자의 신속한 사일런싱을 감소시키기 위해 유도된 만능 줄기 세포에서 유전자의 코돈 최적화를 위한 방법에 관한 것이다.
2. 관련 분야의 기재
[0004] 연구는 동일하게 보이는 세포주의 성능에는 상당한 차이가 있음을 보여주었다(문헌참조: Kyttala, 2016). 동일한 공여자의 다중 클론을 비교할 때 검출되는 이들 차이를 "클론 대 클론 변화"라고 지칭된다. 이들 클론은 동일한 DNA 서열을 포함하고 있는 것으로 사료되고, 일부의 경우 확인되었다. 동일한 세포주의 분화 배치에서 일관되지 않은 수율과 순도는 "배치 대 배치 변화"라고 지칭된다. 많은 경우, 분화 성능의 차이는 특정 후생적 변형에 기인하지만, 특정 후생적 기전을 동정하기 위한 필요성과 세포주의 변화를 방지하기 위해 이들 후생적 기전을 변경하는 방법이 충족되지 않고 있다.
발명의 개요
[0005] 제1 구현예에서, 본원의 개시내용은 적어도 하나의 전이유전자를 발현하도록 가공된 단리된 세포주를 제공하고, 여기서, 적어도 하나의 전이유전자 (a)는 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고; (b) HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어 하에 있고/있거나; (c) 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된다. 특정 양상에서, 세포주는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 세포주이다.
[0006] 일부 양상에서, 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열은 서열번호 14 또는 서열번호 16과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는다. 특정 양상에서 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열은 서열번호 14 또는 서열번호 16이다.
[0007] 일부 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자 (a)는 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고/있거나; (b) HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어 하에 있다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된다.
[0008] 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되어 있고, 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되고, HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되고, HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 및 MYL6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있다.
[0009] 추가의 양상에서, 세포주는 적어도 제1 전이유전자 및 제2 전이유전자를 발현하도록 가공된다. 일부 양상에서, 제1 전이유전자는 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고; 제2 전이유전자는 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어 하에 있다. 다른 양상에서, 제1 전이유전자는 서열번호 1-12 및 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고, 제2 전이유전자는 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 및 MYL6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있다. 일부 양상에서, 제1 전이유전자 및/또는 제2 전이유전자는 안정적인 발현을 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된다. 특정 양상에서, 적어도 50 퍼센트, 예를 들어, 적어도 70 퍼센트, 80 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 CpG 모티프가 제거된다. 특정 양상에서, 모든 CpG 모티프가 제거된다. 일부 양상에서, CpG 모티브 코돈이 희귀하지 않고/않거나 모노뉴클레오타이드 스트레치를 생성하지 않는 코돈으로 대체된다. 특정 양상에서, CpG 모티브 코돈은 표 1에서 상응하는 코돈으로 대체된다.
[0010] 일부 양상에서, 프로모터는 반응 요소이다. 특정 양상에서, 프로모터는 반응 요소에 의해 구동된다.
[0011] 일부 양상에서, 전이유전자는 리포터 유전자 또는 선택 마커이다. 특정 양상에서, 리포터 유전자는 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)과 같은 형광 또는 발광 단백질이다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 푸로마이신, 네오마이신 또는 블라스티딘과 같은 선택 마커이다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 자살 유전자이다. 일부 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 티미딘 키나제, TET, 또는 근아세포 결정 단백질 1 (MYOD1)이다.
[0012] 특정 양상에서, 세포주는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 이상과 같이 적어도 30일 동안 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월 이상, 예를 들어, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다.
[0013] 일부 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 발현 카세트에 의해 암호화되어 있다. 특정 양상에서, 적어도 하나의 전이유전자는 전기천공 또는 지질감염에 의해 세포주로 도입된다. 특정 양상에서, 발현 카세트는 PPP1R12C(AAVS1) 유전자좌 또는 ROSA 유전자좌와 같은 게놈 안전한 하버 부위에 삽입된다.
[0014] 특정 양상에서, 프로모터는 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 프로모터는 서열번호 2, 3, 4, 6, 또는 17을 포함한다.
[0015] 특정 양상에서, 상기 방법은 유전자 편집을 포함하고, 구체적으로 전이유전자는 TALEN 매개 유전자 편집, CRISPR 매개 유전자 편집 또는 ZFN 매개 유전자 편집과 같은 유전자 편집을 포함한다.
[0016] 추가의 구현예는 CpG 모티프를 제거하기 위해 전이유전자 서열을 최적화하는 것을 포함하는 가공된 세포주에서 전이유전자 발현의 사일런싱을 방지하는 방법을 제공한다.
[0017] 일부 양상에서, 최적화는 필수적으로 모든 CpG 모티프 코돈을 대체하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 최적화는 CpG 모티프가 제거되도록 적어도 50 퍼센트, 예를 들어, 적어도 70 퍼센트, 80 퍼센트, 90 퍼센트, 95 퍼센트, 96 퍼센트, 97 퍼센트, 98 퍼센트 또는 99 퍼센트의 CpG 모티프를 대체하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 모든 CpG 모티프가 제거된다. 특정 양상에서, CpG 모티브 코돈은 희귀하지 않고/않거나 모노뉴클레오타이드 스트레치를 생성하지 않는 코돈으로 대체된다. 일부 양상에서, CpG 모티브 코돈은 표 1에서 상응하는 코돈으로 대체된다. 특정 양상에서, CpG 모티프를 제거하도록 최적화된 전이유전자 서열은 야생형 전이유전자 서열의 GC 함량 퍼센트와 실질적으로 유사한 GC 함량 퍼센트를 포함한다.
[0018] 일부 양상에서 전이유전자 서열은 형광 단백질, 예를 들어, GFP 또는 RFP와 같은 리포터 유전자이다.
[0019] 특정 양상에서, 전이유전자는 항시성 프로모터의 제어하에 있다. 일부 양상에서, 항시성 프로모터는 실질적으로 모든 세포 유형에서 발현을 갖는다. 특정 양상에서, 항시성 프로모터는 필수적으로 모든 세포 유형에서 발현을 갖는다. 특정 양상에서, 항시성 프로모터는 모든 세포 유형에서 발현을 갖는다.
[0020] 특정 양상에서, 전이유전자는 유도성 프로모터의 제어하에 있다. 일부 양상에서, 전이유전자는 EEF1A1 프로모터의 제어하에 있다.
[0021] 추가적인 양상에서, 상기 방법은 세포주를 나트륨 부티레이트, VPA 또는 TSA로 처리하는 것을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 나트륨 부티레이트는 0.25 mM 내지 0.5 mM의 농도로 첨가된다.
[0022] 일부 양상에서, 세포주는 iPSC 세포주이다. 특정 양상에서, 상기 방법은 iPSC 세포주를 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, iPSC 세포주는 이에 제한되지 않지만 조혈 전구 세포, 신경 전구 세포, GABA성 뉴런, 대식세포, 미세아교세포 또는 내피 세포와 같은 성숙한 세포로 분화된다.
[0023] 또 다른 구현예는 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 양상에서, 프로모터는 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는다. 특정 양상에서, 프로모터는 서열번호 2, 3, 4, 6, 또는 17을 포함한다. 특정 양상에서, 발현 벡터는 pGL3 플라스미드 벡터이다. 일부 양상에서, 벡터는 프로모터의 제어하에 있는 전이유전자를 암호화한다. 특정 양상에서, 전이유전자는 리포터 유전자, 예를 들어, 형광 또는 발광 단백질, 예를 들어, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)이다.
[0024] 추가의 구현예는, 본원 구현예의 벡터(예를 들어, 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는)를 발현하도록 세포주를 가공함을 포함하는 안정적인 전이유전자 발현을 갖는 세포주를 생성하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 벡터는 상기 전이유전자를 암호화한다. 일부 양상에서, 세포주는 iPSC 세포주와 같은 만능 세포주이다.
[0025] 일부 양상에서, 상기 방법은 19번 염색체의 AAVS1 유전자좌에 벡터를 통합하는 것을 포함한다. 특정 양상에서, 통합은 유전자 편집, 예를 들어, CRISPR-매개된 유전자 편집, TALEN-매개된 유전자 편집 또는 ZFN-매개된 편집을 포함한다.
[0026] 추가의 양상에서, 상기 방법은 세포주를 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 양상에서, 세포주는 조혈 전구세포, 신경 전구세포, GABA성 뉴런, 대식세포, 미세아교세포 또는 내피 세포로 분화된다. 특정 양상에서, 세포주는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 이상과 같이 적어도 30일 동안 배양한다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월 이상, 예를 들어, 1년 이상, 2년 이상 또는 3년 이상 동안 배양한다. 특정 양상에서, 세포주는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 이상과 같이 적어도 30일 동안 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월 이상, 예를 들어, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다. 일부 양상에서, 세포주는 적어도 6개월 동안 배양한다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월째에 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다.
[0027] 또 다른 구현예는 본 구현예의 발현 벡터(예를 들어, 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%(예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)의 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는)를 포함하는 단리된 만능 세포주를 제공한다.
[0028] 추가의 구현예는 외인성 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는 세포주를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 내인성 유전자의 제어하에 전이유전자를 발현하도록 세포주를 가공하는 것을 포함하고, 여기서 상기 내인성 유전자는 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC, 예를 들어 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 또는 MYL6이다.
[0029] 일부 양상에서, 가공은 유전자 편집, 예를 들어, TALEN-매개된 유전자 편집, CRISPR-매개된 유전자 편집 또는 ZFN-매개된 편집을 포함한다. 일부 양상에서, 전이유전자는 리포터 유전자, 선택 마커 또는 자살 유전자이다.
[0030] 특정 양상에서, 세포주는 iPSC 세포주와 같은 만능 세포주이다.
[0031] 또 다른 구현예는 내인성 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC가 전이유전자로 태그된 분리된 세포주를 제공한다. 일부 양상에서, 전이유전자는 리포터 유전자, 선택 마커 또는 자살 유전자이다. 특정 양상에서, 세포주는 iPSC 세포주와 같은 만능 세포주이다.
[0032] 또한, 본원에서는 본 구현예의 세포주를 배양하고 리포터 유전자의 발현을 측정하는 것을 포함하는 세포 검출을 위한 검정이 제공된다. 또한, 본원에서는 세포 생존성 검정과 같은 세포 검정 또는 후보 제제를 스크리닝하기 위한 검정에 대한 본 구현예의 세포주의 용도가 제공된다. 일부 양상에서, 검정은 고속처리량 검정이다. 특정 양상에서, 세포 검정은 리포터 유전자의 발현을 측정하는 것을 포함한다.
[0033] 또 다른 구현예는 세포 검정에 사용하기 위해 본 구현예의 세포주를 포함하는 조성물을 제공한다.
[0034] 본원 개시내용의 다른 목적, 특성 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 구현예를 지적하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것으로 이해되어야만 한다.
[0035] 하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양상을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
[0036] 도 1a-1d: EEF1A1p에 의해 구동되는 ZsGreen 발현은 iPSC에서 반점으로 나타낸다. iPSCs 01278.103 (도 1a, 1b) 및 01279.107 (도 1c, 1d)는 PPP1R12C 유전자좌에서 EEF1A1p-ZsGreen으로 가공된다. 명시야 및 형광(GFP) 현미경을 사용하여 가공 후 11회 계대되거나(도 1a-1b) 또는 가공후 18회 계대된 (도 1c-1d) 세포에서 GFP 발현을 캡처하였다.
[0037] 도 2: AcGFP1 DNA 서열(서열번호 13)의 코돈 최적화는 CpG가 유리된 AcGFP1 DNA 서열(서열번호14)을 유도하였다.
[0038] 도 3a-3b: CpG가 유리된 AcGFP1 발현은 안정적이지만, 시간 경과시 AcGFP1 발현은 유지되지 않는다. AAVS1 유전자좌에서 EEF1A1p-CpG-유리된-AcGFP1으로 표적화된 5개의 클론(도 3a)과 EEF1A1p-AcGFP1으로 표적화된 9개의 클론(도 3b)에서의 GFP 발현 퍼센트는 시간 경과에 따라 모니터링하였다.
[0039] 도 4a-4c: iPSC에서 AcGFP1의 신속한 사일런싱. 3개의 카세트 EEF1A1p-mRFP1+PGKp-Puro, EEF1A1p-AcGFP1 또는 EEF1A1p-CpG-유리된 AcGFP1을 사용하여 PPP1R12C 유전자좌(AAVS1 안전한 하버)에서 iPSC의 가공에 대한 도식. 도면에 표시된 것은 문서 전체에 걸쳐 추가 실험에 사용된 세포주 8717 및 9650의 가공된 iPSC ID 번호이다(도 4a). AcGFP1을 발현하는 클론을 선별하여 확장했지만 일관된 발현을 유지하지 못했다. 배양 2개월 후, AcGFP1이 가공된 iPSC를 AcGFP1 발현에 대해 대량 분류 하였다. 명시야 및 형광(GFP) 현미경을 사용하여 분류 후 12일(도 4b) 또는 분류후 23일 (도 4c) 세포에서 GFP 발현을 캡처하였다. 단량체 mNeonGreen과 사량체 ZsGreen을 포함한 다른 녹색 형광 단백질에서도 유사한 사일런싱이 관찰되었다.
[0040] 도 5a-5b: 사일런싱된 전이유전자는 NaBut 처리로 재활성화시킨다. CpG 유리된 AcGPF1 배양에서는 소수의 세포가 사일런싱되었다(세포의 <3%, 도 3a). 이들 사일런싱된 세포를 단일 세포로 분류하고 확장하여 사일런싱에 대해 추가로 조사하고 사일런싱을 극복하기 위한 방법을 연구하였다. GFP 발현이 없는 것에 대한 분류 2개월 후, 사일런싱된 CpG-유리된 AcGFP1 클론은 1mM, 0.5mM, 또는 1μM의 NaBut로 처리하였다. NaBut 처리 9일 후, 세포는 유동 세포측정에 의한 GFP 발현 %에 대해 검정하였고, CpG-유리된 AcGFP1의 용량 의존적 재활성화를 관찰하였다. 성공적인 파일럿 실험 후, NaBut 처리의 지속 기간은 0.25mM 및 0.5mM의 처리 용량으로 46일까지 증기시키고, GFP 발현 수준은 형광 현미경과 유동 세포측정법에 의해 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 초기 결과는 확인되었다(도 5a 및 5b, 암청색 막대: 처리 8일). NaBut 처리의 용량 의존적 효과는 실험의 지속 기간 전반에 걸쳐 명백하다(도 5a 및 5b).
[0041] 도 6: iPSC 9650(AAVS1에서 CpG-유리된-AcGFP1) 분화. iPSC 9650은 간세포 분화(CXCR4, AAT 및 ALB 발현으로 측정) 및 유도 뉴런(iN) 분화(TUJ 발현으로 측정) 전반에 걸쳐 GFP 발현을 유지하였다.
[0042] 도 7a-7c: 1069에 대한 플라스미드: WT PuroR (도 7a), 1362: CpG-유리된 PuroR1 (도 7b) 및 1363: CpG-유리된 PuroR1 (도 7c).
[0043] 도 8: AAVS1에서 CpG-유리된 AcGFP1로 가공된 iPSC 9650-GFP로부터 내피 세포를 생성하는 프로토콜에 대한 개략적인 기재.
[0044] 도 9: 저산소증 순응된 iPSC를 Purecoat Amine 플레이트에 분주하여 6일 동안 혈액 내피 세포의 생성을 개시하였다. 분화 6일째의 iPSC 유래된 혈관내피세포를 촬영한 대표 사진은 GFP의 발현을 유지하는 2차원 포맷의 혈관내피 콜로니가 존재함을 밝힌다.
[0045] 도 10: 배양 중 2회 계대에서 9650-GFP 유래된 내피 세포의 형태는 4배 대물렌즈를 사용하여 GFP/BF의 중첩을 보여준다.
[0046] 도 11: 9650-GFP iPSC로부터 유래된 내피 세포의 순도. 저산소증 순응된 iPSC를 Purecoat 아민 플레이트 상에 분주하여 혈액내피세포의 생성을 개시하고, 이후 다수의 계대를 통해 증식될 수 있는 순수한 내피세포를 생성하기 위해 재분주하였다. 내피 세포의 순도는 유동 세포 측정에 의해 CD31, CD144 및 CD105의 동시 발현에 대한 염색에 의해 계대 시 정량화하였다.
[0047] 도 12: 저산소증 순응된 iPSC를 Purecoat 아민 플레이트 상에 분주하여 혈액내피세포의 생성을 개시하고, 이후 다수의 계대를 통해 증식될 수 있는 순수한 내피세포를 생성하기 위해 재분주하였다. GFP 발현의 강도는 다수의 계대에 걸쳐 유동 세포측정으로 정량화하였다.
[0048] 도 13: iPSC로부터 조혈 전구 세포(HPC)를 생성하기 위한 프로토콜에 대한 개략적인 기재.
[0049] 도 14a-14c: 저산소증에 순응된 iPSC를 수거하여 13 내지 15일의 기간 동안 3D 응집체 포맷으로 HPC로 분화시켰다. HPC 분화 과정의 말기에 세포를 수거하여 CD34, CD45, CD31, CD41 및 CD235의 발현과 GFP(도 14c) 또는 RFP(도 14c) 발현에 대한 염색에 의해 HPC의 순도를 정량화하여 말기 HPC에서 형광이 유지되는지를 보여준다. MACS 분리 후 CD34와 GFP의 동시 발현은 90% 초과이다(도 14b).
[0050] 도 15. HPC를 생성하는 효율: 1 인풋 iPSC는 8717 및 9650에 대해 각각 0.766 및 0.225 HPC를 발생시켰다.
[0051] 도 16: HPC로부터 미세아교세포의 생성의 도식.
[0052] 도 17a-17b: 세포주 9650-GFP(도 17a) 및 8717-RFP(도 17b)의 미세아교세포 분화로부터의 상 및 형광 이미지.
[0053] 도 18: 조혈 전구 세포(HPC) 생성의 효율. CD34+ MAC는 9650-GFP 유래된 HPC를 분류하였고, 분류되지 않은 8717-RFP는 미세아교세포로 분화시켰다. 인풋 HPC와 아웃풋 미세아교세포의 총 생존 가능한 수를 정량화하였다. 공정 효율은 미세아교세포 분화 23일째에 존재하는 CD34+ 양성 세포의 순도와 절대 수를 인풋 생존 가능한 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기준으로 계산하였다.
[0054] 도 19c-19d: 8717-RFP(도 19a) 및 9650-GFP(도 19c) iPSC로부터 각각 생성된 23일째 미세아교세포의 순도 프로필. 최종 단계 미세아교세포를 수거하여 PU.1, IBA, CX3CR, TREM2 및 P2RY12 발현의 존재에 대해 염색하고 유동 세포측정으로 정량화하였다. 마커의 동시 발현은 최종 말기 세포에서 GFP 또는 RFP의 보유와 함께 정량화하였다(도 19b, 19d).
[0055] 도 20: HPC로부터 최종 단계 대식세포를 생성하는 도식.
[0056] 도 21: 8717-RFP로부터 유래된 HPC를 추가로 분화시켜 최종 단계의 대식세포를 생성하였다. 최종 단계 대식세포의 순도 평가는 분화 과정의 44일과 51일째에 CD68 발현의 존재에 대해 염색하여 정량화하였다.
[0057] 도 22: 대식세포 분화 과정의 상이한 날 동안의 8717-RFP 세포주의 상 및 형광 이미지. 이미지는 10X 배율로 캡처하였다.
[0058] 도 23: 8717-RFP iPSC 유래된 HPC는 최종 단계 대식세포로 분화시켰다. 인풋 HPC와 아웃풋 대식세포의 총 생존 가능한 수를 정량화하였다. 공정 효율은 대식세포 분화 51일째에 존재하는 CD68+ 양성 세포의 순도와 절대 수를 인풋 생존 가능한 HPC의 절대 수로 나눈 값을 기준으로 계산하였다.
[0059] 도 24: 분화 과정 전반에 걸쳐 가공된 형광색소의 존재를 유지한다. 9650-GFP 및 8717-RFP iPSC는 iPSC의 HPC로의 분화 전반에 걸쳐 및 추가로 순수한 최종 단계의 미세아교세포 및 대식세포를 생성하는 동안 형광 염색의 존재를 유지하였다.
[0060] 도 25: 이중 SMAD 억제를 사용하지 않고 iPSC를 형성하는 신경 전구 세포(NPC)를 생성하는 방법에 대한 개략적인 기재. 관련된 다양한 단계와 사용되는 매질의 조성에 대해 기재한다.
[0061] 도 26a-26b: (도 26a) NPC 분화 공정의 2D 사전 컨디셔닝 단계 동안에 적색 및 녹색 형광의 가시화. 도 26b는 수거 전 최종 단계의 3D NPC 배양물의 형광을 캡처한다. 모든 이미지는 4X 대물렌즈를 사용해 촬영한다.
[0062] 도 27: 8717-RFP 및 9650-GFP 유래된 NPC에서 해동 후 순도 정량화. NPC를 해동하고 관련 이소타입 대조군을 사용하여 SSEA4, CD56, CD15의 발현의 존재에 대해 염색하였다.
[0063] 도 28: NPC를 GABA성 신경 뉴런으로의 분화 프로토콜. NPC를 3D 분화 배양액에 넣고 PLO-라미닌 코팅 플레이트상에서 2D 배양액으로 전환하였다. 최종 단계 뉴런을 18일에 수거하고 네스틴과 β-튜뷸린 3의 순도를 유동 세포측정으로 정량화하였다.
[0064] 도 29a-29b: GABA성 뉴런분화의 2일차(3D)(도 29a)와 18일차(2D)(도 29b)에 촬영한 명시야 및 형광 이미지. ULA T25 플라스크의 3D 배양 및 6개의 웰 PLO-라미닌 코팅된 플레이트의 2D 배양. 모든 이미지는 10X 배율로 촬영하였다.
[0065] 도 30: 미분화 가공된 iPSC와 GABA성 분화의 13일 및 18일째의 최종 단계 뉴런 세포 배양물에서 GFP 및 RFP 발현의 유지. 13일째 샘플은 PLO-라미닌상으로 분주하기 전에 염색하였고, 18일째 배양물은 GABA성 뉴런 분화의 말기에 염색하였다.
[0066] 도 31: 분화 18일째에 9650-GFP 및 8717-RFP iPSC 배양액으로부터 유래된 GABA성 뉴런을 수거하여 유동 세포측정에 의해 네스틴 및 β-튜뷸린 순도에 대해 염색하였다. 최종 단계 배양액에서 네스틴 및 튜불린과 함께 GFP 또는 RFP의 동시 발현을 정량화하였다.
[0067] 도 32A-32B: (도 32a) 정규화된 루시퍼라제 (반딧불이/레닐라 비율, EEF1A1 = 100%로 정규화됨)를 나타낸다(HSP90AB1del400 프로모터 및 HSP90AB1 프로모터는 EEF1A1의 약 66% 및 75%의 발현을 가졌다). (도 32B) ZsGreen 형광 단백질의 제조를 위한 하나의 예로서 CAG 프로모터를 사용하고 사람 iPSC의 19번 염색체에 있는 AAVS1(PPP1R12C) 안전한 하버(harbor) 유전자좌에 표적화되는 플라스미드 디자인.
[0068] 도 33: ZsGreen(ZsG) 형광 단백질을 발현하는 가공된 iPSC 세포주는 최대 7개월 동안 배양액(E8 배지/비트로넥틴 코팅 플레이트)에 유지하고 Accuri C6 기구(BD)의 유동 세포측정을 사용하여 녹색 발현을 주기적으로 확인하였다. 8월 시점에 형광이 저하된 많은 세포를 보여주는, RPS19 프로모터 클론(5363) 중 하나를 제외하고 대부분의 클론은 시간 경과에 따라 일관된 유동 프로필을 유지하였다. 그래프는 가공되지 않은 iPSC = 1로 정규화된 중앙값 형광 수준을 보여준다.
[0069] 도 34a-34b: (도 34a) ZsGreen (ZsG) 가공된 iPSC 세포주에 대한 유동 세포측정 플롯. (도 34b) 분화 21일째에, 모든 세포는 가시적 뉴런 표현형을 가졌다. 유동 세포측정은 CAG, UBC(v1), HSP90AB1del400 프로모터에 대한 형광이 감소한 많은 세포를 보여준다. UBCv2, UBA52, RPS19 프로모터는 태그된 유전자 HSP90AB1, CTNNB1, MYL6와 마찬가지로 단단하고 안정적인 발현을 보여주었다.
[0070] DNA 메틸화는 유도 전사 억제, 전사 인자의 DNA 결합 방지, 일부 전사 인자의 DNA 결합 필요성, HDAC 복합체 동원, X-염색체 불활성화, TLR9과 같은 CpG 모티프의 면역원성을 포함하는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 수행한다. 포유동물에서 DNA 메틸화는 메틸트랜스퍼라제 효소에 의해 사이토신 포스페이트-구아닌(CpG)에서 사이토신의 다섯 번째 탄소(5-mC)에 메틸 그룹이 부가될 때 발생한다. DNMT3A와 DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제)는 드 노보 메틸화(즉, 이전에 메틸화되지 않은 DNA를 메틸화하는 것)를 담당하고, DNMT3B는 iPSC에서 작동되는 것으로 나타났다. DNMT1은 복제 후 반메틸화된 DNA를 메틸화하는 역할을 하고, 유지 메틸트랜스퍼라제라는 특징이 있다. 보다 최근에 탈메틸화 연구를 통해 Gadd45a가 DNA 복구에서 DNA 탈메틸화 및 DNA에서 5-mC의 산화와 절제에서 TET 및 TDG에서 중요한 역할자로서 동정되었다.
[0071] 게놈의 iPSC로의 가공을 통한 전이유전자의 첨가는 시간 경과 및 분화 과정을 통한 전이유전자의 발현을 모니터링하기 위한 기회를 부여하였다. 녹색 형광 단백질(GFP)과 적색 형광 단백질(RFP)은 고유 단백질 어셈블리와 기능을 크게 방해하지 않으면서 융합 단백질을 생성하는 데 널리 사용되고, 생체 내 분석 및 바이오마커로 전구체 집단을 모니터링하고 새로운 세포 계통의 역학을 결정하는 데 강력한 도구가 되게 한다 시판중에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 iPSC 또는 분화 세포가 결여되어 입증된 바와 같이, 광범위한 계대와 분화를 통해 전이유전자 발현을 유지하기 위한 방법이 필요하다. 구체적으로, 도 1은 iPSC에서 GFP의 반점(motted) 발현을 보여준다.
[0072] 따라서, 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 전이유전자의 서열을 최적화하여 CpG 모티프를 제거하고, 따라서 전이유전자의 신속한 사일런싱을 방지함으로써 세포주에서 전이유전자의 발현을 유지하기 위한 방법을 제공한다. 메틸화는 RNA 관련 사일런싱 및 히스톤 변형에 추가로 주요 후생적 기전이다. 본원 연구에서 도 2에 도시된 바와 같이 아에쿠오레아 코에룰레센스 녹색 형광 단백질(AcGFP1)의 DNA 서열을 변형시켜 CpG 모티프를 제거하였다. 결과는 CpG 유리된 AcGFP1의 발현이 안정적이었지만 야생형 AcGFP1의 발현은 그렇지 않음을 보여주었다(도 3). 따라서, 본원의 방법은 전반적인 메틸화 또는 기타 후생적 조절 장애로 인한 전이유전자 사일런싱을 방지할 수 있게 한다.
[0073] 추가 구현예에서, 본원에 제공된 신규 프로모터(예를 들어, 서열번호 1-12 또는 17)에 의해 전이유전자의 발현을 구동시키거나 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 또는 MYL6와 같은 유전자를 태깅함에 의해 전이유전자의 발현을 구동시킴에 의해 세포주에서 전이유전자의 발현을 유지하기 위한 방법이 제공된다.
[0074] 추가로, 본원 세포주는 특정 세포 유형으로 분화되어 3개월, 6개월 또는 12개월 이상 전이유전자의 발현을 유지할 수 있다. 특정 양상에서, 세포주는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 이상과 같이 적어도 30일 동안 배양한다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월 이상, 예를 들어, 1년 이상, 2년 이상 또는 3년 이상 동안 배양한다. 특정 양상에서, 세포주는 적어도 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 이상과 같이 적어도 30일 동안 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다. 특정 양상에서, 세포주는 6개월 이상, 예를 들어, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는다. 추가의 양상에서, 세포 생존력 및 스크리닝 검정에 대한 본 발명의 세포주를 사용하기 위한 세포 검정을 위한 방법이 제공된다.
I. 정의
[0075] “정제된” 이라는 용어는 절대적인 순도를 요하는 것이라기보다는; 오히려, 상대적인 용어로서 의도한 것이다. 따라서, 정제된 세포의 집단은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과 또는 100% 순수하거나, 또는, 가장 바람직하게는, 필수적으로 다른 세포 유형이 없다.
[0076] 본원에서 사용되는 '안정된 발현'이란 용어는 변형되지 않은 서열보다 더 안정적인 발현을 지칭한다. 예를 들어 안정적인 발현은 1개월, 6개월, 1년 또는 1년 이상의 기간 동안 변화되지 않은 채로 유지되는 발현을 지칭할 수 있다.
[0077] 본원에 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련하여 “필수적으로 부재”는 본원에서 특정 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물에 제형화되지 않고/않거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 의도치 않은 임의의 오염으로 야기된 특정 성분의 총량은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01%이다. 표준 분석 방법으로 특정 성분의 양이 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
[0078] 본원 명세서에서 사용된 바와 같은, 관사 (“a” 또는 “an”)는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수형 관사 ("a" 또는 "an")는 "포함하는" 이라는 단어와 함께 사용되는 경우 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
[0079] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 "또 다른" 이라는 말은 적어도 두번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
[0080] "필수적으로"라는 용어는 방법 또는 조성물이 특정 단계 또는 재료만을 포함하고 이러한 방법 및 조성물의 기본적이고 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 이해되어야 한다.
[0081] "실질적으로 부재"라는 용어는 나열된 성분의 98%와 조성물 또는 입자가 실질적으로 부재인 성분의 2% 미만에 사용된다.
[0082] 본원에 사용된 "실질적으로" 또는 "대략"이라는 용어는 관련된 기본 기능의 변화를 초래하지 않고 허용될 수 있는 임의의 정량적 비교, 값, 측정 또는 기타 표현을 수식하기 위해 적용될 수 있다.
[0083] 용어 "약"은 일반적으로 명시된 값을 측정하기 위한 표준 분석 기술을 사용하여 결정된 명시된 값의 표준 편차 이내를 의미한다. 상기 용어는 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 언급함으로써 사용될 수도 있다.
[0084] 본원에서 사용되는 바와 같이, 야생형 서열과 "실질적으로" 유사한 서열은 야생형 퍼센트 GC 함량의 5% 이내의 퍼센트 GC 함량을 포함한다.
[0085] “세포 집단” 이라는 용어는 보통 통상적인 유형의 세포들의 군을 가리키는데 사용된다. 상기 세포 집단은 공통의 간세포로부터 유래할 수 있거나, 또는 하나 이상의 세포형을 포함할 수도 있다. “접적된” 세포 집단은 출발 세포 집단의 특정 세포형의 백분율보다 더 큰 백분율의 세포형을 포함하는 출발 세포 집단 (예를 들어, 분획화되지 않은, 이종성 세포 집단)으로부터 유래된 세포 집단을 지칭한다. 세포 집단은 하나 이상의 세포형에 대해 강화될 수 있고, 하나 이상의 세포형을 고갈시킬 수도 있다.
[0086] “줄기 세포” 라는 용어는 본원에서 적절한 조건 하에 다양한 범위의 분화 세포형으로 분화할 수 있는 세포, 한편으로는 적절한 다른 조건 하에 자기 재생 및 필수적으로 미분화된 만능 상태로 남아 있을 수 있는 세포를 지칭한다. 또한, “줄기 세포” 라는 용어는 만능 세포, 다능성 세포, 전구체 세포 및 간세포를 포괄한다. 전형적인 사람 줄기 세포는 골수 조직으로부터 수득된 조혈 또는 간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 수득된 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 수득된 배아 생식 세포로부터 수득될 수 있다. 또한, 전형적인 만능 줄기 세포는 다능성과 관련된 특정 전사 인자의 발현에 의해 만능 상태로 체세포를 재프로그래밍함으로써 해당 체세포로부터도 생성될 수 있으며; 이들 세포들은 “유도성 만능 줄기 세포” 또는 “iPSC”로 불린다.
[0087] “만능” 이라는 용어는 배아외, 또는 태반 세포를 제외하고 유기체 내에서 다른 모든 세포형으로 분화하는 세포의 특성을 가리킨다. 만능 줄기 세포는 장시간의 배양 이후에 조차도 세가지의 모든 배엽층 (예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포형)으로 분화할 수 있다. 만능 줄기 세포는 배반포의 내부 세포 매쓰로부터 유래되거나 핵 전달에 의해 생성되는 배아 줄기 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 만능 줄기 세포는 체세포를 재프로그래밍하여 유래된 유도성 만능 줄기 세포이다.
[0088] “분화” 라는 용어는 미분화된 세포가 구조적 및/또는 기능적 특성에 변화가 있는 보다 분화된 유형으로 되는 과정을 일컫는다. 성숙한 세포는 통상 변형된 세포 구조와 조직 특이적 단백질을 가진다.
[0089] 본원에서, “미분화된” 이라는 말은 해당 미분화된 세포를 배아 또는 성체 기원의 말단 분화된 세포와 명백하게 구별짓는 미분화된 세포의 특징적 마커 및 형태학적 특징을 나타내는 세포를 지칭한다.
[0090] “배양체 (EB)” 라는 말은 내배엽, 중배엽 및 외배엽 배엽층으로 분화할 수 있는 만능 줄기 세포의 응집체이다. 스페로이드 구조는 만능 줄기 세포가 비-접착 배양 조건하에 응집하도록 허용된 경우 형성되고 따라서 현탁액 중 Eb를 형성한다.
[0091] “단리된” 세포는 유기체 또는 배양액 중에서 다른 세포로부터 실질적으로 분리되거나 정제된다. 단리된 세포는, 예를 들어, 99% 이상, 98% 이상 순수, 95% 이상 순수 또는 90% 이상 순수할 수 있다.
[0092] 본원에서 사용되는 '세포주'는 하나의 세포로부터 기원하는 세포의 집합체를 지칭한다. 세포주는 튜브, 플라스크 또는 접시에 담긴 성장 배지에 유지될 수 있다. 세포주는 단일 세포에서 다중 세포로 확장되도록 클론 확장에 의해 개발할 수 있다. 세포주는 유전학적으로 동일한 세포를 포함할 수 있고, 수개월 또는 수년 과 같은 장기간에 걸쳐 배양액에 유지할 수 있다.
[0093] “배아”는 접합체 또는 인위적으로 재프로그래밍된 핵으로 활성화된 난모세포의 1회 이상의 분할로 수득된 세포 덩어리를 지칭한다.
[0094] “배아 줄기 (ES) 세포”는 초기 단계의 배아, 예를 들어 배반포 단계에서 내부 세포 덩어리로부터 수득되거나 또는 인위적인 수단 (예를 들어, 핵 치환)에 의해 생성되어 생식 세포 (예를 들어 정자 및 난자)를 비롯한 배아 또는 성체에서 임의의 분화된 세포형을 낼 수 있는 미분화된 만능 세포이다.
[0095] "유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)"는 인자들 (본원에서 재프로그래밍 인자로 지칭함) 조합의 발현 또는 그 발현을 유도함으로써 체세포를 재프로그래밍하여 생성된 세포이다. iPSC는 태아, 출생후, 신생, 발육기, 또는 성체 체세포를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 구현예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들로는, 예를 들어, Oct4 (Oct 3/4로도 지칭함), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog 및 Lin28을 포함한다. 일부 구현예에서, 체세포는 2개 이상의 재프로그래밍 인자, 3개 이상의 재프로그래밍 인자, 또는 4개의 재프로그래밍 인자를 발현시켜 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍함으로써 재프로그래밍된다.
[0096] “피더 부재” 또는 “피더 독립적인” 이라는 말은 본원에서 피더 층에 대한 대체물로서 사이토카인과 성장 인자 (예를 들어, TGFβ, bFGF, LIF)로 보충된 배양액을 가리키는데 사용된다. 따라서, “피더 부재” 또는 피더 독립적인 배양 시스템 및 배지는 만능 세포를 배양하여 미분화 및 증식 상태로 유지하는데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 피더(feeder)가 없는 배양물은 동물계 매트릭스 (예를 들어 MATRIGEL™)를 이용하거나, 또는 피브로넥틴, 콜라겐 또는 비트로넥틴과 같은 기질 상에서 성장한다. 이러한 접근법들은 사람 줄기 세포가 마우스 섬유아세포 “피더 층”에 대한 필요없이 필수적으로 미분화 상태로 남아있도록 해준다.
[0097] “피더 층”은 배양 접시의 바닥 상에서와 같은 세포의 코팅층으로 정의된다. 상기 피더는 배양 배지로 영양분을 방출하여 만능 줄기 세포와 같은 다른 세포가 부착할 수 있는 표면을 제공할 수 있다.
[0098] 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건과 관련하여 사용되는 “합성 (defined)” 또는 “완전 합성 (fully defined)” 이라는 용어는 거의 모든 성분들의 화학 조성과 양이 공지된 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 조건을 가리킨다. 예를 들어, 합성 배지는 소태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 사람 혈청 알부민에서와 같이 규정되지 않은 인자들은 포함하지 않는다. 일반적으로, 합성 배지는 재조합 알부민, 화학적으로 합성된 지질 및 재조합 인슐린이 보충된 기본 배지 (예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), F12, 또는 아미노산, 비타민, 무기염, 버퍼, 산화방지제 및 에너지원을 포함하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 배지 1640)를 포함한다. 완전 합성 배지의 예는 Essential 8™ 배지이다.
[0099] 사람 세포와 함께 사용되는 배지, 세포외 매트릭스 또는 배양 시스템에 대해, 용어 “제노-프리(Xeno-Free) (Xf)”는 사용되는 물질이 비-사람 동물-기원이 아닌 조건을 언급한다.
II. 가공된 세포주
[00100] 일부 구현예에서, 본원에서는 전이유전자가 안정적 발현으로 발현하도록 가공된 세포주가 제공된다. 안정적 발현은 전이유전자 서열을 코돈을 최적화하여 CpG 모티프를 제거하거나, 신규 프로모터(예를 들어, 서열번호: 1-12 또는 17)에 의해 발현을 구동시키거나, 내인성 유전자(예를 들어, HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 또는 MYL6)를 태깅함에 의해 발현을 구동시킴에 의해 달성될 수 있다.
[00101] 본원에서 사용되는 'CpG 모티프'는 사이토신 'C'에 이어서 포스페이트 결합 'p' 및 구아닌 'G'를 함유하는 뉴클레오타이드를 지칭한다. "CpG 모티프의 제거"에 대한 언급은 C 및/또는 G 뉴클레오타이드가 모티프를 제거하도록 변형된 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자와 관련하여 "사람화된"은 핵산 분자가 사람 서열과 유사하거나 매우 유사한 서열 또는 서열의 일부를갖거나, 그렇지 않으면 상기 분자가 사람 세포에서 보다 기능성이 되도록 만들어졌음을 의미한다. 예를 들어, 사람 세포에서 핵산 발현의 효과를 증진시키기 위해 사람에서 공지된 코돈 용법을 기반으로 코돈을 사람 용도에 맞게 최적화하여 더 신속한 해독 속도와 높은 정확도를 달성할 수 있다.
표 1. 예시적 대체 코돈.
[00102] 메틸화에 의해 유전자가 중단되는 과정은 궁극적으로 염색질 구조에 변화를 유도하여 전사 약화 상태를 형성하는 일련의 연속적인 사건으로 설명된다. 유전자에서 5'-CpG-3 '의 메틸화는 메틸화된 DNA 서열에 결합하고 동시에 히스톤 데아세틸라제(MBD-HDAC)와 전사 억제제 단백질(전사 교정자(redresser) 단백질)에 결합한다. 인공 유전자 합성 기술은 이러한 가능성에서 선택된 모든 뉴클레오타이드 서열이 합성될 수 있게 하고. 여기서 상응하는 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 바람직하게 변화되지 않는다. 변형된 표적 핵산 서열은 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 단계적 PCR에 의해 긴 올리고뉴클레오타이드로부터 생성하거나, 통상적인 유전자 합성의 경우 전문 공급업체(예를 들어, Geneart GmbH, Qiagen AG)에 의해 생성된다.
[00103] 일부 양상에서 유전자 코드 범위 내에서 제거할 수 있는 전이유전자에서 모든 CpG가 제거된다. 그러나 덜한 CpG, 예를 들어 50%, 60%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 CpG가 또한 제거될 수 있다. 본원 개시내용에 따른 코돈 최적화 작제물은 예를 들어, 사용된 발현 시스템에서와 동일한 코돈 분포를 선택함으로써 제조될 수 있다. 발현 시스템은 사람 시스템과 같은 포유동물 시스템일 수 있다. 따라서 코돈 최적화는 사람 유전자의 코돈 선택과 매칭하는 것이 바람직하다.
[00104] 호모 사피엔스의 일부 코돈의 풍부함은 낮은 반면 다른 코돈은 중간 정도이거나 높다. 본원에서 사용되는 '희귀 코돈'은 호모 사피엔스에서 빈도가 0.2 미만인 코돈을 지칭한다. DNA 서열을 변형시키는 경우 희귀 코돈의 사용을 회피하기 위해 코돈 빈도 표를 사용하여 적어도 0.3, 예를 들어, 적어도 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 빈도인 코돈을 선택할 수 있다.
표 2. 호모 사피엔스 중의 코돈 빈도.
[00105] 예를 들어, L, 류신을 암호화하는 서열을 변형시키는 경우 평가할 코돈은 6개이다(여기서는 코돈 + 빈도로 나열됨): UUA 8%, UUG 13%, CUU 13%, CUC 20%, CUA 7%, 또는 CUG 40%. 류신 코돈 CUC에 이어서 G로 시작하는 코돈이 이어지면 CG 모티프가 존재하고, CG 모티프를 제거하고 희귀 코돈을 사용하지 않기 위해 다른 4개의 코돈보다 류신 코돈을 CUG로 변형시키는 것이 선호된다.
[00106] CG 모티프를 제거하기 위해 프롤린에 대한 CCG와 같은 코돈의 변형은 코돈 CCC를 성취될 수 있지만, 단백질 영역에 여러 개의 프롤린이 포함되어 있는 경우 이러한 변형은 모노뉴클레오타이드 스트레치 반복체를 생성한다. 따라서, CCU 또는 CCA와 같은 다른 코돈은 모노뉴클레오타이드 스트레치를 회피하기 위해 프롤린에 대한 것으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "모노뉴클레오타이드 스트레치"는 CCCCCC와 같이 연속적으로 동일한 뉴클레오타이드가 6개 이상 있는 영역을 지칭한다.
[00107] 전이유전자 서열은 RNA, 이의 유도체 또는 모방체, 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 변형된 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 단백질 또는 이의 변형된 단백질을 암호화할 수 있다. 전이유전자는 또한 다양한 야생형 서열의 키메라 및/또는 어셈블리된 서열일 수 있고, 예를 들어 융합 단백질 또는 모자이크형 어셈블리된 폴리유전자 작제물을 암호화할 수 있다. 전이유전자는 또한 합성 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 핵산 서열은 예를 들어, 컴퓨터 모델을 사용함에 의해 합성적으로 모델링될 수 있다.
[00108] 발현될 전이유전자는 임의의 단백질, 예를 들어 재조합 단백질, 인공 폴리펩타이드, 융합 단백질 및 이들의 등가물에 대한 유전자 서열일 수 있다. 일부 양상에서, 전이유전자는 진단학적 및/또는 치료학적 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 일부 양상에서, 전이유전자는 리포터 유전자, 예를 들어 이에 제한되지 않지만 GFP, RFP, 루시퍼라제, β-갈락토시다제 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제이다. 일부 양상에서, 전이유전자는 LacZ, mSEAP, 또는 루시아(Lucia)이다. 펩타이드/단백질은 예를 들어, i) 사람 효소(예를 들어, 아스파라기나제, 아데노신 데아미나제, 인슐린, tPA, 응고인자, 비타민 K 에폭사이드 리덕타제), 호르몬(예를 들어, 에리트로), 단백질, 난포 자극 호르몬, 에스트로겐과 같은 치료학적 단백질 및 기타 사람 유래된 단백질(예를 들어, 골 형성 단백질, 안티트롬빈)의 생성물, ii) 백신으로 사용될 수 있는 바이러스 단백질, 세균 단백질 또는 기생충으로부터 유래된 단백질(예를 들어, HIV, HBV, HCV, 인플루엔자, 보렐리아, 헤모필러스, 메닌고코커스, 안트락스(Anthrax), 보툴린 독소, 디프테리아 독소, 파상풍 독소, 플라스마디움 등) 또는 iii) 진단제를 포함한다. 전이유전자는 블라스티시딘 또는 네오마이신과 같은 프로모터 또는 선택 유전자일 수 있다.
A. 유도성 만능 줄기 세포
[00109] 일부 구현예에서, 가공된 세포주는 iPSC이다. 만능성의 유도는 본래에 만능성과 연관된 전사 인자의 도입을 통한 체세포의 재프로그래밍에 의해 2006년에 마우스 세포를 사용하고(문헌참조: Yamanaka et al. 2006), 2007년에 사람 세포를 사용하여 (문헌참조: Yu et al. 2007;Takahashi et al. 2007) 달성되었다. 만능 줄기 세포는 미분화 상태로 유지될 수 있어 임의의 성체 세포형으로 분화될 수 있다.
[00110] 생식계열 세포를 제외하고는, 어떤 체세포라도 iPCS를 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 유형은 케라틴세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간엽 세포, 간 세포 또는 위 세포일 수 있다. T 세포는 재프로그래밍을 위한 체세포 공급원으로도 사용될 수 있다 (미국 특허 제8,741,648호). 세포 분화의 정도 또는 해당 세포가 수거되는 동물의 나이에는 제한이 없고; 미분화 전구세포 (체세포 줄기 세포를 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙한 세포조차도 본원에 기재된 방법에서 체세포의 공급원으로 사용될 수 있다. iPSC는 사람 ES 세포를 특정 세포 유형으로 분화시키는 것으로 알려진 조건 하에 성장하여, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81를 포함하는 사람 ES 세포 마커를 발현할 수 있다.
A. HLA 매칭
[00111] 주요 조직적합성 복합체(MHC)는 동종이계 기관 이식의 면역 거부에 있어서 주된 요인이다. 3개의 주요 부류 I MHC 반수체형 (A, B 및 C)과 3개의 주요 MHC 부류 II 반수체형 (DR, DP 및 DQ)이 존재한다.
[00112] 공여체와 수용체간의 MHC 조직적합성은, 공여체 세포가 HLA 동형접합성, 즉 각 항원 제시 단백질에 대해 동일한 대립유전자를 포함하는 경우에 크게 증가한다. 대부분의 개체들은 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형접합성이지만, 특정 개체들은 이러한 유전자들에 대해 동형접합성이다. 이들 동형접합성 개체들은 초 공여자로서 기능할 수 있으며, 이들의 세포로부터 생성된 이식편은 해당 반수체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 모든 개체에 이식될 수 있다. 추가로, 동형접합성 공여자 세포가 한 집단에서 높은 빈도수로 발견되는 반수체형을 보유하는 경우, 이러한 세포들은 다수의 개체들을 위한 이식 요법에 적용할 수 있다.
[00113] 따라서, iPSC는 치료될 대상체, 또는 해당 환자와 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 또 다른 대상체로부터 생성될 수 있다. 한 경우에 있어서, 공여자의 주요 HLA (예를 들어, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개의 주요 유전자좌)는 수용자의 주요 HLA와 동일하다. 일부의 경우, 체세포 공여자는 초 공여자일 수 있어서; MHC 동형접합성 초 공여자로부터 유래한 iPSC는 분화된 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 초공여자로부터 유래한 iPSC는 반수체형에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 대상체에 이식될 수 있다. 예를 들어, iPSC는 2개의 HLA 대립유전자, 예를 들어, HLA-A 및 HLA-B에서 동형접합성일 수 있다. 이와 같이, 초 공여자로부터 생성된 iPSC는 다수의 잠재적인 수용자들을 잠재적으로 “매칭”할 수 있는 분화된 세포를 생성하기 위해 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
B. 재프로그래밍 인자
[00114] 체세포는 당업자에게 공지된 방법들을 사용하여 재프로그래밍되어 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성할 수 있다. 당업자라면 유도된 만능 줄기 세포를 용이하게 생성할 수 있으며, 이에 대해서는 예를 들어, 공개된 미국 특허출원 20090246875호, 공개된 미국 특허출원 2010/0210014호; 공개된 미국 특허출원 20120276636호; 미국특허 8,058,065호; 미국특허 8,129,187호; 미국특허 8,278,620호; PCT 공보 WO 2007/069666 A1호, 및 미국특허 8,268,620호를 참조하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자를 사용하여 체세포로부터 만능 줄기 세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28을 사용한다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4를 사용한다. 일부 양상에서, 5개, 6개, 7개, 또는 8개 재프로그래밍 인자들이 사용된다.
[00115] 세포는 핵 재프로그래밍 물질로 처리하는데, 이는 일반적으로 체세포 또는 이러한 물질들을 암호화하는 핵산으로부터 iPCS를 유도할 수 있는 하나 이상의 인자들이다 (벡터 내에 통합된 형태를 포함함). 상기 핵 재프로그래밍 물질은 일반적으로 적어도 Oct3/4, Klf4 및 Sox2 또는 이러한 분자들을 암호화하는 핵산을 포함한다. p53의 기능적 억제제인 L-myc, 또는 L-myc를 암호화하는 핵산, 및 Lin28 또는 Lin28b, 또는 Lin28 또는 Lin28b를 암호화하는 핵산은 추가의 핵 재프로그래밍 물질로 사용될 수 있다. Nanog도 핵 재프로그래밍을 위해 사용될 수 있다. 공개된 미국 특허출원 20120196360호에 개시된 바와 같이, iPCS의 제조를 위한 대표적인 재프로그래밍 인자로는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc (Sox2는 Soxl, Sox3, Soxl5, Soxl7 또는 Soxl8로 대체될 수 있으며; Klf4는 Klfl, Klㄹf2 또는 Klf5로 대체가능함); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 거대 T 항원 (SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 사람 유두종 바이러스 (HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L- Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmil; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HP VI 6 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함)를 포함한다. 비제한적인 한 예에서, Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc가 사용된다. 다른 구현예에서, Oct4, Nanog 및 Sox2가 사용되는데, 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제7,682,828호를 참조한다. 이러한 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만, Oct3/4, Klf4 및 Sox2를 포함한다. 다른 예에서, 상기 인자들로는, 이에 제한되지는 않지만 Oct 3/4, Klf4 및 Myc를 포함한다. 일부 비제한적인 예에서, Oct3/4, Klf4, c-Myc 및 Sox2가 사용된다. 다른 비제한적인 예에서, Oct3/4, Klf4, Sox2 및 Sal 4가 사용된다. Nanog, Lin28, Klf4 또는 c-Myc와 같은 인자들은 재프로그래밍 효율을 증가시킬 수 있으며, 수개의 서로 다른 발현 벡터들로부터 발현될 수 있다. 예를 들어, 통합 벡터, 예를 들어 EBV 성분 기반 시스템이 사용될 수 있다 (미국특허 8,546,140). 추가의 양태에서, 재프로그래밍 단백질은 단백질 형질도입에 의해 체세포 내로 직접 도입될 수 있다. 재프로그래밍은 글리코겐 신타제 키나제 3 (GSK-3) 억제제, 미토겐 활성화 단백질 키나제 (MEK) 억제제, 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 수용체 억제제 또는 신호전달 억제제, 백혈병 억제인자 (LIF), a p53 억제제, NF-카파 B 억제제 또는 이들의 조합을 비롯한 하나 이상의 신호전달 수용체로 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 조절자로는 소분자, 억제성 뉴클레오타이드, 발현 카세트, 또는 단백질 인자를 포함할 수 있다. 사실상 모든 임의의 iPS 세포 또는 세포주가 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
[00116] 이러한 핵 재프로그래밍 물질의 마우스 및 사람 cDNA 서열은 본원에 참고로 포함되는 WO 2007/069666호에 언급된 NCBI 등록 번호를 참조하여 이용가능하다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질, 또는 이러한 재프로그래밍 물질을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 공개된 미국 특허 출원 제2012/0196360호 및 미국 특허 제8,071,369호에 기재되어 있고, 상기 2개의 문헌은 본원에 참고로 인용된다.
[00117] iPSC는 일단 유도되면 다능성을 유지하기에 충분한 배지 중에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 제7,442,548호 및 미국 특허 공개 공보 제2003/0211603호에 기재된 바와 같이 만능 줄기 세포, 보다 구체적으로, 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술과 함께 사용될 수 있다. 마우스 세포의 경우, 통상적인 배지에 분화 억제 인자로서 백혈병 억제인자 (LIF)를 첨가하여 배양을 수행한다. 사람 세포의 경우, LIF 대신에 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)를 첨가하는 것이 요망될 수 있다. 당업계의 숙련자에게 공지된 바와 같은 iPSC의 배양 및 유지를 위한 기타 방법들도 사용될 수 있다.
[00118] 특정 구현예에서, 비한정 조건이 사용될 수 있는데; 예를 들어, 만능 세포는 섬유아세포 피더 세포 또는 줄기 세포를 미분화 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 피더 세포에 노출시킨 배지 상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 피더 세포로서 세포 분열을 종료시키기 위해 방사선 또는 항생제로 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공존 하에 배양된다. 대안적으로, 만능 세포는 TESR™ 배지 (Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8™ 배지 (Chen et al., 2011)와 같은 합성된 피더 독립적인 배양 시스템을 사용하여 배양되어 필수적으로 미분화 상태로 유지될 수 있다.
C. 플라스미드
[00119] 일부 구현예에서, iPSC는 프로모터 및 제1 마커를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 인핸서를 포함하는 것과 같이 외인성 핵산을 발현하도록 변형될 수 있다. 또한, 작제물은 해독 개시를 위한 리보솜 결합 부위 (내부 리보솜 결합 서열) 및 전사/해독 종결자와 같은 기타 요소들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 세포를 작제물로 형질감염시키는 것이 유리하다. 안정한 형질감염을 위해 적절한 벡터로는, 이에 제한되지는 않지만 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 센다이 바이러스를 포함한다.
[00120] 일부 구현예에서 마커를 암호화하는 플라스미드는 다음으로 구성된다: (1) 고카피수의 복제 오리진, (2) 선택가능한 마커, 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 가나마이신을 이용한 항생제 선별을 위한 네오 유전자, (3) 티로시나제 인핸서를 포함하는, 전사 종결 서열, (4) 다양한 핵산 카세트의 도입을 위한 다중클로닝 부위; 및 (5) 티로시나제 프로모터에 작동가능하게 연결된 마커를 암호화하는 핵산서열. 단백질을 암호화하는 핵산을 유도하기 위해 당업계에 공지된 수많은 플라스미드 벡터들이 존재한다. 이들의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 미국 특허 제6,103,470호; 미국 특허 제7,598,364호; 미국 특허 제7,989,425호; 및 미국 특허 제6,416,998호에 개시된 벡터들을 포함하고, 상기 특허문헌들은 본원에 참조로 인용된다. 일부 양상에서, 플라스미드는 “자살 유전자”를 포함하고, 이는 프로드럭 또는 약물의 투여시, 유전자 생성물의 숙주 세포를 사멸시키는 화합물로의 전환에 영향을 준다. 사용될 수 있는 자살 유전자/프로드럭 또는 약물 조합의 예는 예를 들어, 제한 없이 절단된 EGFR 및 세툭시맙; 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex Virus)-티미딘 키나제(HSV-tk) 및 간시클로비르(ganciclovir), 아시클로비르(acyclovir), 또는 FIAU; 옥시도리덕타제 및 사이클로헥시미드; 사이토신 데아미나제 및 5-플루오로사이토신; 티미딘 키나제 티미딜레이트 키나제 (Tdk::Tmk) 및 AZT; 및 데옥시시티딘 키나제 및 사이토신 아라비노시드이다.
[00121] 바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA계 또는 DNA계 바이러스 벡터일 수 있다. 에피좀 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바르 바이러스 (EBV)계 에피좀 벡터, 효모계 벡터, 아데노바이러스계 벡터, 유인원 바이러스 40 (SV40)계 에피좀 벡터, 소 유두종 바이러스 (BPV)계 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
[00122] 마커로는, 이에 제한되지는 않지만, 형광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질), 효소 (예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제 또는 반딧불이/레닐라 루시퍼라제 또는 나노럭), 또는 기타 단백질을 포함한다. 마커는 단백질 (분비된, 세포 표면, 또는 내부 단백질 포함; 합성되거나 또는 세포에 의해 취득됨); 핵산 (예를 들어 mRNA, 또는 효소적으로 활성인 핵산 분자) 또는 폴리사카라이드일 수 있다. 항체, 렉틴, 프로브 또는 관심 세포형의 마커에 특이적인 핵산 증폭 반응에 의해 검출가능한 임의의 이러한 세포 성분들의 결정자도 포함된다. 상기 마커들은 생화학적 또는 효소 검정, 또는 유전자 생성물의 기능에 의존하는 생물학적 반응에 의해 확인될 수도 있다. 이러한 마커들을 암호화하는 핵산 서열은 티로신 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가로, 다른 유전자들은 예를 들어, 줄기 세포 분화, 또는 세포 기능, 또는 생리학, 또는 병리학에 영향을 줄 수 있는 유전자들도 포함될 수 있다.
D. 전달 시스템
[00123] 본원 개시내용의 가공된 세포주로 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 도입은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달을 위해 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 생체외 형질감염에 의한(Wilson et al., 1989, Nabel et al, 1989), 주사에 의한(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859호, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다)(이는 마이크로주사(Harland and Weintraub, 1985; 미국 특허 제5,789,215, 본원에 참조로 인용된다)를 포함함); 전기천공에 의해(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조로 인용됨; Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984); 인산칼슘 침전에 의해(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe　et　al.,　1990); DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜을 사용함에 의해(Gopal, 1985); 직접적인 음파 로딩에 의해(Fechheimer　et　al.,　1987); 리포좀 매개된 형질감염(Nicolau and Sene, 1982; Fraley　et　al.,　1979; Nicolau　et　al.,　1987; Wong　et　al., 1980; Kaneda　et　al.,　1989; Kato　et　al.,　1991) 및 수용체-개매된 형질감염에 의해 (Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 마이크로추진 충격에 의해(PCT Application Nos. WO 94/09699 and 95/06128; 미국 특허 제5,610,042호; 제5,322,783호, 제5,563,055호, 제5,550,318호, 제5,538,877호 및 제5,538,880호, 및 이의 각각은 본원에 참조로 인용됨); 탄화규소 섬유과 함께 진탕에 의해(Kaeppler　et　al.,　1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호, 이의 각각은 본원에 참조로 인용된다); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환에 의해 (미국 특허 제5,591,616호 및 제5,563,055호, 각각은 본원에 참조로 인용됨); 건조/억제-매개된 DNA 취득에 의해(Potrykus　et　al.,　1985), 및 상기 방법의 임의의 조합과 같은 DNA의 직접적인 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들과 같은 기술의 적용을 통해, 기관(들), 세포(들), 조직 (들) 또는 유기체(들)은 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
1. 바이러스 벡터
[00124] 바이러스 벡터는 본원 개시내용의 특정 양상에서 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성하는데 있어서, 비-필수 유전자는 전형적으로 이종성 (또는 비-고유) 단백질에 대한 유전자 또는 암호화 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 일종의 발현 작제물이고 이는 핵산 및 능히 단백질을 세포로 도입하기 위해 바이러스 서열을 사용한다. 특정 바이러스가 세포를 감염시키거나 수용체-매개된 세포내이입을 통해 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈에 통합하고 안정하게 및 효율적으로 바이러스 유전자를 발현시키는 능력은 이들이 외래 핵산의 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)로의 전달을 위해 매력적인 후보물이 되게 한다. 본원의 개시내용의 특정 양상의 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다.
[00125] 레트로바이러스는 이들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시키고 대량의 외래 유전학적 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고 특수 세포-주에서 팩키징되는 이들의 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 유망하다(문헌참조: Miller, 1992).
[00126] 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입되어 복제-결함인 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 팩키징 성분이 없는 팩키징 세포주를 작제한다(문헌참조: Mann　et al.,　1983). 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특수 세포주로 도입되는 경우 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해), 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 팩키징되도록 하고 이어서 이는 배양 배지로 분비된다(문헌참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann　et al.,　1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 이어서 수거하고, 임의로 농축시키고 유전자 전달을 위해 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 요구한다(문헌참조: Paskind　et al.,　1975).
[00127] 렌티바이러스는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol, 및 env외에 , 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌참조: 예를 들어, Naldini et al., 1996; Zufferey et al., 1997; Blomer et al., 1997; U.S. Patents 6,013,516 and 5,994,136).
[00128] 재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 둘다를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-분열 세포-여기서, 적합한 숙주 세포는 팩키징 기능, 즉, gag, pol 및 env, 및 rev 및 tat를 함유하는 2개 이상의 벡터로 형질감염된다―를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있다.
2. 에피좀 벡터
[00129] 플라스미드-또는 리포좀-기반 염색체외 (즉, 에피좀) 벡터의 사용은 또한 본원의 개시내용의 특정 양상에서 제공될 수 있다. 상기 에피좀 벡터는 예를 들어, oriP-기반 벡터, 및/또는 EBNA-1의 유도체를 암호화하는 벡터를 포함할 수 있다. 이들 벡터는 DNA의 큰 단편이 세포로 도입되고 염색체 외부에서 유지되고 세포 사이클 당 1회 복제되고 딸 세포를 효율적으로 분할시키고 실질적으로 어떠한 면역 반응을 유발할 수 없도록한다.
[00130] 특히, oriP-기반 발현 벡터의 복제를 위해 요구되는 유일한 바이러스 단백질인 EBNA-1은 세포 면역 반응을 유발하지 않는데 그 이유는 이것이 MHC 부류 I 분자의 제공을 위해 요구되는 프로세싱을 우회하는 효율적인 기전을 발달시키기 때문이다(문헌참조: Levitskaya et al., 1997). 추가로, EBNA-1은 트랜스로 작용하여, 클로닝된 유전자의 발현을 증진시킬 수 있고, 일부 세포주에서 100배까지 클로닝된 유전자의 발현을 유도할 수 있다(문헌참조: Langle-Rouault et al., 1998; Evans et al., 1997). 최종적으로, 상기 oriP-기반 발현 벡터의 제조는 저렴하다.
[00131] 특정 양상에서, 재프로그래밍 인자는 하나 이상의 외인성 에피좀 유전적 요소에 포함된 발현 카세트로부터 발현된다 (본원에 참조로 인용되는 미국 특허 공개공보 2010/0003757 참조). 따라서, iPSC는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 요소와 같은 외인성 유전적 요소가 필수적으로 부재일 수 있다. 이러한 iPSC들은 외인성 벡터 또는 바이러스 요소가 필수적으로 없는 iPSC를 만들기 위해 에피좀 복제가 가능한 벡터인, 염색체외 복제 벡터 (즉, 에피좀 벡터)를 사용하여 제조된다 (본원에 참고로 포함되는 미국특허 8,546,140호; Yu et al., 2009). 다수의 DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 유인원 액포형 바이러스(Simian vacuolating virus) 40 (SV40) 또는 소 유두종 바이러스 (BPV), 또는 출아 효모 ARS (Autonomously Replicating Sequences, 복제기점염기순서) 함유 플라스미드는 포유동물 세포 내에서 염색체외 또는 에피좀 복제를 한다. 이러한 에피좀 플라스미드는 필수적으로 통합 벡터와 관련된 이러한 모든 난점들 (Bode et al., 2001)이 부재이다. 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 림프구친화성 헤르페스 바이러스계 포함 또는 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)는 염색체외 복제를 하여 재프로그래밍 유전자를 체세포로 전달하는데 도움을 줄 수 있다. 유용한 EBV 요소로는 OriP 및 EBNA-1, 또는 이들의 변이체 또는 기능적 균등물을 들 수 있다. 에피좀 벡터의 추가의 장점은 외인성 요소가 세포에 도입된 후 시간 경과에 따라 상실되어 필수적으로 이러한 요소가 없는 자립형 iPSC를 유도할 수 있다는 것이다.
[00132] 다른 염색체외 벡터로는 다른 림프구친화성 헤르페스 바이러스계 벡터를 포함한다. 림프구친화성 헤르페스 바이러스는 림프아구세포 (예를 들어, 사람 B 림프아구세포) 내에서 복제하여 이의 자연적인 생활 주기의 일부에 대한 플라스미드가 되는 헤르페스 바이러스이다. 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)는 "림프구친화성" 헤르페스 바이러스는 아니다. 전형적인 림프구친화성 헤르페스 바이러스는, 이에 제한되지는 않지만 EBV, 카포시 육종 헤르페스 바이러스 (KSHV); 다람쥐원숭이 헤르페스 바이러스 (HS) 및 마렉병 바이러스 (MDV)를 포함한다. 또한, 에피좀계 벡터의 다른 공급원이 고려되고, 예를 들어, 효모 ARS, 아데노바이러스, SV40, 또는 BPV가 있다.
[00133] 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제하기 위한 장비를 잘 갖추고 있다(문헌참조: 예를 들어, Maniatis et al., 1988 and Ausubel et al., 1994, 이 둘다는 본원에 참조로 인용된다).
[00134] 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나 다르게는 표적화된 세포에 유익한 성질을 제공하는 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 상기 다른 성분은 예를 들어, 세포로의 결합 또는 표적화에 영향을 주는 성분들(세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분들을 포함하는); 벡터 핵산의 세포에 의한 취득에 영향을 주는 성분들; 취득 후 세포 내 폴리뉴클레오타이드의 위치화에 영향을 주는 성분들(핵 위치화를 매개하는 매개하는 제제들과 같은); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 주는 성분들을 포함한다.
[00135] 상기 성분들은 또한 핵산을 취득하고 벡터에 의해 전달된 핵산을 발현하는 세포를 검출하거나 선택하기 위해 사용될 수 있는 검출가능한 마커 및/또는 선택 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 상기 성분들은 벡터의 천연 특성 (성분 또는 기능 매개 결합 및 취득을 갖는 특정 바이러스 벡터의 용도와 같은)으로서 제공되거나 벡터는 변형되어 상기 기능을 제공할 수 있다. 다양한 상기 벡터는 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 가용하다. 벡터가 숙주 세포에 유지되는 경우, 상기 벡터는 숙주 세포의 게놈내에 혼입되어 있는 자율적 구조체로서 감수분열 동안에 세포에 의해 안정하게 복제될수 있거나 숙주 세포의 핵 또는 세포질에 유지될 수 있다.
3. 조절 요소들
[00136] 본원의 개시내용에 유용한 재프로그래밍 벡터에 포함된 발현 카세트는 바람직하게 (5'-에서-3' 방향으로) 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결된 진핵 전사 프로모터, 삽입 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다.
a. 프로모터/인핸서
[00137] 본원에 제공된 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 구동시키기 위해 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 최상의 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유동물 종결 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 레이트 유전자에 대한 프로모터와 같이 TATA 박스가 부재인 일부 프로모터에서, 개시 부위 자체 위에 위치한 구분된 요소는 개시 위치를 고정시키는 것을 도와준다. 추가의 프로모터 요소들은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110　bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 개시 부위의 다운스트림에 기능성 요소들을 함유하는 것으로 나타났다. 암호화 서열을 프로모터“의 제어하에” 있도록 하기 위해, 하나는 선택된 프로모터의 “다운스트림”(즉, 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한다. “업스트림” 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
[00138] 프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 가요성이어서 프로모터 기능은 요소들이 서로 상대적으로 역위되거나 이동되는 경우 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 간의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 이격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 의존하여, 이것은 개별 요소들이 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있음을 나타낸다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용 조절 서열을 언급하는 “인핸서”와 연계하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
[00139] 프로모터는 암호화 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비-암호화 서열을 단리시킴에 의해 수득될 수 있는 바와 같이 핵산 서열과 천연적으로 연합된 것일 수 있다. 상기 프로모터는 “내인성”으로서 언급될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 상기 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 특정 이점은 정상적으로 이의 천연 환경에서 핵산 서열과 연합되지 않은 프로모터 프로모터를 언급하는, 재조합 또는 이종성 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 분절을 위치시킴에 의해 획득될 수 있다. 재조합 또는 이종성 인핸서는 또한 이의 천연 환경에서 핵산 성려과 정상적으로 연합되지 않은 인핸서를 언급한다. 상기 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “천연적으로 존재”하지 않는, 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조절 영역, 및/또는 돌연변이의 상이한 요소들을 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물에서 대부분 통상적으로 사용되는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제), 락토스 및 트립토판 (trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 합성적으로 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 생성하는 것에 추가로, 서열은 본원에 기재된 조성물과 연계하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(문헌참조: 미국 특허 제4,683,202호 및 제5,928,906호, 각각은 본원에 참조로 인용된다). 추가로, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
[00140] 천연적으로, 기관(organelle), 세포 유형, 기관(organ), 또는 발현을 위해 선택된 유기체 내에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요하다. 분자 생물학적 분야의 당업자는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다(문헌참조: 예를 들어, Sambrook et　al. 1989, 본원에 참조로 인용됨). 사용되는 프로모터는 항상성, 조직-특이적, 유도성일 수 있고/있거나 도입된 DNA 분절의 고수준의 발현을 지시하기 위해 적당한 조건하에서 유용할 수 있고, 예를 들어, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생성에 유리하다. 프로모터는 이종성 또는 내인성일 수 있다.
[00141] 추가로 임의의 프로모터/인핸서 조합(예를 들어, 진핵 세포 프로모터 데이터 베이스 EPDB 당)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적당한 세균 폴리머라제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전학적 발현 작제물의 일부로서 제공된 경우 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지지할 수 있다.
[00142] 프로모터의 비제한적인 예는 어얼리 또는 레이트 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 어얼리 또는 레이트 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 이메디에이트 어얼리 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 어얼리 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터 (Ng, 1989; Quitsche et al., 1989), GADPH 프로모터 (Alexander et al., 1988, Ercolani et al., 1988), 메탈로티오네인 프로모터(Karin et al., 1989; Richards et al., 1984); 및 연결된(concatenated) 반응 요소 프로모터들, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터들 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 (phorbol) 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 부근의 반응 요소 프로모터들 (tre)를 포함한다. 또한 사람 성장 호르몬 프로모터 서열(예를 들어, Genbank에 기재된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터, 승인 번호 X05244, 뉴클레오타이드 283-341) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007로부터 가용한)를 사용할 수 있다.
[00143] 특히, 프로그래밍으로부터 유래된 조혈 세포 및 조혈 세포의 전구체에서 리포터 유전자 발현을 위한 조직-특이적 전이유전자 발현은 유래된 조혈 세포 및 전구체를 동정하기 위한 방식으로서 바람직할 수 있다. 특이성 및 활성 둘다를 증가시키기 위해, 시스-작용 조절 요소들의 사용이 고려되었다. 예를 들어, 조혈 세포-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 이러한 많은 조혈 세포 특이적 프로모터는 당업계에 공지되어 있다.
[00144] 특정 양상에서, 본 개시내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키고 시스로 작용하고 이들의 배향과 무관하에 심지어 보다 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수킬로베이까지 이격되어 있는)에서 작용할 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 이들이 또한 소정의 프로모터에 근접하여 기능할 수 있으므로 필수적으로 상기 긴 거리에 제한되지 않는다.
[00145] 많은 조혈 세포 프로모터 및 인핸서 서열이 동정되었고 본 발명의 방법에 유용할 수 있다. 하기 문헌을 참조한다: 예를 들어, 미국 특허 제5,556,954호; 미국 특허 출원 제20020055144호; 미국 특허 출원 제20090148425호.
b. 개시 신호 및 연계된 발현
[00146] 특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 해독을 위해 본원의 개시내용에 제공된 발현 작제물에 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. 외인성 해독 제어 신호는 ATG 개시 코돈을 포함하고 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이를 용이하게 결정할 수 있고 필요한 신호를 제공할 수 있다. 개시 코돈은 전체 삽입체의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호화 서열의 판독 프레임과 “인 프레임”으로 있어야 한다는 것은 널리 공지되어 있다. 외인성 해독 제어 신호 및 개시 코돈은 천연이거나 합성일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 인핸서 요소들의 내포에 의해 증진될 수 있다.
[00147] 특정 구현예에서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소들을 사용하여 다중유전자, 또는 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소들은 5' 메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회할 수 있고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(문헌참조: Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스 패밀리의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌척수심근염)으로부터의 IRES 요소들은 문헌 (참조: Pelletier and Sonenberg, 1988)에 기재되었고, 또한 포유동물 메시지로부터의 IRES가 기재되어 있다(문헌참조: Macejak and Sarnow, 1991). IRES 요소들은 이종성 개방 판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께 전사될 수 있고 각각은 IRES에 의해 분리되어 있고 폴리시스트론 메시지를 생성한다. IRES 요소에 의해, 각각의 개방 판독 프레임은 효율적인 해독을 위해 리보솜에 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다(문헌참조: 미국 특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호, 각각은 본원에 참조로 인용된다).
[00148] 추가로, 특정 2A 서열 요소들을 사용하여 본원의 개시내용에 제공된 작제물 내 프로그래밍 유전자의 연결되거나 동시 발현을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 절단 서열을 사용하여 단일 시스트론을 형성하기 위해 개방 판독 프레임들을 연결시킴에 의해 유전자들을 동시 발현시킬 수 있다. 예시적 절단 서열은 F2A (구제역 질환 바이러스 2A) 또는 “2A-유사” 서열(예를 들어, 토세아 아시그나 바이러스 2A; T2A)이다(문헌참조: Minskaia and Ryan, 2013). 특정 구현예에서, F2A-절단 펩타이드를 사용하여 다중-계통 작제물 내 유전자들의 발현을 연결한다.
c. 복제 오리진
[00149] 숙주 세포 내 벡터를 증가시키기 위해, 하나 이상의 복제 오리진 부위 (흔히 “ori”로 칭함), 예를 들어, 상기된 바와 같이 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖고, 유전학적으로 가공된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기된 바와 같이 다른 염색체외 복제 바이러스의 복제 오리진 또는 자발적으로 복제하는 서열 (ARS)이 사용될 수 있다.
d. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
[00150] 특정 구현예에서, 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터 내 마커를 포함시킴에 의해 시험관내 또는 생체내에서 동정될 수 있다. 상기 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 동정을 가능하게 하는 세포에 동정가능한 변화를 부여한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 성질을 부여하는 마커이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 마커이고 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 차단시키는 마커이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
[00151] 일반적으로, 약물 선택 마커의 내포는 형질전환체의 클로닝 및 동정을 원조하고, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 수행을 기반으로 하는 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 추가로, 스크리닝가능한 마커, 예를 들어, 이의 기반이 비색 분석인 GFP를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝가능한 효소가 사용될 수 있다. 당업자는 또한 능히 FACS 분석과 연계된 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고 있다. 사용되는 마커는 이것이 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 사료되지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
E. 유전자 편집
[00152] 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 DNA-결합 표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성화인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 및 RNA-가이드된 뉴클레아제, 예를 들어, CRlSPR-연합된 뉴클레아제 (Cas)를 포함하고, 구체적으로 유전자 또는 이의 일부의 서열에 표적화되도록 디자인된 서열 특이적 또는 표적화된 뉴클레아제에 의한 유전자 편집을 포함한다.
[00153] 일부 구현예에서, 유전자 편집은 전형적으로 표적화된 방식으로 유전자 내 하나 이상의 이중 가닥 파열 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 파열의 도입에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파열은 뉴클레아제, 예를 들어, 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 유전자-표적화된 뉴클레아제에 의해 수행된다. 일부 양상에서, 상기 파열은 유전자의 암호화 영역 내, 예를 들어, 엑손내 유도된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 유도는 암호화 영역의 N-말단 부위 부근에서, 예를 들어, 제1 엑손내, 제2 엑손 내 또는 후속 엑손내에서 일어난다.
[00154] 일부 양상에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파열은 예를 들어, 비-상동성 말단-접합 (NHEJ) 또는 상동성-지시된 복구(HDR)에 의해 세포성 복구 공정을 통해 복구를 진행한다. 일부 양상에서, 상기 복구 공정은 오류가 발생하기 용이하고, 유전자의 완전한 녹아웃을 유도할 수 있는, 프레임 전환 돌연변이, 예를 들어, 양대립유전자 프레임 전환 돌연변이와 같은 유전자의 파괴를 유도한다.
[00155] 일부 구현예에서, 상기 유전자 편집은 유전자에 특이적으로 결합하거나 이에 하이브리드화하는, DNA-표적화 분자, 예를 들어, DNA-결합 단백질 또는 DNA-결합 핵산, 또는 복합체, 화합물 또는 이를 함유하는 조성물을 사용하여 성취된다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 아연 핑거 단백질(ZFP) DNA-결합 도메인, 전사 활성화인자-유사 단백질 (TAL) 또는 TAL 이펙터 (TALE) DNA-결합 도메인, 클러스터링된 규칙적으로 이격된 팔린드롬 반복체 (CRISPR) DNA-결합 도메인, 또는 메가뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인을 포함한다. 아연 핑거, TALE, 및 CRISPR 시스템 결합 도메인은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 아연 핑거 또는 TALE 단백질의 인지 나선 영역의 가공 (하나 이상의 아미노산을 변경하는)을 통해 소정의 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 가공될 수 있다. 가공된 DNA 결합 단백질(아연 핑거 또는 TALE)은 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 합리적 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기위한 대체 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참조하고; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 공보 제2011/0301073호를 참조한다.
[00156] 일부 구현예에서, DNA 표적화 분자, 복합체 또는 조합은 DNA 결합 분자 및 유전자의 억제 또는 파괴를 용이하게 하는 이펙터 도메인과 같은 하나 이상의 추가 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전자 편집은 DNA 결합 단백질 및 이종성 조절 도메인 또는 이들의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질에 의해 수행된다. 일부 양상에서 도메인은 예를 들어 활성화제, 억제제, 공동 활성화제, 공동 억제제, 사일런서, 종양 유전자, DNA 복구 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형제, DNA 재배열 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형제, 염색질 관련 단백질 및 이들의 변형제 등과 같은 전사인자 도메인, 예를 들어, 키나제, 아세틸라제 및 탈아세틸라제, DNA 변형 효소, 예를 들어, 메틸트랜스퍼라제, 토포이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제 및 이들의 관련 인자 및 변형제를 포함한다. 예를 들어, DNA 결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 자세한 내용은 미국 특허 출원 공개번호 2005/0064474, 2006/0188987 및 2007/0218528을 이들의 전문으로 참조로 인용된다. 일부 양상에서, 추가의 도메인은 뉴클레아제 도메인이다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자 편집은 뉴클레아제 및 뉴클레아제 함유 복합체 또는 융합 단백질과 같은 가공된 단백질을 사용하여 유전자 또는 게놈 편집에 의해 촉진되고 상기 단백질은 비특이적 DNA 절단 분자에 융합되거나 복합체화된 서열 특이적 DNA 결합 도메인으로 구성되어 있다.
[00157] 일부 양상에서 이들 표적화된 키메라 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 함유 복합체는 표적화된 이중 가닥 절단 또는 단일 가닥 절단을 유도함에 의해 오류 성향의 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성 지시된 복구(HDR)를 포함한 세포 DNA 복구 기전을 자극하여 정밀한 유전학적 변형을 수행한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALE 뉴클레아제(TALEN), 및 CRISPR 관련(Cas) 단백질과 같은 RNA 가이드 엔도뉴클레아제(RGEN), 또는 메가뉴클레아제와 같은 엔도뉴클레아제이다.
[00158] 일부 구현예에서, 공여자 핵산, 예를 들어, 공여자 플라스미드 또는 유전학적으로 가공된 항원 수용체를 암호화하는 핵산이 제공되고, DSB의 도입에 따른 유전자 편집 부위에서 HDR에 의해 삽입된다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전자의 파괴 및 항원 수용체, 예를 들어, CAR의 도입은 동시에 수행되며, 이에 따라 유전자는 부분적으로 CAR-암호화 핵산의 녹인 또는 삽입에 의해 파괴된다.
[00159] 일부 구현예에서, 어떠한 공여자 핵산이 제공되지 않는다. 일부 양상에서 DSB 도입 후 NHEJ 매개 복구는 미스센스 돌연변이 또는 프레임전환을 생성하여 유전자 파괴를 유발할 수 있는 삽입 또는 결실 돌연변이를 초래한다.
1. ZFP 및 ZFN
[00160] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 엔도뉴클레아제와 같은 이펙터 단백질에 융합된 하나 이상의 아연 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화인자-유사 단백질 (TAL)과 같은 DNA-결합 단백질을 포함한다. 예는 ZFN, TALE, 및 TALEN을 포함한다.
[00161] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 하나 이상의 아연-핑거 단백질 (ZFP) 또는 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 대형 단백질 내 단백질 또는 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 축약된다. ZFP 중에는 개별 핑거의 어셈블리에 의해 생성되는 전형적으로 9 내지 18개 뉴클레오타이드 길이의 특이적 DNA 서열을 표적화하는 인공 ZFP 도메인이 있다.
[00162] ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 아미노산 길이이고 단일 베터 턴의 2개 시스테인과 함께 아연을 통해 배위된 2개의 영구 히스티딘 잔기를 함유하고 2, 3, 4, 5 또는 6개 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열-특이성은 아연 핑거 인지 나선 상에 4개의 나선 위치 (-1, 2, 3 및 6)에서 아미노산을 치환함에 의해 변경될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 비-천연적으로 존재하는 것이고, 예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 가공된다.
[00163] 일부 양상에서, MeCP2의 파괴는 유전자 내 첫 번째 표적 부위를 첫 번째 ZFP와 접촉시켜 유전자를 파괴함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 유전자 내 표적 부위는 6개의 핑거와 조절 도메인을 포함하는 융합 ZFP와 접촉하여 유전자의 발현을 억제한다.
[00164] 일부 구현예에서, 접촉시키는 단계는 추가로 유전자 내 제2 표적 부위를 제2 ZFP와 접촉시킴을 포함한다. 일부 양상에서, 제1 및 제2 표적 부위는 인접해 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 ZFP는 공유적으로 연결된다. 일부 양상에서 첫 번째 ZFP는 조절 도메인 또는 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
[00165] 일부 구현예에서, 제1 및 제2 ZFP는 각각 조절 도메인을 포함하거나 각각 적어도 2개의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 조절 도메인은 전사 억제제, 전사 활성화제, 엔도뉴클레아제, 메틸 트랜스퍼라제, 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제 또는 히스톤 데아세틸라제이다.
[00166] 일부 구현예에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산에 의해 암호화된다. 일부 양상에서, 방법은 핵산을 지질:핵산 복합체 또는 나출된 핵산에서 세포에 먼저 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, ZFP는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 ZFP 핵산을 포함하는 발현 벡터에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, ZFP는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 암호화된다. 일부 양상에서, ZFP는 약한 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산에 의해 암호화된다.
[00167] 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 업스트림에 있다. 일부 구현예에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위에 인접해 있다. 일부 양상에서, 표적 부위는 유전자의 전사 개시 부위의 다운스트림에 있는 RNA 폴리머라제 중단 부위에 인접해 있다.
[00168] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)을 형성하기 위해 DNA 절단 도메인에 융합된 아연-핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 Type liS 제한 효소로부터 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 가공될 수 있거나 가공될 수 없는 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 도메인은 유형 liS 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터 유래한다. Fok I는 일반적으로 하나의 가닥 상에 이의 인지 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드 및 다른 가닥 상에 이의 인지 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다.
[00169] 일부 구현예에서, ZFN은 가공된 세포에 존재하는 유전자를 표적화한다. 일부 양상에서, ZFN은 이중 가닥 절단(DSB)을 예를 들어, 유전자의 암호화 영역 내 미리 결정된 부위에서 효율적으로 생성한다. 표적화된 일반적인 영역에는 엑손, N 말단 영역을 암호화하는 영역, 제1 엑손, 제2 엑손, 프로모터 또는 인핸서 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, ZFN의 일시적 발현은 가공된 세포에서 표적 유전자의 매우 효율적이고 영구적인 파괴를 촉진한다. 특히, 일부 구현예에서, ZFN의 전달은 50%를 초과하는 효율로 유전자의 영구적 파괴를 초래한다.
[00170] 많은 유전자-특이적 가공된 아연 핑거는 시판되고 있다. 예를 들어, 제조원(Sangamo Biosciences (Richmond, CA, USA))은 제조원(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA))과 협력하에 아연-핑거 작제를 위한 플랫폼 (CompoZr)을 개발하여 연구자가 아연-핑거 작제 및 확증을 함께 우회하도록 하여 수천개의 단백질에 대해 특이적으로 표적화된 아연 핑거를 제공한다(문헌참조: Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). 일부 구현예에서, 시판되는 아연 핑거를 사용하거나 맞춤식으로 디자인된다.
2. TAL, TALE 및 TALEN
[00171] 일부 구현예에서, DNA-표적화 분자는 천연적으로 존재하거나 전사 활성화인자-유사 단백질 이펙터 (TALE) 단백질에서와 같이 가공된 (비-천연적으로 존재하는) 전사 활성화인자 유사 단백질 (TAL) DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제2011/0301073호를 참조하고 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[00172] TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE는 하나 이상의 TALE 반복체 도메인/유닛을 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복체 도메인은 TALE의 이의 동족 표적 DNA 서열로의 결합에 관여한다. 단일 "반복체 유닛" (또한 “반복체”로서 언급됨)은 전형적으로 33 내지 35개 아미노산 길이이고 천연적으로 존재하는 TALE 단백질 내 다른 TALE 반복체 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 각각의 TALE 반복체 유닛은 전형적으로 반복체의 위치 12 및/또는 13에서 반복체 가변 이잔기(RVD)를 구성하는 1 또는 2개 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE의 DNA 인지를 위한 천연 (정준 (canonical)) 코드는 위치 12 및 13에서 HD 서열이 사이토신 (C)로의 결합을 유도하도록 결정되었다. NG의 T로의 결합, NI의 A로의 결합, NN의 G 또는 A로의 결합 및 NO의 T로의 결합 및 비-정준 (비전형적) RVD는 또한 공지되어 있다. 미국 특허 공개 공보 제2011/0301073호를 참조한다. 일부 구현예에서, TALE는 표적 DNA 서열에 대한 특이성과 함께 TAL 어레이의 디자인에 의해 임의의 유전자에 표적화될 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
[00173] 일부 구현예에서, 상기 분자는 DNA 결합 엔도뉴클레아제, 예를 들어, TALE 뉴클레아제(TALEN)이다. 일부 양상에서, TALEN은 TALE로부터 유래된 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
[00174] 일부 구현예에서, TALEN은 유전자 내 표적 서열을 인지하고 절단한다. 일부 양상에서, DNA의 절단은 이중 가닥 파열을 유도한다. 일부 양상에서, 상기 파열은 상동성 재조합 또는 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 불완전 복구 공정이고 이는 흔히 절단 부위에서 DNA 서열에 대한 변화를 유도한다. 일부 양상에서, 복구 기전은 직접적인 재-연결을 통해 또는 소위 미세상동성-매개된 말단 연결을 통해 (문헌참조: Critchlow and Jackson, 1998) 또는 소위 마이크로상동성 매개된 말단 연결을 통해 2개의 DNA 말단에 잔류하는 것의 재연결을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ를 통한 복구는 작은 삽입 또는 결실을 유도하고 이를 사용하여 유전자를 파괴하고 이로써 리프레싱할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 일부 양상에서, 절단-유도된 돌연변이유발 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연속한 돌연변이유발 이벤트가 일어난 세포는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정되고/되거나 선택될 수 있다.
[00175] 일부 구현예에서, TALE 반복체는 유전자를 특이적으로 표적화하도록 어셈블리된다. 18,740개의 사람 단백질-암호화 유전자를 표적화하는 TALEN의 라이브러리를 작제하였다. 맞춤 디자인된 TALE 어레이는 제조원(Cellectis Bioresearch (Paris, France), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA), 및 Life Technologies (Grand Island, NY, USA))을 통해 시판되고 있다.
[00176] 일부 구현예에서, TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된 전이유전자로서 도입된다. 일부 양상에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용한 세포의 동정 및/또는 선택을 위해 제공되는 선택 마커를 함유할 수 있다.
3. RGEN (CRISPR/Cas 시스템)
[00177] 일부 구현예에서, 파괴는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN)을 통한 파괴와 같은, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 파괴는 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 팔린드롬 반복체 (CRISPR) 및 CRISPR-연합 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 총체적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr (트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-쌍(mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “직접적인 반복체” 및 tracrRNA-가공된 부분 직접적인 반복체), 가이드 서열(또한, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여 “스페이서”로서 언급되는)), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터 다른 서열 및 전사체를 포함하는, CRISPR-연합 (“Cas”) 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 다른 요소들을 언급한다.
[00178] CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 뉴클레아제 기능 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)과 함께 DNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)에 서열 특이적으로 결합하는 비-암호화 RNA 분자(가이드) RNA를 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들은 예를 들어, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래된 I형, II형, 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.
[00179] 일부 양상에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (표적 서열 및 고정된 tracrRNA에 특이적인 crRNA의 융합을 포함하는)는 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5’ 말단에서 표적 부위는 Cas 뉴클레아제를 상보성 염기 쌍형성을 사용하여 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화시킨다. 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 서열의 바로 5’ 위치를 기준으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오타이드를 표적 DNA 서열에 상응하도록 변형시킴에 의해 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소들에 의해 특징화된다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 언급하고, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 완전한 상보성은 필수적으로 요구되지 않고, 단, 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키기에 충분한 상보성이 있다.
[00180] CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단 (DSB)에 이어서 본원에 논의된 바와 같은 붕괴를 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, “닉카제”로 간주되는 Cas9 변이체를 사용하여 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹(nick)한다. 쌍 형성 닉카제를 사용하여, 예를 들어, 각각 닉의 동시 도입시, 5’ 오버행이 도입되도록 하는 한쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시되는 특이성을 개선시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 촉매적 불활성 Cas9는 전사 리프레서 또는 활성화인자와 같은 이종성 이펙터 도메인에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
[00181] 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에, 예를 들어, 세포의 기관 내 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 언급된다. 일부 양상에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 언급될 수 있다. 일부 양상에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
[00182] 전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함하는)의 형성은 표적 서열에서 또는 이의 부근에서 (예를 들어, 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내) 하나의 가닥 또는 가닥 둘다의 절단을 유도한다. 야생형 tracr 서열 전부 또는 일부 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 또는 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 이상의 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한 예를 들어, tracr 서열의 적어도 일부를 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 쌍 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화함에 의해 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 형성에 관여하는 tracr 쌍 서열에 충분한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬되는 경우 tracr 쌍 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
[00183] CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소들의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터는 세포에 도입되어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISRR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 성분들은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-쌍 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상에 별도의 조절 요소들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소들로부터 발현되는 2개 이상의 요소들은 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분들을 제공하는 하나 이상의 추가의 벡터와 함께 단일 벡터에 조합될 수 있다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인지 서열 (또한 “클로닝 부위”로서 언급되는)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소들의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물은 세포 내 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
[00184] 벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 암호화하는 효소-암호화 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로서 공지된), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체 또는 이의 변형된 버젼을 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있고; 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 승인 번호 Q99ZW2하에 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
[00185] CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 에스. 피오게네스로부터 또는 에스. 뉴모니아로부터)일 수 있다. CRISPR 효소는 예를 들어, 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내, 표적 서열의 위치에서 가닥 하나 또는 가닥 둘다의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 상응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화하여 상기 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥 하나 또는 가닥 둘다를 절단하는 능력이 부재일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파르테이트 대 알라닌 치환 (D10A)은 가닥 둘다를 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제 (단일 가닥을 절단하는)로 Cas9를 전환시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제는 가이드 서열(들), 예를 들어, 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조합은 가닥 둘다를 닉킹하도록 하고 NHEJ 또는 HDR을 유도하기 위해 사용된다.
[00186] 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 암호화 서열은 특정 세포에서, 예를 들어, 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되어 있다. 진핵 세포는 특정 유기체, 예를 들어, 사람, 마우스, 래트, 토끼, 개 또는 비-사람 영장류를 포함하는 포유동물의 세포이거나 이들로부터 유래된 세포일 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 고유 아미노산 서열을 유지하면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 흔하게 또는 가능 흔하게 사용되는 코돈으로 대체함에 의해 관심 대상의 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 언급한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 용법에서의 차이)은 흔히 전령 RNA (mRNA)의 해독 효율과 상호관련되고, 이는 이어서 무엇 보다 해독될 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 가용성에 의존하는 것으로 사료된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 흔하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자들은 코돈 최적화를 기준으로 소정의 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
[00187] 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 CRISPR 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 지시하기에 충분히 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우 약 또는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%이상이다.
[00188] 최적의 정렬은 서열을 정렬시키기위한 임의의 적합한 알고리듬을 사용하여 결정될 수 있고 상기 알고리즘의 비제한적인 예는 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform)을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, 버로우 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner), 클러스탈 더블유 (Clustal W), 클러스탈 엑스(Clustal X), BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 가용한), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 가용한)를 포함한다.
[00189] CRISPR 효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신 (Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광성 단백질 (GFP), HcRed, DsRed, 시안(cyan) 형광성 단백질 (CFP), 황색 형광성 단백질 (YFP), 및 청색 형광 단백질 (BFP)를 포함하는 자가형광 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질 (MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합체, GAL4A DNA 결합 도메인 융합체 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) BP 16 단백질 융합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있다.
F. iPSC의 분화
[00190] 일부 구현예에서, 사람 iPSC와 같은 만능 줄기 세포 (PSC)의 필수적으로 단일 세포 현탁액으로부터 분화된 세포를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, PSC는 컨플루언스 전 상태 (pre-confluency)까지 배양하여 임의의 세포 응집물을 방지한다. 특정 양태에서, PSC는 TRYPSIN™ 또는 TRYPLE™에 의해 예시되는 바와 같이 세포 해리 효소를 이용한 항온배양에 의해 해리된다. PSC는 파이펫팅에 의해 필수적으로 단일 세포 현탁액으로도 해리될 수 있다. 또한, 블레비스타틴 (예를 들어, 약 2.5 μM)을 배지에 첨가하여 단일 세포로 해리된 후 세포들이 배양 용기에 부착되지 않으면서 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다. 블레비스타틴 대신에 ROCK 억제제를 대안으로 사용하여 단일 세포로 해리된 후 PCS 생존을 증가시킬 수도 있다.
[00191] 일단 PSC의 단일 세포 현탁액을 공지된 세포 밀도로 수득하면, 상기 세포를 일반적으로 적절한 배양 용기, 예를 들어, 플라스크, 6웰, 24웰, 또는 96웰 플레이트와 같은 조직 배양 플레이트에 씨딩한다. 세포를 배양하는데 사용되는 배양 용기로는, 줄기 세포를 배양할 수 있다면 특별히 제한되지는 않지만, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양용 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CELLSTACK® 챔버, 배양백 및 회전병을 포함할 수 있다. 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 용적 중에서 배양될 수 있다. 특정 구현예에서, 배양 용기는 세포가 증식될 수 있도록 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 생체외 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있는 생물반응기일 수 있다. 상기 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 입방 미터 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위의 용적을 가질 수 있다.
[00192] 특정 양상에서, PSC, 예를 들어 iPSC를 효율적인 분화에 적절한 세포 밀도로 분주한다. 일반적으로, 세포를 약 1,000 내지 약 75,000 세포/cm2, 예를 들어 약 5,000 내지 약 40,000 세포/cm2의 세포 밀도로 분주한다. 6웰 플레이트에서, 세포를 웰당 약 50,000 내지 약 400,000개 세포의 세포 밀도로 분주할 수 있다. 예시적인 방법에서, 세포를 웰당 약 100,000, 약 150,00, 약 200,000, 약 250,000, 약 300,000 또는 약 350,000개의 세포, 예를 들어 웰당 약 200,000개의 세포의 세포 밀도로 분주한다.
[00193] PSC, 예를 들어 iPSC는 일반적으로 하나 이상의 세포 부착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 상에 배양하여 세포 생존력을 유지하면서 세포 부착을 촉진시킨다. 예를 들어, 바람직한 세포 부착 단백질로는 만능 세포 성장을 위한 고형 지지체를 제공하는 수단으로 배양체 표면을 코팅하는데 사용될 수 있는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. “세포외 매트릭스” 라는 용어는 당업계에 주지되어 있다. 이의 성분들로는 하나 이상의 하기의 단백질을 포함한다: 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 테나신, 엔탁틴, 트롬보스폰딘, 엘라스틴, 젤라틴, 콜라겐, 피브릴린, 메로신, 안코린, 콘드로넥틴, 링크 단백질, 뼈 시알로단백질, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 에피넥틴, 히알루로넥틴, 언둘린, 에필리그린 및 칼리닌. 예시적인 방법에서, PSC를 비트로넥틴 또는 피브로넥틴으로 코팅된 배양 플레이트 상에서 성장시킨다. 일부 구현예에서, 세포 부착 단백질은 사람 단백질이다.
[00194] 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질은 자연에서 기원할 수 있어 사람 또는 동물 조직으로부터 정제될 수 있거나, 다르게는, ECM 단백질은 유전자 조작된 재조합 단백질이거나 또는 자연에서 합성될 수 있다. ECM 단백질은 전체 단백질이거나 또는 천연 또는 조작된 펩타이드 단편의 형태일 수 있다. 세포 배양용 매트릭스에서 유용할 수 있는 ECM 단백질의 예로는 라미닌, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 비트로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 피브로넥틴 또는 재조합 피브로넥틴의 합성 제조된 펩타이드 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 조성물은 제노-프리이다. 예를 들어, 사람 세포를 배양하기 위한 제노-프리 매트릭스에서, 사람 기원의 매트릭스 성분이 사용될 수 있으며, 이 경우 사람이 아닌 임의의 동물 성분들은 배제될 수 있다.
[00195] 일부 양상에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 ng/mL 내지 약 1 mg/mL일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 1 μg/mL 내지 약 300 μg/mL이다. 보다 바람직한 구현예에서, 매트릭스 조성물 내의 총 단백질 농도는 약 5 μg/mL 내지 약 200 μg/mL이다.
[00196] 세포는 각각의 특정 세포 집단의 성장을 지원하는데 필요한 영양분으로 배양될 수 있다. 일반적으로 세포는 탄소 공급원, 질소 공급원, 완충액을 포함한 성장 배지에서 배양하여 pH를 유지한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제 물질, 피루브산, 버퍼제 및 무기염을 포함할 수도 있다. 전형적인 증식 배지는 줄기 세포 성장을 향상시키기 위해 다양한 영양분, 예를 들어 비필수 아미노산 및 비타민이 보충된 최소 필수 배지, 예를 들어 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 또는 ESSENTIAL 8™ (E8™) 배지를 포함한다. 최소 필수 배지의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 최소 필수 배지 이글 (MEM) 알파 배지, 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM), RPMI-1640 배지, 199 배지 및 F12 배지를 포함한다. 추가로, 최소 필수 배지는 말, 송아지 또는 소태아 혈청과 같은 첨가물로 보충될 수 있다. 다르게는, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에 있어서, 증식 배지는 본원에서 배양액 중에서 줄기 세포와 같은 미분화 세포를 성장시켜 유지하는데 최적화된 무혈청 제제로 지칭되는 “녹아웃 혈청 대체물”을 포함할 수 있다. KNOCKOUT™ 혈청 대체물은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 미국 특허출원 2002/0076747호에 개시되어 있다. 바람직하게는, PSC를 완전 합성되고 피더 부재 배지 중에서 배양한다.
[00197] 따라서, PSC를 일반적으로 분주 후 완전 합성된 배양 배지 중에서 배양한다. 특정 양상에서, 분주 후 약 18-24시간 후, 배지를 흡인시키고, 신선한 배지, 예를 들어 E8™ 배지를 배양액에 첨가한다. 특정 양상에서, 단일 세포 PSC를 완전 합성된 배양 배지 중에서 분주 후 약 1, 2 또는 3일 동안 배양한다. 바람직하게는, 단일 세포 PSC를 분화 과정을 진행하기 전에 완전 합성된 배양 배지 중에서 약 2일 동안 배양한다.
[00198] 일부 구현예에서, 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물로는 알부민 (예를 들어, 지질이 풍부한 알부민, 알부민 대체물, 예를 들어 재조합 알부민, 식물성 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해산물), 트랜스페린 (또는 다른 철 운반체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이의 균등물을 적절하게 포함하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 예를 들어 국제특허공보 WO 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 보다 편리함을 위해 임의의 임의의 시판되는 물질이 사용될 수 있다. 시판되는 물질로는 KNOCKOUT™ 혈청 대체물 (KSR), 화학적으로 합성된 지질 농축물 (Gibco) 및 GLUTAMAX™ (Gibco)을 포함한다.
[00199] 다른 배양 조건들은 적절하게 정의될 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40°C, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C일 수 있지만, 특별히 이들에 제한되지 않는다. 하나의 구현예에서, 세포를 37°C에서 배양한다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2 내지 5% 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 분압은 적어도, 이하, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20%, 또는 상기 수치에서 추론가능한 임의의 범위일 수 있다.
G. iPSC 또는 분화된 세포의 동결보존
[00200] 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포는 동결보존될 수 있고 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 문헌(PCT 공개 공보 제2012/149484 A2호)를 참조한다. 세포는 기질과 함께 또는 기질없이 동결보존될 수 있다. 여러 구현예에서, 저장 온도는 약 -50°C 내지 약 -60°C, 약 -60°C 내지 약 -70°C, 약 -70°C 내지 약 -80°C, 약 -80°C 내지 약 -90°C, 약 -90°C 내지 약 -100°C 범위이고, 이들의 중첩 범위도 포함한다. 일부 구현예에서, 동결보존된 세포의 저장 (예를 들어, 유지)를 위해 낮은 온도를 사용한다. 여러 구현예에서, 액체 질소 (또는 이와 유사한 다른 액체 냉각제)를 사용하여 세포를 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 6시간 이상 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 약 72시간 저장한다. 여러 구현예에서, 세포를 48시간 내지 약 1주 저장한다. 또 다른 구현예에서, 세포를 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7주, 또는 8주 동안 저장한다. 추가의 구현예에서, 세포를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개월 또는 12개월 동안 저장한다. 더 긴 시간 동안 세포를 저장할 수도 있다. 세포를 별도로 또는 본원에 개시된 임의의 기질과 같은 기질 상에서 동결보존할 수도 있다.
[00201] 일부 구현예에서, 추가의 동결보호제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 동결보호제, 예를 들어 DM80, 혈청 알부민, 예를 들어 사람 또는 소 혈청 알부민을 포함하는 동결보존 용액 중에서 동결보존될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 용액은 약 1 %, 약 1.5%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%의 DMSO를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 용액은 약 1% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 4%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 7%, 약 6% 내지 약 8%, 약 7% 내지 약 9%, 또는 약 8% 내지 약 10%의 디메틸설폭시드 (DMSO) 또는 알부민을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 2.5%의 DMSO를 포함한다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 상기 용액은 10%의 DMSO를 포함한다.
[00202] 세포는 예를 들어, 동결보존을 하는 동안 약 1 °C/분으로 냉각할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 동결보존 온도는 약 -80°C 내지 약 -180°C, 또는 약 -125°C 내지 약 -140°C이다. 일부 구현예에서, 세포는 약 1°C/분으로 냉각시키기 전에 4°C로 냉각된다. 동결보존된 세포의 사용을 위해 해동하기 전에 액체 질소의 증기상으로 해당 동결보존된 세포를 이동시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포가 일단 약 -80°C에 도달하면, 이들을 액체 질소 저장소로 이동시킨다. 동결보존은 제어된-속도의 동결기 (controlled-rate freezer)를 사용하여 수행될 수도 있다. 동결보존된 세포는 예를 들어, 약 25°C 내지 약 40°C의 온도에서, 통상 약 37°C의 온도에서 해동될 수 있다.
III. 가공된 세포주의 용도
[00203] 특정 양상은 다수의 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적에 사용될 수 있는 안정적 전이유전자 발현을 갖는 세포주를 생성하기 위한 방법을 제공한다.
[00204] 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포주는 iPSC 또는 분화된 세포에 현재 공지된 어떠한 방법 및 용도에서라도 사용될 수 있다. 예를 들어, 화합물을 평가하는 방법이 제공될 수 있고, 상기 방법은 세포주상에 화합물의 약리학적 또는 독성학적 성질을 검정하는 단계를 포함한다. 또한 세포 배양에 대한 효과에 대해 화합물을 평가하는 방법이 제공될 수 있고, 상기 방법은: a) 본원에 제공된 상기 세포 배양물을 상기 화합물과 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 세포 배양물에 대한 화합물의 효과를 검정하는 단계를 포함한다.
A. 시험 화합물 스크리닝
[00205] 세포 배양물을 상업적으로 사용하여 이러한 세포의 특성 및 이들의 여러 자손에 영향을 주는 인자 (예를 들어, 용매, 소분자 약물, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드) 또는 환경 조건 (예를 들어, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 화합물, 소분자, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토카인 또는 다른 생물학적 제제일 수 있다.
[00206] 하나의 구현예에서, 방법은 세포 배양물을 시험 제제와 접촉시키는 단계 및 상기 시험 제제가 집단 내에서 세포의 활성 또는 기능을 조절하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 응용에서, 스크리닝 검정은 세포 증식을 조절하거나, 세포 분화를 변경하거나 세포 생존능에 영향을 미치는 제제의 동정을 위해 사용된다. 스크리닝 검정은 시험관내 또는 생체내 수행할 수 있다. 후보 제제를 스크리닝하고 동정하는 방법은 고속처리량의 스크리닝에 적합한 것들을 포함한다. 예를 들어, 세포 배양물은 잠재적 치료학적 분자의 확인을 위해, 배양 접시, 플라스크, 회전병 또는 플레이트 (예를 들어, 하나의 멀티웰 접시 또는 접시, 예를들어, 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536개의 멀티웰 플레이트 또는 접시) 상에 임의로 정해진 위치에 위치시키거나 배치시킬 수 있다. 스크리닝될 수 있는 라이브러리로는, 예를 들어, 소분자 라이브러리, siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질감염 벡터 라이브러리를 포함한다.
[00207] 다른 스크리닝 용도는 망막조직 유지 또는 수선에 대한 약학 화합물의 효과를 시험하는 것에 대한 것이다. 스크리닝은, 해당 화합물이 세포에 대하여 약리학적 효과를 가지도록 고안되었기 때문에, 또는 어딘가 효과를 갖도록 고안된 화합물이 이러한 조직 유형의 세포에 대해 의도하지 않은 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행될 수 있다.
B. 치료요법 및 이식
[00208] 다른 구현예는 질환 또는 장애의 치료를 위해 세포주를 사용할 수도 있다. 또 다른 양상에서, 본원의 개시내용은 가공된 세포를 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여함을 포함하는, 치료를 필요로하는 개체의 치료 방법을 제공한다.
[00209] 치료제 투여를 위한 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위해, 세포를 먼저 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 하나의 양상에서, 세포주는 이들이 생존하여 이들의 생체내 표현형을 유지하는 능력에 대해 평가한다. 조성물을 면역결핍 동물 (예를 들어, 누드 마우스 또는 화학적으로 또는 방사선에 의해 면역결핍된 동물)에 이식한다. 조직들을 성장 기간 이후에 수거하여 만능 줄기 세포 유래의 세포들이 여전히 존재하는지의 여부에 대해 평가한다.
[00210] 본원에서 사용되는 질환 또는 장애는 예를 들어 감염 또는 유전학적 결함으로 인해 발생하며 동정 가능한 증상을 특징으로 하는 유기체 내 병리학적 병태를 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같은 예시적인 질환은 암과 같은 신생물 질환이다. 본원에서 사용되는 신생물 질환은 종양 발생, 성장, 전이 및 진행을 포함하여 암과 관련된 임의의 질환을 지칭한다.
[00211] 본원에서 사용되는 암은 전이성 암, 림프종양, 혈액암을 포함한 임의의 유형의 악성 종양으로 인해 유발되거나 이를 특징으로 하는 질환에 대한 용어이다. 예시적인 암은 백혈병, 림프종, 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 신경교종, 선암, 간암 및 피부암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사람에서 예시적인 암은 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암(예를 들어, 신경교종 종양), 자궁 경부암, 융모막암, 결장 및 직장암, 결합 조직 암, 소화기 암, 자궁 내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암, 상피내 신생물, 콩팥암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암 (예를 들어, 소세포 및 비소세포), 호지킨 및 비호지킨 림프종을 포함한 림프종, 흑색종, 골수종, 신경모세포종, 구강암 (예를 들어, 입술, 혀, 입, 인두), 난소암, 췌장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 직장암, 신장암, 호흡기 암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 비뇨기 암, 기타 암종 및 육종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 개, 고양이 및 기타 반려동물에서 흔히 진단되는 예시적인 암은 림프육종, 골육종, 유선 종양, 비만세포종, 뇌종양, 흑색종, 선암종, 카르시노이드 폐종양, 기관지 종양, 세기관지 선암종, 섬유종, 점액 연골종, 폐육종, 신경육종, 골종, 유두종, 망막 모세포종, 유잉 육종(Ewing’s sarcoma), 윌름 종양(Wilm’s tumor), 버킷 림프종, 미세교종, 신경 모세포종, 파골 세포종, 구강 신생물, 섬유 육종, 골육종 및 횡문근육종, 생식기 편평 세포 암종, 전염성 성병 종양, 고환 종양, 정상피종, 세르톨리 세포 종양(Sertoli cell tumor), 혈관주위세포종, 조직구종, 녹색종 (예를 들어, 과립구 육종), 각막 유두종, 각막 편평 세포 암종, 혈관 육종, 흉막 중피종, 기저세포 종양, 흉선종, 위 종양, 부신암종, 구강 유두종증, 혈관 내피종 및 낭종, 여포 림프종, 장 림프 육종, 섬유 육종 및 폐 편평 세포 암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 흰족제비와 같은 설치류에서 진단된 예시적인 암은 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌장 섬 세포 종양, 위 MALT 림프종 및 위 선암종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 농업용 가축에 영향을 미치는 예시적인 신생물은 백혈병, 혈관주위세포종 및 소 안구 신생물(소의 경우); 포피 섬유육종, 궤양성 편평 세포 암종, 포피 암종, 결합 조직 신생물 및 비만세포종(말의 경우); 간세포 암종(돼지의 경우); 림프종 및 폐선종증(양의 경우); 폐육종, 림프종, 라우스 육종, 세망내피증, 섬유육종, 신모세포종, B세포 림프종 및 림프성 백혈병(조류 종의 경우); 망막모세포종, 간 신생물, 림프육종(림프구성 림프종), 형질세포양 백혈병 및 수영방광육종(어류의 경우), 건락성 림프절염(CLA): 코리네박테리움 가성결핵균에 의해 발생하는 양과 염소의 만성 감염성 전염성 질환, Jaagsiekte에 의해 유발되는 양의 전염성 폐종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00212] 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포주의 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 이들 조성물은 적어도 약 1 x 103개의 세포, 약 1 x 104개의 세포, 약 1 x 105 개의 세포, 약 1 x 106 개의 세포, 약 1 x 107 개의 세포, 약 1 x 108 개의 세포 또는 약 1 x 109 개의 세포를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 분화된 세포를 포함하는 실질적으로 정제된 제제이다. 또한, 스캐폴드, 예를 들어, 중합체 담체 및/또는 세포외 매트릭스, 및 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 유효량의 세포를 포함하는 조성물도 제공된다. 매트릭스 물질은 일반적으로 생리학적으로 허용될 수 있고, 생체내 적용에 사용하기 위해 적합하다. 예를 들어, 상기 생리학적으로 허용되는 물질은 흡수성 및/또는 비흡수성 고체 매트릭스 물질, 예를 들어 소장 점막하조직 (SIS), 가교성 또는 비가교성 알기네이트, 하이드로콜로이드, 발포체, 콜라겐 겔, 콜라겐 스펀지, 폴리글리콜산 (PGA) 메쉬, 플리스 및 생체접착제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[00213] 적절한 중합체 캐리어로는 합성 또는 천연 중합체뿐만 아니라 중합체 용액으로 형성된 다공성 메쉬 또는 스펀지도 포함한다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 중합체 메쉬 또는 스펀지, 또는 중합체 하이드로겔이다. 사용될 수 있는 천연 중합체로는 단백질, 예를 들어 콜라겐, 알부민 및 피브린; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 알기네이트 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체로는 생분해성 중합체와 비생분해성 중합체를 모두 포함한다. 예를 들어, 생분해성 중합체로는 히드록시산, 예를 들어 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA) 및 폴리락트산-폴리글리콜산 (PGLA)의 중합체, 폴리오르쏘에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠 및 이들의 조합을 포함한다. 비생분해성 중합체로는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트 및 폴리비닐 알콜을 포함한다.
[00214] 연성인 이온성 또는 공유결합성 하이드로겔을 형성할 수 있는 중합체가 사용될 수 있다. 하이드로겔은 유기 중합체 (천연 또는 합성)가 공유결합, 이온결합 또는 수소결합을 통해 가교결합되어 물분자를 가둬 겔을 형성하는 3차원 개방형 격자 구조를 생성하는 경우에 형성되는 물질이다. 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 물질의 예로는 폴리사카라이드, 예를 들어 이온 가교결합성인 알기네이트, 폴리포스파진 및 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체, 예를 들어 각각 온도 또는 H에 의해 가교결합되는 PLURON1CS™ 또는 TETRON1CS™, 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체를 포함한다. 기타 물질로는 피브린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐과 같은 중합체를 포함한다.
C. 상업적, 치료학적 및 연구 목적을 위한 유통
[00215] 일부 구현예에서, 제조, 유통 또는 사용시 어느 때라도 존재하는 세포 세트 또는 조합을 포함하는 시약 시스템이 제공된다. 상기 배양 세트는 흔히 동일한 게놈을 공유하는, 미분화 만능 줄기 세포 또는 다른 분화 세포 유형과 조합하여 본원에 기재된 세포 집단의 임의의 조합을 포함한다. 각 세포 유형은 동일한 실체 또는 사업상 관계를 공유하는 서로 다른 실체들의 제어 하에, 동시에 또는 다른 시점에, 동일한 시설 내에서 또는 서로 다른 장소에서, 함께 또는 별도의 컨테이너로 팩키징될 수 있다.
[00216] 약제학적 조성물은 임의로는 조직의 질환 또는 손상을 개선하기 위한 세포 기능의 재구성과 같은 요구되는 목적에 대한 서면 지침서를 구비한 적합한 컨테이너에 팩키징될 수 있다.
IV. 실시예
[00217] 하기의 실시예를 들어 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다. 당업계의 숙련자라면, 하기의 실시예에 기술된 기법들이 본 발명을 잘 수행하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기법들을 대표하는 것이기 때문에, 발명의 수행에 대한 바람직한 양태를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 그러나, 당업계의 숙련자라면, 본 명세서의 내용을 고려하여, 개시된 구체적인 구현예에 있어서 본 발명의 개념과 범위를 벗어나지 않으면서 여러가지 변화를 주어도 그와 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다.
실시예 1 - 유전자 사일런싱을 방지하기 위한 코돈 최적화
[00218] 메틸화가 전이유전자 사일런싱의 원인인지를 시험하기 위해, 사일런싱되는 것으로 공지되어 있거나(예를 들어, GFP) 사일런싱되는 것으로 추측되는(예를 들어, PuroR 및 NeoR) 유전자의 암호화 영역에서 모든 CpG 모티프를 제거하였다. 육안으로 쉽게 검사할 수 있기 때문에, 상기 개념은 WT AcGFP1 및 CpG 유리된 AcGFP1을 비교하여 엄격하게 시험되었다. 서열번호 13과 서열번호 14 사이의 CpG 모티프를 제거한 후 아미노산 서열에는 변화가 없었다.
AcGFP1 DNA 서열 (서열번호 13) : atggtgagcaagggCGcCGagctgttcacCGgcatCGtgcccatcctgatCGagctgaatggCGatgtgaatggccacaagttcagCGtgagCGgCGagggCGagggCGatgccacctaCGgcaagctgaccctgaagttcatctgcaccacCGgcaagctgcctgtgccctggcccaccctggtgaccaccctgagctaCGgCGtgcagtgcttctcaCGctacccCGatcacatgaagcagcaCGacttcttcaagagCGccatgcctgagggctacatccaggagCGcaccatcttcttCGaggatgaCGgcaactacaagtCGCGCGcCGaggtgaagttCGagggCGataccctggtgaatCGcatCGagctgacCGgcacCGatttcaaggaggatggcaacatcctgggcaataagatggagtacaactacaaCGcccacaatgtgtacatcatgacCGacaaggccaagaatggcatcaaggtgaacttcaagatcCGccacaacatCGaggatggcagCGtgcagctggcCGaccactaccagcagaatacccccatCGgCGatggccctgtgctgctgccCGataaccactacctgtccacccagagCGccctgtccaaggaccccaaCGagaagCGCGatcacatgatctacttCGgcttCGtgacCGcCGcCGccatcacccaCGgcatggatgagctgtacaagTAA
CpG-유리된 AcGFP1 DNA 서열 (서열번호14) : ATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATCGTGCCCATCCTGATCGAGCTGAATGGCGATGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCTGTGCCCTGGCCCACCCTGGTGACCACCCTGAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCTCACGCTACCCCGATCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGCTACATCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCGAGGATGACGGCAACTACAAGTCGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATCGCATCGAGCTGACCGGCACCGATTTCAAGGAGGATGGCAACATCCTGGGCAATAAGATGGAGTACAACTACAACGCCCACAATGTGTACATCATGACCGACAAGGCCAAGAATGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGACCACTACCAGCAGAATACCCCCATCGGCGATGGCCCTGTGCTGCTGCCCGATAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGCCCTGTCCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGATCTACTTCGGCTTCGTGACCGCCGCCGCCATCACCCACGGCATGGATGAGCTGTACAAG
[00219] 관심 대상의 유전자의 DNA 서열을 세심하게 변형시켜 1) 드물지 않고, 2) 모노뉴클레오타이드 스트레치를 생성하지 않고, 3) WT 버전의 유전자와 유사한 % GC 함량을 유지한 코돈으로 대체된 모든 CG 모티프를 제거하였다. 예를 들어, CpG-유리된 AcGFP1의 경우, AcGFP1의 WT 버전(서열번호 13)은 59% GC 함량을 갖고 새로운 CpG-유리된 AcGFP1(서열번호 14)은 52% GC 함량을 갖는다.
[00220] EEF1A1 프로모터는 PPP1R12C 유전자좌의 iPSC에서 AcGFP1의 발현에 사용하였다. WT AcGFP1과 비교하여 CpG-유리된 AcGFP1을 시험한 결과, 단백질 암호화 서열에서 CpG를 제거함으로써 유전자 발현의 사일런싱이 극복된 것으로 밝혀졌다(도 3).
[00221] 그러나 5개월 후에는 AcGFP1에서 CpG가 제거되었음에도 불구하고 GFP 발현이 없는 작은 퍼센트(3%) 세포가 검출되었다. 상기 집단을 조사하기 위해 GFP 발현이 없는 단일 세포 분류에 의해 클론을 단리하였다. 세포는 염색질 구조를 제거하고 탈메틸화를 유도할 수 있는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제인 나트륨 부티레이트(NaBut)로 처리하였다. NaBut 처리로 인해 GFP 발현이 용량 의존적으로 재활성화되는 것으로 관찰되었다(도 5).
[00222] CpG-유리된 AcGFP1 iPSC는 간세포 또는 뉴런으로 분화되었고, 높은 퍼센트의 GFP 양성 분화된 세포가 관찰되었다(도 6).
[00223] 결과를 검증하기 위해 pUC57-KanR(m)에서 PuroRv1(Invivogen 아미노산 서열을 기반으로 합성됨)의 코돈 최적화를 수행하였다. PuroR의 CpG 유리된 서열(서열번호 15)은 하기에 나타낸다.
플라스미드 1346 CpG-유리된 PuroR:
ATGACTGAATACAAACCAACTGTTAGACTGGCAACTAGAGATGATGTTCCAAGAGCAGTTAGAACCCTGGCTGCTGCATTTGCTGACTACCCTGCAACCAGACACACTGTGGACCCAGACAGACACATTGAAAGAGTGACTGAACTGCAGGAGCTGTTCCTGACCAGAGTGGGCCTGGACATTGGCAAAGTGTGGGTGGCAGATGATGGTGCTGCTGTGGCAGTGTGGACCACCCCTGAATCTGTTGAAGCTGGTGCAGTGTTTGCTGAGATTGGCCCAAGAATGGCAGAACTGTCTGGCAGCAGACTGGCAGCACAACAGCAGATGGAAGGTCTGCTGGCACCACACAGACCAAAAGAACCTGCTTGGTTCCTGGCAACTGTGGGTGTGAGCCCTGACCACCAGGGTAAGGGCCTGGGCTCTGCAGTGGTGCTGCCTGGTGTGGAAGCAGCTGAAAGAGCAGGTGTGCCTGCTTTCCTGGAGACCTCAGCTCCAAGAAACCTGCCTTTCTATGAAAGACTGGGCTTCACTGTGACTGCTGATGTGGAAGTGCCAGAAGGCCCAAGAACTTGGTGCATGACTAGAAAACCAGGTGCTTGATAATGA (서열번호 15)
플라스미드 1347 및 1363에서 CpG-유리된 PuroRv2:
ATGACTGAATACAAACCAACTGTTAGACTGGCAACTAGAGATGATGTTCCAAGAGCAGTTAGAACCCTGGCTGCTGCATTTGCTGACTACCCTGCAACCAGACACACTGTGGACCCAGACAGACACATTGAAAGAGTGACTGAACTGCAGGAGCTGTTCCTGACCAGAGTGGGCCTGGACATTGGCAAAGTGTGGGTGGCAGATGATGGTGCTGCTGTGGCAGTGTGGACCACCCCTGAATCTGTTGAAGCTGGTGCAGTGTTTGCTGAGATTGGCCCAAGAATGGCAGAACTGTCTGGCAGCAGACTGGCAGCACAACAGCAGATGGAAGGTCTGCTGGCACCACACAGACCAAAAGAACCTGCTTGGTTCCTGGCAACTGTGGGTGTGAGCCCTGACCACCAGGGTAAGGGCCTGGGCTCTGCAGTGGTGCTGCCTGGTGTGGAAGCAGCTGAAAGAGCAGGTGTGCCTGCTTTCCTGGAGACCTCAGCTCCAAGAAACCTGCCTTTCTATGAAAGACTGGGCTTCACTGTGACTGCTGATGTGGAATGCCCAAAGGACAGAGCAACTTGGTGCATGACTAGAAAACCAGGTGCTTGATAATGA (서열번호 16)
[00224] CpG-유리된 PuroR 카세트는 전기천공에 의해 iPSC로 도입하였다. CpG-유리된 PuroRv1 및 PuroRv2가 있는 세포는 약물 내성을 부여할 수 있는 것으로 관찰되었다.
[00225] 표 2. WT PuroR 대 CpG-유리된 PuroR의 약물 내성.
iPSC 세포주 2.038을 항시성 프로모터에 의해 구동되는 푸로마이신 유전자(WT 또는 CpG-유리된)를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. iPSC의 성장은 mTeSR1 단독, mTeSR1과 0.1ug/mL 푸로마이신 또는 mTeSR1과 0.3ug/mL 푸로마이신을 공급했을 때 0(-) 내지 3(+++) 스케일로 스코어링되었다. 형질감염되지 않은 세포주(2.038)를 대조군 푸로마이신 처리 대조군으로 사용하였다.
[00226] 표 3. WT PuroR 대 CpG-유리된 PuroR.
[00227] 표 4. 전기천공 후 4일 및 선택 3일째에 WT PuroR과 CpG-유리된 PuroR의 생존 가능성.
iPSC 세포주 2.038을 항시성 프로모터에 의해 구동되는 푸로마이신 유전자(WT 또는 CpG-유리된)를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. iPSC의 성장은 mTeSR1 단독, mTeSR1과 0.1ug/mL 푸로마이신 또는 mTeSR1과 0.3ug/mL 푸로마이신을 공급했을 때 0(-) 내지 3(+++) 스케일로 스코어링되었다. 형질감염되지 않은 세포주(2.038)를 대조군 푸로마이신 처리 대조군으로 사용하였다.
[00228] 표 5. AAVS1 절단 부위에서 오프 표적 통합 또는 돌연변이 없이 올바른 게놈 가공의 검증을 위해 스크리닝된 클론. 백본 PCR을 수행하여 플라스미드의 오프 표적 통합이 없음을 확인하였다.
[00229] 표 6. 세포를 가공하기 위해 사용되는 플라스미드.
[00230] 이들 결과는 CpG가 iPSC 세포주의 전이유전자 사일런싱에 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 추가로, 이들 결과는 전반적인 메틸화 또는 기타 후생적 조절 장애가 분화 결함이 있는 iPSC에서 중요한 역할을 수행함을 시사한다. 따라서 일부 또는 모든 CpG 모티프를 제거하는 본원의 최적화 방법은 전이유전자 사일런싱을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 2 - CpG 최적화된 iPSC의 분화
[00231] CpG-유리된 AcGFP1 및 mRFP1로 형질감염된 iPSC는 배양 중 많은 계대 동안 항시성으로 형광색소의 발현을 유지하였다. 다음 단계는 iPSC를 전구 세포로 분화하는 동안 형광색소의 유지뿐 아니라 가공된 iPSC로부터의 최종 단계 계통을 확인하는 것이었다. CpG-유리된 플라스미드로 형질감염된 가공된 iPSC는 내피 세포, 조혈 세포, 대식세포 및 미세아교세포의 순수한 집단을 성공적으로 생성한 것으로 나타났다.
[00232] 9650 GFP iPSC로부터 iPSC 유래된 내피 세포 생성: 미분화된 9650-GFP는 E8의 존재 하에 MATRIGEL™ 또는 비트로넥틴(Vitronectin)상에 유지되고 적어도 5-10 계대 동안 저산소증에 적응된 iPSC였다. 내피 분화를 개시하기 위해 서브컨플루언트 iPSC를 수거하고 저산소 상태에서 5uM 블레비스타틴 또는 1uM H1152가 보충된 무혈청 합성(SFD) 배지(표 5) 존재 하에 순수 코트 아민 배양 접시상에 25만 세포/웰의 밀도로 분주하였다. 분주 24시간 후, 세포를 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF-b가 보충된, SFDEB#1 배지로서 공지된 SFD 배지에 넣었다(표 7). 4-6일 동안 48시간마다 세포를 공급하여 혈액내피 전구세포를 생성하였다. 이들 전구 세포는 H1152를 갖는 SFD 기반 내피 배지(표 7)의 존재 하에 내피 분화를 개시하기 위해 정상 산소 조건 하에서 10k/cm2의 밀도로 조직 배양 처리된 플라스틱 표면에 동결보존시키거나 재분주될 수 있다.
[00233] 예시적인 방법에서, 동결보존된 6일째의 혈액 내피 세포 또는 살아있는 배양물을 1uM H1152 및 정상 산소 조건을 갖는 SFD 기반 내피 배지의 존재 하에 조직 배양 처리된 플라스틱 표면상에 10k/cm2로 분주하였다. 세포에 분주 후 24시간째에 새로운 내피 배지를 공급하고, 이들이 컨플루언시에 도달할 때까지 48시간마다 공급하였다. 세포가 컨플루언시에 도달하는 데는 배양에서 5-6일이 소요되었다. 세포를 TrypLE Select를 사용하여 수거하고, 표면 내피 마커 CD31, CD105 및 CD144에 대해 염색하고, 내피 배지를 사용하여 10 k/cm2로 조직 배양 처리된 플라스틱상에 재분주하고, 정상 산소 배양기 조건에 위치시켜 순수한 내피 세포 집단을 확장 및 증식시켰다.
[00234] 표 7. iPSC 유래된 내피 세포를 생성하기 위한 예시적인 배지 제형.
[00235] GFP 가공된 9650 및 RFP 가공된 8717 iPSC로부터 조혈 전구 세포(HPC)의 생성: GFP 가공된 9650 및 RFP 가공된 8717 iPSC를 E8의 존재 하에 매트리겔(Matrigel) 또는 비트로넥틴상에서 유지하였고 적어도 5-10 계대 동안 저산소증에 적응시켰다. 세포를 서브컨플루언트 iPSC로부터 분리하여 5 uM 블레비스타틴 또는 1 μM H1152가 보충된 무혈청 합성 (SFD) 배지의 존재하에 스피너 플라스크에 25만 내지 50만 세포/ml의 밀도로 분주하였다. 분주 후 24시간에 50ng/ml의 BMP4, VEGF 및 FGF2가 보충된 SFD 배지로 교체하였다. 분화 과정 5일째에 세포를 50ng/ml의 Flt-3 리간드, SCF, TP0, IL3 및 IL6을 함유하는 배지에 10 U/ml의 헤파린과 함께 위치시켰다. 세포는 분화 과정 전반에 걸쳐 48시간 마다 공급하였다. 전체 공정은 저산소 조건하에서 수행하였다. HPC의 순도는 CD4 및 CD34 발현의 정량화에 의해 결정되었다. 상기 공정 개요는 도 14에 도해한다. HPC는 CD34 항체를 사용한 자기 분류에 의해 추가로 정제하였다.
[00236] HPC 순도는 12일에 개시하여 평가하였고, 도 14a에 명시된 바와 같이 CD34 발현이 >20%에 도달할때까지 계속하였다. 분화하는 HPC 배양물은 GFP의 발현을 유지하였다(도 14b). 세포주 9650의 CD34+ MACS 정제는 15일째에 수행하였다. RFP 가공된 8717은 HPC를 생성하는데 보다 낮은 효율을 나타냈다. 그럼에도 불구하고, 배양물은 분화 과정 전반에 걸쳐 RFP의 발현을 유지하였다. 17일째에 배양물의 절반을 미세아교세포 분화를 위해 소화 및 분주하고 나머지 절반은 대식세포 분화를 위한 응집체로서 유지하였다. 세포주 둘다에 대한 공정 효율은 도 15에 나타낼 수 있다.
[00237] 표 8. iPSC로부터 HPC를 생성하기 위한 무혈청 합성 배지(SFD), EB#1 및 MK#5의 예시적 제형.
[00238] 미세아교세포의 생성 정제된 HPC를 정상산소 조건 하에서 미세아교세포 분화 배지(MDM)에 넣었다. 배양물은 48시간마다 2X MDM을 사용하여 공급되었고, 분화 공정은 23일 후에 종료되었다. 상기 공정은 도 16에 요약되어 있다. 미세아교세포 분화 과정 전반에 걸쳐 세포의 형태와 형광을 도 17a 및 17b에서 관찰될 수 있다. HPC로부터 미세아교세포까지의 과정의 효율성은 도 18에 나타낼 수 있다.
[00239] 최종 단계의 미세아교세포 배양물은 순도에 대해 평가하였다. 유동 세포측정법에 의한 CD45, CD33, TREM2 및 CD11b의 세포 표면 발현뿐만 아니라 PU.1, IBA, P2RY12, TREM2, CX3CR1 및 TMEM119의 세포내 발현(도 19a 및 19b).
[00240] 표 9. 미세아교세포 분화 배지.
[00241] 표 10. 미세아교세포 분화 배지 2X.
[00242] 대식세포의 생성: 대식세포 분화는 HPC 분화 17일째에 세포주 8717-RFP로 개시되었다. HPC로부터 대식세포 공정의 개요는 도 20에 요약되어 있다. 상기 분화 부분에 대한 배지 편집은 표 11에 기재되어 있다. 20일째에 응집체를 분해하여 CMP 배지에 분주하였다. 상기 시점에서 배양은 정상산소 환경으로 변화되었다. 1주 후, 배양액을 대식세포 배지로 변화시키고, 그 후 4일마다 2X 대식세포 배지를 공급하였다. CD68 순도는 44일 및 51일에 평가하였고, 도 21에 나타낸다. 세포를 수거하고 52일째에 동결보존하였다. 세포의 형태와 형광은 도 22에 나타낼 수 있다. HPC에서 대식세포까지의 과정의 효율은 도 23에 기재되어 있다. iPSC로부터 HPC, 미세아교세포 및 대식세포까지 유동 세포측정법으로 측정한 형광 강도를 도 24에 나타낸다.
[00243] 표 11. 배지 제형.
[00244] 8717-RFP 및 9650-GFP 가공된 iPSC로부터 신경 전구체 넬(NPC)의 생성: 신경 전구 세포(NPC)는 뉴런과 신경교를 생성하는 능력을 갖는 자가 재생 전구 세포이다(문헌참조: Breunig et al., 2011). 1차 신경 세포 및 iPSC로부터 NPC를 생성하기 위한 다양한 효율성을 갖는 확립된 프로토콜이 많이 있다(문헌참조: Shi et al., 2012a, Shi et al., 2012b). 최근 프로토콜의 대부분은 SMAD 신호 전달 경로의 억제에 의존한다. 본원의 방법은 이중 SMAD 억제 경로를 사용하지 않고 외배엽을 향한 iPSC의 자발적인 전환(drift)을 활용하여 상이한 iPSC 세포주에 걸쳐 NPC를 생성하는 간단한 프로토콜을 기재한다. 이중 SMAD 억제를 사용하지 않고 iPSC로부터의 신경 전구 세포(NPC)를 생성하는 방법에 대한 개략적인 기재. 관련된 다양한 단계와 사용된 배지의 조성이 도 25에 기재되어 있다. 간략하게, 에피좀 재프로그래밍된 iPSC 세포주인 8717-RFP 및 9650-GFP를 매트리겔/라미닌/비트로넥틴 코팅 플레이트 및 E8 배지상에서 유지하였다. iPSC는 NPC를 생성하기 위한 분화가 개시되기 전에 저산소 조건하에 유지되었다. 신경 전구체 분화를 개시하기 위해 iPSC를 수거하고 락(rock) 억제제의 존재하에 E8 배지를 사용하여 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트상에 15K/cm2로 씨딩하였다. 세포를 락 억제제의 부재하에 다음 48시간 동안 새로운 E8 배지에 놓았다. 다음 단계는 정상 산소 조건하에서 배지를 매일 변경하면서 72시간 동안 3 μM CHIR이 보충된 DMEMF12 배지에 iPSC 배양물을 배치함을 포함하는 사전 컨디셔닝 단계를 포함하였다. 세포는 사전 컨디셔닝 단계의 종료시 수거하였고, 매트리겔, 라미닌 또는 비트로넥틴 플레이트상에서 30K/cm2의 2D 포맷으로 재분주하거나 락 억제제의 존재하에 ml 당 30만 세포의 밀도로 초저 접착(ULA)(Ultra Low Attachment) 플레이트 또는 스피너 플라스크를 사용하여 3D 응집체를 생성하였다. 정상 산소 조건 하에서 다음 8일 동안 N2가 보충된 E6 배지를 격일로 배양물에 공급하였다. 분화 과정 전반에 걸쳐 GFP 및 RFP 형광의 유지는 도 26에 포착된다. 분화 14일째에 배양물을 수거하고 TrypLE를 사용하여 개별화하였다. 세포 표면 염색에 의해 SSEA4, CD56, CD15의 존재에 대해 세포를 염색하였다. NPC의 순도의 정량은 도 27에 도시된다. CD56은 상기 방법에 의해 유래된 NPC에 대한 마커로 사용되었다. 세포를 CS10을 사용하여 동결보존하였고, 이들은 해동 후 순도와 증식 가능성을 유지하였다.
[00245] 신경 전구 세포로부터 GABA성 뉴런의 생성: NPC를 해동하고 세포를 도 28에 요약된 분화 경로에 배치함으로써 NPC의 효능을 시험하였다. 간략하게, NPC를 다운스트림 분화 프로토콜에 배치하여 GABA성 뉴런을 생성하였다. NPC를 해동하고 N2 및 NEAA가 보충된 DMEM/F12에 10μM 브레비스타틴의 존재하에 24시간 동안 0.3e6/mL로 씨딩하여 응집체를 형성하였다. 배양물에는 N2 및 NEAA가 보충된 DMEM/F12, 소닉 헤지호그 신호전달 분자(SHH)(Sonic Hedgehog Signaling Molecule) 및 푸르모파민(Purmorphamine)이 각각 100ng/mL 및 1.5μM로 10일 동안 매일 완전한 배지 교환이 제공되었다. 다음 48시간 동안 배양물에 N2, NEAA 및 5μM DAPT가 보충된 DMEM/F12를 공급한 후 24시간 동안 DMEM/F12, N2, NEAA 및 10μM 블레비스타틴을 사용하여 PLO-라미닌 코팅된 플레이트에 200,000/cm2로 분주하였다. 배양물에는 다음 날마다 DMEM/F12, N2, NEAA 및 5 μM DAPT를 공급하고 분주 후 5일에 수거하였다. GABA 뉴런의 새로운 배양물에서 형광의 보유는 도 29에 도시되어 있다. iPSC 단계부터 18일차 GABA 뉴런 분화까지 GFP 및 RFP 강도의 정량화는 도 30에 포착되어 있다. 최종적으로, 네스틴 및 β-튜불린 3 순도의 정량화에 의한 최종 단계 GABA 뉴런의 순도는 도 31에 도시되어 있다. 이들 세포 분화는 CpG 최적화된 iPSC가 상기 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 세포 유형으로 분화될 수 있음을 보여주었다.
실시예 3 - 안정적 발현을 위한 프로모터
[00246] 시간과 분화 후 iPSC 세포주에서 안정적인 전이유전자 발현을 달성하는 것은 어려운 일이었다. 많은 프로모터는 사일런싱 또는 가변 발현을 나타내고, 이전 연구에서는 PGK 및 EEF1A1과 같은 프로모터에 대해 이를 보여주었다. iPSC 및 분화된 세포 유형 둘다에서 안정적인 발현을 제공하는 데 사용할 수 있는 프로모터 또는 태그 가능 유전자좌를 확인하기 위해 다음 연구를 수행하였다. DNA 메틸화가 크게 변화하고 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우는 종종 분화 과정 중에 발생함에 따라서 최상의 프로모터는 분열 세포와 세포 분열이 최소인 정지 세포(예를 들어, 성숙하고 완전히 분화된 심근세포) 둘다에서 활성일 필요가 있다.
[00247] 클로닝된 프로모터: 하기의 프로모터는 모든 세포 유형에서 항시성 발현을 위해 가능한 후보로 동정되었다. 일부는 기존의 플라스미드 (CAG, PGK, UBC-버전1, EEF1A1, ACTB)로부터 클로닝되었다. iPSC와 분화된 세포 둘다에서 안정적인 발현을 제공하는 프로모터를 동정하기 위한 목적으로 다른 영역이 새롭게 생성된다(게놈 DNA의 PCR 또는 합성에 의해). 새로운 프로모터는 RPS19, UBA52, HSP90AB1, UBC(버전 2)의 확대 영역, UBB, RPSA, NACA 및 COX8A를 포함한다. 루시퍼라제 리포터 유전자를 구동시킬 때 프로모터 강도를 비교할 수 있도록 서열을 pGL3 플라스미드 벡터(MluI와 NcoI 제한 부위 사이의 SV40 프로모터 대체)에 클로닝하였다.
[00248] 표 12: 프로모터 서열
[00249] 일시적 형질감염 동안에 루시퍼라제 발현: 발현 강도를 결정하기 위해 프로모터-pGL3 플라스미드를 iPSC로의 일시적인 형질감염을 수행하였다. 96wp 포맷을 사용하여 50uL의 E8 배지 + 10uM 블레비스타틴을 각 웰에 추가하였다. 각 플라스미드는 16.5uL의 다음 시약 제제를 첨가하여 3회 분석되었다. iPSC 세포주 01279.107의 6wp 중 하나의 웰을 아쿠타제를 사용하여 수거하고, 3.5mL E8 배지 + 10uM 블레비스타틴에 재현탁시키고, 50uL를 각 웰에 첨가하였다. 1일 후에 세포를 이중-루시퍼라제 리포터 검정 시스템(Promega)을 사용하여 검정하였다.
[00250] 표 13: 시약 조성물.
[00251] 정규화된 루시퍼라제 (반딧불이/레닐라 비율, EEF1A1 = 100%로 정규화됨)를 하기에 나타낸다(HSP90AB1del400 프로모터 및 HSP90AB1 프로모터는 EEF1A1의 약 66% 및 75%의 발현을 가졌다). PGK 프로모터 수준 이상의 발현 값이 요구됨에 따라서 RPS19, UBA52, HSP90AB1 및 UBC가 추가 연구를 위해 선택되었다.
[00252] AAVS1 안전한 하버 유전자좌에 통합된 ZsGreen 작제물: 염색체 관련하여 후보 프로모터에 의해 구동되는 보다 장기 발현을 조사하기 위해 이들을 ZsGreen 형광 단백질을 제어하는 플라스미드에 클로닝하였고, 사람 iPSC의 염색체 19상의 AAVS1 안전한 하버 유전자좌에 표적화하였다(플라스미드 디자인은 일례로서 CAG 프로모터를 사용하는 것을 하기에 나타낸다). CRISPR 매개된 유전자 편집을 통해 플라스미드를 iPSC 세포주 01279.107에 통합하고, 푸로마이신 선택을 적용하고, 내성 콜로니를 골라내어 PCR로 유전자형을 분석하였다. 올바르게 표적화된 이형접합 클론을 확장시켰다.
[00253] 표 14: 생성된 클론.
[00254] 항시성 발현을 생성하기 위해 태그하기 위해 적합한 게놈 유전자좌: 안전한 하버로부터의 프로모터 구동된 발현 외에도 대부분의 세포 유형에서 발현되는 특정 유전자에 리포터 유전자를 태그하여 항시성 발현을 제공할 수 있다. HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 및 MYL6 유전자는 평가를 위해 선택되었고, TALEN 매개된 유전자 편집을 통해 ZsGreen 및 F2A 절단 서열로 태그하였다. 올바르게 표적화된 이형접합 클론을 확장시켰다.
[00255] 표 15: iPSC 클론 및 유전자좌.
[00256] iPSC에서 ZsGreen 발현: ZsGreen 형광 단백질을 발현하는 가공된 iPSC 세포주는 최대 7개월 동안 배양액(E8 배지/비트로넥틴 코팅된 플레이트)에 유지하고 Accuri C6 기구(BD)의 유동 세포측정을 사용하여 녹색 발현을 주기적으로 확인하였다. 8월 시점에 형광이 저하된 많은 세포를 보여주는, RPS19 프로모터 클론(5363) 중 하나를 제외하고 대부분의 클론은 시간 경과에 따라 일관된 유동 프로필을 유지하였다.
[00257] 분화: 분화 후 발현의 안정성을 결정하기 위해, 가공된 세포주에 분화 프로토콜을 적용하여 이들이 뉴런 또는 심장 세포 유형으로 진행되도록 하였다.
[00258] 표 16: 뉴런 프로토콜.
[00259] 분화 21일째에, 모든 세포는 가시적 뉴런 표현형을 가졌다. 유동 세포측정은 CAG, UBC(v1), HSP90AB1del400 프로모터에 대한 형광이 감소한 많은 세포를 보여주었다. UBCv2, UBA52, RPS19 프로모터는 태그된 유전자 HSP90AB1, CTNNB1, MYL6와 마찬가지로 단단하고 안정적인 발현을 보여주었다.
[00260] 표 17: 심장 프로토콜.
[00261] 분화 21일째에 CAG, UBC(v1), RPS19 및 HSP90AB1del400 프로모터 세포주는 다양한 양의 발현 사일런싱을 보여주었다. UBC(v2) 및 UBA52 프로모터는 태그된 유전자 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, 및 MYL6와 마찬가지로 단단하고 안정적인 발현을 보여주었다.
[00262] 새롭게 생성된 프로모터 영역 UBCv2, UBA52, RPS19 및 HSP90AB1del400은 배양에서 4개월 동안 안정적인 iPSC 발현을 제공하였고, RPS19만 상기 시점에서 일부 사일런싱을 보이면서 7개월까지 나타났다. 유전자좌 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 및 MYL6은 태그된 ZsGreen 리포터의 안정적 발현을 제공하는 것으로 나타났다. UBCv2 및 UBA52 리포터는 두 가지 서로 다른 분화 프로토콜과 HSP90AB1, CTNNB1 및 MYL6 유전자에서 구동되는 발현 하에서 안정적인 것으로 나타났다.
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[00263] 본원에 기재되고 청구된 모든 방법은 본원 개시내용에 기초하여 과도한 실험 없이 만들어질 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 당업계의 개념, 의미 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본원에 기술된 방법들, 상기 방법의 단계들 또는 상기 방법 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당업계의 숙련자들에게는 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 제제의 경우 이들을 사용하여도 동일하거나 유사한 결과가 달성된다면 본원에 기술된 제제를 대체할 수 있음도 명백할 것이다. 당업계의 숙련자들에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 의미, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
참고문헌
하기의 참고문헌들은, 본원에 기술된 내용에 대하여 예시적인 절차이거나 이를 보충하는 기타 상세한 설명을 제공하는 정도로, 본원에 참고로서 상세하게 포함된다.
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240 tctgttgaag ctggtgcagt gtttgctgag attggcccaa gaatggcaga actgtctggc 300 agcagactgg cagcacaaca gcagatggaa ggtctgctgg caccacacag accaaaagaa 360 cctgcttggt tcctggcaac tgtgggtgtg agccctgacc accagggtaa gggcctgggc 420 tctgcagtgg tgctgcctgg tgtggaagca gctgaaagag caggtgtgcc tgctttcctg 480 gagacctcag ctccaagaaa cctgcctttc tatgaaagac tgggcttcac tgtgactgct 540 gatgtggaat gcccaaagga cagagcaact tggtgcatga ctagaaaacc aggtgcttga 600 taatga 606 <210> 17 <211> 1977 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic promotor sequence <400> 17 aaatcctgag tcccgcttga caccttttgt caggcaccac cacctttctg ggcgaatgcg 60 gtagtaccgt ctgctctccc tgctgctgtc ctgaaatcca ttcaggcaca gcggccgaga 120 gctttataat aaccgattcc aggtgttagg tgctttccca gccccgactc ctgcgtcctg 180 gacccgcagt cctctgctta atacctttgc tttattagaa aacattctcc tctactccgt 240 tcagctattc gctgagggcc cgccaaccgc cagcggttgt cagtggccta gaggcagcgg 300 acgcaaacac ggggagaggt gcaatcgtct caagtgactc ggcgggcggg gcccacaacc 360 ggaagcgggt gggcgacctt cacccacgtg cgctgcggct tcgttcgcca gcatccaaga 420 tggcggcagg gcggggccca aggcgcggcg cgaattgtga cgcaggcgtc cggcgtgctc 480 cgtgcgcaag cgctttcggc ggcgattagg tggtttccgg ttccgctatc ttctttttct 540 tcagcgaggc ggccgagctg gttggtggcg gcggtcgtgc gggttcgcgc cgggccgaga 600 gcgggttggg ggctgcggga ggctgcaggg gcctgggcgg cagaagaggc ggccctgagc 660 tggctcatgc gggccagtct cggcagggtg gctgggcagg gctcgcgagg ccacggctcg 720 gagcccagac cggggcccag gaggcgagcg ccgttttgga gaggagcctg cctgctctgc 780 ctgccagcgt gaccccacga ggcctcgggc gggaagaggt cctcggggca gatccgagtt 840 aatgagagag gggtattgag cgtgtagcgt taactctgcc agtcactgcg tcagtcgctt 900 tggaaatact aaatttctcg agctgagtct tcatacctgg ctccattact acgtctgtaa 960 ggaggagctg gtggtagtgt ctgcttttta gacttttctt tagactattt gtattttttt 1020 cagatggagt cttgctctgt cgcctaagct ggagttcagt ggtgcggtct cggctcactg 1080 caatctccac ctcccgggct cgagcgattc ttctgcctca gcctcccgag tagctgggat 1140 tataggcgcc tgccaccacg cccagttgat ttttgtagtt ttagtagaga cggagtttca 1200 ccatgttagc caggctcatc ttgaactctt gacctcaaat 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Claims (102)

  1. 적어도 하나의 전이유전자를 발현하도록 가공된 단리된 세포주로서, 여기서, 적어도 하나의 전이유전자 (a)는 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고; (b) HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있고/있거나; (c) 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된, 단리된 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자 (a)가 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고/있거나; (b) HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있는, 세포주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된, 세포주.
  4. 제3항에 있어서, 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 상기 서열이 서열번호 14 또는 서열번호 16과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 세포주.
  5. 제3항에 있어서, 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 상기 서열이 서열번호 14 또는 서열번호 16인, 세포주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되고, 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있는, 세포주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되고, HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있는, 세포주.
  8. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 안정적인 발현을 제공하기 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화되고, HSP90AB1, ACTB, CTNNB1 및 MYL6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있는, 세포주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 적어도 제1 전이유전자 및 제2 전이유전자를 발현하도록 가공된, 세포주.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 전이유전자가 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고; 상기 제2 전이유전자가 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 및 UBC로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있는, 세포주.
  11. 제9항에 있어서, 상기 제1 전이유전자가 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 프로모터의 제어하에 있고; 상기 제2 전이유전자가 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, 및 MYL6으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내인성 유전자의 제어하에 있는, 세포주.
  12. 제9항 또는 제11항에 있어서, 상기 제1 전이유전자 및/또는 제2 전이유전자가 안정적인 발현을 위해 CpG 모티프를 제거하도록 변형된 서열에 의해 암호화된, 세포주.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티프의 적어도 50 퍼센트가 제거된, 세포주.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티프의 적어도 70 퍼센트가 제거된, 세포주.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티프의 적어도 90 퍼센트가 제거된, 세포주.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 CpG 모티프가 제거된, 세포주.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티브 코돈이 희귀하지 않고/않거나 모노뉴클레오타이드 스트레치를 생성하지 않는 코돈으로 대체된, 세포주.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티프 코돈이 표 1의 상응하는 코돈으로 대체된, 세포주.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 유도 만능 줄기 세포(iPSC)주인, 세포주.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 리포터 유전자 또는 선택 마커인, 세포주.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 리포터 유전자인, 세포주.
  22. 제21항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 형광 단백질인, 세포주.
  23. 제21항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)인, 세포주.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 선택 마커인, 세포주.
  25. 제24항에 있어서, 상기 선택 마커가 푸로마이신, 네오마이신 또는 블라스티시딘인, 세포주.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 자살 유전자인, 세포주.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 티미딘 키나제, TET, 또는 근아세포 결정 단백질 1 (MYOD1)인, 세포주.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 6개월에 걸쳐 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는, 세포주.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 발현 카세트에 의해 암호화된, 세포주.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 전이유전자가 전기천공 또는 지질감염에 의해 세포주 내로 도입되는, 세포주.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 게놈 안전한 하버(harbor) 부위에 삽입되는, 세포주.
  32. 제31항에 있어서, 상기 게놈 안전한 하버 부위가 PPP1R12C (AAVS1) 유전자좌 또는 ROSA 유전자좌인, 세포주.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 세포주.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 세포주.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17을 포함하는, 세포주.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 반응 요소인, 세포주.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 반응 요소에 의해 구동되는, 세포주.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 유전자 편집을 포함하는, 세포주.
  39. 제38항에 있어서, 유전자 편집이 TALEN 매개 유전자 편집, CRISPR 매개 유전자 편집, 또는 ZFN 매개 유전자 편집을 포함하는, 세포주.
  40. CpG 모티프를 제거하기 위해 전이유전자 서열을 최적화하는 것을 포함하는 가공된 세포주에서 전이유전자 발현의 사일런싱을 방지하기 위한 방법.
  41. 제40항에 있어서, 최적화가 필수적으로 모든 CpG 모티프 코돈을 대체함을 포함하는, 방법.
  42. 제40항에 있어서, 최적화가 상기 CpG 모티프의 적어도 50 퍼센트가 제거되도록 대체함을 포함하는, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 CpG 모티프의 적어도 70 퍼센트가 제거되는, 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 CpG 모티프의 적어도 90 퍼센트가 제거되는, 방법.
  45. 제40항에 있어서, 모든 CpG 모티프가 제거되는, 방법.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CpG 모티브 코돈이 희귀하지 않고/않거나 모노뉴클레오타이드 스트레치를 생성하지 않는 코돈으로 대체된, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 CpG 모티프 코돈이 표 1의 상응하는 코돈으로 대체된, 방법.
  48. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, CpG 모티프를 제거하도록 최적화된 상기 전이유전자 서열이 야생형 전이유전자 서열의 GC 함량 퍼센트와 실질적으로 유사한 GC 함량 퍼센트를 포함하는, 방법.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자 서열이 리포터 유전자인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 GFP 또는 RFP인, 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 항시성 프로모터의 제어하에 있는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 실질적으로 모든 세포 유형에서 발현을 갖는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 필수적으로 모든 세포 유형에서 발현을 갖는, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 항시성 프로모터가 모든 세포 유형에서 발현을 갖는, 방법.
  55. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 유도성 프로모터의 제어하에 있는, 방법.
  56. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 EEF1A1 프로모터의 제어하에 있는, 방법.
  57. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주를 나트륨 부티레이트, VPA 또는 TSA로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주를 나트륨 부티레이트로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 나트륨 부티레이트가 0.25 mM 내지 0.5 mM의 농도로 첨가되는, 방법.
  60. 제40항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 iPSC 세포주인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 iPSC 세포주를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 iPSC 세포주가 분화된, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 iPSC 세포주가 성숙한 세포로 분화되는, 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 iPSC 세포주가 조혈 전구세포, 신경 전구세포, GABA성 뉴런, 대식세포, 미세아교세포 또는 내피 세포로 분화되는, 방법.
  65. 서열번호 1-12 또는 17과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 발현 벡터.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 발현 벡터.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 서열번호 2, 3, 4, 6 또는 17을 포함하는, 발현 벡터.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 pGL3 플라스미드 벡터인, 발현 벡터.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 프로모터 제어하에 전이유전자를 암호화하는, 발현 벡터.
  71. 제70항에 있어서, 상기 전이유전자가 리포터 유전자인, 발현 벡터.
  72. 제71항에 있어서, 상기 리포터 유전자가 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)인, 발현 벡터.
  73. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항의 벡터를 발현하도록 세포주를 가공하는 단계를 포함하고, 상기 벡터가 상기 전이유전자를 암호화하는, 안정적인 전이유전자 발현을 갖는 세포주를 생성하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 세포주가 만능 세포주인, 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 만능 세포주가 iPSC 세포주인, 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 19번 염색체상의 AAVS1 유전자좌에 벡터를 통합하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 통합이 유전자 편집을 포함하는, 방법.
  78. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 통합이 CRISPR 매개 유전자 편집, TALEN 매개 유전자 편집, 또는 ZFN 매개 유전자 편집을 포함하는, 방법.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 세포주를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 뉴런 또는 심장 세포로 분화되는, 방법.
  81. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 적어도 30일 동안 배양되는, 방법.
  82. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 적어도 6개월 동안 배양되는, 방법.
  83. 제73항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 적어도 30일 동안 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는, 방법.
  84. 제73항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 6개월에 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는, 방법.
  85. 제55항 내지 제84항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 만능 세포주.
  86. 외인성 전이유전자의 안정적인 발현을 갖는 세포주를 생성하는 방법으로서, 상기 방법이 내인성 유전자의 제어하에 전이유전자를 발현하도록 세포주를 가공하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 내인성 유전자가 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 또는 UBC인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 가공이 유전자 편집을 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 유전자 편집이 TALEN 매개 유전자 편집, CRISPR 매개 유전자 편집, 또는 ZFN 매개 유전자 편집을 포함하는, 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자가 리포터 유전자, 선택 마커 또는 자살 유전자인, 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포주가 만능 세포주인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 만능 세포주가 iPSC 세포주인, 방법.
  92. 내인성 HSP90AB1, ACTB, CTNNB1, MYL6, UBA52, CAG, RPS 또는 UBC가 전이유전자로 태그된 단리된 세포주.
  93. 제92항에 있어서, 상기 전이유전자가 리포터 유전자 또는 선택 마커인, 세포주.
  94. 제92항에 있어서, 상기 세포주가 만능 세포주인, 세포주.
  95. 제94항에 있어서, 상기 만능 세포주가 iPSC 세포주인, 세포주.
  96. 제1항 내지 제39항, 제85항, 또는 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하고 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 세포를 검출하기 위한 검정.
  97. 세포 검정을 위한 제1항 내지 39항, 제85항 또는 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항의 세포주의 용도.
  98. 제97항에 있어서, 세포 검정이 세포 생존력 검정인, 용도.
  99. 제97항에 있어서, 상기 세포 검정이 후보 제제를 스크리닝하기 위한 검정인, 용도.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검정이 고속처리량 검정인, 용도.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 검정이 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 용도.
  102. 세포 검정에 사용하기 위한 제1항 내지 39항, 제85항 또는 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항의 세포주를 포함하는 조성물.
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