JP2015500637A - 一倍体細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)被験雌からの未受精の卵母細胞をインビトロで活性化させて単為生殖を誘導し;
(b)ステップ(a)で活性化された卵母細胞を培養して桑実胚および/または胚盤胞を生成させ;
(c)ステップ(b)の桑実胚および/または胚盤胞から胚性幹細胞を単離し、必要に応じてその胚性幹細胞を、その胚性幹細胞の分化を抑制する細胞培地に移し;
(d)ステップ(c)の胚性幹細胞をFACS分析し、一倍体DNAを含む胚性幹細胞を同定し、および/または豊富化し;
(e)必要に応じ、一倍体DNAを含む胚性幹細胞のFACS精製とその胚性幹細胞の増殖を繰り返すことにより、一倍体胚性幹細胞系を生成させる操作を含んでいる。
1)卵母細胞を精子ではなく一倍体胚性幹細胞の核と人工的に受精させることができる。この方法がうまくいくなら、2匹の雌からの生存する初めての子孫となろう。
2)受精した卵母細胞の雌前核を取り出し、本発明の一倍体胚性幹細胞の一倍体ゲノムで置き換え、雄の前核と融合させることができよう。そうすることで一倍体胚性幹細胞はヘテロ接合マウスを生み出すため、導入された潜在的な突然変異が生体内に取り込まれ、それを詳細に分析することができよう。
卵母細胞の単為生殖活性化
卵母細胞を回収し、5%エタノールの中で5分間にわたってインキュベートした。その後、生きている卵母細胞を偽妊娠マウスに移し、胎生日齢3.5日目に胚盤胞を回収した。
以前に報告されているES細胞導出培地(Bryja他、2006年)が入っていて、支持細胞で覆われた細胞培養皿の上に胚盤胞を載せた。胚盤胞の増殖物をトリプシンで処理し、支持層の上に再度載せてES細胞のコロニーを増殖させた。
マウスの肝臓またはES細胞からのDNAを精製し、超音波処理によって剪断し、イルミナ・アダプタ連結プロトコルを実施し、イルミナHiSeqの中でシークエンシングした。Bowtieを用いて読み取った結果をゲノムにマッピングした。
qPCRまたは免疫蛍光標識と、アルカリホスファターゼに関する酵素アッセイを利用して細胞を分析し、幹細胞マーカーの存在を調べた。
LIFを除去してEBを形成することによって、またはニューロンを直接分化させることによって細胞を分化させた(Pollard他、2006年)。奇形腫を形成するため、細胞をヌードマウスの精巣または皮下に注入し、奇形腫の成長をモニタした。キメラマウスを生成させるため、HMSc2 ES細胞をC57BL/6 ED3.5胚盤胞に注入し、偽妊娠雌に移した。毛色によってキメラの割合を求めた。
ウイルスを 白金E細胞の中に包装した。G418を用いて遺伝子トラップ挿入の選択を行なった。逆PCRのプロトコルをCaretteらに基づいて改変した(Carette他、2011年)。
細胞の突然変異ライブラリを致死量のリシンに3週間にわたって曝露した。生き延びた細胞のDNAを精製し、逆PCRを実施し、ディープ・シークエンシングによって分析した。shRNAノックダウンを用いて確認するため、細胞を48時間にわたってリシンに曝露し、FACSを利用して生存を定量した。
方法
実施例1.1:単為生殖による一倍体幹細胞の導出
標準的なプロトコルを利用してC57BL/6×129 F1雌マウスを過剰排卵させ、未受精の卵母細胞を排出させて回収した。活性化のため、報告されているようにして卵母細胞を5%エタノールまたは25mMのSrCl2に曝露した(Kaufman他、1983年;Otaegui他、1999年)。活性化の4時間後、生きている卵母細胞を偽妊娠129雌に移し、胎生日齢(ED)3.5日目に再度回収し、確立されている胚性幹細胞導出プロトコル(Bryja他、2006年)に従って細胞を導出した。単為生殖に由来する幹細胞は、最初は支持層の上に維持し、その後、無支持細胞培養条件に適合させた。一倍体細胞を訓練して徐々に支持細胞の密度を小さくし、最終的に支持細胞を培地から除去することによって無支持細胞培養条件下で成長させた。幹細胞培地は、15%FCS(Gibco社)を含むDMEMに2mMのL-グルタミン酸、1mMのピルビン酸ナトリウム、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、1×非必須アミノ酸、50mMのβ-メルカプトエタノール(すべてSigma社)、1,000U/mlのESGRO(Millipore社)を補足したもので構成した。
Covaris DNAソニケータを用いてゲノムDNA調製物を剪断し、アダプタを連結させ、イルミナ・シークエンシング(HiSeq)を製造者のプロトコルに従って実施した。読み取った結果をBowtieを用いてマッピングし(3個のミスマッチまで許容でき、読み取った結果は単一のゲノム位置にマッピングする必要がある)、カバー率を、親系統である129とC57BL/6におけるカバー率に対する読み取り結果/50kbウインドウとして分析した。そのとき独自のゲノム座標だけを考慮した。C57BL/6と129で異なっているSNPをSanger(www.sanger.ac.uk/resources/mouse/genomes/)から検索し、そのSNPとゲノム・マッピングの間に観察されたディープ・シークエンシングの読み取り結果のミスマッチを評価した。Solexaの読み取り結果によってカバーされた各SNPを、優勢な読み取り結果に従ってC57BL/6と129に割り当てた。
VECTORキットSK-5300を用いてアルカリホスファターゼ活性を検出した。染色体の広がりは、確立されているプロトコル(Nagy他、2008年)に従って調べた。培養した細胞または胚様体(EB)培養物、神経幹細胞培養物、分化した神経幹細胞培養物の免疫蛍光を、4%PFAの中で1時間固定し、1%グリシンと、2%BSAと、0.2%トリトンと、5%FCSを補足したPBSの中で1時間ブロックして透過させた後に実行した。細胞を一次抗体o/nとともに4℃でインキュベートし(抗ネスチン、Abcam 6142、1:300;抗Gata4、Santa Cruz社、1:500;抗Oct3/4、BD Transduction社、1:100;抗Tuj1、Covance社RB-435P、1:1000;抗サイトケラチン5、PRP160P-100、Covance社;抗GFAP、DAKO社、1:200;抗Sox2、Cell Signaling社、L1D6A2マウスmAB、1:100;抗Nanog、Abcam ab80892、1:100)、洗浄し、蛍光標識したヤギ二次抗体(Molecular Probes社)とともにインキュベートし、Zeiss Axioplan2(神経幹細胞の分化)またはZeiss LSM700共焦点顕微鏡(胚様体)を用いて可視化した。生体内での分化を分析するため、奇形腫を回収し、4%PFAの中で固定しo/n、パラフィンに包埋し、切除し、ヘマトキシリンとエオシン(H&E社)、アルシアンブルーと核ファーストレッドで染色するか、ネスチンとサイトケラチン5の免疫検出を実施した。ビオチニル化した二次抗体を用いて一次Abを検出した。ストレプトアビジン-HRPとDABを用いてAb染色を可視化し、ヘマトキシリンを用いて切片を対比染色した。Ventana自動化システムを用いて免疫組織化学を実施した。Zeiss Miraxscanを用いて画像を取得した。奇形腫の評価は認定された病理医によってなされたことに注意されたい。
FACS分析のため、細胞をトリプシンで処理し、洗浄した後、プレプレーティングしながら10μg/mlのヘキスト33342とともに30分間にわたってインキュベートした。その後、細胞を遠心分離によって回収し、BD FACSAriaIIIを用いてFACSでDNA含量(とFSC-AとSSC-A)をソーティングした。免疫組織化学染色について記載したのと同じ一次抗体と二次抗体を用いて(トリプシン処理の後のFACSのための)細胞内染色を実施した。
QIAgen RNeasyミニ・キットを用いてRNAを精製した。x44Kマウス遺伝子発現アレイ・デザインID 14868を用い、逆転写、DNA標識化、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーションを製造者のプロトコル(Agilent社)に従って実施した。qPCR分析のため、QIAgen RNeasyミニ・キットを用いてRNAを精製し、iScriptキット(Biorad社)を用いて逆転写した。iQ5リアル・タイムPCR検出システム(Biorad社)を用い、iQ SYBRグリーン・スーパーミックスで増幅をモニタした。ハウスキーピング遺伝子としてGapdhを用い、Δデルタct法を利用して発現レベルを計算した。以下のPCRプライマを使用した:
nanog GCAAGAACTCTCCTCCATT(配列ID番号3) 順
ATGCGTTCACCAGATAGC(配列ID番号4) 逆
oct-4/pou5f1 TCACTCACATCGCCAATC(配列ID番号5) 順
CCTGTAGCCTCATACTCTTC(配列ID番号6) 逆
sox2 CTCGCAGACCTACATGAAC(配列ID番号7) 順
CTCGGACTTGACCACAGA(配列ID番号8) 逆
klf4 TCTCTCTTCTTCGGACTCC(配列ID番号9) 順
CTGGACGCAGTGTCTTCT(配列ID番号10) 逆
c-myc GTACCTCGTCCGATTCCA(配列ID番号11) 順
CATCTTCTTGCTCTTCTTCAG(配列ID番号12) 逆
sall4 AACTTCTCGTCTGCCAGT(配列ID番号13) 順
GAGTCATGTAGTGTACCTTCA(配列ID番号14) 逆
kf12 CTCAGCGAGCCTATCTTG(配列ID番号15) 順
AGAGGATGAAGTCCAACAC(配列ID番号16) 逆
gata-4 GTGAGCCTGTATGTAATGC(配列ID番号17) 順
CTGCTGGCGTCTTAGATT(配列ID番号18) 逆
hand1 CCTTCAAGGCTGAACTCA(配列ID番号19) 順
CGCCCTTTAATCCTCTTCT(配列ID番号20) 逆
gata-6 CTCCTACTTCCTCTTCTTCTAA(配列ID番号21) 順
CGTCTTGACCTGAATACTTG(配列ID番号22) 逆
foxa2 GAGCCGTGAAGATGGAAG(配列ID番号23) 順
GTGTTCATGCCATTCATCC(配列ID番号24) 逆
sox17 GCCGATGAACGCCTTTA(配列ID番号25) 順
CAACGCCTTCCAAGACTT(配列ID番号26) 逆
krt18 TTGCCGCCGATGACTT(配列ID番号27) 順
CAGCCTTGTGATGTTGGT(配列ID番号28) 逆
zfp42/rexl CTGCCTCCAAGTGTTGTC(配列ID番号29) 順
GAACAATGCCTATGACTCAC(配列ID番号30) 逆
drosha CCAAGATGATCCAACTCCTT(配列ID番号31) 順
GGTGCTGATTCTGAACAATG(配列ID番号32) 逆
rarg CACCATTTGAGATGCTGAG(配列ID番号33) 順
GGCTTATAGACCCGAGGA(配列ID番号34) 逆
胚様体(EB)を形成するため、幹細胞をトリプシンで処理し、LIFの不在下にて、懸滴(ハンギング・ドロップ)の中、または細菌皿の中で培養した。レチノイン酸(RA)によって誘導される分化に関しては、0.1μMのRAのもとで細胞を一週間増殖させ、10cmの皿1つにつき100万個の密度にプレーティングし、72時間後に調べた。筋芽細胞の分化に関しては、LIFのない幹細胞培地の中で懸滴中にて4.5日間培養した後、洗浄してゼラチン化細胞培養皿に載せた。LIFのない8ml/10mlの幹細胞培地を交換することにより、接着する細胞の塊を3日ごとに供給した。Zeiss Axiovert 200MとCoolSNAP HQ2を使用し、脈打っている筋芽細胞の動画を11〜13日目に36ショット/秒の割合で記録した。神経幹細胞の導出と、神経幹細胞のGFAP+アストロサイトおよびTuj1+ニューロンへのさらなる分化を報告されているようにして実施した(Pollard他、2006年)。奇形腫の形成に関しては、細胞をヌードマウスの精巣または皮下に注入し、奇形腫の成長をモニタした。キメラマウスを作製するため、フローサイトメトリーを利用してHMSc2幹細胞の二倍体分画を精製し、7日間培養し、C57BL/6 ED3.5胚盤胞に注入し、偽妊娠129雌に移した。キメラの割合を毛色によって求めた。
スプライス・アクセプタの後に、3つの読み枠のネオマイシン耐性遺伝子と、転写を増大させるOct結合部位とを有するOct4増大遺伝子トラップ・レトロウイルス(Schnutgen他、2008年)を白金E細胞(Cell Biolabs社)に包装し、遠心分離(25,000rpm、4℃、4時間)によって濃縮し、2μg/mlのポリブレンを用いて8時間にわたって幹細胞に適用した。遺伝子トラップ挿入の選択は、0.2mg/mlのG418(Gibco社)を用いて実施した。組み込み数を評価するため、5000,000個の細胞を15cmの皿でプレーティングし、G418選択を利用して組み込みを選択し、10日後にコロニーを数えた。比較のため、5,000個の細胞を選択なしでプレーティングした。
逆PCRのプロトコルをCaretteら(Carette他、2011年)に基づいて改変した。簡単に述べると、ゲノムDNA調製物をDpnIIまたはMseIを用いて消化させ、QIAquickゲル抽出キットを用いて精製し、断片を3μg/mlの濃度で一晩かけて連結させた。次いでリガーゼを熱によって不活性化し、酵素NheIとPvuIIを用いてリングをリガーゼ緩衝液の中で再度消化させた。直線にした断片をQIAquickゲル抽出キットを用いて精製し、Accuprime Taqポリメラーゼ(Invitrogen社)と、FS Solexa上流プライマと、FS Solexa下流プライマと、BioRad社の熱サイクラーを用いてPCRを実施した。95℃で30秒間、60℃で30秒間、68℃で105秒間というプログラムを36回繰り返した。アンプリコンをアガロース・ゲルに装填し、溶離させ、イルミナ・ゲノム分析装置とFSフローセル・プライマを用いてディープ・シークエンシングを実施した。以下のiPCRプライマを使用した:
上流プライマ
AATGATACGGCGACCACCGAGATCGCCAGTCCTCCGATTGA(配列ID番号35)
下流プライマ
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTA(配列ID番号36)
フローセル・シークエンシング・プライマ
TGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA(配列ID番号37)
Bowtieを用いてSolexaの読み取り結果をマウス・ゲノムにマッピングしたが、そのときゲノムへの唯一の最適一致が必要とされる。ENSEMBLE遺伝子注釈付けを利用し、イントロン内、エキソン内、UTR内、プロモータ(転写開始部位の2kb上流と定義される)内と、残る遺伝子間領域における組み込み部位の割合を求めた。われわれの一倍体幹細胞でのENSEMBLE転写産物の発現レベルを、トランスクリプトーム分析で使用するAgilentアレイ上での絶対信号によって測定し、その発現レベルに応じてENSEMBLE転写産物を10個の区画に分割し、ウイルスが組み込まれた転写産物の割合を各区画で評価した。同等な遺伝子に基づく分析に関しては、各遺伝子について発現が最も多い転写産物を考慮した。分析を繰り返し、全挿入部位のサブサンプルでウイルス組み込みのカバー率を評価した。
madcaml-F AGTCTCTCCTTTGCCCTGCTACTGG(配列ID番号38)
madcaml-R CACAGGCATTGAACAGTTTTGTTGG(配列ID番号39)
drosha-F TTCGAGTTATAGACTGTAATGAGCC(配列ID番号40)
drosha-R CCTACACTCTCTAGCAACGGAAGCC(配列ID番号41)
RARG-F GCTGTTGTCACCCTTGTGCAT AAGCC(配列ID番号42)
RARG-R AGATGCTGGGAATGGAACCCTGGTCC(配列ID番号43)
Ap4sl-F GTAGCTTAGAAACTCTGGCCACTGG(配列ID番号44)
Ap4sl-R CAGTGAAGTCTGAATACAGAGAATGG(配列ID番号45)
Arapl-F GTCCATGCAGGTTTGAGTGACTCC(配列ID番号46)
Arapl-R GACCTCCAGCTACAGAGGACAGAGCC(配列ID番号47)
Evxl-F TGTCAAGGGCAAGAGCTGCGAAGG(配列ID番号48)
Evxl-R CCAATGTCAAACCGGAAGGGAGAAGG(配列ID番号49)
Bcl211-F GAGTTACAGATGACTGCGAGCTGCC(配列ID番号50)
Bcl211-R GAAGCATTGAGTAGCTTTACCTGCC(配列ID番号51)
2210012G12Rik-F GTAGACCTGACTTGACTGGCTTGG(配列ID番号52)
2210012G12Rik-R GATGCTCATCTTACCAAACGCATCTC(配列ID番号53)
Tit-F CTTCGACCGTCTGGTCCTCAAGAGG(配列ID番号54)
Tit-R GAAACCAGCCTGATCTACATAGTGG(配列ID番号55)
chr2:50928851-F ACTTCCGACAAGAT TCTCAGTCC(配列ID番号56)
chr2:50928851-R CGTGACCTTTGGGTGTGTAATGCC(配列ID番号57)
分化の指標としてのOct4の発現の喪失を分析するためにわれわれが以前に公開した高含量スクリーニング(HCS)プロトコル(Walker他、2010年;Walker他、2007年)を改変したものを用い、分化分析を実施した。50継代を超える無支持サブクローンHMSc2-27を用いてすべてのHCS実験を実施した。96ウエル組織培養プレート(Greiner社)の別々の列で細胞を並列に培養した。細胞をトリプシンで処理して個別細胞懸濁液にし、フィブロネクチン/ゼラチン混合物(12.5μg/mlのフィブロネクチン、Sigma社と、水中の0.02%のゼラチン、Millipore社)であらかじめ被覆しておいたウエルに6000細胞/ウエルの割合でプレーティングした。細胞を24時間、48時間、72時間の時点で4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間にわたって室温で固定した。Oct4のための免疫染色を以下のようにして実施した:固定した細胞を室温で30分間にわたってブロックし、4℃で1時間にわたって0.1%トリトンX-100/PBSを用いて透過状態にし、透過緩衝液(PB、5%FBS、0.3%トリトンX-100を含むPBS)で1回洗浄した後、マウスのモノクローナルOct4抗体(BD、1:100)とともに室温で1時間にわたってインキュベートした。その後、細胞をPBSで4回洗浄し、DAPIを1:5000に希釈したPBの中で抗マウスIgG1 AlexaFluor488(Invitrogen社、1:100)とともに1時間にわたってインキュベートした。次に、ThermoFisher Cellomics ArrayScan VTi自動化蛍光顕微鏡でプレートの画像を取得した。それぞれの時点と条件について最低で9個のウエルを用いてデータを取得した。一倍体細胞系HMSc2-27の混合培養物の中で一倍体細胞を二倍体細胞から識別するため、核サイズとDAPI強度(DNA含量)に基づくアルゴリズムをR言語で設計した。われわれの一倍体と二倍体の分析が忠実になされたことを確かめるため、Rアルゴリズムは、DAPI強度が対照一倍体の平均DAPI強度よりも低い場合にだけ細胞を“一倍体”と呼び、DAPI強度が対照二倍体の平均DAPI強度よりも高い場合にだけ細胞を“二倍体”と呼んだ(図9参照)。
遺伝子トラップ・ベクターを有するクローンに、CreリコンビナーゼとGFPをコードしているプラスミドを過渡的にトランスフェクトし、GFP陽性細胞をFACSでソーティングし、クローン密度でプレーティングし、採取し、増殖させ、PCR分析を利用して逆転を分析した。
pSIN-TRE-dsRed-miR30/shRNA-PGK-Venus-shRNA標的部位ベクターを使用した。このベクターはpSENSORの誘導体であり、shRNAを発現している細胞を蛍光(dsRed)に基づいてモニタすることを可能にする(Fellmann他、2011年)。このベクターの2つの変異体として、ホタル・ルシフェラーゼを標的とする強力なshRNA(shLuc.1309)を含んでいて、その具体的な標的部位がVenusの3’UTRにあるものとないもののそれぞれを、MSCV-rtTA3-PGK-Puroをともに、対照野生型ES細胞と、アンチセンス(AS)方向とセンス(S)方向の突然変異誘発ベクターが組み込まれたES細胞に、リポフェクタミン2000を製造者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクションの8時間後、トランスフェクトされた細胞をドキシシリン(1μg/ml)で処理してshRNAの発現を誘導し、48時間後、shRNAを発現している(dsRed+)細胞のVenusレポータの発現レベルをFACS-Aria-IIIフローサイトメータ(BD社)で分析した。
細胞培地中のリシン粗抽出物をSimmonsとRussell(1985年)に記載されているようにして生成させ、すべての細胞を3〜4日以内に効果的に殺す濃度を滴定した。リシン毒性に関与する遺伝子を同定するため、上記の突然変異ライブラリ(図13)の2500万個の細胞を5枚の15cmの皿にプレーティングした。使用したライブラリは、遺伝的に独立な約750万通りの異なる突然変異からなるという複雑性を持っていた。6番目の15cmの皿にサブクローンHNSc2-27の突然変異していない細胞を500万個プレーティングした。リシンが存在する幹細胞培地の中に細胞を2週間維持した。この時点で、突然変異がなければ空であったはずのプレートには数百個の明確に異なるコロニーが出現したのに対し、対照プレートには、典型的な幹細胞の形を持つコロニーがまったくなかった。リシン不感受性細胞をさらに精製するため、すべての細胞をトリプシンで処理し、同じ面積で再度プレーティングした。対照とライブラリにおけるリシン選択を1週間延長した。対照プレートにはその時点でコロニーがまったくなかったのに対し、ライブラリのプレートは増殖を始めていた。1つの集団内のすべての細胞を溶解させ、DNAを精製し、DNAに逆PCRとディープ・シークエンシング(上述)を実施して、継続的なリシン処理を3週間実施した後に残っていた細胞内のウイルス組み込み部位をすべて求めた。
Gpr107を標的とするshRNA(TGCTGTTGACAGTGAGCGCAACTAGCTTATTCATAGCCA-
ATAGTGAAGCCACAGATGTATTGGCTATGAATAAGCTAGTTTTGCCTACTGCCTCGGA、配列ID番号58)を設計し、Zuberら(2010年);Zuberら(2011年)が記載しているLMN (MSCV-miR30-PGK-NeoR-IRES-GFP)にクローニングした。GPFを発現するレトロウイルス・ベクターと、Gpr107をノックダウンするshRNAまたはスクランブル状態の対照shRNAとを白金E細胞に包装し、HMSc2-27細胞とNIH3T3細胞にトランスフェクトしたものを3つ用意した。72時間後、細胞を2つの10cmのプレートに分割し、一方のプレートは処理せずに放置し、他方のプレートはリシンで処理した(NIH3T3に関しては粗抽出液の1:250、HMSc2-27に関しては粗抽出液の1:2000)。リシンを添加してから48時間後に生存を分析した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、LSR Fortessa(BD社)を用いて絶対数、eGFP発現、生存率(プロピジウムヨード染色)を求めた。
単為生殖胚は一倍体卵母細胞から発生するため、母親のゲノムだけを含んでいる。しかし単為生殖胚に由来する報告されているどの細胞系も染色体の二倍体セットを有する(Kaufman他、1983年)。一倍体細胞が単為生殖初期胚の中に相変わらず存在している可能性があり、一倍体幹細胞をそのような胚盤胞から導出できる可能性があることは、以前は知られていなかった。それを実現するため、過剰排卵させたC57BL/6×129 F1雌からの卵母細胞を5%エタノールまたは25mMのSrCl2によって活性化させた。次に、活性化した卵母細胞を偽妊娠レシピエントに移した(図1A)。胎生日齢(ED)3.5日目に、コンパクトになった桑実胚と胚盤胞を回収し、幹細胞の導出に用いる条件下で培養した。FACS分析から、単為生殖に由来する少数の細胞でDNA含量が実際に低下していることがわかった(図8A)。この集団でFACS精製を数回実施した後に増殖させると、2つの異なる胚盤胞に由来する2つの独立な細胞系が得られ(それを今後はHMSc1とHMSc2と名づける)、細胞周期のG1期では1n染色体セット、G2期では2n染色体セットであった(図1B、図8A)。染色体の広がりから、両方の細胞系が20本の染色体からなる一倍体セットを有することがわかった(図1C、図8B)。両方の細胞系が今では50継代を超えているが、増殖危機の兆候はないことに注意されたい。したがって減数分裂の卵母細胞を活性化させ、胚盤胞を単為生殖で導出することにより、一倍体染色体セットを持つマウス細胞を確立することができた。
確立された一倍体細胞の遺伝子の特徴を明らかにするため、ディープ・シークエンシングを利用してそのゲノムを親マウス系統C57BL/6および129のゲノムと比較し、識別性カバー率分析を実施した。簡単に述べると、50kbの移動ウインドウ(10kbのオフセット)の中で唯一のゲノム位置にマッピングされるシークエンシングの読み取り結果をデュープリケートは考慮せずに評価し、各ライブラリのゲノムにマッピングされる読み取り結果の合計数で規格化した。予想通り、系統間で多くの位置が異なっていることが見いだされた(ウェブのwww.starklab.org/data/elling_CSC_2011/に掲載)。そこで両方の一倍体細胞系から両方の親系統までのゲノムDNAについてのディープ・シークエンシングの読み取り結果を比較し、両方の親系統に対するずれに焦点を当ててまとめた(図1D、図1E)。総合すると、HMSc1は、親系統とは、219箇所の非重複領域に対応する1553個の重複ウインドウで2倍を超えて異なっていること(多重検定補正p値≦10-3)、そしてHMSc2は、読み取りカウント数が増加したウインドウが568個(113領域)、読み取りカウント数が減少したウインドウが61個(10領域)であること(2倍以下;多重検定補正p値≦10-3)が見いだされた。読み取りカウント数が増加した1155個のウインドウと、減少した99個のウインドウが、HMSc1とHMSc2で重複していたのに対し、397個と4個のウインドウがそれぞれ異なっていた。発明者にはこの観察結果の原因がわからないが、共通するこれらコピー数の変動(CNV)は、さまざまなタイプの細胞(ES細胞対成体腎臓)からDNAを調製している間やシークエンシングの間のバッチ効果など、シークエンシング手続きのバイアスに起因している可能性がある。一次シークエンシングの全データは、UCSC ゲノム・ブラウザ(genome.ucsc.edu/)にアップロードするための形式にしたwww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/とwww.starklab.org/data/elling_CSC_2011/ で入手できる。したがってまとめると、一倍体細胞系は親系統と比べて限られた数の所定のCNVを示す。これは、一倍体細胞系が、確立されたES細胞(Baker他、2007年)またはiPS細胞系(Hussein他、2011年)を用いた以前の報告と似た少数の複製と欠失を有する可能性が大きいことを示唆している。
次に、一倍体細胞系が典型的な胚性幹細胞マーカーを発現するかどうか、すなわち一倍体細胞が実際に幹細胞であるかどうかを調べた。単為生殖に由来する一倍体のHMSc1系とHMSc2系の両方とも、ES細胞の典型的な形態を示し、ES細胞マーカーであるアルカリホスファターゼに関する染色で陽性であった(図2A)。Oct4、Nanog、Sox2を検出するための免疫標識(図2B)により、HMSc1細胞とHMSc2細胞が典型的なES細胞マーカーを発現することが確認された。トランスクリプトーム分析から、両方の一倍体細胞系の発現プロファイルは二倍体ES細胞系IB10/Cの発現プロファイルと非常によく似ていることがわかった(図9A)。識別値が最大の遺伝子に焦点を絞るため、100個の遺伝子セット(その中にはNanog、Oct4、Klf4が含まれる(Chambers他、2003年))について、マウス胚性線維芽細胞(MEF)と二倍体ES細胞の間で、どちらかの方向の遺伝子発現の最大差を分析した。この遺伝子セットの分析から、HMSc1細胞系とHMSc2細胞系の両方とも、真正の二倍体ES細胞系IB10/Cと非常によく似た発現の兆候を示すことがわかった(図9B)。定量PCR分析により、HMSc1細胞とHMSc2細胞の両方が典型的なES細胞マーカーを発現することが確認された(図2C)(Elling他、2006年;TakahashiとYamanaka、2006年)。合わせて考えると、全体的なトランスクリプトーム・プロファイリングと典型的な観察結果マーカーの発現分析により、両方の一倍体細胞系が幹細胞の性質を持つことが確認された。
われわれの一倍体ES細胞の分化能力を調べるため、最初に胚様体(EB)の形成を調べた。両方の一倍体細胞系は容易にEBを形成し、EB細胞は内胚葉マーカーGata4を発現した(図2D)。リアルタイムPCRを利用して分化をさらに確認した。典型的なES細胞マーカーNanog、Rex1、Oct4、Sox2、Klf4、Sall4、Kfl2(Chambers他、2003年;TakahashiとYamanaka、2006年)は、EBでは、親一倍体ES細胞と比べて下方調節されたのに対し、分化系列決定マーカーHand1(中胚葉、栄養外胚葉)、Nkx2-5とブラキュリー(両方とも中胚葉)、ネスチン(神経)、Gata4、Gata6、Foxa2(すべて内胚葉)、Sox17(内胚葉と中胚葉)、Cxcr4R(内胚葉)、ケラチン18(外胚葉)は上方調節された(図2E、図9C)。これらの結果は、一倍体ES細胞が3つの生殖層すべてのいくつかの系譜に分化できることを示している。
確立された一倍体ES細胞系が成体マウスに寄与する分化能力を評価するため、アグーチ+ES系HMSc2をED 3.5胚盤胞に注入した。競合的増殖、したがって効率的な寄与を保証するため、一倍体HMSc2に由来する二倍体細胞を使用した。生まれた25匹のマウスのうちの6匹で毛色キメラが観察された(図3A)。単為生殖に関して以前に報告されているように(ThomsonとSolter、1988年)、さまざまな臓器に対する全面的に母に由来する細胞の寄与を分析するため、識別PCRを実施し、多数の組織でHMSc2に由来する細胞を検出した(図10A)。われわれの一倍体幹細胞の固有分化能力を調べるため、生体内奇形腫アッセイを実施した。対照二倍体ES細胞と同様、HMSc1細胞とHMSc2細胞の両方を注入すると常に4〜8週間以内に奇形腫が形成された。
一倍体幹細胞が安定に増殖する固有の能力を有するかどうかを評価するため、FACS精製の直後に個別の一倍体細胞をプレーティングしていくつかの個別の細胞クローンを確立した。これらサブクローンは、無支持条件で確立されたものであり、以前に30継代を超えて培養されたHMSc1とHMSc2両方の親系に由来する。導出されたすべてのサブクローンが幹細胞マーカーOct4とSox2を発現し(図4A、図11)、Gata4+内胚葉細胞とTuj1+ニューロンを含むEBを形成した(図4A、図12)。一倍体サブクローンHMSc2-27を選択し、その増殖速度と安定な一倍体細胞の数をさらに調べた(図13A、図13B)。
一倍体幹細胞を確立するというアイディアは、ゲノム・スケールでの順遺伝学と逆遺伝学のためのツールを作り出すことを目的としている。一倍体マウス幹細胞での突然変異誘発能力を証明するため、FACS精製したばかりの一倍体HMSc2-27培養物の細胞5×108個に、可逆的遺伝子トラップを含む以前に報告されているレトロウイルス(Schnutgen他、2008年)を感染させた。このベクターは、幹細胞の中で検出可能な発現がわずかであるか発現がない遺伝子への挿入を可能にする除去可能なOct4結合部位も含んでいる(Schnutgen他、2008年)。感染の後、コロニー形成アッセイで評価すると7.5×106個の独立なゲノム挿入が生成した。
挿入突然変異誘発のため以下のアプローチを採用した:転写終了カセットを共有するベクター、すなわち所定の遺伝子の1つのイントロンに挿入された後にポリAシグナルがあると新生mRNAの未熟な切断につながる、遺伝子転写産物を“捕獲する”スプライス・アクセプタ(SA)を共有するベクター(図15A)。組み込まれる遺伝子トラップは、トラップされる遺伝子のプロモータから転写された抗生物質耐性カセットを用いて選択した。われわれは、そのようなカセットをレトロウイルス骨格で使用し(図15B)、それを眠れる美女トランスポゾン骨格にクローニングした(図15C)。この方法は、遺伝子座の転写を必要とするため、各タイプの細胞に転写される遺伝子に限定される。遺伝子トラッピングは、最近、胚性幹様細胞特異的エンハンサ要素を付加することによって改良された(図15D)(Schnutgen他、2008年)。そうすることで、胚性幹様細胞での発現が弱い遺伝子が、十分な選択を可能にするレベルまで活性化される。ポリAトラッピング・カセットは自らのプロモータとともに挿入されるが(図15Eの水色の矢印)、mRNAは、ゲノムポリアデニル化シグナルの上流に挿入される場合、したがって転写産物内に挿入される場合を除き、失われたポリAシグナルが原因で不安定なままである。したがってこの系は、胚性幹様細胞で標的遺伝子の転写をまったく必要としない。
次に、レトロウイルス突然変異誘発の設定を利用し、個々のクローンを取り出し、約1000の細胞系の挿入部位を同定し、センス挿入とアンチセンス挿入がある10個のクローンを選択してさらに分析した。部位特異的プライマを用いたPCR分析により、われわれのシークエンシング法を利用すると全部で10のケースにおいて正しい標的部位が同定されることを確認した(図6C)。非常に重要なのは、これらのデータから、10のクローンすべてがホモ接合の挿入を有することもわかることである(図6D)。これは、突然変異誘発が一倍体細胞に起こったこと、そしてこの方法が実際に劣性遺伝学にとって実用的であることを示している。
最後に、一倍体幹細胞系を用いてゲノム・レベルでの劣性順遺伝子スクリーニングを実施した。ひまし油植物ヒマからの天然のリシン毒性は非常に有毒である。分子レベルでは、リシンは、N-アセチルガラクトサミンまたはβ-1,4-連結ガラクトース残基に結合するとともに、細胞表面のマンノース受容体に結合するため、リシン分子は、ゴルジ体を通じた逆行性輸送に従って小胞体(ER)の管腔に入り、そこから細胞質ゾルの中に流出してリボソームを不活性化すると考えられる。われわれは、リシンがマウスES細胞に対して非常に強い毒性を示すことを見いだしたため、突然変異した一倍体HMSc2-27細胞ライブラリを使用し、細胞に致死量のリシンでチャレンジを行なった。リシンは対照幹細胞をすべて殺したが、突然変異した一倍体HMSc2-27細胞からは多数の幹細胞コロニーが成長していることを観察した(図7A)。そこでこれらコロニーをプールし、ディープ・シークエンシングによって組み込み部位を求めた。以前の研究から予想されるように、糖代謝に関与する多数の酵素が見いだされた。すなわちβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ1(B4galt1)、N-アセチルラクトサミニドβ-1,6-N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼ(Gcnt2)、ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(Galnt2)、糖タンパク質ガラクトシルトランスフェラーゼα1,3(Ggta1)、ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ3(B4galnt3)である(図7B、図7C)。α-(1,3)-フコシルトランスフェラーゼFut9における多数の破壊性突然変異も得られ、GDP-フコース輸送体1 Slc35clがヒットした(図7B、図7C)。フコシル化経路とリシン毒性はこれまで関連づけられたことがまったくない。
潜在的な結合パートナー、またはGpr107の機能を同定するため、プルダウン実験を実施した。このタンパク質のC末端にタグ(mCherry、Ha、myc)を付けたものを、ノックアウト一倍体幹細胞をバックグラウンドとして過剰発現させた。改変したこのタンパク質により、われわれの細胞で機能を再構成することができた。それは、リシン毒性に対する感受性が再獲得されたことからわかる。この発現コンストラクトを使用し、全細胞ライセートの中でGpr107の抗HAプルダウン実験を実施した。溶離したタンパク質の質量分析により、Gpr107の潜在的相互作用パートナーがいくつか同定された。それらは現在さらに研究中である。
Gpr107の野生型細胞とノックアウト細胞と再構成細胞を同数用意し、さまざまな濃度のシュードモナス外毒素Aで3日間処理した。その後、アラマールブルー細胞生存アッセイを利用して生存率を調べた。Gpr107ノックアウト細胞は、毒素のもとで、この受容体を発現している細胞よりも生存率が大きかった(図18F)。
フコシル化阻害剤
われわれの一倍体幹細胞スクリーニングにおいて、フコシル化がリシン毒性の主要な経路であることがわかった。フコシル化は非常に興味深い。なぜならこの経路がこれまでリシン毒性と関連づけられたことはまったくないからである。われわれは、基質として機能するが、それと同時にヒト細胞の中でフコシルトランスフェラーゼを抑制する小分子を調べた。HL-60を2F-ペルアセチル-フコース(Rillahan他、2012年の中の化合物2。合成情報に関しては付録を参照)で3日間処理した。
エピトープSSEA-1を有するフコースを染色した後、FACS分析を行なうと、われわれの細胞で用量に依存したフコシル化の喪失が実際に見られた。次に、前処理した細胞をリシンと阻害剤の両方の存在下で4日間増殖させた後、生存率と細胞数を調べた。フコース類似体で前処理した細胞は毒素ストレスの存在下で生存率が顕著に上昇していたことから、リシン毒性におけるフコシル化の役割がヒト細胞でも確認された。さまざまな分子と化合物(例えば2-デオキシ-D-ガラクトース)が哺乳動物のさまざまなフコシルトランスフェラーゼFucTIII、V、VI、VIIを特異的に抑制することが以前からわかっており(Buechsel他、1980年、Burkart他、2000年;Lee他、2003年、Hosoguchi他、2010年;Rillahan他、2012年)、リシン毒性の効果を低下させるのに使用できる。
一倍体バックグラウンドでの遺伝子スクリーニングにより、数千個の遺伝子を同時に分析することが可能になった。しかしスクリーニングの結果を評価し、遺伝子セットの生体内での機能をさらに研究するには、動物モデルが貴重なツールとして役立つため、動物モデルを作製した。最近、さまざまな単為生殖マウスと雄性生殖マウスの一倍体ESCが、遺伝子操作の後でさえ生殖系に寄与することが示された(Li他、Nature、2012年)。これによってわれわれが目指したマウス一倍体幹細胞を直接用いて生体内表現型の研究を行なう可能性が生まれる。キメラマウスの作製に胚盤胞幹細胞を注入する従来法とは別に、一倍体幹細胞を用い、細胞質内注入によって減数分裂II卵母細胞を直接受精させることができる(セミクローニング)。こうすることで、ドナー一倍体ESCの遺伝材料を子孫に伝達することができる。われわれの一倍体幹細胞の多能性の最適なエピジェネティック状態を維持または再獲得するのに適切な条件は、GSK3とMEKキナーゼの活性を化学的に抑制することによって実現できた(2i培地)。セミクローニングにより、ノックアウト系または入手可能な一倍体幹細胞系を使用し、この明細書に記載した一倍体幹細胞遺伝学を利用して新規遺伝子を同定することだけでなく、これら突然変異クローンを生体内マウス実験に直接“移す”こともできる。
Burkart他(2000年)Bioorganic & Medicinal Chemistry 第8巻、1937〜1946ページ、
Buechsel他(1980年)Eur. J. Biochem. 第111巻、445〜453ページ、
Bryja他(2006年)Nat. Protoc. 第1巻、2082〜2087ページ、
Carette他(2009年)Science第326巻、1231〜1235ページ、
Carette他(2011年)Nat. Biotechnol. 第29巻、542〜546ページ、
Carette他(2011年)Nature第477巻、340〜343ページ、
CavaleriとScholer (2003年)Cell第113巻、551ページ、
Evans他(1981年)Nature第292巻:154〜156ページ、
Fellmann他(2011年)Mol. Cell. 第41巻、733〜746ページ、
Hartwell他(1974年)Science第183巻、46〜51ページ、
Hosoguchi他(2010年)J. Med. Chem. 第53巻、5607〜5619ページ、
Kaufman他(1983年)J. Embryol. Exp. Morphol. 第73巻、249〜261ページ、
Krotz他(2010年)J. Assist. Reprod. Genet. 第27巻(12):743〜750ページ、
Latham他(2002年)Biol. Reprod. 第67巻、386〜392ページ、
Lee他(2003年)J. Am. Chem. Soc. 第125巻、9588〜9589ページ、
Leeb, M.、Wutz, A.(2011年)Nature第479巻(7371):131〜134ページ、
Li他(2012年)Nature第490巻(7420):407〜411ページ、
Lorthongpanich他(2010年)Int. J. Dev. Biol. 第54巻(11〜12):1631〜1640ページ、
Martin(1981年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第78巻:7634〜7638ページ、
Mitsui他(2003年)Cell第113巻、643ページ、
Nagy他(2008年)CSH Protoc. 2008, pdb prot4706、
Otaegui他(1999年)Cloning 第1巻、111〜117ページ、
Otto他(2001年)Science第292巻、2441〜2443ページ、
Pollard他(2006年)Methods Enzymol. 第418巻、151〜169ページ、
Schnutgen他(2008年)Nucleic Acids Res. 第36巻、e133ページ、
Ready M.他(1984年)J. Biol. Chem. 第259巻(24):15252〜15256ページ、
Rillahan他(2012年)Nature Chemical Biology (第8巻):661〜668ページ、
Simmons他(1985年)Anal. Biochem. 第146巻、206〜210ページ、
Walker他(2010年)Cell Stem Cell第6巻、153〜166ページ、
Walker他(2007年)Cell Stem Cell第1巻、71〜86ページ、
Wu他(2011年)Stem Cells第29巻(5):755〜763ページ、
Zuber他(2010年)Nat. Biotechnol. 第29巻、79〜83ページ、
Zuber他(2011年)Nature第478巻、524〜528ページ、
Elling他(2006年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA第103巻、16319〜16324ページ、
Takahashi他(2006年)Cell第126巻、663〜676ページ、
Chambers他(2003年)Cell第113巻、643〜655ページ、
Thomson他(1988年)Genes Dev. 第2巻、1344〜1351ページ、
Thomson他(1995年)Proc. Natl. Acad. Sci. USA第92巻:7844〜7848ページ、
Chong他(2008年)J. Exp. Med. 第205巻、2005〜2017ページ、
Wang他(2007年)Nat. Genet. 第39巻、380〜385ページ、
Yan他(2000年)Nature第403巻、723〜724ページ、
Yi他(2009年)Science第326巻、430〜433ページ、
アメリカ合衆国特許第6,235,970号
アメリカ合衆国特許第7,592,175号
WO 2008/33469 A1
WO 2001/32015 A1
WO 2001/30978 A1
WO 2006/56615 A1
WO 2006/56617 A1
WO 2002/88353 A2
WO 2001/29208 A1
Elling他、Cell Stem Cell第9巻(6)(2011年):563〜574ページ、
Schimenti、Cell Stem Cell第9巻(6)(2011年):488〜489ページ、
WO 2012/117254 A1
Claims (40)
- 一倍体細胞の哺乳動物細胞系を生成させる方法であって、
発生において塊になっている胚段階、好ましくは胚盤胞段階にある複数の一倍体細胞を取得し、
その複数の一倍体細胞から細胞を単離し、
その複数の一倍体細胞から単離した細胞を増殖させ、
その増殖させた細胞から一倍体ゲノムを持つ1個以上の個別の細胞を選択して単離し、それによって、安定な一倍体細胞の細胞系の細胞を取得することを含む、方法。 - 前記哺乳動物の一倍体単為生殖卵母細胞または胚性細胞を取得するステップと、その卵母細胞または胚性細胞を偽妊娠雌に移すステップと、その卵母細胞または胚性細胞を多細胞段階へと増殖させるステップと、必要に応じてその多細胞段階の細胞を培養して胚盤胞段階にすることにより、発生において塊になっている胚段階にある前記複数の一倍体細胞を提供するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞培養物の前記細胞を培養し、50継代までの後にその細胞培養物から一倍体細胞を単離し、その単離した一倍体細胞を新たに継続する細胞培養物として増殖させることをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 親細胞がヘテロ接合またはホモ接合であり、好ましくはヘテロ接合である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 単為生殖の桑実胚または胚盤胞に由来する多能性一倍体胚性幹細胞系を生成させる方法であって、
(a)被験雌からの未受精の卵母細胞をインビトロで活性化させて単為生殖を誘導し;
(b)ステップ(a)で活性化された卵母細胞を培養して桑実胚および/または胚盤胞を生成させ;
(c)ステップ(b)の桑実胚および/または胚盤胞から胚性幹細胞を単離し、必要に応じてその胚性幹細胞を、その胚性幹細胞の分化を抑制する細胞培地に移し;
(d)ステップ(c)の胚性幹細胞をFACS分析し、一倍体DNAを含む胚性幹細胞を同定し、および/または豊富にし;
(e)必要に応じ、一倍体DNAを含む胚性幹細胞のFACS精製とその胚性幹細胞の増殖を繰り返し、それによって一倍体胚性幹細胞系を生成させること
を含む、方法。 - ステップ(a)の前記未受精の卵母細胞が、インビトロで成熟した卵母細胞である、請求項5に記載の方法。
- ステップ(a)の卵母細胞をエタノール(5%が好ましい)または塩化ストロンチウム(SrCl2)(25 mMが好ましい)に曝露することによって活性化させる、請求項5または6に記載の方法。
- ステップ(d)および/または(e)を少なくとも5回繰り返す、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物の前記被験雌または前記細胞を、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、マカク属(例えばカニクイザル、アカゲザル)、カリスリクス属または大型類人猿(例えばゴリラ、チンパンジー、オランウータン))、マウス、ラット、ヤギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ラクダの中から選択することが好ましい、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞が、細胞周期のG1期に1n染色体セットを持ち、G2期に2n染色体セットを持つことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の生成した胚性幹細胞の少なくとも60%が一倍体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞が、胚性幹細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ、Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Rex1、Klf2、cMyc、Sall4、SSEA-1のうちの1つ以上の発現を特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞が、少なくとも50継代にわたって安定な増殖を示す、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞が、少なくとも7継代にわたって一倍性を維持する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞を分化させることをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞系の一倍体胚性幹細胞の遺伝子を改変することをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 内部細胞塊の培養によって、またはその内部細胞塊または栄養芽層または胚盤胞の成長に由来する細胞の培養によって細胞を維持することを含むか、前記複数の細胞の単離に、多細胞段階の細胞(例えば胚盤胞全体)の個別化を好ましくは多細胞段階、好ましくは胚盤胞のトリプシン処理によって実施することを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 個別の細胞を増殖させて細胞培養物にする(サブクローニング)、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を、好ましくは支持層の上で維持した後に、無支持細胞培養条件で維持するか増殖させる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法によって生成した、桑実胚または胚盤胞に由来する胚性幹様細胞系。
- 少なくとも60%の一倍体胚性幹細胞を含む、桑実胚または胚盤胞に由来する胚性幹様細胞系。
- 桑実胚または胚盤胞に由来する請求項20または21の胚性幹様細胞系を含む試験系またはキット。
- 胚盤胞に由来する前記胚性幹様細胞が、胚盤胞の内部細胞塊(ICM)に由来する、請求項20または21に記載の胚性幹様細胞。
- 胚盤胞に由来する前記胚性幹様細胞が、栄養芽層、好ましくはOct4を過剰発現している栄養芽層に由来する、請求項20または22に記載の胚性幹様細胞。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法によって得ることが可能な一倍体ゲノムを有する細胞からなる細胞培養物。
- 一倍体ゲノムを有する細胞、好ましくは哺乳動物の細胞を提供することを含む、突然変異の分析方法であって、突然変異をその細胞の興味の対象である遺伝子座に導入し、その細胞でその遺伝子座に関係する変化した活性を観察する操作を含む、方法。
- 前記細胞が、少なくとも10継代にわたって一倍体の形態で安定であり、好ましくは、その細胞は、請求項1〜19のいずれか1項の方法によって得ることが可能であるかまたは得られる、請求項26に記載の方法。
- 対象である1個以上の遺伝子が不活性化されている、請求項25に記載の細胞培養物の細胞。
- 遺伝子Droshaおよび/またはRargのノックアウトを含む一倍体哺乳動物細胞であって、好ましくは、その細胞が、請求項25の細胞培養物の細胞である、一倍体哺乳動物細胞。
- 対象である表現型を含む細胞を生成させる方法であって、
一倍体ゲノムを有する複数の細胞、好ましくは哺乳動物の細胞、特に好ましくは請求項1〜19のいずれか1項の方法によって得ることが可能であるかまたは得られる細胞をランダムに突然変異させ、
前記の対象の表現型を有する細胞を選択すること
を含む、方法。 - 対象である前記表現型が、前記細胞を毒素または増殖阻害剤と接触させたときの細胞の生存または細胞の増殖である、請求項30に記載の方法。
- 前記毒素がリシンである、請求項31に記載の方法。
- 前記複数の細胞が少なくとも1000個の細胞を含む、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項30〜33のいずれか1項に記載の方法によって得ることができて、毒素、好ましくはリシンに対する耐性を持つ一倍体細胞。
- 細胞で毒素耐性の活性を有する遺伝子標的をスクリーニングする方法であって、
請求項31〜33のいずれか1項に記載の毒素耐性を有する細胞を生成させ、
前記ランダム突然変異のない細胞と比較した、毒素耐性を有するそれら細胞における突然変異を同定することをさらに含む、方法。 - 毒素に対する治療薬を同定する方法であって、請求項35に記載の遺伝子標的を同定し、その遺伝子標的、またはその遺伝子標的の遺伝子産物に治療候補分子を好ましくは単離した細胞内で接触させ、その候補と前記遺伝子標的または遺伝子産物との結合イベント、または前記毒素に対する前記細胞の改変された耐性を同定することを含む、方法。
- 前記毒素がリシンであり、好ましくは前記遺伝子標的の選択が、Gpr107、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2、Ggtalの中からなされる、請求項36に記載の細胞。
- 対象におけるAB5毒素の中毒、好ましくはリシン中毒を治療する方法、または対象においてAB5毒素またはリシンに対する耐性を誘導する方法であって、
表1または表2の遺伝子、好ましくはGprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2、Ggtalのうちの任意の1つを前記対象において抑制することを含み、好ましくは、その抑制は、阻害剤の投与、特に表1または表2の遺伝子、好ましくはGprl07、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galtl、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2、Ggtalいずれかの遺伝子産物のうちの任意の1つに特異的な抗体の投与、または阻害性核酸、特にsiRNAまたはshRNAを含むかコードしている阻害性核酸、特に好ましくは細胞内で前記遺伝子のmRNAを少なくとも20%、特に少なくとも50%減少させる阻害性核酸の投与によってなされる、方法。 - AB5毒素、特にリシンに対する耐性が増大した改変細胞であって、表1または表2の遺伝子、好ましくはGpr107、Fut9、Tcf711、Slc35cl、Fgfr2、Galnt2、Mid1、B4galt1、B4galnt3、Plcd3、Ror2、Samd4b、Gcnt2、Ggta1、またはこれらの組み合わせのうちの任意の1つの発現が、前記毒素に対する耐性の増大がない非改変細胞と比べて低下している改変細胞。
- AB5毒素の中毒、好ましくはリシンまたはシュードモナス外毒素Aの中毒を治療する方法であって、フコシル化阻害剤、好ましくは小分子フコシル化阻害剤を投与する操作を含んでいて、特に好ましくは前記阻害剤がFut9および/またはSlc35clを抑制する、方法。
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Non-Patent Citations (3)
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CELL, (1993), VOL. 73, P. 643-658, JPN6016038516 * |
J. EXP. MED., (2008), VOL. 205, NO. 9, P. 2005-2017, JPN6016038513 * |
NATURE, (2011), VOL. 479, P. 131-134, JPN6016038509 * |
Cited By (4)
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---|---|---|---|---|
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CN108138138B (zh) * | 2015-07-29 | 2023-11-14 | 纽约干细胞基金会有限公司 | 单倍体人胚胎干细胞系和体细胞系及其制备方法 |
US12091678B2 (en) | 2015-07-29 | 2024-09-17 | New York Stem Cell Foundation, Inc. | Haploid human embryonic stem cell lines and somatic cell lines and methods of making the same |
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