CN108138138B - 单倍体人胚胎干细胞系和体细胞系及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了单倍体人胚胎干细胞和细胞系、单倍体多潜能人细胞及单倍体分化的人细胞。另外，提供了制备和使用单倍体人细胞的方法。

Description

单倍体人胚胎干细胞系和体细胞系及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年7月29日提交的美国序列号62/198,614、2016年1月15日提交的美国序列号62/279,490及2016年2月8日提交的美国序列号62/292,755的优先权权益，这些专利的全部内容以引用的方式整体并入本文。
序列表的合并
所附序列表中的材料据此以引用的方式并入本申请。所附序列表文本文件以名称NYSC1270_3WO_Sequence_Listing创建于2016年7月27日，且大小为2kb。该文件可使用采用Windows OS的计算机上的Microsoft Word来评价。
发明背景
二倍性是哺乳动物中的基本遗传特征，其中单倍体细胞通常仅作为减数分裂后生殖细胞而出现，这些减数分裂后生殖细胞用于确保受精之后的二倍体基因组。配子操纵产生了来自若干哺乳动物物种的单倍体胚胎干(ES)细胞，1–6但在本方明之前，不是来自人。
单倍体遗传学是一种用于勾画基因组功能的有用的工具，且单倍体哺乳动物细胞通过功能丧失遗传筛选被证明是无价值的，因为单个等位基因突变足以诱导表型。7单倍体人ES细胞系的衍生可能受到人卵母细胞的有限利用度的阻碍。10因此，在人中，功能丧失筛选至今为止已通过近单倍体慢性骨髓性白血病细胞系30及其衍生细胞得到促进。31虽然有用，但它们是代表单一细胞类型的染色体异常的癌细胞。从这点上讲，利用单倍体人ES细胞用于遗传筛选的益处依赖于以下前提：它们的基因组稳定性、它们为人早期发育建模的能力以及它们产生实际上任何目标细胞类型的潜力。
虽然成簇规律间隔的短回文重复(CRISPR)/Cas9介导的诱变的不断提高的效率可促进二倍体细胞中的功能丧失筛选，但各等位基因受到不同的影响，使得单倍体基因组中的功能基因破坏更为有效。32,33然而，尽管CRISPR/Cas9的使用需要预设计的单导向RNA(sgRNA)，但倾向性少的诱变方法(如基因捕获方法)可容易应用于单倍体，而非二倍体细胞以供功能丧失筛选。7
在整个进化过程中，哺乳动物基因组已通过二倍性依赖性自适应如亲本印记得到巩固，这限制了单倍体单亲本胚胎的发育。尽管如此，单倍体细胞还是能够在某些动物物种中指导发育。34单倍体人基因组的惊人的分化潜力提示二倍性依赖性自适应，而非单倍性，可造成人发育的主要障碍。我们关于单倍体人ES细胞的发现因此提供了勾画人遗传学和发育的基本方面的新型手段。
发明概要
未受精的中期II(MII)人卵母细胞的人工活化造成向胚泡期的有效发育及随后单性生殖ES(pES)细胞系的衍生。13–15虽然在MII中的第二极体挤出产生单倍体卵，但这些ES细胞一直被报道为二倍体。产生并分析来源于单倍体卵母细胞的人单性生殖ES细胞系集合，导致成功地分离并维持具有正常单倍体核型的人ES细胞系。单倍体人ES细胞展示多能性干细胞特征，如自我更新能力和多能特异性分子标签。然而，使用基因捕获的单倍体人ES细胞文库论证了这些细胞作为用于功能丧失遗传筛选的平台的效用。
然而，单倍体人ES细胞还展示了来自它们的二倍体配对物的独特性质，包括X染色体失活与氧化磷酸化中涉及的基因的差异调节，同时在绝对基因表达水平与细胞大小方面的减小。惊人的是，发现单倍体人类基因组在体外和体内不仅与未分化多能状态相容，而且与代表所有三个胚胎生殖细胞层的分化的体细胞命运相容，尽管在常染色体与X染色体之间存在持续的剂量失衡。单倍体人ES细胞提供了用于研究人类功能基因组及发展的新型手段。
在一个实施方案中，本发明提供了一种单倍体人ES细胞在培养物中的富集群，及一种优选地在培养基中包含单倍体人ES细胞的富集群的组合物。
本发明还提供了一种用于产生单倍体人ES细胞的富集群的方法，所述方法包括在来自ES细胞群的样品中鉴别单倍体中期，其中所述ES细胞衍生自人工活化的人卵母细胞；及基于细胞倍性分选ES细胞群以产生单倍体人ES细胞的富集群。在一些实施方案中，所述方法还包括将ES细胞的富集群维持在培养物中至少三代。优选地，样品中的单倍体细胞是通过中期散布分析或分选具有小于2个染色体拷贝的细胞来鉴别。在一些实施方案中，基于细胞倍性的分选步骤包括流式细胞术(优选地，荧光激活细胞分选(FACS))的至少一个循环。单倍体细胞还可通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色或DNA荧光原位杂交(FISH)来鉴别。
优选地，富集群包含至少5％单倍体人ES细胞。
另一方面，本发明提供一种在培养物中的基本上纯的单倍体人ES细胞群，及一种优选地在培养基中包含基本上纯的单倍体人ES细胞群组合物。
本发明的又一方面提供一种用于产生基本上纯的单倍体人ES细胞群的方法，所述方法包括在来自ES细胞群的样品中鉴别单倍体中期，其中ES细胞衍生自人工活化的人卵母细胞；及使用FACS的2-5个循环，基于细胞倍性分选所述ES细胞群；由此产生基本上纯的单倍体人ES细胞群。优选地，样品中的单倍体细胞通过中期散布分析或分选具有小于2个染色体拷贝的细胞来鉴别。单倍体细胞还可通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色或DNAFISH来鉴别。
优选地，基本上纯的群包含至少95％单倍体人ES细胞。
本发明另外提供了一种用于产生单倍体人ES细胞系的方法，所述方法包括通过本发明方法产生单倍体人ES细胞的富集群；将单倍体人ES细胞的富集群维持在培养物中；及每三至四代分选培养物中的ES细胞，其中所述分选是基于细胞倍性；由此产生单倍体人ES细胞系。
本发明提供了通过本发明方法产生的单倍体人ES细胞系。
本发明的其它实施方案包括在培养物中的单倍体多潜能人细胞群及包含单倍体多潜能人细胞群的组合物。
本发明的另一实施方案为一种用于产生单倍体多潜能人细胞群的方法，所述方法包括在定向分化的条件下培养单倍体人胚胎干细胞，由此产生单倍体多潜能人细胞群。
另一方面，本发明提供了一种用于产生单倍体多潜能人细胞群的方法，所述方法包括在诱导胚状体形成的条件下培养单倍体人ES细胞；及将所述胚状体解离成细胞；由此产生单倍体多潜能人细胞群。在一些实施方案中，所述方法还包括基于细胞表面标记分选所解离的细胞。在一些实施方案中，所述分选包括FACS。
优选地，单倍体多潜能人细胞群为基本上纯的群。在一个实施方案中，单倍体多潜能人细胞群包含内胚层祖细胞。在一个实施方案中，单倍体多潜能人细胞群包含中胚层祖细胞。在一个实施方案中，单倍体多潜能人细胞群包含外胚层祖细胞。在一个实施方案中，单倍体多潜能人细胞群包含神经祖细胞。
本发明提供了一种在培养物中的单倍体分化的人体细胞群，及一种包含单倍体分化的人体细胞群的组合物。本发明还提供了一种用于产生单倍体分化的人体细胞群的方法，所述方法包括在定向分化的条件下培养单倍体人ES细胞，由此产生单倍体分化的人体细胞群。本发明还提供了一种用于产生单倍体分化的人体细胞群的方法，所述方法包括在诱导畸胎瘤形成的条件下将单倍体人ES细胞注射到非人哺乳动物中；及将所述畸胎瘤解离成细胞；由此产生单倍体多潜能人细胞群。
优选地，单倍体分化的人体细胞选自由以下组成的组：神经元、心肌细胞、胰腺细胞、皮肤细胞、肌细胞、肾细胞、肝细胞、肺细胞及肠细胞。
本发明的又一方面为一种遗传筛选方法，所述方法包括将人单倍体ES细胞的富集群暴露于诱变剂以在细胞中诱导至少一种突变；在富集群中选择含有所述突变的人单倍体ES细胞；及鉴别人单倍体ES细胞中的突变的基因型和/或表型效应。在一个实施方案中，遗传筛选为正向遗传筛选。在一个实施方案中，诱变剂选自由以下组成的组：物理诱变剂、化学诱变剂及生物试剂。优选地，诱变剂为生物试剂，更优选地，为载体。
又一方面，本发明提供了一种基因修饰的人单倍体ES细胞群。类似地，另一方面，本发明提供了一种基因修饰的人单倍体多能细胞群。仍另一方面，本发明提供了一种基因修饰的或人单倍体分化的体细胞群。在这类实施方案的每个中，基因修饰的人单倍体细胞(即，ES细胞、多能细胞或分化的体细胞)含有至少一种人工引入的突变。另一方面，本发明提供了一种所述基因修饰的人单倍体细胞(即，基因修饰的ES细胞、多能细胞或分化的体细胞的文库)的文库，例如像基因捕获文库，其中所述文库包含多个不同的人工引入的突变。在涉及基因修饰的人单倍体细胞的实施方案的每个中，突变可通过用选自由以下组成的组的诱变剂处理人单倍体细胞来引入：物理诱变剂、化学诱变剂及生物试剂。类似地，在这些实施方案的每个中，基因修饰的单倍体细胞可任选还包含一个或多个标记或报道基因，例如与人工引入的突变有关。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅彩色绘制的附图。在提出请求并交纳必要费用的情况下，可以由局方提供该具有彩图的专利或专利申请公报的副本。
图1a-1g示出了单倍体人ES细胞系的衍生。图1a示出了单性生殖卵母细胞活化及在所产生的ES细胞系中的潜在单倍性的示意图。在未经受精下MII中的第二极体(PB)挤出产生单倍体1-细胞期胚胎且单倍体细胞由于二倍体化而逐渐被除去。图1b示出了理论二倍体化概率为10％的单倍体卵的二倍体化速率模型，与指数衰减拟合重叠(红色曲线)。指示了不同ES细胞系衍生阶段的大致细胞周期数。图1c示出了在1c-细胞的反复分选和富集之后单倍体富集的人ES细胞系h-pES10的建立。c：染色体拷贝。从上到下：未分选的二倍体细胞、在第四次分选时的部分纯化的单倍体细胞及在第六次分选时的大部分纯化的单倍体细胞的DNA含量分布。图1d示出了在4轮单倍体细胞富集和扩增之前和之后pES10的二倍体和单倍体核型。图1e示出了通过流式细胞术在7个传代中的h-pES10的二倍体化动力学，与数据的指数拟合重叠(红色曲线)。误差棒表示标准偏差(s.d.)。图1f示出了DNA FISH且图1g示出了在单倍体富集的和未分选的二倍体pES10细胞中的着丝粒染色。放大插图示出了具有单或双杂交信号(图1f)及分别23或46个着丝粒(图1g)的代表性单倍体和二倍体核。白色箭头指向二倍体核。比例尺＝10μm。
图2a-2i示出了单倍体人ES细胞展示多能性干细胞的经典特征且能够实现功能丧失遗传筛选。图2a示出了单倍体富集的和匹配二倍体细胞系的集落形态。比例尺为50μm。图2b示出了h-pES10和h-pES12的碱性磷酸酶染色。比例尺＝50μm。图2c示出了在集落分辨率(上图；比例尺＝50μm)和单细胞分辨率(下图；比例尺＝10μm)下在h-pES10中的多能性标记(红色)、着丝粒(绿色)和DNA(蓝色)的共染色。放大插图示出了具有23个着丝粒的代表性单倍体细胞。图2d示出了在针对G1中的单倍体细胞的选通之后，通过共染色DNA和细胞表面标记TRA-1-60和CLDN6的h-pES10的流式细胞术分析。图2e示出了在G1中的单倍体(1n)和二倍体(2n)pES10和pES12细胞的多能基因的平均表达水平±s.d.(对于各组，n＝4，每个细胞系有两个生物平行测定(replicate)，对数尺度)。RPKM：每百万作图片段每千碱基的读数。图2f示出了在G1中的一式两份的单倍体(1n)和二倍体(2n)pES10和pES12细胞以及对照成纤维细胞(Fib)在多能基因下的DNA甲基化水平。图2g示出了在单倍体人ES细胞中的全基因组基因捕获的示意概图及针对6-TG抗性基因的筛选。图2h示出了在3个6-TG-抗性克隆中检测的NUDT5插入物(红色箭头)。上图示出了基因结构。下图示出了内含子插入位点(由TTAA所示)和上游外显子序列(在框中)的基因组序列。图2i示出了导致经由NUDT5介导的PRPP产生的6-TG毒性的代谢途径的示意图。ADP：腺苷二磷酸；AMP：腺苷一磷酸。
图3a-3j示出了单倍体和二倍体ES细胞的分子和细胞比较。图3a示出了用于比较分析的单倍体和二倍体ES细胞分离的实验方案。图3b示出了与2n pES12-衍生的胚状体(EB)样品相比，在G1的等基因单倍体(1n)和二倍体(2n)细胞的基于RNA-Seq的分级聚类分析(每细胞系两个生物平行测定)。图3c示出了在单倍体对比二倍体ES细胞中在常染色体和X染色体上的相对下调和上调基因的饼形图表示。图3d示出了通过X染色体基因的分级聚类分析。图3e-3h示出了在单倍体和二倍体ES细胞中的差别X染色体失活(XCI)状态。图3e示出了全基因组基因表达移动中值图(相对于通过RNA-Seq在G1中的的二倍体的平均值，窗口大小＝100个基因)。图3f示出了XIST表达水平。(1)和(2)表示生物平行测定。图3g示出了H3K27me3染色。比例尺＝10μm。图3h示出了在X染色体上的DNA甲基化水平。图3i示出了在G1-分选的单倍体与二倍体ES细胞之间的相对总RNA、细胞体积及线粒体DNA(mtDNA)与基因组DNA(gDNA)的比率。平行测定的数量在括号中示出。误差棒代表s.d.。图3j示出了核(上图)和线粒体氧化磷酸化基因(下图)的平均表达水平±平均值标准误差(s.e.m.)，在单倍体ES细胞中相对于二倍体ES细胞下调(对于各组，n＝4，如图2e中)，及它们在此途径中结构的示意图。IMS：膜间间隙。*P<0.05；**P<0.01(双尾非配对Student t检验)。
图4a-4p示出了单倍体人细胞的分化潜力。图4a示出了来自单倍体富集的和二倍体pES12细胞的21天EB的代表性图像。比例尺＝100μm。图4b示出了从图4a中的单倍体富集的EB解离的细胞的单倍体核型(图10a中示出的铺板细胞)。图4c示出了h-pES10EB细胞的DNA含量分布。图4d示出了组织特异性和多能特异性基因在在G1-分选的单倍体(1n)和二倍体(2n)ES和EB pES10细胞)中的表达。图4e示出了NCAM1-阳性h-pES10-衍生的神经祖细胞(NPC)的DNA含量分布。图4f示出了神经特异性和多能特异性基因(分别在左图和右图)在G1-分选的单倍体pES10ES细胞和NPC中的表达。颜色编码的标度示出了相对于在NPC样品和ES细胞重复中的平均值的表达。图4g示出了在单倍体和二倍体pES10-衍生的EB和NPC中的差别XCI状态，如由全基因组基因表达移动中值图(窗口大小＝200个基因)所示。示出了在h-pES12-衍生的TUJ1-阳性神经元(图4h)、TNNT2-阳性心肌细胞(图4i)、FOXA2-阳性确定的内胚层细胞(图4k)及PDX1-阳性和NKX6.1-阳性PPC(图4l)中的着丝粒和分化标记共染色。放大插图示出了代表性单倍体和二倍体核。比例尺＝10μm。示出了分化为心肌细胞(图4j)和PDX1-阳性PPC(图4m)的h-pES12细胞的DNA含量分布。图4n示出了在h-pES12-衍生的畸胎瘤中的TUJ1(外胚层)、α-SMA(中胚层)、AFP(内胚层)及OCT4(多能性)染色。比例尺＝50μm。图4o示出了h-pES10-衍生的畸胎瘤的DNA含量分布。图4p示出了通过苏木精和曙红染色组织学(左图；比例尺＝20μm)和DNA FISH(右图；比例尺＝20μm)分析的连续h-pES12-衍生的畸胎瘤切片。放大插图示出了代表性单倍体核(比例尺＝5μm)。
图5a-5e示出了单倍体人ES细胞系h-pES12的衍生。图5a示出了在使用Hoechst33342染色对1c-细胞进行重复分选和富集之后由pES12细胞建立的单倍体富集的人ES细胞系。从上到下示出了未分选的二倍体细胞、在第三次分选时的部分纯化的单倍体细胞、及在第五次分选时的大部分纯化的单倍体细胞的DNA含量分布。c：染色体拷贝。图5b示出了在富集和传代过程中的核型和单倍体中期百分比。图5c示出了DNA FISH且图5d示出了在h-pES12中的着丝粒蛋白免疫荧光染色。放大插图示出了分别具有单杂交信号(图5c)和23个着丝粒(图5d)的代表性单倍体核。比例尺＝10μm。图5e示出了比较单倍体(1n)pES10和pES12细胞与它们的未分选的二倍体(2n)配对物(对数尺度)相的基于单核苷酸多态性(SNP)阵列的拷贝数变异(CNV)分析。
图6a-6f示出了通过着丝点(centromere foci)量化在单细胞水平下的倍性测定。图6a示出了与倍性相关的着丝粒的计数数目。1n：在第四次分选之后生长4代的单倍体富集的pES10细胞(n＝33；通过此测定法测定的76％单倍体)；2n：未分选的二倍体pES10细胞(n＝34)；3n：soPS2细胞35(n＝27)；4n：杂交1细胞36(n＝27)。黑色水平线表示平均值±s.e.m.且虚线标记出预期的染色体数目。图6b示出了通过图6a中的单倍体富集的(n＝152；通过此测定法测定的73％单倍体)和二倍体(n＝135)细胞中的DNA FISH对单倍体(1n)和二倍体(2n)细胞的量化。图6c示出了图6a中的单倍体富集的细胞的DNA含量分布(通过此测定法测定的73％单倍体)。c：染色体拷贝。着丝粒与磷酸组蛋白3(pH3，Ser10)(图6d)抑或5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)(图6e)的共染色区分了在单倍体pES12细胞中分裂间期的不同阶段。DNA染色以蓝色示出。比例尺＝5μm。图6f示出了在图6d和图6e中所示的不同细胞周期阶段中着丝粒计数的定量。以括号示出。黑色水平线表示平均值±s.e.m.。
图7示出了在单倍体pES12细胞中的多能性干细胞标记。示出了在集落分辨率(上图；比例尺＝50μm)和单细胞分辨率(下图；比例尺＝10μm)下在h-pES12中的多能性标记NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4及TRA-1-6(红色)、着丝粒(绿色)和DNA(蓝色)的共染色。放大插图示出了具有23个着丝粒的代表性单倍体细胞。
图8a-8e示出了在单倍体人单性生殖ES细胞中的亲本印记和基因捕获诱变的分析。图8a和图8b示出了二倍体(2n)体外受精(IVF)ES细胞及G1-分选的单倍体(1n)和二倍体单性生殖ES(pES)细胞通过印记基因的表达水平(n＝75，参见表6)(图8a)和在印记差异甲基化区域处的DNA甲基化水平(iDMR，n＝35)37(图8b)的分级聚类分析。(1)和(2)表示生物平行测定。图8c示出了在图8a(RPKM比率)中所示的样品中在7个染色体中的代表性父本表达的印记基因的相对平均表达水平±s.e.m.。图8d示出了在图8b中所示的样品中代表性父本甲基化和母本甲基化iDMR(通常在双亲本对照细胞中是中等甲基化的，且在单性生殖细胞中分别是甲基化不足和过度甲基化的)的平均DNA甲基化水平±s.e.m.。β值的范围从完全甲基化不足(0)至完全过度甲基化(1)。图8e示出了piggyBac基因捕获系统的示意概图。基因捕获载体52侧接有piggyBac反向末端重复(ITR)和FRT位点，并且携带5′剪接受体(SA)、内部核糖体进入位点(IRES)元件，继之以无启动子嘌呤霉素抗性基因(PuroΔtk)和3′聚(A)信号(pA)。在PiggyBac转座酶(在单独的质粒上编码53)存在下，基因捕获载体经历向基因组中的随机转座。向转录活性基因中的插入造成内源性转录物的截短及嘌呤霉素抗性的引入。ITR：反向末端重复；FRT：flox位点。
图9a-9i示出了等基因单倍体与二倍体人ES细胞的比较分析。图9a示出了在G1中的单倍体(1n)和二倍体(2n)ES细胞的分选纯度。图9b示出了在单倍体与二倍体人ES细胞之间的相对差异基因表达的对数标度的火山图，分成以下各图：所有基因(上)、常染色体基因(中)及X染色体基因(下)。Q：假发现率(FDR)。在单倍体细胞中的显著下调和上调基因(>2倍变化，Q<0.05)分别以红色和蓝色标记，且它们的总量在右侧示出。注意XIST是在单倍体细胞中最下调的转录物。图9c示出了所有表达的基因、所有表达的常染色体基因及所有表达的X染色体基因的1n/2n基因表达比率的平滑分布(表达阈值，平均RPKM>0.1)。图9d示出了通过表达微阵列分析得到的在G1中的单倍体与二倍体pE10细胞之间的基因表达比率的全基因组移动中值图(窗口大小＝100个基因)。图9e和图9f示出了如由差别XCI状态所推断的单倍体人ES细胞中的全基因组常染色体基因水平降低的模型。图9e示出了单倍体(Xa)和二倍体(XaXi)人ES细胞中的DNA含量、相对于总RNA的RNA表达水平、及绝对X染色体基因剂量的假定相等使得能够实现每单倍体细胞的总RNA水平的估计。Xa和Xi分别表示有活性(蓝色)和无活性的(红色)X染色体。A：常染色体；X：X染色体；R：总RNA。图9f示出了在图9e中所示的细胞中的相对和绝对RNA水平的示意性全基因组表示。图9g示出了G1-分选的单倍体和二倍体ES细胞的平均直径及计算的表面积和体积。误差棒代表s.d.(n＝4-8)。*P<0.01(双尾非配对Student t检验)。图9h和图9i示出了与二倍体ES细胞相比在单倍体ES细胞中相对下调基因和差异甲基化区(DMR)(图9h)以及相对上调基因(图9i)的功能注解富集分析。
图10a-10c示出了单倍体人ES细胞的EB分化。图10a示出了从h-pES12-衍生的21天EB解离的铺板细胞的代表性图像，其核型呈现于图4b中。比例尺＝100μm。图10b示出了衍生自单倍体富集的和二倍体pES12细胞的解离的EB的DNA含量分布。c：染色体拷贝。图10c示出了在未分化的(ES)和分化的(EB)G1-分选的单倍体(1n)pES10细胞中组织特异性和多能特异性基因的表达水平(RPKM)。
图11a-11i示出了单倍体人ES细胞的定向分化。图11a和图11b示出了在神经分化之后于h-pES10细胞中具有DNA和NCAM1共染色的流式细胞术分析。图11a示出了基于阴性第二抗体染色的对照样品(左图)对NCAM1-阳性细胞(右图)的选通。图11b示出了整个细胞群的DNA含量分布(与图4e有关)。c：染色体拷贝。图11c示出了在G1-分选的单倍体(1n)pES10ES细胞和NPC中神经特异性基因的表达水平(RPKM)。图11d示出了在单倍体和二倍体(2n)pES10-衍生的EB和NPC中的XIST表达水平。图11e示出了在h-pES12-衍生的神经元中的TUJ1染色。比例尺＝100μm。图11f示出了在图11e中所示的神经元上的DNA FISH。放大插图示出了分别具有单和双杂交信号的代表性单倍体和二倍体核。比例尺＝10μm。图11g示出了在G1-分选的单倍体pES12-衍生的心肌细胞中的TNNT2染色。比例尺＝10μm。图11h和图11i示出了在胰腺分化之后于h-pES10细胞中具有DNA和PDX1共染色的流式细胞术分析。图11h示出了基于阴性第二抗体染色的对照样品(左图)对PDX1-阳性细胞(右图)的选通。图11i示出了整个细胞群的DNA含量分布(与图4m有关)。c：染色体拷贝。
图12a和图12b示出了单倍体人ES细胞的体内分化。图12a示出了衍生自h-pES10和h-pES12的畸胎瘤的苏木精和曙红组织切片。比例尺＝50μm。图12b示出了在h-pES10-衍生的畸胎瘤中的TUJ1(外胚层)、α-SMA(中胚层)、AFP(内胚层)及OCT4(多能性)染色。DNA染色以蓝色显示。注意不存在核OCT4染色。比例尺＝100μm。
发明详述
本发明的许多方面描述于本专利申请的上述发明内容部分以及附图/图、附图/图的简要说明、及本专利申请的权利要求书部分。本详细说明部分提供与本发明有关的某些另外的说明且意图结合本专利申请的所有其它部分来理解。
本发明提供了在单倍体人卵母细胞活化之后的单倍体人单性生殖ES细胞系。对小鼠卵母细胞活化的早期研究已证实单倍性可能至少部分持续存在于所生成的胚胎的内细胞团(ICM)中。8,9尽管如此，二倍体细胞还是渐渐成为增加的细胞周期的主导，这是由于自发和不可逆的二倍体化事件(图1a)。9,16,17基于二倍体化动力学模型，我们估计即使二倍体化会在10个细胞周期中的1个中出现，但1％的ES细胞可在早期传代保持为单倍体(图1b)。为了对培养物中的ES细胞和早期胚胎细胞的二倍体化动力学建模，考虑以下定义和假设：
(1)如果Hn为在第n个细胞分裂周期的单倍体细胞的总数目，且p为在单个细胞分裂周期经历二倍体化的概率，则在第n个细胞分裂周期的二倍体化事件(d)的总数目为：
dn＝p·Hn-1
(2)在第n个细胞分裂周期的二倍体细胞(D)的总数目为：
Dn＝2Dn-1+dn
(3)在第n个细胞分裂周期的细胞(T)的总数目为：
Tn＝2Tn-1-dn
(4)且在第n个细胞分裂周期的单倍体分数(h)因此为：
简化起见，进一步假设：
(1)二倍体化由于失败的细胞分裂周期以恒定概率出现，产生一个二倍体子细胞，而非两个单倍体子细胞。
(2)正常细胞分裂周期产生两个子细胞，且平均是同步的。
(3)有利于单倍体或二倍体细胞的任何选择性优势可忽略，且不考虑细胞死亡和非整倍性的情况。
在所有100个细胞分裂周期中的此模型的模拟生成了图1b中绘出的数据点，拟合指数衰减函数。
单倍体细胞的出现率随时间降低的原因是在于二倍体基因组的逐渐且不可逆的获取，其出现率需要超过2,000个中期及在第4-10代的总计14个单性生殖ES细胞系的分析，以便允许以14％成功率建立两个单独单倍体ES细胞系。总的来说，利用四种独立方法，亦即中期散布分析、流式细胞术、FISH及着丝粒量化，以确定未分化和分化细胞中的倍性。
单倍体和二倍体人ES细胞享有许多相似性，包括经典多能性干细胞属性以及在体外和体内的多谱系分化潜力，并且不能基于它们的相对全基因表达谱来区分。关于非人单倍体ES细胞的其它研究大多数强调其相似性，我们的目的在于鉴别推定的转录、表观遗传及物理性质，这些性质将这两个倍性状态分开。在二倍体人ES细胞中容易观察到的XCI，19不出现在单倍体ES细胞中。值得注意地，XCI的缺失还延伸到最近的二倍体化的ES细胞，它们可稍后变成培养物中的XaXi。这些发现使我们推断在单倍体人ES细胞中的绝对基因表达水平的降低，一个未能在未分化小鼠ES细胞(其中XCI没有出现)中得出的结论。26这提示总转录补偿不是细胞活力的先决条件，只要常染色体平衡得到保留即可。相比之下，常染色体失衡基于人常染色体单体性的严格缺失而似乎不能容忍。27再者，单倍体:二倍体比率之间在物理参数如直径(～0.8)、表面积(～0.7)和体积(～0.6)上的差异暗示调节稳固性涉及特定的补偿机制。有趣的是，观察到涉及核与线粒体基因组之间的协调串话的氧化磷酸化中所牵涉的基因的细微但一致的相对上调，这可能是单倍体细胞中线粒体丰度的相对提高的反映。此稳固性可反映早期胚胎中更适合的调节期，特别是鉴于X染色体剂量及提高的氧化磷酸化活性，这都与早期植入前外胚层特性一致。28
显示单倍体人核型不是ES细胞分化的障碍。具体说来，显示单倍体人ES细胞产生神经祖细胞，而剩余单倍体，如也在小鼠中所观察到的2。然而，尽管小鼠研究显示单倍体细胞在进一步分化之后丢失，2,16但观察到人单倍体细胞特异化为所有三个胚胎胚层的体细胞命运，尽管在X染色体与常染色体之间有剂量失衡，保持从多能状态到分化状态。
本发明的单倍体人ES细胞是通过衍生自人工活化的人卵母细胞的ES细胞群的中期散布分析或次2c(其中“c”表示染色体拷贝数)细胞分选来鉴别。单倍体人ES细胞也可通过流式细胞术(优选FACS)、着丝粒蛋白免疫荧光染色或DNA FISH来鉴别。用于进行中期散布分析和次2c分选、着丝粒蛋白免疫荧光及DNA FISH的方法是本领域中已知的且在本文中描述。
人工活化方法是本领域中已知的且包括但不限于单性生殖活化和雄激素活化。单性生殖技术涉及使用电脉冲、钙离子载体、激酶抑制剂、翻译抑制剂或这些的组合对卵母细胞的活化。41雄激素技术涉及用精子对去核卵母细胞的受精，通常通过细胞质内精子注射。在卵母细胞受精之前或之后除去卵母细胞的基因组以产生仅含有精子基因组的细胞。卵母细胞可暴露于如用于单性生殖的活化刺激。
流式细胞术(包括FACS)可用于本发明的方法中以基于倍性、细胞表面标记或其它表型特征来鉴别和/或分选细胞。本领域中已知的其它细胞分选技术，例如磁性激活细胞分选(MACS)，也可用于本发明的方法中。
本发明的单倍体人ES细胞和细胞系可保持“在培养物中”，通过非限制性实例，这指的是标准人ES细胞生长条件。亦即，在含有补充有15％敲除血清替代物(KSR；Gibco,LifeTechnologies)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、青霉素和链霉素(分别为50单位mL–1和50μg mL–1)、0.1mMβ-巯基乙醇及8ng mL–1碱性成纤维细胞生长因子的敲除Dulbecco改良的Eagle培养基(Gibco,Life Technologies)的培养基中在凝胶包被的板中在停滞小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上的培养。细胞可维持在37℃和5％CO2下的湿润培养箱中并且使用无EDTA的胰蛋白酶溶液A每3–5天进行传代。优选地，单倍体人ES细胞维持在培养物中至少三代、至少四代、至少五代、至少七代、至少十代、至少二十代或至少三十代。优选地，单倍体人ES细胞维持在培养物中至少约十天、至少约二十天、至少约三十天、至少约四十五天、至少约六十天、至少约三个月、至少约四个月或至少约六个月。
本发明的“多能”单倍体人细胞为具有发育成多种但非所有细胞类型的潜力的祖细胞或干细胞。神经干细胞、造血干细胞和间充质干细胞是多能细胞的非限制性实例。本发明者已证实多能单倍体人细胞可从由单倍体人ES细胞分化的胚状体或通过单倍体人ES细胞向特定谱系的定向分化而产生。
术语“细胞系”是指可在培养物中生长许多代且可通过细胞分选富集单倍体细胞的细胞。根据本发明的一个实例，将细胞系在标准人ES细胞生长条件下培养且每3至5次传代通过分选偶尔富集单倍体级分。
如本文所用，术语“富集群”是指大于1％，优选大于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的单倍体细胞在总细胞群中的百分比。通常，富集群可在单个分选(如FACS)循环之后获得。
术语“基本上纯的”是指大于90％，优选大于91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的单倍体细胞在总细胞群中的百分比。最优选地，基本上纯的群为单倍体细胞的汇合群。
本发明的单倍体人细胞可用于例如发育学、遗传学及细胞生物学研究中以探究如单倍性对二倍性、X染色体失活、亲本印记及杂交的基本机制。因为单倍体人细胞可被工程化以具有所需纯合性和免疫原性性质，所以它们也适用于治疗目的，如在再生医学中。单倍体单性生殖ES细胞或单倍体分化的人细胞的基因组可潜在地用于人再生中，以替代卵母细胞的基因组。
重要的是，本发明的单倍体人细胞适用于遗传筛选、优选正向遗传学中。一个实例是在纯合子功能丧失筛选中鉴别各种疾病的靶标，且在药物筛选中鉴别用于治疗这些疾病的候选化合物。遗传筛选可包括使用诱变剂来将一个或多个突变引入单倍体人细胞中。适用于本发明中的诱变剂包括物理诱变剂，如电离辐射(X射线、γ射线、紫外线等)；化学诱变剂，如烷化剂；及生物试剂，如质粒、噬菌体或病毒载体。生物试剂的实例包括插入载体，例如基因捕获载体；和用于定点诱变的技术，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas9系统。
除非文中另外清楚指出，如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个”与“至少一个”可互换使用。
此外，“和/或”被视为有或没有其它的两个指定特征或组分的每个的具体公开。因此，如在短语如“A和/或B”中所用的术语“和/或”意图包括A和B、A或B、A(单独)及B(单独)。同样，如在短语如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意图包括以下：A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(单独)；B(单独)；及C(单独)。
除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Dictionary of Cell and Molecular Biology(第5版J.M.Lackie编著,2013)、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(第2版R.Cammack等人编著,2008)及Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology(第2版P-S.Juo,2002)可为技术人员提供本文使用的一些术语的一般定义。
单位、前缀和符号均按照Système国际单位系统(SI)接受的形式的表示。数值范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不限制本发明的各个方面或实施方案，它们可以通过整体参考说明书而获得。因此，通过参考整个说明书，下面将要定义的术语将得到更加充分的定义。
每当用词语“包含”描述实施方案时，包括按照“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方案。
本公开中所引用的所有参考文献据此以引用的方式整体并入。另外，在本文引用或提及的任何产品的任何制造商说明书或目录以引用的方式并入。以引用的方式并入本文中的文献或其中的任何教导都可用于本发明的实践。以引用的方式并入本文中的文献不承认为现有技术。
在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
实施例1.方法
人卵母细胞操纵和单性生殖ES细胞系衍生
人卵母细胞捐赠及pES和swaPS细胞系衍生程序先前已有描述。15,35简言之，使用钙离子载体和/或电脉冲活化成熟MII卵母细胞，之后是与嘌呤霉素一起的4小时培养。指示单倍性的极体挤出和单一原核的存在得到证实，且允许卵母细胞发育到胚泡阶段。在卵母细胞(其核基因组已与另一卵母细胞的核基因组交换)活化之后衍生出swaPS细胞。15ES细胞系是通过滋养外胚层的激光消融38且将10μM的ROCK抑制剂Y-27632添加至衍生培养基中而衍生出。35铺板之后2至3天，对剩余滋养外胚层细胞进行激光消融，且允许ICM细胞生长10-14天直到外生长的手工挑取是可行的。
细胞培养
除非另外陈述，将人ES细胞在包含补充有15％敲除血清替代物(KSR,ThermoFisher Scientific)、2mM l-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、50单位mL–1青霉素、50μg mL–1链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇及8ng mL–1碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的敲除Dulbecco改良的Eagle培养基的标准人ES细胞培养基中在生长停滞的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。细胞不含支原体并将其维持在37℃和5％CO2下的湿润培养箱中。使用无EDTA的胰蛋白酶溶液A(Biological Industries)在平缓的胰蛋白酶化作用下以机械方式或在添加10μM ROCK抑制剂Y-27632(Stemgent)下使用TrypLE Express(Thermo FisherScientific)以酶促方式进行传代持续1天或直到分裂后2天。单倍体ES细胞也可在无饲养细胞的条件下在mTeSR1(STEMCELL Technologies)或StemFitN.AK03(Ajinomoto)培养基中在Matrigel包被的板(Corning)上生长。外生长的快速扩增允许在早至第三代时单倍体ES细胞的分离。
单倍体人ES细胞系的分离和维持
通过中期散布分析或次2c细胞分选(表1和表2)鉴别第6-8代的人单性生殖ES细胞系中的单倍体细胞之后，通过分选1c细胞群来建立单倍体ES细胞系，其中二倍体细胞用作参照。每3-4代通过1c细胞分选的富集轮次进一步维持单倍体ES细胞培养物。
表1：通过中期散布分析鉴别早期传代人单性生殖ES细胞系中的单倍体细胞
细胞系pES1–6的衍生先前已报道。15,35
表2：通过次2c细胞分选从早期传代人单性生殖ES细胞系中分离单倍体细胞
*swaPS细胞为在卵母细胞(其核基因组已与另一卵母细胞的核基因组交换)活化之后衍生出的单性生殖ES细胞。35
中期散布分析
对于有丝分裂停滞的引入，将生长中的细胞在100ng mL–1秋水仙碱(BiologicalIndustries)存在下孵育40min，在37℃和5％CO2下直接添加到湿润培养箱中的培养基中。然后将细胞胰蛋白酶化，在室温下在1000RPM下离心并轻轻地重悬浮于37℃-温低渗溶液(2.8mg mL–1KCl和2.5mg mL–1柠檬酸钠)中，之后在37℃下孵育20-min。将细胞通过添加固定溶液(3:1甲醇:乙酸)来固定并在室温下孵育5min。在离心并重悬浮于固定溶液中之后重复进行固定至少三次。在玻片上制备中期散布并使用标准G-显带技术来染色。基于对至少80％分析的中期(每次分析最少20个中期)中的正常核型的观察，根据InternationalSystem for Human Cytogenetic Nomenclature(ISCN)确定核型完整性。
通过DNA含量的活ES细胞分选
将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，使用TrypLE Select或TrypLE Express(Thermo Fisher Scientific)解离，并在37℃下在人ES细胞培养基中用10μg mL–1Hoechst333422(Sigma-Aldrich)染色30min。离心之后，将细胞重悬浮于含有15％KSR和10μM ROCK抑制剂Y-27632的PBS中，经由70-μm细胞滤过器(Corning)过滤并在BD FACSAria III或BDInflux(BD Biosciences)中使用405nm激光来分选。对于继续生长，将分选的细胞用含有10μM ROCK抑制剂Y-27632的新鲜培养基铺板持续24小时。对于比较分析，将G1-期细胞从等基因单倍体富集的和未分选的二倍体培养物中分选。将经历最近培养物(在单倍体细胞富集之后的3代内)中的二倍体化的细胞通过分选单倍体富集的培养物中的G2/M-期峰来分离并与来自未分选的二倍体培养物的G2/M-期二倍体细胞相比较。注意到单倍体富集的培养物也是由G2/M-期单倍体与G1-期二倍体的混合群组成。通过经由仪器再运行分选样品的级分来证实分选纯度。
流式细胞术
基于具有Hoechst 33342染色的流式细胞术产生所有DNA含量分布。基于1c细胞的百分比及G1细胞关于细胞周期的其它期的相对贡献来估计单倍体细胞比例。二倍体化速率的估计是基于连续富集轮次之间的单倍体细胞比例以及通过在甲醇固定的及RNA酶处理的细胞中用碘化丙啶使用流式细胞术每次传代分析2-3个平行测定的DNA含量进行在全部7代(30天)中h-pES10二倍体化动力学的实验分析。通过将数据拟合至指数衰减曲线来估计二倍体化速率。对于DNA含量和细胞表面分子的同时流式细胞术分析，将细胞洗涤，解离并在10μg mL–1Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)和1:200稀释的缀合的抗体或第二抗体存在下于冰上孵育30min且之后与第一抗体一起孵育60min。对于DNA含量和细胞内PDX1的同时流式细胞术分析，将解离的细胞如免疫荧光程序中所述处理，其中Hoechst 33342用于DNA染色。第一抗体详述于表3中。在所有流式细胞术程序中，将样品经由70-μm细胞滤过器(CorningLife Sciences)过滤并在BD FACSAria III或BD Influx(BD Biosciences)中分析。
表3：实施例中使用的第一抗体
NA：不可用；IF：免疫荧光染色；FC：流式细胞术。
DNA荧光原位杂交
使用用于人染色体2和4的探针及用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的DNA染色如别处39所述进行DNA FISH。基于单或双杂交信号对每个核分别测定单倍性和二倍性。在分析之前将经历FISH的ES细胞在Matrigel包被的MATEK玻璃板上生长若干代。
碱性磷酸酶和免疫荧光染色
使用白细胞碱性磷酸酶试剂盒(Sigma-Aldrich)进行碱性磷酸酶染色。对于免疫荧光染色，将样品用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定10min，并透化处理并且在阻断溶液(在PBS中的0.1％Triton X-100和5％驴血清)阻断。将细胞与在阻断溶液中1:500稀释的第一抗体(表3)和第二抗体一起孵育，并将DAPI用于DNA染色。在固定及每次孵育步骤之后将细胞用PBS洗涤两次。使用Zeiss LSM 510Meta共焦显微镜获取图像。通过手动计数沿Z轴的个别平面上的着丝点进行着丝粒量化。使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行EdU染色。在分析之前将在图1g和图5d中经历着丝粒染色的ES细胞在Matrigel包被的MATEK玻璃板上生长若干代。
6-TG抗性筛选
为了生成基因捕获突变文库，使用Bio-Rad Gene Pulser(悬浮于800μL Opti-MEM中，4-mm小杯，320V，250μF)将4–5×106单倍体pES10细胞(在1c-细胞富集之后的1代内)的9个平行测定用20μg5′-PTK-3′基因捕获载体52和20μg pCyL43piggyBac转座酶质粒53共转染，并再铺板于含有DR3MEF和ROCK抑制剂Y-27632的100×20mm培养皿中。从转染后48小时开始，使用0.3μg mL–1嘌呤霉素进行针对向所表达的基因座中的插入物的选择，之后汇集于由大约16,000个抗性克隆表示的单一文库中。仅用5′-PTK-3′的转染被用作阴性对照。为了针对6-TG-抗性突变体进行筛选，将突变文库在6μM6-TG(Sigma-Aldrich)存在下在DR4MEF上生长18天，期间6个抗性克隆被独立分离并表征。提取基因组DNA(NucleoSpin TissueKit，MACHEREY-NAGEL)并如先前所述使用splinkerette PCR检测插入位点，54继之以PCR产物纯化和Sanger测序(ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems))。使用UCSC BLAT搜索工具将序列作图成人基因组(GRCh38/hg38)。
总DNA和RNA的分离
使用NucleoSpin组织试剂盒(MACHEREY-NAGEL)分离总DNA。根据制造商方案，使用Qiagen RNeasy试剂盒分离总RNA。为了测定每个细胞的总RNA水平，通过分别分选1c(单倍体G1)和4c(二倍体G2/M)群从相同培养物中分离单倍体和二倍体细胞。生长2代之后，收获细胞并计数，且从来自每个细胞系及倍性状态(pES10和pES12，单倍体和二倍体；总计12个样品)的400,000个细胞的三个重复中分离出RNA。使用NanoDrop量化RNA的量。
基因组完整性分析
根据制造商方案，使用Infinium Omni2.5Exome-8BeadChip单核苷酸多态性(SNP)阵列(Illumina)，对G1-分选的单倍体和二倍体pES10和pES12细胞的DNA样品进行拷贝数变异(CNV)分析(表4)。使用基因组Studio Genotyping Module(Illumina)来处理原始数据以获得log R比率值用于使用R统计编程语言的分析。
表4：通过SNP阵列和DNA甲基化阵列分析的样品
*M：DNA甲基化分析；S：SNP阵列分析
RNA测序
通过聚(A)+RNA的下拉就mRNA来富集总RNA样品(200ng–1μg，RNA完整性数目(RIN)>9)。根据制造商方案，使用TruSeq RNA Library Prep试剂盒v2(Illumina)制备RNA-Seq文库并使用Illumina NextSeq 500来测序以产生85bp单末端读数。
表5提供了通过RNA-Seq所分析的样品的详细列表。
表5：通过RNA-Seq所分析的样品
转录组分析
使用允许5个错配的TopHat(2.0.8b版)将RNA-Seq读数与人类参考基因组(GRCh37/hg19)比对。将每百万作图片段每千碱基的读数(RPKM)值使用Cuffquant来量化并使用Cuffnorm in Cufflinks(2.1.1版)来归一化以产生相对基因表达水平。使用Pearson相关及平均联接对RPKM值进行分级聚类分析。在单倍体和二倍体人ES细胞(在各组中n＝4)中相对于总RNA的差异基因表达分析通过两个补充策略如下进行：首先，我们使用具有默认参数的Cuffdiff，将在FDR<0.05下>2倍的差异视为显著性；其次，为了鉴别可能细微但一致的转录差异，我们测试了在某些组的所有平行测定中的最低表达水平高于其它组的所有平行测定中它们的最高表达水平的基因。然后通过双尾非配对Student t检验确定统计学显著性。通过DAVID(使用Benjamini方法来确定统计学显著性)完成功能注解富集分析。印记分析包括75个人印记基因(参见Geneimprint网站)，列举于表6中。来自对照ES细胞系NYSCF1的RNA-Seq数据在别处公开37(GEO登记号GSE61657)。在通过定底线至1并设定超过1的表达阈值来除去平均参照二倍体样品中不表达的基因之后，使用R程序包zoo(1.7-12版)生成全基因组基因表达移动中值图。来自不同组织的RNA-Seq数据撷取自Genotype-TissueExpression(GTEx)Portal。40图4d中的颜色编码标度对应于相对于组织(左侧标度)中及ES细胞重复和EB样品的各组(右侧标度)中的平均值的基因表达水平。通过使用Affymetrix人基因1.0ST阵列如先前41所述进行表达微阵列分析。
表6：用于分级聚类分析的印记基因
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DNA甲基化分析
使用Infinium HumanMethylation450BeachChips(Illumina)，遵循先前所述的Infinium HD甲基化方案对来自表4中详述的样品的基因组DNA进行DNA甲基化分析。37来自对照ES细胞系NYSCF1的DNA甲基化数据在(GEO登记号GSE61657)之前公开。37通过使用阵列归一化(SWAN)内的亚集组-分位数对数据进行处理和归一化并且使用R程序包ChAMP(1.4.0版)调节批次效应。如先前所述分析在与多能特异性基因和iDMR有关的CpG位点处的DNA甲基化水平。37对于X染色体上的DNA甲基化水平分析，滤除具有小于0.4的平均β值的探针。使用默认设置，通过ChAMP中的lasso功能完成DMR分析。然后将DMR通过接近度指派给基因并使用DAVID(使用Benjamini方法来确定统计学显著性)分析功能注解富集。
细胞大小分析
在G1中的单倍体和二倍体细胞群的分选之后，通过Countess Automated CellCounter(Invitrogen)测量单个活细胞的直径(2r)并且将它们的表面积和体积分别计算为4πr2和4/3πr3。分析包括分别针对1n pES10、1n pES12、2n pES10及2n pES12的7、4、8及4个技术平行测定。
线粒体DNA丰度分析
使用线粒体基因ND2的引物(正向引物：5′–TGTTGGTTATACCCTTCCCGTACTA–3′(SEQID NO:1)；反向引物：5′–CCTGCAAAGATGGTAGAGTAGATGA–3′(SEQ ID NO:2))，通过定量PCR(qPCR)分析相对mtDNA丰度并且通过使用核基因BECN1的引物(正向引物：5′–CCCTCATCACAGGGCTCTCTCCA–3′(SEQ ID NO:3)；反向引物：5′–GGGACTGTAGGCTGGGAACTATGC–3′(SEQ ID NO:4))如别处所述针对核DNA进行归一化。42使用具有PerfeCTa SYBR GreenFastMix的Applied Biosystems 7300实时PCR系统(Quanta Biosciences)进行分析。分析包括表4中详述的所有G1-分选的样品(对于各组n＝4，每个细胞系两个生物平行测定)。
所有高吞吐量数据都以登记号GSE71458保藏于Gene Expression Omnibus(GEO)。
胚状体分化
通过用无EDTA的胰蛋白酶溶液A(Biological Industries)分离ES细胞克隆来进行EB分化，之后重悬浮并进一步在低附着板上在无bFGF的人ES细胞培养基中进一步培养细胞聚集体。在1c-细胞富集之后的2代内开始单倍体ES细胞的分化。21天之后，在解离并在37℃下用10μg mL–1Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)染色30min之后，从G1中的未分选的和/或分选的EB细胞中提取EB RNA。对铺板于0.2％明胶上并在无bFGF的人ES细胞培养基中扩增的解离的EB细胞进行中期散布分析。
向神经祖细胞的分化
使用在稍微修改下的用于有效神经分化的10-天方案43获得NCAM1-阳性ES细胞衍生的NPC。44在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。通过用Hoechst 33342与1:200稀释的抗人NCAM-1/CD56第一抗体和Cy3-缀合的第二抗体(Jackson ImmunoresearchLaboratories)共染色，从G1中的分选的单倍体NCAM1-阳性细胞中提取RNA。
神经元分化
向神经元的分化是基于有修改的SMAD信号传导的协同抑制46通过遵循公开方案45如下进行：在1c-细胞富集之后的2代内开始分化，其中通过用无bFGF且含有10μMSB431542(Selleckchem)和2.5μM LDN-193189(Stemgent)的人ES细胞培养基替换培养基将完全汇合的ES细胞于Matrigel包被的板上在mTeSR1中培养4天。随后，将细胞保持在补充有10μM SB431542和2.5μM LDN-193189的N2培养基中45再持续4天，之后在补充有B-27(Thermo Fisher Scientific)和10μM DAPT(Stemgent)的N2培养基中持续2天。然后将细胞解离并在10μM ROCK抑制剂Y-27632(Selleckchem)存在下再铺板于0.01％聚-l-鸟氨酸-(Sigma-Aldrich)和层粘连蛋白包被的(4μg/ml，Thermo Fisher Scientific)板上，并且在无Y-27632的相同培养基中进一步培养接下来的4天。将神经元培养物维持在补充有B-27和20ng–1BDNF(R&D)的N2培养基中直到在第20天通过免疫染色和FISH进行分析。
心肌细胞分化
于Matrigel包被的板(Corning)上在mTeSR1(STEMCELL Technologies)中生长的80–90％汇合ES细胞经历基于分别用CHIR99021和IWP-2(Selleckchem)的连续GSK3和WNT抑制的11-天方案47。在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。在分化的第11天，对1c-细胞进行分选并铺板用于免疫染色。
向胰腺谱系的分化
基于若干近期的出版物开发了此处利用的方案。48–50通过使用STEMdiffDefinitive Endoderm试剂盒(Stemcell Technologies)将在无饲养细胞的条件下生长的ES细胞分化为定形内胚层持续3-4天。通过涉及用重组人KGF/FGF7(R&D Systems)、LDN-193189(Stemgent),KAAD-环杷明(Stemgent)及视黄酸(Stemgent)处理的逐步方案完成随后的特异化。在第8-11天，EGF(R&D System)被用于诱导胰腺祖细胞(PPC)。在1c-细胞富集之后的2代内开始分化。
畸胎瘤形成测定
动物中的所有实验程序都得到Hebrew University伦理委员会的认可。将ES细胞用胰蛋白酶消化并将大约2×106个细胞重悬浮于100μL人ES细胞培养基和100μL Matrigel(BD Biosciences)中，之后皮下注射到NOD-SCID Il2rg-/-免疫缺陷小鼠(JacksonLaboratory)中。注射之后8-12周，解剖肿瘤并经历进一步的分析。由使用Leica CM1850低温恒温器(Leica Biosystems，10-μm切片)低温保存在O.C.T.化合物(Sakura Finetek)中的肿瘤切片制备组织切片，继之以免疫染色、苏木精和曙红染色或FISH分析。对从新鲜解剖的肿瘤解离出的细胞进行伴有Hoechst 33342染色的流式细胞术。
实施例2.通过着丝点的量化测定单细胞水平下的倍性。
我们设计了一种基于着丝粒蛋白免疫荧光染色来测定单细胞分辨率下的倍性的方法。因为每个染色体通常具有一个着丝粒，所以推理出，能够检测和列举着丝粒将提供一种目测各个细胞中的倍性的手段，同时还允许通过对特异性标记的共染色来定义细胞特性。
首先在已知倍性的细胞系上测试此方法，所述细胞系包括单倍体富集的和二倍体pES10细胞、三倍体soPS2细胞35和四倍体杂交1细胞，36证明了倍性与着丝粒的计数数目之间的相关性(图6a)。着丝粒计数在染色体数目的预期范围内。76％的单倍体富集的细胞显示出15-25个着丝点，而剩余细胞显示出30-48个着丝点，类似于二倍体细胞(34-51)中记录的范围。重要的是，单倍体细胞的此百分比与通过DNA FISH(73％，图6b)和DNA含量流式细胞术(73％，图6c)估计的一致，说明着丝点量化是用于鉴别单倍体ES细胞的可靠方法。
计数着丝粒的准确度随着倍性增加而降低，这是由于着丝粒群集，由此可导致个别着丝粒实际数目的低估以及在单一细胞中计数大量着丝粒的困难。观察到超过预期数量的位点(foci)可由在罕见细胞中的视觉假象或非整倍性来解释。为了弄清细胞周期进程是否改变着丝点数目或影响它们的量化，就着丝粒蛋白和磷酸-组蛋白3(pH3，Ser10)或5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)(标记细胞分别进入有丝分裂并经历DNA复制)对单倍体ES细胞进行共染色，以便量化在细胞周期的不同阶段的着丝粒数目(图6d-6f)。显然，着丝点数目在DNA复制期间没有增加，证实了单倍体细胞可通过着丝粒染色在整个分裂间期被准确地检测。
实施例3.单倍体人ES细胞的衍生
生成并分析14个早期传代(传代≤9次)人pES细胞系集合的单倍体细胞的持久性。所有细胞系来源于展现第二极体挤出和单一原核的活化的卵母细胞。开始使用通过中期散布和G-显带的染色体计数作为一种用于明确和定量发现罕见单倍体核的方法。在10个单独pES细胞系中，低比例的单倍体中期排它地见于单一细胞系pES10中(1.3％，表1)。我们还使用在Hoechst 33342染色下的活FACS，目的在于将具有小于两个染色体拷贝(2c)的DNA含量的细胞与另外4个细胞系分离，由此实现单倍体细胞从第二细胞系pES12中的成功富集(表2)。
两个单独单倍体富集的ES细胞系是由在5至6轮1c-细胞FACS富集和扩增内的pES10和pES12(下文中称为h-pES10和h-pES12)建立(图1c(pES10)，图5a(pES12))。这些细胞系在标准培养条件下生长30代以上，同时包括具有正常单倍体核型的细胞(图1d，图5b)。然而，由于二倍体化以每天3–9％的细胞速率出现(图1e)，需要每3至4代的细胞分选用于维持和分析单倍体细胞。此外，在粘附条件下倍性的目测通过DNA荧光原位杂交(FISH)(图1f，图5c)及着丝粒蛋白位点的量化(图1g，图5d；图6)而实现。除了它们的完整核型之外，单倍体ES细胞不能携带相对于它们未分选的二倍体配对物的显著拷贝数量的变异(CNV)(图5e)。重要的是，未能观察到在将产生伪二倍体的两个细胞系中特定区域的共同复制。因此，在整个单倍体细胞分离和维持过程中基因组完整性得以保留。如所预期，单核苷酸多态性(SNP)阵列分析证明了在所有染色体中二倍体pES10和pES12细胞的完整纯合性。
h-pES10和h-pES12都展现经典的人多能性干细胞特征，包括典型的集落形态和碱性磷酸酶活性(图2a，图2b)。单一单倍体ES细胞表达不同的标志性多能性标记(NANOG、OCT4、SOX2、SSEA4及TRA1-60)，如通过着丝点量化(>95％单倍体)在基本上纯的单倍体培养物所证实(图2c，图7)。值得注意地，选择性流式细胞术使得能够验证两个人ES-细胞特异性细胞表面标记(TRA-1-60和CLDN618)在单一单倍体细胞中的表达(图2d)。然而，分选的单倍体和二倍体ES细胞显示出多能基因的高度相似的转录和表观遗传特征(图2e，图2f)。由于单倍体ES细胞衍生为孤雌生殖体，所以它们展示了母本印记的独特转录和表观遗传谱，因为不存在父本遗传的等位基因和父本表观遗传谱(图8)。
单倍体细胞对于功能丧失遗传筛选是有价值的，因为表型可选择的突变体可在单个等位基因破坏之后被鉴别。为了证明此原理在单倍体人ES细胞中的适用性，使用靶向转录活性位点的piggyBac转座子基因捕获系统生成全基因组突变文库(图2g，图8e)，并且就对嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤(6-TG)的抗性进行筛选。在六个分离和分析的6-TG-抗性克隆中，有三个携带定位在核苷二磷酸连接部分X-型基序5(NUDT5)常染色体基因处的基因捕获插入物(图2h)。最近证实NUDT5破坏通过对5-磷酸-d-核糖-1-焦磷酸(PRPP)的产生在上游发挥作用51赋予人细胞中的6-TG抗性，PRPP充当次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)介导的6-TG向一磷酸硫代鸟苷(TGMP)转化中的磷酸核糖基供体(图2i)。由于常染色体突变所致的功能丧失表型的检测证实了遗传筛选在单倍体人ES细胞中是可行的。
实施例4.单倍体与二倍体ES细胞的分子和细胞比较
人ES细胞作为单倍体和二倍体存在的能力引导我们研究这两个倍性状态是否可在基因调节和细胞生物学的某些方面上不同。为了分析在细胞周期相同时期中的单倍体和二倍体ES细胞，我们使用FACS来分离G1-期单倍体细胞(1c)并将它们与来自未分选的二倍体培养物的等基因G1-期二倍体细胞(2c)进行比较(图3a，图9a)。首先目的在于通过使用RNA测序(RNA-Seq)比较单倍体与二倍体ES细胞的转录组揭示推定的倍性相关差异，考虑到表达水平中观察到的变化将相对于各倍性状态的总基因表达，而非表示绝对差异。在基因组规模上，未分化单倍体与二倍体ES细胞紧密地彼此群集并且与分化的胚状体(EB)分离，表明相似性延伸超出遗传背景的影响(图3b)。然而，总共565个差异表达的基因被鉴别(>2倍变化，假发现率(FDR)<0.05)，对应于在单倍体中与二倍体相比275个相对上调基因和290个相对下调基因(图9b)。
值得注意地，X染色体基因在相对上调的基因集组中显著频繁表现(overrepresent)(40％，P<0.001，χ2拟合优度检验)(图3c)，且X染色体基因的表达水平单独清楚地区分单倍体与二倍体ES细胞；后者群集甚至比它们未分化的单倍体配对物更接近它们分化的衍生物(图3d)。这些数据与在单倍体和二倍体人ES细胞中的X染色体失活(XCI)的预期差别状态一致：虽然单倍体中的单一X染色体有转录活性(Xa)，但二倍体中的两个X染色体中的一个经常经历如雌性体细胞中的XCI(XaXi)19。实际上，单倍体人ES细胞通过RNA-Seq和表达微阵列分析两者展现出与二倍体相比X染色体基因表达的相对增加，及XCI-驱动的转录物XIST的缺乏表达(图3e，图3f，图9b-9d)，如在二倍体XaXa人ES细胞中所观察到20。XCI是一种表观遗传现象，通过抑制组蛋白和DNA甲基化修饰来调节。H3K27me3位点在未分选的二倍体ES细胞中而没有在它们的单倍体富集的配对物中一致地观察到(图3g)。然而，甲基化组分析显示单倍体ES细胞的X染色体DNA甲基化特征类似于二倍体雄性ES细胞(XaY)，其单拷贝X染色体基本上甲基化不足，与二倍体雌性细胞中甲基化不足Xa和过度甲基化Xi的复合模式相反(图3h)。有趣的是，通过所有以上提及的测定，在二倍体化之后不久(在单倍体细胞富集之后的3代内)，近期二倍体化的ES细胞保留XaXa(图3a，图3e-3h)。
常规相对基因表达分析所固有的总基因表达的归一化，21得到常染色体基因与二倍体ES细胞相比似乎相似的表达水平，但在单倍体中更高的X-连锁基因水平(图3e，图9c)。然而，假设在单倍体Xa和二倍体XaXi细胞中X-连锁基因的绝对表达是相等的，这些数据提示在单倍体细胞中全基因组常染色体基因水平的降低(图9e，图9f)。支持这一观点，发现从单倍体ES细胞中分离的总RNA量显著低于从相同数量的二倍体细胞获得的那些(图3i)。总基因表达的总体降低意味着这些细胞的物理尺寸也被改变。实际上，G1中的分选的单倍体与二倍体ES细胞之间的平均直径比率为约0.8(分别为9.6和11.5μm)，对应于表面积约0.7和体积约0.6的单倍体:二倍体比率(图3i，图9g)。
随后关注在常染色体内的一致分化调节。基于转录和DNA甲基化分析，发现编码具有信号肽的蛋白质的基因的显著富集在单倍体ES细胞中相对下调(图9h)。值得注意的，还检测到在单倍体细胞中的氧化磷酸化所涉及的11个基因的微小但明显的相对上调，包括构成此途径的五个复合体中四个的代表性编码亚单位(图3j，图9i)。此外，氧化磷酸化中涉及的所有13个线粒体基因也在单倍体细胞中一致上调(图3j)，表明在这些核与线粒体基因之间的协同调节。这与在单倍体与二倍体之间的线粒体DNA(mtDNA)与核DNA比率的32％增加一致(图3i)，提示相对于核DNA含量的线粒体丰度在单倍体细胞中相对较高。
实施例5.人单倍体ES细胞的分化
然后设法评价单性生殖来源的单倍体人ES细胞的分化潜力。虽然哺乳动物单性生殖发育由于亲本基因组的非等效性而受到限制，22,23但二倍体人单性生殖多能性干细胞在功能上是多能性的，如通过它们产生所有胚胎谱系的能力所看出。13,24,25为了弄清人单性生殖ES细胞是否能够作为单倍体多谱系分化，进行了若干分化测定，随后对所生成细胞的倍性和分化状态表征。通过单倍体富集的和二倍体ES细胞的自发分化生成的21日龄的EB不能由外观来区分(图4a)，且解离的单倍体细胞衍生的EB细胞的形态与分化一致(图10a)。值得注意地，中期散布分析揭示了单倍体核型(图4b；4/4中期)，且在h-pES10-和h-pES12-衍生的EB细胞中通过流式细胞术证实大部分单倍体DNA谱(～70％单倍体)(图4c，图10b)。然后比较G1-分选的单倍体ES与EB细胞的基因表达谱，关注在8个组织和多能性干细胞中显示明显特异性的18个基因。例如，我们的基因集组包括CHRM1(胆碱能受体)、KRT17(角蛋白)、MYL1(肌球蛋白)、REN(肾素)、ALB(白蛋白)、CPA1(羧肽酶)、SFTPD(表面活性剂)及MALRD1(MAM和LDL受体)，它们分别在脑、皮肤、肌肉、肾脏、肝脏、胰腺、肺及肠中表达(图4d)。这些谱系特异性基因的表达在未分化的ES细胞中可忽略，但全部都在单倍体和二倍体EB细胞中表达(图4d，图6c)。另外，单倍体和二倍体EB细胞显示多能特异性基因的不显著表达，与所有三个胚胎胚层的体细胞命运的有效分化和获取一致。
为了将此项分析扩展至更特异性且潜在更成熟的细胞类型，使单倍体ES细胞经历定向分化测定。经历向神经命运的定向分化持续10天的单倍体ES细胞保留单倍体，同时有效地产生神经细胞粘附分子1(NCAM1)-阳性神经祖细胞(NPC，～90％效率)(图4e，图11a，图11b)。分选的单倍体NPC表达多个神经谱系特异性基因，但不表达多能特异性基因(图4f，图11c)，表明在承担神经命运的同时从多能状态的稳健退出。XCI在二倍体分化的雌性细胞中是必不可少的，造成剂量补偿及X染色体与常染色体之间的1:2比率。由于单倍体ES细胞不能使它们的单拷贝X染色体失活，1:1的X:常染色体剂量失衡将持续至分化状态。实际上，单倍体NPC和单倍体EB细胞两者都显示与二倍体EB细胞的XaXi特征相反的Xa特征，如由全基因组表达分析和XIST水平所指示(图4g，图11d)。
神经元分化不限于祖细胞阶段，因为细胞至第20天还以高效率(>90％)分化为成熟TUJ1(也称为β-微管蛋白III)-阳性神经元，有单倍体细胞的显著持久性，如通过着丝粒的共染色(图4h；47％单倍体，n＝104)和FISH分析所示(图11e，图11f；46％单倍体，n＝200)。类似地，在产生自发搏动集落的11-天方案期间单倍体细胞分化为表达心肌肌钙蛋白T类型2(TNNT2)的心肌细胞(图4i；32％单倍体，n＝97)并且从整个培养物(25％1c细胞)分选的39％(n＝31)单倍体细胞经证实为TNNT2-阳性的(图4j，图11g)。然后，将单倍体富集的培养物(～70％单倍体)分化为胰腺谱系，通过着丝点分析对分化的两个阶段进行分析，亦即特异化为定形内胚层且进一步分化为胰腺细胞。观察到单倍体和二倍体都稳健地分化(>90％)为分叉头框A2(FOXA2)-阳性定形内胚层细胞(图4k；56％单倍体，n＝112)，且分化为胰腺和十二指肠同源异型框1(PDX1)-阳性胰腺细胞(图4l；13％单倍体，n＝103)，其中一些还对NK6同源异型框1(NKX6.1)呈阳性。除了着丝粒分析之外，还通过流式细胞术证实单倍体PDX1-阳性细胞的持久性(图4m；10％PDX1-阳性1c细胞；图11h，图11i)。
最终，两种单倍体富集的人ES细胞系都产生包含外胚层、中胚层及内胚层起源的细胞类型的畸胎瘤，如通过TUJ1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及α-胎蛋白(AFP)的组织和免疫染色分析所示(图4n，图12a，图12b)，满足了人多能性在体内的最严格标准。重要的是，未能检测到残留的未分化OCT4阳性细胞(图4n，图12b)。解剖之后，DNA含量分析揭示相当大的h-pES10-衍生的畸胎瘤细胞群保留单倍体(图4o)。通过组织学和FISH对来自独立的h-pES12-衍生的畸胎瘤的系列切片的组合分析证实体内分化的单倍体人细胞的存在能够在响应于发育信号的同时促成组织化的组织结构(图4p)。值得注意的是，在所有分析的畸胎瘤中鉴别出单倍体细胞(n＝4)，尽管在可变的比例下，这可受到单倍体细胞的初始量和/或分化时间长度的影响。
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***
具体实施方案的前述说明充分地披露了本发明的一般性质以便他人可以通过应用本领域普通技术人员的知识且在无需过多的实验下很容易地修改和/或改进这些具体实施方案用于各种应用，而没有脱离本发明的一般概念。因此，基于本文所提供的教导和指导，这些改进和修改意在涵盖于所公开的实施方案的等同的含义和范围内。应理解的是，本文的措辞或术语只是为了描述的目的，而不是限制性的，从而，本说明书的术语或措辞由本领域的熟练技术人员根据教导和指导来解释。本发明进一步通过以下权利要求书来描述。
序列表
<110> THE NEW YORK STEM CELL FOUNDATION
YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW
UNIVERSITY OF JERUSALEM
EGLI , Dietrich M.
BENVENISTY , Nissim
SAGI , Ido
<120> 单倍体人胚胎干细胞系和体细胞系及其制备方法
<130> NYSC1270-3WO
<150> US 62/198,614
<151> 2015-07-29
<150> US 62/279,490
<151> 2016-01-15
<150> US 62/292,755
<151> 2016-02-08
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 线粒体基因 ND2
<220>
<221> misc_feature
<223> 正向引物
<400> 1
tgttggttat acccttcccg tacta 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 线粒体基因 ND2
<220>
<221> misc_feature
<223> 反向引物
<400> 2
cctgcaaaga tggtagagta gatga 25
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 核基因 BECN1
<220>
<221> misc_feature
<223> 正向引物
<400> 3
ccctcatcac agggctctct cca 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> 核基因 BECN1
<220>
<221> misc_feature
<223> 反向引物
<400> 4
gggactgtag gctgggaact atgc 24

Claims (34)

1.一种用于产生单倍体人胚胎干(ES)细胞的富集群的体外方法，其中所述群能够分化为选自单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞的终末分化的单倍体细胞群，所述方法包括：
a)接受通过提供展示第二极体挤出和单一原核的人工活化的人MII卵母细胞产生的多个ES细胞群，其中所述人MII卵母细胞通过钙离子载体、电脉冲或钙离子载体和电脉冲两者来活化，并且允许所述人工活化的人卵母细胞体外发育为胚泡，消融滋养外胚层和在ES细胞培养基中培养内细胞团；
b)通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色、DNA荧光原位杂交、中期散布分析或次2c细胞分选来鉴别所述接受的ES细胞群的至少一个中的单倍体中期细胞；及
c)从鉴别为包含单倍体中期细胞的所述ES细胞群分选具有对应于小于2个染色体拷贝的DNA含量的细胞以产生单倍体人ES细胞的富集群。
2.权利要求1所述的方法，其还包括将ES细胞的富集群在培养物中维持至少3代。
3.权利要求1所述的方法，其中通过分析所述ES细胞群的中期散布或分选具有小于2个染色体拷贝的细胞来鉴别所述单倍体中期细胞。
4.权利要求1所述的方法，其中所述分选步骤包括荧光激活细胞分选(FACS)的至少一个循环。
5.权利要求4所述的方法，其中所述分选具有对应于小于2个染色体拷贝的DNA含量的细胞包括使用2-5个循环的FACS并且产生基本上纯的单倍体人ES细胞群。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述富集群包含至少5％单倍体人ES细胞。
7.权利要求6所述的方法，其中所述富集群是基本上纯的群并且包含至少95％单倍体人ES细胞。
8.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法是用于产生能够分化为选自单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞的终末分化的单倍体细胞的单倍体人ES细胞系的方法并且进一步包括：将单倍体人ES细胞的富集群维持在培养物中；以及每三至四代分选培养物中的ES细胞，其中所述分选是基于细胞倍性。
9.一种用于产生单倍体多潜能人细胞群的方法，其中所述群能够分化为选自单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞的终末分化的单倍体细胞，所述方法包括通过权利要求1-5中任一项所述的方法产生单倍体人ES细胞群，并且在低附着表面上培养所述单倍体人胚胎干细胞，由此产生单倍体多潜能人细胞群。
10.权利要求9所述的方法，进一步包括：在条件下培养所述单倍体人ES细胞且持续足以诱导胚状体形成的时间，以及将所述胚状体解离成细胞。
11.一种用于产生单倍体多潜能人细胞群的方法，其中所述群能够分化为选自单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞的终末分化的单倍体细胞，所述方法包括：
a)通过权利要求1-5中任一项所述的方法产生单倍体人ES细胞群；
b)在诱导畸胎瘤形成的条件下将所述单倍体人ES细胞注射到非人哺乳动物中；及
c)将所述畸胎瘤解离成细胞。
12.权利要求10所述的方法，其还包括基于细胞表面标记分选所述解离的细胞，任选地，其中所述分选包括FACS。
13.权利要求11所述的方法，进一步包括基于细胞表面标记分选所述解离的细胞，任选地其中所述分选包括FACS。
14.权利要求9所述的方法，其中所述单倍体多潜能人细胞群包含内胚层祖细胞、中胚层祖细胞、外胚层祖细胞、神经祖细胞或其组合。
15.权利要求11所述的方法，其中所述单倍体多潜能人细胞群包含内胚层祖细胞、中胚层祖细胞、外胚层祖细胞、神经祖细胞或其组合。
16.一种用于产生单倍体终末分化的人体细胞群的方法，所述方法包括通过权利要求1-5中任一项所述的方法产生单倍体人ES细胞群，和任选地通过权利要求11至13中任一项所述的方法将所述单倍体人ES细胞群分化为单倍体多潜能人细胞群；在定向分化的条件下培养所述单倍体人ES细胞或单倍体多潜能人细胞，其中所述终末分化的人体细胞是：
I.终末分化的神经元并且所述定向分化的条件包括抑制SMAD信号传导；
II.终末分化的心肌细胞并且所述定向分化的条件包括糖原合成酶激酶-3(GSK3)和WNT抑制；或
III.终末分化的胰腺细胞并且所述定向分化的条件包括分化为定形内胚层以及添加重组成纤维细胞生长因子7(FGF7)、LDN-193189、KAAD-环杷明、视黄酸和表皮生长因子(EGF)；
由此产生单倍体终末分化的人体细胞群。
17.一种用于产生单倍体人胚胎干(ES)细胞的富集群的体外方法，其中所述群包括以与多潜能标记在体外在二倍体人ES细胞中的表达基本相同的水平的所述多潜能标记的表达并且其中所述多潜能标记包括Nanog，所述方法包括：
a)接受通过提供展示第二极体挤出和单一原核的人工活化的人MII卵母细胞产生的多个ES细胞群，其中所述人MII卵母细胞通过钙离子载体、电脉冲或钙离子载体和电脉冲两者活化，并且允许所述人工活化的人卵母细胞体外发育为胚泡，消融滋养外胚层和在ES细胞培养基中培养内细胞团；
b)通过流式细胞术、着丝粒蛋白免疫荧光染色、DNA荧光原位杂交、中期散布分析或次2c细胞分选来鉴别所述接受的ES细胞群的至少一个中的单倍体中期细胞；及
c)从鉴别为包含单倍体中期细胞的所述ES细胞群分选具有对应于小于2个染色体拷贝的DNA含量的细胞以产生单倍体人ES细胞的富集群。
18.单倍体人ES细胞的体外富集群，其由权利要求1-5和17中任一项所述的方法产生。
19.权利要求18所述的富集群，其中所述ES细胞包含分化为单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞的能力。
20.权利要求18所述的富集群，其中所述多潜能标记选自Nanog、OCT4、SOX2、SSEA4和TRAI-60。
21.权利要求18所述的富集群，其中所述群包括以与所述多潜能标记在体外在二倍体人ES细胞中的表达基本相同的水平表达多潜能标记并且其中所述多潜能标记包括Nanog。
22.单倍体人ES细胞系，其通过权利要求8所述的方法产生。
23.单倍体多潜能人细胞群，其由权利要求9所述的方法产生。
24.单倍体多潜能人细胞群，其由权利要求11所述的方法产生。
25.权利要求23所述的群，其中所述单倍体多潜能包括分化为单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞中的至少一种的能力。
26.权利要求23所述的群，包括以与衍生自体外二倍体人ES细胞的二倍体多潜能人细胞中外胚层、中胚层或内胚层标记的表达基本相同的水平表达外胚层、中胚层或内胚层标记，其中所述外胚层标记选自CHRM1、STMN2、KRT17和DSC3，所述中胚层标记选自MYL1、TNNI1、TMEM52B和REN，并且所述内胚层标记选自ALB、FGG、SPINK1、CPA1、SFTPD、SLC34A2、MALRD1、RBP2和FOXA2。
27.权利要求24所述的群，其中所述单倍体多潜能包括分化为单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞中的至少一种的能力。
28.权利要求24所述的群，包括以与衍生自体外二倍体人ES细胞的二倍体多潜能人细胞中外胚层、中胚层或内胚层标记的表达基本相同的水平表达，其中所述外胚层标记选自CHRM1、STMN2、KRT17和DSC3，所述中胚层标记选自MYL1、TNNI1、TMEM52B和REN，并且所述内胚层标记选自ALB、FGG、SPINK1、CPA1、SFTPD、SLC34A2、MALRD1、RBP2和FOXA2。
29.单倍体人终末分化的体细胞群，其由权利要求16的方法产生。
30.权利要求29所述的群，其中所述体细胞选自单倍体成熟神经元、单倍体胰腺细胞和单倍体心肌细胞，并且以与衍生自体外二倍体人ES细胞的二倍体人终末分化的体细胞中的成熟神经元标记、胰腺细胞标记或心肌细胞标记的表达基本相同的水平表达成熟神经元标记、胰腺细胞标记或心肌细胞标记。
31.权利要求29所述的群，其中所述神经元标记是TUJ1，所述胰腺标记是PDX1并且所述心肌细胞标记是TNNT2。
32.一种遗传筛选方法，其包括：
a)将权利要求18所述的人单倍体ES细胞的富集群暴露于诱变剂以在所述细胞中诱导至少一种突变；
b)在所述富集群中选择含有所述突变的人单倍体ES细胞；及
c)鉴别所述人单倍体ES细胞中的突变的基因型和/或表型效应。
33.权利要求32所述的方法，其中所述遗传筛选为正向遗传筛选。
34.权利要求32所述的方法，其中所述诱变剂选自由以下组成的组：物理诱变剂、化学诱变剂及生物试剂。
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