CN108048400B - 一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法 - Google Patents

一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法，在原有普通猴子干细胞培养基的基础上进行优化培养，用0.05％的胰蛋白酶/EDTA处理单倍体胚胎干细胞克隆，成为单细胞状态，用EB培养基进行悬浮培养，形成拟胚体球；从分化第一天开始，培养基中要加ROCK抑制剂Y‑27632来抑制细胞凋亡；在第五天EB培养基换为神经诱导培养基；将初步形成神经外胚层的EB球种在基底胶铺底的培养皿中，加入神经诱导培养基进行分化；挑取神经花环，种在30μg/ml多鸟氨酸和3μg/ml层粘连蛋白铺底的培养皿中；培养14天后，进行流式细胞术，分选单倍体细胞。本发明第一次实现了在体外获得猴子单倍体神经干细胞，并具有向神经下游方向分化的能力。

Description

一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法。
背景技术
由于猴子单倍体胚胎干细胞系很难建系(目前文献报道的仅有一个课题组建立该细胞系)。猴子单倍体胚胎干细胞分化能力较弱，而且在单倍体神经分化过程中会存在严重的二倍化现象。所以目前尚未有报道证明能通过体外分化的方法得到猴子单倍体神经干细胞。
综上所述，现有技术存在的问题是：通过体外分化的方法得到猴子单倍体神经干细胞数据技术空白。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法。由于单倍体神经干细胞只有一套基因组，在遗传学筛选过程中可以避免隐性基因性状被遮盖的情况。同时由于神经干细胞有分化成下游神经元和神经胶质细胞的能力，所以该细胞系可以用于各种神经疾病靶点基因的筛选。是非常良好的筛选工具。起初用正常的灵长类干细胞培养液培养并分化发现猴子单倍体胚胎干细胞的神经分化能力很弱，分化到神经方向的细胞很少。于是就大胆猜测可能是由于单倍体只有一半基因组，控制多能性的蛋白剂量不够。于是就参考前人发表的工作，提升猴子单倍体胚胎干细胞的多能性。保障向神经干细胞分化的正常进行。进一步发现，随着多能性的提升，猴子单倍体胚胎干细胞的单倍性更稳定，分化出来的神经干细胞生存能力更强。
本发明是这样实现的，一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法，所述猴子单倍体神经干细胞的获得方法包括以下步骤：
步骤一，在原有普通猴子干细胞培养液中加入10ng/ml的人白血病抑制因子(LIF)，0.5μM的PD0325901，3μM的CHIR99021，10μM的SB203580和10μM的SP600125。
步骤二，用0.05％的胰蛋白酶/EDTA处理单倍体胚胎干细胞克隆，成为单细胞状态，用EB培养基进行悬浮培养，形成拟胚体球；
步骤三，从分化第一天开始，培养基中要加ROCK抑制剂Y-27632来抑制细胞凋亡；在第五天EB培养基换为神经诱导培养基；
步骤四，将初步形成神经外胚层的EB球种在基底胶铺底的培养皿中，加入神经诱导培养基进行分化；
步骤五，挑取神经花环，种在30μg/ml多鸟氨酸和3μg/ml层粘连蛋白铺底的培养皿中；
步骤六，培养14天后，进行流式细胞术，分选单倍体细胞。
进一步，所述步骤五培养皿中的培养基加入人碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的神经干细胞培养基。
进一步，所述步骤六在分选前，单倍体神经祖细胞经过大致4次传代来使细胞得到富集。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述猴子单倍体神经干细胞的获得方法获得的猴子单倍体神经干细胞。
本发明第一次实现了在体外获得猴子单倍体神经干细胞，并证明其具有向神经下游方向分化的能力。因为基本上各种神经退行性疾病和神经紊乱性疾病都是下游神经元细胞的病变导致的，结合单倍体只有一套染色体组的特点，具有向下游分化能力的猴子单倍体神经干细胞可以用来进行这些疾病靶点基因的筛选。
附图说明
图1是本发明实施例提供的猴子单倍体神经干细胞的获得方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的猴子单倍体神经干细胞的获得方法包括以下步骤：
S101：在改进的单倍体猴子干细胞生长的培养液中培养猕猴单倍体胚胎干细胞。培养液包含20％KOSR和0.1mM非必需氨基酸的D/F12培养基，培养基中别的添加物为0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml的青霉素，0.1mg/ml的链霉素，2mM的L-Glutamine，5ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)，10ng/ml的人白血病抑制因子(LIF)，0.5μM的PD0325901，3μM的CHIR99021，10μM的SB203580和10μM的SP600125；
S102：培养中的猕猴单倍体胚胎干细胞用0.05％的胰蛋白酶消化成单细胞，用EB培养液重悬后在悬浮培养皿中悬浮培养；
S103：分化的第一天在EB培养液里加10μM的Y-27632以减少细胞凋亡；在分化的第5天EB培养液换成神经诱导培养液(NIM)；在分化的第7天，悬浮培养的EB贴敷于matrigel包被的贴壁培养皿；大约一周之后，贴壁的集落中间会出现玫瑰花环样的细胞；
S104：手动挑出玫瑰花环并置于包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的贴壁培养皿；此时培养液换成含有bFGF和EGF的神经干细胞培养液，扩增。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：
1、一种多能性猴子胚胎干细胞培养液的制备
经过改进，单倍体猴子干细胞生长的培养液包含20％KOSR和0.1mM非必需氨基酸的D/F12培养基，培养基中别的添加物为0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml的青霉素，0.1mg/ml的链霉素，2mM的L-Glutamine，5ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)，10ng/ml的人白血病抑制因子(LIF)，0.5μM的PD0325901，3μM的CHIR99021，10μM的SB203580和10μM的SP600125。
2、猕猴单倍体神经干细胞的获得
培养中的猕猴单倍体胚胎干细胞用0.05％的胰蛋白酶消化成单细胞，用EB培养液重悬后在悬浮培养皿中悬浮培养。分化的第一天在EB培养液里加10μM的Y-27632以减少细胞凋亡。在分化的第5天EB培养液换成神经诱导培养液(NIM)。在分化的第7天，悬浮培养的EB贴敷于matrigel包被的贴壁培养皿。大约一周之后，贴壁的集落中间会出现玫瑰花环样的细胞。手动的挑出玫瑰花环并置于包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的贴壁培养皿。此时培养液换成含有bFGF和EGF的神经干细胞培养液，进一步扩增。
2、流式分析和流式分选
待流式分选的细胞用0.05％的胰蛋白酶消化成单细胞，然后用Hoechst 33342(5μg/ml)染色，37℃水浴孵育15min。细胞筛过滤后用BD FACS AriaII进行分选“n”峰处的细胞。待流式分析的细胞用0.05％的胰蛋白酶消化成单细胞，用75％的分析级乙醇4℃过夜固定。第二天用5μg/ml的碘化丙啶染色，同时加入2mg/ml RNA酶，37℃水浴孵育15min。细胞筛过滤后用BD LSRII SORP进行相关分析。
3、单倍体神经干细胞的分化潜能
为了验证所获得的单倍体神经干细胞具有神经分化的潜能，单倍体神经干细胞按照2万/cm2的密度铺在用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的贴壁培养皿。对于神经元细胞的分化，培养液换成DMEM/F12，添加N2B27，胶质源性神经营养因子(GDNF),脑源性神经营养因子(BDNF),双丁酰环腺苷酸(cAMP)和抗坏血酸(VC)。在此培养液的基础上加入1％的胎牛血清，就能分化到星形胶质细胞和少突胶质细胞。
4、免疫荧光染色
生长在玻片上的细胞用4％的多聚甲醛4℃过夜固定。PBS洗三遍后用0.3％的Triton X-100室温孵育一小时。然后用3％的牛血清白蛋白(BSA)室温孵育一小时。按照推荐浓度稀释一抗，4℃过夜孵育。二抗室温避光孵育一小时。
5、染色体核型分析
培养中的细胞用0.2ug/ml nocodazle处理3小时(神经干细胞)/2小时(胚胎干细胞)进行中期同步化。胰蛋白酶消化成单细胞后用0.075mM的KCL在37℃水浴30分钟。然后用固定液(甲醇：乙酸＝3：1)4℃固定20分钟。重复固定一次。然后细胞滴在洁净的玻片上。用吉姆萨染液染色7分钟后自然晾干。
6、生长曲线
96孔板的每空加入1000个细胞。在生长的第1，2，3，4，5天分别加入10μl CCK8溶液和90μl神经干细胞培养液。一小时后用酶标仪记录数据。
7、电生理
单倍体神经干细胞在贴壁培养皿分化三周。用膜片钳记录全细胞钠钾电流。加入500nM河豚毒素(TTX)后钠离子电流明显受阻。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
本发明通过优化猴子单倍体胚胎干细胞的培养体系，并利用流式细胞术得到了能够稳定维持单倍性的猴子单倍体神经干细胞。通过分化实验，证明得到的猴子单倍体神经干细胞具有完整的分化能力。具体过程及结果如下：
1、细胞培养。猴子单倍体胚胎干细胞获赠于昆明理工大学谭韬研究员处，培养条件为：加了20％KOSR和0.1mM非必需氨基酸的D/F12培养基，培养基中别的添加物为0.1mMβ-巯基乙醇，100U/ml的青霉素，0.1mg/ml的链霉素，2mM的L-Glutamine，5ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)，10ng/ml的人白血病抑制因子(LIF)，0.5μM的PD0325901，3μM的CHIR99021，10μM的SB203580和10μM的SP600125。在这个培养体系中，猴子单倍体胚胎干细胞能维持较高的多能性、单倍性维持和分化潜能，并且其细胞状态要好于传统培养条件。
2、通过单倍体胚胎干细胞的体外分化获得单倍体神经干细胞。采用的方法为拟胚体(EB)随机分化的方法来获得单倍体神经干细胞。为了得到拟胚体，用0.05％的胰蛋白酶/EDTA处理单倍体胚胎干细胞克隆，使其成为单细胞状态，然后用EB培养基进行悬浮培养，以形成拟胚体球。从分化第一天开始，培养基中要加ROCK抑制剂Y-27632来抑制细胞凋亡。在第五天的时候，EB培养基换为神经诱导培养基。换成神经诱导培养基两天后，可以看到神经外胚层结构的出现，然后将初步形成神经外胚层的EB球种在基底胶铺底的培养皿中，加入神经诱导培养基进行进一步分化。4-5天后，形成初始神经上皮结构。在分化后15天左右，大量细胞聚集在一起，形成成熟神经上皮结构和神经花环结构。然后挑取神经花环，种在30μg/ml多鸟氨酸和3μg/ml层粘连蛋白(laminin)铺底的培养皿中，培养基为加了人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的神经干细胞培养基。培养14天后，进行流式细胞术，分选单倍体细胞。在分选前，单倍体神经祖细胞经过大致4次传代来使细胞得到富集。得到的神经祖细胞能够维持较好的单倍性，不经流式分选，传20代后仍能保持较高单倍体比例。且用这种方法得到的单倍体神经干细胞与正常的二倍体神经干细胞在生长能力上也没有差别。
3、对得到的猴子单倍体神经干细胞进行鉴定。首先对猴子单倍体神经干细胞进行免疫荧光染色，发现其表达神经干细胞特异性的标记基因Nestin、Sox1和Pax6。实时定量PCR结果也说明了同样的结果。另外发现猴子单倍体神经干细胞没有X染色体失活必需基因Xist的表达。同时对猴子单倍体神经干细胞进行了分化培养，评估其分化潜能。结果发现在培养基中添加特定生长因子3周左右其可以形成星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。并且分化得到的神经元也是具有电生理功能的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种猴子单倍体神经干细胞的获得方法，其特征在于，所述猴子单倍体神经干细胞的获得方法包括以下步骤：
步骤一，在改进的单倍体猴子干细胞生长的培养液中培养猕猴单倍体胚胎干细胞，培养液是添加有0.1mM β-巯基乙醇，100U/ml的青霉素，0.1mg/ml的链霉素，2mM的L-Glutamine，5ng/ml的成纤维细胞生长因子bFGF，10ng/ml的人白血病抑制因子LIF，0.5μM的PD0325901，3μM的CHIR99021，10μM的SB203580，10μM的SP600125，20% KOSR和0.1mM非必需氨基酸的D/F12培养基；
步骤二，用0.05%的胰蛋白酶/EDTA处理单倍体胚胎干细胞克隆，成为单细胞状态，用EB培养基进行悬浮培养，形成拟胚体球；
步骤三，从分化第一天开始，培养基中要加ROCK抑制剂Y-27632来抑制细胞凋亡；在第五天EB培养基换为神经诱导培养基；
步骤四，将初步形成神经外胚层的EB球种在基底胶铺底的培养皿中，加入神经诱导培养基进行分化；
步骤五，挑取神经花环，种在30μg/ml多聚鸟氨酸和3μg/ml层粘连蛋白铺底的培养皿中；此时培养液换成含有bFGF和EGF的神经干细胞培养液，扩增；
步骤六，培养14天后，进行流式细胞术，分选单倍体细胞。
2.如权利要求1所述的猴子单倍体神经干细胞的获得方法，其特征在于，所述步骤六在分选前，单倍体神经祖细胞经过大致4次传代来使细胞得到富集。
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