CN115975914A - 利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，属于遗传工程技术领域，所述方法包括诱导培养和维持培养；所述诱导培养的方法为将人脐带间充质干细胞在诱导培养基中进行培养，得到pre‑iPSCs细胞；所述诱导培养基以高糖DMEM为基础培养基，添加维生素C、氯化锂、烟酰胺、Forskolin、bFGF、15d‑PGJ2、原钒酸钠、丙戊酸、5‑氮杂胞苷、EPZ004777、DNZep、Y‑27632、CHIR99021、SB431542、JNK‑IN‑8、PD98059、TTNPB、PD173074、ABT‑869；本发明重编程诱导多能干细胞的方法，诱导时间短且诱导效率高。
Description
技术领域
本发明涉及利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，属于遗传工程技术领域。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力和分化为特定细胞的多潜能细胞。干细胞来源包括胚胎干细胞(ESCs)、成体干细胞(ASCs)或脐带血干细胞等。由于从人类胚胎中提取ESCs具有争议性，以及研究资金的限制和潜在的致瘤性。而使用成体干细胞的优势在于，它们来源于同一个患者，并返回给同一个患者，因此不存在免疫介导的排斥反应；但它主要的缺点是这些细胞通常缺乏胚胎干细胞的可塑性和多能性，因此它们的潜能是不确定的。
在成人组织中重新编程体细胞，以创造多能ES样细胞是解决干细胞来源问题的一种方法。2006年，山中伸弥的团队发明了一种由OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四种转录因子构成的“鸡尾酒”法，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞，这种干细胞被称为诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells,简称“iPSCs”)。iPSCs细胞既避免了胚胎干细胞的伦理限制，又解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题，大大拓展了干细胞技术在临床医学上的应用潜力。
目前，重编程方法有多种，主要为病毒载体（逆转录病毒或慢病毒，CN109913494A）、DNA法（CN112266935A、CN109628383A）、RNA和蛋白质法、化学小分子药物法。前3种方法均涉及到核酸，在重编程过程中可能整合到活跃的内源性基因附近，甚至可能导致癌症或肿瘤抑制基因突变的激活或失活。而化学小分子药物法解决了目前许多研究者面临的问题，但存在重编程诱导时间长、诱导效率低下的问题。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种利用化学小分子药物诱导人脐带间充质干细胞重编程为诱导多能干细胞的方法，实现以下发明目的：缩短诱导时间，提高诱导效率。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，所述方法包括诱导培养和维持培养；所述诱导培养的方法为将人脐带间充质干细胞在诱导培养基中进行培养，得到pre-iPSCs细胞；所述诱导培养基以高糖DMEM为基础培养基，添加50μg/mL的维生素C、5mM的氯化锂、1mM的烟酰胺、10μM的Forskolin、100ng/mL的bFGF、1μM的15d-PGJ2、100μM的原钒酸钠、200μM的丙戊酸、10μM的5-氮杂胞苷、5μM的EPZ004777、0.2μM的DNZep、10μM的Y-27632、10μM的CHIR99021、5μM的SB431542、1μM的JNK-IN-8、1μM的PD98059、2μM的TTNPB、1μM的PD173074、1μM的ABT-869。
所述维持培养，将诱导培养得到的pre-iPSCs细胞采用维持培养基进行培养，得到iPSCs细胞；所述维持培养基以含有1%Vol的N2、2%Vol的B27、1%Vol的谷氨酰胺、1%Vol的MEM非必需氨基酸溶液、50μg/mL的维生素C的高糖DMEM为基础培养基，加入1μM的CHIR99021、10μM的Y-27632、1μM的PD0325901、2μM的IWP-2、0.5μM的SB590885、500μM的丙戊酸、10μM的Tranylcypromine、0.05μM的DZNep、5μM的EPZ004777。
所述诱导培养，每3天更换一次诱导培养基；所述维持培养，每2天更换一次维持培养基。
所述诱导培养之前将人脐带间充质干细胞先进行贴壁培养至融合度为80%。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明将人脐带间充质干细胞在化学小分子药物诱导培养基和维持培养基的培养下得到iPSCs细胞，诱导时间短，诱导时间仅为38天；诱导效率高，每孔iPSCs细胞的AKP阳性克隆数为232（初始接种密度为1×105个/每孔）。
附图说明
图1为本发明维持培养8天后得到的iPSCs细胞的显微镜图；
图2为本发明得到的诱导性多能干细胞的染色体核型图；
图3为实施例4中4组iPSCs细胞的AKP染色图；
图4为实施例5中4组iPSCs细胞和ESCs细胞的标志性基因RT-QPCR分析结果图；
图5为本发明 iPSCs诱导形成的拟胚体的显微镜图；
图6为本发明iPSCs诱导的三胚层标志性基因RT-qPCR的分析结果图。
具体实施方式
实施例1人脐带间充质干细胞和人皮肤成纤维细胞的培养
（1）人脐带间充质干细胞培养
取医院捐献的新生儿脐带，在超净工作台中先用75%Vol酒精消毒两次，放在培养皿中，用镊子剥离出其中的华氏胶组织，用剪刀剪碎至0.5mm2大小的小块。将剪碎的华氏胶组织转移到培养瓶中，加入含有配套因子的间充质干细胞无血清培养基（HMSC CultureMedium）（购自辛普森国际生命科技（天津）有限公司）培养基培养，每天用显微镜观察。
长出的干细胞铺满瓶底的80%时，进行传代，传代后细胞生长速度加快，每3天传一代，传至P3代时验证细胞进行后续实验，取4×106个细胞进行流式检测，验证其为间充质干细胞，CD105、CD73、CD90的高表达和CD34、HLA-DR的低表达均显示鉴定的细胞为间充质干细胞。流式检测结果为：CD105的表达率为98.1%，CD90的表达率为98.2%，CD73的表达率为99.9%，CD34的表达率为0.1%，HLA-DR的表达率为0.1%，阳性标志物的高表达和阴性标志物的低表达说明此细胞为人脐带间充质干细胞。
（2）人皮肤成纤维细胞培养
将购自赛百慷( 上海 )生物技术股份有限公司的BJ人皮肤成纤维细胞进行复苏，利用含有10%VolFBS和1%Vol双抗的MEM培养基（购自Gibco）进行培养，放在37℃、5%CO2、湿度为75%的培养箱中培养，传代一次后用于实验。
实施例2 化学小分子诱导培养基诱导pre-iPSCs细胞
人脐带间充质干细胞和人皮肤成纤维细胞分别以1×105个/每孔接种在6孔板中，并用各自相对应的含有配套因子的HMSC Culture Medium和含有10%Vol FBS及1%Vol 双抗的MEM培养基进行贴壁培养，每孔加入2mL对应的培养基；培养到融合度80%时进行诱导，诱导方法为将培养基分别更换为第一种诱导培养基或第二种诱导培养基（每孔加入2mL培养基），计为第0天，在培养过程中每3天更换一次诱导培养基。
各组细胞使用的诱导培养基，具体如下表1：
表1
每天观察细胞，其中组1在第5天时出现单层上皮样细胞，在第7天时融合度达到80%，继续诱导培养10天后，出现多层细胞集落并不断扩大，继续诱导，在40天时出现iPSCs初期细胞，继续培养5天，挑取pre-iPSCs克隆转移到维持培养基中。
组2在第4天时出现单层上皮样细胞，在第7天时融合度达到80%；继续诱导培养9天后，出现多层细胞集落并不断扩大，继续诱导，在38天时出现iPSCs初期细胞，继续培养5天，挑取pre-iPSCs克隆转移到维持培养基中。
组3在第11天时出现单层上皮样细胞，在14天时融合度达到80%；继续诱导培养10天后，出现多层细胞集落并不断扩大，继续诱导，在50天时出现iPSCs初期细胞，继续培养5天，挑取pre-iPSCs克隆转移到维持培养基中。
组4在第11天时出现单层上皮样细胞，在第13天时融合度达到80%，继续诱导培养10天后，出现多层细胞集落并不断扩大，继续诱导，在46天时出现iPSCs初期细胞，继续培养5天，挑取pre-iPSCs克隆转移到维持培养基中。
出现iPSCs初期细胞即为诱导成功，各组的诱导时间见表2。
表2
第一种诱导培养基：以高糖DMEM为基础培养基，添加1μM的15d-PGJ2（一种选择性的PPARγ和共价的 PPARδ激动剂）、100μM的原钒酸钠（Sodium orthovandate）、200μM的丙戊酸（Valproicacid）、10μM的5-氮杂胞苷（5-azacytidine ）、10μM的Tranylcypromine （单胺氧化酶抑制剂）、5μM的EPZ004777（DOT1L抑制剂）、0.2μM的DZNep（组蛋白甲基转移酶抑制剂）、10μM的Y-27632（ROCK抑制剂）、10μM的CHIR99021（GSK-3α/β抑制剂）、5μM的RepSox（ALK5抑制剂）、2μM的TTNPB（RAR激动剂）、10μM的Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）、100ng/mL的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、5μM的EPZ6438（EZH2抑制剂）、1μM的PD0325901（MEK抑制剂）、1μM的JNK-IN-8（JNK抑制剂）、50μg/mL的维生素C（Vitamin C）、50μM的β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）。以上因子除β-巯基乙醇购自索莱宝之外，其余均购自MCE。
第二种诱导培养基：以高糖DMEM为基础培养基，添加50μg/mL的维生素C（VitaminC）、5mM的氯化锂（LiCl）、1mM的烟酰胺（Niacinamide）、10μM的Forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）、100ng/mL的bFGF（碱性成纤维细胞生长因子）、1μM的15d-PGJ2（一种选择性的PPARγ和共价的 PPARδ激动剂）、100μM的原钒酸钠（Sodium orthovanadate）、200μM的丙戊酸（Valproic acid）、10μM的5-氮杂胞苷（5-azacytidine）、5μM的EPZ004777（DOT1L抑制剂）、0.2μM的DNZep（组蛋白甲基转移酶抑制剂）、10μM的Y-27632（ROCK抑制剂）、10μM的CHIR99021（GSK-3α/β抑制剂）、5μM的SB431542（ALK5抑制剂）、1μM的JNK-IN-8（JNK抑制剂）、1μM的PD98059（MEK抑制剂）、2μM的TTNPB（RAR激动剂）、1μM的PD173074（ FGFR1 抑制剂）、1μM的ABT-869（VEGFR 抑制剂）。以上因子除LiCl购自Merck外，其余均购自MCE。
实施例3 Pre-iPSCs细胞维持培养为iPSCs细胞
将4组实验组诱导后的Pre-iPSCs细胞，分别用玻璃针挑至Vitronectin包被六孔板里，每孔加入2mL维持培养基使pre-iPSCs细胞稳定为iPSCs细胞，放置于37℃、5%CO2的培养箱内培养，每两天更换一次维持培养基，培养8天后，显微镜观察细胞形态并拍照（图1），同时对iPSCs细胞进行鉴定。
4组实验诱导后的iPSCs 细胞分别收集1个孔，送至华科鉴联基因科技(北京)有限公司进行STR分析，结果均是来源于各自亲本细胞，没有其它人类细胞交叉污染。同时收集细胞进行核型分析，结果如图2所示，证明得到的诱导多能干细胞具有正常的2倍体核型。
维持培养基：以含有1%Vol的N2（N2添加剂）、2%Vol的B27（B27添加剂）、1%Vol的谷氨酰胺（GlutaMax）、1%Vol的MEM非必需氨基酸溶液（NEAA）、50μg/mL的维生素C（Vitamin C）的高糖DMEM为基础培养基，加入1μM的CHIR99021（GSK-3α/β抑制剂）、10μM的Y-27632（ROCK抑制剂）、1μM的PD0325901（MEK抑制剂）、2μM的IWP-2（Wnt抑制剂）、0.5μM的SB590885（B-Raf抑制剂）、500μM的丙戊酸（Valproic acid）、10μM的Tranylcypromine（单胺氧化酶抑制剂）、0.05μM的DZNep（组蛋白甲基转移酶抑制剂）、5μM的EPZ004777（DOT1L抑制剂）。
下述实施例4-6用到的iPSCs细胞均是实施例3中维持培养8天的细胞。
实施例4利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）检测进行iPSCs克隆的计数
未分化的iPSCs除具有典型的克隆形态外，细胞端粒酶活性高，表面标记AKP呈强阳性，如果其发生分化，则AKP呈阴性。通过AKP的检测，结合形态学和免疫细胞化学的观察，可鉴定iPSCs，判断其是否具有全能性。主要步骤如下:
（1）选取一孔生长状态良好的iPSCs克隆，弃去培养基，用PBS液清洗3次；
（2）加入4%wt多聚甲醛溶液固定20min，吸去固定液，用PBS液清洗3次；
（3）加入适量的BCIP/NBT染液，染色30min，吸出BCIP/NBT染液，用PBS液清洗3次后，显微镜下观察染色结果。
表3 不同组别进行AKP染色的iPSCs克隆计数结果
计数结果如表3和图3所示，在相同的细胞接种密度下，人脐带间充质干细胞在第二种诱导培养基中得到的iPSCs克隆数最高。第二种诱导培养基比第一种诱导培养基的诱导效果好，人脐带间充质干细胞比人皮肤成纤维细胞的效果要好。可能是由于人脐带间充质干细胞从原代细胞培养来的，而人皮肤成纤维细胞是购买的代次比较高的细胞。
实施例5利用RT-QPCR鉴定iPSCs细胞
首先使用RNeasy Plant Mini Kit（购自Qiagen公司，货号：74904）提取诱导后的诱导多能干细胞（iPSCs）和购买的胚胎干细胞（ESCs）的总RNA，提取方法见试剂盒说明书。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（购自TaKaRa公司，货号：RR047A）逆转录二者的RNA形成cDNA，操作方法见试剂盒说明书。使用二者cDNA作为模板，荧光定量PCR试剂购自赛诺公司，检测的基因包括Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、Foxa2，以Gapdh基因作为内参基因。每个PCR反应设3个重复。RT-PCR的程序设置为：94℃ 3min，（94℃、15s，58℃、30s，72℃、30s）×35cycle，在退火过程收集荧光。
结果如图4所示，选用人脐带间充质干细胞经过第二种诱导培养基诱导的iPSCs细胞与ESCs的细胞标志物Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、Foxa2的表达最为相似，而其他三组诱导的iPSCs细胞与ESCs存在一定差异，所以人脐带间充质干细胞经过第二种诱导培养基的诱导效果最好。
实施例6拟胚体EB的形成及分化
取一孔iPSCs细胞消化清洗后转移到没有包被的六孔板中悬浮培养，培养基为含有1%Vol的N2、2%Vol的B27、1%Vol的谷氨酰胺、1%Vol的NEAA、50μg/mL的维生素 C的高糖DMEM，细胞密度为1×105个细胞/孔。
每天取出1~2次，轻轻晃动或用粗口滴管吹打使细胞悬浮，各团分开。每两天换液，并逐日观察拟胚体形成情况，培养2天后的拟胚体形成情况如图5。EB继续悬浮培养8天后，将胚体转移到Vitronectin包被的细胞培养6孔板中继续培养，培养基中加入500µg/L的BMP-6。一周后，取这些细胞作RT-PCR检测。其中，采用外胚层标志性基因TH和GFAP、内胚层标志性基因SOX7和AFP、中胚层标志性基因PECAM和SCL进行检测。
结果如图6所示，EB的分化使得Nanog和OCT-4表达下调，培养基中添加BMP-6之后，外胚层标志性基因TH和GFAP、内胚层标志性基因SOX7和AFP、中胚层标志性基因PECAM和SCL在EB中的表达均出现了不同程度的上调表达,而未分化的iPSCs只表达Nanog和OCT-4基因。表明iPSCs能够分化为内、中、外三个胚层细胞，具有胚胎干细胞样多能性。
综上所述，人脐带间充质干细胞和皮肤成纤维细胞在化学小分子药物诱导培养基和维持培养基的诱导培养下能够诱导为iPSCs细胞，根据iPSCs细胞的诱导数量及鉴定结果，人脐带间充质干细胞在第二种诱导培养基中诱导的iPSCs细胞的时间、数量和效果最优，其他三组略差一些。
Claims (3)
1.利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括诱导培养和维持培养；所述诱导培养的方法为将人脐带间充质干细胞在诱导培养基中进行培养，得到pre-iPSCs细胞；所述诱导培养基以高糖DMEM为基础培养基，添加50μg/mL的维生素C、5mM的氯化锂、1mM的烟酰胺、10μM的Forskolin、100ng/mL的bFGF、1μM的15d-PGJ2、100μM的原钒酸钠、200μM的丙戊酸、10μM的5-氮杂胞苷、5μM的EPZ004777、0.2μM的DNZep、10μM的Y-27632、10μM的CHIR99021、5μM的SB431542、1μM的JNK-IN-8、1μM的PD98059、2μM的TTNPB、1μM的PD173074、1μM的ABT-869；
所述维持培养，将诱导培养得到的pre-iPSCs细胞采用维持培养基进行培养，得到iPSCs细胞；所述维持培养基以含有1%Vol的N2、2%Vol的B27、1%Vol的谷氨酰胺、1%Vol的MEM非必需氨基酸溶液、50μg/mL的维生素C的高糖DMEM为基础培养基，加入1μM的CHIR99021、10μM的Y-27632、1μM的PD0325901、2μM的IWP-2、0.5μM的SB590885、500μM的丙戊酸、10μM的Tranylcypromine、0.05μM的DZNep、5μM的EPZ004777。
2.根据权利要求1所述的利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述诱导培养，每3天更换一次诱导培养基；所述维持培养，每2天更换一次维持培养基。
3.根据权利要求1所述的利用化学小分子药物重编程诱导多能干细胞的方法，其特征在于：所述诱导培养之前将人脐带间充质干细胞先进行贴壁培养至融合度为80%。
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| GR01 | Patent grant | ||
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