JP2023531975A - 間葉系幹細胞を産生するための培地及び方法 - Google Patents

間葉系幹細胞を産生するための培地及び方法 Download PDF

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Abstract

多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進することができるか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる培養培地が提供される。ＰＳＣをＭＳＣに分化させる方法が提供される。分化を伴わずにＭＳＣの細胞個数を増加させる方法も提供される。【選択図】 なし

Description

関連出願
本出願は、２０２０年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０４２、６３４号の優先権の利益を主張し、その内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用する。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、多能性幹細胞を培養するための培養培地に関し、より詳細には、限定するものではないが、多能性幹細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に分化させるために使用することができる新規な培養培地、並びにＭＳＣの増殖性、多能性及び未分化状態を維持することができる新規な培養培地に関する。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多分化能及び自己複製能を有する幹細胞である。ＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、及び筋細胞などの間葉に属する細胞を含む様々な細胞、並びに神経細胞及び肝細胞に分化することができる。さらに、ＭＳＣは、自己産生した液性因子によるパラクリン効果及び細胞接着相互作用を有することが知られている。これらの効果に基づいて、ＭＳＣは、標的組織及び細胞を修復及び再生する能力、並びに免疫応答を制御する能力（例えば、抗炎症）を発揮し、それによって、種々の疾患に対する治療効果を提供する。
ＭＳＣは、様々な成体組織又は胎生組織（例えば、骨髄、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯組織、臍帯血、羊水、及び脂肪組織）に由来し得る。あるいは、無制限かつ再生可能な胎生又は成体のＭＳＣは、それぞれ、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工幹細胞（ｉＰＳ細胞）のいずれかの多能性幹細胞（ＰＳＣ）から産生することができる。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、高品質のヒトＭＳＣを生成するための信頼できる供給源として使用することができる。ｈＥＳＣは、３種類の胚性胚葉の全ての細胞に分化することができる増殖性の未分化幹細胞である。さらに、ｈＥＳＣは、インビトロで無限に増殖及び細胞個数を増加させることができ、ヒト治療のための細胞の、枯渇しない可能性がありドナー不要な供給源を提供するものである。
ヒトｉＰＳ細胞は、体細胞に遺伝子（例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃ、又はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８）を導入することによって得られる人工多能性幹細胞である［Takahashi K. Cell (2007) 131:861-872、及びYu J.et al., Science (2007) 318:1917-1920］。ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣと同様の特性を有し、特定の誘導条件下ではインビトロ及びインビボのいずれの場合も３種類の胚性胚葉の代表的な組織に分化することができる。ｉＰＳ細胞の誘導方法の改善には、ウイルスベクターの代わりにプラスミドを使用すること、又はゲノムへのいかなる組込みも伴わない誘導が含まれ、この改善は、臨床応用へのｉＰＳ細胞の使用を簡略化し得る［Yu J,et al., Science (2009) 324:797-801］。
ヒトＥＳＣ及びｉＰＳ細胞をＭＳＣに分化させる様々な方法が存在する。
米国特許第１０、３５１、８２５号明細書は、ｉＰＳ細胞からＭＳＣを産生する方法を提供し、ここでは、ｉＰＳ細胞は、７～８体積％のＣＯ２を含有する雰囲気中、ＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）の存在下で２０～３５日間培養される。次いで、かかる細胞を、親水性表面を有する培養皿に移し、ＴＧＦ－βインヒビターを含む培地中でＭＳＣを産生するのに十分な時間培養する。
米国特許出願第公開第２０１７０２９０８６４号明細書は、ＥＳＣ又はｉＰＳ細胞が栄養膜の中間分化を介して発生する条件下で、ＥＳＣ又はｉＰＳ細胞をＭＳＣに分化させる方法を提供する。詳細には、多能性幹細胞は、骨誘導因子－４（ＢＭＰ－４）、及び任意選択でＴＧＦ－β阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、Ａ８３－０１、又はＡＬＫ５阻害剤）を含む培地中で培養され、栄養膜は、ゼラチン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、又はコラーゲンで被覆したプレートにおいて、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、又はそれらの組合せを含有するＭＳＣ増殖培地中で栄養膜を培養することによって、ＭＳＣ由来細胞にさらに分化する。
国際公開第２０１１／０９１４７５号は、多能性細胞からＭＳＣを生成するための方法であって、（ｉ）培養容器の表面に接着したＥＳＣ又はｉＰＳ細胞を、内因性アクチビン及びＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）の存在下で分化させることと、（ｉｉ）得られた細胞をＭＳＣ培地の存在下で継代して、ＭＳＣを産生することと、を含む方法を提供する。
さらなる背景技術としては米国特許第１０、２１４、７２２号明細書、及びSchubert and Smitz: “In vitro culture of human primordial follicles”（Ri-Cheng Chian及びPatrick Quinn編、“Fertility Cryopresservation”、Cambridge University Press. Co University Press 発行、(2020)、200-212頁）が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、基本培地と、有効量のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）とを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．４～２．３の範囲内で含む基本培地を含み、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる、培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及び少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、を含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸と、を含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＭＥＭ ＨＧを含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のピルビン酸ナトリウムと、を含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．６～１．５の範囲内で含む基本培地と、少なくとも３％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも５％の濃度の血清と、を含み、さらに、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、培養培地が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分化させずに細胞個数を増加させる方法であって、本発明のいくつかの実施形態の培養培地中、ＭＳＣを分化させずに細胞個数を増加させることができる培養条件下でＭＳＣを培養することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養でＰＳＣを培養することによって、ＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地と、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養でＰＳＣを培養することによって、ＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地と、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養でＰＳＣを培養することによって、ＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って生成された懸濁培養物中に単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＭＳＣ及び本発明のいくつかの実施形態の培養培地を含む細胞培養物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＰＳＣ及び本発明のいくつかの実施形態の培養培地を含む細胞培養物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＰＳＣと、ＭＥＭαを含む基本培地、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＰＳＣと、ＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、を含む培養培地を含む細胞培養物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、基本培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、基本培地はＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭαに対して０．６～１．５のＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、ｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）のうちの少なくとも１種をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＫｏＳＲの濃度は少なくとも２．５％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＫｏＳＲの濃度は最大で１５％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＫｏＳＲの濃度は２．５～１５％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＫｏＳＲの濃度は５～１５％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＴＳの濃度は少なくとも０．１％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＴＳの濃度は最大で３％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＴＳの濃度は０．１～３％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＴＳの濃度は０．５～３％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、グルコース、Ｌ－アスコルビン酸及びピルビン酸ナトリウムのうちの少なくとも１種をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、グルコースの濃度は少なくとも１ｇｒ／Ｌ（リットル）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、グルコースの濃度は最大で５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、グルコースの濃度は１ｇｒ／Ｌ～５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｌ－アスコルビン酸の濃度は少なくとも２０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｌ－アスコルビン酸の濃度は最大で２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｌ－アスコルビン酸の濃度は２０～２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムの濃度は少なくとも２０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムの濃度は最大で２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムの濃度は２０～２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、血清をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、血清の濃度は少なくとも３％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、血清の濃度は最大で３０％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、血清の濃度は３～３０％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、血清の濃度は５～３０％である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度で塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｂＦＧＦはＦＧＦ２又はＦＧＦ４を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｂＦＧＦはＦＧＦ２及びＦＧＦ４を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ２は少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ２は最大で１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ２は１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ４は少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ４は最大で１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＦＧＦ４は１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びＷＮＴ－３ａのうちの少なくとも１種をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦはＰＤＧＦ－ＢＢを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦは少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦは最大で１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＤＧＦは５～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＧＦβはＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＧＦβは少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＧＦβは最大で５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＧＦβは５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＧＦは少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＧＦは最大で１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＧＦは１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＷＮＴ－３ａは少なくとも１０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＷＮＴ－３ａは最大で２００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＷＮＴ－３ａは１０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は二次元培養を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は懸濁（三次元）培養を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は少なくとも５継代である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は最大２５継代である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、及び軟骨細胞形成系統のいずれか１系統に分化することができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、基材への接着のない培養条件下で行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣの懸濁培養物は凝集塊を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、凝集塊を含む懸濁培養物は、約２５０個を超える多能性幹細胞を含む細胞クラスターを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣの懸濁培養物には凝集塊が存在しない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、凝集塊のない懸濁培養物は、単一細胞又は小クラスターを含み、小クラスターの各々は、約２００個以下の多能性幹細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は３～１４日間行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣの少なくとも４０％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－発現シグネチャーによって特徴付けられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣはヒトＭＳＣを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは成体ＭＳＣを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは胎生ＭＳＣを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣはＰＳＣ由来ＭＳＣを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣはヒトＰＳＣを含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣは胚性幹細胞（ＥＳＣ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）を含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術及び／又は科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を下記に記載する。矛盾する場合、定義を含め、本願特許明細書が優先する。更に、材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態について、その例示のみを目的として添付の図面を参照して本明細書に記載する。以下、特に図面に詳細に言及するが、示される詳細は、例示を目的とし、また本発明の実施形態の例証的説明を目的とすることを強調する。この点に関して、図面を用いて説明することで、当業者には、本発明の実施形態をどのように実践し得るかが明らかとなる。
図１Ａ～図１Ｄは、間葉に分化中のｈＥＳＣの形態を示す。図１Ａ～図１Ｂは、凝集塊を示す。図１Ｃ～図１Ｄは、単一細胞を示す。図１Ａ及び図１Ｃは、懸濁培養における７日間の分化後の細胞凝集塊及び単一細胞の細胞形態を示し、図１Ｂ及び図１Ｄは、細胞を接着培養に再播種した後の細胞形態を示す。スケールバー：１００μｍ。 図２Ａ～図２Ｅは、ｈＥＳＣ（Ｉ３）のＭＳＣへの分化の代表的なＦＡＣＳ解析を示す。ｈＥＳＣを、凝集塊又は単一細胞として、懸濁液中で７日間培養した。青色のヒストグラムは特異的抗体を示し、赤色のヒストグラムは対応するアイソタイプ対照を示す。図２Ａは、ＣＤ１４６及びＣＤ７３発現についての結果を示し、図２Ｂは、ＣＤ１０５発現の結果を示し、図２Ｃは、ＣＤ９０発現の結果を示し、図２Ｄは、ＣＤ４５発現の結果を示し、図２Ｅは、ＣＤ３１発現の結果を示す。注目すべきことに、細胞の９５％超では、ＣＤ１４６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ９０の発現が陽性であり（図２Ａ～図２Ｃ）、ＣＤ３１及びＣＤ４５の発現は陰性であった（図２Ｄ～図２Ｅ）。 図３Ａ～図３Ｃは、インビトロでのｈＥＳＣ－ＭＳＣの誘導中胚葉への分化を示す。三次元懸濁培養における間葉系分化後、細胞を二次元接着培養で再播種し、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞への分化に供した。多房性脂肪細胞はオイルレッドで陽性に染色され（図３Ａ）、骨芽細胞はアリザリンレッドで陽性に染色され（図３Ｂ）、軟骨芽細胞はアルシアンブルーで陽性に染色された（図３Ｃ）。 図４は、様々な濃度のｂＦＧＦを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させたＭＳＣの累積細胞数を示す。 図５は、様々な濃度のｂＦＧＦを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させたＭＳＣの代表的な形態を示す。 図６Ａ～図６Ｃは、様々な濃度及び組み合わせでＰＤＧＦ－ＢＢ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させた臍帯ＭＳＣ（ＭＳＣ－ＵＣ）の（培養期間を通じた）細胞数を示す。図６Ａは、１日当たりの増加倍数を示し、図６Ｂは、集団の倍加時間（ＰＤＴ）を示し、図６Ｃは、細胞数の累積結果を示す。細胞を約６０日間にわたって計数した。平行線は、細胞を計数した日数を表す。（＊）Ｐ＜０．５、（＊＊）Ｐ＜０．０１、（＊＊＊）Ｐ＜０．００１。 同上 同上 図７は、様々な濃度及び組み合わせでＰＤＧＦ－ＢＢ、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させたＭＳＣ－ＵＣの（培養期間全体の）代表的な形態を示す。 図８は、様々な濃度及び組み合わせでｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦβ１及びＷＮＴ－３ａを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させた成体ヒト臍帯ＭＳＣ（ａｈＭＳＣ－ｕＣｓ）の（培養期間を通じた）相対的増殖を示す。様々な濃度の増殖因子及びサイトカインを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地で３回継代した後のａｈＵＣ－ＭＳＣのサンプルの結果である。対照では５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦのみを添加した。 図９Ａ～図９Ｇは、様々な濃度及び組み合わせでｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦβ１及びＷＮＴ－３ａを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２培地）中で細胞個数を増加させたａｈＭＳＣ－ＵＣの（培養期間を通じた）代表的な形態を示す。ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地による結果の例における、成長したａｈＭＳＣ－ＵＣの代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。 図１０は、様々な濃度及び組み合わせでｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＴＧＦβ３及びＷＮＴ－３ａを含む高グルコースＤＭＥＭ培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－ＨＧ）中で細胞個数を増加させた成体ヒト臍帯ＭＳＣ（ａｈＭＳＣ－ｕＣＳ）の（培養期間を通じた）相対的増殖を示す。様々な濃度の増殖因子及びサイトカインを添加したＤＭＥＭ ＨＧ基本培地中で３回継代した後のａｈＵＣ－ＭＳＣのサンプルの結果である。対照では５０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦのみを添加した。 図１１Ａ～図１１Ｊは、様々な濃度及び組み合わせの、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＴＧＦβ３及びＷＮＴ－３ａを含む高グルコースＤＭＥＭ培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－ＨＧ）中で細胞個数を増加させたａｈＭＳＣ－ＵＣの（培養期間を通じた）代表的な形態を示す。ＤＭＥＭ ＨＧ基本培地による結果の例における、成長したａｈＭＳＣ－ＵＣの代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。 図１２Ａ～図１２Ｅは、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１中のａｈＭＳＣ－ＵＣ細胞密度を示す。ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１培地において様々な継代数（継代数１～１１）で成長したａｈＭＳＣ－ＵＣの代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。留意点として、ａｈＭＳＣ－ＵＣは、記載の培地での長期培養後にそれらの形態を維持していた。 図１２Ｆは、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１培地で成長させたｈＵＣ－ＭＳＣの累積細胞数を示す。ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１培地で７２日間（１０継代）成長させた後のａｈＭＳＣ－ＵＣ累積細胞数である。留意点として、ｈＵＣ－ＭＳＣは、記載の培地での長期培養中に有意な増殖を示した。 図１３は、異なる３種類のＭＳＣ分化用培地におけるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）のＦＡＣＳ解析を示す。ｉＰＳＣ。記載の培地でｈｉＰＳＣ（Ｄｙｒ０１００）を培養し、細胞を分化後７日目又は８日目、及び１４日目にＣＤ９０について染色した。赤色のヒストグラムは、記載のマーカーについて染色された細胞を表し、青色のヒストグラムは、染色されていない細胞を表す。注目すべきことに、ＭＳＣマーカーは、分化の７～８日後に最初に出現し、試験した全ての分化用培地における分化により、間葉系マーカーＣＤ９０の広範な発現が観察された。 図１４は、分化用培地で８日後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣにおけるマーカーの変化率を示す（サンプル結果）。ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６、３７及び３８中で８日後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣのマーカーを、０日目と比較した変化率である。注目すべきは、間葉系マーカーの発現である。ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６の発現は増加したが、ＣＤ４５（造血系マーカー）の発現は減少した。 図１５は、記載の分化用培地で２週間後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ細胞におけるＯＣＴ４の発現レベルを示す図である。ｉＰＳＣを異なる３種類のＭＳＣ－Ｄｉｆｆ培地で培養し、重要な多能性マーカーＯＣＴ４について染色した。ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６、３７及び３８で培養した細胞におけるＯＣＴ４発現レベルは、間葉系の分化が進むにつれて顕著に減少した。 図１６Ａ～図１６Ｈは、カルシウム沈着物に対するアリザリンレッドＳ染色によって、ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（間葉系分化用培地で７日後及び１４日後に誘導）の骨形成能が明らかにされたことを示す。骨形成能を示すアリザリンレッドＳ染色の代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（７日間又は１４日間の三次元培養による間葉系分化から生じた）を、それぞれ３０日間又は１６日間にわたってさらに骨細胞に分化させた。注目すべきことに、細胞はアリザリンレッドで陽性に染色され、骨形成を示した。図１６Ａ及び図１６Ｅは、ヒト臍帯由来ＭＳＣ（陽性対照として機能）である。図１６Ｂ及び図１６Ｆは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６で誘導）である。図１６Ｃ及び図１６Ｇは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７で誘導）である。図１６Ｄ及び図１６Ｈは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８で誘導）である。 図１７Ａ～図１７Ｄは、オイルレッドＯ染色によってｉＰＳＣ由来ＭＳＣの脂肪細胞生成能が明らかにされたことを示す。脂肪細胞生成能を示すオイルレッドＯ染色の代表的な光学顕微鏡画像（倍率２０倍）である。注目すべきことに、ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養下での間葉系の誘導により生成）は、オイルレッドで陽性に染色され、脂肪細胞の生成を示す。図１７Ａは、ヒト臍帯由来ＭＳＣ（陽性対照として機能）である。図１７Ｂは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６で誘導）である。図１７Ｃは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７で誘導）である。図１７Ｄは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８で誘導）である。 図１８Ａ～図１８Ｂは、異なる２種類のＭＳＣ分化用培地における二次元の細胞接着アッセイ後のｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣのＭＳＣマーカーについてのＦＡＣＳ解析を示す（サンプル結果）。プラスチック製組織培養プレートに細胞を播種することによって、ｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養において間葉系分化を誘導）のプラスチック接着について試験した。記載の培地でさらに１５日間細胞を培養し、ＭＳＣマーカー：ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６（図１８Ａ）、及びＣＤ９０（図１８Ｂ）の発現について解析した。赤色のヒストグラムは記載のマーカーで染色された細胞を表し、青色のヒストグラムは、染色されていない細胞を表す。注目すべきことに、ｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養由来）は、二次元培養においても間葉系マーカーの高発現を維持した。 図１９は、二次元細胞接着アッセイ下で１５日後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養由来）のマーカーの変化率を示す（サンプル結果）。ｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養において間葉系分化を誘導）を、プラスチック組織培養プレートに細胞を播種することによって、プラスチック接着について試験した。記載の培地でさらに１５日間細胞を培養し、造血マーカーＣＤ４５に加えて、ＭＳＣマーカー：ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６の変化率について解析した。 図２０Ａ～図２０Ｃは、接着アッセイ後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣから分化した骨細胞におけるカルシウム沈着についてのアリザリンレッドＳ染色を示す（サンプル結果）。接着アッセイ後のｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣの骨細胞への分化能を示す、陽性アリザリンレッドＳ染色の代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。ｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（記載の培地での三次元培養で生成）をプラスチック製組織培養プレートに播種し、骨細胞分化培地でさらに１６日間培養した。図２０Ａは、ａｈＵＣ－ＭＳＣ（陽性対照）である。図２０Ｂは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７で誘導）である。図２０Ｃは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８で誘導）である。 図２１Ａ～図２１Ｃは、接着アッセイ後にｉＰＳＣ由来ＭＳＣから分化した脂肪細胞中の脂肪滴のオイルレッドＯ染色を示す（サンプル結果）。接着アッセイ後のｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣの脂肪細胞生成能を示すオイルレッドＯ染色の代表的な光学顕微鏡画像（倍率２０倍）である。ｈｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（記載の培地での三次元培養で生成）をプラスチック製組織培養プレートに播種し、骨細胞分化培地でさらに２３日間培養した。図２１Ａは、ａｈＵＣ－ＭＳＣ（陽性対照）である。図２１Ｂは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７で誘導）である。図２１Ｃは、三次元培養下のｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８で誘導）である。 図２２Ａ～図２２Ｂは、記載の培地で８日後のＥＳＣ由来ＭＳＣ細胞におけるＯＣＴ４及びＮａｎｏｇの発現レベルを示す。ヒト胚性幹細胞を、異なる３種類のＭＳＣ－Ｄｉｆｆ培地における三次元培養で８日間培養した。細胞を、ＯＣＴ４（図２２Ａ）及びＮａｎｏｇ（図２２Ｂ）発現について解析した。注目すべきことに、ＯＣＴ４及びＮａｎｏｇの発現レベルは、間葉系の分化中に顕著に減少した。 同上 図２３Ａ～図２３Ｄは、カルシウム沈着に対して陽性のアリザリンレッドＳ染色により、ＥＳＣ由来ＭＳＣの骨細胞生成能（間葉系分化用培地で７日後に誘導された）を示す。骨細胞生成能を示すアリザリンレッドＳ染色の代表的な光学顕微鏡画像（倍率×１０）である。ＥＳＣ由来ＭＳＣ（三次元培養における間葉分化の７日後に生成）を、さらに３０日間にわたって骨細胞に分化させた。図２３Ａは、ａｈＵＣ－ＭＳＣ（陽性対照）である。図２３Ｂは、三次元培養下のＥＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６で誘導）である。図２３Ｃは、三次元培養下のＥＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７で誘導）である。図２３Ｄは、三次元培養下のＥＳＣ由来ＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８で誘導）である。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、多能性幹細胞を培養するための培養培地に関し、より詳細には、限定するものではないが、多能性幹細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に分化させるために使用することができる新規な培養培地、並びにＭＳＣを増殖性、多能性及び未分化状態を維持することができる新規な培養培地に関する。
本発明の原理及び操作は、図面及び付随する説明を参照することによって、より良く理解され得る。
本発明の少なくとも１種の実施形態を詳細に説明する前に、本発明の用途は、以下の発明を実施するための形態に示される詳細又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施若しくは実現することが可能である。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明のためのものであり、限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、様々な成体組織又は胎生組織に由来し得る多能性細胞であり、インビトロで脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞などの中胚葉誘導体にさらに分化することができ、また（程度は低いが）外胚葉誘導体又は内胚葉誘導体、それぞれニューロン又は肝細胞にも分化することができる。ＭＳＣは、伝統的に二次元接着培養で培養される。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、胚性幹細胞又は人工幹細胞のいずれであっても、成体又は胎生ＭＳＣの代替的で無制限の再現性のある供給源を提供することができる。
ＭＳＣは自己複製能及び多系統分化能を有することから、治療用途におけるＭＳＣの使用は望ましい。しかしながら、ＭＳＣは、従来の細胞培養条件下では、例えば組織培養用プラスチック上で培養されたときには、それらの幹細胞としての特性を失う傾向がある。
本発明を実施に移行しようとする間に、本発明者らは、非接着性であり、担体を含まない、（細胞凝集塊又は単一細胞としての）懸濁培養における、ｈＰＳＣのＭＳＣへの指向性分化のための新規な、特異的な、かつ効率的な培地を見出した。本明細書中に記載されるプロトコルは、分化用培地中で数日（例えば、３～１０日）後、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨芽細胞への高率での分化能を有する、正真正銘のＭＳＣを生成させた。さらに、本発明者らは、二次元接着培養（コーティングあり又はなし）又は懸濁（三次元）培養において成体、胎生及びＰＳＣ由来のＭＳＣを培養するための新規な培養培地を見出した。培養培地は、未分化状態を維持しながらの長期間（例えば、２０～２５継代）にわたるＭＳＣの細胞個数の増加を可能にした。まとめると、本明細書で特定される新規な培養培地は、ＰＳＣからのＭＳＣの効率的かつ迅速な生成のために、並びに未分化状態のＭＳＣの長期におよぶ細胞個数増加及び維持のために、使用することができる。さらに、記載されたプロトコルによって生成されるＭＳＣは、様々な細胞ベースの治療のための、増殖性、多能性、未分化の間葉系幹細胞の無制限の供給源として使用することができる。
すなわち、本発明の一態様によれば、基本培地と、有効量のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）とを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地が提供される。
本発明の一態様によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．４～２．３の範囲である、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地を含む培養培地であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、培養培地が提供される。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」という用語は、３通りのすべての胚性胚葉（すなわち内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の細胞に分化することができる細胞を指す。「多能性幹細胞」という語句は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び／又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）と解し得る。
本明細書で使用される「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」という用語は、妊娠後、着床前に形成された胚組織から得られる細胞（例えば、胚盤胞）（すなわち着床前胚盤胞）、着床後／原腸胚形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｃｅｌｌ、ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号を参照）、及び／又は、妊娠中の任意の時点、好ましくは妊娠１０週前の胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を指す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の多能性幹細胞は、例えばヒト又は霊長類（例えば、サル）由来の、胚性幹細胞である。
本発明の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞をヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトインビボでの着床前の胚又はインビトロでの受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞のヒト胚は胚盤胞期まで細胞数が増加し得る。ヒトＥＳ細胞の単離の際は、胚盤胞から透明帯を除去し、免疫除去法（Ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ）によって内部凝集塊（ＩＣＭ）を単離する。免疫除去法は、栄養外胚葉細胞を溶解して穏やかにピペッティングすることによりインタクトなＩＣＭを取り出す手法である。次いで、ＩＣＭを、増殖を可能にする適切な培地を含む組織培養フラスコ中に播種する。９～１５日後、ＩＣＭ由来の増殖物を、機械的解離又は酵素による分解のいずれかによって凝集塊に解離させ、次いで細胞を新鮮な組織培養培地上に再播種する。未分化の形態を示すコロニーをマイクロピペットによって個々に選択し、機械的に解離させて凝集塊にし、再播種する。次いで、得られたＥＳ細胞を、４～７日毎に定期的に小分けする。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Thomson et al.［米国特許第５、８４３、７８０号明細書、Science 282:1145,1998、Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995］、Bongso et al.［Hum Reprod 4:706,1989］及びGardner et al.［Fertil. Steril. 69:84, 1998］を参照されたい。
市販の幹細胞もまた、本発明のこの態様で使用することができることが理解される。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨのヒト胚性幹細胞登録機関（ｗｗｗ（ｄｏｔ）／／ｅｓｃｒ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞株の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ０４及びＴＥ０６である。
拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、原腸形成前の段階で受精後少なくとも９日目の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、透明帯を消化して［例えば、酸性タイロード溶液（米国、ミズーリ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって］、内部凝集塊を露出させる。次いで、胚盤胞を、受精後少なくとも９日及び１４日以内の間、すなわち、原腸形成イベントの前に、インビトロで標準的な胚性幹細胞培養法を用いて、全胚として培養する。
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、当業者に公知の実験技術を使用して、妊娠約８～１１週の胎児（ヒト胎児の場合）から得られた始原生殖細胞から調製される。生殖隆起を解離させ、小片に切断し、その後、機械的解離によって集塊を細胞へとほぐす。次いで、ＥＧ細胞を適切な培地を含む組織培養フラスコ中で成長させる。ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、典型的には７～３０日又は１～４継代後まで、培地を毎日交換しながら細胞を培養する。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Shamblott et al.,［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998］及び米国特許第６、０９０、６２２号明細書を参照されたい。
本明細書で使用される「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」（又は胚性幹細胞）という語句は、体細胞（例えば、成体体細胞）の脱分化によって得られる増殖性及び多能性幹細胞を指す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣの増殖能力と同様の増殖能力によって特徴付けられ、したがって、ほぼ無制限の期間にわたって培養物中で維持及び細胞数を増加させることができる。
ｉＰＳ細胞には、胚性幹細胞の特徴を獲得するように細胞を再プログラムする遺伝子操作によって多能性を付与することができる。例えば、本発明のｉＰＳ細胞は、本質的にTakahashi and Yamanaka, Cell (2006) 126:663-676、Takahashi et al., Cell (2007) 131(5):861-72、Meissner et al., Nat Biotechnol (2007) 25(10):1177-81、及びOkita et al., Nature (2007) 448:313-318に記載されているように、体細胞においてＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４及びｃ－Ｍｙｃの発現を誘導することによって体細胞から生成することができる。加えて又は代わりに、本発明のｉＰＳ細胞は、本質的にYu et al., Science (2007) 318:1917-20、及びNakagawa et al., Nat Biotechnol (2008) 26(1):101-6に記載されているように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の発現の誘導によって体細胞から生成することができる。体細胞の遺伝子操作（再プログラミング）は、プラスミド若しくはウイルスベクターを使用するなどの任意の公知の方法を使用して、又はゲノムへのいかなる組込みも伴わない誘導によって行うことができることに留意すべきである［Yu et al., Science (2009) 324:797-801］。
本発明のｉＰＳ細胞は、胚線維芽細胞［上記Takahashi and Yamanaka (2006)、上記Meissner et al.(2007)］、ｈＥＳＣから形成された線維芽細胞［Park et al, Nature (2008) 10;451(7175):141-6］、胎児線維芽細胞［上記Yu et al. (2007)、上記Park et al.(2008)］、包皮線維芽細胞［上記Yu et al. (2007)、上記Park et al. (2008)］、成人真皮及び皮膚組織［Hanna et al., Science. (2007) 318:1920-1923、Lowry et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2008) 105(8):2883-8］、Ｂリンパ球［上記Hanna et al (2007)］、並びに成体肝臓及び胃細胞［Aoi et al., Science (2008) 321(5889):699-702］の脱分化を誘導することによって得ることができる。
ＩＰＳ細胞株はまた、ＷｉＣｅｌｌバンクなどの細胞バンクを介して入手可能である。市販のｉＰＳ細胞株の非限定的な例としては、ｉＰＳ包皮クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（包皮）－１－ＤＬ－１］、ｉＰＳＩＭＲ９０クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－１－ＤＬ－１］、及びｉＰＳＩＭＲ９０クローン４［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－４－ＤＬ－１］が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、一般に間葉系として分類される任意の組織に由来する幹細胞を指す。間葉として分類される組織には、骨髄、胎盤、脂肪組織、及び皮膚組織が含まれる。これらの組織に由来する間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞（ＣＢ－ＭＳＣ）、脂肪組織由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞、歯髄間葉系幹細胞等が挙げられる。
一実施形態によれば、ＭＳＣは胎児由来のもの（例えば、ＣＢ－ＭＳＣ、胎盤由来ＭＳＣ）である。
一実施形態によれば、ＭＳＣは、成体由来（すなわち、胎児期後、すなわち、新生児期から寿命の終わりまでの生物であり、例えば、骨髄組織又は脂肪組織から得られたＭＳＣを含む）である。
ＭＳＣは、典型的には、例えば骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、軟骨芽細胞、及び線維芽細胞を含む、複数の間葉系統の分化細胞を生じさせることができる。一般に、間葉系幹細胞はまた、以下の特性のうちの１つ以上：非同期又は非対称の複製を経る能力、すなわち、分裂後の２つの娘細胞が異なる表現型を有し得る能力；広範な自己再生能力；及びそれらが存在する組織（例えば、骨髄の非造血細胞）のクローン再生能力；を有する。
ＭＳＣは、以下で考察されるように、特定の細胞表面マーカーの存在、及び特定の細胞表面マーカーの非存在、の両方によって特徴付けられ得る。ＭＳＣはまた、インビトロ及びインビボの両方における機能的アッセイ、特に、複数の分化した子孫を生じさせる幹細胞の能力に関するアッセイ、標準的なＷＮＴシグナル伝達に対する応答性についてのアッセイなど、によって同定され得る。
ヒトＭＳＣは、限定されないが、ＣＤ５４、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ１４６、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７６、及びＣＤ３０４を含む、いくつかの細胞表面タンパク質の発現によって特徴付けられ得る。ヒトＭＳＣは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ１４及びＣＤ４５が挙げられるがこれらに限定されないマーカー（例えば、造血系マーカー）の細胞表面発現の非存在によって特徴付けられ得る。一実施形態によれば、ヒトＭＳＣは、ＣＤ１４及び／若しくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９及び／若しくはＣＤ７９ａ、又はＨＬＡ－ＤＲの細胞表面発現の非存在によって特徴付けられ得る。マーカーの全てが単一のＭＳＣ細胞上で発現され得るか、あるいは、マーカーが異なるＭＳＣ細胞上で（例えば、同じ培養物中で）発現され得ることが理解される。
特定の実施形態によれば、ヒトＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ４４の細胞表面発現、並びにＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５の細胞表面発現の非存在によって特徴付けられる（すなわち、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－細胞である）。
ＭＳＣは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ＭＳＣは、標準的な手順を用いて骨髄から得ることができる。例えば、骨髄穿刺液又は生検をドナー（例えば、健常ドナー）から収集することができ、ＭＳＣをそこから単離することができる（例えば、Aggarwal & Pittenger, Blood (2005) 105:1815-1822を参照）。一般に、単核細胞は、典型的には、勾配遠心分離によって骨髄穿刺液から単離され、次いで、１０ｍＭ Ｌ－グルタミン及び１０％ウシ胎仔血清ＦＣＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－低グルコースなどのＭＳＣ培地を含有するフラスコに播種され、加湿５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で増殖する。非接着細胞は、典型的には２４時間後に（例えば、ＰＢＳ－ＨＳＡ溶液で洗浄することによって）除去される。培養培地を４日毎に交換する。２週間後には培養物はほとんどコンフルエントになるはずである。トリプシンを用いてＭＳＣを回収し、１継代細胞として再播種する。細胞を少なくとも８継代培養し、ＭＳＣ結合表面分子の存在について定期的に試験することができる。同様に、ＭＳＣは、参照により本明細書に援用するｗｗｗ（ｄｏｔ）ｉｒｖｉｎｅｓｃｉ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ－ｆｏｒ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｉｓｏｌａｔｉｏｎに詳細に論じられているように、脂肪組織、臍帯血、及び臍帯から得ることができる。
市販の間葉系幹細胞も、本発明のこの態様で使用することができる。ヒトＭＳＣは、例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ－ｗｗｗ（ｄｏｔ）ａｔｃｃ（ｄｏｔ）ｏｒｇ）から購入することができる。市販のＭＳＣの非限定的な例としては、脂肪由来間葉系幹細胞、例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－２１０－０１０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－５００－０１１（商標）、骨髄由来間葉系幹細胞、例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－５００－０１２（商標）、臍帯由来間葉系幹細胞、例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ－５００－０１０（商標）が挙げられる。
一実施形態によれば、ＭＳＣは、ＰＳＣ（すなわち、ＰＳＣ由来ＭＳＣ）から得られ、例えば、以下でさらに論じられるように、ＥＳＣ（例えば、ｈＥＳＣ）又はｉＰＳ細胞から分化される。
一実施形態によれば、本発明の多能性幹細胞（ＰＳＣ）及び／又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、哺乳動物細胞であり、ヒト、霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、ＰＳＣ又はＭＳＣはヒト由来である。
本明細書中で使用される場合、「培養培地」という用語は、細胞の増殖を支持するために使用される液体物質をいう。いくつかの実施形態に従い本発明によって使用される培養培地は、いずれも細胞の増殖及び／又は分化に必要である塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えば、サイトカイン、成長因子及びホルモンなどの物質の組み合わせを含む水ベースの培地であり得る。
例えば、本発明のいくつかの実施形態の態様に従う培養培地は、基本培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、例えばから入手可能）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（例えばＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）から入手可能）、ＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ、例えばＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）から入手可能）、ＭＥＭα（例えばＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）から入手可能）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）、Ｋｏ－ＤＭＥＭ（例えばＧｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、ネブラスカ州、グランドアイランド、ネブラスカ州、グランドアイランド）から入手可能）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、例えばＧｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、ネブラスカ州、グランドアイランド）から入手可能）などを含む合成組織培養培地であり得、本明細書においてさらに記載される添加剤が必要に応じて添加される。基本培地の濃度は、以下に説明する代替血清などの他の培地成分の濃度に応じて異なる。
本発明の一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。
本発明の一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ）を含む。
本発明の一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＭＥＭαを含む。
本発明の一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む。
一実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭαに対する０．１～９のＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲（例えば、１０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び９０％ＭＥＭα～９０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び１０％ＭＥＭαの体積）である。
一実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭαに対する０．２５～４のＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲（例えば、２０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び８０％ＭＥＭα～８０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び２０％ＭＥＭαの体積）である。
一実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭαに対する０．４～２．３のＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲（例えば、３０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び７０％ＭＥＭα～７０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び３０％ＭＥＭαの体積）である。
一実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭαに対する０．６～１．５のＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲（例えば、４０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び６０％ＭＥＭα～６０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び４０％ＭＥＭαの体積）である。
一実施形態によれば、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比は、ＭＥＭα対ＤＭＥＭ／Ｆ１２が１対１（例えば、体積で５０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２及び５０％ＭＥＭα）である。
一実施形態によれば、培養培地は限定されたものである。「限定」培養培地は、特定の濃度の既知の成分から製造された既知の組成の限定培養培地を指す。例えば、限定培養培地は、非馴化培養培地である。
「馴化培養培地」は、特定の細胞又は細胞集団が培養され、その後除去された培養培地を指す。細胞が培地中で培養されたとき、それらの細胞は、他の細胞に対する栄養支持を提供し得る細胞因子を分泌し得る。このような因子としては、増殖因子、炎症性メディエーター及び他の細胞外タンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、抗体、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、小胞、及び顆粒を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞因子を含有する培地は、馴化培地（例えば、フィーダー細胞、例えば線維芽細胞が増殖した増殖培地）である。
一実施形態によれば、培養培地は非馴化培養培地である。
一実施形態によれば、培養培地は、馴化培地の成分を含まない。
一実施形態によれば、培養培地は無血清である。
本明細書で使用される場合、用語「無血清」は、ヒト血清又は動物血清を含んでいないことをいう。
培養プロトコルにおける血清の機能は、培養された細胞に、存在するインビボ環境（すなわち、細胞が由来する生物の体内）と同様の環境を提供することであることに留意すべきである。しかしながら、動物原料（例えば、ウシ血清）又はヒト原料（ヒト血清）のいずれかに由来する血清の使用は、ドナー個体（血清が得られる）間の血清成分の有意なばらつき及び異種混入物を有する危険性（動物血清が使用される場合）によって制限される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、無血清培養培地は、血清又はその一部を含まない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、無血清培養培地は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清又は動物血清から精製されたアルブミン）を含まない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は代替血清を含む。
本明細書で使用される場合、「代替血清」という語句は、多能性幹細胞又は間葉系幹細胞に増殖及び生存に必要な成分を提供することによって血清の機能を代替するよう限定された処方を指す。
様々な代替血清処方が当技術分野で公知であり、市販されている。
例えば、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（グランドアイランド、ネブラスカ州、米国）カタログ番号１０８２８－０２８）は、培養中の細胞の増殖及び維持に最適化された限定無血清処方である。ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清の処方は、動物原料（Ｐｒｉｃｅ、Ｐ．Ｊ．らの国際公開第９８／３０６７９号）に由来するＡｌｂｕｍａｘ（脂質を富化したウシ血清アルブミン）を含むことに留意されたい。しかしながら、Crook et al., 2007による最近の刊行物（Crook JM. et al. , 2007, Cell Stem Cell, 1:490-494）は、ｃＧＭＰ－ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、カタログ番号０４－００９５）においてＦＤＡによる承認を受けた臨床用の包皮線維芽細胞を使用して生成された６種類の臨床用ｈＥＳＣ株を記載している。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約０．５％［体積／体積（ｖ／ｖ）］～約５０％（ｖ／ｖ）、約１％［体積／体積（ｖ／ｖ）］～約５０％（ｖ／ｖ）、例えば約１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば約１％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約３％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば約３％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約３％（ｖ／ｖ）～約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、少なくとも例えば約０．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約９％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１０％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１２％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１３％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１４％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２０％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、多くても例えば約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約１１％（ｖ／ｖ）、例えば約１２％（ｖ／ｖ）、例えば約１３％（ｖ／ｖ）、例えば約１４％（ｖ／ｖ）、例えば約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約２０％（ｖ／ｖ）、例えば約３０％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約２．５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約３％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約３．７５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約７．５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約１０％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）の濃度は、約１５％（ｖ／ｖ）である。
別の市販の代替血清は、例えば、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国、ネブラスカ州、グランドアイランドのカタログ番号１２５８７－０１０）から入手可能な、ビタミンＡ不含有のＢ２７サプリメントである。Ｂ２７サプリメントは、ｄ－ビオチン、脂肪酸不含フラクションＶウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カタラーゼ、Ｌ－カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣｌ、Ｄ－ガラクトース（Ａｎｈｙｄ．）、グルタチオン（還元型）、組換えヒトインスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン－２－ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ－３／アルブミン複合体、ＤＬα－トコフェロール及びＤＬα酢酸トコフェロールを含む無血清製剤である。しかしながら、Ｂ２７サプリメントは動物原料由来のアルブミンを含むため、その使用は制限される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、代替血清はゼノフリーである。
用語「ゼノ（ｘｅｎｏ）」は、ギリシャ語の「Ｘｅｎｏｓ」、すなわち「見知らぬ人」に基づく接頭辞である。本明細書中で使用される場合、用語「ゼノフリー」とは、異種（すなわち、同じではない種）に由来する任意の成分を含まないことをいう。そのような成分は、異種に関連する（例えば、感染性の）病原体、異種の細胞成分、又は異種の細胞成分（例えば、体液）などの汚染物質であり得る。
例えば、ゼノフリー代替血清は、インスリン、トランスフェリン及びセレンの組合せを含むことができる。加えて、又は代わりに、ゼノフリー代替血清は、ヒト又は組換え産生アルブミン、トランスフェリン及びインスリンを含むことができる。
市販のゼノフリー代替血清組成物の非限定的な例としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＩＴＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１５００－０５６又はＧｉｂｃｏカタログ番号４１４００－０４５）から入手可能なＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリン及びヒト組換えインスリンを含み、増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇ及びマイトジェンを含まないＳｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ３（例えば、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２６４０から入手可能）と、のプレミックスが挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約０．０１％［体積／体積（ｖ／ｖ）］～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約０．０５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約０．１％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約０．５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約１％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約３％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約０．５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約０．８％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約１．０％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約１．５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約３％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．２％（ｖ／ｖ）～約０．３％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．２％（ｖ／ｖ）～約０．４％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．２％（ｖ／ｖ）～約０．５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約１％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約１．５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約３％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば、約０．５％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約２％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約３％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、少なくとも例えば約０．０１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．０５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．２％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．３％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．４％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．６％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．７％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．８％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約０．９％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３．５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約９％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、最大で例えば約０．２％、例えば約０．３％、例えば約０．５％（ｖ／ｖ）、例えば約１％（ｖ／ｖ）、例えば約１．５％（ｖ／ｖ）、例えば約２％（ｖ／ｖ）、例えば約２．５％（ｖ／ｖ）、例えば約３％（ｖ／ｖ）、例えば約４％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）、例えば約６％（ｖ／ｖ）、例えば約７％（ｖ／ｖ）、例えば約８％（ｖ／ｖ）、例えば約９％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約０．２５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約０．５％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約１％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約２％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）の濃度は、約３％（ｖ／ｖ）である。
一実施形態によれば、培養培地は、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む。
一実施形態によれば、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地は、無血清である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭα、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＭＥＭα及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、血清、すなわち、細胞の生存及び増殖を支持する様々な可溶性タンパク質及び増殖因子の未定義の混合物を含む。様々な血清製剤が当技術分野で公知であり、市販されている。例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）、カタログ番号０４－００７－１Ａ）、ヒトＡＢ血清、ブタ血清、ウマ血清、ウサギ血清及びヤギ血清であり、これらは全て、例えば、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）から市販されている。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約１％［体積／体積（ｖ／ｖ）］～約５０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約３％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約１５％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約５０％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）～約５０％（ｖ／ｖ）の範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えばＦＢＳ）は、少なくとも例えば約１％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約４％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約６％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約７％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約８％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約９％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１０％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約１５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２０％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約２５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３０％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約３５％（ｖ／ｖ）、少なくとも例えば約４０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えばＦＢＳ）は、多くても例えば約５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約２０％（ｖ／ｖ）、例えば約２５％（ｖ／ｖ）、例えば約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約３５％（ｖ／ｖ）、例えば約４０％（ｖ／ｖ）、例えば約５０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約３％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約５％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約１０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約２０％（ｖ／ｖ）である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血清（例えば、ＦＢＳ）は、約３０％（ｖ／ｖ）である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭα、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及び血清を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＭＥＭα、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及び血清を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地はグルコースを含む。グルコースは、限定されるものではないが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの様々な供給元から入手することができる。
培養培地中のグルコースの濃度は、約０．５ｇｒ／Ｌ～５ｇｒ／Ｌ、例えば１ｇｒ／Ｌ～５ｇｒ／Ｌ、例えば１ｇｒ／Ｌ～４．５ｇｒ／Ｌ、例えば１ｇｒ／Ｌ～４ｇｒ／Ｌ、例えば１ｇｒ／Ｌ～３．５ｇｒ／Ｌ、例えば１ｇｒ／Ｌ～３ｇｒ／Ｌであり得る。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、少なくとも例えば約０．５ｇｒ／Ｌ、例えば約１ｇｒ／Ｌ、例えば約１．５ｇｒ／Ｌ、例えば約２ｇｒ／Ｌ、例えば約２．５ｇｒ／Ｌ、例えば約３ｇｒ／Ｌ、例えば約３．５ｇｒ／Ｌ、例えば約４ｇｒ／Ｌ、例えば約４．５ｇｒ／Ｌ、例えば約５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、多くても例えば約５ｇｒ／Ｌ、例えば約４．５ｇｒ／Ｌ、例えば約４ｇｒ／Ｌ、例えば約３．５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、約３．５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、約４ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、約４．５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のグルコースは、約５ｇｒ／Ｌである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地はＬ－アスコルビン酸を含む。Ｌ－アスコルビン酸は、限定されないが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの様々な供給業者から入手することができる。
培養培地中のＬ－アスコルビン酸の濃度は、約２０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、例えば２０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、例えば２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～１５０μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬとすることができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は、少なくとも例えば約２０μｇ／ｍＬ、例えば約３０μｇ／ｍＬ、例えば約４０μｇ／ｍＬ、例えば約５０μｇ／ｍＬ、例えば約６０μｇ／ｍＬ、例えば約７０μｇ／ｍＬ、例えば約８０μｇ／ｍＬ、例えば約９０μｇ／ｍＬ、例えば約１００μｇ／ｍＬ、例えば約１２０μｇ／ｍＬ、例えば約１４０μｇ／ｍＬ、例えば約１６０μｇ／ｍＬ、例えば約１８０μｇ／ｍＬ、例えば約２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は、多くても例えば約２００μｇ／ｍＬ、例えば約１７５μｇ／ｍＬ、例えば約１５０μｇ／ｍＬ、例えば約１００μｇ／ｍＬ、例えば約７５μｇ／ｍＬ、例えば約５０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は約２５μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は約５０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は約７５μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＬ－アスコルビン酸は約１００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地はピルビン酸ナトリウムを含む。ピルビン酸ナトリウムは、限定されないが、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）などの様々な供給業者から入手することができる。
培養培地中のピルビン酸ナトリウムの濃度は、約２０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、例えば２０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、例えば２０μｇ／ｍＬ～６０μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～１５０μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、例えば５０μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬとすることができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、少なくとも例えば約２０μｇ／ｍＬ、例えば約３０μｇ／ｍＬ、例えば約４０μｇ／ｍＬ、例えば約５０μｇ／ｍＬ、例えば約６０μｇ／ｍＬ、例えば約７０μｇ／ｍＬ、例えば約８０μｇ／ｍＬ、例えば約９０μｇ／ｍＬ、例えば約１００μｇ／ｍＬ、例えば約１２０μｇ／ｍＬ、例えば約１４０μｇ／ｍＬ、例えば約１６０μｇ／ｍＬ、例えば約１８０μｇ／ｍＬ、例えば約２００μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、多くても例えば約２００μｇ／ｍＬ、例えば約１７５μｇ／ｍＬ、例えば約１５０μｇ／ｍＬ、例えば約１００μｇ／ｍＬ、例えば約７５μｇ／ｍＬ、例えば約５０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、約２５μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、約５０μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、約７５μｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のピルビン酸ナトリウムは、約１００μｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫｏＳＲ、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＬ－アスコルビン酸を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫｏＳＲ、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、Ｌ－アスコルビン酸及びピルビン酸ナトリウムを含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＫｏＳＲ、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、グルコース、Ｌ－アスコルビン酸及びピルビン酸ナトリウムを含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ）、ＫｏＳＲ、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、Ｌ－アスコルビン酸及びピルビン酸ナトリウムを含む。
以下の実施例の節の実施例１及び実施例２に示されるように、本発明者らは、例えば、１～５０ｎｇ／ｍＬの範囲のｂＦＧＦを含む種々の培養培地（本明細書中以下の表２及び表３に示されるような培地）を使用して、ＰＳＣをＭＳＣに首尾よく分化させ、そしてＭＳＣを首尾よく培養し、そしてそれらを増殖性、多能性及び未分化状態（以下でさらに議論されるような）を維持した。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「塩基性線維芽細胞増殖因子」又は「ｂＦＧＦ」とは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのポリペプチドをいい、これは、ヘパリンに結合し、そして広範なマイトジェン活性及び脈管形成活性を有する。ＢＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡは、複数のポリアデニル化部位を含み、あるいは非ＡＵＧ（ＣＵＧ）及びＡＵＧ開始コドンから翻訳され、異なる特性を有する５つの異なるアイソフォームを生じる。ＣＵＧで開始するアイソフォームは核に局在し、イントラクリン効果に関与するが、ＡＵＧで開始する形態は大部分が細胞質ゾルの局在し、ＦＧＦのパラクリン効果及びオートクリン効果に関与する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ２又はＦＧＦ４を含む。
塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ塩基性、ｂＦＧＦ又はＦＧＦ－β）としても一般に知られているＦＧＦ２は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。本発明のいくつかの実施形態の培養培地において使用されるＦＧＦ２は、精製された、合成された、又は組換え発現されたＦＧＦ２タンパク質（例えば、ヒトｂＦＧＦポリペプチドであるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９９７．５；例えば、ヒトｂＦＧＦポリヌクレオチドであるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２００６）であり得る。
ＦＧＦ４は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。本発明のいくつかの実施形態の培養培地において使用されるＦＧＦ４は、精製された、合成された、又は組換え発現されたＦＧＦ４タンパク質（例えば、ヒトｂＦＧＦポリペプチドであるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９９８．１；例えば、ヒトｂＦＧＦポリヌクレオチドである受託番号ＮＭ＿００２００７）であり得る。
特定の実施形態によれば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、記号ＦＧＦ２又はＦＧＦ４を含む遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
ゼノフリー培養培地の調製のために、ｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４）は、好ましくは、ヒト原料から精製されるか、又は以下にさらに記載されるように組換え発現されることに留意すべきである。ｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４）は、例えば、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）（それぞれ、カタログ番号７１０３０４／８及び７１０４０４）などの様々な商業的供給源から得ることができる。一実施形態によれば、ｂＦＧＦ（すなわち、ＦＧＦ２）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号 ２３３－ＦＢから得られ、ＦＧＦ４は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３５－Ｆ４／ＣＦ、又はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００－３１から得られる。
いくつかの実施形態によれば、培養培地中のｂＦＧＦ（例えばＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４）の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約２ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４）の濃度は、少なくとも例えば約０．０１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約７．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約５０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約９０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１５０ｎｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４）の濃度は、最大で約５ｎｇ／ｍＬ、最大で約１０ｎｇ／ｍＬ、最大で約１５ｎｇ／ｍＬ、最大で約２０ｎｇ／ｍＬ、最大で約３０ｎｇ／ｍＬ、最大で約４０ｎｇ／ｍＬ、最大で約５０ｎｇ／ｍＬ、最大で約６０ｎｇ／ｍＬ、最大で約７０ｎｇ／ｍＬ、最大で約８０ｎｇ／ｍＬ、最大で約９０ｎｇ／ｍＬ、最大で約１００ｎｇ／ｍＬ、最大で約２００ｎｇ／ｍＬ、最大で約５００ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地はＦＧＦ２を含む。
一実施形態によれば、培養培地はＦＧＦ４を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４を含む。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ２の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ２の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ２の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ２の濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ２の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ４の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ４の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ４の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ４の濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＦＧＦ４の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＦＧＦ２を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭα、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）並びにＦＧＦ２を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は血清を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭα、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）並びにＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は血清を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭα、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は血清を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を含む。
本明細書で使用される場合、「トランスフォーミング増殖因子ベータ」又は「ＴＧＦβ」という用語は、多くの細胞型における増殖、分化、及び他の機能の制御において同じ受容体シグナル伝達系を介して機能する、トランスフォーミング増殖因子ベータ（β）の任意のアイソフォームを指す。ＴＧＦβは、形質転換を誘導する際に作用し、負の自己分泌増殖因子としても作用する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３を含む。
トランスフォーミング増殖因子β－１（ＴＧＦβ１）は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのポリペプチドメンバーである。ＴＧＦβ１は、典型的には、多くの細胞型における細胞成長、増殖、分化、及びアポトーシスの制御に関与する。
本発明のいくつかの実施形態の培養培地において使用されるＴＧＦβ１は、精製、合成又は組換え発現されたＴＧＦβ１タンパク質であり得る（例えば、ヒトＴＧＦβ１ポリペプチドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００６５１．３、例えば、ヒトＴＧＦβ１ポリヌクレオチドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００６６０）。ＴＧＦβ１は、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ及びＰｒｏＳｃｉ Ｐｒｏｔｅｉｎｓなどの様々な供給業者から得ることができる。特定の実施形態によれば、ＴＧＦβ１は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４０－Ｂ／ＣＦ、又はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００－２１である。
トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのポリペプチドメンバーである。ＴＧＦβ３は、典型的には、多くの細胞型における増殖、分化、及び他の機能の制御に関与し、形質転換を誘導する際に、及び負の自己分泌増殖因子として作用する。
本発明のいくつかの実施形態の培養培地中で使用されるＴＧＦβ３は、精製された、合成の、又は組換え発現されたＴＧＦβ３タンパク質であり得る（例えば、ヒトＴＧＦβ３ポリペプチドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３２３０．１、例えば、ヒトＴＧＦβ３ポリヌクレオチドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３２３９）。ＴＧＦβ３は、Ａｂｃａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ及びＰｒｏＳｃｉ Ｐｒｏｔｅｉｎｓなどの様々な供給業者から得ることができる。特定の実施形態によれば、ＴＧＦβ３は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４３－Ｂ３、又はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００－３６Ｅである。
特定の実施形態によれば、トランスフォーミング増殖因子βは、記号ＴＧＦＢ１又はＴＧＦＢ３を含む遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
ゼノフリー培養培地の調製のために、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３）は、好ましくは、ヒト原料から精製されるか、又は以下にさらに記載されるように組換え発現されることに留意すべきである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３の濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３の濃度は、少なくとも例えば約０．１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約０．３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約０．７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１．２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１．４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１．６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１．８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約３．５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約６ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約７ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約８ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約９ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１２ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１３ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１４ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも例えば約２０ｎｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３の濃度は、最大で例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１．５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約３ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約４ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約６ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約７ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約８ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約９ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ１の濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約１ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約２０ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ４を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及びＦＧＦ４である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ４を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及びＦＧＦ４である。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ４を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及びＦＧＦ４である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地はＷＮＴ－３ａを含む。
本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ－３Ａ」という用語は、ＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーを指す。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関連する遺伝子からなる。これらのタンパク質は、発癌及びいくつかの発生プロセス（細胞運命の調節及び胚形成の間のパターン化を含む）に関与している。
本発明のいくつかの実施形態の培養培地中で使用されるＷＮＴ－３Ａは、精製された、合成された、又は組換え発現されたＷＮＴ－３Ａタンパク質、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１４９１２２．１、又はＷＮＴ－３Ａポリヌクレオチド、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３１３１．３であり得る。ＷＮＴ－３Ａポリペプチドは、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ（例えば、カタログ番号５０３６－ＷＮ－０１０、５０３６－ＷＮ／ＣＦ）などの様々な製造業者から入手することができる。
特定の実施形態によれば、ＷＮＴ－３Ａは、記号ＷＮＴ３Ａを含む遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、ＷＮＴ－３Ａの安定化剤、すなわち、プロテアーゼを阻害し、ポリペプチドＷＮＴ－３Ａを安定化する剤をさらに含む。安定化剤の例としては、リポソーム及びミセルなど、例えば、ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））（ＤＭＰＧ）及びコレステロール（例えば、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール比１０：１：１０）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は、少なくとも例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約６０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約７０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約８０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約９０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１２０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１４０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１６０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１８０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２００ｎｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は、最大で例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１００ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１２５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１５０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１７５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２００ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は約２０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＷＮＴ－３Ａの濃度は約２００ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＷＮＴ－３Ａを含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＷＮＴ－３Ａを含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及び／又はＦＧＦ４である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む。
本明細書で使用される場合、「血小板由来増殖因子」又は「ＰＤＧＦ」という用語は、２つの異なる受容体を介して細胞応答を活性化するＰＤＧＦの４種類の異なるアイソフォームのいずれかを指す。これらのアイソフォームには、Ａ（ＰＤＧＦ－ＡＡと称されるホモ二量体として、及びＰＤＧＦ－ＡＢと称されるＢアイソフォームとのヘテロ二量体の一部として観察される）、Ｂ（ＰＤＧＦ－ＢＢと称されるホモ二量体として、及びＰＤＧＦ－ＡＢと称されるＡアイソフォームとのヘテロ二量体の一部として観察される）、Ｃ（ＰＤＧＦ－ＣＣと称されるホモ二量体として観察される）及びＤ（ＰＤＧＦ－ＤＤと称されるホモ二量体として観察される）が含まれる。したがって、本明細書で使用される「ＰＤＧＦ」という用語は、一般に、公知のＰＤＧＦホモ及びヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ、及びＰＤＧＦ－ＤＤ）を指す。
特定の実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の培養培地において使用されるＰＤＧＦは、ＰＤＧＦ－ＢＢである。
本発明のいくつかの実施形態の培養培地に使用されるＰＤＧＦは、精製、合成又は組換え発現されたＰＤＧＦタンパク（例えば、ヒトＰＤＧＦサブユニットＢポリペプチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿１４８９３７．１又はＮＰ＿００２５９９．１、例えば、ヒトＰＤＧＦサブユニットＢポリヌクレオチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２６０８又はＮＭ＿０３３０１６、例えば、ヒトＰＤＧＦサブユニットＡポリペプチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２５９８．４又はＮＰ＿１４８９８３．１、例えば、ヒトＰＤＧＦサブユニットＡポリヌクレオチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３３０２３）であり得る。ＰＤＧＦは、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、Ａｂｃａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ及びＰｒｏＳｃｉ Ｐｒｏｔｅｉｎｓなどの様々な供給業者から得ることができる。一実施形態によれば、ＰＤＧＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号１００－１４Ｂ）から入手される。
特定の実施形態によれば、血小板由来増殖因子は、記号ＰＤＧＦＢを含む遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
ゼノフリー培養培地の調製のために、ＰＤＧＦは、好ましくは、ヒト原料から精製されるか、又は以下にさらに記載されるように組換え発現されることに留意すべきである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦの濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦの濃度は、少なくとも例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約７．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約６０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約７０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約８０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約９０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦの濃度は、最大で例えば約１ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１００ｎｇ／ｍＬである。
具体的な実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）の濃度は、約５ｎｇ／ｍＬである。
具体的な実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）の濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬである。
具体的な実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）の濃度は、約２５ｎｇ／ｍＬである。
具体的な実施形態によれば、培養培地中のＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）の濃度は、約５０ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及びＦＧＦ４である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「上皮成長因子」又は「ＥＧＦ」は、細胞増殖及び分化を刺激する、タンパク質の上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーの任意のポリペプチド、又はその改変体をいう。典型的には、ＥＧＦは、上皮成長因子受容体に結合することによってその活性を発揮する。
したがって、それらの生物学的活性を維持するＥＧＦ分子の任意の変異体、例えば、Ｃ末端短縮型分子（Calnan et al., Gut 2000, 47:622-627）又はＮ末端で切断された分子（Svodoca et.al. Biochim. Biophys. Acta 1994, 1206:35-41、Shin et al. Peptides 1995, 16:205-210）が、本教示に従い使用され得る。
本発明のいくつかの実施形態の培養培地に使用されるＥＧＦは、精製、合成又は組換え発現されたＥＧＦタンパク質（例えば、ヒトＥＧＦポリペプチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１９５４．２、ＮＰ＿００１１７１６０２．１、ＮＰ＿００１３４３９５０．１又はＮＰ＿００１１７１６０１．１、例えば、ヒトＥＧＦポリヌクレオチドであるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９６３ ＮＭ＿００１９６３）であり得る。ＥＧＦは、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、Ａｂｃａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ及びＰｒｏＳｃｉ Ｐｒｏｔｅｉｎｓなどの様々な供給業者から得ることができる。一実施形態によれば、ＥＧＦは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（カタログ番号ＡＦ－１００－１５）から入手される。
特定の実施形態によれば、上皮成長因子は、記号ＥＧＦを含む遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。
ゼノフリー培養培地の調製のために、ＥＧＦは、好ましくは、ヒト原料から精製されるか、又は以下にさらに記載されるように組換え発現されることに留意すべきである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は、少なくとも例えば約０．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約７．５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約２５ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約３０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約４０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約６０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約７０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約８０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約９０ｎｇ／ｍＬ、例えば少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は、最大で例えば約１ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約２５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約５０ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約７５ｎｇ／ｍＬ、最大で例えば約１００ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は約１ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は約５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は約２５ｎｇ／ｍＬである。
特定の実施形態によれば、培養培地中のＥＧＦの濃度は約５０ｎｇ／ｍＬである。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＥＧＦを含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。特定の実施態様によれば、この培養培地はＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＥＧＦを含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ４を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。特定の実施態様によれば、この培養培地はＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。
一実施形態によれば、培養培地は、基本培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）代替血清（ＫｏＳＲ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及びＥＧＦを含む。特定の実施形態によれば、この培養培地は無血清である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＦＧＦ２及びＦＧＦ４である。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ１を含む。特定の実施形態によれば、この培養培地はＴＧＦβ３を含む。特定の実施態様によれば、この培養培地はＰＤＧＦ（例えばＰＤＧＦ－ＢＢ）を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、Ｌ－グルタミンをさらに含む。培養培地中のＬ－グルタミンの濃度は、約０．５ミリモル濃度（ｍＭ）～約１０ｍＭ、例えば、約０．１～５ｍＭ、例えば、約１～５ｍＭ、例えば、約２～５ｍＭ、例えば、１ｍＭ、例えば、２ｍＭであり得る。Ｌ－グルタミンは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル国、ベイトハメック）などの様々な供給業者から得ることができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）をさらに含む。非必須アミノ酸は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、ネブラスカ州、グランドアイランド）などの様々な供給業者から１０ｍＭのストックとして入手することができる。培養培地中の非必須アミノ酸の濃度は、約０．１～１０％、例えば約０．２～５％、例えば約０．５～２％、例えば約１％、例えば約０．５％であり得る。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、約０．０１～１ｍＭ、例えば０．０５ｍＭ、例えば０．１ｍＭの濃度範囲で、ベータ－メルカプトエタノール（β－メルカプトエタノール）などの還元剤をさらに含む。β－メルカプトエタノールは、Ｇｉｂｃｏなどの様々な供給業者から入手することができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、汚染細菌及び汚染真菌の増殖を制御するための抗生物質をさらに含む。一実施形態によれば、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液は、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから得ることができる。培養培地中のペニシリンの濃度は、約５～１００Ｕ／ｍＬ、例えば１０～７５Ｕ／ｍＬ、例えば５０Ｕ／ｍＬであり得る。培養培地中のストレプトマイシンの濃度は、約０．０１～１ｍｇ／ｍＬ、例えば０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば０．０５ｍｇ／ｍＬであり得る。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表１Ａに記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表１Ｂに記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－ＨＧである。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表２に示されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ １－１５である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表３に示されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ １６－３４又はＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ４０－５０である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表５Ａに記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３５である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表５Ｂに記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表５Ｃに記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５２である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表６に記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表７に記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表８に記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、本明細書の以下の表９に記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３９である。
特定の実施形態によれば、培養培地は、以下の表１１Ａに示される通りである。
特定の実施形態によれば、表１１Ａに記載の培養培地は、表１１Ｂに記載の成分のうちの少なくとも１種の成分をさらに含む。
特定の実施形態によれば、培養培地は、以下の表１２Ａ～１２Ｂに記載される通りである。
Figure 2023531975000001
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも約５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、及び少なくとも約０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む限定培養培地であり、培養培地は無血清であり、さらに培養培地は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。特定の実施形態によれば、この培養培地は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬの濃度でｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２）をさらに含む。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸を含む限定培養培地であり、培養培地は無血清であり、さらに培養培地は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のピルビン酸ナトリウムを含む限定培養培地であり、培養培地は無血清であり、さらに培養培地は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、少なくとも４ｇｒ／Ｌの濃度のグルコース、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のピルビン酸ナトリウムを含む限定培養培地であり、培養培地は無血清であり、さらに培養培地は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＤＭＥＭ ＨＧを含む基本培地、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸、及び少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のピルビン酸ナトリウムを含む限定培養培地であり、培養培地は無血清であり、さらに培養培地は多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．６～１．５の範囲であるＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地と、少なくとも約３％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも約０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも約５％の濃度の血清とを含み、さらに、培養培地は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数の増加を支持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＭＥＭαを含む基本培地と、少なくとも約０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも約５％の濃度の血清とを含み、さらに、培養培地は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、ＭＥＭαを含む基本培地と、少なくとも約０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも約２０％の濃度の血清とを含み、さらに、培養培地は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進することができる。
言及したように、本発明の培養培地に使用されるタンパク質性因子のいずれか［例えば、ｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ（例えば、ＰＤＧＦ－ＢＢ）、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３、ＷＮＴ－３Ａ、インスリン、セレン、アルブミン、トランスフェリン］は、組換え発現することができ、又は生化学的に合成することができる。さらに、天然に存在するタンパク質性因子（例えば、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＷＮＴ－３Ａ及びＴＧＦβ）は、当該技術分野で周知の方法を使用して、生物学的サンプルから（例えば、ヒト血清、細胞培養物から）精製され得る。動物由来の混入物を含まない培養培地の調製のために、タンパク質性因子は、好ましくはヒト原料から精製されるか、又は組換発現されることに留意すべきである。
本発明のタンパク質性因子の生化学的合成は、標準的な固相技術を用いて行うことができる。これらの方法には、排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合及び古典的な溶液合成が含まれる。
本発明のタンパク質性因子の組換え発現は、Bitter et al., (1987)Methods in Enzymol.153:516-544、Studier et al. (1990) Methods in Enzymol.. 185:60-89、Brisson et al. (1984) Nature310:511-514、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Brogli et al., (1984) Science 224:838-843、Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565、及びWeissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463に記載されている組換え技術を用いて作製することができ、これらの全内容を参照により本明細書に組み込む。
上述したように、本発明のいくつかの実施形態の培養培地は、ＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる。
一態様によれば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分化させることなく細胞数を増加させる方法であって、本発明のいくつかの実施形態の培養培地中でＭＳＣを培養することによって、ＭＳＣを分化させずに（すなわち、例えば脂肪細胞、骨細胞、及び軟骨細胞などの特殊なタイプの細胞へと分化させずに）細胞数を増加させることができる培養条件下でＭＳＣを培養することを含む方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」又は「増殖させること（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」という用語は、培養期間にわたってＭＳＣの数を増加させること（少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上）を指す。単一のＭＳＣから得ることができるＭＳＣの数は、ＭＳＣの増殖能力に依存することが理解されるであろう。ＭＳＣの増殖能力は、細胞の倍加時間（すなわち、細胞が培養物中で有糸分裂を受けるのに必要な時間）、及び間葉系幹細胞培養物が未分化状態で維持され得る期間（継代の数に各継代間の日数を掛けたものに等しい）によって計算され得る。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、２次元培養において７～１５日間で少なくとも約５～５０倍（例えば、１５～２０倍）の、単一ＭＳＣ（例えば、ＢＭ由来ＭＳＣ、ＵＣ由来ＭＳＣ、ＰＳＣ由来ＭＳＣ）の細胞個数の増加を可能にする（以下でさらに論じられる）。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、三次元培養において１５～２５日（例えば、２０日）で少なくとも約１００～１０００倍（例えば、５００～７００倍）の、単一のＭＳＣ（例えば、ＢＭ由来ＭＳＣ、ＵＣ由来ＭＳＣ、ＰＳＣ由来ＭＳＣ）の増殖を可能にする（以下でさらに論じる）。
例えば、以下の実施例のセクションに記載されるように、ＭＳＣは、二次元接着培養（コーティングあり又はなし）又は懸濁（三次元）培養において培養される場合、少なくとも５～２５継代にわたって、ＭＳＣ培養培地（例えば、以下の表１～３に記載されるＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－３５又はＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ４０－４２培地の各々）の存在下で、増殖性、多能性及び未分化状態を維持され得る。各継代が３～７日毎になされることを考慮すると、ＭＳＣは、約１２５～１７５日間（すなわち、約３０００～４２００時間）維持され得る。ＭＳＣ倍加時間が２５～２５０時間であったことを考慮すると、これらの条件下で培養された単一のＭＳＣは、６×１０７～１．２×１０８個のＭＳＣを生じるように細胞数が増加し得る。
一実施形態によれば、ＭＳＣは、２次元（２Ｄ）培養で培養することができる。
「２次元培養」又は「２Ｄ培養」という用語は、典型的にはプラスチック製の平坦なディッシュ（例えば、ポリスチレン製細胞培養用プレート）上での細胞の増殖を指す。
二次元培養物は、細胞が接着及び広がることができるコーティングされた表面を含み得る。ＭＳＣの細胞個数増加に適した二次元培養表面をコーティングするための例示的な材料としては、限定されないが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、又は接着タンパク質などのその他の市販の細胞接着因子、例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）若しくはビトロネクチン（ＶＮ）など、並びに他のコーティングタンパク質、例えばラミニン（ＬＮ）、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ Ｉ）、ＩＶ型コラーゲン（ＣＯＬ ＩＶ）、及びゼラチンが挙げられる。ＭＳＣの二次元培養のためのさらなるコーティング戦略は、参照により本明細書に援用するCimino et al., Stem Cells International (2017) Article ID 6597815にて議論されている。一実施形態によれば、二次元培養ではコーティングはなされない。
一実施形態によれば、二次元培養におけるＭＳＣの培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが分化を制限する細胞密度で培養プレートにＭＳＣを播種することによって行われる。典型的には、約４×１０３個／ｃｍ２～約２×１０４個／ｃｍ２のプレーティング密度（又は播種密度）が用いられる。
二次元培養中に十分かつ一定の栄養素及び成長因子をＭＳＣに供給するために、培養培地を毎日、又は２～７日（例えば、２～３日）ごとなどの所定のスケジュールで交換することができる。例えば、細胞を二次元培養で成長させ、プレートに接着させた場合の培養培地の交換は、培養皿から培地を吸引し、新鮮な培地を添加することによって行うことができる。
一実施形態によれば、ＭＳＣは三次元（３Ｄ）培養で培養することができる。
「三次元培養」又は「三次元培養」という用語は、三次元、すなわち、幅、深さ及び高さにおいて互いに対して配置された細胞を有する細胞培養を指す。
一実施形態によれば、三次元培養は懸濁培養である。
本明細書で使用される場合、「懸濁培養」という語句は、細胞が表面に付着するのではなく培地中に懸濁される培養を指す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁液中で間葉系幹細胞を培養するための条件は、基材への接着のないものであり、例えば、細胞外マトリックスの成分、ガラスマイクロ担体又はビーズなどの外部基材への接着を伴わない（例えば、無担体の懸濁培養である）。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁培養物中のＭＳＣ（例えば、成体ＭＳＣ）の少なくともいくつかは、容器表面に接着する。
本発明のいくつかの実施形態の方法による懸濁培養におけるＭＳＣの培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが分化を制限する細胞密度で培養容器中にＭＳＣをプレーティングすることによって行われる。典型的には、約１×１０５個／ｍＬ～約３×１０６個／ｍＬのプレーティング密度（又は播種密度）が使用される。バイオリアクターが使用される場合には同様の濃度が使用される（以下で考察される）。
懸濁培養中に十分かつ一定の栄養素及び成長因子をＭＳＣに供給するために、培養培地を毎日、又は２～７日（例えば、２～３日）ごとなどの所定のスケジュールで交換することができる。例えば、培養培地の交換は、ＭＳＣ懸濁培養物を３００～４００ｇで約３分間遠心分離にかけ、形成されたＭＳＣペレットを新鮮な培地に再懸濁することによって行うことができる。加えて又は代わりに、ＭＳＣに栄養素又は成長因子を一定供給するために、培養培地が一定の濾過又は透析に供される培養系を採用してもよい。
本発明のいくつかの実施形態の方法に従って懸濁液中でＭＳＣを培養するために使用される培養容器は、任意の組織培養容器（例えば、ＭＳＣを培養するのに適した純度グレードを有する）であり得る。好ましくは、スケーラブルな培養物を得るために、本発明のいくつかの実施形態による培養は、適切な装置を使用して温度、撹拌、ｐＨ、及びｐＯ２などの培養パラメータが自動的に実現される制御された培養システム（好ましくはコンピュータ制御された培養システム）を使用して行われる。培養パラメータが記録されると、システムには、多能性幹細胞の細胞個数の増加に必要とされる培養パラメータの自動調整が設定される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、動的懸濁培養を含む条件下で行われる。
「動的懸濁培養」という語句は、懸濁培養下にある間に細胞が一定の動きに供される条件を指す。このような状態は、本明細書において以下でさらに議論される。
一実施形態によれば、動的懸濁培養は、Ｗａｖｅリアクター、撹拌リアクター又はスピナーフラスコ（例えば、ガラススピナーフラスコ）を利用する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、静的（すなわち、非動的）懸濁培養を含む条件下で行われる。
「静的懸濁培養」という語句は、懸濁培養下にある間に培養が静止状態に供される条件を指す。このような状態は、本明細書において以下でさらに議論される。
一実施形態によれば、静置懸濁培養は、フラスコ（例えば、三角フラスコ）又はペトリ皿（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ国）から入手可能）を利用する。
本明細書で使用される場合、「継代」又は「継代すること」という用語は、典型的には新鮮な培養培地の添加を含み、培養容器中の細胞を２つ以上の培養容器に分割することを指す。継代は、典型的には、細胞が培養物中で特定の密度に達したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、二次元培養システム下で約１×１０６個／ｍＬの濃度で播種されたＭＳＣ培養物の継代は、細胞濃度が約２倍又は３倍（例えば、約２×１０６～３×１０６個／ｍＬの濃度）に、但し約４倍以下（例えば、約４×１０６個／ｍＬの濃度）で増加したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、静的（すなわち非動的）三次元培養システム下で約１×１０６個／ｍＬの濃度で播種されたＭＳＣ培養物の継代は、細胞濃度が約２倍又は３倍（例えば、約２×１０６～３×１０６個／ｍＬの濃度）に、但し約４倍以下（例えば、約４×１０６個／ｍＬの濃度）で増加したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、動的三次元培養システム下（例えばスピナーフラスコ内）で約１×１０６個の濃度で播種されたＭＳＣ培養物の継代は、細胞濃度が約２０～４０倍（例えば、約２０×１０６～４０×１０６個／ｍＬの濃度）に、但し約５０倍以下（例えば、約５０×１０６個／ｍＬの濃度）で増加したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、少なくとも約２継代、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、少なくとも約２０継代、少なくとも約２５継代、少なくとも約３０継代、少なくとも約３５継代、少なくとも約４０継代、少なくとも約４５継代、少なくとも約５０継代及びそれ以上の間、ＭＳＣの増殖性、多能性及び未分化状態を維持することができる。
特定の実施形態によれば、培養培地は、２～５０回の継代、例えば５～４０回の継代、例えば５～３０回の継代、例えば５～２５回の継代、例えば５～２０回の継代、例えば５～１５回の継代、例えば５～１０回の継代、例えば１０～３０回の継代、例えば１０～２０回の継代、例えば１０～１５回の継代、例えば１５～３０回の継代、例えば１５～２５回の継代、例えば１５～２０回の継代、例えば２０～４０回の継代、例えば２０～３０回の継代、例えば２０～２５回の継代、例えば３０～４０回の継代の間、例えば４０～５０回の継代の間、ＭＳＣの増殖性、多能性及び未分化状態を維持することができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の細胞培養物に含まれるＭＳＣは、培養期間中、例えば少なくとも２継代、例えば少なくとも４継代、例えば少なくとも８継代、例えば少なくとも１５継代、例えば少なくとも２０継代、例えば少なくとも２５継代、例えば少なくとも３０継代、例えば少なくとも３５継代、例えば少なくとも４０継代、例えば少なくとも４５継代、例えば少なくとも５０継代にわたって安定な核型（染色体安定性）を示す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、約１０継代、約１５継代、約２０継代、約２５継代、約３０継代又は約３５継代以下の間培養される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物は、ＭＳＣを非腫瘍形成性の遺伝的に安定な状態に維持する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の細胞培養物は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％が未分化の多能性間葉系幹細胞であることを特徴とする。
本発明のいくつかの実施形態によれば、記載の方法に従って細胞数を増加させたＭＳＣは、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、及び軟骨細胞形成系統のいずれか１系統に分化することができる。
上述したように、本発明のいくつかの実施形態の培養培地は、ＰＳＣのＭＳＣへの分化を促進することができる。
「分化」又は「分化すること」という用語は、細胞（例えば、多能性幹細胞）が発生経路をさらに進んだ発生プロセスを指す相対的な用語である。したがって、いくつかの実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、多能性間葉系幹細胞に分化することができる。
一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下で、本発明のいくつかの実施形態の培養培地における懸濁培養でＰＳＣを培養することによってＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下での懸濁培養において、ＰＳＣを培養することによってＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
一態様によれば、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下での懸濁培養において、ＰＳＣを培養することによってＭＳＣを生成することを含む方法が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣの培養は、懸濁培養（すなわち、上述のような三次元培養）において行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁液中で多能性幹細胞を培養するための条件は、基材への接着がなく、例えば、細胞外マトリックスの成分、ガラスマイクロ担体又はビーズなどの外部基材への接着がない。
ｈＥＳＣ及びｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を培養するいくつかのプロトコルは、カプセルを取り囲むバルク培地との栄養素、ガス、及び代謝産物の交換を可能にする半透過性ヒドロゲル膜の内部における細胞のマイクロカプセル化を含むことに留意されたい（詳細については、例えば、Ｂｅａｒｄｓｌｅｙらの米国特許出願公開第２００９００２９４６２号明細書を参照されたい）。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁培養で培養された多能性幹細胞では、細胞のカプセル化が行われない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁液中で多能性幹細胞を培養するための培養培地及び／又は条件は、タンパク質担体、すなわち、培養物中の細胞へのタンパク質又は栄養素（例えば、亜鉛などのミネラル）の移動において作用するタンパク質を含まない。このようなタンパク質担体は、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）、Ａｌｂｕｍａｘ（脂質富化アルブミン）又はプラスマネート（ヒト血漿単離タンパク質）であり得る。これらの担体はヒト原料又は動物原料のいずれかに由来するため、ヒトｉＰＳ細胞培養物のｈＥＳＣにおけるそれらの使用は、バッチ特異的変異及び／又は病原体への曝露によって制限される。したがって、タンパク質担体（例えば、アルブミン）のない培養培地は、組換え又は合成材料から製造することができる真に限定された培地を可能にするため、非常に有利である。
本発明のいくつかの実施形態の方法による懸濁培養におけるＰＳＣの培養は、細胞分化を促進する細胞密度で培養容器に多能性幹細胞を播種することによって行われる。典型的には、約１×１０５個／ｍＬ～約３×１０６個／ｍＬのプレーティング密度（又は播種密度）が用いられる。バイオリアクターを使用する場合、同様の濃度が用いられる。幹細胞の単一細胞懸濁液が通常播種されるが、例えば１０～２００個の細胞を含む、小さなクラスターもまた使用され得ることが理解される。
懸濁培養中に十分かつ一定の栄養素及び成長因子を多能性幹細胞に供給するために、培養培地を毎日、又は２～３日などの所定のスケジュールで交換することができる。例えば、培養培地の交換は、多能性幹細胞懸濁培養物を３００～４００ｇで約３分間遠心分離し、形成された多能性幹細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁することによって行うことができる。加えて、又は代わりに、多能性幹細胞への栄養素又は増殖因子の一定の供給を提供するために、培養培地が一定の濾過又は透析に供される培養系を採用してもよい。
本発明のいくつかの実施形態の方法に従って懸濁液で多能性幹細胞を培養するために使用される培養容器は、その中で培養される多能性幹細胞が表面に接着又は付着できないよう設計された内部表面（例えば、表面への細胞の接着又は付着を防止するために非組織培養処理された表面）を有する任意の組織培養容器（例えば、多能性幹細胞を培養するのに適した純度グレードを有する）であってもよい。好ましくは、スケーラブルな培養物を得るために、本発明のいくつかの実施形態による培養は、適切な装置を使用して温度、撹拌、ｐＨ、及びｐＯ２などの培養パラメータが自動的に実現される制御された培養システム（好ましくはコンピュータ制御された培養システム）を使用して行われる。培養パラメータが記録されると、システムは、多能性幹細胞の細胞個数の増加に必要とされる培養パラメータの自動調整が設定される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、静的（すなわち、非動的）懸濁培養を含む条件下で行われる。
多能性幹細胞の非動的培養のために、多能性幹細胞は、コーティングされていない５８ｍｍペトリ皿（Greiner、ドイツ国、フリッケンハウゼン）中で培養することができる。例えば、５８ｍｍペトリ皿上で懸濁培養を開始するために、多能性幹細胞を１×１０６～５×１０６個／皿の細胞密度で播種する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、動的懸濁培養（例えば、Ｗａｖｅリアクター又は撹拌リアクターを使用する）を含む条件下で行われる。
多能性幹細胞の動的培養のために、多能性幹細胞は、制御ユニットに接続して培養システムを制御することができるスピナーフラスコ［例えば、２００ｍＬ～１０００ｍＬ、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ドイツ国、フェルンヴァルト）の２５０ｍＬのＣｅｌｌＳｐｉｎ、ニュージャージー州、バインランド、Ｂｅｌｌｃｏ製の１００ｍＬのもの、又は１２５ｍＬの三角フラスコ（米国、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）］中で培養することができる。培養容器（例えば、スピナーフラスコ、三角フラスコ）を連続的に振とうする。本発明のいくつかの実施形態によれば、培養容器は、磁気プレートを使用して４０～１１０回転／分（ｒｐｍ）で振とうされ、インキュベータ内に配置される。加えて、又は代わりに、培養容器は、振とう機（Ｓ３．０２．１０Ｌ、ＥＬＭＩ ｌｔｄ（リガ、ラトビア国））を使用して振とうすることができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、１～３日毎、例えば、毎日交換される。インペラーによって培地を撹拌し、本発明のいくつかの実施形態による培養培地中での多能性幹細胞の動的培養に使用することができる、他の好適な制御バイオリアクターとしては、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）ＡＰＬＵＳ細胞培養（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（米国、ニューヨーク州、エッジウッド））、Ｃｅｌｌ Ｌｉｆｔのインペラー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ（スイス国、リッターガッセ））を備えたＣｅｌｌ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ制御バイオリアクター（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（米国、ニュージャージー州、ミルビル））、Ｉｎｆｏｒｍｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ撹拌リアクター（Ｉｎｆｏｒｍｓ ＧＡ、ＣＨ－４１０３、スイス国、ボットミンゲン）が挙げられる。
加えて、又は代わりに、多能性幹細胞の動的培養は、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（米国、ニューヨーク州、エッジウッド）（１リットルを含む２リットルバッグ）などの、細胞の動態が波状運動によって達成される、制御されたバイオリアクターを使用して達成することができる。リアクターのパラメータとしては、傾斜速度：１０～１６回転／分（ｒｐｍ）、角度：７°、温度：３７℃、ＰＨ：７～７．４、Ｏ２濃度：５０％が挙げられる。別の好適なバイオリアクターは、ＷａｖｅＰｏｄ ｓｙｓｔｅｍ ２０／５０ ＥＨ５ Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）であり、このリアクターは、同じパラメータを使用しながら１２日間で７０倍の増加を可能にする。さらなる適切なバイオリアクターは、リアクター内のせん断力を最小にし得る５５ｍＬのＲＷＶ／ＳＴＬＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（米国、テキサス州、ヒューストン）である。
例えば、動的条件下で懸濁培養を開始するために、多能性幹細胞は、約１０４～１０６個／ｍＬの濃度で播種される。
動的懸濁培養において、多能性幹細胞は、（以下に記載されるように）凝集塊を解離することによって５～７日ごとに継代することができる。バイオリアクターは大容量であるため、細胞培養はさらなる培養容器へのさらなる分割を必要とせず、培地の添加及び／又は新鮮な培地との交換のみを３～１０日ごとに行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＳＣの懸濁培養物は、凝集塊を含む。
本明細書で使用される場合、「凝集塊」という用語は、懸濁液中で互いに接着している細胞のクラスターを指す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、凝集塊は、任意の機械的解離又は酵素による解離を用いずに懸濁培養物の培地が変更された（例えば、増やす、減らす又は交換する）ときにそのまま（ｉｎｔａｃｔ）の状態である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞塊の各々は、少なくとも約２５０個の細胞（例えば、約２５０個）、例えば、少なくとも約５００個の細胞（例えば、約５００個）、少なくとも約６００個の細胞（例えば、約６００個）、少なくとも約７００個の細胞（例えば、約７００個）、少なくとも約８００個の細胞（例えば、約８００個）、少なくとも約９００個の細胞（例えば、約９００個）、少なくとも約１０００個の細胞（例えば、約１０００個）、少なくとも約１１００個の細胞（例えば、約１１００個）、少なくとも約１２００個の細胞（例えば、約１２００個）、少なくとも約１３００個の細胞（例えば、約１３００個）、少なくとも約１４００個の細胞（例えば、約１４００個）、少なくとも約１５００個の細胞（例えば、約１５００個）、少なくとも約５×１０３個の細胞（例えば、約５×１０３）、少なくとも約１×１０４個の細胞（例えば、約１×１０４）、少なくとも約５×１０４個の細胞（例えば、約５×１０４）、少なくとも約１×１０５個の細胞（例えば、約１×１０５）、又はそれ以上を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、静的（すなわち非動的）三次元培養システム下で約１×１０６個の濃度で播種された細胞培養物の継代は、細胞濃度が約２倍又は３倍（例えば、約２×１０６～３×１０６個／ｍＬの濃度）に、但し約４倍以下（例えば、約４×１０６個／ｍＬの濃度）増加したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、動的三次元培養システム下（例えばスピナーフラスコ内）で約１×１０６の濃度で播種された細胞培養物の継代は、細胞濃度が約２０～４０倍（例えば、約２０×１０６～４０×１０６個／ｍＬの濃度）であるが、約５０倍以下（例えば、約５０×１０６個／ｍＬの濃度）増加したときに行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代は、細胞培養物中の凝集塊の解離を必ずしも必要としない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁培養物には凝集塊が存在しない。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁培養物は単一細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「単一細胞」という語句は、多能性幹細胞が、懸濁培養において細胞クラスター（すなわち、各クラスターは約２５０個を超える多能性幹細胞を含む）を形成しない状態を指す。
本発明のいくつかの実施形態によれば、多能性幹細胞は細胞クラスターを形成せず、単一細胞の各クラスターは、懸濁培養物中に、約２００、約１５０、約１００、約９０、約８０、約７０、約６０、約５０、約４０、約３０、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約３、約２、又は約１個以下の多能性幹細胞を含む。
本発明のいくつかの実施形態によれば、複数の多能性幹細胞の各々は、懸濁培養中に別の多能性幹細胞に接着しない。
一実施形態によれば、多能性幹細胞塊の単一細胞への分離は機械的解離によって行われ、すなわち、酵素活性ではなく物理的な力によって行われる。
機械的解離のために、多能性幹細胞のペレット（細胞の遠心分離によって達成され得る）又は単離された多能性幹細胞塊は、少量の培地（例えば、０．２～１ｍＬ）中で細胞を上下にピペッティングすることによって解離され得る。例えば、ピペッティングは、２００μＬ又は１０００μＬピペットのチップを使用して数回（例えば、３～２０回の間）行うことができる。
加えて、又は代わりに、大きな多能性幹細胞塊の機械的解離は、凝集塊を所定のサイズに崩し分けるよう設計された装置を使用して行うことができる。このような装置は、スウェーデン国、ゲーテボリのＣｅｌｌＡｒｔｉｓ社から入手することができる。加えて、又は代わりに、機械的解離は、倒立顕微鏡下で凝集塊を観察しながら、２７ゲージの針（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（アイルランド国、ドラハダ）などの針を使用して手作業で行うことができる。
一実施形態によれば、多能性幹細胞塊の単一細胞への分離は、酵素による解離によって（例えば、トリプシン、エラスターゼ及び／又はコラゲナーゼによって）行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、継代は、酵素的解離のない条件下で行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、懸濁液での培養は、酵素による細胞クラスター／細胞塊の解離のない条件下で行われる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養条件は、抗アポトーシス剤を使用しないものである。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養条件は、抗アポトーシス剤、例えばＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤による作用を受ける。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えばＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（米国、カリフォルニア州、ラホヤ）から市販されている。
一実施形態によれば、懸濁培養物中の多能性幹細胞が、少なくとも約２継代及び約１０継代以下の間、酵素による細胞クラスターの解離を伴わずに機械的に継代される場合、多能性幹細胞は単一細胞様式の細胞増殖を採用し（すなわち、それらの細胞は、凝集塊としてではなく、単一細胞として細胞数が増加する）、少なくとも約１５回、２０回又は２５回のさらなる継代の間、（ＰＣＴ国際公開第２０１２／０３２５２１号において以前に議論されたように）細胞クラスターのさらなる解離を必要とせずに増殖する。
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養は、未分化の多能性の状態で少なくとも１回の継代、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回の継代にわたって行われる。
細胞は単一細胞として培養されるが、細胞の濃度が１ミリリットル当たり約１×１０６個の細胞数を超える場合（例えば、５×１０６個／ペトリ皿５ｍＬ中）、それらの細胞はより希釈される必要があることに留意すべきである。
一実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、３～３０日間、例えば、約３～２１日間、例えば、約３～１８日間、例えば、約３～１４日間、例えば、約３～１２日間、例えば、約３～１０日間、例えば、約３～７日間、例えば、約３～５日間、例えば、約５～２１日間、例えば、約５～１４日間、例えば、約５～１０日間、例えば、約５～７日間、例えば、約７～２１日間、例えば、約７～１４日間、例えば、約７～１２日間、例えば、約７～１０日間、例えば、約１０～２１日間、例えば、約１０～１４日間、作用される。
一実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、約３日間、約５日間、約７日間、約１０日間、約１２日間、約１４日間、約１７日間、約１９日間、約２１日間、約２４日間、約２７日間、約３０日間、作用される。
一実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、最大で約５日間、約７日間、約１０日間、約１２日間、約１４日間、約１７日間、約１９日間、約２１日間、約２４日間、約２７日間、約３０日間、作用される。
特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、３～１４日間（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４日間）作用される。
特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、３～１０日間（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０日間）作用される。
特定の実施形態によれば、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の分化は、３～５日間（例えば、約３、４、５日間）作用される。
多能性幹細胞が間葉系幹細胞に分化したか否かの判定は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、ＦＡＣＳ解析などを使用して、細胞表面マーカーの発現を決定することによる（以下で考察される）。加えて、又は代わりに、機能アッセイ、特に、複数の分化子孫細胞を生じる幹細胞の能力に関するアッセイ、及び標準的なＷＮＴシグナル伝達に対する応答性についてのアッセイなどを、インビトロ及びインビボの両方で行うことができる。
一実施形態によれば、ＭＳＣは、例えば、ＣＤ５４、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１１２、ＣＤ１４６、ＣＤ１５５、ＣＤ１６６、ＣＤ２７６及び／又はＣＤ３０４の細胞表面発現を特徴とする。一実施形態によれば、ＭＳＣは、例えばＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ１４及び／又はＣＤ４５の細胞表面発現がないことを特徴とする。一実施形態によれば、ヒトＭＳＣは、ＣＤ１４及び／若しくはＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９及び／若しくはＣＤ７９ａ、又はＨＬＡ－ＤＲの細胞表面発現が存在しないことによって特徴付けられ得る。マーカーの全てが単一のＭＳＣ細胞上で発現され得るか、あるいは、マーカーが異なるＭＳＣ細胞上で（例えば、同じ培養物中で）発現され得ることが理解される。
特定の実施形態によれば、ヒトＭＳＣは、発現シグネチャーＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の細胞を特徴とする。
一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって生成されたＭＳＣの少なくとも約２０～１００％、例えば約２０～３０％、例えば約２０～４０％、例えば約２０～６０％、例えば約３０～５０％、例えば約３０～７０％、例えば約４０～５０％、例えば約４０～８０％、例えば約５０～６０％、例えば約５０～７０％、例えば約６０～８０％、例えば約６０～９０％、例えば約７０～９０％、例えば約８０～１００％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の発現シグネチャーによって特徴付けられる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって生成されるＭＳＣの少なくとも約３０％（例えば、３０％）、少なくとも約３５％（例えば、３５％）、少なくとも約４０％（例えば、４０％）、少なくとも約４５％（例えば、４５％）、少なくとも約５０％（例えば、５０％）、少なくとも約５５％（例えば、５５％）、少なくとも約６０％（例えば、６０％）、少なくとも約６５％（例えば、６５％）、少なくとも約７０％（例えば、７０％）、少なくとも約７５％（例えば、７５％）、少なくとも約８０％（例えば、８０％）、少なくとも約８１％（例えば、８１％）、少なくとも約８２％（例えば、８２％）、少なくとも約８３％（例えば、８３％）、少なくとも約８４％（例えば、８４％）、少なくとも約８５％（例えば、８５％）、少なくとも約８６％（例えば、８６％）、少なくとも約８７％（例えば、８７％）、少なくとも約８８％（例えば、８８％）、少なくとも約８９％（例えば、８９％）、少なくとも約９０％（例えば、９０％）、少なくとも約９１％（例えば、９１％）、少なくとも約９２％（例えば、９２％）、少なくとも約９３％（例えば、９３％）、少なくとも約９４％（例えば、９４％）、少なくとも約９５％（例えば、９５％）、少なくとも約９６％（例えば、９６％）、少なくとも約９７％（例えば、９７％）、少なくとも約９８％（例えば、９８％）、少なくとも約９９％（例えば、９９％）、例えば、１００％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の発現シグネチャーを特徴とする。
特定の実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって生成されるＭＳＣの少なくとも３０％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の発現シグネチャーを特徴とする。
特定の実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって生成されるＭＳＣの少なくとも４０％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の発現シグネチャーを特徴とする。
特定の実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって生成されるＭＳＣの少なくとも５０％は、ＣＤ１０５＋／ＣＤ１４６＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ３１－／ＣＤ３４－／ＣＤ４５－の発現シグネチャーを特徴とする。
一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って生成された懸濁培養物中に単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団が提供される。
一実施形態によれば、ＭＳＣと、本発明のいくつかの実施形態の培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＭＳＣと、基本培地、有効量のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む限定培養培地と、を含む細胞培養物であって、培養培地が無血清である、細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＭＳＣと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも約５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、及び少なくとも約０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む限定培養培地と、を含む細胞培養物であって、培養培地が無血清である細胞培養物が提供される。特定の実施形態によれば、この培養培地は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬの濃度でｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２）をさらに含む。
一実施形態によれば、ＭＳＣと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２対ＭＥＭαの体積比が０．４～２．３の範囲である、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＭＳＣと、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．６～１．５の範囲であるＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも約３％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも約０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、及び少なくとも約５％の濃度の血清を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、本発明のいくつかの実施形態の培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、ＭＥＭαを含む基本培地、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、ＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、基本培地、有効量のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む限定培養培地と、を含む細胞培養物であって、培養培地が無血清である、細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地、少なくとも約５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、及び少なくとも約０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む限定培養培地と、を含む細胞培養物であって、培養培地が無血清である細胞培養物が提供される。特定の実施形態によれば、この培養培地は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬの濃度でｂＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２）をさらに含む。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、ＤＭＥＭ／Ｆ１２対ＭＥＭαの体積比が０．４～２．３の範囲である、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
一実施形態によれば、ＰＳＣと、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．６～１．５の範囲であるＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも約３％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）、少なくとも約０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）、及び少なくとも約５％の濃度の血清を含む培養培地と、を含む細胞培養物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の間葉系幹細胞又は本発明のいくつかの実施形態の細胞培養物を利用して、ホルモン、サイトカイン、成長因子及び薬物などのタンパク質を大量に産生（大量生産）することができる。例えば、タンパク質を産生するために、細胞は、例えばトランスフェクションによってかかるタンパク質を過剰発現するように誘導されるべきであり、細胞個数の増加後に、タンパク質は培養培地から単離され得る。
本発明のいくつかの実施形態の間葉系幹細胞又は本発明のいくつかの実施形態の細胞培養物を使用して、系統前駆細胞（ｌｉｎｅａｇｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）から最終分化細胞への分化に影響を及ぼす因子（小分子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）又は条件（培養条件又は操作など）をスクリーニングすることができる（例えば、薬物スクリーニングのため）。例えば、増殖に影響を与える物質、毒素又は有望な分化因子が、培養培地へのそれらの添加によって試験され得る。
本発明のいくつかの実施形態の間葉系幹細胞又は本発明のいくつかの実施形態の細胞培養物は、ワクチンを調製するために使用することができる。例えば、多能性幹細胞、間葉系幹細胞又はそれらから分化した細胞にウイルス粒子を接種し、新たに産生されたウイルス粒子が細胞溶解により培地中に放出されるまで適切な培地中でさらに培養することができる。該細胞は、ポックスウイルスのファミリーに属する弱毒化ウイルス、特にカナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス及びワクシニアウイルス、例えば天然又は組換えワクシニアウイルス［例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ－１５０８で入手可能なＭＶＡなどの改変ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）又は他のオルトポックスウイルス］の産生に使用することができる。さらなる説明については、全内容を参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第２００４００５８４４１号を参照されたい。
本発明のいくつかの実施形態の多能性幹細胞又は間葉系幹細胞は、目的のポリヌクレオチドの感染又はトランスフェクションのいずれかを使用することによって、遺伝子操作に供され得る。ポリヌクレオチドは、プロモーターの調節下で核酸構築物中に含まれ得る。
ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら［Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992)］、Ａｕｓｕｂｅｌら［Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)］、Ｃｈａｎｇら[Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor MI (1995)]、Ｖｅｇａら[Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor MI (1995)]、Ｖｅｃｔｏｒｓ［A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988)］、及びGilboa et al［Biotechniques 4 (6): 504-512 (1986)］に記載されており、例えば、安定的又は一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、及び組換えウイルスベクターによる感染［例えば、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス由来ベクターＡｄ－ＴＫを使用する、Sandmair et al., 2000. Hum Gene Ther.11:2197-2205）、レトロウイルス成分及びアデノウイルス成分を組み合わせたキメラアデノウイルス／レトロウイルスベクター（Pan et al., Cancer Letters 184:179-188, 2002）が挙げられる。中枢神経系に関与するベクターについては米国特許第４、８６６、０４２号明細書も、また相同組換えを誘導するためのポジティブ－ネガティブ選択法については米国特許第５、４６４、７６４号明細書及び同第５、４８７、９９２号明細書も、参照されたい。
本発明は、細胞置換療法（細胞ベースの療法）を必要とする障害を治療するための、本発明のいくつかの実施形態の細胞個数増加後のＭＳＣ及び／又は分化後のＭＳＣの使用を企図する。
例えば、間葉系細胞は、骨及び軟骨の欠損、心血管疾患、神経疾患、及び免疫疾患の治療において使用することができる（Parekkadan and Milwid, Mesenchymal Stem Cells as Therapeutics, Annu Rev Biomed Eng. (2010) 12:87-117に記載）。
本発明のいくつかの実施形態の間葉系幹細胞は、生物にかかる細胞そのものとして投与されてもよいし、適切な担体又は添加物と混合された医薬組成物として投与されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」は、生理学的に好適な担体及び添加物などの他の化学成分を含む、本明細書に記載の有効成分のうちの１種以上の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
本明細書では、「有効成分」という用語は、生物学的効果をもたらすことのできる間葉系幹細胞を指す。
以下、互換的に使用され得る「生理学的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激をもたらさず、投与する化合物の生物学的活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。これらの語句にはアジュバントが含まれる。
本明細書では、「添加物」という用語は、有効成分の投与を更に容易にするために医薬組成物に添加する不活性な物質を指す。限定するものではないが、添加物の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及び様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、及びポリエチレングリコールが挙げられる。
薬物の処方及び投与のための技術は、参照により本明細書に援用する、“Remington‘s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版に見出すことができる。
好適な投与経路としては、例えば、筋肉内注射、皮下注射及び髄内注射並びに髄腔内注射、直接脳室内注射、心臓内注射、例えば右心室腔又は左心室腔注射、総冠動脈注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射などの、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸、又は非経口での送達を挙げることができる。
本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当該技術分野において周知のプロセスにより、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、浸出、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥のプロセスにより製造され得る。
したがって、本発明のいくつかの実施形態で使用する医薬組成物は、有効成分の製剤への加工を容易にする、薬学的に使用可能である添加物及び助剤を含む、１種以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で処方され得る。適切な処方は、選択される投与経路によって異なる。
例えば、注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル液、又は生理的塩類緩衝液などの生理学的に適合する緩衝液として処方され得る。経粘膜投与の場合、浸透させるバリアに適した浸透剤が処方に使用される。このような浸透剤は、当該技術分野において一般的に既知である。
本発明のいくつかの実施形態に関連して使用するのに好適な医薬組成物としては、意図された目的を達成するのに有効な量で有効成分を含有する組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、骨及び軟骨の欠損）の症状を予防、緩和、又は改善するのに有効であるか、又は治療を受ける対象の生存期間を延長するのに有効である、有効成分（間葉系幹細胞）の量を意味する。
治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療有効量又は治療有効用量は、最初にインビトロ及び細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するよう動物モデルで処方され得る。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の有効成分の毒性及び治療効果は、インビトロ、細胞培養又は実験動物において、標準的な医学的手順によって評価することができる。これらのインビトロ及び細胞培養アッセイ並びに動物実験より得られたデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を公式化（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）する際に使用され得る。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて様々であり得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して各医師が選択することができる。（例えば、Fingl et al., 1975における“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch.1 p.1を参照されたい）。
投与量及び投与間隔は、有効成分の濃度が生物学的効果を誘導又は抑制するのに十分なもの（最小有効濃度、ＭＥＣ）になるよう、個別に調整され得る。ＭＥＣは調製物ごとに異なるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投与量は、個々の特性及び投与経路によって異なる。検出アッセイを使用して血漿濃度を測定することができる。
治療される状態の重症度及び応答性に応じて、投与は、単回投与又は複数回投与とすることができ、治療の工程は、数日から数週間まで、又は治癒がもたらされるまで、又は疾患状態の減縮が達成されるまで持続される。
投与する組成物の量は、当然、治療を受ける対象、苦痛の程度、投与方法、処方した医師の判断などによって異なる。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望される場合、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得る、ＦＤＡ承認キットなどのパック又はディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属箔又はプラスチック箔を含み得る。パック又はディスペンサーデバイスは、投与についての説明書が添付されていてもよい。パック又はディスペンサーはまた、医薬品の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器と関連のある通知を提供してもよく、この通知は、組成物又はヒト若しくは獣医用投与の形態に関する機関による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局によって承認されたラベル、又は製品添付文書であり得る。適合性のある医薬担体で処方された本発明の調製物を含む組成物はまた、上記で更に詳述されるように、調製され、適切な容器中に配置され、指定の状態の治療用にラベルが付されてもよい。
用語「ｎｇ」はナノグラムを指す。用語「ｐｇ」はピコグラムを指す。用語「ｍＬ」はミリリットルを指す。用語「ｍＭ」はミリモル濃度を指す。用語「μＭ」はマイクロモル濃度を指す。
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物、方法又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部分を含み得るが、当該追加の成分、工程、及び／又は部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、又は構造の基本的及び新規な特徴を大きく変化させない場合に限られることを意味する。
本明細書で使用する場合、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１種の化合物」は、複数の化合物を含み、それらの混合物も含み得る。
本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性及び簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限をなすものと解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲の全部、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５及び６も具体的に開示するとみなされるべきである。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
本明細書において数値範囲を示す場合は常に、示された範囲内の任意の記載された数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数と「の間の範囲」という語句と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句とは、本明細書で互換的に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、第１の指示数と第２の指示数との間の分数及び整数の全部とを含むことを意図する。
本明細書で使用する場合、「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「治療すること」という用語は、状態の進行を抑制し、実質的に阻害し、遅延、又は逆転させ、状態の臨床的若しくは審美的な症状を実質的に改善するか、又は状態の臨床的若しくは審美的な症状の出現を実質的に予防することを含む。
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために単一の実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、又は任意の好適な部分的な組み合わせ、又は適宜、本発明の他の任意の記載された実施形態に対しても提供され得る。様々な実施形態に関連して記載される特定の特徴は、その要素なしでは実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須の特徴であるとみなすべきではない。
本明細書に上記され、特許請求の範囲において特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。
以下では実施例を参照する。本実施例は、上記の説明と共に本発明のいくつかの実施形態を非限定的な様式で例示するものである。
全般的に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学、顕微鏡、及び組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、“Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989)、“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４、６６６、８２８号明細書、第４、６８３、２０２号明細書、第４、８０１、５３１号明細書、第５、１９２、６５９号明細書、および第５、２７２、０５７号明細書に記載された方法、“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、“Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３、７９１、９３２号明細書、第３、８３９、１５３号明細書、第３、８５０、７５２号明細書、第３、８５０、５７８号明細書、第３、８５３、９８７号明細書、第３、８６７、５１７号明細書、第３、８７９、２６２号明細書、第３、９０１、６５４号明細書、第３、９３５、０７４号明細書、第３、９８４、５３３号明細書、第３、９９６、３４５号明細書、第４、０３４、０７４号明細書、第４、０９８、８７６号明細書、第４、８７９、２１９号明細書、第５、０１１、７７１号明細書、および第５、２８１、５２１号明細書、“Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、“Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、“Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986)、“Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986)、“A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)および “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press、“PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)を参照されたい。を参照されたい。上記文献の全てが、本参照により本明細書に完全に組み込まれるものとする。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に組み込まれる。
一般的な材料及び実験手順
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株
ＫＹＯＵ－ＤＸＲ０１０９Ｂヒト人工多能性幹（ＩＰＳ）細胞［２０１Ｂ７］、ＡＴＣＣカタログ番号ＡＣＳ－１０２３を使用した。
ＤＹＲ０１００、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＣＳ－１０１１。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株
Ｉ３（ＴＥ０３）、ＥＳＣ、雌性細胞を使用した。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）株
以下の細胞を使用した。
ｈＭＳＣ－ＢＭ－ｃ ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、カタログ番号Ｃ－１２９７４
ｈＭＳＣ－ＵＣ－ｃ ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、カタログ番号Ｃ－１２９７１．
ｈＭＳＣ－Ａｄｉｐｏ－ｃ ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、カタログ番号Ｃ－１２９７７
三次元培養における細胞培養／間葉系分化
無血清培地を用いる懸濁培養（三次元、３Ｄ）により、ｈＰＳＣを細胞凝集塊として又は単一細胞として培養した。細胞凝集塊を、穏やかなピペッティングによって機械的に、又はトリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）若しくは任意の同様な酵素を使用して酵素作用により、３～７日ごとに継代した。
培地組成をｈＰＳＣ増殖培地からＭＳＣ分化用培地に変更することによって間葉系分化を誘導した（以下の表６～表９の分化用培地のリストを参照）。３～７日毎に、穏やかなピペッティングによって機械的に、又はトリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）若しくは任意の同様な酵素を使用して酵素作用により細胞を継代した。分化の２～２１日後に、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ３１及び／又はＣＤ４５の表面発現を調べた。ＭＳＣ分化は、典型的には、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ７３、ＣＤ９０及び／又はＣＤ４４の発現／高発現、並びにＣＤ３１、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４５の低発現／無発現によって決定した。さらに、重要な多能性マーカー（例えば、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ）の発現を調べたところ、間葉系への分化による多能性の喪失が示された。
ｈＥＳＣ又はｉＰＳＣの分化により得られた、それぞれ以下で「ｈＥＳＣ－ＭＳＣ」又は「ｉＰＳＣ－ＭＳＣ」と称されるＭＳＣ細胞は、二次元接着培養で再播種したときプラスチック接着性であった。ｈＥＳＣ－ＭＳＣはさらに、二次元培養では骨細胞、脂肪細胞に、三次元ペレット培養では軟骨細胞に分化した。
脂肪細胞への分化
三次元培養から得られたｈＥＳＣ－ＭＳＣを二次元培養に播種し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ ｌ－グルタミンを含有するＤＭＥＭ Ｆ－１２培地で増殖させた。培地には０．５ｍＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン、１０ｍｇ／ｍＬのインスリン、１０－６Ｍのデキサメタゾン、及び０．１ｍＭのインドメタシン（すべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加した。培地を４週間まで３～４日毎に交換した。脂肪細胞への分化を、以下に考察するオイルレッドＯ染色（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって確認した。
骨細胞への分化（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）
三次元培養から得られたｈＥＳＣ－ＭＳＣを二次元培養に播種し、１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１％非必須アミノ酸、５０ｍｇ／ｍＬのＬ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．０７５ｍＭのｂ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのｂ－グリセロール－リン酸及び０．１ｍＭのデキサメタゾン（すべてＳｉｇｍａから）を含むＧＭＥＭ ＢＨＫ－２１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）からなる骨細胞分化用培地で増殖させた。培地を３～４日毎に３～４週間交換した。骨細胞への分化は、以下に考察するアリザリンレッド染色によって確認した。
軟骨細胞への分化
三次元培養から得られたｈＥＳＣ－ＭＳＣ（２×１０５個）を、１５ｍＬのポリプロピレン製ファルコンチューブ中、３００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを形成した。１０－７Ｍデキサメタゾン、１％ＩＴＳ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｌ－アスコルビン酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのｌ－プロリン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＢＩとも呼ばれる）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で細胞を４～９週間増殖させた。凝集塊を乱さずに、培地を週２回交換した。軟骨細胞への分化は、以下に考察するヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにアルシアンブルー染色によって確認した。
細胞培養－成体ＭＳＣ及び胎生ＭＳＣ
成体ＭＳＣ及び胎生ＭＳＣを、二次元培養（プレートコーティング有り又は無し）において増殖培地（以下の表１～表４及び表５Ａ～表５Ｃの増殖培地のリストを参照）で少なくとも３継代培養した。トリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）又は任意の同様な酵素を使用して、３～７日毎に酵素作用により細胞を継代した。
あるいは、ｈＥＳＣ－ＭＳＣ又はｉＰＳＣ－ＭＳＣを、増殖培地（以下の表１～表４及び表５Ａ～表５Ｃの増殖培地のリストを参照）での懸濁培養（三次元）で７～３０日間培養した。細胞を、穏やかなピペッティングによって機械的に、又はトリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）若しくは任意の同様な酵素を使用して酵素作用により継代した。
マーカー発現（ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ７３、ＣＤ９０及び／又はＣＤ４４の発現並びにＣＤ３１、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４５の低発現／無発現）並びに脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞への多系統分化能について細胞を特徴付けた。
全ての実験において、各培地交換時には増殖因子（ＧＦ）を新たに添加した。
成体ＭＳＣ及び胎生ＭＳＣのための増殖培地のリスト
以下の培養培地の組み合わせを、二次元培養又は懸濁培養（三次元）におけるＭＳＣの増殖（細胞増殖／細胞個数の増加）を支持するそれらの能力について試験した。
Figure 2023531975000002
Figure 2023531975000003
Figure 2023531975000004
Figure 2023531975000005
Figure 2023531975000006
Figure 2023531975000007
Figure 2023531975000008
ＭＳＣ分化用培地のリスト
以下の培養培地を、懸濁培養（三次元）においてヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のＭＳＣへの分化を支持するそれらの能力について試験した。
Figure 2023531975000009
Figure 2023531975000010
Figure 2023531975000011
Figure 2023531975000012
増殖アッセイ
各実験において、細胞が約７０～９０％コンフルエンスに達したら細胞を計数し、増加倍率、集団倍加時間及び累積細胞数を、集団倍加時間（ＰＤＴ）又は比色アッセイ（ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ）によって決定した。
フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）
細胞を、酵素溶液を用いて（二次元培養の場合）、又は遠心分離によって（三次元培養の場合）回収した。細胞を染色バッファーに再懸濁し、以下に示す抗体の各々：ＣＤ４５、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、Ｃ１４６、ＣＤ３１、ＣＤ３４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ７３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｏｃｔ３／４及び／又はＮａｎｏｇ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と共にインキュベートし、ＢＤ（商標）ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを使用して取得した。
アリザリンレッド染色
細胞をＰＢＳで２回濯ぎ、４％ＰＦＡで２０分間固定し、再度濯ぎ、２％のアリザリンレッド溶液（ｐＨ ４．１～４．５、Ｓｉｇｍａ）中、室温で１５分間染色し、水で３回濯ぎ、水中に放置した。
オイルレッド染色
細胞をＰＢＳで３回濯ぎ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２０分間固定し、ＰＢＳで再度濯ぎ、オイルレッドＯ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温にて１０分間染色し、次いで水で３回濯ぎ、水中に放置した。
アルシアンブルー染色
細胞ペレットを４％ＰＦＡで固定し、低融点アガロース（１．５％）中に包埋した後、細胞切片を調製した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）及びアルシアンブルー染色を行った。
実施例１
三次元懸濁培養におけるヒト前駆幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の間葉系幹細胞への分化
懸濁培養系において、ヒトＰＳＣ（系統：ＴＥ０３、Ｋｙｏｕ、Ｉ３）を凝集体として（Ｍａｘｅｌｌｓ（商標））又は単一細胞として（Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標））培養した。
培地をｈＰＳＣ基礎増殖培地からＭＳＣ－Ｄｉｆｆ及び高レベルの３６培地に変更し、懸濁培養して２～２１日後、細胞は形態（図１Ａ及び図１Ｃ）、並びにＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及び高レベルのＣＤ１４６の共発現（図２Ａ～図２Ｃ）によって明らかなようにＭＳＣに分化した。さらに、細胞は、内皮マーカーＣＤ３１及び造血系マーカーＣＤ４５を有しなかった（図２Ｄ～図２Ｅ）。さらに、細胞は、プラスチック接着性であり（図１Ｂ及び図１Ｄ）、インビトロで中胚葉誘導体（骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨芽細胞）に分化した（図３Ａ～図３Ｃ）。
さらなる実験では、ヒト誘導幹細胞（ｉＰＳ細胞株Ｄｙｒ０１００）を異なる３種類の分化用培地、すなわちＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７又はＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８中で成長させ、懸濁培養で７～１４日後、細胞をＭＳＣ細胞シグネチャーについて評価した。図１３から明らかなように、間葉系マーカーＣＤ９０は、３種類の全ての分化用培地において培養開始から７～８日後に見られた。ＭＳＣ分化は、３種類の全ての培養培地において、以下の間葉系マーカー：ＣＤ７３、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６の発現の増加、並びに造血系マーカーＣＤ４５の発現の減少（図１４）、並びに間葉系の分化の進行に伴った多能性マーカーＯＣＴ４の顕著な減少（図１５）から、さらに明らかであった。さらに、ｉＰＳＣ由来ＭＳＣ（３種類の全ての試験培地における間葉系分化の７日又は１４日後）は、インビトロで骨細胞（図１６Ａ～図１６Ｈ）及び脂肪細胞（図１７Ａ～図１７Ｄ）へと分化した。
同様の結果が、二次元接着培養における再プレーティング後のｉＰＳＣ由来ＭＳＣについても見られた。具体的には、分化用培地ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７及びＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８を用いた三次元懸濁培養において分化させたヒトｉＰＳ由来ＭＳＣは、二次元培養において１５日間再播種した後に間葉系マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１４６の高発現を維持し（図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１９）、造血系マーカーＣＤ４５の低発現を示した（図１９）。さらに、これらのｉＰＳＣ由来ＭＳＣは、二次元培養で再播種した後、インビトロで骨細胞（図２０Ａ～図２０Ｃ）及び脂肪細胞（図２１Ａ～図２１Ｃ）に分化した。
ＥＳＣを使用したところ、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３６培地、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３７培地及びＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ３８培地を使用した三次元間葉系分化に関して同様の結果が観察された。図２２Ａ及び図２２Ｂは、三次元における間葉系分化の８日後のＥＳＣ由来ＭＳＣ細胞におけるＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの発現レベルの減少をそれぞれ示し、図２３Ａ～図２３Ｄは、ＥＳＣ由来ＭＳＣの骨細胞形成能を示す陽性アリザリンレッド染色を示す。
実施例２
異なる増殖因子を含む培地における間葉系幹細胞の細胞個数増加
成体ヒトＭＳＣ（骨髄又は臍帯から得た）を、様々な濃度の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２）中で培養した（以下の表１０）。図４及び図５に示すように、ｂＦＧＦは、ＭＳＣの成長及び細胞個数の増加を支持するのに不可欠である。低濃度のｂＦＧＦ（例えば、５ｎｇ／ｍＬ）を使用した場合でさえ、ＭＳＣの成長及び細胞個数の増加が見られた。
Figure 2023531975000013
次に、ＭＳＣの成長及び細胞個数増加を、異なる成長因子を含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２）で調べた。具体的には、ｂＦＧＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）及び／又は血小板由来成長因子－ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）を、上記の表２に従って、様々な濃度及び組み合わせでＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２）に添加し、成体ｈＭＳＣ－ＵＣ細胞の細胞増殖、細胞個数増加及び生存に対するそれらの効果を調べた。したがって、各実験において細胞が約７０～９０％のコンフルエンスに達したら細胞を計数し、倍数増加、集団倍加時間及び累積細胞数を決定した。
別のセットの実験では、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、形質転換成長因子ベータ１又は３（それぞれＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３）、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＥＧＦ及び／又はＷＮＴ－３ａを、上記の表２及び３に従って、様々な濃度及び組み合わせでＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２又はＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－ＨＧ）に添加し、成体ｈＭＳＣ－ＵＣ細胞の細胞増殖、細胞個数増加及び生存に対するそれらの効果を調べた。したがって、各実験において細胞が約７０～９０％コンフルエンスに達したら、比色アッセイ（ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ）により細胞増殖を推定した。
図６Ａ～図６Ｃに示されるように、１日あたりの倍数増加（すなわち、各継代の開始時に播種された細胞数（Ｐ）と比較した１日あたりの細胞個数の増加）、集団倍加時間（ＰＤＴ）（すなわち、各試験について２４時間での細胞の倍加速度）及び累積細胞数（すなわち、以前の数からの全ての細胞が播種された場合に得られた細胞の総数を受け取るための、以前の数への各細胞数の加算）は、増殖因子の組み合わせ及び濃度の多様な効果を示した。様々な濃度及び組み合わせのｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＥＧＦを含むＭＳＣ基本培地（ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２）で培養した成体ｈＭＳＣ－ＵＣ細胞の代表的な形態を図７に示す。図８及び図１０に示すように、様々な濃度及び組み合わせでｂＦＧＦ、ＴＧＦｂ１、ＴＧＦｂ３、ＰＤＧＦ－ＢＢ及びＷＮＴ３ａは、ＭＳＣ－ｄｉｆｆ ０－Ｆ１２又はＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ０－ＨＧにおける細胞増殖の増加をもたらした。それらの代表的な形態を図９及び図１１に示す。
ＭＳＣをＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５１培地（上記の表５Ｂを参照されたい）でさらに増殖させたところ、培養４～７８日目の継代１～１１に示されるように、長期培養後にも形態が維持された（図１２Ａ～図１２Ｅを参照）。重要なことに、ＭＳＣは、７８日の期間にわたって成体ｈＭＳＣ－ＵＣ細胞について示されたように、長期培養中に顕著な増殖を示した（図１２Ｆ参照）。
さらに、ＭＳＣ－Ｄｉｆｆ ５２培地でのＭＳＣの増殖及び細胞個数増加（上記の表５Ｃを参照されたい）では、長期培養後にも形態が維持されたと同時にＭＳＣの顕著な増殖がもたらされた（データ非掲載）。
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替、改変、及び変形が当業者に明らかであることは明白である。したがって、このような代替、改変、及び変形は全て、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるものとする。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により本明細書に援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書に援用される。加えて、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。章の見出しが使用される範囲において、当該見出しは必ずしも限定を加えるものと解釈されるべきではない。更に、本出願の任意の優先権書類は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

Claims (50)

  1. 基本培地と、有効量のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）とを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地。
  2. ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．４～２．３の範囲内で含む基本培地を含み、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、培養培地。
  3. 前記基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む、請求項１に記載の培養培地。
  4. 前記基本培地が、ＤＭＥＭ高グルコース（ＤＭＥＭ ＨＧ）を含む、請求項１に記載の培養培地。
  5. 前記ＭＥＭαに対する前記ＤＭＥＭ／Ｆ１２の前記体積比が、ＭＥＭαに対して０．６～１．５ ＤＭＥＭ／Ｆ１２の範囲である、請求項２に記載の培養培地。
  6. ｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）のうちの少なくとも１種をさらに含む、請求項２又は５に記載の培養培地。
  7. 前記ＫｏＳＲの濃度が２．５～１５％である、請求項１、３、４又は６のいずれか一項に記載の培養培地。
  8. 前記ＩＴＳの濃度が０．１～３％である、請求項１、３、４、６又は７のいずれか一項に記載の培養培地。
  9. グルコース、Ｌ－アスコルビン酸及びピルビン酸ナトリウムのうちの少なくとも１種をさらに含む、請求項１、３又は７～８のいずれか一項に記載の培養培地。
  10. 前記グルコースの濃度が１ｇｒ／Ｌ～５ｇｒ／Ｌである、請求項９に記載の培養培地。
  11. 前記Ｌ－アスコルビン酸の濃度が、２０～２００μｇ／ｍＬである、請求項９に記載の培養培地。
  12. 前記ピルビン酸ナトリウムの濃度が、２０～２００μｇ／ｍＬである、請求項９に記載の培養培地。
  13. 血清をさらに含む、請求項２、５又は６～８のいずれか一項に記載の培養培地。
  14. 前記血清の濃度が、３～３０％である、請求項１３に記載の培養培地。
  15. 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の培養培地。
  16. 前記ｂＦＧＦがＦＧＦ２又はＦＧＦ４を含む、請求項１５に記載の培養培地。
  17. 前記ｂＦＧＦがＦＧＦ２及びＦＧＦ４を含む、請求項１５に記載の培養培地。
  18. 前記ＦＧＦ２が、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１６～１７のいずれか一項に記載の培養培地。
  19. 前記ＦＧＦ４が、１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項１６～１７のいずれか一項に記載の培養培地。
  20. 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びＷＮＴ－３ａのうちの少なくとも１種をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の培養培地。
  21. 前記ＰＤＧＦがＰＤＧＦ－ＢＢを含む、請求項２０に記載の培養培地。
  22. 前記ＰＤＧＦが５～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２０～２１のいずれか一項に記載の培養培地。
  23. 前記ＴＧＦβがＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３を含む、請求項２０に記載の培養培地。
  24. 前記ＴＧＦβが５～５０ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２０又は２３のいずれか一項に記載の培養培地。
  25. 前記ＥＧＦが１～１００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２０に記載の培養培地。
  26. 前記ＷＮＴ－３ａが１０～２００ｎｇ／ｍＬの濃度である、請求項２０に記載の培養培地。
  27. ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）とを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地。
  28. ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＭＥＭαを、ＭＥＭαに対するＤＭＥＭ／Ｆ１２の体積比が０．６～１．５の範囲内で含む基本培地と、少なくとも３％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも０．１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも５％の濃度の血清とを含み、さらに、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、培養培地。
  29. ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸とを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地。
  30. ＤＭＥＭ ＨＧを含む基本培地と、少なくとも５％の濃度のｋｎｏｃｋｏｕｔ代替血清（ＫｏＳＲ）と、少なくとも０．５％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）と、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－アスコルビン酸と、少なくとも２５μｇ／ｍＬの濃度のピルビン酸ナトリウムとを含む限定培養培地であって、無血清であり、さらに多能性幹細胞（ＰＳＣ）の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を促進するか、又はＭＳＣの細胞個数増加を支持することができる、限定培養培地。
  31. 塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を少なくとも１ｎｇ／ｍＬの濃度でさらに含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の培養培地。
  32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載の培養培地中でＭＳＣを培養することによって、ＭＳＣを分化させずに細胞数を増加させる培養条件下でＭＳＣを培養することを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を分化させることなく細胞数を増加させる方法。
  33. 前記培養が二次元培養を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記培養が懸濁（三次元）培養を含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記培養が少なくとも５継代である、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記培養が２５継代までである、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＭＳＣが、脂肪細胞系統、骨芽細胞系統、及び軟骨細胞形成系統のいずれか１系統に分化することができる、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、請求項１～３１のいずれか一項に記載の培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養によってＰＳＣを培養し、ＭＳＣを生成することを含む、方法。
  39. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養によってＰＳＣを培養し、ＭＳＣを生成することを含む、方法。
  40. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法であって、ＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地中、ＰＳＣのＭＳＣへの分化に適した培養条件下の懸濁培養によってＰＳＣを培養し、ＭＳＣを生成することを含む、方法。
  41. 前記培養が、基材への接着のない培養条件下で行われる、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＰＳＣの懸濁培養物が凝集塊を含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記凝集塊を含む前記懸濁培養物が、約２５０個を超える多能性幹細胞を含む細胞クラスターを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記ＰＳＣの懸濁培養物に凝集塊が存在しない、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記凝集塊の存在しない前記懸濁培養物が単一細胞又は小クラスターを含み、前記小クラスターの各々が、約２００個以下の多能性幹細胞を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された懸濁培養物中に含まれる、単離された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団。
  47. ＭＳＣと、請求項１～３１のいずれか一項に記載の培養培地とを含む、細胞培養物。
  48. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）と、請求項１～３１のいずれか一項に記載の培養培地とを含む、細胞培養物。
  49. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）と、ＭＥＭαを含む基本培地、血清及びＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地とを含む、細胞培養物。
  50. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）と、ＭＥＭαを含む基本培地、少なくとも５％の濃度の血清、及び少なくとも１％の濃度のＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン及びセレン）を含む培養培地とを含む、細胞培養物。
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