CN117795057A - 用于悬浮培养哺乳动物家畜多能干细胞的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

提供了确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中所述基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中所述血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，并且其中所述血清替代物缺乏硒。还提供了维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态的方法，所述方法包括在所述确定成分培养基中培养所述哺乳动物家畜多能干细胞。

Description

用于悬浮培养哺乳动物家畜多能干细胞的无血清培养基
相关申请
本申请要求2021年6月9日提交的美国临时专利申请号63/208,595的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
序列表声明
提交本申请的同时提交的于2022年6月1日创建的包括77,824个字节、题为91823SequenceListing.txt的ASCII文件通过引用并入本文。
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及适于扩大处于未分化状态的哺乳动物多能干细胞(如哺乳动物家畜多能干细胞)的确定成分培养基，更具体地，而非排他地，涉及包括其的细胞培养物和使用其扩大哺乳动物多能干细胞的方法。
背景技术
近年来，对改善多能干细胞(PSC)培养系统的广泛研究取得了三项主要进展：(1)在无血清条件下使细胞生长的能力[Amit et al,2000]；(2)在不添加小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基的无饲养层条件下，同时使用选定的生长因子，延长PSC的培养[Amit etal,2004；Xu et al,2005；Xu et al,2005b和Ludwig et al 2006]，以及(3)在悬浮培养物中培养PSC(Amit et al,2010,2011)。
最近的几项研究讨论了几种细胞内转导途径在PSC更新和维持“干性(stemness)”身份方面可能有所参与，但突显(underlining)胚胎干细胞(ESC)自我维持的机制仍未被揭示。在一些培养方法中，如果培养基补充包括Wnt3a、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子(TGF)β-1的因子混合物，则可在无饲养层的情况下连续培养PSC[Xu et al2005,Hanna et al 2007；Amit et al,2004；Ludwig et al 2006:Ross 2019]。悬浮培养方法基于这样的培养基：补充Wnt3a和IL6RIL6嵌合体或白血病抑制因子(LIF)，不含bFGF或bFGF与gp130激动剂的组合[Amit et al 2010和Amit et al 2011]。
传统上，在二维或三维培养系统中培养PSC涉及添加包括15-20％血清或血清替代物如敲除血清替代物(Life technology)的培养基。目前已知的血清替代物制剂包括胰岛素、转铁蛋白、硒、白蛋白和脂肪酸[Amit et al 2000；Life technology ko-SR说明书]。
另外的背景技术还包括Seyed Mohamad Javad Taher-Mofrad et al.,2020(Cryobiology,92:208-214)；Sadegh Ghorbani-Dalini et al.,2020(3Biotech,10:215)。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中所述基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中所述血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，并且其中所述血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，所述胰岛素以0.34X10-3mM至1.88X10-3mM范围内的浓度提供，并且其中所述转铁蛋白以0.137X10-4mM至0.66X10-4mM范围内的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中所述基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中所述血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，其中所述胰岛素以0.34X10-3mM至1.88X10-3mM范围内的浓度提供，并且其中所述转铁蛋白以0.137X10-4mM至0.66X10-4mM范围内的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了细胞培养物，其包括细胞和本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态的方法，其包括在本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中培养所述哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了使哺乳动物家畜多能干细胞分化的方法，包括：
(a)根据本发明的一些实施方式所述的方法培养所述哺乳动物家畜多能干细胞，从而获得处于未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，和
(b)在缺乏所述分化抑制剂的条件下培养处于未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，所述条件允许所述哺乳动物家畜多能干细胞分化，
从而使所述哺乳动物家畜多能干细胞分化。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了制备食品的方法，其包括将由本发明的一些实施方式所述的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞与食品组合，从而制备所述食品。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了食品，其包括由本发明的一些实施方式所述的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基，前提是基础培养基不是RPMI1640。
根据本发明的一些实施方式，所述基础培养基选自KO-DMEM、DMEM/F12和DMEM。
根据本发明的一些实施方式，所述基础培养基选自KO-DMEM和DMEM/F12。
根据本发明的一些实施方式，所述基础培养基以93-98％范围内的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式，所述基础培养基以94-96％范围内的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基缺乏冷冻保护剂。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基还包括硒。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基不包括硒。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基还包括浓度范围为0.5-1.2％(v/v)的脂质混合物。
根据本发明的一些实施方式，所述血清替代物还包括选自以下的脂质：浓度在0.47-0.63x10-4mM范围内的亚油酸、浓度在1-1.33X10-4mM范围内的硫辛酸、浓度在0.32-0.43X10-5mM范围内的花生四烯酸、浓度在0.28-0.37X10-3mM范围内的胆固醇、浓度在0.72-0.96X10-3mM范围内的DL-α-生育酚-醋酸酯、浓度在1.74-2.33X10-5mM范围内的亚麻酸、浓度在2.14-2.86X10-5mM范围内的肉豆蔻酸、浓度在1.73-2.31X10-5mM范围内的油酸、浓度在1.91-2.55X10-5mM范围内的棕榈酸、浓度在1.92-2.571X10-5mM范围内的棕榈油酸和浓度在1.72-2.29X10-5mM范围内的硬脂酸。
根据本发明的一些实施方式，所述血清替代物还包括浓度在125-170mM范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，所述血清替代物还包括浓度在8-17微克/毫升范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，所述血清替代物还包括浓度在0.4％至0.7％体积/体积(v/v)范围内的牛血清白蛋白。
根据本发明的一些实施方式，所述牛血清白蛋白的浓度在0.5％至0.66％体积/体积(v/v)范围内。
根据本发明的一些实施方式，所述血清替代物是以1-10％体积/体积(v/v)范围内的浓度提供的敲除(KO)-血清替代物。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂是生长因子、细胞因子、小分子或其组合，其中所述有效浓度的所述至少一种分化抑制剂能够在培养时维持所述哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代。
根据本发明的一些实施方式，所述生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度在4-110ng/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约50ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约10ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约100ng/ml bFGF。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂是IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述IL6RIL6嵌合体的有效浓度为约100pg/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂是gp130激动剂。
根据本发明的一些实施方式，所述gp130激动剂选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述LIF的有效浓度为约3000U/ml(单位/毫升)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述IL6的有效浓度为约100ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述IL11的有效浓度为约1ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述CNTF的有效浓度为约1ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基还包括抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，所述抗坏血酸的浓度范围为8-600μg/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述抗坏血酸的浓度范围为10-600μg/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述抗坏血酸的浓度范围为450-550μg/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基，其中所述培养基包括浓度范围为450-550μg/ml的抗坏血酸和浓度为40-60ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述Wnt3a多肽的有效浓度为约10ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度在4-100ng/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约100ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述小分子是选自下列的蛋白酶抑制剂：苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(Tosyl-L-lysyl-chloromethanehydrochloride,TLCK)。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂还包括IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述IL6RIL6嵌合体的有效浓度在80-120pg/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述PMSF的有效浓度在70-130μm范围内
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述TLCK的有效浓度在20-80μM范围内。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)的gp130激动剂和选自苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)的蛋白酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，所述培养基中所述Wnt3a多肽的有效浓度在5-20ng/ml范围内，并且其中所述培养基中所述IL6RIL6嵌合体的有效浓度在70-130pg/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，所述至少一种分化抑制剂包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGFβ1)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述TGFβ1的有效浓度为约0.12ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约10ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式所述的确定成分培养基中所述bFGF的有效浓度为约100ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述细胞是哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述方法还包括使所述哺乳动物家畜多能干细胞传代至少一次。
根据本发明的一些实施方式，在所述培养期间每5-21天实现所述传代一次。
根据本发明的一些实施方式，所述传代包括在进一步培养所述细胞之前以1:2或2:3的比例分开(spitting)所述哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述培养在饲养细胞层上进行。
根据本发明的一些实施方式，所述培养在无饲养基质上进行。
根据本发明的一些实施方式，所述培养在缺乏基底黏附(substrate adherence)的悬浮培养物中进行。
根据本发明的一些实施方式，所述条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成肌肉细胞的培养基中培养所述细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成血细胞的培养基中培养所述细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成脂肪细胞的培养基中培养所述细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成结缔组织细胞的培养基中培养所述细胞。
根据本发明的一些实施方式，在悬浮培养物中进行步骤(a)和(b)中的所述培养。
根据本发明的一些实施方式，在所述悬浮培养物中的所述培养不黏附于基底。
除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明实施方式的实践或测试，但下文描述了示例性方法和/或材料。如果有冲突，则以专利说明书(包括定义)为准。此外，这些材料、方法和实例只是说明性的，而并不意图一定是限制性的。
附图说明
本文参考附图以示例的方式描述了本发明的一些实施方式。现在详细具体参考附图，要强调的是，所示细节是示例性的，并且是为了说明性地讨论本发明的实施方式。在这点上，结合附图进行的描述使如何实践本发明的实施方式对本领域技术人员而言显而易见。
在附图中：
图1A-1E是显示未分化牛PSC细胞的形态的照片。图1A-1B描绘了细胞系iBVN1.14p7+23的未分化iPSC集落，该细胞系在MEF上用补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物(Gibco-Invitrogen Corporation))的YF10培养基培养5代。图1C-1E描绘了在指示的培养基中于MEF上培养指示的传代数的未分化PSC集落：图1C-用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养7代的BVN4 P8；图1D-在补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)中培养5代(自诱导(derivation)以来)的BVN3 P5；图1E-用补充5％KoSR的Wnt3a+IL6RIL6嵌合体(含50ng/ml bFGF)培养6代的iBVN1.14 P7+29。比例尺：图1A＝200μm；图1B＝100μm。图1C、1D和1E＝100μm；
图2A-2D是描绘对未分化iPSC集落中TRA-1-60和TRA-1-81表达的免疫荧光分析的图像。iBVN 1.4p7+27细胞在MEF上用补充10％ KoSR培养基的YF10培养基培养8代。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞对TRA 1-60(红色，图2B)和TRA-1-81(绿色，图2D)染色呈阳性。用DAPI(蓝色，图2A-2B)对细胞核复染。比例尺：100μm；
图3A-3D是描绘未分化iPSC集落中Nanog和TRA-1-60表达的图像。iBVN 1.4p7+30细胞在MEF上用补充5％ KoSR培养基的YF10培养基培养11代。免疫荧光(IF)分析前，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞以进行Nanog染色，或用甲醇固定细胞以进行TRA-1-60染色。如IF分析所示，大部分iBVN 1.4p7+30细胞对Nanog(绿色，图3B)和TRA-1-60(红色，图3D)染色呈阳性。用DAPI对细胞核复染(蓝色，图3A和图3C)。比例尺：图3A-3B＝100μm；图3C-3D＝50μm；
图4A-4B是描绘未分化iPSC集落中TRA-1-81表达的图像。iBVN 1.4p7+30在MEF上用补充5％ KoSR培养基的YF10培养基培养11代。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞对TRA-1-81染色呈阳性(绿色，图4B)。用DAPI(蓝色，图4A)对细胞核复染。比例尺：图4A-4B＝100μm；
图5A-5D是描绘未分化iPSC集落中TRA-1-60和TRA-1-81表达的图像。iBVN 1.4p7+30细胞在MEF上用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养11代。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞对TRA-1-60(红色，图5B)和TRA-1-81(绿色，图5D)染色呈阳性。用DAPI对细胞核复染(蓝色，图5A和5C)。比例尺：图5A-5B＝100μm；图5C-5D＝50μm；
图6A-6D是描绘未分化iPSC集落中TRA-1-60和TRA-1-81表达的图像。iBVN 1.14p7+29细胞在MEF上用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养10代。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞对TRA-1-60(红色，图6B)和TRA-1-81(绿色，图6D)染色呈阳性。用DAPI对细胞核复染(蓝色，图6A和6C)。比例尺：图6A-6D＝100μm；
图7是描绘悬浮培养的未分化牛iPSC细胞的形态的图像。未分化iPSC系iBVN1.4p7+27用补充10％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)悬浮培养一个月。比例尺＝50μm；
图8是描绘经悬浮培养并重铺(re-plated)在MEF上的未分化牛iPSC细胞的形态的图像。未分化iPSC系iBVN1.4 p7+17用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/mlbFGF)悬浮培养一个月，然后重铺在MEF上。所有聚集体附着(贴壁，attached)并形成具有未分化细胞形态的集落。比例尺＝100μm；
图9A-9D是描绘未分化iPSC集落中Nanog和TRA-1-60表达的图像。iBVN 1.14p7+30细胞用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)悬浮培养1个月。然后在IF染色前，将细胞重铺在灭活的MEF上。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞对Nanog(绿色，图9B)和TRA-1-60(红色，图9D)染色呈阳性。用DAPI对细胞核复染(蓝色，图9A和9C)。比例尺：图9A-9D＝100μm；
图10A-10B是描绘未分化iPSC集落中TRA-1-81表达的图像。iBVN 1.14p7+30细胞用IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)和5％ KoSR的悬浮培养1个月。然后在IF染色前，将细胞重铺在灭活的MEF上。免疫荧光(IF)分析前，用甲醇固定细胞。如IF分析所示，大部分细胞呈TRA-1-81阳性(绿色，图10B)。用DAPI对细胞核复染(蓝色，图10A)。比例尺：图10A-10B＝100μm。
图11A-11D是描绘在15％ KoSR存在的情况下未分化牛iPSC细胞的形态的图像。iBVN1.4 p7+42细胞在MEF上用补充15％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养3代。部分集落分化，主要分化成脂肪细胞(图11A和11C)。在其它集落中，可注意到有脂肪细胞区域(用白色箭头标记)(图11B和11D)。油红染色证实分化成脂肪细胞(图11C和11D)。比例尺：图11A-11B＝100μm；图11C-11D＝50μm；
图12A-12D是描绘在10％ KoSR存在的情况下未分化牛iPSC细胞的形态的图像。iBVN1.4 p7+42细胞于MEF上在补充10％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)存在的情况下培养3代。部分集落分化，主要分化成脂肪细胞(图12A和12C)。在其它集落中，可注意到有脂肪细胞区域(用白色箭头标记)(图12B和12D)。油红染色证实分化成脂肪细胞(图12C和12D)。比例尺：图12A-12B＝100μm；图12C-12D＝50μm
图13A-13B是描绘在1-2.5％ KoSR存在的情况下于MEF上培养的未分化牛iPSC细胞的形态的图像。iBVN1.4 p7+43细胞在MEF上用补充2.5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养7代(图13A)，或用补充1％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养7代(图13B)。集落保持未分化状态至少13代，分化细胞少于3％。比例尺：图13A-13B＝100μm；
图14A-14C是描绘补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)中BVN3细胞系的诱导的图像。ESC系BVN3采用全胚胎法获得。图14A -去除透明带前的胚胎。图14B-用台罗德酸(Tyrode acid)去除透明带后的胚胎(第8天)。ICM清晰可见(白色箭头)。图14C-ICM向外生长。比例尺：图14A-14B＝50μm；图14C＝200μm；
图15是描绘在MEF上用IL6RIL6嵌合体(含50ng/ml bFGF)培养基和用不同浓度的KoSR培养的牛多能干细胞的集落直径的直方图。本实验中使用第42代和第43代的iBVN1.4系。在包含下列KoSR浓度的IL6RIL6嵌合体(含50ng/ml bFGF)培养基中培养细胞指示的传代数：15％ KoSR–3代；10％ KoSR-3代；7.5％ KoSR-3代；5％ KoSR-3代；2.5％ KoSR-7代，以及1％ KoSR-7代。细胞分开后三天测量集落直径。应注意，在1％或2.5％的KoSR浓度下，集落的平均直径较小——与在补充5％ KoSR或更高浓度KoSR如7.5％、10％或15％的相同培养基中生长的集落的直径相比。未发现5-15％ KoSR的浓度之间存在显著差异。
图16A-16B是描绘在二维培养系统上于CNTF和IL-11培养基中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和Nanog的表达的图像。在2D中(在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上)用补充CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml)的培养基培养牛PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图16A)和Nanog(图16B)的免疫荧光分析。图16A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图16B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充CNTF和IL-11的培养基支持牛PSC多能性至少3代。放大倍数x10(TRA1-60)、x20(Nanog)。
图17A-17C是描绘三维悬浮培养物中于CNTF和IL-11培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4、Nanog和SSEA1表达的图像。在3D中用补充CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml)的培养基培养猪PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图17A)、Nanog(图17B)和SSEA1(图17C)的免疫荧光分析。图17A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图17B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图17C：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4、Nanog和SSEA1染色呈阳性，表明在3D悬浮培养物上培养时，补充CNTF和IL-11的培养基支持猪PSC多能性至少3代。放大倍数x20。
图18A-18B是描绘二维培养系统上在含浓度为70μM PMSF的PMSF培养基中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和Nanog表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充浓度为70μM的PMSF的培养基培养牛PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图18A)和Nanog(图18B)的免疫荧光分析。图18A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图18B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充PMSF 70μM的培养基支持牛PSC多能性至少3代。放大倍数x10(TRA1-60)，x20(Nanog)。
图19显示了描绘二维培养系统上在含浓度为130μM PMSF的PMSF培养基中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60表达的图像。在2D上(在MEF饲养细胞上)用补充浓度为130μM的PMSF的培养基培养牛PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60的免疫荧光分析。显示了TRA1-60(橙色)染色、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)的图像。结果显示TRA1-60染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充PMSF 130μM的培养基支持牛PSC多能性至少3代。放大倍数x20。
图20A-20C是描绘三维悬浮培养物中在含浓度为100μM PMSF的PMSF培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4、Nanog和SSEA1表达的图像。在3D中用补充浓度为100μM的PMSF的培养基培养猪PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图20A)、Nanog(图20B)和SSEA1(图20C)的免疫荧光分析。图20A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图20B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图20C：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4、Nanog和SSEA1染色呈阳性，表明在3D悬浮培养物上培养时，补充浓度为100μM的PMSF的培养基支持猪PSC多能性至少3代。放大倍数x20。
图21A-21B是描绘二维培养系统上在含浓度为100μM PMSF的PMSF培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4和SSEA1表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充浓度为100μM的PMSF的培养基培养猪PSC，并在3代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图21A)和SSEA1(图21B)的免疫荧光分析。图21A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图21B：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4和SSEA1染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充PMSF 100μM的培养基支持猪PSC多能性至少3代。放大倍数x20。
图22显示描绘二维培养系统上在CNTF和IL11培养基中培养的未分化猪PSC(Psus1)中SSEA1表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml)的培养基培养猪PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记SSEA1的免疫荧光分析。显示了SSEA1染色(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示SSEA1染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充CNTF和IL11的培养基支持猪PSC多能性至少3代。放大倍数x20。
图23A-23D是描绘二维培养系统上在CNTF和IL11培养基中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中OCT4、Nanog、TRA1-60和TRA1-81表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml)的培养基培养牛PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图23A)、Nanog(图23B)、TRA1-60(图23C)和TRA1-81(图23D)的免疫荧光分析。图23A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图23B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图23C：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图23D：TRA1-81(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4、Nanog、TRA1-60和TRA1-81染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充CNTF和IL11的培养基支持牛PSC多能性至少5代。放大倍数x20。
图24A-24B是描绘三维悬浮培养物中在CNTF和IL11培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4和SSEA1表达的图像。在3D中用补充CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml)的培养基培养猪PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图24A)和SSEA1(图24B)的免疫荧光分析。图24A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图24B：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4和SSEA1染色呈阳性，表明在3D悬浮培养物上培养时，补充CNTF和IL11的培养基支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数OCT4(X20)，SSEA1(x10)。
图25A-25B是描绘三维悬浮培养物中在含浓度为100μm PMSF的PMSF培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4和SSEA1表达的图像。在3D中用补充浓度为100μM的PMSF的培养基培养猪PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图25A)和SSEA1(图25B)的免疫荧光分析。图25A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图25B：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4和SSEA1染色呈阳性，表明在3D悬浮培养物上培养时，补充浓度为100μM的PMSF的培养基支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数X10。
图26A-26B是描绘二维培养系统上在确定成分无血清培养基(“IT1”)中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和Nanog表达的图像。确定成分无血清培养基(“IT1”)由下列组成：DMEM/F12，补充bFGF(50ng/ml)、IL6RIL6(100pg/ml)、脂质混合物1％、胰岛素0.43μM、转铁蛋白0.0172μM、BSA 0.5％、L-谷氨酰胺4μM、抗坏血酸500μg/ml和抗生素(青霉素：50U/ml和链霉素：0.05mg/ml)。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基培养牛PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图26A)和Nanog(图26B)的免疫荧光分析。图26A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图26B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基(“IT1”培养基)支持牛PSC多能性至少3代。放大倍数x10。
图27A-27B是描绘二维培养系统上在确定成分无血清培养基(“IT2”)中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和Nanog表达的图像。确定成分培养基(IT2培养基)由下列组成：DMEM/F12，补充bFGF(50ng/ml)、IL6RIL6嵌合体(100pg/ml)、脂质混合物1％(v/v)、胰岛素1.57μM、转铁蛋白0.055μM、牛血清白蛋白(BSA)0.5％(v/v)、抗坏血酸500μg/ml、L-谷氨酰胺4μM和抗生素(青霉素：50U/ml和链霉素：0.05mg/ml)。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基(“IT2”)培养牛PSC，并在培养3代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图27A)和Nanog(图27B)的免疫荧光分析。图27A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图27B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基支持牛PSC多能性至少3代。放大倍数x10。
图28是描绘二维培养系统上在CNTF和IL11培养基(含CNTF(1ng/ml)和IL11(1ng/ml))中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充CNTF和IL11的培养基培养猪PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4的免疫荧光分析。显示了OCT4染色(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)图像和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充CNTF和IL11的培养基支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数x10。
图29A-29B是描绘二维培养系统上在含浓度为100μM PMSF的PMSF培养基中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中OCT4和SSEA1表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用补充浓度为100μM的PMSF的培养基培养猪PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记OCT4(图29A)和SSEA1(图29B)的免疫荧光分析。图29A：OCT4(红色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，红色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图29B：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示OCT4和SSEA1染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充PMSF的培养基支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数x10。
图30A-30B是描绘二维培养系统上在确定成分无血清培养基(“IT1”培养基)中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中SSEA1和Nanog表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基培养猪PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记SSEA1(图30A)和Nanog(图30B)的免疫荧光分析。图30A：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图30B：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示SSEA1和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基(“IT1”培养基)支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数x20。
图31显示了描绘二维培养系统中在确定成分无血清培养基(“IT2”培养基)中培养的未分化猪PSC(Psus 1)中SSEA1表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基培养猪PSC，并在5代后对细胞进行关键的多能性标记SSEA1的免疫荧光分析。显示了下列图像：SSEA1(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示SSEA1染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基(“IT2”培养基)支持猪PSC多能性至少5代。放大倍数x20。
图32A-32B是描绘二维培养系统上在确定成分无血清培养基(“IT1”培养基)中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和TRA1-81表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基培养牛PSC，并在5代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图32A)和TRA1-81(图32B)的免疫荧光分析。图32A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图32B：TRA1-81(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和TRA1-81染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基(“IT1”培养基)支持牛PSC多能性至少5代。放大倍数TRA1-60(x20)和TRA1-81(x10)。
图33A-33B是描绘二维培养系统上在确定成分无血清培养基(“IT2”培养基)中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60和TRA1-81表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用确定成分无血清培养基培养牛PSC，并在培养5代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图33A)和TRA1-81(图33B)的免疫荧光分析。图33A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图33B：TRA1-81(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60和TRA1-81染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，确定成分无血清培养基(“IT2”培养基)支持牛PSC多能性至少5代。放大倍数TRA1-60(x10)和TRA1-81(x20)。
图34A-34C是描绘二维培养系统上在补充浓度为70μM的PMSF的培养基中培养的未分化牛PSC(iBVN 1.4)中TRA1-60、TRA1-81和Nanog表达的图像。在2D中(在MEF饲养细胞上)用PMSF培养基培养牛PSC，并在培养6代后对细胞进行关键的多能性标记TRA1-60(图34A)、TRA1-81(图34B)和Nanog(图34C)的免疫荧光分析。图34A：TRA1-60(橙色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，橙色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图34B：TRA1-81(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。图34C：Nanog(绿色)、DAPI(细胞核染色，蓝色)和合并图像(“合并”，绿色和蓝色双重染色显示多能干细胞)。结果显示TRA1-60、TRA1-81和Nanog染色呈阳性，表明在2D培养系统上培养时，补充浓度为70μM的PMSF的培养基支持牛PSC多能性至少6代。放大倍数x20。
具体实施方式
本发明在其一些实施方式中涉及适于扩大处于未分化状态的哺乳动物多能干细胞(如哺乳动物家畜多能干细胞)的确定成分培养基，更具体地，而非排他地，涉及包括细胞和确定成分培养基的细胞培养物以及使用确定成分培养基扩大哺乳动物多能干细胞的方法。
在详细说明本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明在其应用上不一定限于以下描述中阐述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式，或者能够以各种方式实践或执行。
以下实施例部分显示，补充低浓度血清替代物(胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、抗坏血酸和脂肪酸)的培养基能够支持哺乳动物多能干细胞如家畜多能干细胞的未分化生长。本发明人鉴定的确定成分无血清培养基能够在使用饲养层、无饲养层和无载体悬浮培养物的同时支持哺乳动物多能干细胞(例如牛或猪PSC)的有效生长。
以下实施例部分的实施例4以及图15显示，在低至1-2.5％(体积/体积)KoSR中培养的PPSC的集落直径小于在5％(v/v)KoSR或更高浓度7.5％(v/v)、10％(v/v)或15％(v/v)KoSR中培养的PPSC的集落直径，这表明在最初1-7代的过程中集落的生长速率稍慢。另一方面，在1-2.5％(v/v)KoSR浓度下，PPSC没有显著的背景分化(如上述实施例1和图13A-13B中描述的，背景分化小于3％)，而在5％ KoSR浓度下，向脂肪细胞的背景分化为约5％。相比之下，在10％ KoSR浓度下，向脂肪细胞的背景分化为约10％(图12A-12D)；以及在15％ KoSR浓度下，向脂肪细胞的背景分化为约15-20％(图11A-11D)，因此这些结果显示，将KoSR的浓度从5％(v/v)增加到10％(v/v)或15％(v/v)导致背景分化增加。
以下实施例部分的实施例5和6证明了包含低浓度血清替代物(例如5％(v/v)的KoSR，补充gp130激动剂如CNTF和IL11(图16A-16B、17A-17C、22、23A-23D、24A-24B和28)或蛋白酶抑制剂PMSF(图18A-18B、19、20A-20C、21A-21B、25A-25B、29A-29B和34A-34C)的培养基，当在饲养细胞层(二维培养系统)上培养或在不存在基底黏附的悬浮培养物(三维培养系统)中培养时维持牛或猪iPSC处于多能且未分化状态的能力。
本发明人发现，当在二维或三维培养系统中培养时，包括胰岛素和转铁蛋白但不包括硒的血清替代物能够与分化抑制因子(一种或多种)一起用于培养基中，以维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态。
以下实施例部分的实施例7显示，化学上确定成分培养基——其包括：胰岛素和转铁蛋白且缺乏硒；有效浓度的至少一种分化抑制剂(例如，bFGF和IL6RIL6嵌合体)；和任选地抗坏血酸，能够维持哺乳动物家畜多能干细胞的未分化生长至少3或5代(图26A-26B、27A-27B、30A-30B、31、32A-32B和33A-33B)。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，并且其中血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，胰岛素以0.34X10-3 mM至1.88X10-3 mM范围内的浓度提供，并且其中转铁蛋白以0.137X10-4 mM至0.66X10-4 mM范围内的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，其中胰岛素以0.34X10-3 mM至1.88X10-3 mM范围内的浓度提供，并且其中转铁蛋白以0.137X10-4 mM至0.66X10-4 mM范围内的浓度提供。
本文所用，短语“无血清”是指缺乏人或动物血清。
根据本发明的一些实施方式，无血清培养基不包括血清或其部分。
根据本发明的一些实施方式，无血清培养基不包括血清或其部分，前提是无血清培养基可包括牛血清白蛋白。
如本文所用，短语“培养基”是指用于支持细胞生长的液体物质。根据一些实施方式，本发明使用的培养基可以是水基培养基，其包括物质如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质如细胞因子、生长因子和激素的组合，所有这些物质都是细胞增殖和/或分化所需要的。
本发明的一些实施方式的培养基包括基础培养基。基础培养基是可补充添加剂如氨基酸(一种或多种)(例如l-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA))、β巯基乙醇和/或抗生素的合成培养基。应当注意，一些合成培养基已经包括非必需氨基酸(NEAA)、脂质和/或白蛋白。
例如，根据本发明的一些实施方式的一个方面的培养基可包括合成的组织培养基础培养基如Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM，例如，可例如获自Gibco-InvitrogenCorporation产品,格兰德岛,NY,USA)、DMEM/F12(例如，可例如获自BiologicalIndustries,Biet HaEmek,以色列)、Ko-DMEM(例如，可例如获自Gibco-InvitrogenCorporation产品,格兰德岛,NY,USA)或Eagle极限必需培养基(EMEM，例如，可例如获自Gibco-Invitrogen Corporation产品,格兰德岛,NY,USA)——其补充如下文进一步描述的必需添加剂。基础培养基的浓度取决于其它培养基成分(诸如下面讨论的血清替代物)的浓度。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基不是RPMI1640。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基选自KO-DMEM、DMEM/F12和DMEM。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基选自KO-DMEM和DMEM/F12。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基是KO-DMEM。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基是DMEM/F12。
根据本发明的一些实施方式，基础培养基以94-96％范围内的浓度提供。
如本文所用的“确定成分”培养基是指由特定浓度的已知组分制备的化学上确定成分培养基。例如，确定成分培养基是非条件培养基(non-conditioned culture medium)。
条件培养基(conditioned medium)是在一定培养期后存在的单层细胞培养物(即饲养细胞)的生长培养基。条件培养基包括培养物中单层细胞所分泌的生长因子和细胞因子。
条件培养基可从在培养时形成单层的各种细胞中收集。实例包括小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基、包皮条件培养基、人胚胎成纤维细胞条件培养基、人输卵管上皮细胞条件培养基等。
如本文所用，短语“血清替代物”是指确定成分制剂，其通过为多能干细胞提供生长和存活所需的组分来替代血清的功能。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基的血清替代物中胰岛素的浓度为至少0.34X10-3mM且不超过1.88X10-3mM，例如，0.43X10-3mM且不超过1.57X10-3mM，例如，至少0.43X10-3mM且不超过1.0X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.55X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.53X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.51X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.50X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.4X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.3X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.1X10-3mM，例如，至少0.78X10-3mM且不超过1.0X10-3mM，例如，约0.43X10-3mM，例如，约1.57X10-3mM。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基的血清替代物中胰岛素的浓度为至少0.34X10-3mM且不超过1.57X10-3mM，例如，至少0.34X10-3mM且不超过1.0X10-3mM，至少0.34X10-3mM且不超过0.87X10-3mM，至少0.34X10-3mM且不超过0.87X10-3mM，至少0.34X10- 3mM且不超过0.528X10-3mM，至少0.43X10-3mM且不超过0.528X10-3mM，至少0.34X10-3mM且不超过0.516X10-3mM，至少0.34X10-3mM且不超过0.473X10-3mM，至少0.4X10-3mM且不超过0.65X10-3mM，例如，约0.58X10-3mM。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基的血清替代物中胰岛素的浓度为至少0.8X10-3mM且不超过1.50X10-3mM，例如，至少0.9X10-3mM且不超过1.50X10-3mM，例如，至少1.0X10-3mM且不超过1.5X10-3mM，例如，至少1.1X10-3mM且不超过1.5X10-3mM，例如，至少1.2X10-3mM且不超过1.5X10-3mM。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基的血清替代物中转铁蛋白的浓度为至少0.137X10-4mM且不超过0.66X10-4mM，至少0.172X10-4mM且不超过0.55X10-4mM，例如，至少0.172X10-4mM且不超过0.34X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.52X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.5X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.49X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.48X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.47X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.46X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.45X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.44X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.43X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.42X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.41X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.4X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.39X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.38X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.37X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.36X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.35X10-4mM，例如，至少0.27X10-4mM且不超过0.34X10-4mM，例如，约0.172X10-4mM，例如，约0.55X10-4mM。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基的血清替代物中转铁蛋白的浓度为至少0.27X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.28X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.29X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.3X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.31X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.32X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.33X10-4mM且不超过0.54X10-4mM，例如，至少0.34X10-4mM且不超过0.5X10-4mM，例如，至少0.35X10-4mM且不超过0.45X10-4mM，例如，至少0.37X10-4mM且不超过0.4X10-4mM。
根据本发明的一些实施方式，根据本发明的一些实施方式的确定成分培养基不包括硒。
应当注意的是，硒通常可以亚硒酸钠盐的形式获得。
根据本发明的一些实施方式，根据本发明的一些实施方式的确定成分培养基可包括痕量的硒，例如，不超过2.11X10-6mM的量，例如，不超过2.11X10-7mM的量，例如，不超过2.11X10-8mM的量，例如，不超过2.11X10-9mM的量，例如，不超过2.11X10-10mM的量，例如，不超过2.11X10-11mM的量，例如，不超过2.11X10-12mM的量。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括浓度在125-170ng/ml范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括浓度在8-17微克/毫升范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括浓度在10-15微克/毫升范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括浓度在11.125-14.8微克/毫升范围内的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括下列浓度的牛血清白蛋白：范围为0.4％至0.7％体积/体积(v/v)，例如，0.45％至0.7％(v/v)，0.5％至0.66％体积/体积(v/v)，例如，范围为0.51％-0.65％v/v，例如，范围为0.52％-0.64％v/v，例如，范围为0.53％-0.63％v/v，例如，范围为0.54％-0.62％v/v，例如，范围为0.55％-0.61％v/v，例如，范围为0.56％-0.6％v/v，例如，范围为0.57％-0.6％v/v，例如，约0.5％v/v。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括脂质混合物。
如本文所用，短语“脂质混合物”是指培养未分化状态的多能干细胞所需的确定成分(例如，化学上确定成分)脂质组合物。
应注意，脂质混合物通常被添加到缺乏血清的培养基中。
此外，由于一些市售血清替代物制剂(如GIBCOTMKnockoutTM血清替代物)已经包含脂质，因此脂质混合物通常被添加到不包括GIBCOTMKnockoutTM血清替代物的培养基。
可用于本发明的一些实施方式的培养基中的市售脂质混合物的非限制性实例是化学上确定成分脂质浓缩物(Chemically Define Lipid Concentrate)(例如，可获自Invitrogen，目录号11905-031)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的血清替代物中包括的脂质混合物是化学上确定成分脂质浓缩物。
根据本发明的一些实施方式，培养基中脂质混合物的浓度为约0.5％[体积/体积(v/v)]至约1.2％v/v，例如，约0.6％v/v至约1％v/v，例如，约0.7％v/v至约1％v/v，例如，约0.8％v/v至约1％v/v，例如，约0.9％v/v至约1％v/v，例如，约1％v/v。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的血清替代物包括胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和浓度为0.5％[体积/体积(v/v)]至1.2％v/v的脂质混合物，其中血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的血清替代物包括胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、浓度为0.5％[体积/体积(v/v)]至1.2％v/v的脂质混合物和浓度范围为BSA0.4％(v/v)至0.7％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)。
以下是非限制示例性血清替代物制剂，其包括胰岛素和转铁蛋白但不包括硒，并且其可以是本发明的一些实施方式的确定成分培养基的一部分：
(i)胰岛素0.387-0.473μM，转铁蛋白0.0155-0.0189μM，脂质混合物0.9-1.1％体积/体积，牛血清白蛋白0.45-0.55％v/v，和任选地浓度为10-15μg/ml的抗坏血酸。
(ii)胰岛素1.413-1.727μM、转铁蛋白0.0495-0.0605μM、脂质混合物0.9-1.1％体积/体积、牛血清白蛋白0.45-0.55％v/v，和任选地浓度为10-15μg/ml的抗坏血酸。
(iii)胰岛素0.387-0.473μM，转铁蛋白0.0155-0.0189μM，脂质混合物0.9-1.1％体积/体积，牛血清白蛋白0.45-0.55％v/v，和任选地浓度为125-170ng/ml的抗坏血酸。
(iv)胰岛素1.413-1.727μM，转铁蛋白0.0495-0.0605μM，脂质混合物0.9-1.1％体积/体积，牛血清白蛋白0.45-0.55％v/v，和任选地浓度为125-170ng/ml的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，根据本发明的一些实施方式的确定成分培养基还包括硒。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基中硒的浓度不超过2.23X10-4克/升或5.9X10-5mM。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基中硒的浓度在2.11X10-5mM至5.9X10-5mM范围内，例如，在4.4X10-5mM至5.9X10-5mM范围内。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物还包括选自以下的脂质：浓度在0.47-0.63x10-4mM范围内的亚油酸、浓度在1-1.33X10-4mM范围内的硫辛酸、浓度在0.32-0.43X10-5mM范围内的花生四烯酸、浓度在0.28-0.37X10-3mM范围内的胆固醇、浓度在0.72-0.96X10-3mM范围内的DL-α-生育酚-醋酸酯、浓度在1.74-2.33X10-5mM范围内的亚麻酸、浓度在2.14-2.86X10-5mM范围内的肉豆蔻酸、浓度在1.73-2.31X10-5mM范围内的油酸、浓度在1.91-2.55X10-5mM范围内的棕榈酸、浓度在1.92-2.571X10-5mM范围内的棕榈油酸和浓度在1.72-2.29X10-5mM范围内的硬脂酸。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中使用的血清替代物包括胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)和脂质混合物(浓度为0.5-1.2％(v/v))。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中使用的血清替代物包括胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)、脂质混合物(浓度为0.5-1.2％(v/v))和浓度范围为BSA 0.4％(v/v)至0.7％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中使用的血清替代物包括胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)和脂肪酸混合物[包括浓度在0.47-0.63x10-4mM范围内的亚油酸、浓度在1-1.33X10-4mM范围内的硫辛酸、浓度在0.32-0.43X10-5mM范围内的花生四烯酸、浓度在0.28-0.37X10-3mM范围内的胆固醇、浓度在0.72-0.96X10-3mM范围内的DL-α-生育酚-醋酸酯、浓度在1.74-2.33X10-5mM范围内的亚麻酸、浓度在2.14-2.86X10-5mM范围内的肉豆蔻酸、浓度在1.73-2.31X10-5mM范围内的油酸、浓度在1.91-2.55X10-5mM范围内的棕榈酸、浓度在1.92-2.571X10-5mM范围内的棕榈油酸和浓度在1.72-2.29X10-5mM范围内的硬脂酸]。
各种血清替代物制剂是本领域已知的，并且是市售的。
例如，GIBCOTMKnockoutTM血清替代物(Gibco-Invitrogen Corporation,格兰德岛,NY USA；目录号10828028)是一种经优化以在培养时使未分化ES细胞生长和维持其的确定成分无血清制剂。应当注意的是，GIBCOTMKnockoutTM血清替代物的制剂中包括动物来源的Albumax(富含脂质的牛血清白蛋白)(Price,P.J.等人的国际专利公开号WO 98/30679)。然而，Crook等人2007年(Crook JM.,et al.,2007,Cell Stem Cell,1:490-494)的近期公开描述了在cGMP制造的KnockoutTM血清替代物(Invitrogen Corporation,USA,例如，目录号04-0095)中使用FDA批准的临床级包皮成纤维细胞生成的六种临床级hESC系。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基中GIBCOTMKnockoutTM血清替代物的浓度在约1-10％体积/体积(v/v)范围内，例如，浓度为1-7.5％(v/v)，例如，1-5％(v/v)，例如，5-7.5％(v/v)，例如，3％、4％、5％、6％、7％或7.5％(v/v)。
另一种合适的市售血清替代物是不含维生素A的B27补充剂，其可获自Gibco-Invitrogen,Corporation,格兰德岛,NY USA,例如，目录号12587-010。B27补充剂是一种无血清制剂，其包括d-生物素、脂肪酸游离部分V牛血清白蛋白(BSA)、过氧化氢酶、L-肉碱HCl、皮质酮、乙醇胺HCl、D-半乳糖(无水)、谷胱甘肽(还原型)、重组人胰岛素、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺-2-HCl、亚硒酸钠、超氧化物歧化酶、T-3/白蛋白复合物、DLα-生育酚、DLα-生育酚醋酸酯。
例如，SR3(Sigma)制剂是一种无异种成分(xeno-free)血清替代物。
根据本发明的一些实施方式，将无异种成分血清替代物制剂SR3(Sigma)以1:250的比例稀释，以达到X0.25工作浓度。
根据本发明的一些实施方式，血清替代物是无异种成分的。
术语“异种(xeno)”是一个基于希腊语单词“Xenos”的前缀，即陌生者。如本文所用，短语“无异种成分”是指缺乏源自异种(即，不相同，外来者)物种的任何组分。此类组分可以是污染物，如与异种物种相关的(例如，感染性)病原体、异种物种的细胞组分或异种物种的非细胞组分(例如，流体)。
应当注意，包括胰岛素、转铁蛋白和硒的组合的组合物可从各种来源获得。例如，市售的无异种成分血清替代物组合物包括可获自Invitrogen公司的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)的预混物(premix)(ITS,Invitrogen Corporation,例如,目录号51500-056)。
根据本发明的一些实施方式，以X100溶液提供的无异种成分血清替代物制剂ITS(Invitrogen Corporation)通过1:250的比例稀释以达到X0.25工作浓度。
根据本发明的一些实施方式，以X100溶液提供的无异种成分血清替代物制剂ITS(Invitrogen Corporation)通过1:330的比例稀释以达到X0.33工作浓度。
如上所述，本发明的一些实施方式的确定成分培养基包括至少一种分化抑制剂。
如本文所用，短语“分化抑制剂”是指这样的剂：能够抑制当在体外培养时至少50％的多能干细胞群分化至少5代。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂能够抑制当在体外培养时至少50％或更多的多能干细胞群分化至少5代，例如，至少10代，例如，至少15代，例如，至少20代，例如，至少25代，例如，至少30代，例如，至少35代，例如，至少40代。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂能够抑制当在体外培养时至少55％，例如，至少60％，例如，至少65％，例如，至少70％，例如，至少75％，例如，至少80％，例如，至少85％，例如，至少90％，例如，至少95％或更多的多能干细胞群分化至少5代。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂能够抑制当在体外培养时至少80％的多能干细胞群分化至少5代，例如，至少10代，例如，至少15代，例如，至少20代，例如，至少25代，例如，至少30代，例如，至少35代，例如，至少40代。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂抑制当在悬浮培养物中体外培养时多能干细胞的分化。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂抑制当在无饲养培养系统中体外培养时多能干细胞的分化。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂抑制当在饲养层上体外培养时多能干细胞的分化。
根据本发明的一些实施方式，分化抑制剂能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多代。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂是生长因子、细胞因子、小分子或其组合，其中有效浓度的至少一种分化抑制剂能够在培养时维持哺乳动物多能干细胞(例如，家畜多能干细胞)处于未分化状态至少5代。
根据本发明的一些实施方式，生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
如本文所用，术语“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)”是指成纤维细胞生长因子(FGF)家族的多肽，其结合肝素并具有广泛的促有丝分裂和血管生成活性。BFGF基因的mRNA含有多个多聚腺苷酸化位点，并从非AUG(CUG)和AUG起始密码子交替翻译，产生五种具有不同性质的不同的同工型。CUG起始的同工型位于细胞核内且负责内分泌效应，而AUG起始的同工型主要为胞质型且负责这种FGF的旁分泌和自分泌效应。
bFGF多肽(例如，GenBank登录号NP_001997(SEQ ID NO:1))可从Peprotech、R&D系统(例如，目录号:233-FB)和Millipore等多家制造商获得。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度在4-130ng/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度为约50ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度在30ng/ml至70ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度为约10ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度在4ng/ml至15ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度为约100ng/ml bFGF。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度在70-130ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂是IL6RIL6嵌合体。
如本文所用，术语“IL6RIL6”是指嵌合多肽，其包括白细胞介素-6受体的可溶性部分(IL-6-R，例如，GenBank登录号AAH89410，SEQ ID NO:2所示的人IL-6-R)(例如，GenBank登录号AAH89410的氨基酸112-355，SEQ ID NO:3所示的可溶性IL6受体的一部分)和白细胞介素-6(IL6)(例如，GenBank登录号CAG29292，SEQ ID NO:4所示的人IL-6)或其生物活性部分(例如，受体结合结构域)。
优选地，根据本发明的此方面的方法使用的IL6RIL6嵌合体能够支持哺乳动物多能干细胞(例如，哺乳动物家畜多能干细胞)的未分化生长，同时维持其多能性能力。将理解的是，当构建IL6RIL6嵌合体时，两个功能部分(即IL6及其受体)可通过合适的连接体(例如，多肽连接体)彼此直接融合(例如，附接或翻译融合，即由单个开放阅读框编码)或缀合(附接或翻译融合)。优选地，IL6RIL6嵌合多肽表现出与天然存在的IL6和IL6受体相似的糖基化量和模式。例如，合适的IL6RIL6嵌合体如Revel M.等人的WO 99/02552(其通过引用完整并入本文)的SEQ ID NO:5和图11中所示。
根据本发明的一些实施方式，包括在确定成分培养基中的IL6RIL6嵌合体以至少50pg/ml(皮克/毫升)且不超过150pg/ml的浓度存在，例如，至少75pg/ml且不超过150pg/ml，优选地，至少80pg/ml且不超过150pg/ml，优选地，至少85pg/ml且不超过150pg/ml，优选地，至少90pg/ml且不超过150pg/ml，例如，约100pg/ml。
根据本发明的一些实施方式，IL6RIL6嵌合体的有效浓度为约100pg/ml。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的IL6RIL6嵌合体以至少50ng/ml(纳克/毫升)且不超过150ng/ml的浓度存在，例如，至少75ng/ml且不超过150ng/ml，优选地，至少80ng/ml且不超过150ng/ml，优选地，至少85ng/ml且不超过150ng/ml，优选地，至少90ng/ml且不超过150ng/ml，例如，约100ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中IL6RIL6嵌合体的有效浓度为约100ng/ml。
应当注意，IL6RIL6嵌合体的浓度可根据其合成或重组表达后的嵌合多肽的纯度而变化，并且本领域技术人员能够根据这种纯度调节最佳浓度。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂是gp130激动剂。
如本文所用，短语“gp130激动剂”是指当体外培养时结合并激活gp130信号转导物并抑制哺乳动物多能干细胞如哺乳动物家畜多能干细胞分化的分子。
根据本发明的一些实施方式，gp130激动剂选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)。
如本文所用，术语“白血病抑制因子(LIF)”是指多效性细胞因子，其参与造血分化的诱导、神经元细胞分化的诱导、是肾发育期间间充质向上皮转化的调节剂，并且还可在母体-胎儿界面处的免疫耐受中起作用。
本发明的一些实施方式的培养基中使用的LIF可以是纯化的、合成的或重组表达的LIF蛋白[例如，人LIF多肽GenBank登录号NP_002300.1(SEQ ID NO:6)；人LIF多核苷酸GenBank登录号NM_002309.4(SEQ ID NO:7)。应当注意，为了制备无异种成分培养基，LIF优选从人来源纯化或重组表达。可从多种来源获得重组人LIF，如Chemicon,USA(目录号LIF10100)和AbD Serotec(MorphoSys US Inc,Raleigh,NC 27604,USA)。鼠LIF(LIF)可获自Millipore,USA(目录号ESG1107)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中LIF的浓度为约1000单位/ml至约4,000单位/ml，例如，约2000单位/ml至约4,000单位/ml，例如，约2000单位/ml至约3,800单位/ml，例如，约2000单位/ml至约3,600单位/ml，例如，约2000单位/ml至约3,500单位/毫升，例如，约2000单位/ml至约3,400单位/毫升，例如，约2,500单位/ml至约3,500单位/毫升，例如，约2,800单位/毫升至约3,200单位/毫升，例如，约2,900单位/毫升至约3,100单位/毫升，例如，约3000单位/毫升。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的LIF的有效浓度为约3000U/ml。
根据本发明的一些实施方式，培养基中LIF的浓度为至少约1000单位/ml且不超过5000单位/ml，例如，至少约2000单位/ml，例如，至少约2100单位/ml，例如，至少约2200单位/ml，例如，至少约2300单位/ml，例如，至少约2400单位/ml，例如，至少约2500单位/ml，例如，至少约2600单位/ml，例如，至少约2700单位/ml，例如，至少约2800单位/ml，例如，至少约2900单位/ml，例如，至少约2950单位/ml且不超过5000单位/ml，例如，约3000单位/ml。
如本文所用，术语“IL6”(白细胞介素6)是指在炎症和B细胞成熟中起作用的细胞因子。
本发明的一些实施方式的确定成分培养基中使用的IL6可以是纯化的、合成的或重组表达的IL6蛋白，如GenBank登录号NP_000591.1(SEQ ID NO:8)、NP_001305024.1(SEQID NO:9)或NP_001358025.1(SEQ ID NO:10)所示的蛋白。
IL6可从各种制造商如Peprotech、R&D Systems获得。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的IL6的有效浓度在50ng/ml至200ng/ml之间，例如，在70-180ng/ml之间，例如，在90-150ng/ml之间，例如，在90-120ng/ml之间，例如，在90-110ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的IL6的有效浓度为约100ng/ml。
如本文所用，术语“白细胞介素11(IL11)”是指细胞因子gp130家族的蛋白成员，也称为AGIF和IL-11。白细胞介素11[例如，人IL-11多肽GenBank登录号NP_000632.1(SEQ IDNO:11)；人IL-11多核苷酸GenBank登录号NM_000641.2(SEQ ID NO:12)]可从各种商业来源如R&D Systems或PeproTech获得。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的IL11的有效浓度在0.2-2ng/ml之间，例如，在0.5-1.5ng/ml之间，例如，在0.8-1.2ng/ml之间，例如，在0.9-1.1ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的IL11的有效浓度为约1ng/ml。
如本文所用，术语“睫状神经营养因子”(也称为HCNTF；CNTF)是指其作用似乎限于神经系统的多肽激素，在神经系统中其促进某些神经元群体中神经递质合成和神经突增生。该蛋白是神经元和少突胶质细胞的强力存活因子，并且可能与减少炎性发作期间组织破坏有关。CNTF[例如，人CNTF多肽GenBank登录号NP_000605.1(SEQ ID NO:13)；人CNTF多核苷酸GenBank登录号NM_000614(SEQ ID NO:14)]可从各种商业来源如R&D SYSTEMS或PeproTech获得。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的CNTF的有效浓度在0.2-2ng/ml之间，例如，在0.5-1.5ng/ml之间，例如，在0.8-1.2ng/ml之间，例如，在0.9-1.1ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的CNTF的有效浓度为约1ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
如本文所用，术语“WNT3A”是指WNT基因家族的成员。WNT基因家族由编码分泌型信号传导蛋白的结构相关基因组成。这些蛋白与肿瘤发生和数个发育过程包括胚胎发生过程中细胞命运和行为模式(patterning)的调控有关。
WNT3A mRNA(GenBank登录号NM_033131.3；SEQ ID NO:15)编码WNT3A多肽(GenBank登录号NP_149122.1；SEQ ID NO:16)。WNT3A多肽可从各种制造商如R&D SYSTEMS(例如，目录号5036-WN-010)获得。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中Wnt3a多肽的有效浓度在5-20ng/ml之间，例如，在5-15ng/ml之间，例如，在6-15ng/ml之间，例如，在8-13ng/ml之间，例如，在9-12ng/ml之间。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中Wnt3a多肽的有效浓度为约10ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度在4-100ng/ml的范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中bFGF的有效浓度为约100ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度为约10ng/ml的Wnt3a多肽和浓度为4-100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括小分子。
根据本发明的一些实施方式，小分子是蛋白酶抑制剂。
如上所述，本发明的一些实施方式的确定成分培养基包括有效量的蛋白酶抑制剂。
如本文所用，短语“蛋白酶抑制剂的有效量”是指足以在培养时维持多能干细胞(例如，哺乳动物多能干细胞，例如，家畜多能干细胞)处于多能状态例如至少5代的蛋白酶抑制剂的量。
优选地，蛋白酶抑制剂的有效量足以在培养时维持多能干细胞处于未分化状态至少5代。
根据本发明的一些实施方式，蛋白酶抑制剂是可逆蛋白酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方式，蛋白酶抑制剂抑制丝氨酸蛋白酶(一种或多种)。
可用于本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的可逆蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括但不限于苯甲基磺酰氟(PMSF)、GSK3β抑制剂、醛类–CHO、芳基酮类-CO-芳基、三氟甲基酮类-COCF3和酮羧酸类–COCOOH。
根据本发明的一些实施方式，蛋白酶抑制剂是苯甲基磺酰氟(PMSF)。
PMSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，常用于制备细胞分裂物。PMSF在水中会迅速降解，并且储备溶液通常由无水乙醇、异丙醇、玉米油或DMSO组成。当使用浓度在0.1-1mM之间的PMSF时，发生蛋白水解抑制。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中使用的PMSF以下列浓度提供：至少约0.01mM，例如，至少约0.02mM，例如，至少约0.03mM，例如，至少约0.04mM，例如，至少约0.05mM，例如，至少约0.06mM，例如，至少约0.07mM，例如，至少约0.08mM，例如，至少约0.09mM，例如，至少约0.1mM PMSF。
例如，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的PMSF可在0.05mM至1mM范围内，例如，在0.05mM至0.8mM范围内，例如，在0.05mM至0.7mM范围内，例如，在0.05mM至0.6mM范围内，例如，在0.05mM至0.5mM范围内，例如，在0.06mM至0.4mM范围内，例如，在0.07mM至0.3mM范围内，例如，在0.07mM至0.2mM范围内，例如，在0.07mM至0.15mM范围内，例如，在0.07mM至0.13mM范围内，例如，在0.08mM至0.2mM范围内，例如，在0.09mM至0.15mM范围内，例如，在0.09mM至0.12mM范围内，例如，在0.09mM至0.1mM范围内，例如，约0.1mMPMSF，例如，约0.07mM PMSF，例如，约0.13mM PMSF。
根据本发明的一些实施方式，蛋白酶抑制剂是不可逆蛋白酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方式，不可逆蛋白酶抑制剂抑制丝氨酸蛋白酶(一种或多种)。
根据本发明的一些实施方式，不可逆蛋白酶抑制剂是甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)。
TLCK(CAS 4238-41-9)是胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的不可逆抑制剂。
TLCK可从各种供应商如abcam(例如，目录号ab144542)、Enzo(目录号BML-PI121-0200)、GENAXXON bioscience目录号M3375.0100)等获得。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的TLCK以约0.05μM至约1000μM的浓度范围提供。例如，在0.5μM至约500μM之间、在0.5μM至约400μM之间、在0.5μM至约300μM之间、在0.5μM至约200μM之间、在0.5μM至约100μM之间、在1μM至约100μM之间、在5μM至约100μM之间、在10μM至约100μM之间、在10μM至约90μM之间、在10μM至约80μM之间、在10μM至约70μM之间、在20μM至约70μM之间、在30μM至约70μM之间、在40μM至约70μM之间、在40μM至约60μM之间，例如，约50μM、约55μM或约60μM。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的TLCK以20-80μM的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的TLCK以30-70μM的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中TLCK的有效浓度在40-60μM之间的范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中的TLCK在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中以约50μM的浓度提供。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基包括有效量的蛋白酶抑制剂和有效量的IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，IL6RIL6嵌合体在进一步包括蛋白酶抑制剂的确定成分培养基中的有效浓度在50-150pg/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，IL6RIL6嵌合体在进一步包括蛋白酶抑制剂的确定成分培养基中的有效浓度在70-130pg/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，IL6RIL6嵌合体在进一步包括蛋白酶抑制剂的确定成分培养基中的有效浓度在80-120pg/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，IL6RIL6嵌合体在进一步包括蛋白酶抑制剂的确定成分培养基中的有效浓度在50-150ng/ml范围内。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)的gp130激动剂和选自苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)的蛋白酶抑制剂。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度在5-20ng/ml范围内的Wnt3a多肽和浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度在5-20ng/ml范围内的Wnt3a多肽和浓度在80-120pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGFβ1)。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β3(TGFβ3)。
如本文所用，短语“转化生长因子β(TGFβ)”是指转化生长因子β的任何同工型，其在多种细胞类型中通过同一受体信号传导系统在控制增殖、分化和其它功能方面发挥作用。TGFβ在诱导转化起作用，也充当负性(negative)自分泌生长因子。
TGFβ存在三种已知的同工型，即TGFβ1[人TGFβ1mRNA序列GenBank登录号NM_000660.4(SEQ ID NO:17)，多肽序列GenBank登录号NP_000651.3(SEQ ID NO:18)]、TGFβ2[人TGFβ2mRNA序列GenBank登录号NM_001135599.1同工型1(SEQ ID NO:19)或GenBank登录号NM_003238.2同工型2(SEQ ID NO:20)；多肽序列GenBank登录号NP_001129071.1同工型2(SEQ ID NO:21)或GenBank登录号NP_003229.1同工型2(SEQ ID NO:22)或TGFβ3[人TGFβ3mRNA序列GenBank登录号NM_003239.2(SEQ ID NO:23)，多肽序列GenBank登录号NP_003230.1(SEQ ID NO:24)]。TGFβ亚型可从各种商业来源获得，如R&D SystemsMinneapolis MN,USA和Sigma,St Louis,MO,USA。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中TGFβ1的有效浓度在0.06-0.24ng/ml TGFβ1范围内，例如，在0.08-0.20ng/ml TGFβ1范围内，例如，在0.1-0.15ng/ml TGFβ1范围内，例如，在0.11-0.13ng/ml TGFβ1范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中TGFβ1的有效浓度为约0.12ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，在包括TGFβ1和bFGF的确定成分培养基中，bFGF的有效浓度在4-20ng/ml bFGF范围内，例如，约10ng/ml bFGF。
根据本发明的一些实施方式，在包括TGFβ1和bFGF的确定成分培养基中，bFGF的有效浓度在70-130ng/ml bFGF范围内，例如，约100ng/ml bFGF。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中TGFβ3的有效浓度在0.5-4ng/ml TGFβ3范围内，例如，在4ng/ml TGFβ3范围内，例如，在1.5-3.5ng/ml TGFβ3范围内，例如，在1.5-2.5ng/ml TGFβ3范围内。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基中TGFβ3的有效浓度为约2ng/ml。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基还包括抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基中抗坏血酸的浓度在8-600微克/毫升(μg/ml)范围内，例如，在10-15μg/ml范围内，例如，在40-60μg/ml范围内，例如，在450-550μg/ml范围内，例如，约500μg/ml。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体和浓度在450-550μg/ml的抗坏血酸。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％ DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、浓度为0.5％[体积/体积(v/v)]至1.2％v/v的脂质混合物、浓度范围为BSA 0.4％(v/v)至0.7％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和抗坏血酸450-550μg/ml，其中血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)、浓度为0.5％[体积/体积(v/v)]至1.2％v/v的脂质混合物、浓度范围为BSA0.4％(v/v)至0.7％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)、抗坏血酸450-550μg/ml和浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体，其中血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％ DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充ITS[胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)]、浓度为0.5-1.2％v/v的脂质混合物、范围为450-550μg/ml的抗坏血酸和牛血清白蛋白(浓度为0.4％至0.7％)。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充ITS[胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)]、浓度为0.5-1.2％v/v的脂质混合物、范围为450-550μg/ml的抗坏血酸、浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体和牛血清白蛋白(浓度为0.4％至0.7％)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基包括95％DMEM/F12(或KO-DMEM)并补充ITS[胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)]；脂肪酸混合物[包括浓度在0.47-0.63x10-4mM范围内的亚油酸、浓度在1-1.33X10-4mM范围内的硫辛酸、浓度在0.32-0.43X10-5mM范围内的花生四烯酸、浓度在0.28-0.37X10-3mM范围内的胆固醇、浓度在0.72-0.96X10-3mM范围内的DL-α-生育酚-醋酸酯、浓度在1.74-2.33X10-5mM范围内的亚麻酸、浓度在2.14-2.86X10-5mM范围内的肉豆蔻酸、浓度在1.73-2.31X10-5mM范围内的油酸、浓度在1.91-2.55X10-5mM范围内的棕榈酸、浓度在1.92-2.571X10-5mM范围内的棕榈油酸和浓度在1.72-2.29X10-5mM范围内的硬脂酸]；范围为450-550μg/ml的抗坏血酸；和牛血清白蛋白(浓度为0.4％至0.7％v/v)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的一些实施方式的确定成分培养基包括95％DMEM/F12(或KO-DMEM)并补充ITS[胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)]；脂肪酸混合物[包括浓度在0.47-0.63x10-4mM范围内的亚油酸、浓度在1-1.33X10-4mM范围内的硫辛酸、浓度在0.32-0.43X10-5mM范围内的花生四烯酸、浓度在0.28-0.37X10-3mM范围内的胆固醇、浓度在0.72-0.96X10-3mM范围内的DL-α-生育酚-醋酸酯、浓度在1.74-2.33X10-5mM范围内的亚麻酸、浓度在2.14-2.86X10-5mM范围内的肉豆蔻酸、浓度在1.73-2.31X10-5mM范围内的油酸、浓度在1.91-2.55X10-5mM范围内的棕榈酸、浓度在1.92-2.571X10-5mM范围内的棕榈油酸和浓度在1.72-2.29X10-5mM范围内的硬脂酸]、浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体和牛血清白蛋白(浓度为0.4％至0.7％v/v)。
根据本发明的一些实施方式，至少一种分化抑制剂包括浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体、浓度为450-550μg/ml的抗坏血酸和浓度为30-70ng/ml的bFGF。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM、浓度为0.5％[体积/体积(v/v)]至1.2％v/v的脂质混合物、浓度范围为BSA 0.4％(v/v)至0.7％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)、抗坏血酸450-550μg/ml、浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体和浓度为30-70ng/ml的bFGF，其中血清替代物缺乏硒。
根据本发明的一些实施方式，确定成分培养基包括基础培养基(例如，95％DMEM/F12(或KO-DMEM))，其补充ITS[胰岛素(浓度范围为0.34X10-3mM至1.88X10-3mM)、转铁蛋白(浓度范围为0.137X10-4mM至0.66X10-4mM)和硒(浓度范围为2.11X10-5mM至5.9X10-5mM)]、浓度为0.5-1.2％v/v的脂质混合物、范围为450-550μg/ml的抗坏血酸、浓度在50-150pg/ml范围内的IL6RIL6嵌合体、浓度为30-70ng/ml的bFGF和牛血清白蛋白(浓度为0.4％至0.7％)。
根据本发明的一些实施方式，本发明的确定成分培养基不适合细胞的冷冻保存。
如本文所用，术语“冷冻保存”是指在冷冻条件下，如在0℃水凝固点以下的温度下，例如，低于-5℃、-10℃、-18℃、-20℃、-50℃或-70℃(符号“-”表示负值)下保存细胞。
根据本发明的一些实施方式，本发明的确定成分培养基缺乏冷冻保护剂。
冷冻保护剂是一种用于使生物组织或细胞免受成冰作用(结冰，ice formation)造成的冷冻损伤的物质。
已知的常规冷冻保护剂包括但不限于乙二醇、丙二醇和甘油等二醇。二甲基亚砜(DMSO)也被认为是一种常规的冷冻保护剂。甘油和DMSO已被用于减少冷冻保存在液氮中的精子、卵母细胞和胚胎中的成冰作用。海藻糖是由酵母和昆虫产生的非还原糖，并且被用作冷冻保护剂。
根据本发明的一些实施方式，本发明的确定成分培养基缺乏冷冻保护剂如二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖、半乳糖、海藻糖、二醇(例如，乙二醇、丙二醇、甲醇和甘油)。
如所述，本发明的一些实施方式的确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代。
如所述，本发明的一些实施方式的确定成分培养基能够在培养时维持人多能干细胞处于未分化状态至少5代。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了细胞培养物，其包括本发明的一些实施方式的确定成分培养基以及细胞。
根据本发明的一些实施方式，细胞是干细胞。
根据本发明的一些实施方式，细胞是哺乳动物多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞(PSC)是哺乳动物多能干细胞，例如，人多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，细胞是哺乳动物家畜多能干细胞。
如本文所用，短语“干细胞”是指能够在培养时长时间保持未分化状态(例如，全能的、多能的(pluripotent)或多能的(multipotent)干细胞)直到被诱导分化成具有特定、特化功能的其它细胞类型(例如，完全分化的细胞)的细胞。
短语“多能干细胞”是指能够分化成所有三个胚胎胚层，即外胚层、内胚层和中胚层，或保持未分化状态的细胞。
短语“多能干细胞”可理解为(read on)胚胎干细胞(ESC)和/或诱导多能干细胞(iPS细胞)。
如本文所用的短语“胚胎干细胞”是指从着床前(即着床前胚泡)妊娠后(例如，胚泡)形成的胚胎组织获得的细胞；从着床后/原肠胚形成前阶段胚泡获得的扩展胚泡细胞(extended blastocyst cells,EBC)和/或在妊娠期间的任何时间，优选在妊娠10周之前从胎儿的生殖组织获得的胚胎生殖(embryonic germ,EG)细胞。
根据本发明的一些实施方式，本发明的多能干细胞是胚胎干细胞，如哺乳动物来源的胚胎干细胞，如哺乳动物家畜多能干细胞或人多能干细胞。
本发明的胚胎干细胞可使用公知的细胞培养方法获得。例如，可从哺乳动物胚泡中分离哺乳动物胚胎干细胞。哺乳动物胚泡可从体内着床前胚胎或体外受精(IVF)胚胎获得。可选地，单细胞哺乳动物胚胎可扩展至胚泡期。为了分离哺乳动物ES细胞，从胚泡中去除透明带，并通过免疫外科手术分离内细胞团(ICM)，其中滋养层细胞被分开并通过轻柔移液从完整ICM中去除。然后将ICM置于含有能够使其向外生长的适当培养基的组织培养瓶中。6至15天后，通过机械解离或酶促降解将ICM衍生的向外生长物(outgrowth)解离成团块，然后将细胞重铺在新鲜的组织培养基上。通过微量移液器单个地选择表现出未分化形态的集落，将其机械解离成团块，然后重铺。然后每隔4-7天常规地使所得的ES细胞分开。制备人ES细胞的方法描述于Thomson等人[美国专利号5,843,780；Science 282:1145,1998；Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995]；Bongso etal.,[Hum Reprod 4:706,1989]；和Gardner et al.,[Fertil.Steril.69:84,1998]中。制备哺乳动物家畜ES细胞的方法描述于Toshihiko Ezashi等人2016(Annu.Rev.Anim.Biosci.4:223-253和其中引用的参考文献中，这些文献通过引用完整并入本文中)。
应当理解，市售干细胞也可用于本发明的这一方面。人ES细胞可从NIH人胚胎干细胞登记处(NIH human embryonic stem cells registry)(www(dot)escr(dot)nih(dot)gov)购买。市售胚胎干细胞系的非限制性实例是BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE04和TE06。
人扩展胚泡细胞(EBC)可从受精后至少9天、原肠胚形成前的某个阶段的人胚泡获得。在培养胚泡之前，将透明带消化[例如通过台罗德酸溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)]以暴露内细胞团。然后使用标准胚胎干细胞培养方法，在受精后(即，在原肠胚形成事件前)于体外将胚泡培养成完整胚胎至少9天且不超过14天。
哺乳动物家畜扩展胚泡细胞(EBC)可从受精后至少7天、原肠胚形成前的某个阶段的哺乳动物家畜胚泡获得。在培养胚泡之前，将透明带消化[例如通过台罗德酸溶液(SigmaAldrich,St Louis,MO,USA)]以暴露内细胞团。然后使用标准多能干细胞培养方法，在受精后(即，在原肠胚形成事件前)于体外将胚泡培养成完整胚胎至少4天且不超过21天。
另一种制备ES细胞的方法描述于Chung等人的Cell Stem Cell，第2卷，第2期，113-117，2008年2月7日。此方法包括在体外受精过程中从胚胎中取出单细胞。胚胎在此过程中没有被破坏。
使用本领域任何技术人员已知的实验室技术，从从妊娠约8-11周的胎儿(在人类胎儿的情况下)获得的原始生殖细胞制备胚胎生殖(EG)细胞。生殖嵴被解离并切割成小块，之后通过机械解离分解成细胞。然后使EG细胞在含适当培养基的组织培养瓶中生长。每天更换培养基来培养细胞，直至观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常在7-30天或1-4代后。有关制备人EG细胞方法的更多详细信息，请参见Shamblott et al.,[Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13726,1998]和美国专利号6,090,622。
如本文所用的短语“诱导多能干细胞”(或胚胎样干细胞)是指通过体细胞(例如，成体体细胞)的去分化获得的增殖性且多能的干细胞。
根据本发明的一些实施方式，iPS细胞的特征在于与ESC相似的增殖能力，因此可在培养使维持和扩展几乎无限的时间。
通过对细胞进行再编程以获得胚胎干细胞特征的遗传操纵，可赋予IPS细胞多能性。例如，本发明的iPS细胞可通过在体细胞中诱导Oct-4、Sox2、Kfl4和c-Myc的表达而从体细胞如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞生成，基本上如Yamanaka S,Cell StemCell.2007,1(1):39-49；Aoi T,et al.,Generation of Pluripotent Stem Cells fromAdult Mouse Liver and Stomach Cells.Science.2008Feb 14.(Epub ahead of print)；IH Park,Zhao R,West JA,et al.Reprogramming of human somatic cells topluripotency with defined factors.Nature2008；451:141-146；K Takahashi,TanabeK,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 2007；131:861-872(其中每一篇都通过引用以其整体并入本文)所述。另外地或可选地，本发明的iPS细胞可通过诱导OCT4、Sox2、Nanog和Lin28的表达而从体细胞生成，基本上如Yu Junying等人(Science 318:1917-1920,2007和Nakagawa等人2008(Nat Biotechnol.26(1):101-106)所述。应当注意，体细胞的遗传操纵(再编程)可使用任何已知的方法进行，如使用质粒或病毒载体，或者通过衍生化而不与基因组进行任何整合[Yu J,et al.,Science.2009,324:797-801]。其它胚胎样干细胞可通过核移植至卵母细胞、与胚胎干细胞融合或核移植到受精卵中(如果受体细胞在有丝分裂中停滞)生成。WO 03/046141A2(Advanced Cell Tech Inc.2003年6月5日)教导了通过孤雌生殖以及通过体细胞核移植生成活化的人类胚胎。
本发明的iPS细胞可通过诱导胚胎成纤维细胞去分化获得[Takahashi andYamanaka,2006Cell.2006,126(4):663-676；Meissner et al,2007Nat Biotechnol.2007,25(10):1177-1181]，从hESCs形成的成纤维细胞[Park et al,2008Nature.2008,451(7175):141-146]，胎儿成纤维细胞[Yu et al,2007Science.2009,324(5928):797-801；Park et al,2008(上文)]，包皮成纤维细胞[Yu et al,2007(supra)；Park et al,2008(上文)]，成人皮肤和皮肤组织[Hanna et al,2007Science.2007,318(5858):1920-1923；Lowry et al,2008Proc Natl Acad Sci USA,105(8):2883-2888]，B-淋巴细胞[Hanna etal 2007(上文)]和成人肝和胃细胞[Aoi et al,2008Science.2008Aug 1；321(5889):699-702]。
IPS细胞系也可通过细胞库如WiCell bank获得。市售iPS细胞系的非限制性实例包括iPS包皮克隆1[Wicell目录号iPS(包皮)-1-DL-1]、iPSIMR90克隆1[WiCell目录号iPS(IMR90)-1-DL-1]和iPSIMR90克隆4[WiCell目录号iPS(IMR90)-4-DL-1]。
本发明的一些实施方式的确定成分培养基可用于衍生多能干细胞系。
如本文所用，关于“哺乳动物多能干细胞系”的短语“衍生”是指从分离自单一哺乳动物胚胎(例如，从离体培养的哺乳动物胚胎如离体培养的牛胚胎)的至少一种干细胞(例如，卵裂球(胚泡的细胞)、上胚细胞或晚期多能干细胞)生成哺乳动物多能干细胞群。
如本文所用，短语“上胚细胞”是指胚胎上胚的细胞。这些细胞具有多能性，因此能够分化成所有三个胚胎胚层。
如本文所用，短语“晚期多能干细胞”是指衍生自晚期上胚期直至原肠胚形成的细胞。这些细胞具有多能性，因此能够分化成所有三个胚胎胚层。
根据本发明的一些实施方式，上胚细胞和/或晚期多能干细胞的特征在于核质比高。
如本文所用，短语“哺乳动物家畜”是指通常用作食物如肉和/或乳来源的家养哺乳动物。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜是反刍哺乳动物家畜。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜是非反刍哺乳动物家畜。
根据本发明的一些实施方式，反刍哺乳动物家畜选自牛亚科、绵羊、山羊、鹿和骆驼。
根据本发明的一些实施方式，牛亚科的反刍哺乳动物家畜是牛或牦牛。
根据本发明的一些实施方式，牛亚科的反刍哺乳动物家畜是牛。
根据本发明的一些实施方式，牛是水牛、野牛或奶牛(牛科)。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜是奶牛(牛科)。
根据本发明的一些实施方式，牛是奶牛(牛科)。
根据本发明的一些实施方式，非反刍哺乳动物家畜选自猪、兔和马。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜多能干细胞衍生自延迟的牛胚泡，例如，通过体外培养受精后至少7天的哺乳动物家畜胚胎至少4天且不超过直到受精后21天的培养期，以获得包括上胚细胞和/或晚期多能干细胞的胚胎。
衍生自延迟的牛胚泡的哺乳动物家畜多能干细胞系的非限制性实例包括BVN1、BVN2、BVN5和BVN6。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜多能干细胞衍生自牛胚泡，如通过在饲养细胞层(如MEF饲养层)或无饲养细胞基质(如Matrigel基质、纤连蛋白基质、层粘连蛋白基质、胶原基质、弹性蛋白基质和玻连蛋白基质)上直接培养受精后7天的哺乳动物家畜胚胎。
衍生自牛胚泡的哺乳动物家畜多能干细胞的非限制性实例包括但不限于牛胚胎干细胞(ESC)如BVN3和BVN4。
牛胚胎干细胞的衍生基本上可按照Bogliotti YS等人2018(Efficientderivation of stable primed pluripotent embryonic stem cells from bovineblastocysts.PNAS,115(9):2090–2095)，其在牛胚胎的第7天使用全胚胎培养。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了哺乳动物家畜多能干细胞系，其衍生自哺乳动物家畜胚泡(例如，来自卵裂球)、上胚细胞或晚期多能干细胞——通过在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中离体培养细胞。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜多能干细胞系是BVN3细胞系，其由本发明人使用包括IL6RIL6R嵌合体的本发明的一些实施方式的确定成分培养基衍生得到。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜多能干细胞系可从胚泡期的7天牛胚胎获得。在去除透明带(ZP)后，在根据本发明的一些实施方式的确定成分培养基(例如，包括IL6RIL6R嵌合体和5％血清替代物的培养基)存在的情况下，将7天牛胚胎铺设(plated)在饲养细胞(例如，MEF)上。胚胎第17天，可在显微镜下机械收集具有PSC形态的培养细胞，并重铺在新鲜的饲养细胞层(例如，MEF)上。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜多能干细胞是从经历去分化的哺乳动物家畜体细胞衍生的诱导多能干细胞(iPSC)。可使用商业重编程试剂盒[如Epi5 episomaliPSC试剂盒(Thrmo-Fisher)、Simplicon RNA重编程试剂盒(Merck-Millipore)、Stemcca试剂盒(Merck-Millipore)、Stemgent stemRNA3ed重编程试剂盒(Reprocelll)或CytoTuneTM试剂盒(Life Technology)]进行去分化，每个试剂盒都按照制造商的说明进行。
哺乳动物家畜iPSC的非限制性实例包括衍生自牛胎组织和子宫内膜上皮细胞的细胞系，如iBVN1.4、iBVN1.14和iBVN1.15。
根据本发明的一些实施方式，哺乳动物家畜iPSC通过重编程因子(例如，Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4基因)的瞬时表达生成。
根据本发明的一些实施方式，一旦生成，哺乳动物家畜iPSC就不依赖于重编程因子(例如，Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4基因)的持续表达以维持其多能性和未分化状态。
根据本发明的一些实施方式，一旦生成，就关闭(shut down)编码重编程因子的载体，并且不存在重编程因子(例如，Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4基因)的持续表达。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态的方法，包括在本发明的一些实施方式的确定成分培养基中培养哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法还包括使哺乳动物家畜多能干细胞传代至少一次。
如本文所用，如本文所用的术语“代”或“传代”是指使培养容器中的细胞分到2个或更多个培养容器，通常包括添加新鲜培养基。传代通常在细胞在培养时达到一定密度时进行。
根据本发明的一些实施方式，在培养期间每5-21天实现一次传代。
根据本发明的一些实施方式，传代包括在进一步培养细胞之前以1:2或2:3的比例分开哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，传代是通过机械传代进行的。
如本文所用，短语“机械解离”是指通过使用物理力而不是酶促活性将多能干细胞团粒分离成单细胞。
对于机械解离，可通过在少量培养基(例如，0.2-1ml)中上下抽吸(pipetting)细胞来解离多能干细胞的团块(可通过离心细胞实现)或分离的多能干细胞团块。例如，可使用200μl或1000μl移液管的尖端进行几次抽吸(例如，在3-20次之间)。
另外地或可选地，大的多能干细胞团块的机械解离可使用被设计成将团块破碎成预定尺寸的装置来进行。此类装置可从瑞典哥德堡CellArtis获得。另外地或可选地，可在倒置显微镜下观察团块的同时使用27g针(BD Microlance,Drogheda,爱尔兰)等针手动执行机械解离。
根据本发明的一些实施方式，传代是在缺乏酶团块解离的条件下实现的。
根据本发明的一些实施方式，方法还包括机械传代多能干细胞至少2代，例如，至少3代，例如，至少4代，例如，至少5代，从而获得扩大的多能干细胞群。
根据本发明的一些实施方式，传代是通过细胞团块的酶促解离进行的。
多能干细胞团块(一个或多个)的酶促消化可通过使团块(一个或多个)或集落经受酶如IV型胶原酶(Worthington biochemical corporation,Lakewood,NJ,USA)进行。用酶孵育的时间取决于细胞培养物中存在的细胞团块或集落的大小。通常，当多能干细胞在培养时每5-21天解离一次细胞团块时，用1.5mg/ml IV型胶原酶孵育20-60分钟会产生小的细胞团块，其可在未分化状态下进一步培养。可选地，多能干细胞团块可经受1.5mg/ml IV型胶原酶孵育约25分钟，之后用1mg/ml分散酶孵育5分钟。
根据本发明的一些实施方式，方法还包括使多能干细胞群体酶促传代至少2代，例如，至少3代，例如，至少4代，例如，至少5代，从而获得扩大的多能干细胞群。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞群在连续传代的同时以未分化状态扩大延长的时间段。
根据本发明的一些实施方式，当在培养时，延长的时间段是至少一个两周，例如，至少一个月，例如，至少3、4、5、6、7个月或更长。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞的连续传代每5-21天，例如，每5-15天，例如，每5-10天，例如，每5-7天进行一次。
根据本发明的一些实施方式，通过酶促传代(例如，使用IV型胶原酶、分散酶、TryPLE胰蛋白酶)使多能干细胞传代。
根据本发明的一些实施方式，培养是在饲养细胞层上进行的。
根据本发明的一些实施方式，在二维培养系统上进行哺乳动物家畜多能干细胞的培养。
根据本发明的一些实施方式，二维培养系统包括无饲养基质。
根据本发明的一些实施方式，培养是在细胞外基质上进行的。
根据本发明的一些实施方式，培养是在缺乏基底黏附的悬浮培养物中进行的。
如本文所用，短语“悬浮培养物”是指多能干细胞悬浮于培养基中而非黏附于表面的培养物。
因此，本发明的培养“缺乏基底黏附”，其中多能干细胞能够扩大而不黏附于外部基底如细胞外基质的组分、玻璃微载体或珠。
应当注意，培养多能干细胞如ESC和iPS细胞的一些方案包括将细胞微囊化在半透性水凝胶膜内，这允许营养物、气体和代谢产物与囊状物周围的本体培养基(bulk medium)交换(详情参见例如，Beardsley等人的美国专利申请号20090029462)。
根据本发明的一些实施方式，在悬浮培养物中培养的多能干细胞缺乏细胞包囊。
根据本发明的一些实施方式，悬浮培养多能干细胞的培养基和/或条件缺乏蛋白质载体。
根据本发明的一些实施方式，悬浮培养物缺乏基底黏附并且缺乏蛋白质载体。
如本文所用，短语“蛋白质载体”是指在将蛋白质或营养物(例如，矿物质如锌)转移到培养物中的细胞中起作用的蛋白质。这样的蛋白质载体可以是，例如，白蛋白(例如，牛血清白蛋白)、Albumax(富含脂质的白蛋白)或plasmanate(人血浆分离的蛋白质)。
悬浮培养是通过在培养容器中以促进细胞存活和增殖但限制分化的细胞密度铺设多能干细胞实现的。通常，使用约5x104–2x105个细胞/ml的铺设密度。将理解的是，尽管通常接种干细胞的单细胞悬液，但也可使用小簇如10-200个细胞。
为了在悬浮培养的同时向PSC提供充足且恒定供应的营养物和生长因子，可每日更换培养基，或按预定时间表如每2-3天更换培养基。例如，可通过使PSC悬浮培养物经历80g离心约3分钟并将形成的PSC团粒重新悬浮在新鲜培养基中来更换培养基。另外地，或可选地，可采用这样的培养系统：使培养基经历恒定的过滤或透析以向PSC提供恒定供应的营养物或生长因子。
由于大的PSC簇可能导致细胞分化，因此采取措施避免大的PSC聚集体。优选地，形成的PSC团块每5-7天解离一次，并将单细胞或小的细胞团块分开到另外的培养容器中(即传代)或者仍在相同的培养容器中但含有另外的培养基。对于大的PSC团块的解离，可对PSC团粒(可如上文所述通过离心实现)或分离的PSC团块进行酶促消化和/或如上说明的机械解离。
如上所述，哺乳动物多能干细胞能够分化成内胚层、中胚层和外胚层胚胎胚层。
本发明的一些实施方式的多能干细胞向内胚层、中胚层和外胚层胚胎胚层的分化可通过在细胞培养中直接分化、通过分化成胚状体和/或通过形成畸胎瘤来进行。
本发明的一些实施方式的细胞培养物所包括的和/或本发明的一些实施方式的方法所使用的哺乳动物多能干细胞(例如，来自家畜)可用作生成分化的谱系特异性细胞的来源。这类细胞可通过使PSC经受各种分化信号(例如，细胞因子、激素、生长因子)而直接从多能干细胞获得，或通过形成胚状体并随后使EB的细胞分化成谱系特异性细胞而间接获得。
因此，根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了从多能干细胞生成胚状体的方法。方法通过以下实现：(a)根据本发明的一些实施方式的方法培养本发明的一些实施方式的多能干细胞，从而获得扩大的、未分化的多能干细胞；和(b)使扩大的、未分化的多能干细胞经受适于将干细胞分化成胚状体的培养条件，从而从多能干细胞生成胚状体。
如本文所用，短语“胚状体”是指由经历了分化的ESC、扩展胚泡细胞(EBC)、胚胎生殖细胞(EGC)和/或诱导多能干细胞群组成的形态结构。EB形成始于多能干细胞培养物中分化阻断因子的去除。在EB形成的第一步，多能干细胞增殖成小团细胞，然后进行分化。在分化的第一阶段，在预定的培养期(例如，人ESC或人iPS细胞培养1-4天；例如，哺乳动物家畜多能干细胞培养1-4天)之后，在小团的外层上形成内胚层细胞层，从而产生“简单的EB”。在第二阶段，在分化后3-20天，形成“复杂的EB”。复杂的EB的特征是外胚层和中胚层细胞及衍生组织广泛分化。
在培养期间，进一步监测EB的分化状态。细胞分化可通过检查已知指示分化的细胞或组织特异性标记来确定。例如，EB衍生的分化细胞可表达神经丝68KD，这是外胚层细胞谱系的特征标记。
可通过跟踪OCT-4表达的丧失以及其它标记如甲胎蛋白、NF-68kDa、α-cardiac和白蛋白的表达水平的升高来监测EB细胞的分化水平。用于监测特定基因表达水平的方法为本领域公知，并且包括RT-PCR、半定量RT-PCR、RNA印迹、RNA原位杂交、蛋白质印迹分析和免疫组化。
因此，根据本发明的一些实施方式的方法涉及在上述任何培养基中培养本发明的一些实施方式的多能干细胞以获得扩大的、未分化的多能干细胞，然后使扩大的、未分化的多能干细胞经历适于将多能干细胞分化成胚状体的培养条件下。这种促进分化的培养条件基本上缺乏当多能干细胞以未分化状态扩大时所使用的分化抑制因子，如TGFβ1、TGFβ3、抗坏血酸、gp130激动剂，例如，IL-11、CNTF、制瘤素、bFGF和/或il6ril6嵌合体。
对于EB形成，将多能干细胞(ESC或iPS细胞)从其无饲养培养系统或悬浮培养物中取出，并在含有血清或血清替代物且缺乏分化抑制因子的培养基存在的情况下转移至悬浮培养物中。例如，适合EB形成的培养基可包括补充20％ FBSd(HyClone,Utah,USA)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和1％非必需氨基酸储液的基础培养基(例如，Ko-DMEM或DMEM/F12)。
监测EB的形成在本领域技术人员的能力范围内，并且可通过形态学评估(例如，组织学染色)和确定分化特异性标记的表达来实现[例如，使用免疫学技术或基于RNA的分析(例如，RT-PCR，cDNA微阵列)]。
将理解的是，为了从EB获得谱系特异性细胞，EB的细胞可进一步经受适于谱系特异性细胞的培养条件。
根据本发明的一些实施方式，为了从多能干细胞生成谱系特异性细胞，方法还包括步骤(c)：使胚状体的细胞经受适于分化和/或扩大谱系特异性细胞的培养条件；从而从胚胎干细胞生成谱系特异性细胞。
如本文所用，短语“适于分化和/或扩大谱系特异性细胞的培养条件”是指培养系统(例如，无饲养基质或悬浮培养物)与适于分化和/或扩大衍生自EB细胞的特异性细胞谱系的的培养基的组合。这种培养条件的非限制性实例将在下文进一步描述。
将理解的是，由于EB是复杂的结构，EB分化成特异性的分化的细胞、组织或器官可能需要从EB中分离谱系特异性细胞。
根据本发明的一些实施方式，本发明的此方面的方法还包括在步骤(b)之后分离谱系特异性细胞。
如本文所用，短语“分离谱系特异性细胞”是指混合细胞群在培养物中的富集，其中细胞主要展示出至少一种与特异性谱系表型相关的特征。将理解的是，所有细胞谱系都衍生自三个胚胎胚层。因此，例如，肝细胞和胰腺细胞衍生自胚胎内胚层、骨、软骨、弹性、纤维结缔组织、肌细胞、心肌细胞、骨髓细胞、血管细胞(即内皮且平滑的肌细胞)，而造血细胞从胚胎中胚层分化，以及神经、视网膜和表皮细胞衍生自胚胎外胚层。
可通过荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)对EB的细胞分选，或对EB内包含的细胞、组织和/或组织样结构进行机械分离来实现这种分离。
根据本发明的一些优选实施方式，通过经由荧光激活细胞分选仪(FACS)分选EB的细胞来实现谱系特异性细胞的分离。
通过FACS分析分离EB衍生的分化细胞的方法是本领域已知的。根据一种方法，使用胰蛋白酶和EDTA(分别为0.025％和0.01％)的溶液解聚EB，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％胎牛血清(FBS)洗涤，并与针对特定细胞谱系的细胞表面抗原特性的荧光标记抗体在冰上孵育30min。例如，通过附接针对血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelialcell adhesion molecule-1,PECAM1)的抗体如可获自PharMingen(PharMingen,BectonDickinson Bio Sciences,San Jose,CA,USA)的荧光标记PECAM1抗体(30884X)——如在Levenberg,S.等人(Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002.99:4391-4396)中所述——来分离内皮细胞。使用荧光标记抗体如CD34-FITC、CD45-PE、CD31-PE、CD38-PE、CD90-FITC、CD117-PE、CD15-FITC、I类FITC分离造血细胞(所有这些抗体的IgG1均可获自PharMingen)、CD133/1-PE(IgG1)(可获自Miltenyi Biotec,Auburn,CA)和糖蛋白A-PE(IgG1)(可获自Immunotech(Miami,FL)。在FACScan(Becton Dickinson Bio Sciences)上分析活细胞(即无固定)——通过使用碘化丙锭，用PC-LYSIS或CELLQUEST软件排除死亡细胞。将理解的是，可使用如Kaufman,D.S.等人(Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98:10716–10721)所述的磁标记第二抗体和磁分离柱(MACS,Miltenyi)进一步富集分离的细胞。
根据本发明的一些实施方式，通过机械分离EB内包含的细胞、组织和/或组织样结构来实现谱系特异性细胞的分离。
例如，可从EB中分离搏动的心肌细胞，如Xu等人的美国专利号申请号20030022367中公开的。将本发明的四日龄的EB转移到明胶包被的板或腔室载玻片上，并使其附着和分化。机械分离从分化第8天观察到的自发性收缩细胞，并将其收集到含有低钙培养基或PBS的15mL管中。根据胶原酶的活性，使用胶原酶B在37℃下消化60-120分钟使细胞解离。然后将解离的细胞重新悬浮在分化KB培养基(85mM KCI、30mM K2HPO4、5mM MgSO4、1mM EGTA、5mM肌酸、20mM葡萄糖、2mM Na2ATP、5mM丙酮酸和20mM牛磺酸，缓冲至pH 7.2，Maltsev et al.,Circ.Res.75:233,1994)中并在37℃下孵育15-30min。解离后，将细胞接种到腔室载玻片中并在分化培养基中培养以生成能够搏动的单个心肌细胞。
将理解的是，适于分离的谱系特异性细胞的分化和扩大的培养条件包括各种组织培养基、生长因子、抗生素、氨基酸等，并且本领域技术人员能够确定应当应用哪些条件来扩大和分化特定细胞类型和/或细胞谱系[综述于Fijnvandraat AC,et al.,CardiovascRes.2003；58:303-12；Sachinidis A,et al.,Cardiovasc Res.2003；58:278-91；Stavridis MP and Smith AG,2003；Biochem Soc Trans.31(Pt 1):45-9中]。
根据本发明的一些实施方式，通过使EB经受分化因子，从而诱导EB分化成谱系特异性分化细胞来实现谱系特异性细胞的分离。下面描述了诱导EB分化成谱系特异性细胞的非限制性程序和方法。
神经前体细胞
为了将本发明的一些实施方式的EB分化成神经前体，将四日龄的EB在组织培养皿中培养5-12天，组织培养皿包括含5mg/ml胰岛素、50mg/ml转铁蛋白、30nM氯化硒和5mg/ml纤连蛋白的DMEM/F-12培养基(ITSFn培养基,Okabe,S.et al.,1996,Mech.Dev.59:89-102)。所得的神经前体可进一步移植以在体内生成神经细胞(Brüstle,O.et al.,1997.Invitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:14809-14814)。将理解的是，在其移植之前，在0.1％ DNase存在的情况下，将神经前体胰蛋白酶化并磨碎成单细胞悬液。
少突胶质细胞和有髓细胞(myelinate cells)
本发明的一些实施方式的EB可通过在改良的SATO培养基，即含牛血清白蛋白(BSA)、丙酮酸、孕酮、腐胺、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、氨基酸、神经营养蛋白3、睫状神经营养因子和Hepes的DMEM培养基中培养细胞而分化成少突胶质细胞和有髓细胞(Bottenstein,J.E.&Sato,G.H.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,514-517；Raff,M.C.,Miller,R.H.,&Noble,M.,1983,Nature 303:390-396]。简而言之，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA(37℃下5min)解离EB并磨碎成单细胞悬液。将悬浮细胞铺设在含补充5％马血清和5％胎牛血清(FCS)的SATO培养基的烧瓶中。培养4天后，轻轻摇动烧瓶，使松散黏附的细胞(主要是少突胶质细胞)悬浮，而星形胶质细胞仍黏附于烧瓶上并进一步产生条件培养基。将原代少突胶质细胞转移至含SATO培养基的新烧瓶中，再培养两天。在总共6天的培养之后，将寡球体(oligospheres)部分解离并重浮在用于细胞移植的SATO培养基中，或者完全解离并铺设在衍生自先前摇动步骤的寡球体条件培养基中[Liu,S.et al.,(2000).Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinatein culture and after spinal cord transplantation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97:6126-6131]。
肥大细胞
对于肥大细胞分化，将本发明的一些实施方式的两周龄的EB转移到组织培养皿中，组织培养皿包括补充10％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素、20％(v/v)WEHI-3细胞条件培养基和50ng/ml重组大鼠干细胞因子的DMEM培养基(rrSCF,Tsai,M.et al.,2000.In vivo immunological function of mast cells derived fromembryonic stem cells:An approach for the rapid analysis of even embryoniclethal mutations in adult mice in vivo.Proc Natl Acad Sci USA.97:9186-9190)。每周通过将细胞转移到新烧瓶中并更换一半的培养基来扩大培养物。
血液-淋巴样细胞(Hemato-lymphoid cells)
为了从本发明的一些实施方式的EB生成血液-淋巴样细胞，使用具有可调节氧含量的培养箱，在7.5％ CO2和5％ O2存在的情况下，将2-3日龄的EB转移到气体可渗透培养皿中。分化15天后，收获细胞并用胶原酶(0.1单位/mg)和分散酶(0.8单位/mg)温和消化使细胞解离，这两种酶均可获自F.Hoffman-La Roche Ltd,Basel,瑞士。使用抗-CD45单克隆抗体(mAb)M1/9.3.4.HL.2和与山羊抗大鼠免疫球蛋白缀合的顺磁微珠(Miltenyi)分离CD45阳性细胞，如Potocnik,A.J.et al.,(Immunology Hemato-lymphoid in vivoreconstitution potential of subpopulations derived fromin vitrodifferentiated embryonic stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1997,94:10295-10300)中所述。使用MACS柱(Miltenyi)上的单个通道可进一步富集分离的CD45阳性细胞。
应当注意，本发明的一些实施方式的EB可用于生成在培养时能够无限制扩大的谱系特异性细胞系。
本发明的一些实施方式的细胞系可通过本领域已知的方法使EB衍生细胞永生化(包括，例如，在细胞中表达端粒酶基因(Wei,W.et al.,2003.Mol Cell Biol.23:2859–2870))或与NIH 3T3 hph-HOX11逆转录病毒生产细胞共培养细胞(Hawley,R.G.et al.,1994.Oncogene 9:1-12)来产生。
如上所述，谱系特异性细胞也可通过将扩大的、未分化的多能干细胞如ESC或iPS细胞直接诱导至适于特异性细胞谱系分化的培养条件来获得。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了使哺乳动物家畜多能干细胞分化的方法。方法是通过下列进行的：(a)根据本发明的一些实施方式的方法培养哺乳动物家畜多能干细胞，从而获得未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，和(b)在缺乏分化抑制剂而允许哺乳动物家畜多能干细胞分化的条件下培养未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，从而分化哺乳动物家畜多能干细胞。
根据本发明的一些实施方式，步骤(a)和(b)中的培养是在悬浮培养物中进行的。
根据本发明的一些实施方式，悬浮培养物中的培养不黏附于基底。
本发明的一些实施方式的哺乳动物家畜多能干细胞可被诱导分化成各种细胞谱系和细胞类型。
根据本发明的一些实施方式，条件包括在适于将哺乳动物家畜未分化干细胞分化成肌肉细胞的培养基中培养细胞。
分化成心肌细胞——可采用各种已知方法诱导多能干细胞分化成心肌细胞，如P.W.Burridge et al.,(2014；Nat Methods.11:855–860；“Chemically definedgeneration of human cardiomycytes”)；I.Batalov et al.,(2015；Biomarker Insights2015:10(S1)；“Differentiation of Cardiomycytes from Human Pluripotent StemCells Using Monolayer Culture”)；和P.W.Burridge et al.2013(Chapter 12In:Methods in Molecular Biology 997；Uma Lakshmipathy and Mohan C.Vemuri Editors；Pluripotent Stem Cells,Methods and Protocols；“Highly Efficient DirectedDifferentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells intoCardiomyocytes”)，其每一篇均通过引用以其整体完全并入本文。例如，对于心肌细胞分化，多能干细胞可在条件培养基中培养，从而允许形成胚状体(EB)，然后可将其暴露于含血清培养基(例如，胎牛血清)中以黏附和形成收缩的心肌细胞。
分化成平滑肌细胞——可采用各种已知方法诱导多能干细胞分化成平滑肌细胞，如使用可成功分化成平滑肌细胞的多能血管原性周细胞(vasculogenic pericytes)，基本上如Dar A.等人2012(Circulation.125:87-99；“Multipotent Vasculogenic PericytesFrom Human Pluripotent Stem Cells Promote Recovery of Murine Ischemic Limb”)所述，其通过引用以其整体完全并入本文。简而言之，多能干细胞经历自发分化成EB，而EB中作为CD105+/CD90+/CD73+/CD31-多能产克隆中胚层前体的细胞可被MACS微珠分离并产生周细胞，周细胞可进一步增殖并进一步分化成平滑肌细胞。
另外地或可选地，多能干细胞可在化学上确定成分培养基中培养，这种培养基包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和糖原合成激酶3b(GSK3b)的抑制剂以及添加骨形态发生蛋白4(BMP4)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)，以在第36天之前成功地将高达约60％的细胞转化为肌原性程序(myogenic program)，如MYOG+细胞群所示，基本上如ELLIOT W.SWARTZ,etal.,2016(“A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-AssociatedHumanInduced Pluripotent Stem Cells Into Contractile SkeletalMyotubes”；STEM CELLS TRANSLATIONAL MEDICINE 2016；5:1461–1472)所述，其通过引用以其整体完全并入本文。
诱导多能干细胞分化成肌肉细胞的其它合适方法描述于Jérome Chal等人2016(“Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from humanpluripotent stem cells in vitro”；Nature protocols；VOL.11:1833-1850)；NunnapasJiwlawat et al.,2018(“Current Progress and Challenges for Skeletal MuscleDifferentiation from Human Pluripotent Stem Cells Using Transgene-FreeApproaches”；Stem Cells International,第2018卷,pp:1-18)中，其每一篇均通过引用以其整体完全并入本文。
根据本发明的一些实施方式，条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成血细胞的培养基中培养细胞。
分化成红细胞——可采用多种方案诱导多能干细胞分化成造血细胞，如红细胞。
例如，分化成造血细胞可通过使多能干细胞分化成胚状体(EB)来实现。
多能干细胞可通过自发分化成胚状体(EB)来诱导分化成造血细胞，基本上如H.Lapillonne等人2010[haematologica,95(10):1651-1659；“Red blood cellgeneration from human induced pluripotent stem cells:perspectives fortransfusion medicine”]所述，其以其整体完全并入本文。简而言之，分化成EB是在存在含有人血浆的培养基如Iscove改良的Dulbecco培养基——glutamax、在存在干细胞因子(SCF，例如，约100ng/mL)、血小板生成素(TPO，例如，约100ng/mL)、FLT3配体(例如，约100ng/mL)、重组人骨形态发生蛋白4(BMP 4；例如，约10ng/mL)、重组人血管内皮生长因子(VEGF-A165；例如，约5ng/mL)、白细胞介素-3(IL-3；例如，约5ng/mL)、白细胞介素-6(IL-6；例如，约5ng/mL)和促红细胞生成素(Epo；例如，约3U/mL)的情况下进行的。培养约20天后，所得的胚状体含有具有早期红细胞定型(early erythroid commitment)的细胞。然后将EB的细胞解离成单细胞，并在含有血浆(例如，约10％)、胰岛素(例如，约10μg/ml)和肝素(例如，约3U/mL)以及另外的因子如SCF(例如，约100ng/mL)、IL-3(例如，约5ng/mL)和Epo(例如，约3U/mL)的培养基中进一步培养。培养8天后，用补充SCF(例如，约100ng/mL)和Epo(例如，约3U/mL)的培养基更换培养基，再培养3天。从第11天到第25天，可在补充Epo(3U/mL)的培养基中培养细胞。此方案可产生能够成熟上至去核红细胞的终末(定形，definitive)红细胞，去核红细胞含有功能四聚体形式的胎儿血红蛋白。
可选地，多能干细胞可直接分化成终末成红细胞，基本上如Bin Mao等人(2016,Stem Cell Reports,Vol.7,pp 869–883)所述，其通过引用以其整体完全并入本文。简而言之，通过将培养基从hPSC维持培养基更换为诱导造血培养基，可诱导培养于二维基质或饲养细胞上的多能干细胞分化成造血谱系。例如，诱导造血培养基可以是补充胎牛血清(FBS；例如，约10％)(例如，Hyclone)、1％非必需氨基酸、抗坏血酸(例如，约50mg/mL)和VEGF(血管内皮生长因子；例如，约20ng/mL)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)，并且培养可进行约10-12天的培养期以形成造血祖细胞和祖红细胞。在第10-12天，可收获共培养物并将其转移至补充干细胞因子(SCF；例如，约100ng/mL)、白细胞介素-6(IL-6；例如，约100ng/mL)、白细胞介素-3(IL-3；例如，约5ng/mL)、胎肝(例如，约10ng/mL)、血小板生成素(TPO；例如，约10ng/mL)、促红细胞生成素(EPO；例如，约4IU/mL)和VEGF(例如，约20ng/mL)的超低附着板上6天，然后在补充干细胞因子、白细胞介素-3(IL-3)和促红细胞生成素的无血清培养基中再培养细胞7-8天。最后，为了使成红细胞成熟，将细胞在补充促红细胞生成素(EPO)的无血清RBC培养基中培养约1-2周，基本上如Giarratana,M.C.,2005(Nat.Biotechnol.23,69–74)所述，其以其整体完全并入本文。要注意的是，成熟的成红细胞(衍生自多能干细胞)可通过GPA+CD36低/+来鉴定，其表达较高水平的β-珠蛋白，同时逐渐丧失中胚层和内皮特性，并最终抑制CD36。
另外地或可选地，要注意一旦获得或分离了CD34+细胞，就可在无饲养培养条件下获得去核红细胞，基本上如Kenichi Miharada等人2006(“Efficient Enucleation ofErythroblasts Differentiated in Vitro From Hematopoietic Stem and ProgenitorCells”；Nat.Biotechnol.24(10):1255-6)所述，其通过引用以其整体完全并入本文。简而言之，在含有干细胞因子(SCF)、促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素-3(IL-3)、血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子-II(IGF-II)的培养基中培养CD34+细胞实现第一代，然后在仅补充SCF和EPO的培养基中培养实现第二代和第三代，从而获得约77％的有核红细胞。
根据本发明的一些实施方式，条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成生脂(例如，脂肪)细胞的培养基中培养细胞。
分化成生脂细胞谱系——本领域公知在有效量的生脂分化剂存在的情况下，通过直接诱导可诱导多能干细胞分化为生脂谱系。例如，可通过在人骨形态发生蛋白4(BMP4)存在的情况下培养多能干细胞来实现直接分化，基本上如Qi-Qun Tang,2004[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(26):9607–9611“Commitment of C3H10T1/2pluripotent stem cells to the adipocyte lineage”]中所述。另外地或可选地，多能干细胞可通过胚状体(EB)分化，分化成生脂细胞。例如，可将10日龄的EB铺在涂有明胶的平板上，其中培养基(例如，DMEM/F12)包括20％ KSR(敲除血清替代物)，又10天过后，将向外生长物培养在培养基中，其含有DMEM/F12和10％ KSR，补充IBMX(1-甲基-3-异丁基黄嘌呤；例如，浓度为0.5mM)、地塞米松(例如，0.25μM)、T3(例如，0.2nM)、胰岛素(例如，1μg/ml)和罗格列酮(例如，1μM)，基本上如Tala Mohsen-Kanson et al.,2014(Stem Cells,32:1459-1467)中所述，其通过引用完全并入本文。
如本文所用，短语“生脂分化剂”是指这样的物质：例如，激素和/或化学剂，当在体外培养时添加到多能干细胞时，其导致诱导细胞朝生脂细胞谱系分化，最终导致脂肪细胞的生成。
根据本发明的一些实施方式，生脂分化剂诱导培养于二维培养系统中(例如，培养在基质或饲养细胞层(一个或多个)上)的多能干细胞朝生脂谱系分化。
已知的生脂分化剂的非限制性实例包括但不限于IBMX(1-甲基-3-异丁基黄嘌呤或3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，其在本文中可互换使用)、氢化可的松、地塞米松、BMP(骨形态发生蛋白)、T3(三碘甲腺原氨酸)、吲哚美辛和脂肪酸如单不饱和ω5(例如，肉豆蔻酸)、单不饱和ω7(例如，棕榈油酸)、单不饱和ω9(例如，芥酸、反油酸、油酸)或支化脂肪酸(例如，植烷酸和降植烷酸)，基本上如F.Mehta et al 2019Sissel Beate (ed.),Myogenesis:Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,vol.1889,Springer Science+Business Media,LLC,part of Springer Nature 2019中所述。
以下是适用于诱导多能干细胞如人ESC或iPSC生脂分化的示例性有效浓度范围。生脂分化培养基可包括0.01-1mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1-10μM的氢化可的松、0.01-1mM的吲哚美辛、0.4-0.6mM的IBMX、0.2-0.3μM的地塞米松、0.15-0.3nM的T3、1-2μg/ml的胰岛素和1-2μM的罗格列酮。
根据本发明的一些实施方式，衍生自延迟胚泡的哺乳动物家畜多能干细胞可在不添加生脂分化剂的情况下自发分化成生脂谱系。
根据本发明的一些实施方式，条件包括在适于使哺乳动物家畜未分化干细胞分化成结缔组织细胞的培养基中培养细胞。
分化成软骨细胞——多能干细胞可通过胚状体的形成诱导分化成软骨细胞，例如，基本上如Sergey P.Medvedev et al.,2011(“Human Induced Pluripotent StemCells Derived from Fetal Neural Stem Cells Successfully Undergo DirectedDifferentiation into Cartilage”；STEM CELLS AND DEVELOPMENT,第20卷,第6期:1099-1112)所述，其通过引用以其整体完全并入本文。简而言之，允许多能干细胞自发分化成胚状体8-15天。对于定向软骨形成分化，可在软骨形成培养基中进一步培养胚状体21天，软骨形成培养基包括DMEM，其补充牛血清(例如，约5％)、地塞米松(例如，约10nM)、抗坏血酸(例如，约50μg/mL)、L-脯氨酸(例如，约40μg/mL)、转化生长因子B3(TGFβ3；例如，约10ng/mL)和骨形态发生蛋白-2(BMP2；例如，约10ng/mL)。为了进一步的软骨自组装，可将EB解聚(例如，使用胰蛋白酶)，并进一步转移至包被的96孔板(例如，用琼脂糖包被)，密度为105个细胞/孔，并在相同的培养基中进一步培养。
另外地或可选地，多能干细胞可采用各种方案，通过在诱导软骨形成培养基存在的情况下将细胞铺于基质上直接分化成软骨细胞，例如，如Lach et al.,2014.Journal of Tissue Engineering第5卷:1–9中所综述的，其通过引用以其整体完全并入本文。例如，多能干细胞可在培养基中于基质上培养，培养基补充各种生长因子如WNT-3a、激活素、促滤泡素抑制素、BMP4、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、生长和分化因子5(GDF5)和神经营养蛋白4(NT4)，基本上如Oldershaw RA,et al.2010(“Directeddifferentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes”；NatBiotechnol 28(11):1187–1194)中所述，其通过引用以其整体完全并入本文。
另外地或可选地，为了分化成软骨细胞样细胞，多能干细胞可在仅包括六种生长因子即WNT-3a、激活素、促滤泡素抑制素、BMP4、成纤维细胞生长因子2(FGF2)和生长和分化因子5(GDF5)的培养基中培养，基本上如Yang S-L,et al.2012(“Compound screeningplatform using human induced pluripotent stem cells to identify smallmolecules that promote chondrogenesis”.Protein Cell,3(12):934–942)中所述，其通过引用以其整体完全并入本文。这些方案可导致分化成软骨细胞样细胞，与对照细胞系相比，COL2A1(II型胶原，α1)和SRY(性别决定区Y)-box 9(SOX9)表达高且多能标记表达减少。
根据本发明的一些实施方式，可使多能干细胞分化生成间充质基质细胞。
CD73-阳性和SSEA-4-阴性间充质基质细胞可通过机械增加多能干细胞培养物中形成的成纤维细胞样分化细胞的分数(fraction)而由多能干细胞生成，基本上如TrivediP and Hematti P.Exp Hematol.2008,36(3):350-9所述。简而言之，为了诱导多能干细胞分化，培养基更换之间的间隔增加到3-5天，并且ESC集落外围的细胞变成纺锤形的成纤维细胞样细胞。在这些条件下9-10天后，当培养物中约40-50％的细胞获得成纤维细胞外观时，物理去除多能干细胞集落的未分化部分并将剩余的分化细胞在相同条件下传代至新培养板。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞可分化生成多巴胺能(DA)神经元。
为了诱导多能干细胞分化成多巴胺能(DA)神经元，可将细胞与小鼠基质细胞系PA6或MS5共培养，也可与基质细胞衍生因子1(SDF-1/CXCL12)、多效营养因子(PTN)、胰岛素样生长因子2(IGF2)和肝配蛋白B1(EFNB1)的组合一起培养，基本上如Vazin T,et al.,PLoS One.2009Aug 12；4(8):e6606；和Elkabetz Y.,et al.,Genes Dev.2008年1月15日；22:152–165所述。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞可分化生成中脑多巴胺(mesDA)神经元。
为了生成中脑多巴胺(mesDA)神经元，可对多能干细胞进行遗传修饰以表达转录因子Lmx1a(例如，使用具有PGK启动子和Lmx1a的慢病毒载体)，基本上如Friling S.,etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.2009,106:7613–7618所述。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞可分化生成肺上皮(II型肺细胞)。
为了由多能干细胞生成肺上皮(II型肺细胞)，可在市售细胞培养基(小气道生长培养基；Cambrex,College Park,MD)存在的情况下，或可选地，在从肺细胞细胞系(例如，A549人肺腺癌细胞系)收集的条件培养基存在的情况下培养多能干细胞，如Rippon HJ.,etal.,Proc Am Thorac Soc.2008；5:717–722所述。
根据本发明的一些实施方式，多能干细胞可分化生成神经细胞。
为了诱导多能干细胞分化成神经细胞，可在补充TGF-b抑制剂(SB431542,Tocris；例如,10nM)和头发生素(Noggin)(R&D；例如,500ng/ml)的血清替代物培养基存在的情况下培养多能干细胞约5天，之后在500ng/mL头发生素存在的情况下用增加量(例如，25％、50％、75％，每两天更换一次)的N2培养基(Li XJ.,et al.,Nat Biotechnol.2005,23:215-21)培养细胞，基本上如Chambers SM.,et al.,Nat Biotechnol.2009,27:275–280所述。
应当注意，由本发明的一些实施方式的哺乳动物家畜多能干细胞分化的细胞可并入食品中。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了制备食品的方法，其包括将由本发明的一些实施方式的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞与食品组合，从而制备食品。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了食品，其包括由本发明的一些实施方式的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞。
根据本发明的一些实施方式，食品包括可培养肉或与其它物质组合以产生培养肉的培养细胞。
如本文所用，术语“培养肉”是指经加工赋予肉的感官感觉和质地的体外培养的动物细胞。
培养肉制品可包括多种细胞，包括但不限于脂肪细胞、肌肉细胞、血细胞、软骨细胞、骨细胞、结缔组织细胞、成纤维细胞和/或心肌细胞。
根据本发明的一些实施方式，体外培养的动物细胞是哺乳动物家畜细胞。
根据本发明的一些实施方式，体外培养的动物细胞是牛细胞(但可包括其它细胞，例如，鱼、猪、鸟等)。
根据本发明的一些实施方式，体外培养的动物细胞是通过本发明的一些实施方式的哺乳动物家畜多能干细胞的自发分化获得的脂肪细胞。
根据本发明的一些实施方式，培养肉基本上不含任何有害的微生物或寄生虫污染。
应当注意的是，脂肪含量高的肉通常更美味，但高脂肪含量可带来更高的不良健康后果风险，如心脏病。
根据本发明的一些实施方式，培养肉包括可被控制以产生具有最佳风味和健康效果的肉制品的肌肉与脂肪细胞之比。例如，这种比例可通过将期望的细胞初始接种在培养物中或通过控制哺乳动物家畜多能干细胞分化成肌肉、软骨、血液或脂肪细胞来控制。
分化可发生在支持层上，以支持培养肉的结构和/或质地。
根据本发明的一些实施方式，无菌技术可用于培养产生肉制品的细胞，肉制品基本上不含有害微生物如细菌、真菌、病毒、朊病毒、原生动物或上述的任何组合。有害微生物可包括致病型微生物如沙门氏菌(salmonella)、弯曲杆菌(campylobacter)、大肠杆菌0156:H7(E.coli 0156:H7)等。无菌技术也可在肉制品离开生物生产线时用于将其包装。这种质量保证可通过本领域已知的微生物或化学品标准测定来监测。“基本上不含”意为微生物或寄生虫的浓度在临床上显著的污染水平以下，即在摄入将导致疾病或不利健康状况的水平以下。
根据本发明的一些实施方式，可添加来自完整动物的肉制品中正常缺乏的其它营养物如维生素来增加肉的营养价值。这可通过向生长培养基中直接添加营养物或通过基因工程技术来实现。例如，负责生物合成特定维生素(如维生素D、A，或不同的维生素B复合物)的酶的一个或多个基因可转染到培养的肌肉细胞中以产生特定维生素。
根据本发明的一些实施方式，衍生自体外培养的细胞的肉制品可包括肉制品的不同的衍生物。这些衍生物可通过例如，将体外生长的组织磨碎或切碎，并与适当的调味料混合制成肉丸、鱼丸、汉堡肉饼等来制备。衍生物也可由切割和调味成例如牛肉干、火腿、博洛尼亚红肠(bologna)、萨拉米香肠(salami)等的多层组织来制备。因此，本发明的肉制品可用于生成源自动物肉的任何种类的食品。
畸胎瘤
本发明的一些实施方式的多能干细胞的多能能力也可通过将细胞注射到SCID小鼠中来证实[Evans MJ和Kaufman M(1983).Pluripotential cells grown directly fromnormal mouse embryos.Cancer Surv.2:185-208]，SCID小鼠在注射后就会形成畸胎瘤。使用4％多聚甲醛固定畸胎瘤，并对三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)进行组织学检查。
除了监测分化状态外，还经常监测干细胞的核型，以验证细胞学真核性，其中所有染色体都存在并且在培养期间没有可检测到的改变。可使用标准Giemsa染色对培养的干细胞进行核型分析(karyotyped)并与相应物种的已公布核型进行比较。
如所提到的，本发明培养基中使用的任何蛋白质因子(例如，bFGF、IL6RIL6嵌合体、WNT3a、LIF)都可重组表达或生化合成。此外，还可使用本领域公知的方法从生物样品(例如，从人血清、细胞培养物)中纯化天然存在的蛋白质因子如bFGF、WNT3a、LIF。应当注意，对于无异种培养基的制备，优选重组表达蛋白质因子。
本发明的蛋白质因子的生物化学合成可使用标准固相技术进行。这些方法包括纯固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法和经典溶液合成法。
本发明的蛋白质因子的重组表达可使用重组技术生成，如Bitter et al.,(1987)Methods in Enzymol.153:516-544,Studier et al.(1990)Methods in Enzymol.185:60-89,Brisson et al.(1984)Nature 310:511-514,Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-1680,Brogli et al.,(1984)Science 224:838-843,Gurley et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463所述。具体地，IL6RIL6嵌合体可如Revel M.等人和Chebath J等人1997的PCT公开WO 99/02552(其通过引用完整并入本文)中所述来生成。
如所提到的，本发明的一些实施方式的方法采用在饲养细胞层上或在无饲养细胞培养系统上培养哺乳动物(例如，家畜)多能干细胞。
以下是饲养细胞层的示例性、非限制性描述。
小鼠饲养层——培养多能干细胞最常用的方法是以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层，补充含血清或白血病抑制因子(LIF)的组织培养基，支持多能干细胞的增殖和多能性[Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,Waknitz MA,Swiergiel JJ,MarshallVS,JonesJM.(1998).Embryonic stem cell lines derived from humanblastocysts.Science 282:1145-7；Reubinoff BE,Pera MF,Fong C,Trounson A,BongsoA.(2000).Embryonic stem cell lines from human blastocysts:somaticdifferentiation in vitro.Nat.Biotechnol.18:399-404]。MEF细胞衍生自在补充胎牛血清的培养基中的第12-13天小鼠胚胎。在这些条件下，小鼠ES细胞在培养时可维持作为多能干细胞，从而保留其表型和功能特征。应当注意，饲养细胞的使用大大增加了生产成本。此外，饲养细胞被代谢性灭活以防止它们长出干细胞之外，因此多能干细胞培养物每次分开都需要新鲜的饲养细胞。
多能干细胞也可在无血清条件下，使用补充碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清替代物在MEF上培养[Amit M,Carpenter MK,Inokuma MS,Chiu CP,Harris CP,WaknitzMA,Itskovitz-Eldor J,Thomson JA.(2000).Clonally derived human embryonic stemcell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolongedperiods of culture.Dev.Biol.227:271-8]。在这些条件下，ES细胞的克隆效率是胎牛血清条件下的4倍之高。此外，在血清替代物下培养6个月后，ES细胞仍维持其多能性——通过其形成含有所有三个胚胎胚层的畸胎瘤的能力所示。尽管此系统采用了成分更加确定的培养条件，但培养物中存在小鼠细胞可能会使多能干细胞培养物暴露于小鼠病原体，从而限制其在基于细胞的疗法中的应用。
以人胚胎成纤维细胞或成体输卵管上皮细胞为饲养层——利用人胚胎成纤维细胞或成体输卵管上皮细胞可使胚胎干细胞生长和维持。当在这些人饲养细胞上生长时，胚胎干细胞表现出正常核型，呈现碱性磷酸酶活性，表达Oct-4和其它胚胎细胞表面标记(包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和GCTM-2)，在体内形成畸胎瘤，并保留所有关键的形态特征[Richards M,Fong CY,Chan WK,Wong PC,Bongso A.(2002).Human feeders supportprolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonicstem cells.Nat.Biotechnol.20:933-6]。
包皮饲养层——可在人包皮饲养层上培养胚胎干细胞，如美国专利申请号10/368,045所公开的。包皮衍生的饲养细胞层由适于培养胚胎干细胞的完全无动物环境组成。此外，包皮细胞自其衍生以来可在培养时维持长达42代，从而为胚胎干细胞提供相对恒定的环境。在这些条件下，发现胚胎干细胞与用替代方案(例如，MEF)生长的细胞在功能上没什么区别。分化后，胚胎干细胞在体外表达与所有三个胚胎胚层相关的基因，并在体内形成畸胎瘤，由来自所有三个胚层的组织组成。此外，与人输卵管上皮细胞或人胚胎成纤维细胞不同，在包皮饲养层上培养的人胚胎干细胞在培养时维持多能和未分化状态至少87代。然而，尽管包皮细胞可在培养时维持很长时间(即42代)，但由于不同批次之间的差异，包皮培养系统成分并不十分确定(not well-defined)。此外，基于人饲养层的培养系统仍需要饲养层和hES细胞两者同时生长。因此，开发了无饲养培养系统。
如所述，本发明的一些实施方式的多能干细胞可被培养并且在无饲养培养系统上培养的同时维持未分化状态延长的时间段，例如，至少5代或更多代(例如，超过10、15、20、25、30、35、40代)。
在培养基存在的情况下，多能干细胞可在细胞外基质等固体表面上生长。与需要饲养细胞和干细胞同时生长并且可能产生混合细胞群的基于饲养的培养不同，在无饲养系统上生长的多能干细胞易与表面分离。用于干细胞生长的培养基包括有效抑制分化并促进其生长的因子(例如，本文所述的分化抑制因子(一种或多种))。
常用的无饲养培养系统利用基于动物的基质(例如，MatrigelRTM)，补充小鼠或牛血清，或补充MEF条件培养基[Xu C,et al.(2001).Feeder-free growth ofundifferentiated human embryonic stem cells.Nat Biotechnol.19:971-4]，其存在动物病原体交叉转移到其它物种(例如，人)多能干细胞的风险。
细胞外基质可由衍生自基膜的组分和/或形成黏附分子受体-配体偶联的一部分的细胞外基质组分组成。(Becton Dickinson,USA)是适于与本发明联用的市售基质的一个实例。/>是一种来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，在室温下胶凝形成重构的基底膜；/>也可用作生长因子减少制剂。适于与本发明联用的其它细胞外基质组分和组分混合物包括包皮基质、层粘连蛋白基质、纤连蛋白基质、蛋白聚糖基质、巢蛋白基质、硫酸乙酰肝素基质、胶原基质等——单独或以其各种组合的形式。
根据本发明的一些实施方式，无饲养基质选自MatrigelTM基质、纤连蛋白基质、层粘连蛋白基质、胶原基质、弹性蛋白基质和玻连蛋白基质。
根据本发明的一些实施方式，基质是无异种成分的。
在需要完全无异种培养条件的情况下，基质优选衍生自同一胚胎来源，例如，哺乳动物家畜，例如，牛，也可使用重组技术合成。这样的基质包括例如，重组纤连蛋白、重组层粘连蛋白、合成纤连蛋白基质、玻连蛋白基质和/或胶原基质。合成纤连蛋白基质可获自Sigma,St.Louis,MO,USA。
本发明的一些实施方式的多能干细胞或由其分化的细胞(例如，脂肪细胞、肌肉细胞、血细胞、软骨细胞、骨细胞、结缔组织细胞、成纤维细胞和/或心肌细胞)可使用表征这些细胞的各种表达标记来鉴定。表达标记可在RNA或蛋白质水平上进行鉴定。
检测RNA表达水平的方法包括但不限于RNA印迹分析、RT-PCR分析、RNA原位杂交染色、原位RT-PCR染色、DNA微阵列/DNA芯片、寡核苷酸微阵列。
检测蛋白质表达和/或活性的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选脂肪细胞、肌肉细胞、血细胞、软骨细胞、骨细胞、结缔组织细胞、成纤维细胞和/或心肌细胞(FACS)、免疫组织化学分析和原位活性测定。
如本文所用，术语“约”指±10％。
根据本发明的一些实施方式，术语“约”指±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.5％、±0.1％或±0.01％。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”及其词形变化形式(conjugates)意为“包括但不限于”。
术语“由……组成”意为“包括且限于”。
术语“主要由……组成”意为组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在该另外的成分、步骤和/或部分实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征时才包括。
如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/”包括复数提及，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请全文中，本发明的各种实施方式都可以范围格式呈现。应理解，以范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该理解成对本发明范围的刻板限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1到6的范围的描述应当被认为已经具体公开了子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。无论范围有多广，这都适用。
每当本文中指示数值范围时，其意在包括所指示范围内的任意引用的数字(小数或整数)。短语“范围在第一指示数字和第二指示数字之间/范围介于第一指示数字和第二指示数字”以及“范围从第一指示数字到第二指示数字/范围介于第一指示数字到第二指示数字”在本文中可互换使用，并且意为包括第一和第二指示数字以及其之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或容易从已知的方式、手段、技术和程序发展的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转状况的进展、基本上改善状况的临床或美学症状或基本上预防状况的临床或美学症状的出现。
当提及特定序列表时，这种提及应理解为还涵盖基本上对应于其互补序列的序列，包括由例如，测序错误、克隆错误或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变引起的微小序列变异，前提是这种变异的频率低于50个核苷酸中有1个，可选地，低于100个核苷酸中有1个，可选地，低于200个核苷酸中有1个，可选地，低于500个核苷酸中有1个，可选地，低于1000个核苷酸中有1个，可选地，低于5,000个核苷酸中有1个，可选地，低于10,000个核苷酸中有1个。
将理解的是，本申请中公开的任何序列识别号(Sequence IdentificationNumber,SEQ ID NO)都可指代DNA序列或RNA序列，这取决于提及该SEQ ID NO的上下文，即使SEQ ID NO仅以DNA序列格式或RNA序列格式表达。例如，SEQ ID NO:15以DNA序列格式表达(例如，叙述胸腺嘧啶为T)，但它可指代对应于WNT3A核酸序列的DNA序列，或RNA分子核酸序列的RNA序列。类似地，尽管某些序列以RNA序列格式表达(例如，叙述尿嘧啶为U)，但取决于所描述的分子的实际类型，它可指代包括dsRNA在内的RNA分子的序列，或对应于所示RNA序列的DNA分子的序列。无论如何，具有所公开序列的DNA和RNA分子以及任何替代物都是可以想到的。
将理解的是，为清楚起见，在单独实施方式的环境下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方式中以组合方式提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的环境下描述的本发明的各种特征也可单独地或以任意适当的子组合的方式提供，或者如在本发明的任意其它所描述的实施方式中那样适当地提供。在各种实施方式的环境下描述的某些特征不被认为是那些实施方式的基本特征，除非该实施方式在没有这些要素的情况下无法操作。
上文和下文权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面都在以下实施例中得到了实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，这些实施例与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方式。
总体上，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室程序包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。文献中对这样的技术进行了详尽的说明。参见，例如，“MolecularCloning:A laboratory Manual”Sambrook et al.,(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”第I-III卷Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide至Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren etal.(eds)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,第1-4卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法学；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷Cellis,J.E.,ed.(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Selected Methodsin Cellular Immunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定泛泛地描述于专利和科技文献中，参见，例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.,eds.(1985)；"Transcription and Translation"Hames,B.D.和Higgins S.J.,Eds.(1984)；"Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"Immobilized Cells andEnzymes"IRL Press,(1986)；"A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)和"Methods in Enzymology"第1-317卷,Academic Press；"PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications",Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshaket al.,"Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual"CSHL Press(1996)；所有这些文献都通过引用并入本文，如同在本文中完整阐述一样。本文件还提供了其它一般参考文献。其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的。其中包含的所有信息都通过引用并入本文。
总体材料与实验方法
细胞系：
使用衍生自延迟牛胚泡的多能干细胞(PSC)(BVN1、BVN2、BVN5和BVN6)、牛ESC(BVN3和BVN4)以及来自牛胎组织和来自子宫内膜上皮细胞的诱导PSC(iPSC)(分别为iBVN1.4、iBVN1.14和iBVN1.15)。
由延迟胚细胞衍生牛PSC系：用台罗德酸溶液(Sigma Aldrich,St Louis,MO,USA)消化透明带后，铺设暴露的胚泡。有两种铺设可能：(i)铺设在饲养层如有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或有丝分裂灭活的包皮成纤维细胞上，(ii)铺设在合适的基质(MatrigelTM基质、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其它商业细胞外基质)上。使用27g针——一种抽吸式巴斯德移液管(pulled Pasteur Pipette)——通过用一滴合适的基质覆盖胚胎，将胚胎附着于表面，或将胚胎放置过夜直至胚胎自发附着于表面。附着的胚泡在受精后于MEF上培养7-21天成为完整胚胎，直至形成大胞囊。如果由于MEF或基质质量需要，则使用27规格注射器针将胚胎整体转移到新的MEF覆盖的板上，留下少量周围的成纤维细胞。在胚胎发育胞囊后，从中分离出盘状结构并将其分别置于新鲜的MEF或基质覆盖的板上。机械传代具有干细胞形态的细胞(具有大细胞核的小细胞)。传代几次(例如，约4-6代)后，当达到均质培养时，使用1mg/ml IV型胶原酶(Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)每5-10天常规地使细胞传代。
牛iPSC系的衍生：
牛iPSC细胞衍生自牛胎细胞或牛子宫内膜细胞。使用“培养基X”(下文描述，以DMEM\F12作为基础培养基)培养牛胎细胞。使用“培养基S”(下文描述)培养牛子宫内膜细胞。重编程前，使用“培养基X”(下文描述，以DMEM\F12作为基础培养基)铺设牛子宫内膜细胞。在重编程前将第7代的细胞培养4-7天。
使用包括Oct3/4、Sox2、cMyc和Klf4基因的重编程载体进行重编程。合适的载体可在市售试剂盒如Epi5 episomal iPSC试剂盒(Thrmo-Fisher)、Simplicon RNA重编程试剂盒(Merck-Millipore)、Stemcca试剂盒(Merck-Millipore)、Stemgent stemRNA 3ed重编程试剂盒(Reprocelll)或CytoTuneTM试剂盒(Life Technology)中找到，每种试剂盒均可根据制造商的说明使用。约10天后，在双目显微镜(binocular)下查看细胞培养物的同时，用移液管尖拾取多能干细胞集落来分离集落。在存在如下所述的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)的情况下，使分离的集落培养于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。
例如，iBVN 1.14p7+23是来自牛的诱导PSC系，其衍生自第7代胚胎间充质牛细胞(重编程前)，并再培养23代成诱导PSC。
培养基
培养基X：此培养基由下列组成：80％是基础培养基——DMEM\F12(BiologicalIndustries,Bet Ha’emek,以色列)或KO-DMEM(Gibco Life Technology)，并补充20％的确定成分胎牛血清(确定成分FBS)(HyClone,Utah,USA)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和1％非必需氨基酸储液(均自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA产品)。
培养基S：此培养基由下列组成：90％是DMEM(Biological Industries,Bet Ha’emek；以色列)，并补充10％的确定成分FBS(HyClone,Utah,USA)和1mM L-谷氨酰胺(均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA产品)。
下列培养基中使用的基础培养基包括低浓度的KO-血清替代物(如附图或下文所示)或低浓度的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、脂肪酸、抗坏血酸和牛血清白蛋白，如下所述。发现这些基础培养基连同添加的因子能够支持在饲养细胞层上培养的家畜多能干细胞的未分化生长，或在不存在饲养细胞支持的情况下，诸如在3维(3-D)悬浮培养中支持其未分化生长至少5代而不发生基底黏附。
“基础培养基-1”：DMEM/F12(或KO-DMEM)基础培养基，浓度为80-99.9％v/v，补充如下文和附图所示的KO-血清替代物(Gibco Life Technology)(例如，0.1％-20％体积/体积KoSR)、1mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸储液和生长因子，如下所述。注意，基础培养基的浓度取决于所用的KoSR浓度，所得达到100％体积。例如，当使用5％KoSR时，则以95％v/v的浓度提供基础培养基DMEM/F12(或KO-DMEM)。当使用1％ KoSR时，则以99％v/v的浓度提供基础培养基DMEM/F12(或KO-DMEM)。
已确认
嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)：基础培养基-1，补充100pg/ml IL6RIL6嵌合体(R&D Systems)和50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(除嵌合体外的所有产品均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。
嵌合体培养基(含10ng/ml bFGF)：基础培养基-1，补充100pg\ml IL6RIL6嵌合体(R&D Systems)和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(除嵌合体以外的所有产品均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。
基于GP130激动剂的培养基：基础培养基-1，补充IL6(浓度为100ng/ml)、IL11(浓度为1ng/ml)、LIF(浓度为3000U/ml)或CNTF(浓度为1ng/ml)，以及浓度在10-50ng/ml之间的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
LIF培养基，基础培养基-1，补充3000U/ml(单位/毫升)白血病抑制因子(LIF)(PeproTech)和50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(所有产品均来自GibcoInvitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。
LIF培养基-10、基础培养基-1，补充3000U/ml LIF(PeproTech)和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(所有产品均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。
Wnt3a培养基，基础培养基-1，补充10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(所有产品均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。应注意，bFGF的使用浓度范围可为4-100ng/ml)。
蛋白酶抑制剂和IL6RIL6嵌合体培养基：基础培养基-1，补充蛋白酶抑制剂如浓度为100μM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，或浓度为50μM的甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)，以及浓度为100pg/ml的IL6RIL6嵌合体。
蛋白酶抑制剂和GP130激动剂培养基：基础培养基-1，补充蛋白酶抑制剂如浓度为100μM的苯甲基磺酰氟(PMSF)或浓度为50μM的甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK))和GP130激动剂。GP130激动剂可以是白细胞介素6(IL6)(例如，浓度为100ng/ml)、白细胞介素11(“IL11”或“IL-11”，其在本文中可互换使用)(例如，浓度为1ng/ml)、LIF(例如，浓度为3000U/ml)或睫状神经营养因子(CNTF)(例如，浓度为1ng/ml)。
Wnt3a培养基：基础培养基-1，补充10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(所有产品均来自Gibco Invitrogen公司产品,San Diego,CA,USA)。应注意，bFGF的使用浓度范围可为4-100ng/ml)。
Wnt3a+嵌合体培养基：基础培养基-1，补充10ng/ml Wnt3a(R&D Systems)和100pg/ml IL6RIL6嵌合体。
yF10：基础培养基-1，补充10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
yF100：基础培养基-1，补充100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
BFGF(10)和TGFβ1：基础培养基-1，补充转化生长因子β-1(TGFβ1)0.12ng/ml和10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)。
BFGF(100)和TGFβ1：基础培养基-1，补充TGFβ1 0.12ng/ml和100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)。
CNTF和IL11培养基：DMEM/F12 91.8％v/v，KoSR 5％v/v，NEAA非必需氨基酸)1％(v/v)，CNTF 1ng/ml，IL-11 1ng/ml，β巯基乙醇0.1mM，L-谷氨酰胺1mM，bFGF 20ng/ml，青霉素50U/ml，链霉素0.05mg/ml。
PMSF培养基：DMEM/F12 92.8％v/v，KoSR 5％v/v，NEAA(非必需氨基酸)1％(v/v)，β巯基乙醇0.1mM，L-谷氨酰胺1mM，浓度范围为70-130μM的PMSF(确切浓度在各个实验或附图中有描述)。
注意，PMSF培养基不包括bFGF。
确定成分“IT1”培养基：DMEM/F12(94.7％)，胰岛素0.43μM(Sigma目录号I9287)，转铁蛋白0.0172μM(Holo Transferrin Sigma T0665)，脂质混合物1％体积/体积(Gibco,目录号11905-031)，牛血清白蛋白0.5％v/v(Sigma目录号A9418)，bFGF(50ng/ml)，IL6RIL6嵌合体100pg/ml(R&D Cat:8954-SR-025)，抗坏血酸500μg/ml(RND-SOL-041)，L-谷氨酰胺4mM，青霉素50U/ml，链霉素0.05mg/ml。
注意，“IT1”培养基不包括任何添加的NEAA。
确定成分“IT2”培养基：DMEM/F12(94.7％)，胰岛素1.57μM(Sigma目录号I9287)，转铁蛋白0.055μM(Holo Transferrin Sigma T0665)，脂质混合物1％体积/体积(Gibco,目录号11905-031)，牛血清白蛋白0.5％v/v(Sigma目录号A9418)，bFGF(50ng/ml)，IL6RIL6嵌合体100pg/ml(R&D Cat:8954-SR-025)，抗坏血酸500μg/ml(RND-SOL-041)，L-谷氨酰胺4mM，青霉素50U/ml，链霉素0.05mg/ml。
注意，“IT2”培养基不含任何添加的NEAA。
EB形成：
为了形成胚状体(EB)，使用四孔板中四个汇合孔中的两个。在培养基X存在的情况下培养细胞，并放置14天不分开，达到汇合培养，并且EB自发形成。有些仍然附着于培养物表面，而有些则是漂浮的EB(图3A-3D)。使用培养基X培养EB。
细胞培养：
贴壁培养：除每周1天外，每天更换培养基。每5-10天用4型胶原酶分开细胞。使用由10％二甲基亚砜(DMSO)(Sigma,St Louis,MO,USA)、10％ FBS(Hyclone,Utah,USA)和80％ DMEM\F12组成的冷冻溶液在液氮中冷冻细胞。
悬浮培养：
1.适应悬浮后，使用TrypLEx(Gibco-Invitrogen Corporation,格兰德岛NY,USA)、胰蛋白酶EDTA(BI)、accutase或IV型胶原酶(Worthington)等酶分开细胞，并将其转移至Petri培养皿中。可选地，可通过使用200-1000μL Gilson尖端上下抽吸细胞团，使细胞团机械解离来分开细胞。
2.将细胞培养3-5代，每5-10天分开一次(如上1所述)。
3.可将细胞转移到旋转瓶(spinner flasks)中(75rpm(每分钟转数))。无需分开。
4.可将细胞转移到生物反应器中。
免疫染色：
在室温下将细胞固定并暴露于一抗。然后用二抗孵育细胞。下表1总结了反应条件和抗体。
表1：免疫染色条件
表1
朝脂肪细胞自发分化：在MEF饲养层上用培养基X或用15％ko-SR和IL6RIL6嵌合体培养基(包括50 ng/ml bFGF)培养的细胞自发分化成脂肪细胞——作为背景分化，或在超过14天不进行传代时自发分化成脂肪细胞。
油红染色：
在室温(RT)下用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞20分钟(min)。用PBS洗涤PFA后，将细胞与油红O溶液(Sigma)在RT下孵育10 min。用水洗涤培养物，并通过相差显微镜可视化。
实施例1
低浓度血清替代物能够支持哺乳动物家畜多能干细胞的未分化生长
本发明人测试了含低浓度血清替代物(例如，1-10％之间的KoSR)的各种培养基配方(formulations)支持哺乳动物家畜多能干细胞的未分化和多能状态的能力。
实验结果：
测试了几种基于不同生长因子组合和低浓度血清替代物的培养基配方在各种培养系统下，诸如在饲养细胞层(例如，MEF)，或无饲养层培养系统上——诸如在悬浮和或合成基质(无饲养贴壁培养)中支持哺乳动物家畜多能干细胞(iPSC、扩展胚泡ESC或ESC)生长的能力。发现测试培养基配方适于支持未分化PSC增殖和PSC特性的维持。
在饲养细胞层上培养
当在补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC维持未分化状态——如图1A-1B所示，在MEF上用补充5％ KoSR的YF10培养5代的iBVN 1.14p7+23细胞维持未分化多能干细胞的形态。类似地，在MEF上用补充5％ KoSR的Wnt3a+IL6RIL6嵌合体(含50ng/ml bFGF)的培养基培养6代的iBVN1.14P7+29细胞维持未分化多能干细胞的形态(图1E)。
当在补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛ESC维持未分化状态——在MEF上用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养的牛ESC(BVN3 P5和BVN4 P8)维持未分化多能干细胞的形态(图1C-1D)。
当在补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC维持未分化和多能状态——在MEF上用补充5％ KoSR的YF10培养基培养17代的iBVN 1.4p7+30显示出多能干细胞标记TRA-1-81的阳性染色(图4A-4B，在用补充5％KoSR的YF10培养基培养11代后采集图像)。
类似地，在MEF上用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养13代的iBVN 1.4p7+30显示出多能干细胞标记TRA-1-60和TRA-1-81的阳性染色(图5A-5D，在用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养11代后采集图像)。
此外，在MEF上用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养13代的iBVN 1.14p7+29细胞显示出TRA-1-60和TRA-1-81多能干细胞标记染色呈阳性(图6A-6D，在用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养10代后采集图像)。
当在补充5-10％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC维持未分化和多能状态——在MEF上用补充10％ KoSR的YF10培养基培养8代的iBVN 1.4p7+27细胞显示出多能干细胞标记TRA-1-60和TRA-1-81的阳性染色(图2A-2D)。
类似地，在MEF上用补充5％ KoSR培养基的YF10培养基培养11代的iBVN 1.4p7+30细胞显示出多能干细胞标记Nanog和TRA-1-60的阳性染色(图3A-3D)。
当在补充1-2.5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC维持未分化状态——在MEF上用补充2.5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养13代的iBVN1.4 p7+43细胞显示出未分化状态的形态(图13A，在用补充2.5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养7代后采集图像)。类似地，当在MEF上用补充1％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养相同的细胞13代时，细胞集落仍处于未分化状态(图13B，在用补充1％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养7代后采集图像)。
悬浮培养
当在补充10％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中以悬浮培养方式培养至少5代时，牛iPSC维持未分化状态——用补充10％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)悬浮培养1个月的iBVN1.4 p7+27细胞维持未分化牛iPSC细胞的形态(图7)。
当在补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中悬浮培养至少5代时，牛iPSC维持未分化状态——用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)悬浮培养1个月，然后重铺在MEF上的iBVN1.4 p7+17细胞维持未分化牛iPSC细胞的形态(图8)。
当在补充5％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中悬浮培养至少5代时，牛iPSC维持未分化和多能状态——用补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/mlbFGF)悬浮培养1个月的iBVN 1.14p7+30细胞显示出多能干细胞标记Nanog和TRA-1-60(图9A-9D)以及TRA-1-81(图10A-10B)的阳性染色。
实施例2
浓度增加的血清替代物对哺乳动物家畜多能干细胞背景分化的影响
本发明人测试了含浓度增加的血清替代物(例如，在10-15％之间的KoSR)的各种培养基配方支持哺乳动物家畜多能干细胞的未分化和多能状态的能力。
实验结果：
在饲养细胞层上培养
当在补充10％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC显示出一定程度的脂肪细胞背景分化——在补充10％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)存在的情况下于MEF上培养的iBVN1.4 p7+42细胞显示出一定程度的背景分化。如图12A-12D所示，集落中的一些发生分化——主要分化成脂肪细胞(图12A和12C)，以及可注意到在其它集落区域中存在脂肪细胞(用白色箭头标出)(图12B和12D)。油红染色证实分化成脂肪细胞(图12C和12D)。
当在补充15％ KoSR(KNOCKOUTTM血清替代物)的培养基中于饲养细胞上培养至少5代时，牛iPSC表现出一定程度的脂肪细胞背景分化——在MEF上用补充15％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养3代的iBVN1.4 p7+42细胞显示出一定程度的分化。如图11A-11D所示，集落中的一些发生分化——主要分化成脂肪细胞(图11A和11C)，以及可注意到在其它集落区域中存在脂肪细胞(用白色箭头标出)(图11B和11D)。油红染色证实分化成脂肪细胞(图11C和11D)。
实施例3
在补充5％血清替代物的培养基中牛胚胎干细胞的衍生
实验结果：
图14A-14C描绘了在补充5％ KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)中BVN3细胞系的衍生。ESC系BVN3是采用全胚胎法衍生的。结果表明，牛胚胎干细胞可在补充低浓度血清替代物(如5％ KoSR)的培养基中衍生。
实施例4
在各种低浓度血清替代物中培养的牛多能干细胞的集落直径的比较数据
实验结果：
本发明人通过在分开集落(传代)后三天时测量(第42代和第43代iBVN1.4细胞系的)牛iPSC集落的直径，比较了血清替代物浓度对集落细胞生长的影响。在MEF上用补充不同浓度KoSR的IL6RIL6嵌合体培养基(含50ng/ml bFGF)培养iBVN1.4细胞。如图15所示，与在补充5％ KoSR或更高浓度即7.5％、10％或15％ KoSR的相同培养基中生长的集落的直径相比，在1％或2.5％ KoSR浓度下的集落平均直径更小。当在补充5-15％KoSR的培养基中生长时，未发现集落直径之间有显著差异。
分析和总结
牛多能干细胞在测试培养基配方中培养至少27代并且维持其PSC特征，包括未分化的增殖、细胞和集落形态以及多能性。
此外，在测试培养基中培养的牛PSC强烈表达特异性多能性标记如Nanog、OCT4(数据未显示)、TRA-1-60和TRA-1-81。
如图15所示，以低至1-2.5％ KoSR培养的PSC集落直径小于用5％ KoSR或更高浓度即7.5％、10％或15％ KoSR培养的细胞的集落直径，表明在1％或2.5％ KoSR存在的情况下，集落在第1-7代期间的生长速率稍慢。另一方面，应注意，在1-2.5％ KoSR浓度下，PPSC没有显著的背景分化(在上面实施例1以及图13A-13B中描述，少于3％的背景分化)，而在5％ KoSR浓度下，有约5％的脂肪细胞背景分化。相比之下，在10％ KoSR浓度下，有约10％的脂肪细胞背景分化(图12A-12D)；以及在15％ KoSR浓度下，有约15-20％的脂肪细胞背景分化(图11A-11D)，因此将KoSR的浓度从5％增加到10％或15％导致背景分化增加。
在体外，通过胚状体(EB)的形成来检查使用测试的新配方的同时进行长期培养后细胞的发育潜力(数据未显示)。当悬浮培养时，例如，传代10次后，在测试的培养基中，PSC形成含有三个胚胎胚层代表性细胞的EB。此外，油红染色还显示出细胞分化成脂肪细胞的能力。
因此，发现新的测试的培养基配方适于PSC的长期培养，同时维持PSC特性。
实施例5
含低浓度血清替代物并补充CNTF和IL11的培养基维持家畜多能干细胞处于未分化状态
使用包括5％ KoSR、1ng/ml CNTF和1ng/ml IL11的CNTF和IL11培养基在二维培养物上(在MEF饲养细胞上)或在三维悬浮培养物上培养牛和猪多能干细胞(iPSC)。
实验结果
二维培养系统
如图16A-16B和23A-23D所示，在MEF上用CNTF和IL11培养基培养的牛iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记TRA1-60、Nanog、OCT4和TRA1-81的阳性表达。
类似地，如图22和28所示，在MEF上用CNTF和IL11培养基培养的猪iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记SSEA1和OCT4的阳性表达。
三维培养系统
如图17A-17C和24A-24B所示，在3-D悬浮培养物中用CNTF和IL11培养基培养的猪iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记Nanog、OCT4和SSEA1的阳性表达。
实施例6
含低浓度血清替代物并补充蛋白酶抑制剂的培养基维持家畜多能干细胞处于未分化状态
在二维培养物上(在MEF饲养细胞上)或在三维悬浮培养物上用包括5％ KoSR和70、100或130μM PMSF的PMSF培养基培养牛和猪多能干细胞(iPSC)。
实验结果
二维培养系统
如图18A-18B、19、21A-21B、29A-29B和34A-34C所示，在悬浮培养物(3D)中用PMSF培养基培养的牛或猪iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记TRA1-60、Nanog、OCT4、SSEA1和TRA1-81的阳性表达。
三维培养系统
如图20A-20C和25A-25B所示，在3D悬浮培养物中用PMSF培养基培养的猪iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记Nanog、OCT4和SSEA1的阳性表达。
实施例7
含胰岛素和转铁蛋白的确定成分培养基维持家畜多能干细胞处于未分化状态
本发明人测试了化学上确定成分培养基维持哺乳动物家畜多能干细胞未分化生长的能力。化学上确定成分培养基包括胰岛素和转铁蛋白以及脂质混合物BSA，并补充分化抑制因子(bFGF、IL6RIL6嵌合体和抗坏血酸)，然而，它们并不包括硒。被称为“IT1”的第一化学上确定成分培养基包括0.43μM胰岛素和0.0172μM转铁蛋白。被称为“IT2”的第二化学上确定成分培养基包括1.57μM胰岛素和0.055μM转铁蛋白。
实验结果
二维培养系统
如图26A-26B、27A-27B、30A-30B、31、32A-32B和33A-33B所示，在MEF上用确定成分培养基(“IT1”或“IT2”)培养的牛和猪iPSC维持其未分化和多能状态至少3或5代，显示出多能性标记TRA1-60、Nanog、SSEA1和TRA1-81的阳性表达。
尽管已结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是很明显，多种可选方案、修改和变型对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些可选方案、修改和变型。
申请人(一个或多个)的意图是，本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都将通过引用以其整体并入说明书中，就像每个单独的出版物、专利或专利申请在被引用时都被具体地和单独地注明其将通过引用并入其中一样。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这种参考文献可作为本发明的现有技术获得。就使用章节标题而言，不应将其理解为必然是限制性的。此外，本申请的任何优先权文件(一个或多个)特此通过引用以其整体并入本文。
序列表
<110> 艾策尔塔公司
M·艾米特
<120> 用于悬浮培养哺乳动物家畜多能干细胞的无血清培养基
<130> 91823
<150> US 63/208,595
<151> 2021-06-09
<160> 24
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<211> 365
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 5
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IL6R/IL6嵌合蛋白
<400> 5
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Glu Phe Met Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys
355 360 365
Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile
370 375 380
Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys
385 390 395 400
Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu
405 410 415
Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys
420 425 430
Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr
435 440 445
Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe
450 455 460
Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val
465 470 475 480
Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr
485 490 495
<210> 6
<211> 202
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Lys Val Leu Ala Ala Gly Val Val Pro Leu Leu Leu Val Leu His
1 5 10 15
Trp Lys His Gly Ala Gly Ser Pro Leu Pro Ile Thr Pro Val Asn Ala
20 25 30
Thr Cys Ala Ile Arg His Pro Cys His Asn Asn Leu Met Asn Gln Ile
35 40 45
Arg Ser Gln Leu Ala Gln Leu Asn Gly Ser Ala Asn Ala Leu Phe Ile
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Ala Gln Gly Glu Pro Phe Pro Asn Asn Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Cys Gly Pro Asn Val Thr Asp Phe Pro Pro Phe His Ala Asn Gly
85 90 95
Thr Glu Lys Ala Lys Leu Val Glu Leu Tyr Arg Ile Val Val Tyr Leu
100 105 110
Gly Thr Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Lys Ile Leu Asn Pro
115 120 125
Ser Ala Leu Ser Leu His Ser Lys Leu Asn Ala Thr Ala Asp Ile Leu
130 135 140
Arg Gly Leu Leu Ser Asn Val Leu Cys Arg Leu Cys Ser Lys Tyr His
145 150 155 160
Val Gly His Val Asp Val Thr Tyr Gly Pro Asp Thr Ser Gly Lys Asp
165 170 175
Val Phe Gln Lys Lys Lys Leu Gly Cys Gln Leu Leu Gly Lys Tyr Lys
180 185 190
Gln Ile Ile Ala Val Leu Ala Gln Ala Phe
195 200
<210> 7
<211> 3987
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
cttcctggac tggggatccc ggctaaatat agctgtttct gtcttacaac acaggctcca 60
gtatataaat caggcaaatt ccccatttga gcatgaacct ctgaaaactg ccggcatctg 120
aggtttcctc caaggccctc tgaagtgcag cccataatga aggtcttggc ggcaggagtt 180
gtgcccctgc tgttggttct gcactggaaa catggggcgg ggagccccct ccccatcacc 240
cctgtcaacg ccacctgtgc catacgccac ccatgtcaca acaacctcat gaaccagatc 300
aggagccaac tggcacagct caatggcagt gccaatgccc tctttattct ctattacaca 360
gcccaggggg agccgttccc caacaacctg gacaagctat gtggccccaa cgtgacggac 420
ttcccgccct tccacgccaa cggcacggag aaggccaagc tggtggagct gtaccgcata 480
gtcgtgtacc ttggcacctc cctgggcaac atcacccggg accagaagat cctcaacccc 540
agtgccctca gcctccacag caagctcaac gccaccgccg acatcctgcg aggcctcctt 600
agcaacgtgc tgtgccgcct gtgcagcaag taccacgtgg gccatgtgga cgtgacctac 660
ggccctgaca cctcgggtaa ggatgtcttc cagaagaaga agctgggctg tcaactcctg 720
gggaagtata agcagatcat cgccgtgttg gcccaggcct tctagcagga ggtcttgaag 780
tgtgctgtga accgagggat ctcaggagtt gggtccagat gtgggggcct gtccaagggt 840
ggctggggcc cagggcatcg ctaaacccaa atgggggctg ctggcagacc ccgagggtgc 900
ctggccagtc cactccactc tgggctgggc tgtgatgaag ctgagcagag tggaaacttc 960
catagggagg gagctagaag aaggtgcccc ttcctctggg agattgtgga ctggggagcg 1020
tgggctggac ttctgcctct acttgtccct ttggcccctt gctcactttg tgcagtgaac 1080
aaactacaca agtcatctac aagagccctg accacagggt gagacagcag ggcccagggg 1140
agtggaccag cccccagcaa attatcacca tctgtgcctt tgctgcccct taggttggga 1200
cttaggtggg ccagaggggc taggatccca aaggactcct tgtcccctag aagtttgatg 1260
agtggaagat agagaggggc ctctgggatg gaaggctgtc ttcttttgag gatgatcaga 1320
gaacttgggc ataggaacaa tctggcagaa gtttccagaa ggaggtcact tggcattcag 1380
gctcttgggg aggcagagaa gccaccttca ggcctgggaa ggaagacact gggaggagga 1440
gaggcctgga aagctttggt aggttcttcg ttctcttccc cgtgatcttc cctgcagcct 1500
gggatggcca gggtctgatg gctggacctg cagcaggggt ttgtggaggt gggtagggca 1560
ggggcaggtt gctaagtcag gtgcagaggt tctgagggac ccaggctctt cctctgggta 1620
aaggtctgta agaaggggct ggggtagctc agagtagcag ctcacatctg aggccctggg 1680
aggccttgtg aggtcacaca gaggtacttg agggggactg gaggccgtct ctggtcccca 1740
gggcaaggga acagcagaac ttagggtcag ggtctcaggg aaccctgagc tccaagcgtg 1800
ctgtgcgtct gacctggcat gatttctatt tattatgata tcctatttat attaacttat 1860
tggtgctttc agtggccaag ttaattcccc tttccctggt ccctactcaa caaaatatga 1920
tgatggctcc cgacacaagc gccagggcca gggcttagca gggcctggtc tggaagtcga 1980
caatgttaca agtggaataa gccttacggg tgaagctcag agaagggtcg gatctgagag 2040
aatggggagg cctgagtggg agtggggggc cttgctccac ccccccccat cccctactgt 2100
gacttgcttt agggtgtcag ggtccaggct gcaggggctg ggccaatttg tggagaggcc 2160
gggtgccttt ctgtcttgat tccagggggc tggttcacac tgttcttggg cgccccagca 2220
ttgtgttgtg aggcgcactg ttcctggcag atattgtgcc ccctggagca gtgggcaaga 2280
cagtccttgt ggcccaccct gtccttgttt ctgtgtcccc atgctgcctc tgaaatagcg 2340
ccctggaaca accctgcccc tgcacccagc atgctccgac acagcaggga agctcctcct 2400
gtggcccgga cacccataga cggtgcgggg ggcctggctg ggccagaccc caggaaggtg 2460
gggtagactg gggggatcag ctgcccattg ctcccaagag gaggagaggg aggctgcaga 2520
tgcctgggac tcagaccagg aagctgtggg ccctcctgct ccacccccat cccactccca 2580
cccatgtctg ggctcccagg cagggaaccc gatctcttcc tttgtgctgg ggccaggcga 2640
gtggagaaac gccctccagt ctgagagcag gggagggaag gaggcagcag agttggggca 2700
gctgctcaga gcagtgttct ggcttcttct caaaccctga gcgggctgcc ggcctccaag 2760
ttcctccgac aagatgatgg tactaattat ggtacttttc actcactttg cacctttccc 2820
tgtcgctctc taagcacttt acctggatgg cgcgtgggca gtgtgcaggc aggtcctgag 2880
gcctggggtt ggggtggagg gtgcggcccg gagttgtcca tctgtccatc ccaacagcaa 2940
gacgaggatg tggctgttga gatgtgggcc acactcaccc ttgtccagga tgcagggact 3000
gccttctcct tcctgcttca tccggcttag cttggggctg gctgcattcc cccaggatgg 3060
gcttcgagaa agacaaactt gtctggaaac cagagttgct gattccaccc ggggggcccg 3120
gctgactcgc ccatcacctc atctccctgt ggacttggga gctctgtgcc aggcccacct 3180
tgcggccctg gctctgagtc gctctcccac ccagcctgga cttggcccca tgggacccat 3240
cctcagtgct ccctccagat cccgtccggc agcttggcgt ccaccctgca cagcatcact 3300
gaatcacaga gcctttgcgt gaaacagctc tgccaggccg ggagctgggt ttctcttccc 3360
tttttatctg ctggtgtgga ccacacctgg gcctggccgg aggaagagag agtttaccaa 3420
gagagatgtc tccgggccct tatttattat ttaaacattt ttttaaaaag cactgctagt 3480
ttacttgtct ctcctcccca tcgtccccat cgtcctcctt gtccctgact tggggcactt 3540
ccaccctgac ccagccagtc cagctctgcc ttgccggctc tccagagtag acatagtgtg 3600
tggggttgga gctctggcac ccggggaggt agcatttccc tgcagatggt acagatgttc 3660
ctgccttaga gtcatctcta gttccccacc tcaatcccgg catccagcct tcagtcccgc 3720
ccacgtgcta gctccgtggg cccaccgtgc ggccttagag gtttccctcc ttcctttcca 3780
ctgaaaagca catggccttg ggtgacaaat tcctctttga tgaatgtacc ctgtggggat 3840
gtttcatact gacagattat ttttatttat tcaatgtcat atttaaaata tttatttttt 3900
ataccaaatg aatacttttt tttttaagaa aaaaaagaga aatgaataaa gaatctactc 3960
ttggctggca aaaaaaaaaa aaaaaaa 3987
<210> 8
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 9
<211> 136
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu
1 5 10 15
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
20 25 30
Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val
35 40 45
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
50 55 60
Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys
65 70 75 80
Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn
85 90 95
Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp
100 105 110
Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser
115 120 125
Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
130 135
<210> 10
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ile Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val
1 5 10 15
Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys
20 25 30
Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr
35 40 45
Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu
50 55 60
Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln
65 70 75 80
Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu
85 90 95
Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser
100 105 110
Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile
115 120 125
Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro
130 135 140
Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn
145 150 155 160
Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys
165 170 175
Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
180 185
<210> 11
<211> 199
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro
1 5 10 15
Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser
20 25 30
Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser
35 40 45
Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe
50 55 60
Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg
85 90 95
Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg
100 105 110
Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr
115 120 125
Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met
130 135 140
Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro
145 150 155 160
Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala
165 170 175
Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu
180 185 190
Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu
195
<210> 12
<211> 2354
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gctcagggca catgcctccc ctccccaggc cgcggcccag ctgaccctcg gggctccccc 60
ggcagcggac agggaagggt taaaggcccc cggctccctg ccccctgccc tggggaaccc 120
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gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga 600
cccgccggcg cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca 660
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ttatttattt caggagcagg ggtgggaggc aggtggactc ctgggtcccc gaggaggagg 960
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tcttccccat ctaggcctgg gcaggaacat atattattta tttaagcaat tacttttcat 1080
gttggggtgg ggacggaggg gaaagggaag cctgggtttt tgtacaaaaa tgtgagaaac 1140
ctttgtgaga cagagaacag ggaattaaat gtgtcataca tatccacttg agggcgattt 1200
gtctgagagc tggggctgga tgcttgggta actggggcag ggcaggtgga ggggagacct 1260
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ttgtttgttt tttgagatgg agtctcgctc tgttgcctag gctggagtgc agtgaggcaa 1440
tctgaggtca ctgcaacctc cacctcccgg gttcaagcaa ttctcctgcc tcagcctccc 1500
gattagctgg gatcacaggt gtgcaccacc atgcccagct aattatttat ttcttttgta 1560
tttttagtag agacagggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtttcgaact cctgacctca 1620
ggtgatcctc ctgcctcggc ctcccaaagt gctgggatta caggtgtgag ccaccacacc 1680
tgacccatag gtcttcaata aatatttaat ggaaggttcc acaagtcacc ctgtgatcaa 1740
cagtacccgt atgggacaaa gctgcaaggt caagatggtt cattatggct gtgttcacca 1800
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gaaacagcag gctacaaaac cactgcatgc tgtgatccca attttgtgtt tttctttcta 2160
tatatggatt aaaacaaaaa tcctaaaggg aaatacgcca aaatgttgac aatgactgtc 2220
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actattttta gaat 2354
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp Leu
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Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
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Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Gln Trp
50 55 60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu Asn Leu Gln Ala Tyr
65 70 75 80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
85 90 95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
100 105 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
115 120 125
Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
130 135 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145 150 155 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
165 170 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His
180 185 190
Tyr Ile Ala Asn Asn Lys Lys Met
195 200
<210> 14
<211> 1902
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
agtctttgag agtcacatct cttatttgga ccagtataga cagaagtaaa cccagctgac 60
ttgtttcctg ggacagttga gttaagggat ggctttcaca gagcattcac cgctgacccc 120
tcaccgtcgg gacctctgta gccgctctat ctggctagca aggaagattc gttcagacct 180
gactgctctt acggaatcct atgtgaagca tcagggcctg aacaagaaca tcaacctgga 240
ctctgcggat gggatgccag tggcaagcac tgatcagtgg agtgagctga ccgaggcaga 300
gcgactccaa gagaaccttc aagcttatcg taccttccat gttttgttgg ccaggctctt 360
agaagaccag caggtgcatt ttaccccaac cgaaggtgac ttccatcaag ctatacatac 420
ccttcttctc caagtcgctg cctttgcata ccagatagag gagttaatga tactcctgga 480
atacaagatc ccccgcaatg aggctgatgg gatgcctatt aatgttggag atggtggtct 540
ctttgagaag aagctgtggg gcctaaaggt gctgcaggag ctttcacagt ggacagtaag 600
gtccatccat gaccttcgtt tcatttcttc tcatcagact gggatcccag cacgtgggag 660
ccattatatt gctaacaaca agaaaatgta gcagttagtc ccttctctct tccttgcttt 720
ctcttctaat ggaatatgcg tagttccctg gggcctcgct ttcccatctt aaatttctaa 780
aaacagttaa gacaacaggc attttctttc ttttttctct gaccacctgc agcctgttga 840
aggactacag gtattttcat caagtagcgt tggagacata cacaaatggg catacaagtt 900
tagcctgggg ggtgtgattt gtgtgcgtgc ttgcatgtgc tgcaggtgta agagagtggg 960
agcagggaca acgtccttcc acttcagggt tctaaccttt ctaacccact aagtaacctc 1020
tacaggcatt taactgcctt acagacagaa tatacatatg ttaattctag tcctggatga 1080
ctcggtctga gaagattcaa tttaaaatca gactctttag ttgatttaaa ctcttagaga 1140
ataagaataa taatggctaa cttttattat cttctatatt aaggcagtat gccaagggtc 1200
tttatgtata ttatgtacag cgtttacaac cttgtgagca aggtggtgtt actcccatta 1260
ggtagatgag aaaacaggct cacagagatt tggttaagct cacacagcta acaagtagca 1320
cactgagttt gaacacagat cattctcctt gtaaaagcct atgtgccttt cactttagag 1380
gcttgatcat gaatcactgc acctctttgt cacagggtgt tggaagatgc atccatgtaa 1440
tctattccca tcgctggaaa acagctgctg ttagatgtcc tcagaagtca gttgcaaatt 1500
ttagcgttaa agtcaggatt tattgttcat acttggcggt gaggagggca gctggagatc 1560
ttaagattcc attttggaaa atgattaggc ccgccaaact tctgaacttt ggaagctggg 1620
gatgtttagt aatacagcct ggtttttaag tactcactaa aagttctcaa atattgggtt 1680
gggcacggct tataccaggt tacctcactt ttaattagtg atgcaggcag tgtaacccaa 1740
gcatttgtgg acaatgagtg gaatactaaa gttaaaaagt caaactttca cctcagattt 1800
tctggactta gtcatgagga gagggtgagg cccactctgt tcctactgga gataccagag 1860
actctgaaac tatagaataa agcctctgtg ctgcacaaca aa 1902
<210> 15
<211> 2988
<212> DNA
<213> 智人
<400> 15
gcaggagggc ccagcgacgc cgccgcgcca gctcccaggg cccggccccc cccggcgctc 60
acgctctcgg ggcggactcc cggccctccg cgccctctcg cgcggcgatg gccccactcg 120
gatacttctt actcctctgc agcctgaagc aggctctggg cagctacccg atctggtggt 180
cgctggctgt tgggccacag tattcctccc tgggctcgca gcccatcctg tgtgccagca 240
tcccgggcct ggtccccaag cagctccgct tctgcaggaa ctacgtggag atcatgccca 300
gcgtggccga gggcatcaag attggcatcc aggagtgcca gcaccagttc cgcggccgcc 360
ggtggaactg caccaccgtc cacgacagcc tggccatctt cgggcccgtg ctggacaaag 420
ctaccaggga gtcggccttt gtccacgcca ttgcctcagc cggtgtggcc tttgcagtga 480
cacgctcatg tgcagaaggc acggccgcca tctgtggctg cagcagccgc caccagggct 540
caccaggcaa gggctggaag tggggtggct gtagcgagga catcgagttt ggtgggatgg 600
tgtctcggga gttcgccgac gcccgggaga accggccaga tgcccgctca gccatgaacc 660
gccacaacaa cgaggctggg cgccaggcca tcgccagcca catgcacctc aagtgcaagt 720
gccacgggct gtcgggcagc tgcgaggtga agacatgctg gtggtcgcaa cccgacttcc 780
gcgccatcgg tgacttcctc aaggacaagt acgacagcgc ctcggagatg gtggtggaga 840
agcaccggga gtcccgcggc tgggtggaga ccctgcggcc gcgctacacc tacttcaagg 900
tgcccacgga gcgcgacctg gtctactacg aggcctcgcc caacttctgc gagcccaacc 960
ctgagacggg ctccttcggc acgcgcgacc gcacctgcaa cgtcagctcg cacggcatcg 1020
acggctgcga cctgctgtgc tgcggccgcg gccacaacgc gcgagcggag cggcgccggg 1080
agaagtgccg ctgcgtgttc cactggtgct gctacgtcag ctgccaggag tgcacgcgcg 1140
tctacgacgt gcacacctgc aagtaggcac cggccgcggc tccccctgga cggggcgggc 1200
cctgcctgag ggtgggcttt tccctgggtg gagcaggact cccacctaaa cggggcagta 1260
ctcctccctg ggggcgggac tcctccctgg gggtggggct cctacctggg ggcagaactc 1320
ctacctgaag gcagggctcc tccctggagc tagtgtctcc tctctggtgg ctgggctgct 1380
cctgaatgag gcggagctcc aggatgggga ggggctctgc gttggcttct ccctggggac 1440
ggggctcccc tggacagagg cggggctaca gattgggcgg ggcttctctt gggtgggaca 1500
gggcttctcc tgcgggggcg aggcccctcc cagtaagggc gtggctctgg gtgggcgggg 1560
cactaggtag gcttctacct gcaggcgggg ctcctcctga aggaggcggg gctctaggat 1620
ggggcacggc tctggggtag gctgctccct gagggcggag cgcctcctta ggagtggggt 1680
tttatggtgg atgaggcttc ttcctggatg gggcagagct tctcctgacc agggcaaggc 1740
cccttccacg ggggctgtgg ctctgggtgg gcgtggcctg cataggctcc ttcctgtggg 1800
tggggcttct ctgggaccag gctccaatgg ggcggggctt ctctccgcgg gtgggactct 1860
tccctgggaa ccgccctcct gattaaggcg tggcttctgc aggaatcccg gctccagagc 1920
aggaaattca gcccaccagc cacctcatcc ccaaccccct gtaaggttcc atccacccct 1980
gcgtcgagct gggaaggttc catgaagcga gtcgggtccc caacccgtgc ccctgggatc 2040
cgagggcccc tctccaagcg cctggctttg gaatgctcca ggcgcgccga cgcctgtgcc 2100
accccttcct cagcctgggg tttgaccacc cacctgacca ggggccctac ctggggaaag 2160
cctgaagggc ctcccagccc ccaaccccaa gaccaagctt agtcctggga gaggacaggg 2220
acttcgcaga ggcaagcgac cgaggccctc ccaaagaggc ccgccctgcc cgggctccca 2280
caccgtcagg tactcctgcc agggaactgg cctgctgcgc cccaggcccc gcccgtctct 2340
gctctgctca gctgcgcccc cttctttgca gctgcccagc ccctcctccc tgccctcggg 2400
tctccccacc tgcactccat ccagctacag gagagataga agcctctcgt cccgtccctc 2460
cctttcctcc gcctgtccac agccccttaa gggaaaggta ggaagagagg tccagccccc 2520
caggctgccc agagctgctg gtctcatttg ggggcgttcg ggaggtttgg ggggcatcaa 2580
ccccccgact gtgctgctcg cgaaggtccc acagccctga gatgggccgg cccccttcct 2640
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tcctgactca tccgcctggc ccgggaatga atggggaggc cgctgaaccc acccggccca 2760
tatccctggt tgcctcatgg ccagcgcccc tcagcctctg ccactgtgaa ccggctccca 2820
ccctcaaggt gcggggagaa gaagcggcca ggcggggcgc cccaagagcc caaaagaggg 2880
cacaccgcca tcctctgcct caaattctgc gtttttggtt ttaatgttat atctgatgct 2940
gctatatcca ctgtccaacg gagttagacg aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2988
<210> 16
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Ala Pro Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr
20 25 30
Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
35 40 45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
50 55 60
Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65 70 75 80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
100 105 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
115 120 125
Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly
130 135 140
Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu
145 150 155 160
Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
165 170 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
180 185 190
Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
195 200 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
210 215 220
Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225 230 235 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
245 250 255
Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val
260 265 270
Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
275 280 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile
290 295 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala
305 310 315 320
Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr
325 330 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
340 345 350
<210> 17
<211> 2217
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
ccccgccgcc gccgcccttc gcgccctggg ccatctccct cccacctccc tccgcggagc 60
agccagacag cgagggcccc ggccgggggc aggggggacg ccccgtccgg ggcacccccc 120
cggctctgag ccgcccgcgg ggccggcctc ggcccggagc ggaggaagga gtcgccgagg 180
agcagcctga ggccccagag tctgagacga gccgccgccg cccccgccac tgcggggagg 240
agggggagga ggagcgggag gagggacgag ctggtcggga gaagaggaaa aaaacttttg 300
agacttttcc gttgccgctg ggagccggag gcgcggggac ctcttggcgc gacgctgccc 360
cgcgaggagg caggacttgg ggaccccaga ccgcctccct ttgccgccgg ggacgcttgc 420
tccctccctg ccccctacac ggcgtccctc aggcgccccc attccggacc agccctcggg 480
agtcgccgac ccggcctccc gcaaagactt ttccccagac ctcgggcgca ccccctgcac 540
gccgccttca tccccggcct gtctcctgag cccccgcgca tcctagaccc tttctcctcc 600
aggagacgga tctctctccg acctgccaca gatcccctat tcaagaccac ccaccttctg 660
gtaccagatc gcgcccatct aggttatttc cgtgggatac tgagacaccc ccggtccaag 720
cctcccctcc accactgcgc ccttctccct gaggacctca gctttccctc gaggccctcc 780
taccttttgc cgggagaccc ccagcccctg caggggcggg gcctccccac cacaccagcc 840
ctgttcgcgc tctcggcagt gccggggggc gccgcctccc ccatgccgcc ctccgggctg 900
cggctgctgc cgctgctgct accgctgctg tggctactgg tgctgacgcc tggccggccg 960
gccgcgggac tatccacctg caagactatc gacatggagc tggtgaagcg gaagcgcatc 1020
gaggccatcc gcggccagat cctgtccaag ctgcggctcg ccagcccccc gagccagggg 1080
gaggtgccgc ccggcccgct gcccgaggcc gtgctcgccc tgtacaacag cacccgcgac 1140
cgggtggccg gggagagtgc agaaccggag cccgagcctg aggccgacta ctacgccaag 1200
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cccgtgttgc tctcccgggc agagctgcgt ctgctgaggc tcaagttaaa agtggagcag 1380
cacgtggagc tgtaccagaa atacagcaac aattcctggc gatacctcag caaccggctg 1440
ctggcaccca gcgactcgcc agagtggtta tcttttgatg tcaccggagt tgtgcggcag 1500
tggttgagcc gtggagggga aattgagggc tttcgcctta gcgcccactg ctcctgtgac 1560
agcagggata acacactgca agtggacatc aacgggttca ctaccggccg ccgaggtgac 1620
ctggccacca ttcatggcat gaaccggcct ttcctgcttc tcatggccac cccgctggag 1680
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agctccacgg agaagaactg ctgcgtgcgg cagctgtaca ttgacttccg caaggacctc 1800
ggctggaagt ggatccacga gcccaagggc taccatgcca acttctgcct cgggccctgc 1860
ccctacattt ggagcctgga cacgcagtac agcaaggtcc tggccctgta caaccagcat 1920
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gtgtactacg tgggccgcaa gcccaaggtg gagcagctgt ccaacatgat cgtgcgctcc 2040
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cgccccgccc ccgctgcctt gcccatgggg gctgtattta aggacacccg tgccccaagc 2160
ccacctgggg ccccattaaa gatggagaga ggactgcgga aaaaaaaaaa aaaaaaa 2217
<210> 18
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
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Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
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Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 19
<211> 5251
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
cgcacacgca cacacacaca cacacacaca cacgcacgca cacacgtgtg cgcttctctg 60
ctccggagct gctgctgctc ctgctctcag cgccgcagtg gaaggcagga ccgaaccgct 120
ccttctttaa atatataaat ttcagcccag gtcagcctcg gcggcccccc tcaccgcgct 180
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atctcattgc tccaagaatt tttttcttct tactcgccaa agtcagggtt ccctctgccc 420
gtcccgtatt aatatttcca cttttggaac tactggcctt ttctttttaa aggaattcaa 480
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acaacaacaa caaaaaacca aacaactctc cttgatctat actttgagaa ttgttgattt 600
ctttttttta ttctgacttt taaaaacaac ttttttttcc acttttttaa aaaatgcact 660
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cctgcagcac actcgatatg gaccagttca tgcgcaagag gatcgaggcg atccgcgggc 780
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aagatttaac atctccaacc cagcgctaca tcgacagcaa agttgtgaaa acaagagcag 1320
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acaggaacct gggatttaaa ataagcttac actgtccctg ctgcactttt gtaccatcta 1440
ataattacat catcccaaat aaaagtgaag aactagaagc aagatttgca ggtattgatg 1500
gcacctccac atataccagt ggtgatcaga aaactataaa gtccactagg aaaaaaaaca 1560
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cgacaacgat gatgcttgta acaagaaaac ataagagagc cttggttcat cagtgttaaa 2100
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aggacagtca cttcagaagt catgctttaa agcacaagag tcaggccata tccatcaagg 4800
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<213> 智人
<400> 20
cgcacacgca cacacacaca cacacacaca cacgcacgca cacacgtgtg cgcttctctg 60
ctccggagct gctgctgctc ctgctctcag cgccgcagtg gaaggcagga ccgaaccgct 120
ccttctttaa atatataaat ttcagcccag gtcagcctcg gcggcccccc tcaccgcgct 180
cccggcgccc ctcccgtcag ttcgccagct gccagccccg ggaccttttc atctcttccc 240
ttttggccgg aggagccgag ttcagatccg ccactccgca cccgagactg acacactgaa 300
ctccacttcc tcctcttaaa tttatttcta cttaatagcc actcgtctct ttttttcccc 360
atctcattgc tccaagaatt tttttcttct tactcgccaa agtcagggtt ccctctgccc 420
gtcccgtatt aatatttcca cttttggaac tactggcctt ttctttttaa aggaattcaa 480
gcaggatacg tttttctgtt gggcattgac tagattgttt gcaaaagttt cgcatcaaaa 540
acaacaacaa caaaaaacca aacaactctc cttgatctat actttgagaa ttgttgattt 600
ctttttttta ttctgacttt taaaaacaac ttttttttcc acttttttaa aaaatgcact 660
actgtgtgct gagcgctttt ctgatcctgc atctggtcac ggtcgcgctc agcctgtcta 720
cctgcagcac actcgatatg gaccagttca tgcgcaagag gatcgaggcg atccgcgggc 780
agatcctgag caagctgaag ctcaccagtc ccccagaaga ctatcctgag cccgaggaag 840
tccccccgga ggtgatttcc atctacaaca gcaccaggga cttgctccag gagaaggcga 900
gccggagggc ggccgcctgc gagcgcgaga ggagcgacga agagtactac gccaaggagg 960
tttacaaaat agacatgccg cccttcttcc cctccgaaaa tgccatcccg cccactttct 1020
acagacccta cttcagaatt gttcgatttg acgtctcagc aatggagaag aatgcttcca 1080
atttggtgaa agcagagttc agagtctttc gtttgcagaa cccaaaagcc agagtgcctg 1140
aacaacggat tgagctatat cagattctca agtccaaaga tttaacatct ccaacccagc 1200
gctacatcga cagcaaagtt gtgaaaacaa gagcagaagg cgaatggctc tccttcgatg 1260
taactgatgc tgttcatgaa tggcttcacc ataaagacag gaacctggga tttaaaataa 1320
gcttacactg tccctgctgc acttttgtac catctaataa ttacatcatc ccaaataaaa 1380
gtgaagaact agaagcaaga tttgcaggta ttgatggcac ctccacatat accagtggtg 1440
atcagaaaac tataaagtcc actaggaaaa aaaacagtgg gaagacccca catctcctgc 1500
taatgttatt gccctcctac agacttgagt cacaacagac caaccggcgg aagaagcgtg 1560
ctttggatgc ggcctattgc tttagaaatg tgcaggataa ttgctgccta cgtccacttt 1620
acattgattt caagagggat ctagggtgga aatggataca cgaacccaaa gggtacaatg 1680
ccaacttctg tgctggagca tgcccgtatt tatggagttc agacactcag cacagcaggg 1740
tcctgagctt atataatacc ataaatccag aagcatctgc ttctccttgc tgcgtgtccc 1800
aagatttaga acctctaacc attctctact acattggcaa aacacccaag attgaacagc 1860
tttctaatat gattgtaaag tcttgcaaat gcagctaaaa ttcttggaaa agtggcaaga 1920
ccaaaatgac aatgatgatg ataatgatga tgacgacgac aacgatgatg cttgtaacaa 1980
gaaaacataa gagagccttg gttcatcagt gttaaaaaat ttttgaaaag gcggtactag 2040
ttcagacact ttggaagttt gtgttctgtt tgttaaaact ggcatctgac acaaaaaaag 2100
ttgaaggcct tattctacat ttcacctact ttgtaagtga gagagacaag aagcaaattt 2160
tttttaaaga aaaaaataaa cactggaaga atttattagt gttaattatg tgaacaacga 2220
caacaacaac aacaacaaca aacaggaaaa tcccattaag tggagttgct gtacgtaccg 2280
ttcctatccc gcgcctcact tgatttttct gtattgctat gcaataggca cccttcccat 2340
tcttactctt agagttaaca gtgagttatt tattgtgtgt tactatataa tgaacgtttc 2400
attgcccttg gaaaataaaa caggtgtata aagtggagac caaatacttt gccagaaact 2460
catggatggc ttaaggaact tgaactcaaa cgagccagaa aaaaagaggt catattaatg 2520
ggatgaaaac ccaagtgagt tattatatga ccgagaaagt ctgcattaag ataaagaccc 2580
tgaaaacaca tgttatgtat cagctgccta aggaagcttc ttgtaaggtc caaaaactaa 2640
aaagactgtt aataaaagaa actttcagtc agaataagtc tgtaagtttt tttttttctt 2700
tttaattgta aatggttctt tgtcagttta gtaaaccagt gaaatgttga aatgttttga 2760
catgtactgg tcaaacttca gaccttaaaa tattgctgta tagctatgct ataggttttt 2820
tcctttgttt tggtatatgt aaccatacct atattattaa aatagatgga tatagaagcc 2880
agcataattg aaaacacatc tgcagatctc ttttgcaaac tattaaatca aaacattaac 2940
tactttatgt gtaatgtgta aatttttacc atatttttta tattctgtaa taatgtcaac 3000
tatgatttag attgacttaa atttgggctc tttttaatga tcactcacaa atgtatgttt 3060
cttttagctg gccagtactt ttgagtaaag cccctatagt ttgacttgca ctacaaatgc 3120
attttttttt taataacatt tgccctactt gtgctttgtg tttctttcat tattatgaca 3180
taagctacct gggtccactt gtcttttctt ttttttgttt cacagaaaag atgggttcga 3240
gttcagtggt cttcatcttc caagcatcat tactaaccaa gtcagacgtt aacaaatttt 3300
tatgttagga aaaggaggaa tgttatagat acatagaaaa ttgaagtaaa atgttttcat 3360
tttagcaagg atttagggtt ctaactaaaa ctcagaatct ttattgagtt aagaaaagtt 3420
tctctacctt ggtttaatca atatttttgt aaaatcctat tgttattaca aagaggacac 3480
ttcataggaa acatcttttt ctttagtcag gtttttaata ttcaggggga aattgaaaga 3540
tatatatttt agtcgatttt tcaaaagggg aaaaaagtcc aggtcagcat aagtcatttt 3600
gtgtatttca ctgaagttat aaggttttta taaatgttct ttgaagggga aaaggcacaa 3660
gccaattttt cctatgatca aaaaattctt tctttcctct gagtgagagt tatctatatc 3720
tgaggctaaa gtttaccttg ctttaataaa taatttgcca catcattgca gaagaggtat 3780
cctcatgctg gggttaatag aatatgtcag tttatcactt gtcgcttatt tagctttaaa 3840
ataaaaatta ataggcaaag caatggaata tttgcagttt cacctaaaga gcagcataag 3900
gaggcgggaa tccaaagtga agttgtttga tatggtctac ttcttttttg gaatttcctg 3960
accattaatt aaagaattgg atttgcaagt ttgaaaactg gaaaagcaag agatgggatg 4020
ccataatagt aaacagccct tgtgttggat gtaacccaat cccagatttg agtgtgtgtt 4080
gattattttt ttgtcttcca cttttctatt atgtgtaaat cacttttatt tctgcagaca 4140
ttttcctctc agataggatg acattttgtt ttgtattatt ttgtctttcc tcatgaatgc 4200
actgataata ttttaaatgc tctattttaa gatctcttga atctgttttt ttttttttta 4260
atttgggggt tctgtaaggt ctttatttcc cataagtaaa tattgccatg ggaggggggt 4320
ggaggtggca aggaaggggt gaagtgctag tatgcaagtg ggcagcaatt atttttgtgt 4380
taatcagcag tacaatttga tcgttggcat ggttaaaaaa tggaatataa gattagctgt 4440
tttgtatttt gatgaccaat tacgctgtat tttaacacga tgtatgtctg tttttgtggt 4500
gctctagtgg taaataaatt atttcgatga tatgtggatg tctttttcct atcagtacca 4560
tcatcgagtc tagaaaacac ctgtgatgca ataagactat ctcaagctgg aaaagtcata 4620
ccacctttcc gattgccctc tgtgctttct cccttaagga cagtcacttc agaagtcatg 4680
ctttaaagca caagagtcag gccatatcca tcaaggatag aagaaatccc tgtgccgtct 4740
ttttattccc ttatttattg ctatttggta attgtttgag atttagtttc catccagctt 4800
gactgccgac cagaaaaaat gcagagagat gtttgcacca tgctttggct ttctggttct 4860
atgttctgcc aacgccaggg ccaaaagaac tggtctagac agtatcccct gtagccccat 4920
aacttggata gttgctgagc cagccagata taacaagagc cacgtgcttt ctggggttgg 4980
ttgtttggga tcagctactt gcctgtcagt ttcactggta ccactgcacc acaaacaaaa 5040
aaacccaccc tatttcctcc aatttttttg gctgctacct acaagaccag actcctcaaa 5100
cgagttgcca atctcttaat aaataggatt aataaaaaaa gtaattgtga ctcaaaaaaa 5160
aaaaaaa 5167
<210> 21
<211> 442
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
Pro Ser Glu Thr Val Cys Pro Val Val Thr Thr Pro Ser Gly Ser Val
115 120 125
Gly Ser Leu Cys Ser Arg Gln Ser Gln Val Leu Cys Gly Tyr Leu Asp
130 135 140
Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg Ile Val Arg Phe
145 150 155 160
Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu Val Lys Ala Glu
165 170 175
Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg Val Pro Glu Gln
180 185 190
Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp Leu Thr Ser Pro
195 200 205
Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His Glu Trp Leu His
225 230 235 240
His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu His Cys Pro Cys
245 250 255
Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro Asn Lys Ser Glu
260 265 270
Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Thr
275 280 285
Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys Lys Asn Ser Gly
290 295 300
Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser Tyr Arg Leu Glu
305 310 315 320
Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Ala Ala Tyr
325 330 335
Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile
340 345 350
Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly
355 360 365
Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser
370 375 380
Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro
385 390 395 400
Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu
405 410 415
Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser
420 425 430
Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
435 440
<210> 22
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met His Tyr Cys Val Leu Ser Ala Phe Leu Ile Leu His Leu Val Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Leu Ser Thr Cys Ser Thr Leu Asp Met Asp Gln Phe
20 25 30
Met Arg Lys Arg Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu
35 40 45
Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro
50 55 60
Pro Glu Val Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Leu Leu Gln Glu
65 70 75 80
Lys Ala Ser Arg Arg Ala Ala Ala Cys Glu Arg Glu Arg Ser Asp Glu
85 90 95
Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Tyr Lys Ile Asp Met Pro Pro Phe Phe
100 105 110
Pro Ser Glu Asn Ala Ile Pro Pro Thr Phe Tyr Arg Pro Tyr Phe Arg
115 120 125
Ile Val Arg Phe Asp Val Ser Ala Met Glu Lys Asn Ala Ser Asn Leu
130 135 140
Val Lys Ala Glu Phe Arg Val Phe Arg Leu Gln Asn Pro Lys Ala Arg
145 150 155 160
Val Pro Glu Gln Arg Ile Glu Leu Tyr Gln Ile Leu Lys Ser Lys Asp
165 170 175
Leu Thr Ser Pro Thr Gln Arg Tyr Ile Asp Ser Lys Val Val Lys Thr
180 185 190
Arg Ala Glu Gly Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Ala Val His
195 200 205
Glu Trp Leu His His Lys Asp Arg Asn Leu Gly Phe Lys Ile Ser Leu
210 215 220
His Cys Pro Cys Cys Thr Phe Val Pro Ser Asn Asn Tyr Ile Ile Pro
225 230 235 240
Asn Lys Ser Glu Glu Leu Glu Ala Arg Phe Ala Gly Ile Asp Gly Thr
245 250 255
Ser Thr Tyr Thr Ser Gly Asp Gln Lys Thr Ile Lys Ser Thr Arg Lys
260 265 270
Lys Asn Ser Gly Lys Thr Pro His Leu Leu Leu Met Leu Leu Pro Ser
275 280 285
Tyr Arg Leu Glu Ser Gln Gln Thr Asn Arg Arg Lys Lys Arg Ala Leu
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys Leu Arg
305 310 315 320
Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His
325 330 335
Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr
340 345 350
Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn
355 360 365
Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp
370 375 380
Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile
385 390 395 400
Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410
<210> 23
<211> 3183
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
gacagaagca atggccgagg cagaagacaa gccgaggtgc tggtgaccct gggcgtctga 60
gtggatgatt ggggctgctg cgctcagagg cctgcctccc tgccttccaa tgcatataac 120
cccacacccc agccaatgaa gacgagaggc agcgtgaaca aagtcattta gaaagccccc 180
gaggaagtgt aaacaaaaga gaaagcatga atggagtgcc tgagagacaa gtgtgtcctg 240
tactgccccc acctttagct gggccagcaa ctgcccggcc ctgcttctcc ccacctactc 300
actggtgatc tttttttttt tacttttttt tcccttttct tttccattct cttttcttat 360
tttctttcaa ggcaaggcaa ggattttgat tttgggaccc agccatggtc cttctgcttc 420
ttctttaaaa tacccacttt ctccccatcg ccaagcggcg tttggcaata tcagatatcc 480
actctattta tttttaccta aggaaaaact ccagctccct tcccactccc agctgccttg 540
ccacccctcc cagccctctg cttgccctcc acctggcctg ctgggagtca gagcccagca 600
aaacctgttt agacacatgg acaagaatcc cagcgctaca aggcacacag tccgcttctt 660
cgtcctcagg gttgccagcg cttcctggaa gtcctgaagc tctcgcagtg cagtgagttc 720
atgcaccttc ttgccaagcc tcagtctttg ggatctgggg aggccgcctg gttttcctcc 780
ctccttctgc acgtctgctg gggtctcttc ctctccaggc cttgccgtcc ccctggcctc 840
tcttcccagc tcacacatga agatgcactt gcaaagggct ctggtggtcc tggccctgct 900
gaactttgcc acggtcagcc tctctctgtc cacttgcacc accttggact tcggccacat 960
caagaagaag agggtggaag ccattagggg acagatcttg agcaagctca ggctcaccag 1020
cccccctgag ccaacggtga tgacccacgt cccctatcag gtcctggccc tttacaacag 1080
cacccgggag ctgctggagg agatgcatgg ggagagggag gaaggctgca cccaggaaaa 1140
caccgagtcg gaatactatg ccaaagaaat ccataaattc gacatgatcc aggggctggc 1200
ggagcacaac gaactggctg tctgccctaa aggaattacc tccaaggttt tccgcttcaa 1260
tgtgtcctca gtggagaaaa atagaaccaa cctattccga gcagaattcc gggtcttgcg 1320
ggtgcccaac cccagctcta agcggaatga gcagaggatc gagctcttcc agatccttcg 1380
gccagatgag cacattgcca aacagcgcta tatcggtggc aagaatctgc ccacacgggg 1440
cactgccgag tggctgtcct ttgatgtcac tgacactgtg cgtgagtggc tgttgagaag 1500
agagtccaac ttaggtctag aaatcagcat tcactgtcca tgtcacacct ttcagcccaa 1560
tggagatatc ctggaaaaca ttcacgaggt gatggaaatc aaattcaaag gcgtggacaa 1620
tgaggatgac catggccgtg gagatctggg gcgcctcaag aagcagaagg atcaccacaa 1680
ccctcatcta atcctcatga tgattccccc acaccggctc gacaacccgg gccagggggg 1740
tcagaggaag aagcgggctt tggacaccaa ttactgcttc cgcaacttgg aggagaactg 1800
ctgtgtgcgc cccctctaca ttgacttccg acaggatctg ggctggaagt gggtccatga 1860
acctaagggc tactatgcca acttctgctc aggcccttgc ccatacctcc gcagtgcaga 1920
cacaacccac agcacggtgc tgggactgta caacactctg aaccctgaag catctgcctc 1980
gccttgctgc gtgccccagg acctggagcc cctgaccatc ctgtactatg ttgggaggac 2040
ccccaaagtg gagcagctct ccaacatggt ggtgaagtct tgtaaatgta gctgagaccc 2100
cacgtgcgac agagagaggg gagagagaac caccactgcc tgactgcccg ctcctcggga 2160
aacacacaag caacaaacct cactgagagg cctggagccc acaaccttcg gctccgggca 2220
aatggctgag atggaggttt ccttttggaa catttctttc ttgctggctc tgagaatcac 2280
ggtggtaaag aaagtgtggg tttggttaga ggaaggctga actcttcaga acacacagac 2340
tttctgtgac gcagacagag gggatgggga tagaggaaag ggatggtaag ttgagatgtt 2400
gtgtggcaat gggatttggg ctaccctaaa gggagaagga agggcagaga atggctgggt 2460
cagggccaga ctggaagaca cttcagatct gaggttggat ttgctcattg ctgtaccaca 2520
tctgctctag ggaatctgga ttatgttata caaggcaagc attttttttt tttttttaaa 2580
gacaggttac gaagacaaag tcccagaatt gtatctcata ctgtctggga ttaagggcaa 2640
atctattact tttgcaaact gtcctctaca tcaattaaca tcgtgggtca ctacagggag 2700
aaaatccagg tcatgcagtt cctggcccat caactgtatt gggccttttg gatatgctga 2760
acgcagaaga aagggtggaa atcaaccctc tcctgtctgc cctctgggtc cctcctctca 2820
cctctccctc gatcatattt ccccttggac acttggttag acgccttcca ggtcaggatg 2880
cacatttctg gattgtggtt ccatgcagcc ttggggcatt atgggttctt cccccacttc 2940
ccctccaaga ccctgtgttc atttggtgtt cctggaagca ggtgctacaa catgtgaggc 3000
attcggggaa gctgcacatg tgccacacag tgacttggcc ccagacgcat agactgaggt 3060
ataaagacaa gtatgaatat tactctcaaa atctttgtat aaataaatat ttttggggca 3120
tcctggatga tttcatcttc tggaatattg tttctagaac agtaaaagcc ttattctaag 3180
gtg 3183
<210> 24
<211> 412
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Lys Met His Leu Gln Arg Ala Leu Val Val Leu Ala Leu Leu Asn
1 5 10 15
Phe Ala Thr Val Ser Leu Ser Leu Ser Thr Cys Thr Thr Leu Asp Phe
20 25 30
Gly His Ile Lys Lys Lys Arg Val Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu
35 40 45
Ser Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His
50 55 60
Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Glu Leu Leu
65 70 75 80
Glu Glu Met His Gly Glu Arg Glu Glu Gly Cys Thr Gln Glu Asn Thr
85 90 95
Glu Ser Glu Tyr Tyr Ala Lys Glu Ile His Lys Phe Asp Met Ile Gln
100 105 110
Gly Leu Ala Glu His Asn Glu Leu Ala Val Cys Pro Lys Gly Ile Thr
115 120 125
Ser Lys Val Phe Arg Phe Asn Val Ser Ser Val Glu Lys Asn Arg Thr
130 135 140
Asn Leu Phe Arg Ala Glu Phe Arg Val Leu Arg Val Pro Asn Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Arg Asn Glu Gln Arg Ile Glu Leu Phe Gln Ile Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Glu His Ile Ala Lys Gln Arg Tyr Ile Gly Gly Lys Asn Leu Pro
180 185 190
Thr Arg Gly Thr Ala Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Asp Thr Val
195 200 205
Arg Glu Trp Leu Leu Arg Arg Glu Ser Asn Leu Gly Leu Glu Ile Ser
210 215 220
Ile His Cys Pro Cys His Thr Phe Gln Pro Asn Gly Asp Ile Leu Glu
225 230 235 240
Asn Ile His Glu Val Met Glu Ile Lys Phe Lys Gly Val Asp Asn Glu
245 250 255
Asp Asp His Gly Arg Gly Asp Leu Gly Arg Leu Lys Lys Gln Lys Asp
260 265 270
His His Asn Pro His Leu Ile Leu Met Met Ile Pro Pro His Arg Leu
275 280 285
Asp Asn Pro Gly Gln Gly Gly Gln Arg Lys Lys Arg Ala Leu Asp Thr
290 295 300
Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys Val Arg Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro
325 330 335
Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg
340 345 350
Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu
355 360 365
Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu
370 375 380
Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln
385 390 395 400
Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser
405 410

Claims (60)

1.确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中所述基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中所述血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，并且其中所述血清替代物缺乏硒。
2.根据权利要求1所述的限定无血清培养基，其中所述胰岛素以0.34X10-3 mM至1.88X10-3 mM范围内的浓度提供，并且其中所述转铁蛋白以0.137X10-4 mM至0.66X10-4 mM范围内的浓度提供。
3.确定成分无血清培养基，其包括基础培养基、血清替代物和有效浓度的至少一种分化抑制剂，其中确定成分培养基能够在培养时维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代，其中所述基础培养基被选择适于维持多能干细胞处于未分化状态，其中所述血清替代物包括胰岛素和转铁蛋白，其中所述胰岛素以0.43X10-3 mM至1.57X10-3 mM范围内的浓度提供，并且其中所述转铁蛋白以0.172X10-4 mM至0.55X10-4 mM范围内的浓度提供。
4.根据权利要求1、2或3所述的确定成分培养基，前提是所述基础培养基不是RPMI1640。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的培养基，其中所述基础培养基选自KO-DMEM、DMEM/F12和DMEM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的确定成分培养基，其中所述基础培养基选自KO-DMEM和DMEM/F12。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的确定成分培养基，其中所述基础培养基以94-96％范围内的浓度提供。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的确定成分培养基，其中所述培养基缺乏冷冻保护剂。
9.根据权利要求3所述的确定成分培养基，其中所述培养基还包括硒。
10.根据权利要求3所述的确定成分培养基，其中所述培养基不包括硒。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的确定成分培养基，还包括浓度范围为0.5-1.2％(v/v)的脂质混合物。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的确定成分培养基，其中所述血清替代物还包括浓度在125-170mM范围内的抗坏血酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的确定成分培养基，其中所述血清替代物还包括浓度在0.4％至0.7％体积/体积(v/v)范围内的牛血清白蛋白。
14.根据权利要求3-8中任一项所述的确定成分培养基，其中所述血清替代物是以1-10％体积/体积(v/v)范围内的浓度提供的敲除(KO)-血清替代物。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂是生长因子、细胞因子、小分子或其组合，其中所述有效浓度的所述至少一种分化抑制剂能够在培养时维持所述哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态至少5代。
16.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
17.根据权利要求16所述的确定成分培养基，其中所述bFGF的所述有效浓度在4-110ng/ml的范围内。
18.根据权利要求16所述的确定成分培养基，其中所述bFGF的所述有效浓度为约50ng/ml。
19.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂是IL6RIL6嵌合体。
20.根据权利要求19所述的确定成分培养基，其中所述IL6RIL6嵌合体的所述有效浓度为约100pg/ml。
21.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂是gp130激动剂。
22.根据权利要求21所述的确定成分培养基，其中所述gp130激动剂选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)。
23.根据权利要求22所述的确定成分培养基，其中所述IL11的所述有效浓度为约1ng/ml。
24.根据权利要求22或23所述的确定成分培养基，其中所述CNTF的所述有效浓度为约1ng/ml。
25.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约50ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
26.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括浓度为约3000U/ml的白血病抑制因子(LIF)和浓度为约10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
27.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
28.根据权利要求27所述的确定成分培养基，其中所述Wnt3a多肽的所述有效浓度为约10ng/ml。
29.根据权利要求27或28所述的确定成分培养基，其中所述bFGF的所述有效浓度在4-100ng/ml的范围内。
30.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述小分子是选自下列的蛋白酶抑制剂：苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)。
31.根据权利要求30所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂还包括所述IL6RIL6嵌合体。
32.根据权利要求31所述的确定成分培养基，其中所述IL6RIL6嵌合体的所述有效浓度在80-120pg/ml的范围内。
33.根据权利要求30、31或32所述的确定成分培养基，其中所述PMSF的所述有效浓度在70-130μM的范围内。
34.根据权利要求30、31或32所述的培养基，其中所述TLCK的所述有效浓度在20-80μM的范围内。
35.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括选自白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-11(IL11)和睫状神经营养因子(CNTF)的gp130激动剂和选自苯甲基磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲烷盐酸盐(TLCK)的蛋白酶抑制剂。
36.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括Wnt3a多肽和所述IL6RIL6嵌合体。
37.根据权利要求36所述的确定成分培养基，其中所述Wnt3a多肽的所述有效浓度在5-20ng/ml的范围内，并且其中所述IL6RIL6嵌合体的所述有效浓度在70-130pg/ml的范围内。
38.根据权利要求15所述的确定成分培养基，其中所述至少一种分化抑制剂包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGFβ1)。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的确定成分培养基，还包括抗坏血酸。
40.根据权利要求39所述的培养基，其中所述抗坏血酸的浓度范围为8-600μg/ml。
41.根据权利要求39所述的培养基，其中所述抗坏血酸的浓度范围为450-550μg/ml。
42.根据权利要求1-11和13-14中任一项所述的培养基，其中所述培养基包括浓度范围为450-550μg/ml的抗坏血酸和浓度为40-60ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子。
43.细胞培养物，其包括权利要求1-42中任一项所述的确定成分培养基以及细胞。
44.根据权利要求43所述的细胞培养物，其中所述细胞是哺乳动物家畜多能干细胞。
45.维持哺乳动物家畜多能干细胞处于未分化状态的方法，包括在权利要求1-44中任一项所述的确定成分培养基中培养所述哺乳动物家畜多能干细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，还包括使所述哺乳动物家畜多能干细胞传代至少一次。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述传代在所述培养期间每5-21天实现一次。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述传代包括在进一步培养所述细胞之前以1:2或2:3的比例分开所述哺乳动物家畜多能干细胞。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述培养在饲养细胞层上进行。
50.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述培养在无饲养基质上进行。
51.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述培养在缺乏基底黏附的悬浮培养物中进行。
52.使哺乳动物家畜多能干细胞分化的方法，包括：
(a)根据权利要求45-51中任一项所述的方法培养所述哺乳动物家畜多能干细胞，从而获得处于未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，和
(b)在缺乏所述分化抑制剂的条件下培养所述处于未分化状态的哺乳动物家畜多能干细胞的扩大群体，所述条件允许所述哺乳动物家畜多能干细胞分化，
从而使所述哺乳动物家畜多能干细胞分化。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述条件包括在适于使所述哺乳动物家畜未分化干细胞分化成肌肉细胞的培养基中培养所述细胞。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述条件包括在适于使所述哺乳动物家畜未分化干细胞分化成血细胞的培养基中培养所述细胞。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述条件包括在适于使所述哺乳动物家畜未分化干细胞分化成脂肪细胞的培养基中培养所述细胞。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述条件包括在适于使所述哺乳动物家畜未分化干细胞分化成结缔组织细胞的培养基中培养所述细胞。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中在悬浮培养物中进行步骤(a)和(b)中的所述培养。
58.根据权利要求57所述的方法，其中在所述悬浮培养物中的所述培养不黏附于基底。
59.提供了制备食品的方法，所述方法包括将由权利要求52-58中任一项所述的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞与食品组合，从而制备所述食品。
60.食品，其包括由权利要求52-58中任一项所述的方法得到的分化的哺乳动物家畜细胞。
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