JP7383069B2 - 多能性幹細胞を未分化状態で培養する培地、細胞培養および方法 - Google Patents

Description

本発明は、その一部の実施形態では、幹細胞を多能性および未分化状態で維持するのに使用可能な異種成分不含培地、また限定された培地に対する一部の実施形態では、多能性幹細胞を浮遊培養下で培養するための、それを含む細胞培養物およびそれを使用する方法に関する。

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の特異的分化能は、それらを、初期ヒト発生、系統関与、分化プロセスを試験し、かつ工業目的および細胞に基づく治療として使用されるべき最適モデルの１つとして明らかである。

人工多能性（ｉＰＳ）細胞は、インビトロおよびインビボの双方で３つの胚性胚葉の代表的組織に分化する能力を有するＥＳＣ様細胞に再プログラム化される体細胞である。マウスまたはヒトｉＰＳ細胞は、体細胞における４つの転写因子、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２の過剰発現によって生成された。ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣと同じコロニー形態を形成し、かつ、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｕｔｆ１、Ｔｅｌ１およびＬＩＦ受容体遺伝子などのあまり重要でないマーカー以外の、Ｍｙｂ、Ｋｉｔ、Ｄｇｆ３およびＺｉｃ３などの数種の典型的なＥＳＣマーカーを発現することが示され、それにより、ｉＰＳ細胞がＥＳ細胞に類似するが同一でないことが確認された［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年；Ｏｋｉｔａら、２００７年］。Ｙｕ Ｊｕｎｙｉｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０頁、２００７年）は、線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞およびｈＥＳＣに共通の遺伝子発現パターンを見出した。

さらなる試験によると、ｉＰＳ細胞が、体細胞をＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８で形質転換する一方、腫瘍遺伝子Ｃ－Ｍｙｃの使用を省くことによって取得可能であることが示された［Ｙｕら、２００７年；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８年］。ｉＰＳ細胞誘導方法の改善には、ウイルスベクターの代わりとしてのプラスミドの使用またはゲノムへの組込みを全く伴わない誘導が含まれ、その場合、臨床用途におけるｉＰＳ細胞の将来の使用が簡素化されうる［Ｙｕ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年、３２４：７９７－８０１頁］。

現在利用可能なｉＰＳ細胞は、胚性線維芽細胞［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年］、ｈＥＳＣから形成される線維芽細胞［Ｐａｒｋら、２００８年］、胎児線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、包皮線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、成体皮膚および皮膚組織［Ｈａｎｎａら、２００７年；Ｌｏｗｒｙら、２００８年］、ｂ－リンパ球［Ｈａｎｎａら、２００７年］、ならびに成体肝および胃細胞［Ａｏｉら、２００８年］、に由来するものである。

ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣと同様、従来から二次元培養下で支持層を用いて培養され、それは未分化状態でのその連続的成長を可能にする。例えば、ｉＰＳ細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充された培地の存在下で、不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または包皮線維芽細胞からなるフィーダー層上で培養された［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年、Ｍｅｉｓｎｎｅｒら（ａｔ ａｌ）、２００７年］。培養方法のさらなる改善には、ｉＰＳ細胞を、血清代替物および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有するより限定された培地の存在下、ＭＥＦフィーダー層上で培養することが含まれる（Ｐａｒｋら、２００８年）。しかし、臨床用途（例えば細胞に基づく治療）または工業目的としては、ｉＰＳ細胞は、制御プロセスを伴う、限定された異種成分不含（例えば動物フリー）およびスケーラブルな培養系下で培養される必要がある。

ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０２６３５３号パンフレットでは、ヒト胚性幹細胞を二次元培養系下、未分化状態で維持することを目的とした、ＴＧＦβアイソフォーム、またはＩＬ６および可溶性ＩＬ６受容体の間で形成されるキメラ（ＩＬ６ＲＩＬ６）を含む、十分に限定された異種成分不含培地が開示されている。

米国特許出願公開第２００５／０２３３４４６号明細書では、ｈＥＳＣを、未分化状態で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で培養される場合に維持するため、ｂＦＧＦ、インスリンおよびアスコルビン酸を含む限定培地が開示されている。

Ｌｕｄｗｉｇ Ｔ．Ｅ．ら、２００６年（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：１８５－７頁）では、ｈＥＳＣを、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンからなるマトリックス上で培養するためのＴｅＳＲ１限定培地が開示されている。

米国特許出願公開第２００９／００２９４６２号明細書では、多能性幹細胞を、微小担体または細胞カプセル化を用いて懸濁液中で増殖する方法が開示されている。

ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０１５６８２号パンフレットでは、ヒト胚性幹細胞を、基質接着を有しない培養条件下の浮遊培養下で増殖・維持する方法が開示されている。

米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号明細書では、多能性幹細胞を、多能性幹細胞に接着する担体を使用し、懸濁液中で成長させる方法が開示されている。

米国特許出願公開第２００８／０２４１９１９号明細書（Ｐａｒｓｏｎｓら）では、多能性幹細胞を、無細胞マトリックスを含む細胞培養容器内の、ｂＦＧＦ、インスリンおよびアスコルビン酸を含む培地中で、浮遊培養下で培養する方法が開示されている。

米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号明細書（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓら）では、アルギン酸ビーズ内部にカプセル化された多能性ＥＳ細胞を、血清代替物およびｂＦＧＦを含む培地中の三次元培養下で培養する方法が開示されている。

米国特許出願公開第２００７／０２６４７１３号明細書では、未分化幹細胞を、ならし培地を使用する容器内、微小担体上で浮遊培養する方法が開示されている。

本発明の一部の実施形態の態様によると、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含む、無血清および異種成分不含培地であって、ここで培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌであり、またここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む、無血清および異種成分不含培地であって、ここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、約５０～２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む、無血清の培地であって、ここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、少なくとも２０００単位／ｍｌの濃度での白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む、無血清の培地であって、ここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および血清代替物を含む培地であって、ここで培地は、多能性幹細胞を、浮遊培養下で、未分化状態で維持する能力を有する、培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、塩基性媒体、約５０μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ－グルタミン、および血清代替物からなる培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、塩基性媒体、約５０μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ－グルタミン、血清代替物および脂質混合物からなる培地が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞および本発明の培地を含む細胞培養物が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、胚性幹細胞系を誘導する方法であって、（ａ）胚性幹細胞を、胎児の着床前期胚盤胞、着床後期胚盤胞および／または生殖器組織から得るステップと、（ｂ）胚性幹細胞を本発明の培地中で培養するステップと、を含み、それによって胚性幹細胞系を誘導する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、人工多能性幹細胞系を誘導する方法であって、（ａ）体細胞を多能性幹細胞に誘導するステップと、（ｂ）多能性幹細胞を本発明の培地中で培養するステップと、を含み、それによって人工多能性幹細胞系を誘導する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法であって、多能性幹細胞を本発明の培地中で培養するステップを含み、それによって多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法であって、多能性幹細胞を、無血清、無フィーダー、マトリックス不含およびタンパク質担体不含であり、かつ約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養するステップを含み、ここで培地は多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞を増殖し、かつ多能性幹細胞を未分化状態で維持する方法であって、多能性幹細胞を、無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養するステップを含み、ここで培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含み、ここで培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも５０μｇ／ｍｌであり、またここで培地は、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有し、それによって幹細胞を未分化状態で増殖・維持する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞を増殖し、かつ多能性幹細胞を未分化状態で維持する方法であって、多能性幹細胞を、無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養するステップを含み、ここで培地は、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含み、ここで培地は、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有し、それによって幹細胞を未分化状態で増殖・維持する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を増殖し、かつｉＰＳ細胞を未分化状態で維持する方法であって、ｉＰＳ細胞を、基質接着を有せず細胞カプセル化を有しないでかつｉＰＳ細胞の未分化状態での増殖を可能にする培養条件下の浮遊培養下で培養するステップを含み、それによってｉＰＳ細胞を未分化状態で増殖・維持する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法であって、（ａ）多能性幹細胞を本発明の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化幹細胞を得るステップと、（ｂ）増殖された未分化幹細胞を、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップと、を含み、それによって系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、胚様体を多能性幹細胞から生成する方法であって、（ａ）多能性幹細胞を本発明の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、（ｂ）増殖された未分化多能性幹細胞を、幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップと、を含み、それによって胚様体を多能性幹細胞から生成する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法であって、（ａ）多能性幹細胞を本発明の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、（ｂ）増殖された未分化多能性幹細胞を、増殖された未分化幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップと、（ｃ）胚様体の細胞を系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップと、を含み、それによって系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する、方法が提供される。

本発明の一部の実施形態によると、細胞培養物は、フィーダー細胞を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、多能性幹細胞を、浮遊培養下で培養される場合、未分化状態で増殖する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、幹細胞は、胚性幹細胞である。

本発明の一部の実施形態によると、幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。

本発明の一部の実施形態によると、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。

本発明の一部の実施形態によると、人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、多能性幹細胞を未分化状態で増殖する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、血清代替物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＴＧＦβ３の濃度は、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約２ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のアスコルビン酸の濃度は、約４００マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約６００μｇ／ｍｌの範囲内である。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のアスコルビン酸の濃度は、約５００μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ミリリットル）である。

本発明の一部の実施形態によると、培養は、マトリックス上で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、マトリックスは、細胞外マトリックスを含む。

本発明の一部の実施形態によると、細胞外マトリックスは、フィブロネクチンマトリックス、ラミニンマトリックス、および包皮線維芽細胞マトリックスからなる群から選択される。

本発明の一部の実施形態によると、マトリックスは、異種成分を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、フィーダー細胞層は、異種成分を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、フィーダー細胞層は、包皮線維芽細胞を含む。

本発明の一部の実施形態によると、ｂＦＧＦは、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、ＴＧＦβ３は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、アスコルビン酸は、約５０μｇ／ｍｌ～約５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲である。

本発明の一部の実施形態によると、ｂＦＧＦは、約５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、ＴＧＦβ３は、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、アスコルビン酸は、約４００μｇ／ｍｌ～約６００μｇ／ｍｌの濃度範囲である。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、血清代替物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、血清代替物は、異種成分を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、脂質混合物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５％～約１０％の濃度での重炭酸ナトリウムをさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、脂質混合物は、約１％の濃度である。

本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ＬＩＦの濃度は、約２０００～４０００単位／ｍｌの範囲内である。

本発明の一部の実施形態によると、培養は、浮遊培養下で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、ＴＧＦβ３を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、０．１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＧＦβ３を含む。

本発明の一部の実施形態によると、浮遊培養の培地は、無血清および無フィーダー細胞である。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、無血清であり、かつ動物汚染物質を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、前記ｂＦＧＦの濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５０～２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含み、ここで培地は、ｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、少なくとも２０００単位／ｍｌの濃度での白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含み、ここで培地は、ｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５０～２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、タンパク質担体を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、増殖するステップは、約１か月後に、少なくとも約８×１０^６個の細胞を単一の多能性幹細胞から得るステップを含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地中で培養された多能性幹細胞は、少なくとも２継代後、正常な染色体核型を示す。本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞は、少なくとも２０時間の倍加時間を示す。

本発明の一部の実施形態によると、維持するステップは、少なくとも５継代にわたる。

特に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術および／または科学用語は、本発明に関係する当業者によって共通に理解される場合と同じ意味を有する。本明細書中に記載の場合に類似するかまたは等しい方法および材料は、本発明の実施形態を実行または試験する上で使用しうるが、典型的な方法および／または材料は、下記の通りである。内容的な不一致が生じる場合には、定義を含む特許明細書が優先されることになる。さらに、材料、方法、および例は、あくまで例示されるものであり、必ずしも限定することを意図していない。

本発明の一部の実施形態は、添付の図面を参照して、あくまで例示として本明細書中に記載される。ここで特に図面を詳細に参照することで、示される詳細内容が、例示であり、本発明の実施形態の例示的考察を目的とすることが強調される。これに関連し、当業者は、本発明の実施形態を実行可能にする方法を、図面に付けられる説明を通じて理解することになる。

本発明の一部の実施形態に従い、新規の異種成分不含（例えば、動物フリー、動物汚染を有しない）培地の存在下、異種成分不含二次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞のコロニー形態を表す写真である。Ｊ１．２－３は、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）支持層とともに、次の動物血清を含まない培地、すなわち、図１Ａ－培地ＨＡ７０（６継代）；図１Ｂ－培地ＨＡ４０／４（６継代）；および図１Ｃ－培地Ｄ２（１６継代）を使用し、培養された。 ｉＰＳ細胞の多能性のマーカーによる免疫蛍光染色を表す写真である。Ｊ１．２－３およびｉＦ４ ｉＰＳ細胞は、動物血清を含まない培地ＨＡ７７の存在下、異種成分不含二次元培養系（ＨＦＦ）上で少なくとも１０継代培養され、次いで未分化マーカーとして次のマーカーで染色された。すなわち、図２Ａ－Ｊ１．２－３ ｉＰＳ細胞はＯｃｔ４で染色され、図２Ｂ－ｉＦ４ ｉＰＳ細胞はＳＳＥＡ４で染色され、また図２Ｃ－ｉＦ４ ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－８１で染色された。 ＨＦＦ由来のＪ１．２－３ ｉＰＳ細胞系の、次の異種成分不含培地中で指定される継代にわたり浮遊培養される場合での形態を表す写真である。図３Ａ－Ｊ１．２－３ ｉＰＳ細胞はｙＦＬ３培地中で１６継代培養され、図３Ｂ－Ｊ１．２－３ ｉＰＳ細胞はＣＭ１００Ｆ培地中で１３継代培養され、図３Ｃ－Ｊ１．２－３ ｉＰＳ細胞はｙＦ１００培地中で８継代培養された。ｉＰＳ細胞は、浮遊培養される間、未分化細胞を有する球状構造をつくることに注目すること。 Ｊ１．２－３ ｉＰＳ細胞の、浮遊培養下で長期培養期間後、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養される場合での形態を表す写真である。Ｊ１．２－３細胞は、ＣＭ１００Ｆ培地中で３７継代浮遊培養され、その後、それらはＭＥＦとともに再培養され、それらのＭＥＦとの培養の２４時間後、典型的なｉＰＳコロニー形態を形成する。 ｉＰＳ細胞の多能性のマーカーによる免疫蛍光染色を表す写真である。Ｊ１．２－３細胞は、培地ＣＭ１００Ｆを使用し、２０継代超にわたり浮遊培養され、次いで未分化幹細胞のマーカーで染色された。図５Ａ－ＴＲＡ－１－８１；図５Ｂ－ＴＲＡ－１－６０；図５Ｃ－ＳＳＥＡ４。 ｉＰＳ細胞の多能性のマーカーによる免疫染色を表す写真である。Ｊ１．２－３細胞は、ＣＭ１００Ｆ培地を使用し、少なくとも３０継代浮遊培養され、次いでスピナーフラスコに移され、さらに３０日間培養され、その後、細胞は未分化幹細胞のマーカーで染色された。図６Ａ－Ｏｃｔ４；図６Ｂ－ＴＲＡ－１－８１；図６Ｃ－ＴＲＡ－１－６０；および図６Ｄ－ＳＳＥＡ４。

その一部の実施形態では、本発明は、新規の培地、それを含む細胞培養物、ならびに多能性幹細胞を増殖性、多能性および未分化状態で維持する上でそれを使用する方法、またより詳細には、限定はされないが、ｈＥＳＣおよび人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、浮遊培養または二次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しながら、増殖する方法、に関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明中に示されるかまたは実施例によって例示される詳述内容に必ずしも限定されないことは理解されるべきである。本発明は、他の実施形態で実施するかあるいは様々な方法で実行または実施することが可能である。

本発明者らは、骨の折れる（ｌａｂｏｒｉｏｕｓ）実験の後に、限定される培地を設計しており、それは、無血清および異種成分不含であり（例えば動物汚染物質を含まない）、かつ、ヒトｉＰＳおよびＥＳＣなどの多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する一方、全部で３つの胚性胚葉に分化させるその多能性能を保持することが可能である。

したがって、以下の実施例セクションで示されるように、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞は、無血清、異種成分不含および限定培地（例えば、ｍＨＡ４０／４、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８またはＨＡ７４）の存在下で、フィーダー層を含まない（例えば、合成マトリックス上；実施例１）かまたは異種成分を含まないフィーダー層に基づく（例えば、包皮線維芽細胞；図１Ａ～Ｃおよび２Ａ～Ｃ、実施例２）二次元培養系上で、未分化状態で培養された。培養下で、多能性幹細胞は、未分化形態を示すとともに、ｉＰＳまたはｈＥＳＣに典型的な形態学的および分子特性、例えば正常な核型、多能性のマーカー（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－１－６０）の発現、および３つ胚性胚葉全部への分化能（インビトロ（少なくとも２８継代後の胚様体の形成による）およびインビボ（少なくとも３１継代後の奇形腫の形成による）の双方で）を示す。

本明細書で使用される表現「多能性幹細胞」は、細胞を３つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）全部に分化する能力を有する細胞を示す。本発明の一部の実施形態によると、表現「多能性幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を包含する。

表現「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚性組織から得られる細胞（例えば胚盤胞）（着床前（すなわち着床前胚盤胞））、着床後期／原腸形成前期の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号パンフレットを参照）、および妊娠期間中の任意の時期、好ましくは妊娠の１０週以前に胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を含みうる。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の多能性幹細胞は、例えばヒトまたは霊長動物（例えばサル）由来の胚性幹細胞である。

本発明の胚性幹細胞は、周知の細胞培養方法を用いて入手可能である。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離しうる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期まで増殖しうる。ヒトＥＳ細胞の単離においては、透明帯が胚盤胞から除去され、内部細胞塊（ＩＣＭ）が免疫手術によって単離され、ここでは栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングによって無傷ＩＣＭから除去される。次いで、ＩＣＭは、その増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にする適切な培地を有する組織培養フラスコ内にプレーティングされる。９～１５日後、ＩＣＭから誘導された増殖物は、機械的解離または酵素的分解のいずれかによって塊に解離され、次いで細胞は、新しい組織培地上に再プレーティングされる。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットによって個別に選択され、塊に機械的に解離され、再プレーティングされる。次いで、得られたＥＳ細胞は、４～７日ごとに定期的に分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎら、［米国特許第５，８４３，７８０号明細書；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５頁、１９９８年；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３頁、１９９８年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４頁、１９９５年］；Ｂｏｎｇｓｏら［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６頁、１９８９年］；およびＧａｒｄｎｅｒら［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４頁、１９９８年］を参照のこと。

市販の幹細胞が本発明のこの態様でも使用可能であることは理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリー（ＮＩＨ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）（ｗｗｗ．ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞系の非限定例として、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ０４およびＴＥ０６が挙げられる。

拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、受精の少なくとも９日後の原腸形成前期の胚盤胞から入手可能である。胚盤胞を培養する前、内部細胞塊を露出させるため、透明帯は［例えばタイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））により］消化される。次いで、胚盤胞は、標準の胚性幹細胞培養方法を用い、受精後少なくとも９日から１４日以下にわたり（すなわち原腸形成事象前）、インビトロで全胚として培養される。

胚性生殖（ＥＧ）細胞は、当業者に既知の実験技術を用い、（ヒト胎児の場合）妊娠から約８～１１週目の胎児から得られる始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は、解離され、小塊に切断され、その後、機械的解離により、細胞に分離される。次いで、ＥＧ細胞は、適切な培地を有する組織培養フラスコ内で成長される。細胞は、ＥＧ細胞に一致した細胞形態が認められるまで、典型的には７～３０日または１～４継代にわたり、毎日交換される培地で培養される。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３７２６頁、１９９８年］および米国特許第６，０９０，６２２号明細書を参照のこと。

本明細書で使用される表現「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞」（または胚性様幹細胞）は、体細胞（例えば成体体細胞）の脱分化によって得られる増殖性および多能性幹細胞を示す。

本発明の一部の実施形態によると、ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣの場合と同様の増殖能によって特徴づけられ、それ故、ほぼ無限の時間、培養下で維持・増殖されうる。

ＩＰＳ細胞は、細胞を再プログラム化し、胚性幹細胞特性を得る遺伝子操作により、多能性を与えることが可能である。例えば、本発明のｉＰＳ細胞は、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年、Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年、およびＯｋｉｔａら、２００７年）において本質的に記載のように、体細胞内でのＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ－Ｍｙｃの発現の誘発により、体細胞から生成しうる。それに加え、またはそれに代わり、本発明のｉＰＳ細胞は、Ｙｕら、２００７年およびＮａｋａｇａｗａら、２００８年において本質的に記載のように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の発現の誘発により、体細胞から生成しうる。体細胞の遺伝子操作（再プログラミング）は、プラスミドまたはウイルスベクターの使用などの任意の既知の方法を用いるか、またはゲノムへの組込みを全く伴わない誘導により、実施可能であることは注目されるべきである［Ｙｕ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年、３２４：７９７－８０１頁］。

本発明のｉＰＳ細胞は、胚性線維芽細胞［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年］、ｈＥＳＣから形成される線維芽細胞［Ｐａｒｋら、２００８年］、胎児線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、包皮線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、成体皮膚および皮膚組織［Ｈａｎｎａら、２００７年；Ｌｏｗｒｙら、２００８年］、ｂ－リンパ球［Ｈａｎｎａら、２００７年］、ならびに成体肝および胃細胞［Ａｏｉら、２００８年］の脱分化を誘発することによって入手可能である。

ＩＰＳ細胞系はまた、ＷｉＣｅｌｌバンクなどの細胞バンクを介して入手可能である。市販のｉＰＳ細胞系の非限定例として、ｉＰＳ包皮クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（包皮）－１－ＤＬ－１］、ｉＰＳＩＭＲ９０クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－１－ＤＬ－１］、およびｉＰＳＩＭＲ９０クローン４［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－４－ＤＬ－１］が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である。

本明細書で使用される表現「培地」は、多能性幹細胞の成長を支持し、それらを未分化状態で維持するのに使用される液体物質を示す。一部の実施形態に従う本発明によって使用される培地は、水に基づく培地であることができるが、それは、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えば、サイトカイン、成長因子およびホルモンなどの物質の組み合わせを含み、それらのすべては、細胞増殖にとって必要であり、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有する。例えば、本発明の一部の実施形態の態様に従う培地は、合成組織培地、例えば、以下にさらに記載のように、必要な添加物が補充された、Ｋｏ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｉｅｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））、Ｍａｂ ＡＤＣＢ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））でありうる。

本明細書で使用される表現「フィーダー細胞支持」は、フィーダー細胞（例えば線維芽細胞）が、多能性幹細胞がフィーダー細胞上で共培養される場合、または多能性幹細胞が、フィーダー細胞によって生成されるならし培地の存在下でマトリックス（例えば、細胞外マトリックス、合成マトリックス）上で培養される場合に、多能性幹細胞を増殖性および未分化状態で維持する能力を示す。フィーダー細胞の支持は、培養下でありながらのフィーダー細胞の構造（例えば、フィーダー細胞を組織培養プレート内で培養することによって形成される三次元マトリックス）、フィーダー細胞の機能（例えば、フィーダー細胞による成長因子、栄養素およびホルモンの分泌、フィーダー細胞の成長速度、フィーダー細胞の老化前の増殖能）、および／または多能性幹細胞のフィーダー細胞層への付着、に依存する。

本明細書で使用される表現「フィーダー細胞支持の不在」は、フィーダー細胞を含まない培地および／または細胞培養物、ならびに／あるいはそれによって生成されるならし培地を示す。

本明細書で使用される表現「無血清」は、ヒトまたは動物血清を含まないことを示す。

培養プロトコル上での血清の機能が、培養細胞を、インビボで存在する場合と同様の環境（すなわち、細胞が由来する生物の内部、例えば胚の胚盤胞）に提供することであることは注目されるべきである。しかし、動物源（例えばウシ血清）またはヒト源（ヒト血清）のいずれかに由来する血清の使用は、ドナー個体間（それらから血清が得られる）での血清成分中の有意な差異と異種成分汚染物質を有するリスク（動物血清が使用される場合）とによる制限を受ける。

本発明の一部の実施形態によると、無血清培地は、血清またはその一部を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の無血清培地は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清または動物血清から精製されたアルブミン）を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、血清代替物を含む。

本明細書で使用される表現「血清代替物」は、血清の機能を、多能性幹細胞に成長および生存度にとって必要とされる成分を提供することによって代替する、限定された製剤を示す。

様々な血清代替物製剤（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、当該技術分野で既知であり、市販されている。

例えば、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、カタログ番号１０８２８０２８）は、培養下で未分化ＥＳ細胞を成長および維持するように最適化された、限定された無血清製剤である。ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの製剤が、動物源に由来するＡｌｂｕｍａｘ（脂質を豊富に含有するウシ血清アルブミン）を含むことは注目されるべきである（国際特許公開番号、国際公開第９８／３０６７９号パンフレット（Ｐｒｉｃｅ Ｐ．Ｊ．らに付与））。しかし、Ｃｒｏｏｋら、２００７年による最近の出版物（Ｃｒｏｏｋ Ｊ．Ｍ．ら、２００７年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１：４９０－４９４頁）は、ｃＧＭＰに基づいて作製されたＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ、カタログ番号０４－００９５）中のＦＤＡで承認された臨床グレードの包皮線維芽細胞を使用して生成された６つの臨床グレードのｈＥＳＣ系について記載している。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの濃度は、約１％［容量／容量（ｖ／ｖ）］～約５０％（ｖ／ｖ）の範囲内、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約２５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）、例えば約１５％（ｖ／ｖ）、例えば約２０％（ｖ／ｖ）、例えば約３０％（ｖ／ｖ）である。

別の市販されている血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ ＵＳＡ、カタログ番号１２５８７－０１０から入手可能である、ビタミンＡを有しないＢ２７補給物である。Ｂ２７補給物は、ｄ－ビオチン、脂肪酸遊離画分Ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カタラーゼ、Ｌ－カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣ１、Ｄ－ガラクトース（Ａｎｈｙｄ．）、グルタチオン（還元）、組換えヒトインスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン－２－ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、超過酸化物不均化酵素、Ｔ－３／アルブミン複合体、ＤＬα－トコフェロール、および酢酸ＤＬαトコフェロールを含む無血清製剤である。しかし、Ｂ２７補給物の使用は、それが動物源由来のアルブミンを含むことから、限定される。

本発明の一部の実施形態によると、血清代替物は、異種成分を含まない。

用語「異種（ｘｅｎｏ）」は、ギリシャ語「クセノス（Ｘｅｎｏｓ）」、すなわちストレンジャー（ｓｔｒａｎｇｅｒ）に基づく接頭辞である。本明細書で使用される表現「異種成分不含（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）」は、クセノス（すなわち同一でない、外来）種に由来する一切の成分を含有しないことを示す。かかる成分は、異種、異種の細胞成分または異種の一細胞成分（例えば流体）に関連した（例えば感染性の）病原体などの汚染物質でありうる。

例えば、異種成分不含血清代替物は、インスリン、トランスフェリンおよびセレンの組み合わせを含みうる。それに加え、またはそれに代わり、異種成分不含血清代替物は、ヒトまたは組換え生成アルブミン、トランスフェリンおよびインスリンを含みうる。

市販の異種成分不含血清代替物組成物の非限定例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＩＴＳ（インスリン、トランスフェリンおよびセレン）の予混合物（ＩＴＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１５００－０５６）；ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）およびヒト組換えインスリンを含み、かつ、成長因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇおよびマイトジェンを含有しないＳｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ３（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２６４０）が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、異種成分不含血清代替製剤ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）は、×１の作用濃度に達するように、１：１００比に希釈される。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、多能性幹細胞を増殖性、多能性および未分化状態で、少なくとも約５継代、少なくとも約１０継代、少なくとも約１５継代、少なくとも約２０継代、少なくとも約２２継代、少なくとも約２５継代、少なくとも約３０継代、少なくとも約３５継代、少なくとも約４０継代、少なくとも約４５継代、少なくとも約５０継代、およびそれより長い継代、維持する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、多能性幹細胞を未分化状態で増殖する能力を有する。

本明細書で使用される用語「増殖する」は、培養期間にわたり、多能性幹細胞の数を（少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％、およびそれより大きい％）増加させることを示す。単一の多能性幹細胞から得ることができる多能性幹細胞の数が、多能性幹細胞の増殖能に依存することは理解されるであろう。多能性幹細胞の増殖能は、細胞の倍加時間（すなわち、細胞が培養下での有糸分裂を経るのに必要な時間）によって計算可能であり、また多能性幹細胞培養物は、未分化状態で維持されうる（それは継代数×各継代間日数に相当する）。

例えば、以下の実施例セクションの実施例１に記載のように、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、無フィーダーマトリックス上で培養される場合、ｍＨＡ４０／４、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７８およびＨＡ７４／１培地の存在下、増殖性、多能性および未分化状態で、少なくとも２２継代維持されうる。各継代が４～７日毎に行われると仮定すると、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、１１０日間（すなわち２６４０時間）維持された。ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳの倍加時間が３６時間であると仮定すると、これらの条件下で培養される単一のｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞であれば、増殖により、２^７３（すなわち９．４×１０^２１）個のｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞が生成されうる。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の一部の実施形態の培地は、単一の多能性幹細胞（例えばｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞）または多能性幹細胞の集団の、約１か月以内で少なくとも２^２３（すなわち８×１０^６）倍、例えば約１か月以内で少なくとも２^２４（すなわち、１６．７×１０^６）倍の増殖を支持する能力を有する。

本発明の一部の実施形態によると、無血清および異種成分不含培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含み、ここで培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも５０μｇ／ｍｌであり、またここで培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する。

アスコルビン酸（ビタミンＣとしても知られる）は、抗酸化剤特性を有する糖酸（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_６；分子量１７６．１２グラム／モル）である。本発明の一部の実施形態の培地によって使用されるアスコルビン酸は、天然アスコルビン酸、合成アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カリウム）、アスコルビン酸のエステル形態（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル）、それらの機能誘導体（本発明の培地中で使用される場合、同じ活性／機能を示すアスコルビン酸に由来する分子）、またはそれらの類似体（例えば、本発明の培地中で使用される場合にアスコルビン酸において認められる活性に類似した活性を示すアスコルビン酸の機能的等価物）でありうる。本発明の一部の実施形態の培地中で使用可能なアスコルビン酸製剤の非限定例として、Ｌ－アスコルビン酸およびアスコルビン酸３－リン酸が挙げられる。

アスコルビン酸は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）などの様々な製造業者から入手しうる（例えば、カタログ番号：Ａ２２１８、Ａ５９６０、Ａ７５０６、Ａ０２７８、Ａ４４０３、Ａ４５４４、Ａ２１７４、Ａ２３４３、９５２０９、３３０３４、０５８７８、９５２１０、９５２１２、４７８６３、０１－６７３０、０１－６７３９、２５５５６４、Ａ９２９０２、Ｗ２１０９０１）。

上記のように、培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌである。 本発明の一部の実施形態によると、アスコルビン酸は、約５０μｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌ、例えば約５０μｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、例えば約５０μｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌ、例えば約１００μｇ／ｍｌ～約８００μｇ／ｍｌ、例えば約２００μｇ／ｍｌ～約８００μｇ／ｍｌ、例えば約３００μｇ／ｍｌ～約７００μｇ／ｍｌ、例えば約４００μｇ／ｍｌ～約６００μｇ／ｍｌ、例えば約４５０μｇ／ｍｌ～約５５０μｇ／ｍｌなどの濃度の範囲内で使用しうる。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも約７５μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１５０μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約２５０μｇ／ｍｌ）、例えば少なくとも約３００μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約３５０μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約４００μｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約４５０μｇ／ｍｌ、例えば約５００μｇ／ｍｌである。

以下の実施例セクションの実施例１に示されるように、本発明者らは、少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度でのアスコルビン酸を含む様々な培地（例えば、ｍＨＡ４０／４、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８およびＨＡ７４／１培地）を使用し、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を培養し、それらを、フィーダー細胞支持の不在下、増殖性、多能性および未分化状態で少なくとも１５継代維持することに成功している。

塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βとしても既知）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。本発明の一部の実施形態の培地中で使用されるｂＦＧＦが、精製、合成または組換え発現されたｂＦＧＦタンパク質［（例えば、ヒトｂＦＧＦポリペプチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９９７．５（配列番号３１）；ヒトｂＦＧＦポリヌクレオチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００６．４（配列番号３２）でありうる。異種成分不含培地の調製においては、ｂＦＧＦが、好ましくはヒト源から精製されるか、または以下にさらに記載されるように組換え発現されることは注目されるべきである。ｂＦＧＦは、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号ＣＲＦ００１ＡおよびＣＲＦ００１Ｂ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号：ＰＨＧ０２６１、ＰＨＧ０２６３、ＰＨＧ０２６６およびＰＨＧ０２６４）、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）（例えば、カタログ番号：ＣＹＴ－２１８）、およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号：Ｆ０２９１）などの様々な市販源から入手しうる。

一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの範囲内、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約６０ｎｇ／ｍｌ、例えば約７０ｎｇ／ｍｌ、例えば約８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１５０ｎｇ／ｍｌ、である。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｎｇ、少なくとも約４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｎｇ、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。

以下の実施例セクションの実施例１に示されるように、本発明者らは、５～２００ｎｇ／ｍｌの範囲内のｂＦＧＦを含む様々な培地（例えば、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むｍＨＡ４０／４、ＨＡ７５およびＨＡ７８培地；１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＨＡ７６およびＨＡ７７培地；ならびに、５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＨＡ７４／１培地）を使用し、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を培養し、またそれらを、フィーダー細胞支持の不在下、増殖性、多能性および未分化状態で少なくとも１５継代維持することに成功している。

トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）は、多数の細胞種における増殖、分化、および他の機能の制御に関与し、形質転換を誘発する場合や、負の自己分泌成長因子として作用する。ＴＧＦβ３は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ，ＵＳＡ）などの様々な市販源から入手しうる。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＴＧＦβ３の濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲内、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＴＧＦβ３の濃度は、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１．２ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１．４ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１．６ｎｇ／ｍｌ、例えば少なくとも約１．８ｎｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌである。

以下の実施例セクションの実施例１に示されるように、本発明者らは、約２ｎｇ／ｍｌの濃度でＴＧＦβ３を含む様々な培地（例えば、ｍＨＡ４０／４、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７８およびＨＡ７４／１培地）を使用し、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を培養し、またそれらを、フィーダー細胞支持の不在下、増殖性、多能性および未分化状態で少なくとも２２継代維持することに成功している。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのＴＧＦβ３、および約５０ｇ／ｍｌ～約５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸を含む。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の一部の実施形態の培地は、約５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのＴＧＦβ３、および約４００μｇ／ｍｌ～約６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸を含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、脂質混合物をさらに含む。

本明細書で使用される表現「脂質混合物」は、多能性幹細胞を培養するのに必要とされる、規定された（例えば化学的に規定された）脂質組成物である。脂質混合物は、通常、血清または血清代替物を含有しない培地に添加され、それにより、通常は血清または血清代替物の調合物に添加される脂質を代替することは注目されるべきである。

本発明の一部の実施形態の培地中で使用可能である、市販の脂質混合物の非限定例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（カタログ番号１１９０５－０３１）が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、培地中の脂質混合物の濃度は、約０．５％［容量／容量（ｖ／ｖ）］～約３％ ｖ／ｖ、例えば約０．５％ ｖ／ｖ～約２％ ｖ／ｖ、例えば約０．５％ ｖ／ｖ～約１％ ｖ／ｖ、例えば約１％ ｖ／ｖである。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の一部の実施形態の培地は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのＴＧＦβ３、約５０μｇ／ｍｌ～約５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む。

ＴＧＦβ３、ｂＦＧＦおよびアスコルビン酸を少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度で含み、かつ多能性幹細胞を増殖性および未分化状態で維持するように使用可能である、異種成分不含および無血清培地の非限定例として、ＨＡ７５およびＨＡ７８培地が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、重炭酸ナトリウムをさらに含む。重炭酸ナトリウムは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（ＢｅｉｔＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手しうる。

本発明の一部の実施形態によると、培地中の重炭酸ナトリウムの濃度は、約５％～約１０％、例えば約６％～約９％、例えば約７％～約８％、例えば約７．５％である。

本発明者らは、多能性幹細胞が、ｂＦＧＦおよびアスコルビン酸を含むがＴＧＦβアイソフォームを含まない無血清および異種成分不含培地中で培養される場合、増殖性、多能性および未分化状態で、少なくとも１５継代維持可能であることを見出した。

本明細書で使用される表現「ＴＧＦβアイソフォーム」は、多数の細胞種における増殖、分化、および他の機能の制御において同じ受容体シグナル伝達系を介して機能する、ＴＧＦβ１（例えば、ホモサピエンスＴＧＦβ１、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６５１）、ＴＧＦβ２（例えば、ホモサピエンスＴＧＦβ２、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３２２９）およびＴＧＦβ３（例えば、ホモサピエンスＴＧＦβ３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３２３０）を含むトランスフォーミング増殖因子ベータ（β）の任意のアイソフォームを示す。ＴＧＦβは、形質転換を誘発する場合に作用し、負の自己分泌成長因子としても作用する。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＧＦβアイソフォーム、例えば０．５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば０．１ｎｇ／ｍｌ以下、例えば０．０５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば０．０１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＧＦβアイソフォームを含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、完全にＴＧＦβアイソフォームを有しない（すなわちＴＧＦβアイソフォーム不含）。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸および約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。

本発明の一部の実施形態によると、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸および約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する．

本発明の一部の実施形態によると、培地中のアスコルビン酸の濃度は、約４１０μｇ／ｍｌ～約５９０μｇ／ｍｌ、約４２０μｇ／ｍｌ～約５８０μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ～約５５０μｇ／ｍｌ、約４６０μｇ／ｍｌ～約５４０μｇ／ｍｌ、約４７０μｇ／ｍｌ～約５３０μｇ／ｍｌ、約４９０μｇ／ｍｌ～約５２０μｇ／ｍｌ、例えば約４９０μｇ／ｍｌ～約５１０ｇ／ｍｌ、例えば約５００μｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１９０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約１８０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～約１７０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１６０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１３０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のｂＦＧＦの濃度は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸および約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地は、異種成分不含血清代替物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸および約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地は、脂質混合物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦおよび約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度でのアスコルビン酸を含む培地は、重炭酸ナトリウムを含有しない。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦおよび約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度でのアスコルビン酸、約１％の濃度での異種成分不含血清代替物および約１％の濃度での脂質混合物を含む。

約４００～６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含み、かつ、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、増殖性および未分化状態で少なくとも２１継代維持する能力を有する、異種成分不含、無血清、およびＴＧＦβアイソフォーム不含培地の非限定例として、ＨＡ７７培地（以下の実施例セクションの実施例１）、または、ＨＡ７７培地に類似するが、重炭酸ナトリウムを含有しない培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－１００ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＳＲ３～１％（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、および限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）からなる培地、が挙げられる。本発明者らは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元（すなわち浮遊培養）系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる、新規の無血清かつ非常に限定された培地を見出している。

本明細書で使用される表現「浮遊培養」は、多能性幹細胞が、表面に付着するのではなく、培地中に懸濁される場合の培養である。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる無血清培地は、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５５～１９０ｎｇ／ｍｌ、例えば約６０～１９０ｎｇ／ｍｌ、例えば約７０～１８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約８０～１６０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０～１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０～１４０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０～１３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０～１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０～１１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９５～１０５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌを含む。

本発明の一部の実施形態によると、約５０～２００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む培地は、血清代替物をさらに含む。

約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦを含む培地の非限定例として、塩基性媒体（例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２、８５％）、血清代替物（１５％）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ｐ－メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）および非必須アミノ酸ストック（１％）を含むＹＦ１００培地が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる無血清培地は、塩基性媒体、約５０μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ－グルタミン、および血清代替物からなる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる無血清培地は、塩基性媒体、約５０μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ－グルタミン、血清代替物および脂質混合物からなる。

本発明の一部の実施形態によると、アスコルビン酸の濃度は、約５０μｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、アスコルビン酸の濃度は、約５００μｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ｂＦＧＦの濃度は、約４ｎｇ／ｍｌである。

塩基性媒体は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ、またはＳｉｇｍａ Ｉｓｒａｅｌ）、Ｋｏ－ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの任意の既知の組織培地でありうる。塩基性媒体の濃度は、血清代替物などの他の培地成分の濃度に依存する。

血清代替物は、使用される血清代替物に基づく１～２０％の濃度範囲での（動物汚染物質を含有しない）任意の異種成分不含血清代替物でありうる。例えば、ＳＲ３血清代替物が使用される場合、その培地中の濃度は、約１％である。

本発明の一部の実施形態によると、Ｌ－グルタミンの濃度は、約２ｍＭである。

本発明の一部の実施形態によると、脂質混合物（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｓｒａｅｌ）の濃度は、約１％である。

かかる培地の非限定例として、修飾ＨＡ１３（ａ）培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、およびＳＲ３－１％］；修飾ＨＡ１３（ｂ）培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、ＳＲ３～１％および脂質混合物（１％）］；修飾ＨＡ１３（ｃ）培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、およびＳＲ３～１％］；ならびに修飾ＨＡ１３（ｄ）培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、ＳＲ３～１％および脂質混合物（１％）］が挙げられる。これらの培地は、多能性幹細胞（例えばｈＥＳＣおよびｈｉｐｓ細胞）を、増殖性、多能性および未分化状態で、二次元（例えば、無フィーダー層培養系上；データは示さない）下で培養される場合に少なくとも２０継代、また三次元培養系（例えば、外部基質への接着、細胞カプセル化またはタンパク質担体への接着を伴わない浮遊培養；データは示さない）下で培養される場合に少なくとも２０継代維持する能力を有した。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる無血清培地は、約５０～２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む。

本明細書で使用される表現「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ」は、インターロイキン－６受容体の可溶性部分［ＩＬ－６－Ｒ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ８９４１０（配列番号３３）によって示されるヒトＩＬ－６－Ｒ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ８９４１０のアミノ酸１１２～３５５（配列番号３４）によって示される可溶性ＩＬ６受容体の一部］およびインターロイキン－６（ＩＬ６；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ２９２９２（配列番号３５）によって示されるヒトＩＬ－６）またはその生物活性画分（例えば受容体結合ドメイン）を含むキメラポリペプチドを示す。

ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを作成する場合、２つの機能的部分（すなわちＩＬ６およびその受容体）が、互いに直接融合されうる（例えば結合されるかまたは翻訳的に融合される、すなわち単一のオープンリーディングフレームによってコードされる）か、あるいは好適なリンカー（例えばポリペプチドリンカー）を介して複合されうる（結合されるかまたは翻訳的に融合される）ことは注目されるべきである。 本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラポリペプチドは、天然ＩＬ６およびＩＬ６受容体と同様のグリコシル化の量およびパターンを示す。例えば、好適なＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、配列番号３６および国際公開第９９／０２５５２号パンフレット（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．らに付与）の図１１（全体として参照により本明細書中に援用される）に示される。

本発明の培地中で使用されるタンパク性因子のいずれか（例えば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ３）が、組換え的に発現されうるかまたは生化学的に合成されうることは理解されるであろう。さらに、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβなどの天然タンパク性因子は、当該技術分野で周知の方法を用い、生物学的試料から（例えば、ヒト血清、細胞培養物から）精製しうる。

本発明のタンパク性因子（例えばＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）の生化学的合成は、標準の固相技術を用いて行いうる。これらの方法は、排他的固相合成法、部分固相合成法、断片縮合および古典的溶液合成を含む。

本発明のタンパク性因子（例えばＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）の組換え発現は、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７年） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４頁、Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０年） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９頁、Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４年） Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４頁、Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７年） ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１頁、Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４年） ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０頁、Ｂｒｏｇｌｉら（１９８４年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３頁、Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６年） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５頁およびＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ、４２１－４６３頁によって記載の組換え技術を用いて行いうる。詳細には、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ＰＣＴ公開の国際公開第９９／０２５５２号パンフレット（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．らおよびＣｈｅｂａｔｈ Ｊ．らに付与、１９９７年）（全体として参照により本明細書中に援用される）中に記載のように生成しうる。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＩＬ６ＲＩＬ６キメラの濃度は、約５５ｐｇ／ｍｌ～約１９５ｐｇ／ｍｌの範囲内、例えば約６０ｐｇ／ｍｌ～約１９０ｐｇ／ｍｌ、例えば約６５ｐｇ／ｍｌ～約１８５ｐｇ／ｍｌ、例えば約７０ｐｇ／ｍｌ～約１８０ｐｇ／ｍｌ、例えば約７５ｐｇ／ｍｌ～約１７５ｐｇ／ｍｌ、例えば約８０ｐｇ／ｍｌ～約１７０ｐｇ／ｍｌ、例えば約８５ｐｇ／ｍｌ～約１６５ｐｇ／ｍｌ、例えば約９０ｐｇ／ｍｌ～約１５０ｐｇ／ｍｌ、例えば約９０ｐｇ／ｍｌ～約１４０ｐｇ／ｍｌ、例えば約９０ｐｇ／ｍｌ～約１３０ｐｇ／ｍｌ、例えば約９０ｐｇ／ｍｌ～約１２０ｐｇ／ｍｌ、例えば約９０ｐｇ／ｍｌ～約１１０ｐｇ／ｍｌ、例えば約９５ｐｇ／ｍｌ～約１０５ｐｇ／ｍｌ、例えば約９８ｐｇ／ｍｌ～約１０２ｐｇ／ｍｌ、例えば約１００ｐｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ含有培地は、ｂＦＧＦをさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ含有培地中のｂＦＧＦの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの範囲内、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１５ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ含有培地は、血清代替物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ含有培地中のＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの濃度は、約１％（ｖ／ｖ）～約５０％（ｖ／ｖ）の範囲内、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）、例えば約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約２５％（ｖ／ｖ）、例えば約１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば約１５％（ｖ／ｖ）である。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約５０～２００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、約５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、および約５～４０％の濃度での血清代替物を含む。

例えば、以下の実施例セクションの実施例４に示されるように、ＣＭ１００Ｆｐ培地は、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を、基質接着を有しない浮遊培養下で、増殖性、多能性および未分化状態で少なくとも５０継代維持する能力を有することが示された。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下の二次元および三次元培養系で、増殖性、多能性および未分化状態で維持しうる無血清培地は、少なくとも２０００単位／ｍｌの濃度でのＬＩＦを含む。

白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、造血分化の誘導、神経細胞分化の誘導、腎臓発生の間での間葉－上皮転換の調節物質に関与する多面的サイトカインであり、また、母体－胎児境界での免疫寛容における役割を有しうる。本発明の一部の実施形態の培地中で使用されるＬＩＦは、精製、合成または組換え発現されたＬＩＦタンパク質［例えば、ヒトＬＩＦポリペプチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２３００．１（配列番号３７）；ヒトＬＩＦポリヌクレオチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２３０９．３（配列番号３８）でありうる。異種成分不含培地の調製においては、ＬＩＦが、好ましくはヒト源から精製されるか、または組換え発現されることは注目されるべきである。組換えヒトＬＩＦは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＵＳＡ（カタログ番号ＬＩＦ１０１００）およびＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＵＳ Ｉｎｃ（Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ２７６０４，ＵＳＡ））などの様々な供給源から入手可能である。マウスＬＩＦ ＥＳＧＲＯ（登録商標）（ＬＩＦ）は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ（カタログ番号ＥＳＧ１１０７）から入手可能である。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＬＩＦの濃度は、約２０００単位／ｍｌ～約１０，０００単位／ｍｌ、例えば約２０００単位／ｍｌ～約８，０００単位／ｍｌ、例えば約２０００単位／ｍｌ～約６，０００単位／ｍｌ、例えば約２０００単位／ｍｌ～約５，０００単位／ｍｌ、例えば約２０００単位／ｍｌ～約４，０００単位／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、培地中のＬＩＦの濃度は、少なくとも約２０００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２１００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２２００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２３００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２４００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２５００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２６００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２７００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２８００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２９００単位／ｍｌ、例えば少なくとも約２９５０単位／ｍｌ、例えば約３０００単位／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ＬＩＦ含有培地は、ｂＦＧＦをさらに含む。

ＬＩＦ含有培地中のｂＦＧＦの濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの範囲内、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば約２ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１５ｎｇ／ｍｌ、例えば約２０ｎｇ／ｍｌである。

本発明の一部の実施形態によると、ＬＩＦ含有培地は、血清代替物をさらに含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約２０００～１０，０００単位／ｍｌの濃度でのＬＩＦ、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、および約１％（ｖ／ｖ）～約５０％（ｖ／ｖ）の濃度範囲でのＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを含む。

本発明の一部の実施形態によると、培地は、約２０００～５，０００単位／ｍｌの濃度でのＬＩＦ、約５～５０ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦ、および約５～３０％の濃度での血清代替物を含む。

例えば、以下の実施例セクションの実施例４に示されるように、ｙＦＬ３培地は、ヒトＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を、浮遊培養下で培養される場合、増殖性、多能性および未分化状態で少なくとも１０継代維持する能力を有することが示された。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の一部の実施形態の培地中に含まれる成分は、組織培養および／または臨床グレードで、実質的に純粋である。

本発明の一部の実施形態の態様によると、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞および本発明の一部の実施形態の培地を含む細胞培養物が提供される。

本発明の一部の実施形態の態様によると、細胞培養物は、フィーダー細胞を含まない（例えば、フィーダー細胞またはフィーダー細胞ならし培地を有しない）。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の一部の実施形態の細胞培養物中に含まれる多能性幹細胞は、培養期間中、例えば少なくとも２継代、例えば少なくとも４継代、例えば少なくとも８継代、例えば少なくとも１５継代、例えば少なくとも２０継代、例えば少なくとも２５継代、例えば少なくとも３０継代、例えば少なくとも３５継代、例えば少なくとも４０継代、例えば少なくとも４５継代、例えば少なくとも５０継代にわたり、安定な核型（染色体安定性）を示す。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の細胞培養物は、少なくとも２０時間の倍加時間、例えば２０～４０時間の間（例えば約３６時間）の倍加時間を示すことから、非腫瘍形成性の遺伝的に安定な多能性幹細胞（例えばｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞）を示す。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の細胞培養物は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の未分化多能性幹細胞によって特徴づけられる。

本発明の一部の実施形態の態様によると、多能性幹細胞を多能性および未分化状態で増殖・維持する方法が提供される。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法は、多能性幹細胞を（本明細書中に記載の）本発明の新規の培地のいずれかの中で培養することによって行われる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法は、多能性幹細胞を、無血清、無フィーダー、マトリックス不含およびタンパク質担体不含であり、かつ約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養することによって行われる。

本発明の一部の実施形態によると、培養は、マトリックスまたはフィーダー細胞層などの二次元培養系上で行われる。

例えば、二次元培養系上での培養は、多能性幹細胞をマトリックスまたはフィーダー細胞層上に、細胞の生存および増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度でプレーティングすることによって行いうる。典型的には、約１５，０００細胞／ｃｍ^２～約３，０００，０００細胞／ｃｍ^２の間のプレーティング密度が使用される。

多能性幹細胞の単細胞懸濁液が通常播種されるが、小塊も使用可能であることは理解されるであろう。このため、塊の破壊に使用される（例えばＩＶ型コラゲナーゼによる）酵素的消化（以下の実施例セクションにおける「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照）は、幹細胞が完全にばらばらになる前に終了し、細胞は、塊（すなわち１０～２００個の細胞）が形成される程度にピペットで粉砕される。しかし、細胞分化を誘発しうる大塊を回避するための手段がとられる。

本明細書で使用される用語「マトリックス」は、多能性幹細胞が、付着可能であり、それ故にフィーダー細胞の細胞付着機能を代替しうる任意の物質を示す。かかるマトリックスは、典型的には、多能性幹細胞が付着可能な細胞外成分を含有し、それ故、好適な培養基質を提供する。

本発明の一部の実施形態によると、マトリックスは、細胞外マトリックスを含む。

細胞外マトリックスは、基底膜に由来する成分または接着分子受容体－リガンドカップリングの一部を形成する細胞外マトリックス成分からなりうる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）は、本発明での使用に適した市販のマトリックスの一例である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、室温でゲル化し、再構成基底膜を形成するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞に由来する可溶性調製物である一方、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）はまた、成長因子低下調製物として使用可能である。本発明での使用に適した他の細胞外マトリックス成分および成分混合物は、包皮マトリックス、ラミニンマトリックス、フィブロネクチンマトリックス、プロテオグリカンマトリックス、エンタクチンマトリックス、ヘパラン硫酸マトリックス、コラーゲンマトリックスなどを、単独でまたはそれらの様々な組み合わせで、含む。

本発明の一部の実施形態によると、マトリックス異種成分を含まない。

完全な動物フリーの培養条件が所望される場合、マトリックスは、好ましくは、ヒト源に由来するか、または上記のような組換え技術を用いて合成される。かかるマトリックスとして、例えば、ヒト由来フィブロネクチン、組換えフィブロネクチン、ヒト由来ラミニン、包皮線維芽細胞マトリックスまたは合成フィブロネクチンマトリックス、が挙げられる。ヒト由来フィブロネクチンは、血漿フィブロネクチンまたは細胞フィブロネクチンに由来することができ、それらの双方は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。ヒト由来ラミニンおよび包皮線維芽細胞マトリックスは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。合成フィブロネクチンマトリックスは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。

本発明の一部の実施形態によると、培養は、フィーダー細胞層上で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法は、多能性幹細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β－３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸（ここで培地中のアスコルビン酸の濃度は、少なくとも５０μｇ／ｍｌである）を含む無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養することによって実施される。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法は、多能性幹細胞を、約４００～６００μｇ／ｍＩの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養することによって実施される。

本発明の一部の実施形態によると、フィーダー細胞層は、異種成分を含まない。

本発明の一部の実施形態によると、フィーダー細胞層は、包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層である。

本発明の一部の実施形態によると、発明の一部の実施形態に従う培養は、浮遊培養下で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、浮遊培養は、基質接着を有しない、例えば、細胞外マトリックス、ガラスマイクロキャリアまたはビーズの成分などの外部基質への接着を伴わない。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、タンパク質担体を含まない培地中で行われる。

本明細書で使用される表現「タンパク質担体」は、培養下でのタンパク質または栄養素（例えば亜鉛などのミネラル）を細胞に移す役割を果たすタンパク質を示す。かかるタンパク質担体は、例えば、アルブミン（例えばウシ血清アルブミン）、Ａｌｂｕｍａｘ（脂質に富むアルブミン）またはプラスマネート（ヒト血漿単離タンパク質）でありうる。これらの担体はヒトまたは動物源のいずれかに由来することから、ヒトｉＰＳ細胞培養物のｈＥＳＣにおけるその使用は、バッチに特異的な差異および／または病原体への暴露による制限を受ける。したがって、タンパク質担体（例えばアルブミン）を有しない培地は、組換えまたは合成材料から作製可能な真に限定された培地を可能にすることから、非常に有利である。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、無血清および無フィーダー細胞培地中で行われる。

ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を培養する一部のプロトコルが、半透性ヒドロゲル膜内部での細胞のマイクロカプセル化を含み、それにより、栄養素、ガス、および代謝産物とカプセルを取り囲むバルク培地との交換が可能になることは注目されるべきである（詳細については、例えば米国特許出願公開第２００９／００２９４６２号明細書（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙらに付与）を参照）。

本発明の一部の実施形態によると、浮遊培養下で培養される多能性幹細胞は、細胞カプセル化を有しない。

本発明の一部の実施形態の態様によると、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を増殖し、かつｉＰＳ細胞を未分化状態で維持する方法が提供される。本方法は、ｉＰＳ細胞を、基質接着を有せず細胞カプセル化を有しないでかつｉＰＳ細胞の未分化状態での増殖を可能にする培養条件下の浮遊培養下で培養することにより、実施される。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの濃度が約５０～２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の範囲内である場合のＩＬ６ＲＩＬ６キメラ含有培地の存在下で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）含有培地（ここでＬＩＦの濃度は少なくとも約２０００単位／ｍｌである）の存在下で行われる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約６０ｎｇ／ｍｌ～約１９０ｎｇ／ｍｌ、例えば約７０ｎｇ／ｍｌ～約１８０ｎｇ／ｍｌ、例えば約８０ｎｇ／ｍｌ～約１７０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０ｎｇ／ｍｌ～約１６０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０ｎｇ／ｍｌ～約１３０ｎｇ／ｍｌ、例えば約９０ｎｇ／ｍｌ～約１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地の存在下で行われる。

例えば、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞を、基質接着および細胞カプセル化を有しない浮遊培養下で培養する場合に適することが見出された培地の非限定例として、血清代替物および１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むｙＦ１００培地が挙げられる。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞の浮遊培養下での培養は、約５０～２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラおよび１～５０ｎｇ／ｍｌの範囲内の濃度でのｂＦＧＦを含む培地の存在下で行われる。

例えば、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞を、基質接着および細胞カプセル化を有しない浮遊培養下で培養する場合に適することが見出された培地の非限定例として、血清代替物、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラおよび１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのｂＦＧＦを含むＣＭ１００Ｆ培地が挙げられる。

例えば、本発明者らは、ＣＭ１００Ｆｐ、ＣＭ１００Ｆ、ｙＦ１００またはｙＦＬ３培地を使用し、多能性幹細胞を、浮遊培養下で、増殖性、多能性および未分化状態で、少なくとも５０継代増殖した（例えば、図３Ａ～Ｃ、４、５Ａ～Ｃおよび６Ａ～Ｄを参照、また以下の実施例セクションの実施例４および５に記載される）。

本発明の一部の実施形態の方法に従う浮遊培養下での培養は、多能性幹細胞を、培養容器内に、細胞の生存および増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度でプレーティングすることによって行われる。典型的には、約５×１０^４～２×１０^６個の細胞／ｍｌのプレーティング密度が使用される。幹細胞の単細胞懸濁液が通常播種されるが、１０～２００個の細胞などの小塊も使用可能であることは理解されるであろう。

多能性幹細胞に、浮遊培養下でありながら、栄養素および成長因子の十分かつ定常的な供給を提供するため、培地は、毎日、または所定のスケジュールで（例えば２～３日ごとに）、交換しうる。例えば、培地の交換は、多能性幹細胞の浮遊培養物に８０ｇで約３分間の遠心分離を施すことと、形成された多能性幹細胞ペレットを新しい培地に再懸濁することにより、行いうる。それに加え、またはそれに代わり、多能性幹細胞に栄養素または成長因子の定常的な供給を提供するように、培地に定常的な濾過または透析が施される培養系を使用しうる。

大塊状の多能性幹細胞が細胞分化を誘発しうることから、大きい多能性幹細胞集合体を回避するための手段がとられる。本発明の一部の実施形態によると、形成された多能性幹細胞塊は、５～７日ごとに解離され、単細胞または小塊状の細胞は、追加的な培養容器に分割される（すなわち通過される）か、またはさらに追加的な培地を有する同じ培養容器内で維持される。大きい多能性幹細胞塊の解離においては、（上記のような遠心分離によって得られうる）多能性幹細胞のペレットまたは単離された多能性幹細胞塊に、酵素的消化および／または機械的解離を施しうる。

多能性幹細胞塊の酵素的消化は、塊に、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ，ＵＳＡ））および／またはディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ，ＵＳＡ））などの酵素を施すことによって行いうる。酵素とのインキュベーションの時間は、浮遊培養下に存在する細胞塊のサイズに依存する。典型的には、多能性幹細胞の細胞塊が、浮遊培養下でありながら、５～７日ごとに解離される場合、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼとの２０～６０分間のインキュベーションの結果、小細胞塊が得られるが、それは未分化状態でさらに培養しうる。あるいは、多能性幹細胞塊に対し、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼとの約２５分間のインキュベーション後、１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼとの５分間のインキュベーションを行いうる。トリプシンを用いたヒトＥＳＣの継代の結果、染色体の不安定性および異常がもたらされうることは注目されるべきである（例えば、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ Ｍ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１９－２０頁、２００５年およびＣｏｗａｎ Ｃ．Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３５０：１３５３－１３５６頁、２００４年を参照）。本発明の一部の実施形態によると、トリプシンを用いたｈＥＳＣまたはｉＰＳ細胞の継代は避けるべきである。

大きい多能性幹細胞塊の機械的解離は、塊を所定のサイズまで破壊するように設計されたデバイスを使用して行いうる。かかるデバイスは、ＣｅｌｌＡｒｔｉｓ Ｇｏｔｅｂｏｒｇ（Ｓｗｅｄｅｎ）から入手可能である。それに加え、またはそれに代わり、機械的解離は、塊を倒立顕微鏡下で観察しながら、２７ｇの針（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ（Ｄｒｏｇｈｅｄａ，Ｉｒｅｌａｎｄ））などの針を使用してマニュアルで行いうる。

本発明の一部の実施形態によると、大細胞塊の酵素的または機械的解離後、解離された多能性幹細胞塊は、２００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用し（例えば細胞を上下にピペッティングすることにより）、小塊にさらに破壊される。

本発明の一部の実施形態の方法に従い、多能性幹細胞を浮遊培養するために使用される培養容器は、（例えば多能性幹細胞の培養に適した純度グレードを有する）任意の組織培養容器であって、その中で培養される多能性幹細胞が内部表面に接着または付着できない（例えば、非組織培養処理された細胞の、表面への付着または接着を阻止する）ように設計された内部表面を有する、容器でありうる。好ましくは、スケーラブルな培養を得るため、発明の一部の実施形態に従う培養は、温度、撹拌、ｐＨ、およびｐＯ_２などの培養パラメータが、好適なデバイスを使用して自動的に実行される、制御された培養系（好ましくはコンピュータ制御された培養系）を使用して行われる。一旦培養パラメータが記録されると、システムは、培養パラメータを、多能性幹細胞の増殖に対する必要性に応じて自動調節するようにセットされる。

以下の実施例セクションに記載のように、多能性幹細胞は、動的条件下（すなわち、多能性幹細胞が浮遊培養下でありながら一定の運動を受ける条件下；例えば、図６Ａ～Ｄ；実施例５を参照）、または、その増殖性、多能性能および核型安定性を少なくとも３０継代保持しながら非動的条件（すなわち、静的培養；例えば、図３Ａ～Ｃ、４および５Ａ～Ｃ；実施例４を参照）下で培養された。

多能性幹細胞の非動的培養においては、多能性幹細胞は、コーティングされていない５８ｍｍのペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））内で培養しうる。

多能性幹細胞の動的培養においては、多能性幹細胞は、スピナーフラスコ［例えば、Ｉｎｔｅｇｒａ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣｅｌｌＰｉｎ（Ｆｅｒｎｗａｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能な２００ｍｌ～１０００ｍｌ、例えば２５０ｍｌ；Ｂｅｌｌｃｏ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮＪ）から入手可能な１００ｍｌ；または１２５ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ，ＵＳＡ））］内で培養することができ、それは、制御ユニットに接続できることから、制御された培養系を提示する。培養容器（例えば、スピナーフラスコ、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）は、連続的に振とうされる。本発明の一部の実施形態によると、培養容器は、振とう器（Ｓ３．０２．１０Ｌ，ＥＬＭＩ ｌｔｄ（Ｒｉｇａ，Ｌａｔｖｉａ））を使用し、９０回転毎分（ｒｐｍ）で振とうされる。本発明の一部の実施形態によると、培地は、毎日変更される。

本発明の一部の実施形態によると、本発明の教示に従って培養される場合、多能性幹細胞の成長はモニタリングされ、その分化状態が判定される。分化状態は、例えば、形態学的評価（例えば、図１Ａ～Ｃ、３Ａ～Ｃに示される場合）、ならびに／あるいは、膜結合マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞外および細胞内マーカーに対する免疫組織化学または免疫蛍光、および分泌される分子マーカーに対する酵素イムノアッセイなどの免疫学的技術を用いた、未分化状態の典型的なマーカーの発現パターンの検出、を含む様々なアプローチを用いて判定しうる。例えば、本発明の一部の実施形態の方法に従って培養されるｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞に対して用いられる免疫蛍光によると、Ｏｃｔ４、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）４、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）－Ｌ－６０およびＴＲＡ－１－８１の発現が示された（図２Ａ～Ｃ、５Ａ～Ｃおよび６Ａ～Ｄ）。さらに、特異的な未分化マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、Ｃｘ４３、ＦＧＦ４）または分化マーカー（例えば、アルブミン、グルカゴン、α－心臓アクチン（ｃａｒｄｉａｃ ａｃｔｉｎ）、β－グロブリン、Ｆｌｋｌ、ＡＣ１３３およびニューロフィラメント）の転写産物のレベルは、ＲＴ－ＰＣＲ分析および／またはｃＤＮＡマイクロアレイ分析などのＲＮＡに基づく技術を用いて検出可能である。

ＥＳ細胞分化の判定はまた、アルカリホスファターゼ活性の測定を介して行いうる。未分化ヒトＥＳ細胞は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））で製造業者の使用説明書に従って展開することによって検出可能なアルカリホスファターゼ活性を有する。

本発明者らは、本発明の新規の異種成分不含および無血清培地を使用し、新しい多能性幹細胞系を誘導可能であることを見出している。

したがって、以下の実施例セクションにさらに示されるように、本発明者らは、ＨＡ４０／４培地を使用し、「ＷＣ１」と称される新しいｈＥＳＣ系を、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー層上で培養される全胚盤胞から誘導することができた（以下の実施例セクションの実施例３）。

本明細書で使用される用語「誘導する」は、胚性幹細胞系または人工多能性幹細胞系を少なくとも１つの胚性幹または人工多能性細胞から生成することを示す。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞系は、胚性幹細胞系であり、胚性幹細胞系を誘導する方法は、（ａ）胚性幹細胞を胎児の着床前期胚盤胞、着床後期胚盤胞および／または生殖器組織から取るステップ、および（ｂ）胚性幹細胞を本発明の一部の実施形態の培地中で培養するステップによって実施され、それによって胚性幹細胞系を誘導する。

本明細書で使用される表現「胚性幹細胞系」は、単一の生物の単一または一群の胚性幹細胞（例えば単一のヒト胚盤胞）に由来し、かつ培養下で未分化状態および多能性能を維持しながら増殖する能力によって特徴づけられる胚性幹細胞を示す。

胚性幹細胞の、胎児の着床前期胚盤胞、着床後期胚盤胞および／または生殖器組織からの取得は、上記および以下の実施例セクションの実施例３に記載のように、当該技術分野で既知の方法を用いて行いうる。要するに、透明帯が、タイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ ＬｏｕｉｓＭＯ，ＵＳＡ））を使用し、５～７日齢胚盤胞から除去され、栄養芽層は、免疫手術により、または２７ｇの針を使用して機械的に特異的に除去され、露出したＩＣＭは、上記の培地のいずれかの存在下で、好適な培養系（例えば、フィーダー層、無フィーダーマトリックスまたは浮遊培養）下で４～１０日間直接培養されるか（着床前胚盤胞が使用される場合）、あるいは、胚盤胞の表面への着床を可能にするフィーダー層または無フィーダー培養系上で、（着床後／原腸形成前胚盤胞が使用される場合に１３日齢胚盤胞の細胞を得るため）ＩＣＭを６～８日間培養することにより、インビトロ着床がなされ、その後、着床された細胞は、単離され、下記のように、上記の培地のいずれかの存在下で、フィーダー層、無フィーダーマトリックスまたは浮遊培養系上でさらに培養しうる。胎児の生殖器組織を使用する場合、生殖隆起は、解離され、小塊に切断され、その後、機械的解離により、細胞に分離される。次いで、単細胞のＥＧ細胞は、上記の培地のいずれかの中で４～１０日間培養される。

本発明の一部の実施形態によると、多能性幹細胞系は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）系であり、ｉＰＳ細胞系を誘導する方法は、（ａ）体細胞を多能性幹細胞に誘導するステップ、および（ｂ）多能性幹細胞を、本発明の一部の実施形態の培地中で培養するステップによって実施され、それによって人工多能性幹細胞系を誘導する。

本明細書で使用される表現「人工多能性幹細胞系」は、単一の人工多能性幹細胞に由来し、かつ培養下で未分化状態および多能性能を維持しながら増殖する能力によって特徴づけられる多能性幹細胞を示す。

多能性幹細胞を誘導する方法は、当該技術分野で周知であり、例が、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年；Ｏｋｉｔａら、２００７年、Ｙｕら、２００７年；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８年、Ｙｕ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年、３２４：７９７－８０１頁；Ｐａｒｋら、２００８年；Ｈａｎｎａら、２００７年；Ｌｏｗｒｙら、２００８年；Ａｏｉら、２００８年（これらの全部が全体として参照により本明細書中に援用される）の中に示される。

ｉＰＳ細胞のＥＳＣは、一旦得られると、本質的に上記のように、多能性幹細胞の未分化状態での増殖を可能にする上記の培地のいずれかの中でさらに培養される。

確立された多能性幹細胞系（例えば胚性幹細胞系または人工多能性幹細胞系）に対し、未分化状態での細胞の増殖性能を阻害することなく、その多能性能を維持するように凍結／解凍サイクルを実施可能であることは理解されるであろう。例えば、以下の実施例セクションに示されるように、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、１５％血清代替物および１０％ＤＭＳＯを使用し、凍結および解凍が成功した。

以下の実施例セクションの実施例１、２、４および５に記載のように、上記の培地のいずれかの中で増殖・維持されたｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞は、二次元（例えば、無フィーダーマトリックスまたは包皮フィーダー）または三次元（例えば、静的または動的浮遊培養）培養系下で、（例えば少なくとも２０または３０継代の）長期の培養期間後、インビトロ（ＥＢの形成による）およびインビボ（奇形腫の形成による）で明らかなように、多能性を示す（すなわち、３つの胚性胚葉、外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての細胞種に分化する能力を有する）。したがって、本発明の教示に従って培養されたｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、分化した系統特異的細胞を生成するための供給源として使用しうる。かかる細胞は、ＥＳＣが様々な分化シグナル（例えば、サイトカイン、ホルモン、成長因子）を受けることによってＥＳＣから直接的に得るか、または胚様体の形成およびそれに続くＥＢの細胞の系統特異的細胞への分化を介して間接的に得ることが可能である。

したがって、本発明の一部の実施形態の態様によると、胚様体を多能性幹細胞から生成する方法が提供される。本方法は、（ａ）多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップ、および（ｂ）増殖された未分化多能性幹細胞を、幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップによって実施され、それによって胚様体を多能性幹細胞から生成する。

本明細書で使用される表現「胚様体」は、分化を経ている、ＥＳＣ、拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）および／または人工多能性幹細胞の集団からなる形態学的構造を示す。ＥＢの形成は、多能性幹細胞培養物からの分化遮断因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の除去後に開始される。ＥＢの形成の第１ステップにおいては、多能性幹細胞が、小細胞塊に増殖し、次いで分化を進める。分化の第１相においては、ヒトＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞のいずれかに対する培養下で１～４日後、内胚葉細胞層が小塊の外部層上に形成される結果、「単純な（ｓｉｍｐｌｅ）ＥＢ」が得られる。第２相においては、分化後の３～２０日後、「複雑な（ｃｏｍｐｌｅｘ）ＥＢ」が形成される。複雑なＥＢは、外胚葉および中胚葉細胞および誘導組織（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）の広範な分化によって特徴づけられる。

したがって、本発明の一部の実施形態に従う方法は、増殖された未分化多能性幹細胞を得るための上記の培地のいずれかの中で多能性幹細胞を培養することと、それに続き、増殖された未分化多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）を、多能性幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くこととを含む。かかる培養条件は、多能性幹細胞が未分化状態で増殖されるべきである場合に使用される分化阻害因子、例えば、ＴＧＦβ３、少なくとも５０μｇ／ｍｌの濃度でのアスコルビン酸、ｂＦＧＦおよび／またはＩＬ６ＲＩＬ６キメラを実質的に有しない。

ＥＢの形成においては、多能性幹細胞（ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）は、そのフィーダー細胞層、無フィーダー培養系または浮遊培養物から取り出され、血清または血清代替物を含有しかつ分化阻害因子を含有しない培地の存在下で浮遊培養に移される（例えば、以下の実施例セクションの実施例１、２、４および５を参照）。例えば、ＥＢの形成に適した培地は、２０％ＦＢＳｄ（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））、１ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸ストックが補充された塩基性培地（例えば、Ｋｏ－ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含みうる。

ＥＢの形成のモニタリングは、当業者の能力の範囲内であり、形態学的評価（例えば組織学的染色）および分化特異的マーカーの発現の判定［例えば、免疫学的技術またはＲＮＡに基づく分析（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイ）を使用］により、実施できる。

系統特異的細胞をＥＢから得るため、ＥＢの細胞は、さらに系統特異的細胞に適した培養条件下に置くことが可能であることは理解されるであろう。

好ましくは、本発明のこの態様の方法は、（ｃ）胚様体の細胞を系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップをさらに含み、それにより、系統特異的細胞が胚性幹細胞から生成される。

本明細書で使用される表現「系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件」は、培養系、例えば、フィーダー細胞層、無フィーダーマトリックスまたは浮遊培養物と、ＥＢの細胞に由来する特異的細胞系の分化および／または増殖に適した培地との組み合わせを示す。さらに、かかる培養条件の非限定例が、以下に記載される。

本発明の一部の実施形態によると、本発明のこの態様の方法は、ステップ（ｂ）後に系統特異的細胞を単離するステップをさらに含む。

本明細書で使用される表現「系統特異的細胞を単離する」は、主に特異的系統表現型に関連した少なくとも１つの特性を示す細胞を有する培養下での細胞の混合集団の集積を示す。すべての細胞系が、３つの胚性胚葉から誘導されることは理解されるであろう。したがって、例えば、肝細胞および膵臓細胞は、内胚葉、骨、軟骨、弾性繊維結合組織、筋細胞、心筋細胞、骨髄細胞、血管細胞（すなわち内皮および平滑筋細胞）から誘導され、また造血細胞は、胚性中胚葉から分化され、神経、網膜および表皮細胞は、胚性外胚葉から誘導される。

本発明の一部の好ましい実施形態によると、系統特異的細胞の単離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＥＢの細胞のソーティングによって行われる。

ＦＡＣＳ分析によるＥＢ由来の分化細胞を単離する方法は、当該技術分野で既知である。一方法によると、ＥＢは、トリプシンおよびＥＤＴＡの溶液（それぞれ０．０２５％および０．０１％）を用いて分離され、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄され、特異的細胞系に対する細胞表面抗原特性に特異的な蛍光標識抗体とともに氷上で３０分間インキュベートされる。例えば、内皮細胞は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ Ｓ．ら（「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２年、９９：４３９１－４３９６頁）に記載のように、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））から入手可能な蛍光標識ＰＥＣＡＭ１抗体（３０８８４Ｘ）など、血小板内皮細胞接着分子－１（ＰＥＣＡＭ１）に特異的な抗体に付着させることによって単離される。造血細胞は、蛍光標識抗体、例えば、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３８－ＰＥ、ＣＤ９０－ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７－ＰＥ、ＣＤ１５－ＦＴＴＣ、クラスＩ－ＦＩＴＣ（それら全部におけるＩｇＧ１はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能）、ＣＤ１３３／１－ＰＥ（ＩｇＧ１）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から入手可能）、およびグリコホリンＡ－ＰＥ（ＩｇＧ１）（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から入手可能）を使用して単離される。生細胞（すなわち固定を伴わない）が、ヨウ化プロピジウムの使用によるＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析され、死細胞が、ＰＣ－ＬＹＳＩＳまたはＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェアのいずれかを用いて除去される。単離細胞は、Ｋａｕｆｍａｎ Ｄ．Ｓ．ら、（「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１年、９８：１０７１６－１０７２１頁）によって記載のように、磁気標識二次抗体および磁気分離カラム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用し、さらに集積されうることは理解されるであろう。

本発明の一部の実施形態によると、系統特異的細胞の単離は、ＥＢ内部に含まれる細胞、組織および／または組織様構造の機械的分離によって行われる。

例えば、拍動する心筋細胞は、米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号明細書（Ｘｕらに付与）中に開示のように、ＥＢから単離されうる。本発明の４日齢ＥＢは、ゼラチンコートされたプレートまたはチャンバースライドに移され、結合および分化が可能になる。分化の８日目に認められる自発的収縮細胞は、機械的に分離され、低カルシウム媒体またはＰＢＳを有する１５ｍＬのチューブに回収される。細胞は、コラゲナーゼ活性に依存し、コラゲナーゼＢによる消化を用いて、３７℃で６０～１２０分間解離される。次いで、解離された細胞は、分化用ＫＢ培地（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＫＢ ｍｅｄｕｉｕｍ）（８５ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭクレアチン、２０ｍＭグルコース、２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ、５ｍＭピルビン酸塩、および２０ｍＭタウリン、ｐＨ７．２に緩衝化、Ｍａｌｔｓｅｖら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：２３３頁、１９９４年）に再懸濁され、３７℃で１５～３０分間インキュベートされる。解離後、細胞がチャンバースライドに播種され、分化培地中で培養され、拍動可能な単一の心筋細胞が生成される。

本発明の一部の実施形態によると、系統特異的細胞の単離は、ＥＢに分化因子を施し、それにより、ＥＢの系統特異的分化細胞への分化を誘発することによって行われる。

以下は、ＥＢの系統特異的細胞への分化を誘発するための多数の手順およびアプローチの非限定的説明である。

本発明の一部の実施形態のＥＢを神経前駆体に分化させるため、４日齢ＥＢは、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの塩化セレン、および５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＩＴＳＦｎ培地、Ｏｋａｂｅ Ｓ．ら、１９９６年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９：８９－１０２頁）を含む組織培養皿内で５～１２日間培養される。さらに、得られた神経前駆体は、移植され、神経細胞がインビボで生成されうる（Ｂｒｕｅｓｔｌｅ Ｏ．ら、１９９７年、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：１４８０９－１４８１４頁）。神経前駆体は、その移植前、０．１％ＤＮａｓｅの存在下で、トリプシン処理され、単細胞懸濁液に粉砕されることは理解されるであろう

本発明の一部の実施形態のＥＢは、オリゴデンドロサイトに分化し、細胞を、修飾ＳＡＴＯ培地、すなわち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピルビン酸塩、プロゲステロン、プトレッシン、チロキシン、トリヨードチロニン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アミノ酸、ニューロトロフィン３、毛様体神経栄養因子およびヘペスを有するＤＭＥＭ中で培養することにより、細胞を有髄化しうる（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｅ．およびＳａｔｏ Ｇ．Ｈ．、１９７９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６、５１４－５１７頁；Ｒａｆｆ Ｍ．Ｃ．、Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．、およびＮｏｂｌｅ Ｍ．、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：３９０－３９６頁］。要するに、ＥＢは、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して解離され（３７℃で５分間）、単一の細胞懸濁液に粉砕される。懸濁された細胞は、５％ウマ血清および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたＳＡＴＯ培地を有するフラスコ内にプレーティングされる。培養下で４日後、フラスコは穏やかに振とうされ、接着が弱い細胞（主にオリゴデンドロサイト）が懸濁される一方、星状細胞は、フラスコに接着し、さらにならし培地を生成する状態が維持される。一次オリゴデンドロサイトは、ＳＡＴＯ培地を有する新しいフラスコにさらに２日間移される。培養下で全体で６日経過後、オリゴスフェアー（ｏｌｉｇｏｓｐｈｅｒｅ）は、細胞移植のため、部分的に解離され、ＳＡＴＯ培地に再懸濁されるか、または完全に解離され、先行する振とうステップから得られるオリゴスフェアーならし培地中にプレーティングされる［Ｌｉｕ Ｓ．ら、（２０００年） 「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６１２６－６１３１頁］。

肥満細胞の分化においては、本発明の一部の実施形態の２週齢ＥＢは、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０％（ｖ／ｖ）のＷＥＨＩ－３細胞ならし培地および５０ｎｇ／ｍｌの組換えラット幹細胞因子が補充されたＤＭＥＭ培地を含む組織培養皿に移される（ｒｒＳＣＦ、Ｔｓａｉ Ｍ．ら、２０００年、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｖｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．」 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：９１８６－９１９０頁）。培養物は、週に１回、細胞を新しいフラスコに移し、かつ培地の半分を交換することにより、増殖される。

血液－リンパ系細胞を本発明の一部の実施形態のＥＢから生成するため、２～３日齢ＥＢは、調節可能な酸素含量を有するインキュベーターを使用し、７．５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２の存在下で、ガス透過性培養皿に移される。分化の１５日後、細胞は採取され、コラゲナーゼ（０．１単位／ｍｇ）およびディスパーゼ（０．８単位／ｍｇ）（双方はＦ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能）での穏やかな消化によって解離される。ＣＤ４５陽性細胞は、Ｐｏｔｏｃｎｉｋ Ａ．Ｊ．ら、（「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｈｅｍａｔｏ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７年、９４：１０２９５－１０３００頁）に記載のように、ヤギ抗ラット免疫グロブリンに複合された抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍ１／９．３．４．ＨＬ．２および常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用し、単離される。単離ＣＤ４５陽性細胞は、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）全体にわたる単回通過を用いて、さらに集積しうる。

単離系統特異的細胞の分化および増殖に適した培養条件は、様々な組織培地、成長因子、抗生物質、アミノ酸などを含み、また、特定の細胞種および／または細胞系を増殖しかつ分化させるため、いずれの条件が適用されるべきかを判定することが当業者の能力の範囲内にあることは理解されるであろう。

それに加え、またはそれに代わり、系統特異的細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞などの増殖された未分化多能性幹細胞を特異的細胞系の分化に適した培養条件に直接誘発することによって得ることができる。

本発明の一部の実施形態の態様によると、系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法が提供される。本方法は、（ａ）多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化幹細胞を得るステップと、（ｂ）増殖された未分化幹細胞を、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップと、によって実施され、それにより、系統特異的細胞が多能性幹細胞から生成される。

以下は、系統特異的細胞の多能性幹細胞（例えばＥＳＣおよびｉＰＳ細胞）からの分化および／または増殖に適した培養条件の非限定例である。

ＣＤ７３陽性およびＳＳＥＡ－４陰性である間葉間質細胞は、Ｔｒｉｖｅｄｉ ＰおよびＨｅｍａｔｔｉ Ｐ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８年、３６（３）：３５０－９頁に本質的に記載のように、ｈＥＳＣの培養物中に形成された線維芽細胞様分化細胞の画分を機械的に増大させることにより、ｈＥＳＣから生成されうる。要するに、ｈＥＳＣの分化を誘発するため、培地の変更の間隔は、３～５日に延長され、ＥＳＣコロニーの周辺部の細胞は、紡錘状の線維芽細胞様細胞になる。これらの条件下で９～１０日後、培養下の約４０～５０％の細胞が線維芽細胞様の外見を得る場合、ＥＳＣコロニーの未分化部分は、物理的に除去され、残りの分化細胞は、同じ条件下で新しい培養プレートを通過される。

ｈＥＳＣのドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化を誘発するため、Ｖａｚｉｎ Ｔ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９年８月１２日；４（８）：ｅ６６０６；およびＥｌｋａｂｅｔｚ Ｙ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８年１月１５日；２２：１５２－１６５頁に本質的に記載のように、細胞は、マウス間質細胞系ＰＡ６またはＭＳ５とともに共培養するか、あるいは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）およびエフリンＢｌ（ＥＦＮＢ１）の組み合わせとともに培養しうる。

中脳ドーパミン（ｍｅｓＤＡ）ニューロンを生成するため、Ｆｒｉｌｉｎｇ Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９年、１０６：７６１３－７６１８頁に本質的に記載のように、ｈＥＳＣは、遺伝子組換えにより、転写因子Ｌｍｘ１ａを発現しうる（例えば、ＰＧＫプロモーターおよびＬｍｘ１ａを有するレンチウイルスベクターを使用）。

肺上皮（ＩＩ型肺胞上皮）をｈＥＳＣから生成するため、ＥＳＣは、Ｒｉｐｐｏｎ Ｈ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｏｃ．２００８年；５：７１７－７２２頁に記載のように、市販の細胞培地（Ｓｍａｌｌ Ａｉｒｗａｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐａｒｋ，ＭＤ））の存在下、またはその代わり、肺細胞の細胞系（例えばＡ５４９ヒト肺腺癌細胞系）から採取されたならし培地の存在下で培養しうる。

ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞の神経細胞への分化を誘発するため、多能性幹細胞は、Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年、２７：２７５－２８０頁に本質的に記載のように、ＴＧＦ－ｂ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、Ｔｏｃｒｉｓ；例えば１０ｎＭ）およびＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ；例えば５００ｎｇ／ｍｌ）が補充された血清代替培地の存在下で約５日間培養することができ、その後、細胞は、５００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎの存在下で、漸増量（例えば、２５％、５０％、７５％、２日ごとに変更）のＮ２培地（Ｌｉ Ｘ．Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、２３：２１５－２１頁）とともに培養される。

系統特異的一次培養物に加え、本発明のＥＢを使用し、培養下で無限の増殖能を有する系統特異的細胞系を生成しうる。

本発明の細胞系は、例えば、細胞内でのテロメラーゼ遺伝子の発現（Ｗｅｉ Ｗ．ら、２００３年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：２８５９－２８７０頁）または同細胞とＮＩＨ３Ｔ３ ｈｐｈ－ＨＯＸｌｌレトロウイルス産生細胞との共培養（Ｈａｗｌｅｙ Ｒ．Ｇ．ら、１９９４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１－１２頁）を含む当該技術分野で既知の方法によってＥＢ由来細胞を不死化することにより、生成されうる。

本発明の教示に従って得られる系統特異的細胞または細胞系が、ヒト胚における天然の場合と同様の分化プロセスによって発生されることから、それらがさらに、ヒト細胞に基づく治療および組織再生のために使用可能であることは理解されるであろう。

したがって、本発明では、細胞補充療法を必要とする疾患を処置することを目的とした、本発明の一部の実施形態の増殖および／または分化された系統特異的細胞または細胞系の使用が想定される。

例えば、オリゴデンドロサイト前駆体はミエリン疾患の処置に使用可能であり（「Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ．」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ．１９９７年、５５４－５６１頁）、軟骨細胞または間葉細胞は、骨および軟骨欠損の処置に使用可能であり（米国特許第４，６４２，１２０号明細書）、また上皮系統の細胞は、創傷またはやけどの皮膚再生において使用可能である（米国特許第５，７１６，４１１号明細書）。

特定の疾患、例えば特定の遺伝子産物が欠損している遺伝子疾患においては［例えば、嚢胞性線維症患者におけるＣＦＴＲ遺伝子産物の欠損（Ｄａｖｉｅｓ Ｊ．Ｃ．、２００２年．「Ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ．」 Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．９５ Ｓｕｐｐｌ ４１：５８－６７頁）］、ＥＳＣ由来細胞またはｉＰＳ細胞由来細胞は、好ましくは、その個体への投与前に突然変異遺伝子を過剰発現するように操作される。他の疾患においては、ＥＳＣ由来細胞またはｉＰＳ由来細胞が、特定の遺伝子を除外するように操作されるべきであることは理解されるであろう。

遺伝子の過剰発現または除外は、ノックインおよび／またはノックアウトコンストラクト［例えば、Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ Ｓ．およびＩｋｅｄａ Ｊ．Ｅ．：「Ｔｒａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｂｙ Ｃｒｅ－ｌｏｘ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．」 ＤＮＡ Ｒｅｓ ３（１９９６年） ７３－５０頁；Ｂｅｄｅｌｌ Ｍ．Ａ．、Ｊｅｒｋｉｎｓ Ｎ．Ａ．およびＣｏｐｅｌａｎｄ Ｎ．Ｇ．：「Ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．」 Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１（１９９７年） １－１１；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ Ｊ．Ｊ．、Ｓｃｈｅｒｅｒ Ｓ．Ｓ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｓ．、Ａｒｒｏｙｏ Ｅ．、Ｋａｌｌａ Ｋ．Ａ．、Ｐｏｗｅｌｌ Ｆ．Ｌ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｍ．Ｇ．：「Ｔｓｔ－ｌ／Ｏｃｔ－６／ＳＣＩＰ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｔｅｐ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ．」 Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １０（１９９６年） １７５１－６２頁を参照のこと］を使用して行われる。

細胞補充療法に加え、本発明の一部の実施形態の系統特異的細胞はまた、ｃＤＮＡライブラリーを調製するのに使用しうる。ｍＲＮＡは、標準的技術により、系統特異的細胞から調製され、さらに逆転写され、ｃＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡ調製物は、望ましくない特異性を有する胚性線維芽細胞および他の細胞に由来するヌクレオチドがサブトラクションされ、当該技術分野で既知の技術により、サブトラクションｃＤＮＡライブラリーを生成することが可能である。

本発明の一部の実施形態の系統特異的細胞を使用し、系統前駆体の最終分化細胞への分化に作用する因子（例えば、小分子薬、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または条件（例えば、培養条件または操作）についてスクリーニングすることが可能である。例えば、成長作用物質、毒素または潜在的な分化因子は、その培地への添加により、試験することが可能である。

本明細書で使用される用語「約」は、±１０％を示す。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの複合は、「限定はされないが～を含む」を意味する。

用語「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含みかつ限定される」を意味する。

用語「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法または構造は、追加的な成分、ステップおよび／または部分を含むことができるが、それは、追加的な成分、ステップおよび／または部分が、特許請求される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特性を物質的に変更しない場合に限られる。

本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明示されない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、複数の化合物（その混合物を含む）を含みうる。

本願全体を通じて、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示されうる。範囲形式での記述は、あくまで便益性および簡潔性を意図したものであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈されるべきではないことは理解される必要がある。したがって、範囲の記述は、すべての考えられる部分範囲、ならびにその範囲内の個別の数値を詳細に開示しているものと考慮されるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を詳細に開示しているものと考慮されるべきである。これは、範囲の幅と無関係に適用される。

数値範囲が本明細書中で示される場合、常に、指示範囲内の任意の言及される数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指定数（ｉｎｄｉｃａｔｅ ｎｕｍｂｅｒ）と第２の指定数「の間の範囲を有する／範囲」および第１の指定数「から」第２の指定数「の範囲を有する／範囲」という表現は、本明細書中で交換可能に使用され、第１および第２の指定数、ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。

本明細書で使用される用語「方法」は、限定はされないが、化学、薬理学、生物学、生化学および医学分野の当業者に既知であるか、または彼らにより、既知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される、様式、手段、技術および手順を含む、所与のタスクを実施するための様式、手段、技術および手順を示す。

本明細書で使用される用語「処置する」は、状態の進行を無効化する（ａｂｒｏｇａｔｉｎｇ）か、実質的に阻害するか、遅延させるか、または食い止める（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）、状態の臨床または美容症状を実質的に改善するか、あるいは状態の臨床または美容症状の出現を実質的に阻止することを含む。

明確化のため、別々の実施形態との関連で説明される本発明の特定の特徴がまた、単一の実施形態と組み合わせて提供されうると理解されている。逆に、簡素化のため、単一の実施形態との関連で説明される本発明の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の好適な小結合でまたは本発明の任意の他の説明される実施形態に適するものとして提供されうる。様々な実施形態との関連で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしに機能を果たさないのでない限り、それら実施形態の本質的な特徴として考えられるべきではない。

上記に詳述されかつ下記の特許請求の範囲の請求項で主張される、本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例において、実験的サポートが見出される。

ここでは、本発明の一部の実施形態を上記の説明とともに非限定的に例示する以下の実施例について言及される。

一般に、本明細書で使用される命名および本発明で使用される実験法は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を含む。かかる技術は、文献において徹底的に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 第Ｉ－ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｒ．Ｍ．編（１９９４年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編） 「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、第１－４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８年）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書および米国特許第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第Ｉ－ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ Ｊ．Ｅ．編（１９９４年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、第Ｉ－ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４年）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４年）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０年）を参照のこと。また、利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に詳述され、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特許第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書および米国特許第５，２８１，５２１号明細書；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 Ｇａｉｔ Ｍ．Ｊ．編（１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」 Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．、およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５年）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」 Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４年）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｒ．Ｉ．編（１９８６年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 Ｐｅｒｂａｌ Ｂ．、（１９８４年）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第１－３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」 ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６年）を参照のこと。これらの全部は、あたかも本明細書中に完全に説明されるように、参照により援用される。他の一般的な参考文献は、本文書全体を通じて提供される。それらの中の手順は、当該技術分野で周知であると考えられ、読者の便益性のために提供される。それらに含まれるすべての情報は、参照により本明細書中に援用される。

一般的な材料および実験方法
細胞系
ｉＰＳ細胞培養物－人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞系Ｊ１．２－３およびｉＦ４［Ｐａｒｋら、２００８年］（それぞれ、包皮線維芽細胞および成体線維芽細胞に由来）を、過去に記載されたように、不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）とともに培養した。次の培地の組み合わせを、付着された［二次元（２Ｄ）］培養物中でのｉＰＳ細胞の成長を支持するそれらの能力について試験した。
ｈＥＳＣ培養物－ヒトＥＳＣ系Ｉ４、Ｉ３、Ｉ６およびＨ９．２を、本試験において使用した。

二次元の培養条件：ｈＥＳＣ系またはヒトｉＰＳ細胞系を、試験培地の存在下で、ＭＥＦとともに、または合成マトリックス上で培養した。細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ，ＵＳＡ））を使用し、４～６日ごとに継代し、１×１０^４～３×１０^５個の細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングした。

二次元培養に使用される培地－
（ｉ）８５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））、１５％ノックアウト血清代替物（ＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸ストック、および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（すべては、特に指定されない限り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ，ＵＳＡ）から入手）からなるｙＦ１０塩基性培地。この塩基性培地は、対照として、また、二次元培養下のフィーダー層としての不活性化ＭＥＦまたは包皮線維芽細胞とともに、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣのルーチン成長のために使用した。
（ｉｉ）ｍＨＡ４０／４ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、ＩＴＳ１％［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＩＴＳ予混合物は、１．２５ｍｇのインスリン、１．２５ｍｇのトランスフェリンおよび１．２５ｍｇの亜セレン酸（Ｓｅｌｅｎｉｕｓ ａｃｉｄ）からなるＸ１００ストック溶液である］、２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ，ＭＮ，ＵＳＡ）製）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－１０ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ヒト血清アルブミン－０．５％（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１６５３）、重炭酸Ｎａ（７．５％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
（ｉｉｉ）ＨＡ７５ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）、ｂＦＧＦ－１０ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＴＧＦβ３ ２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ，ＭＮ，ＵＳＡ））、ＳＲ３（血清代替物）－１％（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
（ｉｖ）ＨＡ７６ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））、ＩＴＳ１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－１００ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＴＧＦβ３ ２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ，ＭＮ，ＵＳＡ））、ヒト血清アルブミン血清－１％（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ１６５３）、重炭酸Ｎａ（７．５％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
（ｖ）ＨＡ７７ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ，Ｓｉｇｍａ Ｉｓｒａｅｌ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－１００ｎｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、重炭酸Ｎａ（７．５％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、ＳＲ３～１％（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）。ＨＡ７７ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）がまた、重炭酸Ｎａを全く含まずに使用されるだけでなく、多能性幹細胞（例えばｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ）の増殖性、多能性および未分化状態での培養を少なくとも１０継代（ｐａｓｓｇｅｓ）にわたり支持しうることは注目されるべきである。
（ｖｉ）ＨＡ７８ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－１０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＴＧＦβ３ ２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ，ＭＮ，ＵＳＡ））、ＳＲ３（商標）－１％（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、重炭酸Ｎａ（７．５％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
（ｖ）ＨＡ７４／１ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、ＩＴＳ１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ）、ｂＦＧＦ－５０ｎｇ／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＴＧＦβ３ ２ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉ，ＭＮ，ＵＳＡ））、ヒト血清アルブミン－０．５％（Ｓｉｇｍａ，Ｉｓｒａｅｌ、カタログ番号Ａ１６５３）、重炭酸Ｎａ（７．５％）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）、限定された脂質混合物１％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。

組換えヒトアルブミン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ａ７２２３）を、ｍＨＡ４０／４、ＨＡ７６、ＨＡ７４／１培地中でヒト血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ａ１６５３）の代わりに使用したとき、これらの培地が、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の多能性および未分化状態での成長を長い培養期間にわたり支持することが見出されたことは注目されるべきである。したがって、これらの結果によると、組換えヒトアルブミンが、本発明の一部の実施形態の培地中でヒト血清アルブミンの代わりに使用することにより、限定された異種成分不含条件を提供しうることが示される。

三次元培養系（浮遊培養）下での培養条件：
浮遊培養に使用される培地－
（ｉ）１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを補充した塩基性培地（ｙＦ１０塩基性培地）からなるＣＭ１００Ｆｐ培地。８５－ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６は、上記のように生成・精製され、ＩｎｔｅｒＰｈａｒｍ，Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏ ｇｒｏｕｐ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ，ＩｓｒａｅｌおよびＧｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。
（ｉｉ）１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを補充した塩基性培地（ｙＦ１０塩基性培地）からなるＣＭ１００Ｆ培地。８５－ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６は、上記のように生成・精製され、ＩｎｔｅｒＰｈａｒｍ，Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏ ｇｒｏｕｐ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ，ＩｓｒａｅｌおよびＧｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。
（ｉｉｉ）１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの代わりに１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを使用したｙＦ１００塩基性培地（ｙＦ１０塩基性培地）。この培地は、ｈＥＳＣのＣＭ１００Ｆと同じ効率での浮遊培養を支持することが見出された。
（ｉｖ）ｙＦＬ３培地は、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの代わりに４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを有しかつ３０００単位／ｍｌの白血病阻害因子（ＬＩＦ）を補充したｙＦ１０塩基性培地からなる。ｉＰＳ細胞が、４または１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むｙＦＬ３培地で同じ効率で培養されたことは注目されるべきである。
（ｖ）修飾ＨＡ１３（ａ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、およびＳＲ３～１％からなり、二次元および三次元培養系下でｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを支持することが見出された。
（ｖｉ）修飾ＨＡ１３（ｂ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５００μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、ＳＲ３～１％および脂質混合物（１％）からなり、二次元および三次元培養系下でｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを支持することが見出された。
（ｖｉｉ）修飾ＨＡ１３（ｃ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、およびＳＲ３～１％からなり、二次元および三次元培養系下でｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを支持することが見出された。
（ｖｉｉｉ）修飾ＨＡ１３（ｄ）培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９５％）、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ－４ｎｇ、ＳＲ３～１％および脂質混合物（１％）からなり、二次元および三次元培養系下でｈＥＳＣおよびｉＰＳＣを支持することが見出された。

静的浮遊（三次元）培養下での培養－浮遊培養を開始するため、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ，ＵＳＡ））を使用し、それらの培養皿から取り出し、さらに２００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用して小塊に破壊し、５８ｍｍのペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））内、１×１０^６～５×１０^６個の細胞／皿の細胞密度で浮遊培養した（５８ｍｍの皿内に５～８ｍｌの媒体）。ペトリ皿を、５％ＣＯ_２中、３７℃でのインキュベーター内で静的に保存した。必要があれば、最初から３継代の間、分化する塊を培養物から取り出す一方、細胞を新しい培養条件に適合させた。浮遊培養下での培地は、毎日変更し、細胞を、（１～３継代に限り）２７ｇの針を使用する塊のマニュアル切断または２００ｍｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用する穏やかなピペッティングのいすれかにより、５～７日ごとに継代した。あるいは、細胞を、トリプシンＥＤＴＡ（０．２５、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））を、トリプシンとのインキュベーション前の１０Ｍ ＲＯＣＫ阻害剤（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））での１時間処理と組み合わせて使用し、継代した。細胞の倍加時間の計算においては、Ｉ３、Ｉ４およびＨ９．２ ｈＥＳＣおよびＪ１．２－３およびｉＦ４ ｉＰＳ細胞を計数し、ＣＭ１００ＦまたはＣＭ１００Ｆｐ培地で懸濁して８日間成長させた。細胞を、一日おきに計数した。４つの生物学的反復の平均倍加時間を計算した。

スピナーフラスコ内での培養（三次元）－ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣ塊を、静的なペトリ皿内で少なくとも１継代培養し、次いで２５０ｍｌのスピナーフラスコ（Ｃｅｌｌ Ｓｐｉｎ ２５０または１００、Ｉｎｔｅｇｒａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）の試験培地に移し、磁気プレートを使用し、９０回転毎分（ｒｐｍ）で連続的に振とうし、５％ＣＯ_２中、３７℃でのインキュベーター内に置いた。培地を、一日おきに変更した。５～７日ごとに、塊を１：２の比で分割した。

二次元（２Ｄ）または三次元培養系上で培養された細胞の免疫蛍光－蛍光免疫染色においては、試験培地の存在下、二次元または三次元培養系下で成長されるかまたはＭＥＦ上で再培養された未分化ｈＥＳＣまたはｉＰＳを、４％パラホルムアルデヒドで固定し、一次抗体に４℃で一晩暴露した。Ｃｙｓ３複合抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を、二次抗体（１：２００）として使用した。一次抗体（１：５０）は、ＳＳＥＡ１、３および４（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｉｏｗａ，ＵＳＡ））、ＴＲＡ１－６０およびＴＲＡ１－８１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、およびＯｃｔ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））を含む。

二次元または三次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの免疫組織化学－組織切片は、脱パラフィン後、外胚葉（β－３－チューブリン１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））、中胚葉（ＣＤ３１ １：２０）、および内胚葉（α－フェトプロテイン１：２０）（双方はＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手）のマーカーの存在に対して、Ｄａｋｏ ＬＳＡＢ＋染色キットを使用して染色した。対照として、ＩｇＧアイソタイプおよび二次抗体の双方の染色を行った。二次抗体を、ペルオキシダーゼに複合させた。

二次元または三次元培養系上で培養された細胞の核型分析－核型分析（Ｇ－バンディング）を、過去に記載のように［Ａｍｉｔら、２００３年］、１試験あたり２つの試料、各試料から少なくとも１０個の細胞に対して行った。核型を、分析し、「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」（ＩＳＣＮ）に準じて報告した。

二次元または三次元培養系上で培養された細胞の胚様体（ＥＢ）形成－ＥＢの形成においては、ｈＥＳＣまたはｉＰＳを、上記のように継代し、５８ｍｍのペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に移した。ＥＢを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））、１０％ノックアウト血清代替物（ＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸ストック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））を補充した８０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））からなる培地中で成長させた。１０～１４日齢ＥＢを、ＲＮＡ単離および組織学的検査のために採取した。組織学的分析のため、ＥＢを、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、段階的アルコール（７０％～１００％）で脱水し、パラフィンで包埋した。１～５μｍの切片を、脱パラフィン化し、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。

二次元または三次元培養系上で培養された細胞のＲＴ－ＰＣＲ－全ＲＮＡを、Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））を使用し、製造業者の使用説明書に従い、試験培地中、異種成分不含二次元または三次元培養系上で１０、１５および２０継代成長させたｈＥＳＣまたはｉＰＳ、および（試験培地の存在下、二次元、三次元で成長させた細胞、またはＭＥＦ上で培養した細胞から形成した）１０～１４日齢ＥＢから単離した。ｃＤＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素ＲＮアーゼＨマイナス（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））を使用し、１μｇの全ＲＮＡから合成した。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の変性、その後、９４℃で３０秒間の反復サイクル、３０秒間の表１（下記）に示されるアニーリング温度、および７２℃で３０秒間の伸長を含んだ。ＰＣＲプライマーおよび反応条件を、表１（下記）中に記載する。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いてサイズ分画した。ＤＮＡマーカーを使用し、得られた断片のサイズを確認した。定量ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）においては、試験遺伝子の濃度測定を、ＧＡＰＤＨに正規化した。３回の反復を、各試験系について行った。

二次元で培養された細胞からの奇形腫の形成－６ウェルプレートの４～６個のウェル（各ウェルは１０ｃｍの全表面積を有し、１．５～２．５×１０^６個の細胞を含む）に由来するｈＥＳＣ（Ｈ９．２およびＩ３）およびｉＰＳ（ｉＦ４およびＪ１．２－３）細胞を、採取し、４週齢雄の重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの後肢筋に注射した。注射の１０週間後、得られた奇形腫を、採取し、ＥＢについて記述した場合と同じ方法を用い、組織学的分析のために調製した。

浮遊培養された（三次元培養系）細胞からの奇形腫の形成－４～６つの５８ｍｍの皿（浮遊培養から、各皿は１．５～２．５×１０^６個の細胞を含む）に由来するｈＥＳＣ（Ｈ９．２およびＩ３）およびｉＰＳ（ｉＦ４およびＪ１．２－３）細胞を、採取し、４週齢雄の重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの後肢筋に注射した。注射の１０週間後、得られた奇形腫を、採取し、ＥＢについて記述した場合と同じ方法を用い、組織学的分析のために調製した。

実施例１
人工多能性幹細胞および胚性幹細胞は、異種成分不含、無フィーダー層の二次元培養系上で培養される場合、未分化および多能性状態で維持されうる
下記の実験は、上の「一般的な材料および実験方法」セクションに記載の方法、培養条件および培地に従って培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して行った。

実験結果
異種成分不含、無血清培地および支持層を含まない系を使用する二次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞およびヒトＥＳＣは、ｉＰＳまたはｈＥＳＣに典型的な未分化形態および特性を示す－いくつかの考えられる培地の組み合わせ（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）における、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの無フィーダー層および異種成分不含（動物汚染物質を全く含まない）培養を支持する能力について試験した。すべての試験培地（すなわち、ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）は、ｉＰＳまたはｈＥＳＣの培養を少なくとも１５継代支持するのに適することが見出された。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）合成マトリックスを使用する無フィーダー層条件下で試験培地を使用し、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、未分化増殖、核型安定性および多能性を含むそれらのｉＰＳまたは（ｏｆ）ｈＥＳＣの特徴を維持しながら、少なくとも１５継代連続培養した（データは示さない）。形態学的差異は、試験培養系で成長させたコロニーと、ｙＦ１０培地の存在下、ＭＥＦ上で成長させたコロニーの間で、全く認めることができず、それに応じて、形態学的特徴は、単細胞レベルで不変のままであり、細胞を小さく丸い状態にし、高い核対細胞質比を示し、そこでは１～３つの核小体の存在が顕著であり、典型的な細胞間間隔が認められた（データは示さない）。試験培地（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）のすべての存在下、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ）合成マトリックス上で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、対照培地（ｙＦ１０塩基性培地）の存在下、ＭＥＦ上で成長させた細胞と同様、（対照培地、ＭＥＦ上で成長させたｉＰＳまたはｈＥＳＣと同様の集団倍加時間を示す）１対２、２対３、または１対３に相当する比で、５～７日ごとに定期的に継代した。ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、９０％超に相当する生存速度で、約１００万個の細胞／１０ｃｍ^２に相当する播種効率で継代した。１５％の血清代替物（ＳＲ）および１０％のＤＭＳＯを使用し、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの凍結および解凍に成功した。

動物フリー培地中の二次元培養系で支持層を含まない系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは多能性のマーカーを発現する－霊長動物の未分化ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に典型的ないくつかの表面マーカーを、［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年、１９９６年、１９９８年に記載のように］免疫蛍光染色を用いて試験した。試験培地で少なくとも１５継代培養された細胞は、表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＯｃｔ４に対して強い陽性を示すことが見出された（データは示さない）。他の霊長動物のＥＳＣなどの場合、ＳＳＥＡ３での染色は弱く、ＳＳＥＡ１における染色は陰性であった（データは示さない）。

動物フリー培地中の二次元培養系で支持層を含まない系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、インビトロでＥＢおよびインビボで奇形腫を形成する－試験条件下での長期培養後における細胞の発生能を、胚様体（ＥＢ）の形成により、インビトロで試験した。試験培地（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）の存在下、フィーダー層を含まない培養系下で培養したｉＰＳまたはｈＥＳＣ細胞は、ＭＥＦ上で成長させたＥＳＣによって生成されるＥＢと同様のＥＢを形成した（データは示さない）。例えば、ｉＰＳ細胞がＥＢを形成する能力は、ＨＡ４０／４培地中で２８継代後、またＨＡ７７培地中で２０継代後に示された。これらのＥＢ内部で、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、３つの胚性胚葉に代表的な細胞種に分化した［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－ｅｌｄｏｒら、２０００年］。それらのＳＣＩＤベージュマウスへの注射後、試験条件下で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、３つの胚性胚葉に代表的な細胞種を有する奇形腫を形成したことから（データは示さない）、それらの完全な多能性が示された。例えば、ｉＰＳ細胞が奇形腫を形成する能力は、ｍＨＡ４０／４培地中で３１継代後、ＨＡ７４／１培地中で２４継代後、またＨＡ７７培地中で１６継代後に示された。

実施例２
人工多能性幹細胞および胚性幹細胞は、異種成分不含および無血清培地の存在下、異種成分不含フィーダー層上で培養される場合、未分化および多能性状態で維持されうる
下記の実験は、上の「一般的な材料および実験方法」セクションに記載の方法、培養条件および培地に従って培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して行った。

実験結果
異種成分不含、無血清培地および異種成分不含フィーダー細胞層を使用する二次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、ｉＰＳまたはｈＥＳＣに典型的な未分化形態および特性を示す－いくつかの考えられる培地の組み合わせ（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）における、ｉＰＳまたはｈＥＳＣの、フィーダー細胞層として包皮線維芽細胞を使用する異種成分不含（動物汚染物質を全く含まない）培養を支持する能力について試験した。すべての試験培地は、ｉＰＳまたはｈＥＳＣの培養を支持するのに適することが見出された。支持層として包皮線維芽細胞を用いる異種成分不含条件下で試験培地を使用し、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、未分化増殖（図１Ａ～Ｃ、データは示さない）、核型安定性および多能性を含むそれらのｉＰＳまたはｈＥＳＣの特徴を維持しながら、少なくとも２２継代連続培養した。形態学的差異は、試験培養系で成長させたコロニーと、対照ｙＦ１０培地の存在下、ＭＥＦ上で成長させたコロニーの間で、全く認めることができず、それに応じて、形態学的特徴は、単細胞レベルで不変のままであり、細胞を小さく丸い状態にし、高い核対細胞質比を示し、そこでは１～３つの核小体の存在が顕著であり、典型的な細胞間間隔が認められた（データは示さない）。試験培地（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）のすべての存在下、包皮線維芽細胞フィーダー細胞上で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、ＭＥＦ上で成長させた細胞と同様、（対照ｙＦ１０培地の存在下、ＭＥＦ上で成長させたｉＰＳまたはｈＥＳＣと同様の集団倍加時間を示す）１対２、２対３、または１対３に相当する比で、５～７日ごとに定期的に継代した。ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、９０％超に相当する生存速度とともに、約１００万個の細胞／１０ｃｍ^２に相当する播種効率で継代した。１５％の血清代替物（ＳＲ）および１０％のＤＭＳＯを使用し、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの凍結および解凍に成功した。

動物フリー培地および異種成分不含支持層の二次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは多能性のマーカーを発現する－霊長動物の未分化ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に典型的ないくつかの表面マーカーを、［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年、１９９６年、１９９８年に記載のように］免疫蛍光染色を用いて試験した。試験培地で少なくとも１５継代培養された細胞は、表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＯｃｔ４に対して強い陽性を示すことが見出された（図２Ａ～Ｃ）。他の霊長動物のＥＳＣなどの場合、ＳＳＥＡ３での染色は弱く、ＳＳＥＡ１における染色は陰性であった（データは示さない）。

動物フリー培地および異種成分不含フィーダー層の二次元培養系上で培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、インビトロでＥＢおよびインビボで奇形腫を形成する－試験条件下での長期培養後における細胞の発生能を、胚様体（ＥＢ）の形成により、インビトロで試験した。試験培地（ＨＡ７４／１、ＨＡ７５、ＨＡ７６、ＨＡ７７、ＨＡ７８、ＨＡ４０／４）の存在下、異種成分不含フィーダー細胞層（包皮線維芽細胞）下で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、ｙＦ１０対照培地の存在下、ＭＥＦ上で成長させたＥＳＣによって生成されるＥＢと同様のＥＢを形成した（データは示さない）。これらのＥＢ内部で、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、３つの胚性胚葉に代表的な細胞種に分化した［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ－ｅｌｄｏｒら、２０００年］。それらのＳＣＩＤベージュマウスへの注射後、試験条件下で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、３つの胚性胚葉に代表的な細胞種を有する奇形腫を形成する（データは示さない）ことから、それらの完全な多能性が示される。

実施例３
本発明の異種成分不含培地上での胚性幹細胞系の誘導
透明帯のタイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））による消化後、全胚盤胞を、（重炭酸ナトリウムを含有しない以外では）ＨＡ４０／４培地の存在下の、有糸分裂的に不活性化されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上に置く。最初に、細胞を、インスリン注射器（ＢＤ ｐｌａｓｔｉｐａｋ、カタログ番号３０００１３）を使用し、機械的に継代し、４継代後、細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｓａｎ Ｄｉａｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））を使用し、４～６日ごとに継代した。得られたヒトＥＳＣ系を、「ＷＣ１」と称した。

実施例４
人工多能性幹細胞および胚性幹細胞は、静的浮遊培養下、未分化および多能性状態で維持されうる
ｉＰＳ細胞の浮遊培養は、特に、細胞および組織移植のため、大量の細胞を得ることを意図する場合、従来の培養よりも有意な利点を有する。

下記の実験は、上の「一般的な材料および実験方法」セクションに記載の方法、培養条件および培地に従って培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して行った。

実験結果
ｉＰＳ細胞は浮遊培養下、未分化状態で維持されうる－ＭＥＦまたは無フィーダー層条件下［Ａｍｉｔら、２００４年］で成長させたｉＰＳ細胞（Ｊ１．２－３およびｉＦ４細胞系）を、浮遊培養下で置いた。ｉＰＳ細胞は、（４ｎｇ／ｍｌもしくは１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、かつ３０００単位／ｍｌのＬＩＦを補充した）試験培地ＣＭ１００Ｆ、ＣＭ１００Ｆｐ、ｙＦＬ３、またはｙＦ１００での浮遊培養下で２４時間後、球状塊または皿様構造をもたらし、それを少なくとも２０継代維持した（図３Ａ～Ｃ、データは示さない）。少なくとも１０継代浮遊培養したｉＰＳの組織学的評価によると、大きい核を有する小細胞の均質集団が示された。球状物が、成長し、５～７日ごとにその形態を維持しながら機械的に分割され、浮遊培養物の増殖が可能になった。あるいは、浮遊細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡおよびＲＯＣＫ阻害剤治療を用いることにより、単細胞に解離でき、さらに同じ形態および特徴の球状物を形成し、それによって効率的な細胞増殖が可能になった。一部の培養は、５０継代を超える期間（１年にわたる連続培養）行った。本明細書中に記載のように試験培地で浮遊培養した２つの異なるｉＰＳ細胞系Ｊ１．２－３およびｉＦ４は、同様の挙動と球状の形態および組織を示した。

ｙＦ１００培地（１０ｎｇ／ｍｌではなく１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むｙＦ１０塩基性培地）、ＣＭ１００ＦｐおよびｙＦＬ３（１０ｎｇ／ｍｌではなく４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含み、３０００単位／ｍｌのＬＩＦを補充したｙＦ１０塩基性培地）は、浮遊培養下で、ヒトＥＳＣの増殖性、未分化および多能性状態での成長を支持することが見出された。

浮遊培養し、二次元培養系上で再培養したｉＰＳ細胞は、典型的なｉＰＳ細胞コロニー形態を維持する－懸濁液中で少なくとも１０継代後、ＭＥＦまたはフィブロネクチン表面での二次元培養に戻した時、球状塊全部がＭＥＦまたはフィブロネクチン表面に接着し、２４～４８時間後、典型的なｉＰＳ細胞コロニー形態を示し、高い核対細胞質比を示し、そこでは１～３つの核小体の存在が顕著であり、典型的な細胞間間隔が認められた（図４）。

ｉＰＳ細胞は、浮遊培養（三次元培養）下で培養されながら、その未分化幹細胞表現型を維持する－霊長動物の未分化ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に典型的ないくつかの表面マーカーを、［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、２００４年；Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００５年に記載のように］免疫蛍光染色を用いて試験した。試験培地で少なくとも３０継代浮遊培養したヒトｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＯｃｔ４に対して強い陽性を示すことが見出された（図５Ａ～Ｃ）。他の霊長動物のＥＳＣ［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年および１９９６年］およびＭＥＦとともに培養したＥＳＣと同様、ＳＳＥＡ３での染色は弱く、ＳＳＥＡ１に対して陰性であった（データは示さない）。幹細胞マーカーに対する染色は、浮遊培養した細胞を、ＭＥＦを有する二次元培養に戻した時、高いままであった（データは示さない）。ＲＴ－ＰＣＲ分析によると、ＭＥＦとともに培養した細胞と同様、少なくとも１０継代浮遊培養したｉＰＳ細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、およびＦＧＦ４を含む、多能性の遺伝子マーカーを発現する［Ｋｉｎｇら、２００６年］ことが示された（データは示さない）。浮遊培養したｉＰＳ細胞間で、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、およびＦＧＦ４の遺伝子発現において検出された差異は、ＭＥＦ上で培養したｉＰＳ細胞の場合に比べて、全く有意でなく、また、連続的な浮遊培養後、ＭＥＦとともに再培養したｉＰＳ細胞の場合でも、同じ条件下のｈＥＳＣと同様、全く有意でなかった。

浮遊培養されたｉＰＳ細胞は正常な核型を維持する－Ｇｉｅｍｓａバンディングによる核型分析を、懸濁液中で３０継代後の細胞上で行い、細胞は、正常な４６、ＸＹ核型を示すことが見出された（データは示さない）。したがって、懸濁細胞培養物の核型は、安定なままであった。

浮遊培養されたｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、インビトロでその多能性を維持する－ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、試験培地での浮遊培養下で長期増殖後、インビトロでのＥＢの形成によって示されたように、その多能性分化能力を維持した。２０継代を超える期間、浮遊培養したｈＥＳＣまたはｉＰＳ細胞を、成長因子の添加を伴わない血清含有培地に移した時、嚢胞性ＥＢの形成が７～１０日後に認められ、それは培養下で１０日後にｈＥＳＣから形成される空洞化された（ｃａｖｉｔａｔｅｄ）ＥＢ［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚら、２０００年］、および１４～２０日後の嚢胞性ＥＢと同様であった。ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣから形成されたＥＢ内部に、ｉＰＳ細胞分化に典型的な３つの胚性胚葉に代表的な細胞種が認められた（データは示さない）。

例えば、ｉＰＳ細胞がＥＢを形成する能力は、浮遊培養下、ＣＭ１００ｐ培地の存在下で２２継代後に示され、ＥＢを形成する能力は、浮遊培養下、ｙＦ１００培地の存在下で２３継代後に示され、ＥＢを形成する能力は、浮遊培養下、ｙＦＬ３培地の存在下で８継代後に示された。

浮遊培養したｉＰＳ細胞はインビボでその多能性を維持する－懸濁したｉＰＳ細胞の多能性は、インビボで奇形腫の形成によってさらに示された。少なくとも２０継代浮遊培養した細胞を、ＳＣＩＤベージュマウスに注射し、１０週間後、腫瘍が形成された（データは示さない）。これらの奇形腫内部に、３つの胚葉に代表的な組織が認められた。

例えば、ｉＰＳ細胞が奇形腫を形成する能力は、浮遊培養下、ＣＭ１００中で２０継代後に示され、奇形腫を形成する能力は、浮遊培養下、ｙＦＬ３中で１０継代後に示された。

実施例５
人工多能性幹細胞および胚性幹細胞は、動的浮遊培養下、未分化および多能性状態で維持されうる
下記の実験は、上の「一般的な材料および実験方法」セクションに記載の方法、培養条件および培地に従って培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを使用して行った。

実験結果
振とう浮遊培養下で培養されるｉＰＳ細胞は、その未分化状態を維持する－系Ｊ１．２－３由来のｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣを、試験培地を使用し、スピナーフラスコ内で少なくとも１か月間浮遊培養した。１か月後の実験によると、細胞によって形成された球状塊の形態学的特性が、ｉＰＳ細胞がペトリ皿内で静的に培養される場合に認められる場合と同様のままであることが示された（データは示さない）。さらに、ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ－４、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－１－６０およびＳＳＥＡ４などの未分化ｈＥＳＣのマーカーを高度に発現した（図６Ａ～Ｄ）。塊中のｉＰＳ細胞は、ＭＥＦ上での再培養時、再付着し、ｉＰＳ細胞に典型的なコロニーを再び形成した（データは示さない）。スピナーフラスコ内で１か月培養した細胞の核型は、正常であることが見出された（データは示さない）。

動的浮遊培養下で培養されるｉＰＳ細胞は正常な核型を維持する－（試験培地の存在下で）静的浮遊培養下で３０継代、次いで（試験培地の存在下で）動的（スピナー）浮遊培養下で３継代培養したＩＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、正常な４６、ＸＹ核型を示すことが見出された。したがって、懸濁したｉＰＳ細胞培養物の核型は、安定なままであった。

動的浮遊培養下で培養されるｉＰＳ細胞または（ｏｆ）ｈＥＳＣは、インビトロでその多能性を維持する－動的浮遊培養下で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの発生能を、インビトロでＥＢの形成によって試験した。ｈＥＳＣまたはｉＰＳを、静的浮遊培養下で２０継代を超える期間、次いで動的浮遊培養下で少なくともさらに１０継代培養し、次いで成長因子の添加を伴わない血清含有培地に移すことで、嚢胞性ＥＢの形成が７～１０日後に認められ、それは培養下で１０日後にｈＥＳＣから形成される空洞化されたＥＢ［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚら、２０００年］、および１４～２０日後の嚢胞性ＥＢと同様であった。ｈＥＳＣまたはｉＰＳ細胞から形成されたＥＢ内部に、ｉＰＳ細胞分化に典型的な３つの胚性胚葉に代表的な細胞種が認められた（データは示さない）。

動的浮遊培養下で培養されるｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣは、インビボでその多能性を維持する－動的浮遊培養下で培養したｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの多能性を、インビボで奇形腫の形成によって実証した。細胞を、静的浮遊培養下で少なくとも２０継代、次いで動的浮遊培養下でさらに１０継代培養し、次いでＳＣＩＤベージュマウスに注射した。マウスへの注射の１０週間後、腫瘍が形成された。これらの奇形腫内部に、３つの胚葉に代表的な組織が認められた（データは示さない）。

この試験は、限定された二次元培養系または浮遊培養系のいずれかを使用し、未分化ｉＰＳ細胞またはヒトＥＳＣを培養するための新規のアプローチを提示する。本発明者らは、これらの条件下で、２つのｉＰＳ細胞系（成体線維芽細胞由来のものと包皮線維芽細胞由来のもの）が、多能性および安定な核型を含むそれらの特徴を維持しながら、多くの継代を通じて成長・増殖されうることを示している。ｉＰＳ細胞を、分化培地（例えば、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸ストックを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）の存在下で懸濁液に移す場合、それらは胚様体（ＥＢ）を自発的に形成する。他方では、（例えば、ＣＭ１００Ｆ、ＣＭ１００Ｆｐ、ｙＦ１００またはｙＦＬ３培地の存在下での）試験培養系を使用すると、ｉＰＳ細胞は、未分化細胞からなる球状物を自発的に形成する。

これは、三次元の振とう浮遊培養下での、未分化ｉＰＳの連続増殖のための方法の第１の説明であり、大規模な細胞生成に十分に適用可能であると思われる。

本発明者らは、無血清培地および限定された成長因子に基づく、未分化ｉＰＳの増殖のための浮遊培養系を初めて提示している。この浮遊培養系では、ペトリ皿、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコ、またはスピナーフラスコのいずれかを使用する。成体皮膚および新生児包皮線維芽細胞に由来する２つのｉＰＳ細胞系を、本発明の新規の方法に従い、２５継代（８６倍加）を超える長期培養後に、安定な核型および多能性を含む、あらゆる典型的なＥＳＣ／ｉＰＳ細胞の特徴を維持する小球状物として培養した。これらの結果は、ｉＰＳ細胞を、三次元培養を用いてフィーダー層を有しない限定培地中で培養することが可能であることを示している。

さらに、動的系上に１か月適用される場合、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞の双方の細胞塊の数は、細胞に固有の特性を維持しながら、数倍に増加した。これらの結果によると、ｉＰＳ細胞またはｈＥＳＣの双方の三次元でのルーチン培養、および治療目的でのｉＰＳ細胞およびｈＥＳＣの大量作製に適した提示される浮遊培養系が示される。

本発明の教示により、スケーラブルで再現可能な制御される培養系が示される。これらの結果によると、臨床および工業用途の双方にとって必要とされる未分化ｉＰＳ細胞およびｈＥＳＣの大規模培養に対する促進者の（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）方法を得るという所望された最終目標に向けての著しい進歩が示される。

本発明は、その特定の実施形態との関連で記載されているが、多くの代替、修飾および変形が、当業者に理解されることは自明である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲の範囲内に含まれるあらゆるかかる代替、修飾および変形を包含することが意図される。

本願中に記述されるすべての出版物、特許および特許出願は、あたかも、各個別の出版物、特許または特許出願が、参照により本明細書中に援用されるべきものとして特別かつ個別に示される場合と同程度に、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。さらに、本願中での一切の参考文献の言及または確認は、かかる参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。それらは、セクション見出しが使用される程度まで、必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。

参考文献
（追加的な参考文献が本文中で言及される）
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配列番号１～３０は、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３６は、ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラタンパク質の配列である。

Claims (9)

1. 多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法であって、約５０～２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および血清代替物を含む無血清の培地中で、基質接着及びフィーダー細胞ならし培地を有さない浮遊培養下で前記多能性幹細胞を少なくとも５継代にわたって培養して、前記多能性幹細胞を前記未分化状態で増殖・維持するステップを含み、前記培地は、前記浮遊培養下で多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有する、方法。
2. 前記培地が、無フィーダー、マトリックス不含およびタンパク質担体不含である、請求項１に記載の方法。
3. 前記培地が、動物汚染物質を含まない、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ｂＦＧＦの濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
8. 胚様体を多能性幹細胞から生成する方法であって、
   （ａ）前記多能性幹細胞を、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、
   （ｂ）前記増殖された未分化多能性幹細胞を、前記幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置いて、前記胚様体を前記多能性幹細胞から生成するステップと、
   を含む方法。
9. 系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法であって、
   （ａ）前記多能性幹細胞を、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、
   （ｂ）前記増殖された未分化多能性幹細胞を、前記増殖された未分化幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップと、
   （ｃ）前記胚様体の細胞を、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置いて、前記系統特異的細胞を前記多能性幹細胞から生成するステップと、
   を含む方法。