CN101189329A - 无限繁殖化饲养细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无限繁殖化饲养细胞系。该无限繁殖化饲养细胞系可由胚胎成纤维细胞获得，所述成纤维细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。本发明还提供包含在合适培养基中的本发明无限繁殖化饲养细胞系的培养物，该培养物是一组合物，其中包含处于合适载体或稀释剂中的本发明无限繁殖化饲养细胞系和通过培养本发明无限繁殖化饲养细胞系产生的条件培养基。本发明还提供培养干细胞的方法以及由此获得的细胞，所述方法包括使用本发明的细胞系和条件培养基。

Description

无限繁殖化饲养细胞
技术领域
本发明涉及无限繁殖化饲养细胞系，其培养基，以及这些细胞及其培养基在干细胞尤其是人胚胎干细胞培养中的应用。
背景技术
由于已经自着床前胚泡的胚内细胞团成功分离得到人胚胎干细胞(hESC)，现在已经有可能体外无限培养未分化hESC，并可由此提供能够分化为三种胚层细胞的起始原料，从而用于生殖治疗[1]。按常规，直接在作为共培养物的饲养细胞层上维持hESC，这些饲养细胞来自小鼠或人[2-7]。近年来，已可在无饲养细胞的条件下培养hESC。在此，在胞外基质(如基质胶(Matrigel))上培养细胞，所述胞外基质添加了饲养细胞层产生的条件培养基(CM)[8，9]。不论物种来源如何，饲养细胞来自初生组织(primary tissue)，因而在培养物中寿命有限。例如，原代饲养细胞只可培养7-9代，然后就衰老了。因此，必须日常不断制备新鲜饲养细胞，这可能造成批次间差异。而且，还存在病原体可能由饲养细胞传递给hESC的问题。
要获得持续、可靠且稳定的饲养细胞来源以用于hESC培养(尤其是大规模培养)，一种可能的方法是将原代饲养细胞无限繁殖化。现有技术曾用多种方法进行了无限繁殖化，其中包括用来自诸如猿病毒40(SV40)、EB病毒(EBV)和人乳头瘤病毒(HPV)等DNA肿瘤病毒的基因转导正常细胞[10-14]。近年来，有研究组报道，人端粒酶逆转录酶(hTERT)过度表达也能够延长体细胞或已分化细胞的寿命[15，16]。
发明详述
第一，本发明提供无限繁殖化饲养细胞系。进一步地说，本发明提供由胚胎成纤维细胞获得的无限繁殖饲养细胞系。更进一步说，本发明的无限繁殖化饲养细胞是由小鼠胚胎成纤维细胞获得的。更进一步说，所述无限繁殖化饲养细胞系是通过一种或多种以下手段由小鼠胚胎成纤维细胞获得的：p53肿瘤抑制蛋白降解，c-myc表达上调，端粒酶活化和pRb降解。更进一步说，所述无限繁殖化饲养细胞系是通过导入HPV16的E6和E7基因由小鼠胚胎成纤维细胞获得的。较好的是通过转导导入E6和E7基因。较好的是用编码HPV16的E6和E7基因的逆转录病毒载体感染胚胎成纤维细胞。较好的是，在被逆转录病毒感染后，细胞群持续繁殖，超过其正常寿命，并且耐受G418抗生素选择。较好的是，经无限繁殖化后的细胞系不会转化为肿瘤细胞。较好的是，在体内，即使将这些细胞肌肉内注射入SCID，长达16周后也不会产生任何明显的肿瘤。
本发明细胞系可繁殖7代、8代或9代以上。本发明的优选细胞系体外繁殖超过70代，且不染上任何致瘤表型。本发明细胞系支持hESC，所述hESC不论是与饲养细胞共培养还是培养在添加了CM的无饲养细胞培养基中，继续保持其特征性未分化形态超过40代；所述hESC持续表达多能标记Oct-4、SSEZ-4、Tar-1-60、Tar-1-81、碱性磷酸酶，并保持正常核型；并且，在注射给SCID小鼠后，所述hESC与三种胚层的代表性组织形成畸胎瘤。
本发明细胞系支持未分化hESC的生长。HESC细胞系很容易适应这些饲养细胞，并在饲养细胞培养基或无饲养细胞培养基中都保持了典型的未分化hESC培养物形态。这些hESC还持续表达包括Oct-4、SSEZ-4、Tar-1-60、Tar-1-81、碱性磷酸酶在内的多能标记。较好的是，25代后，这些细胞仍具有稳定的核型，并能够在SDID小鼠中分化形成畸胎瘤。较好的是，对hESC无饲养细胞培养物进行的mRNA RT-PCR分析证实：这些细胞保持Oct-4阳性，而E6和E7抗原阴性。
本发明提供通过E6和E7抗原过度表达而无限繁殖化的原代MEF。优选实施方式之一中，所述细胞系是本发明所述的ΔE-MEF。细胞系ΔE-MEF依照关于国际公认的用于专利申请目的的微生物保藏布达佩斯条约保藏于美国典型培养物保藏中心。保藏日为2005年5月9日，保藏号为PTA-6705。
本发明还提供保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-6705的无限繁殖饲养细胞系。
本发明还提供包含于合适培养基中的作为前文第一项内容所述无限繁殖饲养细胞系的培养物，以及包含第一项内容所述无限繁殖饲养细胞系的组合物，所述无限繁殖饲养细胞系包含于合适的载体或稀释剂中。
第二，本发明的内容是提供第一项内容所述无限繁殖饲养细胞系生长产生的条件培养基。
所述条件培养基可与胞外基质例如基质胶连用。
第三，本发明提供培养干细胞的方法，其中使用第一项内容所述细胞系作为饲养细胞。较好的是，所述干细胞是人干细胞。更好的是，所述干细胞是人胚胎干细胞。
第四，本发明提供培养干细胞的方法，其中采用了第二项内容所述的条件培养基。较好的是，所述干细胞是人干细胞。更好的是，所述干细胞是人胚胎干细胞。
第三、第四项内容所述的方法包括在培养容器例如细胞工厂中放大未分化hESC的数量。所述放大的数量可达＞108个细胞。
第五，本发明提供用本发明第三或第四项内容所述方法培养的干细胞。较好的是，所述干细胞是人干细胞。更好的是，所述干细胞是人胚胎干细胞。
人胚胎干细胞(hESC)是多能干细胞，具有在培养物中无限繁殖且同时保留其分化为多种不同类型细胞的潜能。然而，hESC培养物必需有与之直接接触的饲养细胞或饲养细胞产生的条件培养基(CM)。饲养细胞的最常用来源是小鼠原代胚胎成纤维细胞(MEF)。
本项研究中，我们考察了在体外用编码HPV16 E6和E7基因的逆转录病毒载体感染后是否能延续原代MEF的繁殖能力直至超出其正常寿命。E6蛋白过度表达造成p53肿瘤抑制蛋白降解，并上调c-myc表达和激活端粒酶[17]。另一方面，表达的E7蛋白与视网膜母细胞瘤蛋白pRb结合，从而导致pRb降解[18]。已证明，E6和E7的表达都能够有效地使正常的人成纤维细胞、哺乳动物上皮细胞和包皮角质形成细胞无限繁殖[11，19，20]。在此，我们通过E6和E7抗原过度表达成功实现了原代MEF的无限繁殖化。所得无限繁殖MEF、ΔE-MEF在体外持续繁殖70代以上，且不染上任何致瘤表型。此外，此前以原代MEF(饲养细胞或无饲养细胞条件)培养的3种hESC细胞系很容易适应ΔE-MEF。
在形态学上，这些hESC维持未分化形态，并持续表达多能干细胞特征性胞内标记和胞外标记。hESC培养物还保持了正常的核型，并在SCID小鼠模型中形成畸胎瘤。
本项研究中，我们通过编码HPV 16的E6和E7基因的逆转录病毒载体感染实现了原代MEF的无限繁殖。所得无限繁殖细胞系ΔE-MEF能够繁殖7-9代以上(此时，原代细胞已衰老)，寿命延续超过70代。当测试其支持hESC生长的能力时发现，不论是在与ΔE-MEF的共培养物中还是在添加了ΔE-MEF产生的CM的无饲养细胞培养物中，＞40代的hESC保持了特征性未分化形态。所述培养物还持续表达多能干细胞标记Oct-4、SSEZ-4、Tar-1-60、Tar-1-81、碱性磷酸酶，并保持正常核型。此外，注射给SCID小鼠后，所述hESC与三种胚层的代表性组织形成畸胎瘤。最后，研究还显示，将ΔE-MEF用于培养容器例如细胞工厂可能实现非分化hESC的扩大培养(放大至＞108细胞)。研究结果表明，无限繁殖饲养细胞可提供稳定且可再现的饲养细胞来源以用于hESC扩增和研究，因而优于原代饲养细胞。
在形态学上，这些hESC维持未分化形态，并持续表达多能干细胞特征性胞内标记和胞外标记。hESC培养物还保持了正常的核型，并在SCID小鼠模型中形成畸胎瘤。
附图简述
图1：原代EMF的无限繁殖化。(a)：感染了表达E6/E7的逆转录病毒的MEF(ΔE-MEF)其第7代(□)和第45代(Δ)的生长曲线，或感染对照逆转录病毒的MEF(ΔC-MEF)其第7代(■)的生长曲线。每日采集培养物样本，用台盼蓝排除法测定细胞数。(b)：RT-PCR分析E6/E7感染细胞(ΔE-MEF，第2和第4泳道)和对照病毒感染细胞(ΔC-MEF，第1和第3泳道)内HPV-E6基因和HPV-E7基因表达。用1％琼脂糖凝胶分辨扩增产物。MW，100-bp DNA阶梯试剂盒(Promega)。
图2：hESC细胞系：直接在ΔE-MEF上培养的HES-3细胞(左图)或在添加了ΔE-MEF产生的条件培养基的Matrigel上培养的HES-3细胞(右图)的形态。使用立体显微镜下放大40倍(a和b，比例条＝400μm)和相差显微镜下放大40倍(c和d，比例条＝300μm)和放大100倍(e，比例条＝100μm)的代表性菌落图像。
图3：饲养细胞上的hESC细胞系(a-d)或无饲养细胞(e-g)培养物中hESC细胞系的胞内Oct-4流式细胞计数分析。将hESC单细胞悬液固定，透化，用抗Oct-4的单克隆抗体染色。用FICT-偶联抗小鼠抗体检测被标记细胞。阴影区代表阴性对照染色，空白区代表Oct-4mAb染色。
图4：与ΔE-MEF共培养(上图)或用ΔE-MEF产生的CM培养(下图)的HES-3上细胞表面标记的表达。细胞用SSEA-4(a，e)、Tra-1-60(b，f)、Tra-1-81(c，g)和碱性磷酸酶(d，h)染色。对于SSEA-4和Tra-1-60/81，菌落再用偶联了PE的第二抗体染色。就AP而言，用罗丹明滤光镜观察到发荧光的红色沉淀说明活性检测为阳性。比例条＝100μm。
图5：在添加ΔE-MEF产生的CM的无饲养细胞条件下传代14代(70PD)的HES-3细胞形成的畸胎瘤的切片。肠样上皮细胞(a)、神经上皮细胞(b)、肌肉(c)、软骨(d)和骨(e)。比例条＝20μm。
图6：用饲养细胞培养(a)和在无饲养细胞条件下培养(b)的未分化HES-3细胞的细胞遗传学分析。在两种培养物的hESC中都看到了正常的雌性核型(46XX)。
图7：RT-PCR分析ΔE-MEF(a)和HES-3无饲养细胞培养物(b)中HPV-E6、HPV-E7、Oct-4和β-肌动蛋白的表达。用1％琼脂糖凝胶分辨RT-PCR的扩增产物。
图8：流式细胞计数分析用三颈烧瓶(a)和细胞工厂(b)以ΔE-MEF放大培养的HES-3细胞的胞内Oct-4。阴影区代表阴性对照染色，空白区代表Oct-4mAb染色。
本发明的最佳实施方式
材料与方法
细胞培养
人胚胎干细胞系HES-2(46X，X)、HES-3(46X，X)和HES-(46X，Y)获自ES CellInternational。37℃/5％CO2，在明胶包覆的器官培养皿中用丝裂霉素-C灭活的饲养细胞(～4×104细胞/cm2)(共培养物)或用添加了饲养细胞产生的CM的基质胶包覆器官培养皿(无饲养细胞培养物)培养这些细胞。用于培养hESC的培养基是KNOCKOUT(KO)培养基，含85％KO-DMEM(添加15％KO血清替代物、1mM L-谷胺酰胺、1％非必需氨基酸和0.1mM 2-巯基乙醇)和4-8ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)。每日更换培养基，每周进行培养物传代，传代前先按照现有技术所述进行酶处理[4]。在无饲养细胞培养物的培养皿中加入基质胶(Becton Dickinson)的冷KO-DMEM稀释液(稀释度1∶30)于40℃培养过夜。
MEF和MEF条件培养基(CM)的制备
用Robertson等[21]所述的方法自129×1/SvJ小鼠(交配后13.5天)胚胎分离原代MEF。将单层原代MEF(第4代)培养至铺满，用10μg/ml丝裂霉素-C处理2.5-3小时。处理后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA剥离细胞，然后接种到前述器官培养皿的F-DMEM培养基上。F-DMEM培养基的组成为90％DMEM高浓葡萄糖、10％FBS、2mM L-谷胺酰胺、25U/ml青霉素和25μg/ml链霉素(Invitrogen)。接种后24小时，将培养基换成KO培养基，平衡24小时后加入hESC或收集MEF-CM。对于MEF-CM，在培养皿上按1.4×105细胞/cm2的密度接种经丝裂霉素-C处理的MEF，加入KO培养基后每过24小时收集一次CM。过滤CM(0.22μm)，再添加8ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)。
无限繁殖化饲养细胞系ΔE-MEF的建立
将原代MEM的第3代(3×105细胞)接种到75cm2T型烧瓶中，在F-DMEM培养基中贴壁过夜。然后，在8μg/ml聚凝胺(Polybrene)(Sigma-Aldrich)存在下，37℃，用含有PA317 LXSN HPV16E6E7或PA317 PXSN包装细胞系(分别为CRL-2203和CRL-2202，ATCC)的逆转录病毒的除菌过滤上清液转导细胞8小时[22]。此后，除去含病毒培养基，换以新鲜F-DMEM，继续培养3天。转导细胞在100μg/ml的G418(Sigma-Aldrich)中选择14天。建成的饲养细胞系ΔE-MEF在不加抗生素的F-DMEM培养基中常规培养，储备物则冷冻保存于90％FBS和10％DMSO中。
生长速度和倍增时间
每日(接种后1-6天)在用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)处理后采集MEF单细胞悬液和hESC单细胞悬液。用台盼蓝排除法测定每份样本的活细胞数和生存力。绘制活细胞数-时间图以估算指数生长期的比生长速度。据此，用公式td＝ln(2)/μ计算倍增时间(td)，μ为比生长速度(小时-1)。
Oct-4表达的流式细胞计数分析
采用流式细胞术和免疫荧光方法估测hESC细胞群的胞内转录因子Oct-4的表达水平。用胰蛋白酶采集单细胞悬液，将细胞固定、透化(CaltagLaboratories)，并与1∶20稀释的小鼠抗Oct-4单克隆抗体(Santa Cruz)一起培养。然后，用1％BSA/PBS洗涤细胞，与1∶500稀释的偶联了FITC的山羊α-小鼠抗体(DAKO)避光培养。培养后，再次洗涤细胞，将细胞重悬在1％BSA/PBS中用于FACScan分析(Becton Dickinson FACS Calibur)。所有培养都在室温下进行15分钟。用适当的同种型对照进行细胞染色，作为阴性对照。
免疫细胞化学
室温下，在4％多聚甲醛中固定细胞45分钟，并抗SSEA-4抗体(纯，Development Studies Hybridomas Bank)、Tra-1-60抗体和Tra-1-81抗体(30μg/ml，Chemicon)在室温下培养1小时。用FITC-偶联山羊α-小鼠抗体(1∶500稀释，DAKO)显示抗体定位。
碱性磷酸酶染色
用Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒I(Vector Laboratory)，按照制造商说明书进行碱性磷酸酶染色。简而言之，用PBS洗涤hESC一次，然后与VectorRed底物工作溶液在室温下避光培养45分钟。用罗丹明激发和发射滤光镜观测反应产物。
RNA分离和逆转录PCR(RT-PCR)
用Macherey Nagel的NucleoSpin RNA II试剂盒自hESC和MEF分离总RNA，用紫外分光光度法定量。用1μg总RNA进行标准逆转录反应，采用寡聚dT引物和ImProm II逆转录酶(Promega)。用Oct-4、β-肌动蛋白、HPV 16E6和HPV 16E7的特异性引物(表1)进行PCR。扩增循环参数为：30轮循环，每轮包括95℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟。此后是72℃10分钟的最后延长。在1％琼脂糖凝胶上观测扩增产物，用溴乙锭染色。
SCID小鼠模型
ΔMEF和hESC经酶处理后，用22号无菌针头将约4.5×106细胞后腿肌肉注射给四周龄SCID小雄鼠。挑出现肿瘤(注射后约9-10周)的小鼠杀死，摘取肿瘤，用10％福尔马林固定。将肿瘤苏木精-伊红染色(Hematoxylin&eosinstaining)后制成石蜡切片进行组织学检查。
核型
由NUS妇产科系的细胞遗传实验室或KK妇女儿童医院进行核型分析。
hESC共培养物的扩大培养
为了进行hESC的扩大培养，在组织培养瓶(T75，75cm2)、三颈烧瓶(TF，500cm2)和细胞工厂(CF，632cm2)(Nunc)上进行共培养物的扩增。培养条件与前文所述相近。将丝裂霉素-C灭活的饲养细胞接种到明胶化培养表面，每个表面的接种密度都是4×104细胞/cm2。为了进行传代，用磷酸盐缓冲液+(PBS+)洗涤细胞，然后室温下与0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)培养2-3分钟。轻轻拍打，使细胞与培养瓶脱离，然后通过反复抽吸将其分散成小块。接着，中和掉胰蛋白酶，按1∶3的接种比将细胞小块接种到已种有灭活饲养细胞的新的明胶化培养皿中。
结果
无限繁殖化MEF的建立和鉴定
用同时编码HPV 16-E6、HPV 16-E7和新霉素抗性的逆转录病毒感染原代MEF的第3代(ΔE-MEF)。用仅含新霉素抗性的对照逆转录病毒感染细胞作为阴性对照(ΔC-MEF)。感染后传过4代后(感染后约12天，P7)，ΔE-MEF持续繁殖(图1a)，倍增时间约为19.7小时。而且，ΔE-MEF的生长速度和倍增时间与原代MEF的第4代相当(表2)。相反，对照病毒感染的细胞(ΔC-MEF)在第7代表现出衰老迹象，因为在相同的6日期间内，活细胞数没有明显增加(图1a)。45代后(群体倍增数为165)，ΔE-MEF保持着近似于第7代的生长动力学特征(图1a)，目前已培养超过70代，繁殖能力仍未下降(数据未显示)。分离了第7代ΔE-MEF和ΔC-MEF的RNA，用RT-PCR检测逆转录病毒感染所导入的E6和E7基因的表达。由图1b看，ΔE-MEF中E6和E7两基因的mRNA表达明显(分别为泳道2和4)，但在对照病毒感染的ΔC-MEF中未检到表达(泳道1和3)。
为了确定ΔE-MEF是否会形成肿瘤，在用E6和E7无限繁殖化后，取5×106细胞注射给SCID小鼠。对小鼠进行定期检查，细胞注射16周后仍未检出明显肿瘤(数据未显示)。
在饲养细胞条件和无饲养细胞条件下使用无限繁殖MEF的hESC的生长和形态
将人ES细胞系HES-3直接常规培养在原代MEF上(共培养物)或常规培养在添加了原代MEF培养物产生的条件培养基的基质胶上(无饲养细胞)。为了判定无限繁殖MEF细胞系ΔE-MEF是否能够支持hESC细胞的非分化生长，将HES-3接种于相应的培养条件，但以ΔE-MEF取代原代MEF。
为制备共培养物，接种到ΔE-MEF上的HES-3细胞块扩增并形成菌落而将饲养细胞推开。由此形成成纤维细胞包围菌落的十分清晰的菌落边界(图2a和2c)。在形态学上，菌落内的hESC保持着高度的集簇性和高核质比(图2e)。为制备无饲养细胞培养物，尽管没有饲养细胞，添加了ΔE-MEF条件培养基的基质胶上的hESC仍形成了清晰且紧密的菌落，与饲养细胞上培养的hESC相似(图2b和2d)。有意思的是，发现在未分化菌落边界围绕有已分化的成纤维细胞样细胞，但后者的密度明显低于hESC(图2d)。在饲养细胞和无饲养细胞条件下，HES-3细胞持续保持未分化hESC形态达连续传代40次以上(群体倍增数(PD)为210)。在饲养细胞和无饲养细胞条件下传代10次以上的另两个hESC细胞系，HES-2和HES-4也观察到相似的形态特征(数据未显示)。此外，HES-3细胞在所述两种培养条件下的比生长速度和倍增时间相当(表2)，并与现有文献报道一致[4，23]。
未分化hESC独特标记的鉴定
未分化hESC特征性地表达一系列标记，例如胞内转录因子Oct-4和细胞表面标记如SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81。我们用流式细胞计数法比较了饲养细胞和无饲养细胞条件下所有3个hESC细胞系的Oct-4表达(图3)。和培养在原代MEF上的HES-3细胞(图3a)一样，＞88％的ΔE-MEF上培养的HES-2、HES-3和HES-4细胞呈Oct-4染色阳性(分别见图3c、3b和3d)。相似地，当细胞维持在添加了ΔE-MEF产生的CM的无饲养细胞条件下时，＞97％的细胞(全部3个hESC细胞系)都呈Oct-4阳性(图3e-3g)。而且，ΔE-MEF(图4，上图)或ΔE-MEFCM(图4，下图)上培养的HES-3细胞还呈SSEA-4(图4a，4e)、Tra-1-60(图4b，4f)、Tra-1-81(图4c，4g)阳性，并具有高碱性磷酸酶活性(图4d，4h)。
为了评价体内形成分化组织的潜能，将在饲养细胞上维持和采用ΔE-MEF的无饲养细胞培养物维持的HES-3细胞注射给SCID小鼠。10周后，都观察到了畸胎瘤。制备肿瘤切片进行组织学检查。由切片看，可鉴定到三种胚层的代表性组织，包括肠样上皮细胞(内胚层，图5a)、神经上皮细胞(外胚层，图5b)、肌肉、软骨和骨(中胚层，图5c-e)。而且，还对至少连续传代25次(130PD)的饲养细胞和无饲养细胞细胞群的HES-3细胞进行了细胞遗传学检查(图6a和6b)。分析结果显示，两种条件下培养的HES-3细胞都保持了正常核型(46X，X)。
最后，因为是用逆转录病毒对原代MEF进行的无限繁殖化，确定ΔE-MEF不产生病毒十分重要，否则会使hESC感染E6和E7抗原。在40代之后的HES-3无饲养细胞培养物中，RT-PCR没有检出E6和E7表达(图7b)。但检出了Oct-4表达，这表明hESC仍未分化。作为对照，也对ΔE-ME F进行了RT-PCR(图7a)。此时可检出，饲养细胞表达E6和E7抗原，但不表达Oct-4。
用ΔE-MEF进行HES-3共培养物的放大培养
为了证明ΔE-MEF可用于非分化hESC的放大培养，将共培养物由器官培养皿扩增到组织培养瓶。然后将组织培养瓶中的细胞作为接种物用于将hESC扩增到三颈烧瓶和细胞工厂的规模。由表3看，在这些大培养容器中，7天后的总细胞得率约为2-3×108细胞。还可以看到，尽管三颈烧瓶和细胞工厂与器官培养皿相比分别将表面积增大的208倍和263倍，细胞密度仍保持为约0.37-0.47×106细胞/cm2。而且，三颈烧瓶和细胞工厂中扩增hESC的89％-96％保持Oct-4染色阳性(图8a和8b)。总的看来，以上结果显示，可以用ΔE-MEF共培养物将未分化hESC扩增到相当大的量。
表1
RT-PCR的引物
引物     序列(5’-3’)     产物大小(bp)   参考文献
  HPV16-E6-FHPV16-E6-RHPV16-E7-FHPV16-E7-ROct-4-FOct-4-Rβ-肌动蛋白-Fβ-肌动蛋白-R     GCAACAGTTACTGCGACGTGGGACACAGTGGCTTTTGACAGATGGTCCAGCTGGACAAGCGTGCCCATTAACAGGTGTTCCGRGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCGCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC     234234143143241241396396   [11][11][11][11][2][2][2][2]
表2：饲养细胞、hESC共培养物和无饲养细胞培养物的比生长速度和倍增时间
hESC细胞系   饲养细胞   比生长速度/μ(h-1)   倍增时间/td(h)
--HES-3HES-3   MEF(P4)ΔE-MEF(P7)ΔE-MEF-(无饲养细胞ΔE-MEF CM)   0.0490.0510.0220.021   20.419.731.832.7
表3：hESC在不同培养参数的总细胞得率和细胞密度
培养平台     表面积(cm2)   总细胞得率(×106)   细胞密度(×106细胞/cm2)
器官培养皿     2.4     1.0     0.42
组织培养瓶三颈烧瓶细胞工厂     75.0500.0632.0     29.4187.5295.3     0.390.370.47
讨论
饲养细胞是hESC培养物中的必要组分。不象小鼠胚胎干细胞，hESC或培养成与饲养细胞直接接触的共培养物，或培养在添加了饲养细胞-CM的无饲养细胞培养物中。hESC在这些条件下保持未分化表型。然而，一个主要局限是，目前用于hESC的饲养细胞源自小鼠或人的初生组织。作为正常体细胞，它们在培养物中的寿命有限，复制有限次数后就衰老了。用HPV 16E6和E7抗原转导原代细胞已显示能将人成纤维细胞的寿命延长到群体倍增数200以上[19]。
本项研究中，我们证明，用HPV 16E6和E7感染可将原代MEF的寿命从7-9代延长至超过70代(群体倍增数为250)。RT-PCT证实有E6和E7表达。曾有报道称，用诸如SV40、E6/E7等基因使细胞无限繁殖化处境艰难，大多数细胞衰老。在这群细胞中，持续分裂的细胞最终形成了无限繁殖细胞系[24]。有意思的是，用ΔE-MEF没有发现上述现象。在以逆转录病毒感染后，细胞群持续繁殖，超过了它们的正常寿命，并耐受G418抗生素选择。在体内，给SCID小鼠肌内注射ΔE-MEF16周后也没有出现任何明显的肿瘤。这证实无限繁殖化后，ΔE-MEF未变成致瘤性。相比之下，注射等量的hESC，9-10周后出现了直径约1-2cm的畸胎瘤。
用E6和E7抗原进行细胞无限繁殖化的一个重要问题是，虽然可通过降解p53和视网膜母细胞瘤蛋白实现无限繁殖化，但有报道称，E6和E7也可能影响无限繁殖细胞的其它路径和细胞功能。Murvai等[25]发现，HPV16 E7还抑制NIH/3T3细胞内转化生长因子-β2(TGF-β2)启动子的活性。在人角质形成细胞内，E6和E7过度表达引起TGF-β2mRNA表达和生物活性TGF-β2分泌降低[26]。另一方面，HPV16 E6显著诱导TGF-β1启动子活性(6倍)，但这一效果对细胞类型特异，仅见于成纤维细胞中，在上皮细胞中则没有[27]。
本项研究中，E6和E7无限繁殖化没有改变ΔE-MEF支持未分化hESC生长的能力。我们发现，3个hESC细胞系能容易地适应这些饲养细胞，并且，在饲养细胞和无饲养细胞培养物中都保持未分化hESC培养物的典型形态。这些hESC还持续表达多能干细胞标记，包括Oct-4、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81和碱性磷酸酶。25代后，细胞仍保持稳定的核型，并能够在SCID小鼠中分化形成畸胎瘤。此外，HES-3无饲养细胞培养物的mRNA的RT-PCR分析证实，细胞保持Oct-4阳性，E6和E7抗原阴性。后一结果很重要，因为这证明ΔE-MEF用于hESC是安全的，不存在由饲养细胞将这两抗原传递给hESC危险。在我们为生产大量未分化hESC所进行的努力中，我们证实，可以在大型培养容器例如细胞工厂中用ΔE-MEF实现HES-3细胞共培养物的扩大培养(约2-3×108细胞)。尽管表面积比在器官培养皿中扩大了208-263倍，但培养7日后可获得相当的密度且未降低细胞质量。
近年来，我们还用本发明方法成功地使3种人包皮成纤维细胞(hF)系无限繁殖化，已知这些细胞系支持hESC扩增[4]。与ΔE-MEF一样，无限繁殖hF细胞系ΔE-Hs68保持了支持未分化HES-3细胞在饲养细胞共培养物(＞26代)和在无饲养细胞培养物(＞16代)中繁殖的能力。HES-3细胞的倍增时间是34.5小时和36.4小时，而原代Hs68共培养物上HES-3细胞的倍增时间为33.3小时。hESC还保持了Oct-4、GCTM-2、SOX-2、Tra-1-60和Tra-1-81染色阳性(结果未显示)。
结论是，以上结果显示，用E6和E7使细胞无限繁殖化是一种全面解决方案，可兼用于小鼠和人饲养细胞。饲养细胞能够持续繁殖超出其正常寿命并保持支持hESC扩增的能力是有利的，因为无需频繁制备原代饲养细胞。这种稳定的饲养细胞来源将提高培养结果的再现性，尤其是在饲养细胞和无饲养细胞培养条件下的hESC扩大培养中，还消除了不同批次饲养细胞质量不一致的问题。而且，还可对这些无限繁殖饲养细胞进行筛以确保它们不含潜在病原体，避免病原体由饲养细胞传递给hESC。
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Claims (36)

1.一种无限繁殖饲养细胞系。
2.一种无限繁殖饲养细胞系，由胚胎成纤维细胞制得。
3.一种无限繁殖饲养细胞系，由小鼠胚胎成纤维细胞制得。
4.一种无限繁殖饲养细胞系，通过一种或多种以下手段由小鼠胚胎成纤维细胞制得：p53肿瘤抑制蛋白降解，c-myc表达上调，端粒酶活化和pRb降解。
5.一种无限繁殖饲养细胞系，通过导入HPV16的E6和E7基因由胚胎成纤维细胞制得。
6.如权利要求5所述的无限繁殖饲养细胞系，所述E6和E7基因通过转导导入。
7.如权利要求6所述的无限繁殖饲养细胞系，所述胚胎成纤维细胞被编码HPV16的E6和E7基因的逆转录病毒感染。
8.如权利要求7所述的无限繁殖饲养细胞系，所述细胞群体在感染逆转录病毒后持续繁殖超过它们的正常寿命，并耐受G418抗生素选择。
9.如权利要求7所述的无限繁殖饲养细胞系，无限繁殖化后，所述细胞系不会转化为肿瘤细胞。
10.如权利要求9所述的无限繁殖饲养细胞系，在体内，将所述细胞肌内注射入SCID小鼠后，16周后仍未引起明显肿瘤。
11.如权利要求1所述的无限繁殖饲养细胞系，所述细胞系繁殖超过7、8或9代。
12.如权利要求11所述的无限繁殖饲养细胞系，所述细胞系体外繁殖超过70代而不染上任何致瘤性表型。
13.如权利要求1所述的无限繁殖饲养细胞系，所述细胞系支持hESC，不论是在共培养物中还是在添加了CM的无饲养细胞培养物中，＞40代的所述hESC保持了特征性未分化形态；持续表达多能标记Oct-4、SSEZ-4、Tar-1-60、Tar-1-81、碱性磷酸酶，并保持正常核型；注射给SCID小鼠后，所述hESC与三种胚层的代表性组织形成畸胎瘤。
14.如权利要求1所述的无限繁殖饲养细胞系，所述细胞系支持未分化hESC生长。
15.如权利要求1所述的无限繁殖饲养细胞系，hESC细胞系很容易适应所述饲养细胞系，并且，在饲养细胞培养物和无饲养细胞培养物中都保持未分化hESC的典型形态。
16.如权利要求15所述的无限繁殖饲养细胞系，所述hESC持续表达多能标记，所述标记包括Oct-4、SSEZ-4、Tar-1-60、Tar-1-81和碱性磷酸酶。
17.如权利要求15所述的无限繁殖饲养细胞系，25代后，所述hESC仍保持稳定的核型，并能够在SCID小鼠内分化形成畸胎瘤。
18.如权利要求15所述的无限繁殖饲养细胞系，HES无饲养细胞培养物mRNA的RT-PCR分析证实细胞保持Oct-4阳性，E6和E7抗原阴性。
19.通过E6和E7过度表达无限繁殖化的原代MEF。
20.本发明所述的细胞系ΔE-MEF。
21.一种无限繁殖饲养细胞系，保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-6705。
22.权利要求1-21中任一项所述无限繁殖饲养细胞系在合适培养基中形成的培养物。
23.一种组合物，包含权利要求1-21中任一项所述无限繁殖饲养细胞系，所述细胞处于合适的载体或稀释剂中。
24.一种条件培养基，由权利要求1-21中任一项所述无限繁殖饲养细胞系产生。
25.如权利要求24所述的条件培养基，与胞外基质例如基质胶联用。
26.一种培养干细胞的方法，包括采用权利要求1-21中任一项所述无限繁殖饲养细胞系作为饲养细胞。
27.如权利要求26所述的方法，所述干细胞是人干细胞。
28.如权利要求27所述的方法，所述干细胞是人胚胎干细胞。
29.一种培养干细胞的方法，包括采用权利要求24或25所述的条件培养基。
30.如权利要求29所述的方法，所述干细胞是人干细胞。
31.如权利要求30所述的方法，所述干细胞是人胚胎干细胞。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，在培养容器例如细胞工厂中产生放大量的未分化hESC。
33.如权利要求32所述的方法，所述放大量大于108细胞。
34.一种干细胞，是用权利要求26-31中任一项所述方法培养的。
35.如权利要求34所述的人干细胞。
36.如权利要求32所述的人胚胎干细胞。
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