CN108359634A

CN108359634A - 一种饲养细胞蛋白复合物及其应用

Info

Publication number: CN108359634A
Application number: CN201810104067.8A
Authority: CN
Inventors: 陈慧敏; 巩慧; 朱海林
Original assignee: JIANGYIN STEMEASY BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: JIANGYIN STEMEASY BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-08-03

Abstract

本发明涉及一种饲养细胞蛋白复合物及其应用，制备方法包括如下步骤：（1）获取人源或鼠源的胚胎成纤维细胞并进行培养；（2）当胚胎成纤维细胞传代到3代时换成无血清的培养基；（3）将收集到的上清液浓缩。本发明制备方法简单，步骤易于操作，制备的得到的饲养细胞蛋白复合物能够用于培养人胚胎干细胞，且能够促进人皮肤伤口划痕两侧的细胞生长。

Description

一种饲养细胞蛋白复合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种饲养细胞蛋白复合物及其应用，属于细胞培养技术领域。

背景技术

人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）是一种源于人囊胚内细胞团，经体外分离、培养获得的原始多能干细胞。由于其人源性，人胚胎干细胞受到高度关注，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。人胚胎干细胞的分离和体外培养成功具有极其重要的研究和临床应用价值，其可用于体外研究人类胚胎发生发育的过程，有助于理解分化发育的机制、认识生命和疾病的现象。人胚胎干细胞最为深远的潜在用途是通过定向分化诱导产生各种特化的细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官，从而治疗许多疾病，如脊髓损伤、脑卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、白血病、骨关节炎等。人胚胎干细胞的培养条件十分苛刻，既需要维持其未分化状态和分化潜能性，又要使其无限增殖，因此传统上需要将人胚胎干细胞置于CF-1来源的饲养细胞上培养。培养液中除基础培养基外，还要加入抑制分化的因子，如beta-巯基乙醇等，同时还需要细胞生长促进因子，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。饲养细胞提供人胚胎干细胞生长的附着位点，并分泌多种细胞因子抑制人胚胎干细胞分化，促进其增殖。常用的饲养细胞有小鼠成纤维细胞系STO细胞、3T3细胞、各种系小鼠的胚胎成纤维细胞等。目前最被广泛认可并使用的是CF-1小鼠来源的饲养细胞，研究发现，其上清中含有多种人胚胎干细胞亟需的生长因子，使用CF-1小鼠来源的饲养细胞制备的条件培养基中的细胞因子量少，只能作为传统培养基的辅助使用。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种饲养细胞蛋白复合物及其应用。

本发明采用如下技术方案：一种饲养细胞蛋白复合物，制备方法包括如下步骤：

（1）胚胎成纤维细胞的获取：获取人源或鼠源的胚胎成纤维细胞，并将胚胎成纤维细胞放入5％CO2培养箱中培养，培养瓶中注明细胞名称、代数及日期

（2）当胚胎成纤维细胞传代到3代，当细胞铺满培养瓶后，弃掉之前的培养基，换成无血清的培养基；

（3）第二天开始进行收集，连续收集5天，将收集到的上清液浓缩，采用切向流超滤器进行切向流过滤，在温度为3-5℃下浓缩至原溶液体积的1/100～1/10，标记饲养细胞蛋白复合物，-20℃保存。

进一步的，所述步骤（1）中人源胚胎成纤维细胞的制备方法为：将收集到的人胎盘或人脐带采用DPBS缓冲液冲洗3-5次，并将组织充分剪碎，采用0.25%的胰酶或胶原酶消化2-10min后得到胚胎成纤维细胞。

进一步的，所述步骤（1）中鼠源的胚胎成纤维细胞的制备方法为：将怀孕10~18天的CF-1小鼠处死后浸入酒精中消毒，在无菌条件下获取CF-1小鼠的胚胎，采用PBS缓冲液冲洗胚胎3-5次，并将组织充分剪碎，采用0.25 % 的胰酶消化2-10 min后得到胚胎成纤维细胞。

进一步的，所述步骤（3）中浓缩后的蛋白复合物可以加入BSA， BSA的加入量为浓缩后的蛋白复合物质量的1～5 %。

饲养细胞蛋白复合物的应用，所述饲养细胞蛋白复合物能够用于培养人胚胎干细胞。

饲养细胞蛋白复合物的应用，所述饲养细胞蛋白复合物能够促进伤口划痕两侧的细胞生长。

本发明的有益效果：（1）本发明制备饲养细胞蛋白复合物能够保持人胚胎干细胞在体外培养条件下不产生分化，克服了目前人胚胎干细胞传统培养中对生物表达bFGF的依赖；（2）本发明制备的饲养细胞蛋白复合物能够促进划痕两侧的细胞生长，加快细胞生长的速度，使划痕两侧的细胞汇合速度加快，能够应用于促进皮肤修复的护肤品及创面敷料；（3）本发明制备的饲养细胞蛋白复合物因含有细胞生长所需的细胞因子和细胞外基质蛋白，模拟细胞生长的微环境，因此能够应用于肿瘤细胞研究和生物3D打印人体组织和器官。

附图说明

图1为CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物培养后的人胚胎干细胞碱性磷酸酶染色结果。

图2为CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物培养后的人胚胎干细胞Oct-4染色结果。

图3为CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物培养后的人胚胎干细胞SSEA-4染色结果。

图4为CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物对人角质形成细胞的划痕实验。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的说明。

本发明中的人胚胎干细胞来源于中科院，所需培养基DMEM/F12均购于Thermofisher。

实施例一：

将CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物应用于人胚胎干细胞的培养：

1.制备CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物

（1）从CF-1胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞

a)处死怀孕10~18天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。

b)无菌获取胚胎，置于无菌的培养皿中。

c)将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。

d)用无菌剪刀将组织充分剪碎，消化后获取细胞。

e)将细胞放入5％CO₂培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。

（2）蛋白复合物的收集及浓缩

a)传代到3代时，当细胞铺满培养瓶后，弃掉之前的培养基，换成无血清的培养基。

b)第二天开始进行收集，共收集5天。

c)将收集到的上清用切线流浓缩。

d)将浓缩物在-20℃保存。

2.用CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物进行人胚胎干细胞的培养复苏人胚胎干细胞细胞

a)从液氮中取出冻存的人胚胎干细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻。

b)将细胞转移到一个预装有人胚胎干细胞完全培养基的离心管中，混匀，离心5分钟。

c)吸弃上清液，人胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。

d)转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的培养瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基。将瓶放入37℃的CO₂培养箱中，观察细胞每天的生长情况。

（1）人胚胎干细胞的传代

a)从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液，立即加入Ⅳ型胶原酶到瓶中，使之覆盖到所有的细胞。

b)将培养瓶重新放回37℃培养箱中，放置约20~30分钟。

c)待克隆消化下来后用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代。

（2）将CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物进行人胚胎干细胞的培养

a)配置含CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物的人胚胎干细胞培养基。

b)将培养基从人胚胎干细胞完全培养基更换为含CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物的人胚胎干细胞培养基。

3.对人胚胎干细胞的检测

（1）碱性磷酸酶染色：

a)从培养皿中吸走原有的人胚胎干细胞培养基，用4%的多聚甲醛固定细胞1~2分钟。

b)吸走多聚甲醛，用PBS冲洗一遍。

c)加入足够的碱性磷酸酶染色液，避光室温孵育15分钟。

d)吸走碱性磷酸酶染色液，润洗一遍后加入PBS防止风干，在显微镜下观察结果。

（2）免疫染色步骤：

a)把细胞固定在4％多聚甲醛中，室温放置30分钟。

b)在无水乙醇中浸泡两次，每次20分钟。

c)将上述溶液吸干，先用PBS洗涤一次，再用抗体稀释液洗涤两次。

d)用封闭液封闭细胞。

e)将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，4℃放置过夜。

f)用PBT洗涤细胞3－5次。

g)将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h。

h)用PBT洗涤3次。

i)荧光显微镜下观察结果。

（3）核型分析

a)加秋水仙素2~6小时后，将细胞消化移入离心管内。

b)离心10分钟，去上清液。

c)加低渗液，吹打混匀，放入37℃水浴箱10分钟。

d)用封闭液封闭细胞。

e)离心去上清液，加固定液，吹打混匀，固定20分钟。

f)吸取细胞悬液均匀滴在两张玻片上，等玻片上的细胞悬液散开后，再将多余的液体从玻片上倒掉。

g)将玻片放在倾斜30度左右的木板上，贴标签，然后放37度烤箱过夜。

h)将玻片水平放在架子上，将染液均匀加载玻片上，染色结束后冲水，自然干燥。

i)显微镜下观察结果。

4.结果

（1）如图1所示，经碱性磷酸酶染色后，在显微镜下可明显观察到，用含CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物培养的人胚胎干细胞，细胞体积小，核大，核浆比例达，细胞排列紧密，碱性磷酸酶染色呈阳性，说明此人胚胎干细胞未分化，染色情况如图1所示。

（2）如图2和图3所示，对人胚胎干细胞标志物进行免疫染色后，可以观察到，人胚胎干细胞边缘清晰，细胞排列紧密，Oct-4染色及SSEA-4染色均呈阳性，说明人胚胎干细胞未分化核型经染色后，经分析后得出，核型正常。

实施例二：

CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物用于伤口愈合。

1.制备CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物

（1）从CF-1胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞

a)处死怀孕10~18天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。

b)无菌获取胚胎，置于无菌的培养皿中。

c)将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。

d)用无菌剪刀将组织充分剪碎，消化后获取细胞。

e)将细胞放入5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。

（2）蛋白复合物的收集及浓缩

b)第二天开始进行收集，共收集5天。

c)将收集到的上清浓缩。

d)将浓缩物在-20℃保存。

2.人角质形成细胞划痕实验

（1）获取人角质形成细胞

a)取包皮组织，为保证无菌，处理前在75%乙醇中浸泡10秒。

b)将包皮组织转入培养皿中，眼科剪和眼科镊修剪，将组织分切为小块。

c)加入皮肤分离液，消化过夜。

d)将消化后的皮肤倒入培养皿中，用眼科镊将表皮和真皮仔细分离。

e)将分离的表皮放入离心管中，加入表皮细胞分离液，37℃消化10分钟。

f)用含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液。

g)离心去除消化液，用PBS清洗，用人角质形成细胞培养基重悬接种。

（2）划痕实验

a)取足量人角质形成细胞，消化后铺入12孔板。

b)待细胞长满后，划出划痕。

c)将划下的细胞吸走，换上不同的培养基，分别为人角质形成细胞正常培养基和含CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物的培养基。

d)每2小时观察划痕的愈合情况，及时拍照。

3.结果

如图4可知，含CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物的培养基能更早的让划痕两侧的细胞开始生长，细胞生长速度明显加快，更快的让划痕两侧的细胞汇合。

Claims

1.一种饲养细胞蛋白复合物，其特征在于：制备方法包括如下步骤：

（1）胚胎成纤维细胞的获取：获取由人胎盘或人脐带得到人源胚胎成纤维细胞或鼠源的胚胎成纤维细胞，并将胚胎成纤维细胞放入5％CO₂培养箱中培养，培养瓶中注明细胞名称、代数及日期

（3）第二天开始进行收集，连续收集5天，将收集到的上清液浓缩，采用切向流超滤器进行切向流过滤，在温度为3～5℃下浓缩至原溶液体积的1/100～1/10得到蛋白复合物， -20～-22℃保存。

2.如权利要求1所述的人源饲养细胞蛋白复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中人源胚胎成纤维细胞的制备方法为：将收集到的人胎盘或人脐带采用DPBS缓冲液冲洗3～5次，并将组织充分剪碎，采用0.25%的胰酶或胶原酶消化2～10min后得到胚胎成纤维细胞。

3.如权利要求1所述的鼠源饲养细胞蛋白复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中鼠源的胚胎成纤维细胞的制备方法为：将怀孕10~18天的小鼠处死后浸入酒精中消毒，在无菌条件下获取CF-1小鼠的胚胎，采用PBS缓冲液冲洗胚胎3～5次，并将组织充分剪碎，采用0.25 % 的胰酶消化2～10 min后得到胚胎成纤维细胞。

4.如权利要求1所述的CF-1小鼠来源饲养细胞蛋白复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中浓缩后的蛋白复合物可以加入BSA， BSA的加入量为浓缩后的蛋白复合物质量的1～5 %。

5.权利要求1所述的饲养细胞蛋白复合物的应用，其特征在于：所述饲养细胞蛋白复合物能够用于培养人胚胎干细胞。

6.权利要求1所述的饲养细胞蛋白复合物的应用，其特征在于：所述饲养细胞蛋白复合物能够促进伤口划痕两侧的细胞生长。