CN102120983B - 北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸭表皮干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：取材，冲洗与消化，原代培养和传代培养。通过本发明方法制备的北京鸭表皮干细胞可为组织工程、基因工程、细胞工程、免疫学和分子生物学等生命科学研究提供种子细胞；不仅在农业上能丰富并改良地方品种，同时在保护畜禽遗传资源多样性方面开辟了一条新的途径；还可作为疫苗生产的主要原材料。

Description

北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法

技术领域

本发明涉及一种鸭表皮干细胞的分离和培养方法，具体地说是利用北京鸭背部皮肤进行分离和培养、传代培养并鉴定。属于细胞生物学领域。 

背景技术

随着科技的发展和人们物质生活需求的不断提高，畜牧业生产正朝着高产、优质、抗逆、抗病及集约化的方向快速转变和发展。在大多数发达国家里，由于人们过于追求经济利益等缘故，大量繁育的畜禽只是少数经济价值高的品种和杂交种，因而，导致了很多产量不高、品质不佳、抗逆和抗病力差的地方品种濒临灭绝，甚至灭绝。虽然相关的国际组织、政府部门和专家学者对畜禽遗传资源的保存和管理工作相当重视，但畜禽种质资源仍在大量丧失，遗传多样性遭到了前所未有的破坏，并且危机程度日益加剧。 

据统计，全球6165个畜禽品种中，有740(12.00％)个已经灭绝、513(8.16％)个濒临灭绝、1092(17.71％)个濒危、有1407(22.18％)个状况不清楚，只有2395(38.8％)个处于非危机状态。1999年已经灭绝、濒临灭绝及濒危的品种占品种总数的比例较1995年所占的比例分别增加了82.09％、37.54％、19.02％。据2000年联合国粮农组织(FAO)与联合国环境规划署的报道，目前全球畜禽品种以每周减少2个品种的速度在丧失，在被FAO所记录的2576个畜禽品种中，几乎半数被认为是濒危畜禽资源，约有1350个品种面临灭绝，使世界畜禽种质资源出现越来越狭窄的格局，因此挽救和保护濒危畜禽品种已成为当务之急。 

我国动物遗传资源丰富，是世界上畜种资源最丰富的国家之一。许多地方畜禽品种以其优良的遗传性状和特有的经济价值闻名于世，为世界畜牧业的发展作出了巨大的贡献。但由于近年来国外优良畜禽品种大量引进、对地方品种的盲目杂交改良以及片面追逐短期经济效益等多方面因素，地方畜禽品种受到严重冲击，数量迅速减少。 

畜禽的品种及其演化往往是对人类劳动过程、膳食、宗教信仰、风俗习惯的记述，是人类历史文化的具体体现形式，具有一定的历史文化价值。许多品种具有珍贵的DNA序列、特殊的生理特性、独特的抗病性以及适应性等，可作为科研模型的理想选择。其遗传多样性为育种学家提供了丰富的育种材料，创造了无限的选择空间，降低了畜牧业所面临的风险和挑战，增强了畜牧业内在的韧性和外在的机遇，使人类游刃有余地应对 自然环境和市场的不断变化，为畜牧业的发展注入无限的生机和活力。保护畜禽遗传资源的多样性，既是中国可持续发展的需要，又是国际社会极为关注并为之努力工作的热点。 

随着体外培养技术和体细胞克隆技术的发展和不断完善，为畜禽基因资源的保存提供了新的方法和途径，体细胞、干细胞保存等新方法逐渐成为资源保存较为理想的方法。 

要尽量全面、妥善地保护现有畜禽品种的种质资源，其实质就是使现有基因库中的基因资源尽量全面保存，根据动物遗传资源多样性在不同层次的特点，可以采取不同的保种措施和方法，主要有活体保种法、保存基因和冷冻保存法等，畜禽胚胎干细胞以及成体干细胞的研究为保护畜禽遗传资源多样性方面开辟了一条新的途径。 

近年来，由于体外培养细胞在遗传资源保存和生命科学研究等诸多方面具有巨大的科学价值和应用价值，已引起各国政府高度重视。除美国外，日本大阪发酵所(IFO)德国培养物保藏所(DSM)等都在逐渐扩大保藏范围，将细胞培养物列入保藏对象。 

细胞是生物体最小的结构和功能单位。有机体每个细胞的核含有完整的遗传信息，这至少在理论上有可能使个别动物的遗传信息以细胞或细胞核的形式保存。细胞可以在超低温条件下长期保存，即使活体动物消失，只要存在同种物种，通过胚胎移植、核移植等技术就可以恢复这些遗传资源。只要完整的保存了具有生物活性的细胞就相当于保存了一个完整的动物个体所有遗传信息。 

因此，畜禽基因资源的体细胞、干细胞保存作为一种新型、安全的离体保存方法切实可行，不仅在细胞水平上将畜禽基因资源长期保存下来，而且为从细胞和分子水平研究现代生物学和医学，特别是动物分类、系统演化、物种起源及其它分子生物学研究提供了宝贵的试验材料。这对于保护濒危动物和遗传品质优秀的基因都具有重要意义。 

自国家“七五”计划以来，北京鸭育种始终被列为国家重点科研项目。北京鸭是世界著名的肉用型鸭品种，是我国优良地方品种。鸭是鸟纲雁形目鸭科鸭亚科水禽的统称。原产于中国北京西郊，已有近300年的饲养历史。除北京外，还分布于天津、上海、广东、辽宁、黑龙江、内蒙古、山西、河南等地。1873年传去美国，后又经美国传至欧洲和日本等。该品种体型较大而紧凑匀称，头大颈粗，体宽、胸腹深、腿短，体躯呈长方形，前躯高昂，尾羽稍上翘。公鸭有钩状性羽，两翼紧附于体躯，羽毛纯白略带奶油光泽。喙和皮肤橙黄色，蹠蹼为橘红色。目前采用农户分散饲养和一些大小不等的鸭场饲养。但是，由于近几十年来自然环境的污染和恶化，的种质资源已经严重匮乏，在绝大 多数地区已经灭绝，在小部分地区也只还存在有限的数目，而目前人工繁育所面临的多方面技术问题导致其繁育效果不佳，我国北京鸭面临濒临灭绝的危险。因此，为保护国家珍惜禽种，一个最优的方法是对北京鸭细胞的培养并加以保藏。 

但是，由于北京鸭表皮干细胞分离很困难，对培养环境十分敏感。若真皮和表皮未分离而直接用组织块法培养，其所获得的干细胞数量极少，细胞类型多而杂，如常混杂有大部分的成纤维细胞和毛囊细胞，随着培养时间的延长，培养物所含各种类型细胞间的生长期限出现差异，成纤维细胞有经过适应生长阶段而加速繁殖生长，而目的细胞则死亡，或者经过逐步退化而至死亡。而第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。而采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，也已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。目前使用较多的反应器培养虽可以获得高密度细胞，但是扩大规模较难，只适合于少量、价值高的细胞培养。   

目前，常采用EB病毒转化技术、贴壁培养法和胶原酶消化技术进行禽类品种体外细胞的大量培养，但对比试验结果表明：EB病毒转化技术对于禽类品种的体外细胞培养并不适用，其培养的细胞活率及纯度均不能达到所需标准，EB病毒转化技术对于人类和灵长类动物的细胞培养效果要优于禽类细胞培养；胶原酶消化技术和贴壁培养法获得的原代细胞分别经传代后接种，细胞群体倍增时间(PDT)分别为35.9h和48h。但前者操作步骤繁杂，不适合于体外大规模化细胞的培养，后者简单易行，适合于体外大规模化细胞的培养。因此建立细胞系以采用后者为佳。对于禽类细胞保藏而言，细胞纯度及活性均有较高的要求，目前，贴壁培养方法存在诸多弊端，如方法单一、成本过高、细胞活性及纯度偏低、细胞冻存复苏后死亡率过高等。因此，现在急需对其方法改进以使北京鸭表皮细胞达到高细胞活率高纯度的标准已得到很好的保藏并延续下去。   

发明内容

本发明的一个目的是提供北京鸭表皮干细胞简单易行的取材方法。 

本发明的另一目的在于提供上述干细胞的分离和培养方法。 

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案： 

北京鸭表皮干细胞具有以下形态学特征：具有未分化细胞的结构及形态特征，表现为细胞体积小，呈球形，胞体透亮，折光性强，核质比高，胞内细胞器少。， 

一种北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，该方法包括下述步骤： 

(1)取材：将北京鸭处死后，抓紧其头部与尾部，尽量把背部部位暴露得最大， 可以尽可能多的取材，并使其皮肤紧绷，有利于退毛。沿着逆毛方向拔毛，拔完较长的毛后，皮肤上还有很多小绒毛，这时只要带上手套在皮肤上轻轻蹭就能很干净地把其除去。毛退干净后，用眼科剪把皮肤剪开，在用眼科镊轻轻把皮肤撕下，放入分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS中，尽快带回无菌间。 

在细胞的分离和培养中，取材不仅仅是分离和培养的前提，而且是很关键的一步。文献报道，猪、羊是在耳中部血管相对较少处，刮毛消毒，用耳号钳剪下一块大小约0.5×0.5cm²的皮肤；人是取水囊引产的健康孕20、28周胎儿的皮肤或成人整形外科手术后剩余皮肤或包皮环切术后的包皮；鼠类是取胎儿或刚出生后不久的鼠背部皮肤。以上所用这些取材方法都不适用于北京鸭。 北京鸭没有相对硬实的耳朵；北京鸭在胚胎10日龄后毛发开始发育，取7-15日龄的胚胎在体式显微镜下剥取皮肤，在4℃消化过夜后，皮肤全部成弥乱状，根本无法把表皮与真皮分开；北京鸭一出生就有毛，不像鼠类。为了解决这一难题，在刚开始实验时，用刀片刮毛不仅刮不干净，还容易把皮肤划破。可能是鸭皮肤比较稚嫩且太软不容易固定。后来想办法用宽胶带粘贴时，不仅容易把皮粘贴破，而且比较费时。需要强调的是：退毛时，手套与鸭背一定要保证是干燥的，不然不仅毛退不干净，培养时易污染；而且还会含有很多毛囊细胞，导致细胞不纯。 

(2)冲洗与消化：皮样在75％的酒精中浸泡30S后，用分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS或0.75％生理盐水冲洗10次，每次5min。取冲洗干净的皮样，用眼科镊夹住其中一角并吊起，在干净的皿上方把之剪成0.2×0.2cm²的小块，然后用0.2ml或1ml移液器把组织周围的PBS或0.75％生理盐水吸干，加入2.5g/L的中性蛋白酶，于4℃冰箱中消化。 

文献中猪、羊是用柳叶刀轻刮皮肤表面以去除血污毛发少量死亡角质化细胞。但北京鸭皮肤用柳叶刀刮时易划破。在实验中发现用眼科剪的钝面轻轻刮则不会出现类似的问题。边清洗边小心分离皮下结缔组织及大部分真皮。另外，与文献中有所不同并需要强调的是：在整个冲洗过程中，由于不仅要轻轻刮去血污毛发少量死亡角质化细胞，而且要保证每个地方都清洗干净，所以导致皮肤容易变形且卷曲甚至会卷成很多圈，故需要多次把之分小，最后剪成0.2cm×1-2cm的条状。 

(3)原代培养：消化好以后，用分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS或0.75％生理盐水冲洗4-5次，分离真皮和表皮。真皮面朝下贴于六孔板中或35mm培养皿中，每孔(皿)3-4块，块与块之间的距离在1cm左右为宜。用0.1ml或0.2ml的移液器把组织块边缘的PBS或0.75％生理盐水吸走，在培养箱(37℃，5％CO₂)中倒置20-30min。 干置后，用0.1ml或0.2ml的移液器慢慢地且少量地添加培养基于组织块周围，每孔(皿)0.2-0.3ml。第二天每孔补加培养液2mL，每3天换液一次。 

由于鸭的表皮非常薄，不像鼠类比较厚，故很容易粘在眼科镊、皿的边沿，所以取分离好的表皮时，只需夹住其中的一个小角或让其附在眼科镊上即可，这样不容易粘住。由于鸭表皮很薄，不像鼠类的较厚，干置后添加培养基时要极其小心，不然容易漂起。 

(4)传代培养：典型的干细胞集落形成后2-3天，即可传代。先用0.25％胰蛋白酶消化4-5min，去消化液后，用细胞刮刀把细胞刮下来。再加0.1％胰蛋白酶再次消化10-15min，用含有血清的培养液中和，1500rpm离心10分钟清洗。用培养基制成细胞悬液，接种在铺有IV型胶原的六孔板中或35mm培养皿中，37℃、5％CO₂和饱和湿度连续培养。以后用同样方法传代。 

(5)鉴定： 

制备细胞爬片，参照抗体说明书分别进行β1-整合素、CK10和CK19免疫荧光检测。 

A.细胞爬片用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，每次5min。 

B.4％的多聚甲醛固定30min，清洗3次，每次5min。 

C.0.2％TritonX-100处理10min，PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，每次5min。 

D.用含3％BSA的PBS在37℃，封闭30min。清洗3次，每次5min。 

E.滴加适当稀释的抗β1-整合素、CK10和CK19的-抗，置于湿盒内，37℃保温30-40min。清洗3次，每次5min。 

F.滴加稀释后的FITC标记的羊抗鼠的二抗IgG，置于湿盒内，37℃保温40min。PBS洗3次，每次5min。 

放置在激光共聚焦显微镜下观察。 

上述北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其中，步骤(1)中所述的北京鸭雏鸭为1日龄。 

上述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其中，步骤(2)中所述的消化的具体方法是：剪好的2-3只北京鸭的皮肤一起放在一个60mm的平皿中，加入2.5g/L中性蛋白酶12-15ml，于4℃冰箱中消化12-13h。 

上述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其中，步骤(3)初代培养所用的培养基是由DMEM/F12+20％FBS+15ng/ml EGF+20ng/mlIGF+5μg/ml胰岛素组成。 

上述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其中，步骤(4)传代培养用冷热消 化相结合的方法，具体步骤是：用PBS洗细胞2-3次后，用0.25％胰蛋白酶消化4-5min，去消化液后，用细胞刮刀把细胞刮下来。再加0.1％胰蛋白酶在37℃消化8-10min后，在显微镜下观察，细胞成片严重或细胞团块大的，再室温消化4-5min。用含有血清的培养液中和，1500rpm离心10分钟清洗。用培养基制成细胞悬液，接种在铺有IV型胶原的六孔板中或35mm培养皿中，37℃、5％CO₂和饱和湿度连续培养。 

本发明的优点与效果：本发明对于取材方法的改进调整，可以使培养出的表皮干细胞无毛囊细胞和成纤维细胞等杂质细胞，细胞纯度与现有技术相比有大幅提高。  

与二步酶消化法相比，组织贴壁培养法的北京鸭表皮干细胞培养效率和质量有很大的提高，只需少量组织就能培养出大量细胞，且表皮可以重复利用多次。这样既节约了取材成本，又大幅提高了工作效率。组织贴壁培养法所得细胞活力高，细胞传代次数多。因此，利用贴壁培养法培养北京鸭表皮干细胞具有明显的优势。本发明培养的细胞生长速度快、成活率高、外源基因表达率高，应用范围广。  

本发明在方法等各方面弥补了现有禽体细胞保存状况不理想的情况，北京鸭表皮干细胞的活率及纯度的提升也使重要、濒危北京鸭品种的基因资源以体外培养细胞的形式得以长期保存。 

由于北京鸭种质资源的匮乏，使得对于北京鸭在各领域内的研究成为空白。而本发明所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量的高品质材料；并可以作为禽体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上可以丰富地方禽品种改良以及地方优良禽品种保种的手段；还可以作为是疫苗生产的主要原材料及肝细胞培养的饲养层；同时可用于细胞凋亡及细胞融合研究之用。 

下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。 

附图说明

图1为北京鸭表皮干细胞显微镜下图(100×)，A为原代表皮干细胞，B为传代前鸭表皮干细胞，C为鸭第一代表皮干细胞； 

图2为ESCs免疫荧光检测，其中，A.CK19阳性细胞(100×)；B.β1-整合素阳性细胞(100×)；C.CK10阴性细胞(200×)； 

D，E，F.分别为A，B，C的相差照片 

具体实施方式

实施例中所用的主要仪器及试剂来源： 

北京鸭来源：北京鸭采自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所家禽试验基地。 

(一)主要仪器设备 

1、CO₂培养箱：Heraeus BB16UV； 

2、DL-CJ-2N高性能无菌实验台：哈尔滨； 

3、IX-71倒置相差显微镜，CX31生物显微镜，IX-71倒置相差荧光显微镜：Olympus； 

4、TDL-40B低速离心机：CENTERIGUGE； 

5、颇尔超纯水器：Pall-pruelab_plus； 

6、电动移液器：德国Accu-jet； 

7、-70℃低温冰箱：美国kelvinator； 

8、激光扫描共聚焦显微镜：尼康TE-2000-E； 

9、一次性塑料培养皿：Corning 

10、电热恒温水浴锅：DK-S12型上海森信实验仪器有限公司 

11、立式压力蒸汽灭菌器：LS-B75江阴滨江医疗设备厂 

(二)主要试剂 

1、DMEM/F12： 

2、胰岛素：sigma，No.15500 

3、EGF：Sigma，No.E9644 

4、IGF-1：Sigma No.3769 

5、IV型胶原(Fluka，No.27663)， 

6、Dispase II(中性蛋白酶，Invitrogen，No.17105-041)， 

7、β1-整合素抗体：Sigma，8、CK19，CK10抗体：Arp，9、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)， 

10、特级胎牛血清(Defined FBS)：Hyclone； 

(三)表皮干细胞培养所用试剂： 

1、DMEM/F12培养基：超纯三蒸水溶解一代DMEM/F12干粉，1.2g的NaHCO₃，加水定容至1L，pH为7.2～7.4，0.45μm与0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存。分装保存。 

2、胰岛素(胰岛素)：取50μl浓盐酸(36.46g/mol，1.19g/mL)溶于60ml四蒸水配为0.01mol/L盐酸，取0.01mol/L盐酸50ml溶解100mg胰岛素粉剂，过滤分装，得到分装浓度为2mg/mL的分装液，可根据需要继续稀释分装，标记后于-20℃保存备用。 

3、EGF：量取HAc(60.05g/mol，1.05g/mL)57.2μl溶于100mL四蒸水，得到10mmol/LHAc 100ml，称取BSA第五组分0.2g溶于上述溶液，得到含0.2％的10mmol/L HAc 100mL，0.22μm滤膜过滤后取20ml溶解200μg EGF，分装为10μg/mL，0.1mL/支的储备液，标记后于-20℃保存备用。 

4、EGF-1：取100μl醋酸(0.1M，已用0.22μm微孔滤膜过滤除菌)充分溶解EGF-1，用10mlPBS使其充分溶解，0.22微孔μm滤膜过滤除菌，400μ1一管分装，-20℃冰箱中密封保存，使用使用CEG培养液稀释为最终浓度。 

5、IV型胶原：1mL 5mg/mL的IV型胶原溶于99mL 0.25％的HAc，过滤标记后-20℃保存备用，用前以PBS稀释至需要浓度，铺板后回收过滤，于4℃保存。 

6、2.5g/L Dispase：称取0.25g Dispase溶于100ml PBS中或基础培养液(不可加热)，磁力搅拌器缓慢搅拌溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌并分装。 

7、培养基：DMEM/F12+20％FBS+15ng/ml EGF+20ng/ml IGF+5μg/ml胰岛素组成，0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存。 

8、双抗贮存液：100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。 

9、1×PBS缓冲液：NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g，KH₂PO₄ 0.10g，加三蒸水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。 

10、0.25％(质量体积比)胰蛋白酶溶液：1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，分装，-20℃贮存。 

11、0.75％(质量比)生理盐水：7.5g NaCl溶于1000ml三蒸水，高压灭菌30min。 

(四)鉴定所用抗体： 

1、鼠抗β1-整合素 

2、鼠抗CK10，CK19 

3、山羊抗鼠FITC标记二抗 

实施例1北京鸭表皮干细胞的分离和培养 

(1)取材：将北京鸭雏鸭处死后，抓紧其头部与尾部，并使其皮肤紧绷，沿着逆毛方向拔毛，拔完较长的毛后，带上手套在皮肤上轻轻蹭把小绒毛除去，毛退干净后，用眼科剪把皮肤剪开，在用眼科镊轻轻把皮肤撕下放入分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS中，尽快带回无菌间； 

(2)冲洗与消化：皮样在75％的酒精中浸泡30S后，用分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS或0.75％生理盐水冲洗10次，每次5min，在清洗的同时小心分离皮下结缔组织及大部分真皮，剪成0.2cm×1-2cm的条状，最后剪成0.2×0.2cm²的小块，把皮肤组织周围的PBS或0.75％生理盐水吸干，加入2.5g/L的中性蛋白酶于4℃冰箱中消化； 

(3)原代培养：消化好以后，用分别加有100IU/mL青霉素和链霉素的PBS或0.75％生理盐水冲洗4-5次，分离真皮和表皮，真皮面朝下贴于六孔板中或35mm培养皿中，每孔(皿)3-4块，块与块之间的距离在1cm左右，用0.1ml或0.2ml的枪头把组织块边缘的PBS或0.75％生理盐水吸走，在37℃，5％CO₂的培养箱中倒置20-30min，干置后，用0.1ml或0.2ml的移液器慢慢地且少量地添加培养基于组织块周围，每孔(皿)0.2-0.3ml，第二天每孔补加培养基2mL，每3天换液一次； 

(4)传代培养：典型的干细胞集落形成后2-3天即可传代，先用0.25％胰蛋白酶消化4-5min，去消化液后，用细胞刮刀把细胞刮下来，再加0.1％胰蛋白酶再次消化10-15min，用含有血清的培养液中和，1500rpm离心10分钟清洗，用培养液制成细胞悬液，接种在铺有IV型胶原的六孔板中或35mm培养皿中，37℃、5％CO₂和饱和湿度连续培养，以后用同样方法传代。 

实施例2北京鸭表皮干细胞的鉴定 

对实施例1培养的北京鸭表皮干细胞进行鉴定，方法及结论如下。 

一、细胞形态学观察 

方法：细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。 

结论：如图1(北京鸭表皮干细胞)所示，当细胞生长状态良好时，其形态为典型的铺路石样，细胞体积小，核质比高、细胞器少，细胞呈球形，致密，在显微镜下折光性强、胞体透亮，证明细胞生长健康旺盛。 

二、细胞活率测定 

方法： 

检测细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μl细胞悬液加人10μl 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者均为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。数二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。 

结论： 

对北京鸭表皮干细胞进行细胞活率测定。结果表明：细胞活率在92％-96％之间。 

三、表面标志鉴定 

制备细胞爬片，参照抗体说明书分别进行β1-整合素、CK10和CK19免疫荧光检测。 

A.细胞爬片用PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，每次5min。 

B.4％的多聚甲醛固定30min，清洗3次，每次5min。 

C.0.2％TritonX-100处理10min，PBS缓冲液(pH7.2～7.4)清洗3次，每次5min。 

D.用含3％BSA的PBS在37℃，封闭30min。清洗3次，每次5min。 

E.滴加适当稀释的抗β1-整合素、CK10和CK19的一抗，置于湿盒内，37℃保温30-40min。清洗3次，每次5min。 

F.滴加稀释后的FITC标记的羊抗鼠的二抗IgG，置于湿盒内，37℃保温40min。PBS洗3次，每次5min。 

放置激光共聚焦显微镜下观察。 

结论：如图2所示，北京鸭表皮干细胞β1-整合素阳性，CK19阳性，CK10阴性。 

以上结果说明了所培养的北京鸭表皮干细胞可以用于组织工程研究等领域。 

Claims (6)

1.北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤，

（1）取材：将北京鸭雏鸭处死后，抓紧其头部与尾部，并使其皮肤紧绷，沿着逆毛方向拔毛，拔完较长的毛后，带上手套在皮肤上轻轻蹭把小绒毛除去，毛退干净后，用眼科剪把皮肤剪开，在用眼科镊轻轻把皮肤撕下放入100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的PBS中，尽快带回无菌间；

（2）冲洗与消化：皮样在75％的酒精中浸泡30s后，用分别加有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的PBS或0.75％(质量比）生理盐水冲洗10次，每次5min，在清洗的同时小心分离皮下结缔组织及大部分真皮，剪成0.2cm×1-2cm的条状，最后剪成0.2×0.2cm²的小块，把皮肤组织周围的PBS或0.75％(质量比）生理盐水吸干，加入2.5g/L的中性蛋白酶于4℃冰箱中消化；

（3）原代培养：消化好以后，用分别加有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的PBS或0.75％(质量比）生理盐水冲洗4-5次，分离真皮和表皮，真皮面朝下贴于六孔板中或35mm培养皿中，每孔/皿3-4块，块与块之间的距离在1cm左右，用0.1ml或0.2ml的枪头把组织块边缘的PBS或0.75％(质量比）生理盐水吸走，在37℃，5％CO₂的培养箱中倒置20-30min，干置后，用0.1ml或0.2ml的移液器慢慢地且少量地添加培养基于组织块周围，每孔/皿0.2-0.3ml，第二天每孔补加培养基2mL，每3天换液一次；

（4）传代培养：典型的干细胞集落形成后2-3天即可传代，先用0.25％（质量体积比）胰蛋白酶消化4-5min，去消化液后，用细胞刮刀把细胞刮下来，再加0.1％（质量体积比）胰蛋白酶再次消化10-15min，用含有血清的培养液中和，1500rpm离心10分钟清洗，用培养液制成细胞悬液，接种在铺有Ⅳ型胶原的六孔板中或35mm培养皿中，37℃、5％CO₂和饱和湿度连续培养，以后用同样方法传代。

2.根据权利要求1所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于，步骤（1）中所述的北京鸭雏鸭为1日龄。

3.根据权利要求1所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于，步骤（2）中所述的消化的具体方法是：剪好的2-3只北京鸭的皮肤一起放在一个60mm的平皿中，加入2.5g/L中性蛋白酶12-15ml，于4℃冰箱中消化12-13h。

4.根据权利要求1所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于，步骤（3）原代培养所用的培养液是由DMEM/F12＋20%FBS＋15ng/mlEGF＋20ng/mlIGF＋5μg/ml胰岛素组成。

5.根据权利要求1所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于，步骤（4）传代培养用冷热消化相结合的方法代替，具体步骤是：用PBS洗细胞2-3次后，用0.25％（质量体积比）胰蛋白酶消化4-5min，去消化液后，用细胞刮刀把细胞刮下来，再加0.1％（质量体积比）胰蛋白酶在37℃消化8-10min后，在显微镜下观察，细胞成片严重或细胞团块大的，再室温消化4-5min，用含有血清的培养液中和，1500rpm离心10分钟清洗，用培养液制成细胞悬液，接种在铺有Ⅳ型胶原的六孔板中或35mm培养皿中，37℃、5％CO₂和饱和湿度连续培养。

6.根据权利要求1所述的北京鸭表皮干细胞的分离和培养方法，其特征在于，步骤（4）传代培养所用的培养液是由DMEM/F12＋20%FBS＋15ng/mlEGF＋20ng/mlIGF＋5μg/ml胰岛素组成。

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